1.4.Изменчивость бактерий. Мутации. Характерные типы

1.4.Изменчивость бактерий.
Мутации.
Характерные типы мутантов бактерий.
Рекомбинация прокариот.
Мобильные элементы генома прокариот: плазмиды и траспозоны.
Горизонтальный перенос генов прокариот.
Адаптация у бактерий (Флуктационный тест Лурии и Дельбрюка).
Изменчивость бактерий.
Изменчивость – свойство организмов приобретать новые признаки, отличающие их
от родительских форм. Изменчивость приводит к росту разнообразия в природных
популяциях. Основные пути роста разнообразия в бактериальных популяциях –
рекомбинация и обмен генетическим материалом (горизонтальный перенос генов).
Источником новых генетических вариантов являются мутации, которые возникают
постоянно и позволяют приобретать новые признаки, необходимы для выживания
популяций и эволюции вида. Адаптивные мутации будут наследоваться, «вредные»
мутации будут элиминироваться давлением отбора. Способствуют изменчивости
мобильные элементы, которые осуществляют перенос отдельных генов и групп генов
[Современная микробиология. Прокариоты, 2005].
В то же время большое количество повреждений ДНК может привести к гибели
клетки, и, очевидно, стабильность генетического материала также необходима для
выживания организма. Восстановления нарушенной структуры генетического материала
происходит при помощи ряда механизмов репарации ДНК. Баланс изменчивости и
эффективной работы репарации обеспечивает стабильное развитие популяций, при
котором частота мутаций поддерживается на определенном уровне (спонтанный
мутационный процесс), достаточном для адаптации организмов к меняющимся условиям
среды.
Мутации.
Мутации
–
стабильные,
наследуемые
изменения
нуклеотидной
последовательности генетического материала. Спонтанные мутации возникают в
результате ошибок репликации, разрывов ДНК и инсерций. Индуцированные мутации
вызываются действием мутагенов. Клетки бактериальных культур «чистых линий»
происходят от одной клетки – общего предка, несмотря на это, в популяции появляются
клетки с генотипом отличным от родительской особи. Причина – постоянно возникающие
мутации.
1
Обычно
ычно мутации идентифицируют по изменению фенотипом в сравнении с
преобладающим «диким типом». По эффекту мутации делятся на морфологические,
биохимические, летальные, адаптивные. Нормальная частота спонтанных мутаций одна
на 106 – 108 клеток.
Точковые мутации:
мутации
•
Миссенс мутации.
•
Нонсенс мутации
•
Сдвиг рамки считывания.
•
Синонимичные (молчащие).
Хромосомные мутации:
мутации
•
Дупликации, делеции, инсерции, инверсии, транслокации.
Рисунок 1. Основные типы точковых мутаций [Иванов,
Иванов, 2006
2006].
Сдвиг рамки считывания, вызванный вставкой или выпадением отдельных
нуклеотидов, приводит к изменению состава всех нуклеотидов следующих за местом
мутации.
2
Рисунок 1. Мутации «сдвиг рамки считывания» [Joanne M. Willey et al. 2008].
Генные (точковые) мутации.
В случае генной мутации происходит замена
з
основания, А-Т
Т – G-C (пурины A и G
заменяют пурины, пиримидины
C и T - пиримидины).. Различают ввставки, делеции,
инверсии и замены (транзиции и трансверсии). В случае транзиций на исходное
пуриновое основание заменяется другим, пиримидиновое, – другим пиримидиновым ((GC
пара меняется на АТ). Трансверсии характеризуются сменой пары нуклеотидов: вместо
пуринового основания становиться пиримидиновое и наоборот (например, GC пара
меняется на ТА или СG)..
Рисунок 1. Замена основания и основные типы хромосомных мутаций ((делеции,
инсерции, инверсии) [Иванов,
Иванов, 2006].
2006
3
Предполагается, что один из главных источников ошибок репликации –
таутомеризация азотистых оснований.
оснований Таутомерия – явление обратимой изомерии,
когда два или более изомеров легко переходят друг в друга. Для азотистых оснований
помимо основной, привычной формы, существуют редкие таутомеры, которые
отличаются меньшей стабильностью. Большую часть времени основания пребывают в
обычной форме, но в течении небольших промежутков времени
времени (микросекунд) могут
переходить в неустойчивые таутомерные формы, что может приводить к образованию
неправильных пар оснований. Так редкая имино-форма
имино форма цитозина образует пару с
аденином, енольная форма тимина – с гуанином.
Рисунок 1. Образование аномальных
аномальных пар с участием енольных и имино
имино-форм
оснований [Joanne M. Willey et al. 2008].
Временная енолизация гуанина приводит к формированию GC – AT транзиции
(мутант). Мутация проявляется во втором поколении, если GT не будет репарирована в
первом поколении.
