Слайд 1 Исследования по бесплодию 7. Дифференцировка
реклама
Слайд 1 Исследования по бесплодию 7. Дифференцировка гамет из эмбриональных и «взрослых» стволовых человека Ana I. Marques-Mari, д.м.н. Валентийское отделение Испанского банка стволовых клеток Научно-исследовательский центр Принц Фелипе, Валенсия, Испания Предлагаем Вашему вниманию главу …. Эта глава называется «Дифференцировка гамет из эмбриональных и «взрослых» стволовых клеток человека» Автор — д.м.н. Ana I. Marques-Mari Слайд 2 Цели обучения Понять потенциал дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека и «взрослых» или соматических стволовых клеток Узнать о различных стратегиях, используемых для дифференцировки гамет и герминальных клеток Понять основные проблемы при проведении дифференцировки in vitro Узнать о современных достижениях в области дифференцировки гамет из стволовых клеток: • Из мышиных и человеческих эмбриональных стволовых клеток • Из мышиных и человеческих соматических стволовых клеток И, наконец, узнать о будущем синтетически генерируемых гамет и их возможном применении в репродуктивной медицине. В этой главе поставлены следующие цели обучения: Понять потенциал дифференцировки эмбриональных стволовых клеток и взрослых или соматических стволовых клеток Узнать о различных стратегиях, используемых для дифференцировки гамет и герминальных клеток Понять основные проблемы проведения дифференцировки in vitro Узнать о современных достижениях в области дифференцировки гамет из стволовых клеток: • Из мышиных и человеческих эмбриональных стволовых клеток • Из мышиных и человеческих соматических стволовых клеток И, наконец, узнать о будущем синтетически генерируемых гамет и их возможном применении в репродуктивной медицине. Слайд 3 Возможности дифференцировки • Тотипотентнные: o Зиготы – бластомеры • Плюрипотентные o Эмбриональные стволовые клетки o Герминативные стволовые клетки o Индуцированные плюрипотентные клетки • Мультипотентные: o Соматические стволовые клетки Стволовые клетки произвели революцию в научном сообществе из-за потенциальной возможности их применения в различных областях. В зависимости от их дифференцировки стволовые клетки по своим возможностям классифицируются как: тотипотентные, когда из них может развиться весь организм, плюрипотентные, когда они могут давать начало всем типам клеток, кроме экстраэмбриональных тканей, таких как плацента, и мультипотентные, когда способность к дифференцировке сводится к ограниченному типу клеток. В соответствующих условиях культивирования можно индуцировать дифференцировку недифференцированных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в различные типы клеток всех трех зародышевых листков: мезодермы, энтодермы и эктодермы, а также половых клеток: яйцеклеток и сперматозоидов. Эктодерма Мезодерма Эндодерма Половые клетки New Mesoderm, ectoderm and endoderm figures http://www.isciii.es/htdocs/terapia/pdf/Documento_Deposito_VAL_10B.pdf New Germ cells figure source: http://en.wikipedia.org/wiki/Stages_of_human_development source: Слайд 4 Образование зародышевой линии Образование развития зародышевой линии у человека in vivo во время эмбрионального ↓ Важный этап: мейоз и эпигенетические модификации Во время эмбрионального развития в условиях in vivo образование зародышевой линии происходит в несколько этапов, которые определяются различными «молекулярными ключами», индуцируются и регулируются разными факторами роста, белками и молекулами. У людей примордиальные герминальные клетки берут начало из группы клеток, расположенных в эпибласте, под воздействием BMP4, 2 и 8b, секретируемых экстраэмбриональной эктодермой. Эти клетки начинают мигрировать в сторону половых гребней. Они попадают в примитивные половые железы и начинают размножаться путем митоза. В этот момент мужские и женские половые клетки развиваются по-разному, что обусловлено окружающими условиями: мужские половые клетки останавливаются на стадии митоза, в то время как женские половые клетки доходят до стадии мейоза I, а затем также останавливаются. Постнатально обе популяции клеток продолжат мейоз в процессе своего созревания, становясь