Н.В. Маркин1, О.Ф. Горбаченко2, М.А. Тихонова1, А.В.

МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского
института масличных культур. Вып. 1 (142-143), 2010
___________________________________________
Н.В. Маркин1,
кандидат биологических наук
О.Ф. Горбаченко2,
кандидат сельскохозяйственных наук
М.А. Тихонова1,
аспирантка
А.В. Усатов1,
доктор биологических наук
1
НИИ биологии Южного федерального университета,
Россия, 344090, Ростов-на-Дону, пр. Стачки 194/1
тел.: (863) 243-33-94, e-mail: nmarkin@mail.ru.
2
ГНУ ДОС им. Л.А. Жданова ВНИИМК Россельхозакадемии
тел.: 8-928-7616-732
КОДОМИНАНТНЫЕ МАРКЕРЫ ГЕНА Rf1 КУЛЬТУРНОГО ПОДСОЛНЕЧНИКА
Ключевые слова: цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС), гены восстановители
фертильности пыльцы (Rf), SCAR-маркеры, маркер-вспомогательная селекция,
подсолнечник, Helianthus.
УДК 575.12:547.962:633.854
Введение. Основой современного производства товарных семян подсолнечника являются
высокопродуктивные межлинейные гибриды, для получения которых селекционеры используют
систему генетического контроля опыления растений, состоящую из материнских линий с цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) на основе цитоплазмона однолетнего дикорастущего вида H. petiolaris (PET1), и отцовских линий-восстановителей фертильности пыльцы – доноров
ядерных генов Rf.
В литературе широко обсуждаются молекулярные механизмы взаимодействия ядерных и
цитоплазматических генов, лежащих в основе ЦМС и восстановления фертильности пыльцы у гибридов F1 [1, 2]. Показано, что у подсолнечника ЦМС типа PET1 является результатом реорганизации митохондриального генома растений. В настоящее время уже определена инсерция размером 5
т.п.н., которая возникает на границе с геном atpA и образует новую открытую рамку считывания.
Вследствие этого синтезируется новый котранскрипт atpA-orfH522 и белок с молекулярной массой
16 кДа, который, как предполагают, встраиваясь в мембраны митохондрий, блокирует цепь транспорта электронов, тем самым нарушая энергетический баланс в спорогенных клетках [3, 4, 5].
Ядерные гены Rf, контролируют реакцию полиаденилирования atpA-orfH522 транскрипта, что индуцирует его разрушение РНКазой II и в конечном итоге приводит к восстановлению фертильности пыльцы [6].
Гибридологический анализ различных линий-восстановителей ЦМС РЕТ1 позволил определить от одного до четырех ядерных генов с различными типами взаимодействия, супрессирующих фенотипический эффект ЦМС PET1 [7]. В то же время установлено, что у большинства линий
культурного подсолнечника восстановление мужской фертильности пыльцы у гибридов F1 контролируют в основном два доминантных гена – Rf1 и Rf2. При этом ген Rf2 локализован в геномах
практически всех инбредных линий, включая линии-закрепители стерильности, и только ген Rf1 в
основном определяет восстановительный потенциал мужской линии [7, 8, 9]. В связи с тем, что
создание новых генетических систем ЦМС-Rf на основе ядерно-цитоплазматических комбинаций
имеет большую практическую значимость, а идентификация новых генотипов с генами Rf классическим методом гибридологического анализа длительна и трудоемка, проблема быстрого и точного
определения доноров генов Rf в генофонде этой сельскохозяйственной культуры чрезвычайно актуальна.
Одним из перспективных вспомогательных инструментов поиска растений, восстанавливающих фертильность пыльцы линий ЦМС, является использование надежных ДНК-маркеров,
сцепленных с генами Rf. В настоящее время генетическое маркирование гена Rf1 проведено с помощью RFLP, RAPD, AFLP, SSR, TRAP маркеров [10, 11, 12, 13, 14]. Многие из них тесно сцеплены с геном Rf1 и демонстрируют определенную надежность в идентификации генотиповвосстановителей фертильности пыльцы ЦМС на основе H. petiolaris.