4
Таблица 1. Механизмы действия некоторых распространенных мутагенов
[Современная микробиология. Прокариоты, 2005].
Мутаген
Мутация
Механизм
Аналог основания
5-Бромурацил
Включается
вместо
Спаривается
с
гуанином
тимина. AT→GC
(ок.
5%
случаев), в 95% случаев спаривается с
аденином.
Соединения, реагирующие с ДНК:
Азотистая кислота (HNO2)
Окислительное
дезаминирование AT→GC
аденина и цитозина.
и
GC→AT
Гидроксиламин
Превращение –NH2 группы в –NHOH AT→GC
(NH2OH)
или –NOH–CH3
Алкилирующие агенты
Монофункциональные
Метилирование
гуанина,
(например,
спаривание с тимином.
ошибочное GC→AT
этилметансульфонат)
Бифункциональные
(например,
Алкилирование и сшивка цепей ДНК с Точковые
N-нитро-N’- удалением модифицированнго участка мутации
нитрозогуанидин).
ДНКазой.
и
делеции.
Вставка
Полициклические
Внедрение
между
нуклеотидными Вставки
ароматические
соединения парами (интеркалирующий агент)
(бенз[а]пирен,
бромистый
и
делеции
этидий).
Облучение
УФ-излучение
Формирование
пиримидиновых Замена
димеров
Гамма-излучение
пары
нуклеотидов
Делеции оснований, одноцепочечные или делеции
разрывы, сшивки ДНК, хромосомные
разрывы.
5
5-Бромурацил – аналог оснований,
который может формировать пары с
аденином и гуанином, что впоследствии
может приводить к замене основания.
Рисунок 1. Схема спаривания 55
Бромурацила
с
аденином
(95%)
и
гуанином (5%) [Joanne M. Willey et al.
2008].
Характерные типы мутантов бактерий.
Использование индуцированного мутагенеза позволяет множество фенотипов
бактерий в результате случайных мутаций. Фенотипические эффекты можно разделить на
преимущества для роста и дефекты метаболизма. Мутантов первого типа выделяют,
используя положительную селекцию,
селекцию основанную
ванную на устойчивости к фагам и
антибиотикам. Мутанты при этом растут в присутствии антибиотиков или фагов, дикий
штамм не способен к росту.
росту
В зависимости от изменения биосинтетических возможностей клеток выделяют:
•
Клетки ауксотрофы – потеря способности
ти синтезировать один из
компонентов компонентов клетки в результате мутации.
•
Прототрофы – сохраняют способность к синтезу.
•
Ревертанты
–
восстановление
исходного
фенотипа
и
супрессоры
восстановление благодаря мутации в другом сайте.
Селективные
методы
из
изоляции
мутантов:
воздействие
антибиотиком,
специфичным к растущим клеткам (пенициллин,
(
, налидиксовая кислота, стептозотоцин) на
растущих прототрофов.. При
П этом выживают покоящиеся клетки ауксотрофов-мутантов,
которые не растут в отсутствии необходимых веществ и могут выжить при водействии
антибиотика (отрицательная
отрицательная селекция).
селекция
Подобными методами невозможно выделить летальные мутации в жизненно
жизненноважных генах. Для изучения таких локусов получают условно
условно-летальные мутации,
наиболее распространены температурочувствительные мутанты. У таких клеток
6
мутации локализованы в белках, активных при пониженной температуре и неактивных
при повышении температуры.
Рекомбинация прокариот
Механизмы роста генетического разнообразия прокариот.
Рост генетического разнообразия происходит в процессах рекомбинации, когда
генетический материал разных молекул ДНК комбинируется в гибридной молекуле ДНК.
У эукариот – рекомбинация в мейозе. У прокариот происходит рекомбинация 3 типов,
по молекулярным механизмам схожая с рекомбинацией эукариот.
•
Гомологичная рекомбинация. Реципрокный обмен участками хромосом с
аналогичными нуклеотидными последовательностями. Возможен нереципрокный обмен с
короткими участками ДНК.
•
Сайт-специфическая рекомбинация. Интеграция многих вирусных геномов.
Донор имеет небольшой участок, гомологичный ДНК хозяина.
•
Транспозиция. С участием мобильных элементов генома.
Рисунок 1. Гомологичная рекомбинация [Joanne M. Willey et al. 2008].
7
Рисунок 1. Нереципрокная гомологичная рекомбинация [Joanne
Joanne M. Willey et al.
2008].
Транспозиция.
Рекомбинация, не зависящая от гомологии участков ДНК, которая происходит во
многих сайтах генома с участием мобильных элементов генома – транспозонов.