зрелыми гаметами. Список литературы: -A.I. Marques-Mari, O. Lacham-Kaplan, J.V. Medrano, A. Pellicer and C. Simón. Differentiation of germ cells and gametes from stem cells. Human Reproduction Update 2009; 15 (3):379-390. События Ключевые молекулы Индукторы Специализация первичных герминальных клеток Soluble…. Градиент растворимых белков из половых гребней Migration Миграция GSC colonization…… Колонизация половых гребней герминальными стволовыми клетками Meiosis Мейоз Arrest in G0 Блок на стадии G0 Arrest in MI Блок на стадии MI POSTNATAL Постнатально Mature gametes Зрелые гаметы Events Molecular keys Inducers PGС specification New figure source: Adapted from: Figure1 Marques-Mari et al., Hum Rep Update 2009; 15(3):379-390 Слайд 5 Образование зародышевой линии Чтобы генерировать половые клетки in vitro и получить более зрелые и функциональные гаметы, имитируют процессы, происходящие in vivo Когда мы пытаемся получить герминальные клетки в культуре ЭСК, мы стараемся следовать тем же этапам, которые происходят в условиях in vivo, но мейоз и созревание гамет - очень деликатные процессы, в которых участвуют многие факторы. Метилирование и деметилирование импринтированных локусов в полученных гаметах должны приобрести соответствующий эпигенетический характер, и процесс прохождения мейоза in vitro требует усовершенствования. Список литературы: -A.I. Marques-Mari, O. Lacham-Kaplan, J.V. Medrano, A. Pellicer and C. Simón. Differentiation of germ cells and gametes from stem cells. Human Reproduction Update 2009; 15 (3):379-390. ICM SC lineages GC lineages Methylation erased Methylation maintained migration PGСs in GR maturation Fertilization Establishment of different epigenetic patterns Maintenance of methylation patterns ESC lines Sperm eggs Somatic imprinting? Precursors of GCs Establishment of appropriate epigenetic patterns? Correct methylation Внутренняя клеточная масса Клеточный росток стволовых клеток Клеточный росток герминальных клеток Метилирование исчезает Метилирование сохраняется Миграция Примордиальные герминальные клетки в половых гребнях Созревание Оплодотворение Создание различных паттернов эпигенетической наследственности Поддержание характера метилирования Линии ЭСК Сперматозоиды ооциты Соматический импритинг? Предшественники герминальных клеток Создание конкретных паттернов эпигенетической наследственности? Поддержание maintenance? Recipient female Healthy offspring? правильного характера метилирования Женщинареципиент Здоровое потомство? New figure source: Adapted from: Figure 2 Marques-Mari et al., Hum Rep Update 2009; 15(3):379-390 Слайд 6 Стратегии по дифференцировке герминальных клеток из ЭСК в условиях in vitro Спонтанная дифференцировка прикрепленных колоний или через стадию эмбриоидных телец после удаления факторов, поддерживающих плюрипотентность, таких как основной ФРФ и ЛИФ Добавление факторов роста и других компонентов, таких как BMP4 или ретиноевая кислота Совместное культивирование с кондиционированными средами или соматическими клетками Предварительный отбор стволовых клеток, чтобы направить их по пути дифференцировки в герминальные клетки, или трансфекция с меченым геном, чтобы облегчить их обнаружение. Трансплантация в живой организм Для дифференцировки герминальных клеток из ЭСК используют несколько основных стратегий, которые считаются более пластичными в плане дифференцировки, чем соматические клетки: • Спонтанная дифференцировка при длительном культивировании прикрепленных колоний или в суспензии через стадию эмбриоидных телец после удаления факторов, поддерживающих плюрипотентность, таких как основной фактор роста фибробластов и лейкемия-ингибирующего фактор (ЛИФ). Эмбриоидные тельца представляют собой круглые трехмерные структуры, которые образуются в результате агрегации ЭСК в суспензии. Они содержат клетки всех трех зародышевых листков, но также могут дифференцироваться в клетки, подобные герминальным. • Добавление факторов роста и других компонентов, таких как BMP4 или ретиноевой кислоты. • Совместное культивирование с кондиционированными средами или соматическими клетками. • Предварительный отбор стволовых