Ранее нами было показано, что SCAR-маркер HRG02/OPY10, разработанный Р. Хорн с сотрудниками [12], может служить в качестве идентификатора не только восстановителей фертильности пыльцы ЦМС PET1, но и ЦМС RIG0 [15]. Описанные в литературе SCAR-маркеры гена Rf1
подсолнечника демонстрируют доминантный тип наследования. Однако известно, что кодоминантные маркеры, позволяющие определять аллельные варианты генов, ассоциированные с хозяйственно
полезными признаками, являются более информативными для маркер-вспомогательной селекции [16].
В связи с этим целью настоящей работы является амплификация кодоминантных маркеров
гена Rf1 – восстановителя фертильности пыльцы цитоплазматической мужской стерильности PET1
культурного подсолнечника и определение их нуклеотидного полиморфизма.
Материал и методы. Материалом исследования служили селекционно ценные линии культурного подсолнечника, созданные сотрудниками Донской опытной станции им. Л.А. Жданова
ВНИИМК для производства коммерческих высокоурожайных гетерозисных гибридов F1. Линиивосстановители фертильности пыльцы получены путем самоопыления из восстановленных гибридов или из специально созданных синтетиков и являются гомозиготными по доминантному гену
Rf1 (Rf1Rf1). Линии ЦМС (PET1) получены путем беккроссирования (8-10 беккроссов) стерильных
растений (ЦМС) и фертильных растений закрепителей стерильности пыльцы (В-форма), в генотипах которых нет доминантных аллелей Rf1 (rf1rf1). Описание родительских линий и полученных на
их основе гибридов F1 приведено в таблице 1.
Для определения молекулярно-генетических маркеров гена Rf1 у исследуемых форм подсолнечника геномную ДНК экстрагировали из молодых листьев по описанной ранее методике [17].
Амплификацию специфического участка ДНК сцепленного (0,8 сМ) с геном Rf1 подсолнечника –
HRG01 инициировали с помощью SCAR-праймеров – OPК13, разработанных Р. Хорн с сотрудниками [12]. ПЦР-смесь объемом 25 мкл содержала 67 мМ трис-HCl pH 8,4, 16 мМ (NH4)2SO4, 2,5 мМ
MgSO4, 0,1 мМ меркаптоэтанола, 0,25 мМ каждого ДНТФ (ДАТФ, ДЦТФ, ДТТФ, ДГТФ), 15 пмоль
праймера, 2,5 ед. Taq-полимеразы, 30 нг выделенной ДНК. Реакцию амплификации проводили в
термоциклере Palm Cycler (Corbett Research, Австралия) по двум программам различающихся температурой отжига праймеров: 1) один цикл: 1 мин 94 °С; 35 циклов: 45 сек. 94 °С , 45 сек. 58 °С, один
цикл: 7 мин 72 °С и 2) один цикл: 1 мин 94 °С; 35 циклов: 45 сек. 94 °С , 45 сек. 54 °С, один цикл:
7 мин 72 °С. Ампликоны разделяли электрофоретически в 1,7 % агарозном геле с бромистым этидием и визуализировали с помощью гельдокументирующей системы Gel Doc 2000 (BioRad, USA).
Очистку фрагментов амплифицированной ДНК для последующего прямого секвенирования
выполняли согласно E. Werle [18]. Секвенирование проводили на генетическом анализаторе 3100
Genetic Analyser (Applied Biosystems, USA) с использованием набора реагентов BigDye Terminator
v.3.1 Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA). Хромотограммы анализировали с помощью пакета
программ DNAStar.
Результаты и обсуждение. Кодоминантные маркеры гена-восстановителя фертильности
пыльцы (Rf1) ЦМС PET1 определяли у родительских линий культурного подсолнечника с известными по гену Rf1 генотипами, установленными гибридологическим анализом: доминантные гомозиготы (RfRf1), рецессивные гомозиготы (rf1rf1) и их гибридов F1 (Rf1rf1) (см. табл. 1). Для
подтверждения присутствия/отсутствия в генотипе исследуемых форм доминантного гена Rf1 проведен молекулярно-генетический анализ геномной ДНК на наличие локуса HRG01, сцепленного (0,8 сМ)
с геном Rf1, методом энзиматической амплификации, используя SCAR-праймеры OPK13.
