МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (140), 2009 __________________________________________________________ Я. Н. Демурин, доктор биологических наук, профессор О. М. Борисенко, научный сотрудник ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии Россия, 350038, г. Краснодар, ул. Филатова, 17 тел.: (861)274-55-94, факс: (861)254-27-80 e-mail:jakdemurin@jandex.ru УСТОЙЧИВОСТЬ МУТАЦИИ ВЫСОКООЛЕИНОВОСТИ МАСЛА К ДЕЙСТВИЮ СУПРЕССОРА В СЕМЕНАХ ПОДСОЛНЕЧНИКА Ключевые слова: мутация высокоолеиновости, супрессор, семена, гибридологический анализ УДК 633.854.78:575.113 Введение. Изучение гибридных семян в скрещивании образцов мировой коллекции подсолнечника с высокоолеиновыми тестерами показало, что мутация Ol была доминантной в 59 % комбинаций скрещиваний, неполностью доминантной в 38 % и рецессивной в 3 % 1 . Наблюдаемое варьирование содержания олеиновой кислоты в отдельных семенах F1 от мутантного до нормального фенотипов объясняется как неполной пенетрантностью гена Ol в гетерозиготе при наличии супрессора 3 , так и потенциальной гетерозиготностью нормальных образцов по супрессору. Предполагается, что гомозиготное состояние супрессора может идентифицироваться и контролироваться только на генотипической среде OlOl гомозиготы, вызывая нормальный фенотип 4 . Наследование мутации высокоолеиновости в семьях F2 при скрещивании высокоолеиновых и супрессорных линий соответствовало различным схемам расщепления: моногенной рецессивной, моногенной доминантной, полигенной и без расщепления. Важно, что доля мутантных семян в популяции F2 положительно коррелировала с содержанием олеиновой кислоты в исходном семени F1 2 . У высокоолеинового мутанта в период активного биосинтеза запасного жира в созревающих семенах отсутствует активность фермента микросомальной олеат-десатуразы, катализирующего превращение олеиновой кислоты в линолевую 5 . Позже было установлено существенное уменьшение уровня накопления в клетках м-РНК этого фермента 6 . Следовательно, с молекулярно-генетической точки зрения, мутация высокоолеиновости вызывается нарушением регуляции транскрипции экспрессирующегося только в клетках зародыша семени ФАД2 гена 7 . Изучение эффекта супрессии мутации высокоолеиновости в ходе гибридологического анализа было целью данной работы. Материал и методы. В скрещиваниях использованы линии генетической коллекции подсолнечника ВНИИМК: высокоолеиновые ЛГ26 и ВК508; линолевые ЛГ28, 83HR4, RIL100, К1587 и ВИР721. Гибридологический анализ выполнен принятыми в лаборатории генетики ВНИИМК методами. Определение жирно-кислотного состава масла проводили с помощью газо-жидкостной хроматографии метиловых эфиров жирных кислот на хроматографе Хром-5 с пламенно ионизационным детектором. Показатель степени доминирования признака рассчитывали как отношение h/d, где h – отклонение фенотипа F1 от среднего (m) между ранжированными родителями P1 и P2, а d – половина разности между родителями P1 и P2 или модуль разности любого родителя и m. Результаты и обсуждение. В рамках международной программы изучения генетики мутации высокоолеиновости у подсолнечника нами была получена из INRA (г. Монпелье, Франция) в 2003 г. рекомбинантная инбредная линия RIL100. Эта линия представляла собой F6 (I5) поколение скрещивания 83HR4×RHA345. Главной особенностью RIL100 являлось необычное сочетание мутации высокоолеиновости, идентифицируемой по молекулярному маркеру, с нормальным низкоолеиновым фенотипом. В задачи нашей работы входила проверка присутствия Ol мутации у RIL100 путѐм гибридологического анализа. В скрещиваниях участвовали три нормальные по жирно-кислотному составу линии: RIL100 (40 % олеиновой кислоты), 83HR4 (42 %) и ЛГ28 (27 %). Все семена F1 двух комбинаций скрещиваний RIL100×83HR4 и ЛГ28×RIL100 обладали нормальным фенотипом. У семян F2 от скрещивания RIL100×83HR4 и одной семьи ЛГ28×RIL100 наблюдались только нормальные фенотипы (табл. 1). В другой семье ЛГ28×RIL100 обнаружено 9 мутантных семян (80-92 % олеиновой кислоты) из 120 штук. Таблица 1 – Наследование мутации высокоолеиновости в F2 в скрещиваниях с линией RIL100 Скрещивание RIL100×83HR4 ЛГ28×RIL100 ВНИИМК, Краснодар, 2003 г. Число семян F2, шт. нормальных мутантных (27-71 % С18:1*) (77-93 % С18:1) 30 0 80 0 111 9 * - С18:1 – олеиновая кислота Факт появления рекомбинантных высокоолеиновых семян в F2 при скрещивании обычных по жирно-кислотному составу линий был обнаружен впервые и доказывает наличие мутации Ol у RIL100 в гипостатическом состоянии. Данные гибридологического анализа подтвердили предположение, высказанное французскими учѐными в молекулярно-генетическом исследовании мутации 4 . Второй аспект изучения особенностей супрессорного эффекта был связан с проведением гибридологического анализа мутации в скрещивании с предварительно отобранными из мировой коллекции подсолнечника линиями, существенно снижающими содержание олеиновой кислоты у гетерозиготных семян. Так, в скрещивании высокоолеиновой ВК508 с двумя супрессорными линиями К1587 и ВИР721 в F1 доминировал признак нормального содержания олеиновой кислоты со значениями h/d 0,05 и 0,25. Этот факт подтвердил ингибиторный эффект супрессорных линий. Тем не менее, высокоолеиновая ЛГ26 в скрещивании с супрессорами показала полное доминирование мутации в F1 с h/d, равным 1,12 и 0,96 (табл. 2). Таблица 2 – Степень доминирования высокоолеиновости в семенах F1 ВНИИМК, Краснодар, 2003 г. Скрещивание K1587 ВК508 ВИР721 ВК508 K1587 ЛГ26 ВИР721 ЛГ26 НСР05 Содержание олеиновой кислоты, % (n = 20) ♀ F1 ♂ 53 71 91 32 54 91 53 89 87 32 86 87 4 8 1 Степень доминирования, h/d НСР05 -0,05 -0,25 1,12 0,96 5 6 2 3 Смена доминирования признака в различных скрещиваниях F1 может объясняться взаимодействием супрессора и мутации Ol по типу доминантного эпистаза. Более парадоксальным представляется феномен отсутствия единообразия гибридов F1, заключающийся в существенном варьировании содержания олеиновой кислоты в отдельных семенах по всем фенотипическим классам от нормального до мутантного для двух первых комбинаций скрещиваний. Очевидно, что дигетерозиготное состояние мутации Ol и супрессора может сопровождаться неопределѐнностью значений признака у семян F1, тогда как гомозигота по супрессору приводит во всех случаях к нормальному фенотипу (RIL100). В шести семьях F2 с участием ВК508 наблюдалось дигенное расщепление на фенотипические классы нормальный и высокоолеиновый в модельном отношении 13 (9 Ol-Sup-, 3 olol Sup-, 1 olol supsup): 3 (Ol- supsup). Кроме того, в одной корзинке все семена оказались фенотипически нормальными. При скрещивании ЛГ26 с супрессорами, однако имело место моногенное расщепление 1 нормальный : 3 высокоолеиновых (табл. 3). Таблица 3 – Расщепление в F2 по мутации высокоолеиновости масла в отдельных семенах при скрещивании с супрессорными линиями Скрещивание ВИР721×ВК508 К1587×ВК508 ВИР721×ЛГ26 К1587×ЛГ26 Фенотип F1, % 29 35 35 72 85 55 70 85 85 85 85 85 85 Число семян F2, шт. норма мутация 40 0 34 6 37 3 34 6 33 7 33 7 30 10 10 30 15 25 5 35 14 26 8 32 9 31 ВНИИМК, Краснодар, 2003-2004 гг. χ2 Доля мутантов 13:3 1:3 0,00 0,15 0,37* 76,80 0,08 3,32* 97,20 0,15 0,37* 76,80 0,18 0,04* 70,53 0,18 0,04* 70,53 0,25 1,03* 53,33 0,75 83,08 0,00* 0,63 50,25 3,33* 0,88 124,10 3,33* 0,65 56,16 2,13* 0,80 98,50 0,53* 0,78 90,62 0,13* * – р > 0,05, χ2st = 3,84 В полевых условиях 2005 г. из отдельных семян F2 с известным жирно-кислотным составом получено 79 семей F3 в трѐх комбинациях скрещиваний ВИР721×ЛГ26, К1587×ВК508 и ВИР721×ВК508. В каждой корзинке проанализировано по 10 отдельных семян для оценки гомогенности потомства (табл. 4). Первое скрещивание ВИР721×ЛГ26 характеризовалось в F3 классическим типом моногенного наследования 1:2:1 по числу нормальных, расщепляющихся и мутантных семей. Кроме того, мутантные семена F2 дали потомство в F3 двух видов: или мутантное, или расщепляющееся, тогда как нормальные семена F2 – только нормальное. Следовательно, мутация Ol наследовалась в F3, как моногенный доминантный признак. Во втором скрещивании К1587×ВК508 не обнаружено ни одной гомогенной семьи F3 с мутантными семенами. При этом расщепление в F2 на 30 нормальных : 10 мутантных соответствовало схеме 13:3, согласно которой класс мутантных семян должен давать в самоопылѐнном потомстве два вида семей F3 – мутантные и расщепляющиеся в отношении 1:2. Из шести полученных семей F3 четыре показали расщепление, а две были гомогенными, но с нормальными