клеток, чтобы направить их по пути дифференцировки в герминальные клетки, или трансфекция с меченым геном, чтобы облегчить их обнаружение. • Трансплантация в живой организм, особенно для дифференцировки мужских половых клеток. Очень часто для получения дифференцировки сочетают нескольких подходов. EBs New Figure source: http://www.isciii.es/htdocs/terapia/pdf/Documento_Deposito_VAL_9.pdf Слайд 7 Современные достижения в области половых клеток из стволовых клеток cell Дифференцировка герминальных клеток из эмбриональных стволовых клеток Authors Авторы Publication date Дата публикации Source of SC Источник стволовых клеток Cell type…. Тип полученных клеток Viable offspring Жизнеспособное потомство mESC Мышиные ЭСК hESC ЭСК человека Oocytes Ооциты PGS in vitro…. Примордиальные стволовые клетки in vitro, сперматозоиды in vivo после трансплантации Spermatides Сперматиды Oocytes (although…. Ооциты, хотя в них Germ differentiation…. дифференцировки Immature oocytes Ovarian follicles Sperm Oocyte-like cells PGS NT PB OF FD PGS присутствовала экспрессия TEKT1 Незрелые ооциты Фолликулы в яичнике Сперматозоиды Ооцит-подобные клетки ПГК Не изучалось Партеногенетическая бластоциста Оплодотворение ооцитов Дегенерация фолликулов Примордиальные герминальные клетки На слайде представлены наиболее значимые работы по дифференцировке ЭСК в мужские и женские половые клетки человека. Первая работа была опубликована в 2003 году, и с тех пор многие группы исследователей разработали различные стратегии по дифференцировке гамет. Слайд 8 Спонтанная дифференцировка прикрепленных колоний Hübner и соавт. Science 2003; 300: 1251-1256 o Образование фолликулоподобных структур, содержащих ооцитподобные клетки. Присутствие маркеров мейоза и образование псевобластоцисты путем партеногенеза Novak и соавт. Stem Cells 2006; 24: 1931-1936 o Отсутствие некоторых мейотических белков, таких как SCP1 и SCP2. Не было выявлено никаких доказательств конъюгации хромосом: нарушение мейоза. Одна из стратегий, используемых для дифференцировки в герминальные клетки, является спонтанная дифференцировка прикрепленных колоний или культивирование на монослое. После индукции дифференцировки Hübner и соавторы наблюдали образование фолликулоподобных структур в этих культурах. Из фолликулов в конечном итоге выделялись большие клетки, похожие на ооциты. Многие из них спонтанно активировать путем партеногенеза и формировали псевобластоцисты, рост которых останавливался на ранних стадиях. С помощью ПЦР-анализа в этих клетках были обнаружены специфические маркеры ооцитов, такие как Figa, маркеры прозрачной оболочки, такие как ZP1, 2 и 3, и маркеры мейоза, такие как SCP3. Novak и соавт. повторили эксперимент и обнаружили, что, несмотря на наличие мейотических белков, в частности SCP3, в ооцитоподобных клетках не хватало других мейотических белков, таких как SCP1 и SCP2. Кроме того, не было выявлено никаких доказательств конъюгации хромосом. Список литературы: -Hübner K, Fuhrmann G, Christenson LK, Kehler J, Reinbold R, De La Fuente R, Wood J, Strauss JF III, Boiani M, Scholer HR. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science 2003; 300:1251-1256. -Novak I, Lightfoot DA, Wang H, Eriksson A, Mahdy E, Hoog C. Mouse embryonic stem cells form follicle-like ovarian structures but do not progress through meiosis. Stem Cells 2006; 24:1931-1936. Слайд 9 Дифференцировка через стадию добавлением факторов роста эмбриоидных телец с Toyooka и соавт. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:11457–11462 o Образование эмбриоидных телец и добавление ростовых факторов. Получение ПГК in vitro, и сперматозоидов in vivo при пересадке химически стерилизованным мышам Geijsen и соавт. Nature 2004;427:148–154. o Получили гаплоидные сперматиды в условиях in vitro и оплодотворили ими нормальные ооциты, в результате чего получили бластоцисты. О дальнейшем развитии этих структур не сообщалось. Toyooka и соавт. в 2003 г. и Geijsen и соавт. в 2004 году дифференцировали мышиные ЭСК в мужские герминальные клетки через стадию эмбриоидных телец в сочетании с добавлением факторов роста. Группа Toyooka добилась