Таблица 1 – Характеристика родительских линий и гибридов F1 подсолнечника
№
Линия
1
2
3
Н 981 А
Н 026 А
IS 1544 А
rf1rf1
rf1rf1
rf1rf1
Стерильная
Стерильная
Стерильная
Маркер
HRG01
-
J-8/RT 991 RF
Rf1Rf1
Фертильная
+
J-8/ХФ 4917 RF
Rf1Rf1
Фертильная
+
ВД 114 RF
Н 981 А × J-8/RT 991 RF
Н 026 А × J-8/ХФ 4917 RF
IS 1544 А × DL 114 RF
Rf1Rf1
Rf1rf1
Rf1rf1
Фертильная
Фертильный
Фертильный
Фертильный
+
+
+
+
4
5
6
7
8
9
ЦМС
Восстановители
фертильности
пыльцы
Гибриды F1
Генотип
Rf1rf1
Фенотип
Результаты ПЦР анализа свидетельствуют, что маркер присутствует у гомозиготных
(Rf1Rf1) линий-восстановителей фертильности пыльцы – J-8/RT 991, J-8/ХФ 4917, BD114, и гетерозиготных (Rf1rf1) гибридов – H 981A x J-8/RT 991, H 026A x J-8/ХФ 4917 и Is 1544A × BD114. У
растений ЦМС-линий (rf1rf1) Н 981A, H 026A, Is 1544A – данный маркер не идентифицирован. В
случае определения SCAR-маркера на электрофореграмме четко визуализируется фрагмент около
450 п.н, что соответствует размеру искомого локуса (рис. 1).
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Рисунок 1 – Электрофореграмма продуктов амплификации локуса HRG01, сцепленного
с геном Rf1, при температуре отжига праймеров 58 оС. 1, 2, 6 – ЦМС-линии (rf1rf1):
Н 981 А, Н 026 А и IS 1544 А соответственно; 3, 4, 5 – линии-восстановители
фертильности пыльцы (Rf1Rf1): J-8/RT 991, J-8/ХФ 4917 и BD114 соответственно;
7, 8, 9 – гибриды F1 (Rf1rf1): H 981A x J-8/RT 991, H 026A x J-8/ХФ 4917
и Is 1544A x BD114 соответственно. М – маркер (100 – 1000 bp)
Эти результаты полностью согласуются с данными гибридологического анализа, что служит подтверждением идентификационной ценности маркера HRG01 для маркер-вспомогательной
селекции подсолнечника при создании родительских линий системы ЦМС-Rf PET1.
Необходимо отметить, что амплифицируемый (температура отжига праймеров 58 оС) фрагмент является доминантным маркером, позволяющим проводить сравнительный анализ исследуемых генотипов по принципу наличие-отсутствие [12]. Однако известно, что SCAR- маркеры,
полученные на основании нуклеотидной последовательности доминантных RAPD-фрагментов, могут быть кодоминантны в случаях, когда сайты связывания праймеров у аллельных локусов отличаются инсерциями или делециями. Методические особенности создания SCAR-праймеров
подробно описаны в работе О.В. Ковезы, С.А Гостимского [19]. Эти же авторы показали, что некоторые SCAR-маркеры генома гороха в зависимости от температуры отжига демонстрируют полиморфизм нуклеотидной последовательности сайтов прайминга. Следовательно, единичные
некомплементарные нуклеотиды в системе праймер-матрица дестабилизируют начальные этапы
амплификации и уменьшают выход неспецифического продукта ПЦР, а температура отжига (Ta)
праймеров, как один из важнейших параметров высокоспецифичной ПЦР-системы, оказывает оптимизирующий (по специфичности) эффект. Таким образом, если различия сайтов прайминга
представлены однонуклеотидным полиморфизмом, изменяя Ta, можно подобрать условия, при которых будет амплифицироваться и другой аллельный локус.
