Получение рекомбинантного капсидного белка цирковируса

ИММУНОЛОГИЯ
УДК 619: 616-085.37
Получение рекомбинантного капсидного
белка цирковируса свиней второго типа
(генотип 2b) в бакуловирусной системе
и использование его для изготовления
вакцины
С.А. Раев, кандидат ветеринарных наук, К.П. Алексеев, кандидат биологических наук, Е.В. Шемельков,
кандидат ветеринарных наук, А.Д. Булгаков, аспирант, М.И. Мусиенко, кандидат биологических наук,
Б.Г. Орлянкин, доктор ветеринарных наук, О.А. Верховский, доктор биологических наук,
Т.И. Алипер, доктор биологических наук
Ключевые слова: бакуловирусная система экспрессии генов, цирковирусная инфекция свиней, рекомбинантный капсидный белок
Сокращения: БОЕ — бляшкообразующая еденица,
ВОЗ — Всемирная Организация Здравоохранения,
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ИФА —
иммуноферментный анализ, ПЦР — полимеразная
цепная реакция, СДНС — синдром дерматита и нефропатии свиней, СПМИ — синдром послеотъемного мультисистемного истощения, ФБР — фосфатный буферный раствор, ЦВАБС — цирковирусассоциированные болезни свиней, ЦВБС — цирковирусные болезни свиней, ЦВС — цирковирус свиней
Введение
ЦВС-1 (контаминант перевиваемой культуры клеток РК-15) и ЦВС-2 (вирус, вызывающий у поросят
СПМИ) отнесены к роду Circovirus семейства Circoviridae. Вирионы цирковирусов — икосаэдрические
частицы диаметром 16…21 нм. Капсид включает в себя 32 капсомера. В вирионах ЦВС-2 обнаружен только
один белок, состоящий из 233 аминокислот [6, 12].
Между геномами ЦВС-1 (1759 нуклеотидов) и ЦВС-2
(1767…1768 нуклеотидов) выявлено менее 80 % гомологии. Все выделенные в различных странах мира штаммы ЦВС-2 имеют близкое антигенное и генетическое
родство. Идентичность нуклеотидной последовательности составляет более 94 %. Определена полная первичная структура генома многих изолятов ЦВС-2, на основании которой они подразделены на пять генотипов:
ЦВС-2a; ЦВС-2b; ЦВС-2c; ЦВС-2d; ЦВС-2e. Наибольшей
патогенностью обладает ЦВС-2b; он широко циркулирует в свиноводческих хозяйствах многих стран [1, 6].
ЦВС-2 играет важную роль в инфекционной патологии свиней: активно размножаясь в клетках иммунной системы, вызывает их гибель и развитие иммунодефицитного состояния. У таких поросят создаются
условия для возникновения вторичных инфекций, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами.
ЦВС-2 обнаруживают при различных заболеваниях
свиней, включая СПМИ, СДНС, репродуктивные на-
рушения и респираторные болезни. Все эти заболевания в Европе называют ЦВБС, а в Северной Америке — ЦВАБС [7, 11, 13].
Возможность борьбы с данным заболеванием при
помощи профилактической вакцинации не вызывает
сомнений. С этой точки зрения, в структуре данного
вируса особо стоит выделить капсидный белок, который
отвечает за способность вируса прикрепляться к клеточным рецепторам. Именно этот белок, кодируемый
последовательностью нуклеотидов открытой рамки
считывания 2 (ORF-2), стал мишенью при производстве
вакцин и диагностических препаратов [8, 10].
Известно, что бакуловирусная система экспрессии
генов является хорошим инструментом при производстве субъеденичных вакцин. В ряде работ было показано, что белки, полученные подобным образом, обладают выраженными иммуногенными свойствами [9,
14]. Возможность использования полученного в бакуловирусной системе экспрессии генов рекомбинантного нуклеокапсидного белка ORF-2 для специфической
профилактики данного заболевания была доказана
многочисленными работами [4, 5].
На основе капсидного белка, продуцированного в бакуловирусной системе, сконструированы четыре коммерческие вакцины («Ingelvac CircoFLEX», «Circumvent»,
«Porcilis PCV», «ВЕРРЕС-ЦИРКО»). Рекомбинантными
субъединичными вакцинами иммунизируют поросят
с 2…3-недельного возраста. Все коммерческие вакцины
обеспечивают значительное снижение заболеваемости
и гибели поросят в периоды доращивания и откорма.