получения примордиальных герминальных клеток в условиях in vitro, а при пересадке этих клеток стерилизованным мышам удалось получить сперматозоиды. Geijsen и соавт. получили гаплоидные круглые сперматиды в условиях in vitro и оплодотворили ими нормальные ооциты, в результате чего получили бластоцисты. О дальнейшем развитии этих структур не сообщалось, вероятно, они остановились в развитии и дегенерировали. Список литературы: -Toyooka Y, Tsunekawa N, Akasu R, Noce T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc Natl Acad Sci USA 2003;100:11457–11462. -Geijsen N, Horoschak M, Kim K, Gribnau J, Eggan K, Daley GQ. Derivation of embryonic germ cells and male gametes from embryonic stem cells. Nature 2004;427:148–154. Слайд 10 Дифференцировка через стадию эмбриоидных телец с совместным культивированием с кондиционированными средами или соматическими клетками Lacham-Kaplan и соавт. Stem Cells 2006;24:266–273. o Совместное культивирование эмбриоидных телец с кондиционированными средами для получения ооцит-подобных клеток на ранних стадиях развития. Отсутствие блестящей оболочки, но экспрессия Figa и ZP3 Qing и соавт. Differentiation 2007;75:902–911. o Совместное культивирование эмбриоидных телец на клетках гранулезы яичников. Присутствие премейотических маркеров (Mvh), мейотических маркеров (SCP3) и постмейотических маркеров (GDF9), а также ооцитспецифических маркеров (Figa и ZP1-3). Lacham-Kaplan и соавт. и Qing и соавт. объединили технологии формирования эмбриоидных телец и совместное культивирование с кондиционированными средами в первом случае и с соматическими клетками во втором случае. Lacham- Kaplan дифференцировали мышиные ЭСК в структуры, похожие на ооциты, экспрессирующие характерные маркеры, такие как Figa и ZP3 (но не ZP1-2). Отсутствие блестящей оболочки и характеристики клеток указывали на то, что полученные клетки были ооцитами на ранней стадии. Qing и соавт. культивировали эмбриоидные тельца на клетках гранулезы яичников. После этого они обнаружили премейотические маркеры (Mvh), мейотические маркеры (SCP3) и постмейотические маркеры (GDF9), а также ооцит-специфические маркеры, такие как Figa и ZP1-3. Список литературы: -Lacham-Kaplan O, Chy H, Trounson A. Testicular cell conditioned medium supports differentiation of embryonic stem cells into ovarian structures containing oocytes. Stem Cells 2006;24:266–273. -Qing T, Shi Y, Qin H, Ye X, Wei W, Liu H, Ding M, Deng H. Induction of oocyte-like cells from mouse embryonic stem cells by co-culture with ovarian granulosa cells. Differentiation 2007;75:902–911. Слайд 11 Трансфекция линий ЭСК + добавление факторов роста стадия эмбриоидных телец + Nayernia и соавт. Dev Cell 2006;11:125–132. o получение мужских гамет, способных производить жизнеспособное потомство o трансфекция мышиных ЭСК мечеными генами, связанными с дифференцировкой по пути сперматогониальных герминальных клеток o подвижные меченые клетки были выпущены в среду после добавления ретиноевой кислоты, а затем трансплантированы в яички стерильных мышей o были получены гаплоидные сперматозоиды, которыми оплодотворили ооциты, и в итоге родились 12 животных mouse Мышь ESCs ЭСК Retinoic acid Ретиноевая кислота Fig. Рис. Nayernia и соавт. в 2006 году получили мужских гаметы, способные производить жизнеспособное потомство. Дизайн их эксперимента включал трансфекцию мышиных ЭСК модифицированными генами, связанными с дифференцировкой по пути сперматогониальных герминальных клеток, чтобы облегчить их обнаружение и выделение, когда эти гены активизируются. Дифференцировка также была индуцирована посредством формирования эмбриоидных телец, и включала добавление ретиноевой кислоты. Клетки с флуоресцентными метками, обладающие подвижностью, были выпущены в среду. Эти клетки были подвергнуты анализу, и после добавления ретиноевой кислоты они экспрессировали мейотические и постмейотические маркеры. Эти клетки были трансплантированы в яички стерильных мышей, и были получены гаплоидные сперматозоиды. Этими клетками оплодотворили нормальные ооциты, и в итоге родились 12 животных, хотя они и умерли преждевременно, вероятно, из-за нарушения