семенами. Следовательно, в F3 не удалось получить рекомбинантный гомозиготный мутантный фенотип после пребывания мутации Ol в гетерозиготном сочетании с супрессором. Таблица 4 – Гомогенность семей F3 по мутации высокоолеиновости масла в отдельных семенах при скрещивании с супрессорными линиями Скрещивание ВИР721×ЛГ26 К1587×ВК508 ВИР721×ВК508 нормальных, без расщепления 7 18 25 ВНИИМК, Краснодар, 2005 г. Число семей F3, шт. мутантных, расщепляющихся всего без расщепления 15 7 29 7 0 25 0 0 25 В третьем скрещивании ВИР721×ВК508, начиная с нормального cемени F1, у 40 нормальных семян F2 и 25 гомогенных семей F3 с 250 нормальными семенами наблюдалось полное отсутствие семян с мутантным фенотипом. Это "исчезновение" мутации не может быть отнесено к артефакту за счѐт отсутствия гибридизации отдельного трубчатого цветка корзинки материнской формы ВИР721 и его самоопыления. Прямым доказательством успешной гибридизации явилось моногибридное расщепление в F2 по гену антоциановой окраски всего растения T (121 антоциановых : 36 зелѐных, χ2(3:1)=0,36; р > 0,05) и дигибридное расщепление МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 1 (140), 2009 __________________________________________________________ по гену T и гену-локализатору антоциановой окраски в лепестках язычковых цветков G (78 антоциановых : 79 не антоциановых, χ2(9:7)=2,75; р > 0,05). Рецессивные аллели этих маркерных генов находились у отцовской формы ВК508. Заключение. В результате гибридологического анализа установлено наличие у нормальной по жирно-кислотному составу линии RIL100 мутации Ol в гипостатическом состоянии. При скрещивании нормальных линий ЛГ28×RIL100 в F2 обнаружены рекомбинантные высокоолеиновые фенотипы с частотой около 8 %. Наследование мутации высокоолеиновости в скрещивании линии ЛГ26 с супрессорами К1587 и ВИР721 соответствовало моногенной доминантной схеме в F1, F2 и F3. Это явление указывает на устойчивость мутации Ol в генотипической среде линии ЛГ26 к действию супрессора. С другой стороны, наследование мутации высокоолеиновости в скрещивании линии ВК508 с супрессорами в F1 и F2 описывалось дигенной моделью по типу доминантного эпистаза Sup над Ol в отношении 13 нормальных : 3 мутантных. Комбинация К1587×ВК508 показала в F3 отсутствие гомозиготных высокоолеиновых семей, а ВИР721×ВК508 – отсутствие не только гомозиготных высокоолеиновых, но и расщепляющихся семей, т.е. полное исчезновение мутантных семян. Подобное явление реверсии признака к дикому типу, вероятно, может объясняться репарационным механизмом действия супрессора. Благодарности. Данная работа поддержана грантом № 08-04-99109 регионального конкурса РФФИ. Литература 1. Демурин, Я. Н. Поиск супрессорных генотипов по мутации высокоолеиновости масла семян подсолнечника / Я. Н. Демурин, О. М. Борисенко, С. Г. Ефименко // НТБ ВНИИМК, Краснодар, 2004. – Вып. 2 (131). – С.31-34. 2. Демурин, Я. Н. Наследование мутации высокоолеиновости в семенах F2 у подсолнечника / Я. Н. Демурин, О. М. Борисенко // Наука Кубани. – 2005. – № 4. – С. 108-111. 3. Demurin, Ya. Unstable expression of Ol gene for high oleic acid content in sunflower seeds / Ya. Demurin, D. Skoric // In: Proc. 14th Int. Sunflower Conf., Beijing. Shenyang, China, 12-20 June 1996. – 1996. – Р. 145150. 4. Lacombe, S. An oleat desaturase and a suppressor loci direct high oleic acid content of sunflower (Helianthus annuus L.) oil in the Pervenets mutant / S. Lacombe, F. Kaan, S. Leger, A. Berville // Life Sciences (Paris). – 2001. – 324. – Р. 1-7. 5. Garces, R. In vitro oleate desaturase in developing sunflower seeds / R. Garces, M. Mancha // Phytochemistry. – 1991. – Vol. 30. – No.7. – Р. 2127-2130. 6. Lacombe, S. Analysis of desaturase transcript accumulation in normal and in high oleic oil sunflower development seeds / S. Lacombe, A. Berville // In: Proc. 15th Int. Sunflower Conf., 12-15 June 2000, Toulouse, France: A1-A6. 7. Martinez-Rivas, J. M. Spatial and temporal regulation of three different microsomal oleat desaturase genes (FAD2) from normal-type and high oleic varieties of sunflower (Helianthus annuus L.) / J. M. Martinez-Rivas, P. Sperling, W. Luhs, E. Heinz // Molecular Breeding. – 2001. – 8. – Р. 159-168.