Разработанная нами ранее рекомбинантная субъединичная вакцина «ВЕРРЕС-ЦИРКО» предназначена для
иммунизации поросят, начиная с 2-недельного возраста,
а также ремонтных свинок, свиноматок и хряков-производителей. По эффективности вакцина не уступает
зарубежным аналогам [2].
На сегодняшний день все коммерческие рекомбинантные вакцины против ЦВБС изготавливаются на основе
капсидного белка ЦВС-2а. Увеличение распространенности ЦВС-2b среди поголовья свиней стало основанием
для разработки вакцин на основе ORF-2 ЦВС-2b [3].
17
РВЖ • СХЖ • № 3/2012
АНО «Научноисследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных» (Москва).
НПО НАРВАК (Москва).
С.А. Раев, К.П. Алексеев, Е.В. Шемельков, А.Д. Булгаков, М.И. Мусиенко,
Б.Г. Орлянкин, О.А. Верховский, Т.И. Алипер
Цель исследования
Разработать технологию получения рекомбинантного капсидного белка ORF-2 ЦВС-2b в бакуловирусной системе экспрессии генов и использовать этот белок в качестве компонента вакцины против ЦВБС.
Материалы и методы
Клетки и вирусы. В данном исследовании были использованы культуры клеток насекомых: Spodoptrera
frugiperda (Sf-9) и Trichoplusia ni (Hi-five). Клетки выращивали в культуральных пластиковых флаконах различного объема, а также в условиях суспензии (10 об/мин)
с использованием бессывороточных сред EX-Cell 420
и EX-Cell 405 (для Sf-9 и Hi-five соответственно) (SAFC)
при 27оС. Для роллерного метода культивирования посевная концентрация клеток составляла 0,5х106 клеток/мл, максимальная 4,5…6,0х106 клеток/мл.
В качестве экспрессирующего вирусного вектора
использовали вирус ядерного полиэдроза AcNPV.
Конструирование, трансфекция и селекция рекомбинантных штаммов бакуловируса. В качестве источника
нуклеотидной последовательности гена нуклеокапсидного белка (открытой рамки считывания — ORF-2) ЦВС-2b
был использован образец патологического материала,
полученного в одном из свиноводческих хозяйств РФ.
Для получения трансферной плазмиды полная последовательность ORF-2 была амплифицирована с помощью
ПЦР. Олигонуклеотиды, использованные для амплификации гена, содержали сайты рестрикции PstI и SalI, по
которым наработанный фрагмент вирусной ДНК был
клонирован в трансферный вектор pFastBacHTTM из набора для бакуловирусной экспрессии Bac-to-Bac (Invitrogen).
Рекомбинантная трансферная плазмида pFastBacHTORF2 была использована для трансформации клеток
E. coli DH10Bac (Invitrogen), которые содержат бакуловирусный геном в виде большой плазмиды с устойчивостью к тетрациклину и вектор-помошник с устойчивостью к канамицину. Внутри E. coli DH10Bac ген ORF-2
из рекомбинантной трансферной плазмиды сайт-специфически перенесли в бакуловирусный геном с помощью
закодированной в плазмиде-помошнике транспозазы.
Колонии E. coli, содержащие рекомбинантную бакмиду
(Бак-ORF-2), отбирали в две стадии: первичный отбор при
помощи цветного теста и последующая проверка выбранных белых колоний методом ПЦР. Положительные в
ПЦР рекомбинантные клоны были использованы для выделения ДНК с последующим определением нуклеотидной
последовательности гена ORF-2 методом секвенирования.
Для дальнейшей работы был отобран клон, нуклеотидная последовательность гена ORF-2 в котором полностью
совпадала с последовательностью исходного штамма.
После выделения и очистки рекомбинантной ДНК
Бак-ORF-2 ее использовали для химической трансфекции
культуры клеток насекомых Sf-9 c помощью катионных
липосомных частиц CellFectin (Invitrogen). В концентрации 1…1,2х106 клеток/мл культуры клеток насекомых
инфицировали рекомбинантным бакуловирусом вируса
ядерного полиэдроза (AcORF-2) с множественностью
заражения 2 БОЕ/мл. Из полученных клонов готовили
матричные расплодки (Master seed) вирусов, определя-
18
ли их инфекционную активность, а также уровень
экспрессии рекомбинантного белка.