импринтинга в полученных гаметах. Список литературы: -Nayernia K, Nolte J, Michelmann HW, Lee JH, Rathsack K, Drusenheimer N, Dev A, Wulf G, Ehrmann IE, Elliott DJ, Vera Okpanyi, Ulrich Zechner, Thomas Haaf, Andreas Meinhardt and Wolfgang Engel. In vitro-differentiated embryonic stem cells give rise to male gametes that can generate offspring mice. Dev Cell 2006;11:125–132. Слайд 12 Дифференцировка ЭСК человека посредством эмбриоидных телец и эмбриоидных телец с добавление факторов роста Clark и соавт. Hum Mol Genet 2004;13:727–739. o Спонтанная дифференцировка путем формирования эмбриоидных телец с получением герминальных клеток. Установка последовательности экспрессии генов во время дифференцировки человеческих ЭСК в герминальные клетки Kee и соавт. Stem Cells Dev 2006;15:831–837. o Добавление BMP4, 7 и 8 в среду с эмбриоидными тельцами увеличивает экспрессию VASA Premeiotic Developement ESCs Postmeiotic Developement Primordial germ cells Embryonic stem cells Specialization Migration colonization Премейотическое развитие ЭСК Постмейотическое развитие Первичные герминальные клетки Эмбриональные стволовые клетки Специализация Миграция Колонизация Mitosis Meiosis Differentiation Gonocytes oogonia Spermatocytes Sperm cells Оocytes Mature oocytes Митоз Мейоз Дифференцировка Гоноциты Оогонии Сперматоциты Сперматозоиды ооциты Зрелые ооциты Первая работа о дифференцировке ЭСК в линию герминальных клеток была опубликована в 2004 году Clark и соавт. Путем формирования эмбриоидных телец они получили клетки, подобные герминальным. С помощью ПЦР-анализа они установили последовательность экспрессии генов во время дифференцировки человеческих ЭСК в герминальные клетки в уcловиях in vitro и выявили зависимость экспрессии различных генов от стадий развития: миграции, колонизации, митоза, мейоза и т.д. Кроме того, они обнаружили, что недифференцированные ЭСК также экспрессируют некоторые ранние маркеры герминальных клеток, такие как DAZ, Stellar или С-Kit, но другие гены, такие как VASA, SCP3 или GDF9, не экспрессировались. В более поздней работе та же группа исследователей показала, что добавление нескольких факторов роста, таких как BMP4, 7 и 8, увеличивает процент VASAпозитивных клеток, специфического маркера герминальной линии, и, следовательно, увеличивает количество возможных герминальных клеток. Список литературы: -Clark AT, Bodnar MS, Fox M, Abeyta MJ, Firpo MT, Pera RA. Spontaneous differentiation of germ cells from human embryonic stem cells in vitro. Hum Mol Genet 2004;13:727–739. -Kee K, Gonsalves JM, Clark AT, Pera RA. Bone morphogenetic proteins induce germ cell differentiation from human embryonic stem cells. Stem Cells Dev 2006;15:831–837. Слайд 13 Дифференцировка ЭСК человека при культивировании с соматическими клетками совместном Park и соавт. Stem Cells 2009; 27:783 -795. o Совместное культивирование ЭСК человека с фетальными половыми клетками для получения ПГК o Они также получили ПГК из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, хотя и менее эффективно, чем из ЭСК. o Соседняя локализация маркеров c-Kit/SSEA1 с FACS использовалась в качестве индикатора принадлежности герминальным клеткам o В полученных клетках начался процесс стирания импринтинга, характерный для герминальных клеток Первичные герминальные клетки из эмбриональных стволовых клеток человка PGcs from iPS Первичные герминальные клетки из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток VASA in c-Kit/SSEA1 VASA в клетках cPGcs from hESC cells Kit/SSEA1 Совсем недавно были опубликованы еще две работы, касающиеся дифференцировки ЭСК в герминальные клетки. Park и соавт. сообщили о получении примордиальных герминальных клеток путем совместного культивирования ЭСК человека с фетальными половыми клетками. Они также получили примордиальные герминальные клетки из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, хотя и менее эффективно, чем из ЭСК. В полученных клетках начался процесс стирания импринтинга, характерный для герминальных клеток в первом триместре эмбрионального развития in vivo. В качестве индикатора принадлежности герминальным клеткам была использована