ОЦЕНКА ГИБРИДОВ РАПСА НА ОСНОВЕ ЦМС С ПОМОЩЬЮ

VII международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 13 г.
ОЦЕНКА ГИБРИДОВ РАПСА НА ОСНОВЕ ЦМС С ПОМОЩЬЮ
МИКРОСАТЕЛЛИТНОГО АНАЛИЗА
Cатина T.Г.1, Анискина Ю.В.2
398037, Липецк, ул. Боевой проезд, 26
ГНУ ВНИИ рanca PACXH
satina_tg@mail.ru
2
127550, Mocква, yл. Тимирязевкая, 42
ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии PACXH
aniskina.julia@gmail.com
1
Проведена оценка однородности гибридов рапса на основе ЦМС с помощью микросателлитного анализа.
Введение. Рапс (В. napus L.) – одна из перспективных масличных культур
для обеспечения населения растительным маслом и животноводства кормовым
белком [1]. Для повышения урожайности этой культуры, необходимо использовать высокопродуктивные сорта и гибриды.
Для производства гибридных семян необходима надежная система контроля опыления растений, препятствующая самоопылению и опылению растений
внутри линии. Наибольший интерес для коммерческого гибридного семеноводства представляет система генетического контроля опыления, основанная на явлении мужской стерильности.
Цитоплазматическая мужская стерильность – это наследуемый материнской линией, кодируемый митохондриальной ДНК признак, который приводит к
нарушению формирования жизнеспособной пыльцы, при этом фертильность женского гаметофита сохраняется. В семействе Капустные найдено несколько типов
ЦМС, но наиболее распространенными являются три типа, используемые во всем
мире. Это ogura-ЦМС (ogu) [2], napus-ЦМС (nap) [3, 4], polima-ЦМС (pol) [5].
При увеличении производства гибридов необходим контроль генетического разнообразия исходного материала для эффективного подбора родительских
пар, тестирования однородных коммерческих партий семян и идентификации селекционного материала с целью защиты авторских прав селекционеров. Новое
поколение молекулярно-генетических маркеров, к которым относятся полиморфные фрагменты ДНК, выявляемые с помощью различных ДНК-технологий, удовлетворяет всем предъявляемым к ним требованиям. В частности, микросателлитные повторы ДНК (SSR), расположенные в геноме эукариот случайным образом,
обладают высоким уровнем полиморфизма, кодоминантны, хорошо воспроизводятся при повторном проведении ПЦР.
Цель и задачи исследований. Оценить генетическую однородность сортов
рапса методом микросателлитного анализа и отобрать для дальнейшей селекции
однородные родительские формы, а также оценить генетическую однородность
полученных гибридов рапса.
Материал и методы. Объектом исследования послужили одна материнская
стерильная линия рапса на основе pol-ЦМС и 3 мужские линии-восстановители
фертильности пыльцы, полученные в отделе селекции ВНИИ рапса (табл. 1), а
также их гибриды. Геномную ДНК выделяли из зеленых листьев с помощью модифицированного CTAB метода [6]. ПЦР осуществляли с помощью 16 локусспецифичных пар праймеров, отобранных ранее [7]. Анализ флуоресцентномеченых ПЦР-фрагментов проводили методом электрофореза в денатурирующих
195
VII международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 13 г.
условиях с помощью автоматического анализатора ALFexpress II Amersham
BioSciences (США). Полученные данные анализировали с помощью пакета прикладных программ ALFwin Software Fragment Analyser.
Результаты и обсуждение. Для оценки генетической однородности родительских форм по микросателлитным маркерам были использованы оптимальные
пары праймеров, подобранные ранее [7].
Таблица 1 – Список проверенных линий
№
п/п
1
2
3
4
№ делянки
Название
468♀ 1р, 2р, 3р, 4р, 5р, 6р, 7р, 8р
466♂ 1р, 3р, 4р, 5р
467♂ 1р, 2р
483♂ 2р, 4р, 5р
Hyola-401×Ратник8
Hanna
Галакси
H-420 р-8 × Hanna р-1
В качестве примера представлена электрофореграмма разделения продуктов ПЦР в 8%-ном ПААГе по четырем парам праймеров: Bna.M.016, Bna.M.001,
Bna.M.013, Bna.M.015 (рис. 1).
1
2
3
4
200
200
Рисунок 1 – Электрофореграмма разделения в 8%-ном ПААГ продуктов ПЦР,
полученных по 4 парам праймеров:
А – Bna.M.016, B – Bna.M.001, C – Bna.M.013, D – Bna.M.015.
М – молекулярный маркер (50-500 п.н.);
1 – Hyola-401×Ратник8; 2 – Hanna; 3 – Галакси; 4 – H-420 р-8×Hanna р-1.
Данные праймеры позволяют различать линии рапса. Как видно на данном рисунке, индивидуальные растения в пределах одной линии имеют одинаковые генотипы, но при этом каждая линия имеет индивидуальный генетический
профиль, отличающий ее от других линий. Вместе с тем материнская стерильная
196
VII международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 13 г.
форма имеет во всех спектрах дополнительные полосы, что свидетельствует о
неоднородности этой линии (рис. 1, дорожка 1). Мужские линии-восстановители
фертильности пыльцы имеют более выровненный генотип за счет многократного
самоопыления. Таким образом, микросателлитный анализ может использоваться
для подбора родительских пар для скрещиваний.