Подготовка образцов для ИФА. При изучении динамики накопления ORF-2 ЦВС-2b исследовали гомогенат клеток. Суспензию клеток центрифугировали 10 мин
при 3000 об/мин (4оС). После удаления супернатанта к
осадку клеток добавляли лизирующий буфер — ФБР,
содержащий 0,001 М фенилметилсульфонилфторида
и 1 % NP-40 (3 мл буфера на 1х107 клеток), замораживали при –70оС, оттаивали при комнатной температуре,
после чего проводили ультразвуковую дезинтеграцию, затем материал центрифугировали 30 мин при 10000 об/мин,
полученный антиген использовали для анализа. Контролем служил аналогично полученный материал из клеток, инфицированных AcNPV без вставки.
ИФА. Относительное содержание ORF-2 ЦВС-2b определяли в сэндвич-варианте ИФА на основе моноклональных антител 1G7 по величине сигнала А450 в ИФА при
одинаковом количестве суммарного белка в анализируемом материале. Оптимальным считали время культивирования, соответствующее получению максимального сигнала в ИФА.
Определение антигенной активности ORF-2. Для определения антигенной активности в качестве экспериментальной модели использовали морских свинок, которых
разбили на три группы (n=10). Животным первой группы
вводили внутримышечно в дозе 1,0 мл рекомбинантную
субъеденичную вакцину «ВЕРРЕС-ЦИРКО»; морских свинок второй группы иммунизировали экспериментальной
рекомбинантной субъеденичной вакциной на основе ORF-2
ЦВС-2b (вакцина «ORF-2 ЦВС-2b»). В качестве адъюванта в
данных вакцинах был использован высокомолекулярный
синтетический полиэлектролит, который в удобной форме предоставляет белок ORF-2 иммунокомпетентным клеткам хозяина, сохраняя его конформационную целостность.
Животных третьей (контрольной) группы не иммунизировали. Сыворотки крови исследовали в сэндвич-варианте
ИФА на основе моноклональных антител 1G7 для выявления специфических антител к капсидному белку ORF-2.
Все иммунологические исследования проводили в динамике, т. е. пробы сыворотки крови морских свинок
брали до вакцинации и на 21-е сутки после нее.
Результаты и обсуждение
Посредством ряда генно-инженерных методов были
получены конструкции, содержащие ген ORF-2 ЦВС-2b.
Указанные конструкции секвенировали для проверки
правильности открытой рамки считывания. При этом
руководствовались референтными последовательностями из базы данных Genbank.
В результате проведенной работы по оптимизации
условий получения рекомбинантного белка ORF-2 было
показано, что максимальное накопление антигена наблюдается через 96 ч после инфицирования (рис. 1). При
этом оптимальная клеточная линия для получения вируса — культура клеток Sf-9, антигена — Hi-five. Необходимо отметить, что большое значение при использовании бакуловирусной системы экспрессии, кроме
выбора клеточной линии, имеет выбор питательной
среды. Отсутствие балластных белков, высокая стабиль-
Получение рекомбинантного капсидного белка цирковируса свиней второго типа (генотип 2b)
в бакуловирусной системе и использование его для изготовления вакцины
(а)
(б)
Рис. 1. Культура клеток Hi!five неинфицированная (а)
и инфицированная (б) AcORF!2 (96 ч)
ность и, как следствие, возможность прогнозирования
результатов, являются ключевыми преимуществами
бессывороточных сред по сравнению с классическими,
требующими добавления сыворотки. Нами было установлено (данные не показаны), что при использовании
среды IPL-41 с добавлением 5…10 % эмбриональной
сыворотки были получены результаты (концентрация и
жизнеспособность клеток, а также уровень экспрессии
антигена), значительно уступающие таковым при использовании среды EX-CELL 420. Также стоит отметить,
что наличие таких антибиотиков, как гентамицин (и ряда других), может существенно снижать уровень экспрессии белка в клетках насекомых, поэтому в своей работе
мы полностью отказались от использования антибиотиков, что согласуется с последними рекомендациями ВОЗ.
Специфичность полученного белка определяли методом иммуноблоттинга с моноклональными антителами 1G7 (рис. 2). Полученный продукт обладает электрофоретической гомогенностью, имеет молекулярную
массу около 30 кДа и детектируется специфическими моноклональными антителами.