оценка соседней локализации c-Kit/SSEA1 с FACS, а также с VASA. Список литераттуры: -Tae Sub Park, Zoran Galic, Anne E. Conway, Anne Lindgren, Benjamin J. van Handel, Mattias Magnusson, Laura Richter, Michael A. Teitell, Hanna K. A. Mikkola, William E. Lowry, Kathrin Plath and Amander T. Clark. Derivation of Primordial Germ Cells from Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells Is Significantly Improved by Coculture with Human Fetal Gonadal Cells. Stem Cells 2009; 27:783 -795. Слайд 14 Трансфекция линий ЭСК человека роста и добавление факторов Nayernia и соавт. Stem cells and Dev 2009; doi:10.1089/scd.2009.0063. Дифференцировка мужских герминальных стволовых клеток из ЭСК человека, экспрессирующих мейотические и постмейотические маркеры Только клетки, полученные из ЭСК человека с кариотипом XY (но не ХХ) смогли вступить в условиях in vitro в мейоз и превратиться в гаплоидные подвижные клетки, подобные сперматозоидам Premeiotic Meiotic Postmeiotic Fig. Премейотические Мейотические Постмейотические Рис. Nayernia и соавт. добились дифференцировки мужских герминальных стволовых клеток из ЭСК человека за счет трансфекции конструкции, связанной с дифференцировкой по сперматогониальному пути. Дифференцировка была индуцирована в монослое в течение трех недель без добавления факторов роста фибробластов. После этого авторы добавили ретиноевую кислоту, изолировали клетки, меченые FACS, и культивировали их дальше с добавлением нескольких экзогенных факторов. Клетки экспрессировали мейотические и постмейотические маркеры, указывающие на созревания гаплоидных мужских гамет. Эти клетки способны были вступать в мейоз и превращаться в условиях in vitro в гаплоидные подвижные клетки, подобные сперматозоидам. Список литературы: -Nayernia K, Lee JH, Lako M, Armstrong L, Herbert M, Li M, Engel W, Elliott D, Stojkovic M, Parrington J, Murdoch A, Strachan T, Zhang X. In Vitro Derivation of Human Sperm from Embryonic Stem Cells. Stem cells and Development 2009; doi:10.1089/scd.2009.0063. Слайд 15 Современное состояние проблемы герминальных клеток из стволовых cell Дифференцировка герминальных клеток из соматических стволовых клеток Authors Авторы Publication date Дата публикации Source of SC Источник стволовых клеток Cell type…. Тип полученных клеток Viable offspring Жизнеспособное потомство mGSCs Мышиные герминальные стволовые клетки Ovarian mGSCs Мышиные герминальные стволовые клетки в ячинике Fetal porcine skin Фетальная кожа свиньи mGSCs in OSE Мышиные герминальные Germ differentiation…. дифференцировки стволовые клетки на поверхности яичников mGSCs in female BM Мышиные and PB герминальные стволовые клетки в женском костном мозге и периферической крови mGSCs in BM Мышиные герминальные стволовые клетки в костном мозге hGSCs in BM Герминальные стволовые клетки человека в костном мозге Oocytes Ооциты Germ cells. Герминальные клетки Spermatogonia Сперматогонии Oocytes (although…. Ооциты, хотя в них присутствовала экспрессия TEKT1 Ovarian follicles Фолликулы в яичнике after…. после трансплантации Follicles with oocytes Фолликулы с after…. ооцитами после трансплантации NT Не изучалось PB Партеногенетическая бластоциста На слайде представлены наиболее значимые работы по дифференцировке мужских и женских половых клеток из соматических или «взрослых» стволовых клеток. Только одна из них посвящена человеческим клеткам. Эта работа была опубликована лишь в сборнике абстрактов, никаких обзорных работ по этому исследованию опубликовано не было. Первое исследование было опубликовано в 2004 году. Как мы видим, источники стволовых клеток очень разнообразны, начиная от яичников и заканчивая костным мозгом, кровью и кожей. Слайд 16 Герминальные стволовые периферической крови клетки в костном мозге и Johnson и соавт. Nature 2004; 428:145–150. Предположили, что в яичниках взрослых мышей существуют герминальные стволовые клетки, которые размножаются и восстанавливают фолликулярный пул: они присутствие клеток VASA на поверхности яичника Johnson и соавт. Cell 2005;122:303–315. Предположили, что герминальные стволовые клетки находятся в костном мозге: экспрессия маркеров генрминальной линии. Трансплантация костного мозга позволяет восполнить фолликулярный резерв. Предполагаемые герминальные клетки в периферической крови: переливание крови может способствовать образованию ооцитов Аргументы против этой гипотезы: Byskov и соавт. 