В результате снижения температуры отжига праймеров OPK13 с 58 оС до 54 оС (уменьшена
специфичность ПЦР) в реакции амплификации геномной ДНК гомозиготных образцов (Rf1Rf1 и
rf1rf1) синтезировались различающиеся по подвижности в агарозном геле фрагменты (рис. 2).
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Рисунок 2 – Электрофореграмма продуктов амплификации локуса HRG01, сцепленного с геном
Rf1, при температуре отжига праймеров 54 оС. 1, 2, 6 – ЦМС-линии (rf1rf1): Н 981 А,
Н 026 А и IS 1544 А соответственно; 3, 4, 5 – линии-восстановители фертильности
пыльцы (Rf1Rf1): J-8/RT 991, J-8/ХФ 4917 и BD114 соответственно; 7, 8, 9 – гибриды F1
(Rf1rf1): H 981A x J-8/RT 991, H 026A x J-8/ХФ 4917 и Is 1544A x BD114 соответственно.
Так, у всех трех ЦМС-линий (rf1rf1) получен единичный фрагмент размером около 350 п.н.
Однако в генотипах двух отцовских линий (Rf1Rf1) – J-8/ХФ 4917 RF и ВД 114 RF – определен
один маркерный фрагмент размером около 450 п.н., а у линии J-8/RT 991 RF – два фрагмента размерами около 450 и 350 п.н. У всех гибридных растений (Rf1rf1) инициируется амплификация также этих двух фрагментов (450 и 350 п.н.) (рис. 2).
Таблица 2 – Полиморфные сайты кодоминантных маркеров гена Rf1
№
Полиморфные сайты
108 109 110 114 128 153 167 169 171 174
179 184 199 200 209 210 224 229 230 243 278 292 327 333
1
Т
C
A
T
T
T
A
T
A
T
G
A
G
A
A
2
Т
C
A
T
T
T
A
T
A
T
G
A
G
A
3
T
C
A
T
T
T
A
T
A
T
G
A
G
A
4
A
T
C
C
G
C
T
A
G
C
A
T
A
5
A
T
C
C
G
C
T
A
G
C
A
T
A
6
A
T
C
C
G
C
T
A
G
C
A
T
A
C
C
G
A
G
G
-
A
G
A
C
C
G
A
G
G
-
A
G
A
G
C
G
A
G
G
-
A
G
G
G
C
T
A
C
T
A
C
G
A
G
G
C
T
A
C
T
A
C
G
A
G
G
C
T
A
C
T
A
C
G
A
Примечание: 1, 2, 3 – нуклеотидная последовательность SCAR-маркера гена Rf1, амплифицированного
на геномной ДНК линий-восстановителей фертильности пыльцы (температура отжига
праймеров 58 оС) – J-8/RT 991, J-8/ХФ 4917 и ВД 114 соответственно; 4, 5, 6 – нуклеотидная
последовательность SCAR-маркера гена Rf1, амплифицированного на геномной ДНК
ЦМС-линий (температура отжига праймеров 54 оС) – Н 981 А, Н 026 А и IS 1544 А соответственно.
Это означает, что снижение температуры отжига праймеров OPK13 приводит к амплификации кодоминантных маркеров. Однако амплификация одновременно двух фрагментов у одной из
трех линий-восстановителей фертильности пыльцы указывает, что сайты отжига SCAR-праймеров
при Ta=54 оС полиморфны и, по-видимому, различаются точковыми мутациями.
Известно, что однонуклеотидные перестройки (ОНП, single nucleotide polymorphisms, SNP)
лежат в основе возникновения новых аллелей. Высокая плотность и эволюционная стабильность
ОНП делают их одними из наиболее удобных генетических маркеров [20]. В этой связи с целью
локализации полиморфных сайтов была исследована нуклеотидная последовательность фрагментов геномной ДНК гомозиготных по гену Rf1 линий, амплифицированных при различных температурах отжига праймеров (58 оС (Rf1Rf1) и 54 оС (rf1rf1) с помощью прямого секвенирования
продуктов ПЦР, и выявлены гомологичные позиции сравниваемых последовательностей. Результаты анализа нуклеотидных последовательностей кодоминантных маркеров гена Rf1 гомозиготных
линий подсолнечника по распределению полиморфных сайтов приведены в таблице 2. Прямое секвенирование фрагментов амплификации локуса HRG01 трех доминантных (температура отжига
праймеров 58 оС) и трех рецессивных (температура отжига праймеров 54 оС) гомозиготных по гену
Rf1 образцов позволило определить последовательности нуклеотидов участка размером 355 п.н. и 247
п.н. соответственно. Сравнительный анализ выровненных по длине всех шести нуклеотидных последовательностей показал, что степень молекулярно-генетического сходства между маркерами одного аллельного варианта составляет 99,6-100 %, между различными аллельными вариантами – 90,7-91,1 %.