На основе этих проверенных родительских линий были получены гибриды (табл. 2), которые проанализировали по отобранным парам праймеров.
Таблица 2 – Список полученных гибридов
N
п/п
1
2
3
Название гибридов
8
F1 468♀ 4р (Hyola-401×Ратник ) × 466♂ 3р (Hanna)
F1 468♀ 4р (Hyola-401×Ратник8) ×466♂ 4р (Hanna)
F1 468♀ 7р (Hyola-401×Ратник8) × 483♂ 4р (H-420 р-8× Hanna р-1)
Для оценки генетической однородности анализировали по 5 индивидуальных растений каждого гибрида. Возможность идентификации гибридов по
микросателлитам определяется тем, что в соответствии с общей закономерностью наследования признаков электрофоретический спектр гибрида F1 должен
включать компоненты обеих родительских форм [8].
1
2
Рисунок 2 – Электрофореграмма разделения продуктов ПЦР в 8%-ном ПААГе по 2 парам
праймеров: А - Bna.M.013, В - Bna.M.015.
1. – 1 – 468♀ 7р; 2, 3, 4, 5, 6 – F1 468♀ 7р × 483♂ 4р; 7 – 483♂ 4р,
М – молекулярный маркер (50-500 п.н.).
2. – М – молекулярный маркер (50-500 п.н.); 1 – 466♂ 3р; 2, 3, 4, 5, 6 – F1 468♀ 4р ×
466♂ 3р; 7 – 468♀ 4р.
197
VII международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 13 г.
Микросателлитные маркеры имеют кодоминантный тип наследования, поэтому могут легко выявить гибридность. На рис. 2 представлены генетические
профили гибридов, полученные по 2-м парам праймеров Bna.M.013 и Bna.M.015.
Гибриды F1 468♀ 7р × 483♂ 4р содержат аллели (рис. 2 – 1 – А и В, дорожки 2-6), соответствующие аллелям родительских форм 468♀ 7р (рис. 2 – 1 – А
и В, дорожка 1) и 483♂ 4р (рис. 2 – 1 – А и В, дорожка 7). Гибриды в этой комбинации скрещивания оказались фертильными.
А вот у гибрида F1 468♀ 4р × 466♂ 3р (рис. 2 – 2, дорожки 2-6) наблюдались аллели, которые отсутствовали у родительских форм этого гибрида (рис. 2 –
2, дорожки 1 и 7). Следует отметить, что в этой комбинации скрещивания все
гибриды оказались стерильными.
Заключение. Таким образом, с помощью оригинальных микросателлитных
маркеров были выявлены однородные линии ярового рапса, которые были использованы в качестве родительских форм для получения гибридов. Установлено, что генетическая однородность линий находится в прямой зависимости от
количества проведенных самоопылений. Отобранные пары праймеров можно использовать для определения гибридности при создании гибридов рапса.
Благодарности. Исследования выполнены при финансовой поддержке
РФФИ, грант № 12-04-90802-мол_рф_нр.
Литература
1. Артемов, И.В. Пути увеличения производства кормов и растительного
масла / И.В. Артемов, А.М. Киселев // Кормопроизводство. – 1997. – №4. – С. 2-7.
2. Ogura, H. Studies on the new male sterility in the Japanese radish with special reference to utilization of this sterility toward the practical raising of hybrid seeds /
H. Ogura // Mem. Fac. Agric. Kagoshima Univ. – 1968. – V. 6. – P. 39-78.
3. Tompson, K.F. Cytoplasmic male sterility on oilseed rape / K.F. Tompson //
Heredity. – 1972. – P. 253-257.
4. Shiga, T. Cytoplasmic male sterility in oilseed rape Brassica napus L. and its utilization to breeding / T. Shiga, S. Baba // Jpn. J. Breed. – 1973. – V. 23. – P. 187-197.
5. Fu, T.D. Production and research of rapeseed in the People’s Republic of
China / T.D. Fu // Eucarpia Cruciferae Newsletter. – 1981. – P. 6-7.
6. Kidwell, K.K. Plant Genomes: Methods for Genetic and Physical Mapping /
K.K. Kidwell, T.C. Osborn. – Kluever Academic Publishers Group. A.H. Dordrecht, The
Netherlands. – 2001. – P. 1-13.
7. Сатина, Т.Г. Различение и идентификация сортов рапса методом микросателлитного анализа / Т.Г. Сатина, Ю.В. Анискина, В.В. Карпачев, П.Н. Харченко,
И.А. Шилов // Доклады РАСХН. – 2010. – № 1. – С. 11-13.
8. Молекулярно-биологические аспекты прикладной ботаники, генетики и
селекции // Теоретич. основы селекции / Под ред. В.Г. Конарева. – М.: Колос,
1993. – Т. I. – 447 с.
ASSESSMENT OF RAPESEED HYBRIDS BASED ON CMS
BY MICROSATELLITE ANALYSIS
Satina T.G., Aniskina Yu.V.
Assessment of the homogeneity of the rapeseed hybrids was made based on
CMS using microsatellite analysis.
198