2005; Eggan и соавт. 2006; Liu и соавт., 2007 В 2004 году Johnson с соавт. предложили очень спорную теорию. Они предположили, что в яичниках взрослых мышей существуют активные герминальные стволовые клетки, которые размножаются и восстанавливают фолликулярный пул: они обнаружили присутствие клеток VASA на поверхности яичника. Через год они предположили, что герминальные стволовые клетки находятся в костном мозге, где они обнаружили экспрессию маркеров генрминальной линии. Они сообщили, что трансплантация костного мозга позволяет восполнить фолликулярный резерв. На основании этих наблюдений они предложили еще более спорную гипотезу: предполагаемые герминальные клетки могут присутствовать в периферической крови, поэтому переливание крови может способствовать образованию ооцитов. Многие аргументы отвергают эту теорию, и для проверки этой революционной гипотезы необходимо проведение дальнейших исследований. Кроме того, другие группы исследователей пытались воспроизвести эти эксперименты, но безрезультатно. В любом случае эти типы клеток не были обнаружены у человека. Список литературы: -Johnson J, Canning J, Kaneko T, Pru JK, Tilly JL. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature 2004; 428:145–150. -Johnson J, Bagley J, Skaznik-Wikiel M, Lee HJ, Adams GB, Niikura Y, Tschudy KS, Tilly JC, Cortes ML, Forkert R et al. Oocyte generation in adult mammalian ovaries by putative germ cells in bone marrow and peripheral blood. Cell 2005;122:303–315. -Byskov AG, Faddy MJ, Lemmen JG, Andersen CY. Eggs forever? Differentiation 2005;73:438–446. -Eggan K, Jurga S, Gosden R, Min IM, Wagers AJ. Ovulated oocytes in adult mice derive from non-circulating germ cells. Nature 2006; 441:1109–1114. -Liu Y, Wu C, Lyu Q, Yang D, Albertini DF, Keefe DL, Liu L. Germline stem cells and neooogenesis in the adult human ovary. Dev Biol 2007; 306:112–120. Слайд 17 Дифференцировка свиной кожи ооцит-подобных клеток из фетальной Dyce и соавт. Nat Cell Biol 2006;8:384–390. Получили ооцит-подобные клетки из фетальной кожи свиньи при совместном культивировании с фолликулярной жидкостью с добавлением гонадотропина в культуральную среду Образование фолликулярных структур, содержащих ооциты, которые подверглись спонтанному дроблению с формированием псевдобластоцисты путем партеногенеза. Присутствие премейотических (VASA) и мейотических (SCP3) маркеров, а также ооцит-специфических маркеров (ZP). Dyce и соавт. получили ооцит-подобные клетки из фетальной кожи свиньи при совместном культивировании с фолликулярной жидкостью с добавлением гонадотропина в культуральную среду. Они наблюдали образование фолликулярных структур, содержащих ооциты, которые подверглись спонтанному дроблению с формированием псевдобластоцисты путем партеногенеза. После ПЦР-анализа были выявлены премейотические (VASA) и мейотические (SCP3) маркеры, а также ооцитспецифические маркеры (ZP). Список литературы: -Dyce PW,Wen L, Li J. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nat Cell Biol 2006;8:384–390. Слайд 18 Дифференцировка ооцитов из клеток яичника с рождением жизнеспособного потомства Zou и соавт. Nature Cell Biology 2009; 11, 631 – 636. Получили линии герминальных стволовых клеток из VASA-положительных клеток яичников новорожденных и взрослых мышей Эти клетки трансфицировали с зеленым флуоресцентным белком (GFP) и пересадили в яичники стерильных мышей, в результате чего были получены фолликулы, содержащие зеленые ооциты. После оплодотворения родилось здоровое фертильное потомство, несущее ген GFP. Wild type Fig. nFGSC аFGSC GFP- positive…. Live imaging…. Дикий тип Рис. Герминальные стволовые клетки новорожденных Герминальные стволовые клетки взрослых GFP-положительные ооциты после трансплантации Прижизненное изображение GFP- положительного потомства В 2009 году Zou и соавт. сообщили о втором достижении в получении жизнеспособного