Как видно из представленных результатов (рис. 3), после вакцинации у всех иммунизированных животных был
Рис. 2. ДСН!электрофорез в 12%!м
ПААГ (а) и иммуноблоттинг
(б) рекомбинантного нуклеокапсид!
ного белка ORF!2 ЦВС!2b с монокло!
нальными антителами 1G7.
Маркер молекулярной массы (1);
лизаты клеток Hi!five, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом
с различными вставками (2, 3) и вставкой ORF!2 ЦВС!2b (4)
Рис. 3. Сравнительная оценка антигенной активности вакцин
«ORF!2 ЦВС!2b» и «ВЕРРЕС!ЦИРКО»
зафиксирован сопоставимый уровень антител (разница
в титре в среднем по группе была менее одного шага
разведения сыворотки).
Выводы
Таким образом, можно сделать вывод, что разработанная нами экспериментальная рекомбинантная субъеденичная вакцина на основе ORF-2 ЦВС-2b против цирковирусной болезни свиней по антигенной активности не
уступает вакцине «ВЕРРЕС-ЦИРКО». В дальнейшем планируется провести опыты по определению эффективности разработанной вакцины ORF-2 ЦВС-2b на свиньях.
1.
Орлянкин Б.Г., Мишин А.М. Цирковирусные болезни свиней // Свиноводство, 2010; 5: 50—53.
2.
Орлянкин Б.Г., Мишин А.М., Алипер Т.И. Специфическая профилактика цирковирусных болезней свиней // Свиноводство, 2011; 2: 67—68.
3.
Beach N.M., Meng X.J. Efficacy and future prospects of commercially available and experimental vaccines against porcine circovirus
type 2 (PCV2) // Virus Res., 2012; 164: 33—42.
4.
Blanchard et. al. Protection of swine against post-weaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) by porcine circovirus type 2 (PCV-2)
proteins // Vaccine, 2003; 21: 4565—4575.
5.
Fan H. et. al. Immunogenicity of empty capsids of porcine circovirus type 2 produced in insect cells // Vet. Res. Comm, 2007; 31: 487—496.
6.
Finsterbusch T., Mankertz A. Porcine circoviruses — small but
powerful // Virus Res., 2009; 143: 177—183.
7.
Gillespie J., Opriessnig T., Meng X.J. et al. Porcine circovirus type 2
and porcine circovirus-associated disease // J. Vet. Intern.Med., 2009; 23:
1151—1163.
8.
Khayat et al. The 2,3-angstrom strutrure of porcine circovirus
2 // J. Virol., 2011; 85 (15): 7856—7862.
9.
Koch G. et. аl. Immunogenic and protective properties of chicken
anemia virus protein expressed by baculovirus // Vaccine, 1995; 14: 763—770.
10.
Lekcharoensuk et al. Eppitope mapping of the major capsid
protein of type 2 porcine circovirus (PCV-2) by using chimeric PCV-1 and
PCV-2 // J. Virol., 2004; 78 (15): 8135—8145.
11.
Opriessnig T., Meng X.J., Halbur P.G. Porcine circovirus type
2-associated disease: update on current terminology, clinical manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies // J. Vet.
Diagn. Invest., 2007; 19: 591—615.
12.
Ramamoorthy S., Meng X.J. Porcine circoviruses: a manuscule
yet mammoth paradox // Anim. Health Res. Rev., 2008; 10: 1—20.
13.
Segales J., Allan G.M., Domingo M. Porcine circovirus diseases // Anim. Health Res. Rev., 2005; 6: 119—142.
14.
Vlak J.M., Keus R.J.A., Baculovirus expression system for production of viral vaccines // Adv Biotechnol Processes., 1990; 14: 91—128.
Summary
S.A. Raev, K.P. Alekseev, Е.V. Schemelkov, A.D. Bulgakov, M.I. Musienko, B.G. Orlyankin, O.A. Verkhovski, T.I. Aliper.
Development of Porcine Circovirus Genotype 2b Recombinant Capsid Protein and its' Employment in a Vaccine
Production. The method of porcine circovirus genotype 2b (PCV52b) recombinant capsid protein (rORF2) production with the
use of serum5free media was developed. The high antigenic activity of the vaccine based on rORF2 PCV52b was demonstrated.
The conclusion was made that rORF2 PCV52b might be used for the production of the vaccine against porcine circovirus disease.
19
РВЖ • СХЖ • № 3/2012
Библиография