Выравнивание шести последовательностей нуклеотидов на участке размером 247 п.н. (с 108 по
355 сайт) выявило 223 гомологичных и 24 полиморфных позиций (см. табл. 2). В основном нуклеотидные замены были выявлены при сравнении сиквенсов двух различных локусов (аллелей). Исключением является 210 позиция доминантного аллельного варианта, где определена трансверсия
пиримидинового основания на пуриновое (С → G). В остальных случаях различия обусловлены следующими заменами: A/G (T/C) – 14 (61 %), A/C (T/G) – 4 (17 %), A/T – 4 (17 %) и одна (4 %) – делеция.
Рассмотренный выше однонуклеотидный полиморфизм представляет практический интерес
для разработки простых и эффективных тест-систем на основе ПЦР, позволяющих выявлять гомозиготные и гетерозиготные точковые мутации, ассоциированные с изучаемым признаком.
Таким образом, путем снижения температуры отжига SCAR-праймеров OPK13, фланкирующих локус HRG01, сцепленный с геном Rf1, инициирована амплификация двух кодоминантных маркеров. При этом один размером около 450 п.н. – ассоциирован с доминантным фенотипом
восстановления фертильности пыльцы, а другой – размером около 350 п.н. – с рецессивным. Исследование последовательности нуклеотидов этих маркеров позволило определить полиморфные
сайты сравниваемых участков (аллелей), которые могут служить основой для разработки аллельспецифичной ПЦР тест-системы, позволяющей идентифицировать аллельные варианты генавосстановителя фертильности пыльцы Rf1 в целях ее использования для маркер-вспомогательной
селекции подсолнечника.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и образования
РФ (грант «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010)» № 2.1.1/4947).
Список литературы
1. Horn, R. Recombination: Cytoplasmic male sterility and fertility restoration in higher plants / R.
Horn // Progress in Botany. – 2006. – Vol. 67. – P. 31-52.
2. Иванов, М.К. Цитоплазматическая мужская стерильность и восстановление фертильности
пыльцы у высших растений / М.К. Иванов, Г.М. Дымшиц // Генетика. – 2007. – Т. 43. – № 4. – С. 451-468.
3. Kohler, T. Cytoplasmic male sterility in sunflower is correlated with the co-transcription of a
new open reading frame with the atpA gene / T. Kohler, R. Horn, A. Lossl, K. Zetsche // Mol. Gen. Gen. –
1991. – Vol. 262. – № 2. – P. 283-290.
4. Horn, R. A mitochondrial 16kD protein is associated with cytoplasmic male sterility in sunflower / R. Horn, R.H. Kohler, K.A. Zetsche // Plant Mol. Biol. – 1991. –Vol. 17. – P. 29-36.
5. Moneger, F. Nuclear restoration of cytoplasmic male sterility in sunflower is associated with
tissue-specific regulation of a novel mitochondrial gene / F. Moneger, C.J. Smart, C.J. Leaver // EMBO J.
– 1994. – Vol. 86. – P. 259-268.
6. Gagliardi, D. Polyadenylation accelerates the degradation of the mitochondrial mRNA
associated with cytoplasmic male sterility in sunflower / D. Gagliardi, C.J. Leaver // EMBO J. – 1999. –
Vol. 18. – P. 3757-3766.
7. Serieys, H. Identificаtion, study, and utilization in breeding programs of new CMS sources / H.
Serieys // Helia. – 1996. – Vol. 19. – P. 144-160.