потомства из синтетических гамет, в данном случае дифференцированных из соматических клеток. Источником этих клеток были яичники новорожденных и взрослых мышей. Zou и соавт. получили линии герминальных стволовых клеток из VASA-положительных клеток яичников, выделенных с помощью FACS. Эти клетки трансфицировали с зеленым флуоресцентным белком (GFP) и пересадили в яичники стерильных мышей, в результате чего были получены фолликулы, содержащие зеленые ооциты. После оплодотворения родилось здоровое фертильное потомство, несущее ген GFP. Список литературы: -Kang Zou, Zhe Yuan, Zhaojuan Yang, Huacheng Luo, Kejing Sun, Li Zhou, Jie Xiang, Lingjun Shi, Qingsheng Yu, Yong Zhang, Ruoyu Hou & Ji Wu. Production of offspring from a germline stem cell line derived from neonatal ovaries. Nature Cell Biology 2009; 11, 631 – 636. Слайд 19 Дифференцировка мужских герминальных клеток из костного мозга Nayemia и соавт. Laboratory Investigation 2006; 86, 654–663. Получили GFP-колонии из клеток костного мозга от Stra8-GFP трансгенных мышейпосле добавления в культуральную среду ретиноевой кислоты. GFP-клетки обладали активностью щелочной фосфатазы и были Mvh-положительные Субпопуляция стволовых клеток костного мозга экспрессировала маркеры герминальных клеток, такие как с-Kit, Dazl, Oct4 и Mvh Полученные клетки остались на премейотической стадии в условиях in vitro. После пересадки в яички стерильных мышей дальнейшая дифференцировка не наблюдалась. . Nayemia и соавт. сообщили, что они получили потомство не только из гамет, дифференцированных из мышиных ЭСК, но и мужские герминальные клетки из костного мозга. Из клеток костного мозга от Stra8-GFP трансгенных мышей (несущих ген, связанный с дифференцировкой по сперматогониальному пути), после добавления в культуральную среду ретиноевой кислоты появились GFP-колонии, в которых определялась активность щелочной фосфатазы (характерный признак герминальных клеток). Более того, эти GFP-клетки были Mvh-положительные. ПЦР-анализ показал, что субпопуляция стволовых клеток костного мозга экспрессировали маркеры герминальных клеток, такие как с-Kit, Dazl, Oct4 и Mvh. Полученные клетки остались на премейотической стадии в условиях in vitro. После пересадки в яички стерильных мышей дальнейшая дифференцировка не наблюдалась. Процесс, по-видимому, оставался заблокированным на том же этапе даже в условиях in vivo. Список литературы: -Karim Nayernia, Jae Ho Lee, Nadja Drusenheimer, Jessica Nolte, Gerald Wulf, Ralf Dressel, Jörg Gromoll and Wolfgang Engel. Derivation of male germ cells from bone marrow stem cells. Laboratory Investigation 2006; 86, 654–663. Слайд 20 Получение будущее гамет из стволовых клеток: настоящее и Удалось получить поколение гамето-подобных клеток из эмбриональных и соматических стволовых клеток Удалось, добиться завершения мейоза in vitro, получения гаплоидных клеток и рождения жизнеспособного потомства Созданы модели для исследований гаметогенеза в условиях in vitro ….. Необходимо разработать новые стратегии для правильного завершения мейоза и установления соответствующего эпигенетического паттерна Синтетические гаметы можно будет использовать в качестве инструмента для проведения фундаментальных исследований Потенциальное использование ооцитов в области регенеративной медицины с терапевтическим клонированием и технологией переноса ядра Потенциальное использование полученных гамет в программах вспомогательных репродуктивных технологий. Подведем итог прогрессу, достигнутому в этой области, и возможностям его применения в будущем: На сегодняшний день удалось получить поколение гамето-подобных клеток, добиться завершения мейоза и рождения жизнеспособного потомства. Были созданы модели для исследований гаметогенеза в условиях in vitro. Что касается будущего, то необходимо разработать новые стратегии для правильного завершения мейоза и установления соответствующего эпигенетического паттерна. В этом случае полученные гаметы можно будет использовать в качестве инструмента для проведения фундаментальных исследований в области регенеративной медицины или даже в программах вспомогательных репродуктивных технологий.