8. Reddy, P.S. Inheritance of fertility restoration in sunflower (Helianthus annuus L.) / P.S. Reddy,
B. Thammiraju // Euphytica. – 1977. – Vol. 26. – P. 409-412.
9. Анащенко, А.В. Изучение генетической системы ЦМС-Rf у подсолнечника (Helianthus
annuus L.). Сообщ. II. Восстановление мужской фертильности у гибридов на основе ЦМСр / А.В.
Анащенко, М.В. Дука // Генетика. – 1985. – Т. 21. - № 12. – С. 1999-2004.
10. Gentzbittel, L. Development of a consensus linkage RFLP map of cultivated sunflower
(Helianthus annuus L.) / L. Gentzbittel, F. Vear, Y.X. Zhang, A. Berville // Theor. Appl. Genet. – 1995. –
Vol. 90. – P. 1079-1086.
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского
института масличных культур. Вып. 1 (142-143), 2010
___________________________________________
11. Berry, S.T. Molecular marker analysis of Helianthus annuus L. 2. Construction of a RFLP linkage map for cultivated sunflower / S.T. Berry, A.J. Leon, C.C. Hanfrey, P. Challis, A. Burkholz, S.R.
Barnes, G.K. Rufener, M. Lee, P.D.S. Galigari // Theor. Appl. Genet. – 1995. – Vol. 91. – P. 195-199.
12.Horn, R. Molecular mapping of the Rf1 gene restoring pollen fertility in PET1 – based F1 hybrids in sunflower (Helianthus annuus L.) / R. Horn, B. Kusterer, E. Lazarescu, M. Prüfe, W. Friedt //
Theor. Appl. Genet. – 2003. – Vol. 106. – P. 599-606.
13. Kusterer, B. Molecular mapping of the fertility restoration locus Rf1 in sunflower and development of diagnostic markers for the restorer gene / B. Kusterer, R. Horn, W. Friedt // Euphytica. – 2005.
– Vol. 143. – P. 35-43.
14. Yue, B. Genetic mapping for the Rf1 (fertility restoration) gene in sunflower (Helianthus annuus L.) by SSR and TRAP markers / B. Yue, B.A. Vick, X. Cai, J. Hu // Plant Breeding. – 2010. – Vol.
129. – I.1. – P. 24-28.
15. Маркин, Н.В. SCAR-маркер гена Rf1 подсолнечника у линий восстановителей фертильности пыльцы растений с различными типами ЦМС / Н.В. Маркин, М.А. Тихонова, И.Н. Анисимова,
В.Т. Рожкова, В.А. Гаврилова, А.В. Усатов // Масличные культуры. – 2009. – Вып. 2 (141). – С. 3-5.
16. Irish, B.M. Characterization of a resistance locus (Pfs-1) to the spinach downy mildew pathogen
(Peronospora farinose f. sp. spinaciae) and development of a molecular marker linked to Pfs-1 / B.M. Irish,
J.C. Correll, C. Feng, T. Bentley, B.G. Reyes // Phytopathology. – 2008. – Vol. 98. – № 8. – P. 894-900.
17. Маркин, Н.В. RAPD-анализ генотипов солеустойчивых форм горчицы (Brassica juncea
L.) / Н.В. Маркин, А.В. Усатов, М.Г. Федоренко // Экологический вестник научных центров
Черноморского экономического сотрудничества. – 2006. – № 2. – С. 78-81.
18. Werle, E. Convenient single-step, one tube purification of PCR products for direct sequencing
/ E. Werle, C. Schneider, M. Renner, M. Volker, W. Fiehn // Nucl. Acids Res. – 1994. – Vol. 22. – № 20.
– Р. 4354-4355.
19. Ковеза, О.В. Создание и изучение SCAR-маркеров у гороха (Pisum sativum L.) / О.В.
Ковеза, С.А. Гостимский // Генетика. – 2005. – Т. 41. – № 11. – С. 1522-1530.
20. Gupta, P.K. Single nucleotide polymorphisms: a new paradigm for molecular marker
technology and DNA polymorphism detection with emphasis on their use in plants / P.K. Gupta, J.K. Roy,
M. Prasad // Curr. Sci. – 2001. – Vol. 80. – P. 524-535.