Мобильные элементы могут перемещаться между хромосомной и нехромо
нехромосомной ДНК,
они внедряются в геном хозяина, меняя генную структуру или подчиняя экспрессию генов
новым регуляторным элементам. Данный тип рекомбинации не зависит от гомологии
участков ДНК и происходит
оисходит во многих сайтах генома. Мобильные элементы внедряются в
геном хозяина, меняя генную структуру или подчиняя экспрессию генов новым
регуляторным элементам,
элементам они могут перемещаться между хромосомной и нехромосомной
ДНК.
Инсерционные транспозоны (IS).
•
Открыты в 1970г. П.Сталинжером, Г.Сэдлером и Дж.Шапиро. Обычно
несколько is-элементов
элементов содержится в бактериальной хромосоме.
хромос
Размеры 750
750-1550 п.н.
•
На концах инвертированные последовательности ((IR) необходимые для
переноса. В центральной части ген транспозазы, необходимый для распознавания isэлементов и взаимодействия с is-элементами
элементами в процессе перемещения.
8
Рисунок 1.. Строение инсерционного
и
транспозона [Joanne M.. Willey et al. 2008].
Составные транспозоны.
транспозоны
•
Содержат дополнительные гены (устойчивости к антибиотикам или
токсинам), фланкированные IS последовательностями.
•
Частота перемещения зависит от типа транспозона. Считается, что они
произошли от 2 ассоциированных
инсерционных транспозона, включая область
кодирующих генов между ними.
Рисунок 1.. Строение составного транспозона [Joanne M. Willey et al. 2008].
Репликативный транспозон.
транспозон
•
Перемещаются посредством механизма репликативной транспозиции
транспозиции.
Процесс катализируется белком ресольвазой (сайт-специфическая
(
специфическая рекомбинация).
•
Исходный транспозон остается в исходном сайте, реплицируясь на участке
ДНК-мишени.
Рисунок 1.. Строение репликативного транспозона [Joanne M
M. Willey et al. 2008].
9
Рисунок 1. Транспозон встраивается в соответствующем сайте [Joanne M. Willey et
al. 2008].
Рисунок 1.. Вырезание транспозона [Joanne M. Willey et al.. 2008]
2008].
10
Рисунок 1. Перенос транспозона на новую ДНК-мишень [Joanne M. Willey et al.
2008].
Функции транспозонов.
•
Могут встраиваться в гены, вызывая мутации или стимулируя хромосомные
перестройки, делеции.
•
Могут переносить стоп-кодоны либо промоторные участки, что влияет на
транскрипцию или трансляцию гена-мишени.
•
Часто перемещаются между плазмидами, которые могут содержать
несколько транспозонов.
•
Могут перемещаться между плазмидами и хромосомами, создавать
плазмиды устойчивости, содержащие несколько генов устойчивости к антибиотикам.
Мобильные элементы генома прокариот: плазмиды.
Плазмиды. Небольшие молекулы ДНК (от 1 000 п.н. до неск. сот тыс. п.н.),
способные к самостоятельной репликации (репликон). Существуют в свободном
состоянии или в составе хромосом, это свойство отличает плазмиды от транспозонов,
которые не существуют вне хромосомы. Эписомы – плазмиды, способные к обратимой
интеграции в хромосому. Крупные плазмиды, содержащие гены «домашнего хозяйства» –
называют хромосомами. Плазмиды состоят из модулей: обязателен репликативный,
другие опциональны. Плазмиды реплицируются независимо от хромосомы, могут
11
существовать в большом количестве в клетке. Могут содержать мобильные элементы
(транспозоны), способные переходить от плазмиды к хромосоме и между плазмидами.
Рисунок 1. Плазмиды в свободном состоянии и интегрированные в бактериальную
хромосому. 1 – бактериальная хромосома, 2 – плазмиды, 3 – деление, 4 – ДНК с
включенным материалом плазмид. [Joanne M. Willey et al. 2008].
Понятие мобилом – объединяет мобильные генетические элементы клетки.
Плазмиды способны переносить генетический материал при конъюгации бактериальных
клеток (F-плазмиды). В их состав входят гены белков пилей и другие, всего до 14 генов.
Плазмиды контролируют количество своих копий в клетке, в зависимости от типа
плазмиды это число варьирует от 1 до100, но для каждого типа относительно постоянно.
Плазмиды контролируют собственную репликацию по механизму обратной связи на
уровне инициации репликации. Плазмиды с одним типом контроля репликации или
системы распределения несовместимы, плазмиды с разными типами репликации
совместимы. Несовместимость не зависит от дополнительных генов плазмид.
Сохранение
плазмид
в
бактериальной
клетки
обеспечивают
системы
распределения, особенно важные для плазмид присутствующих в количестве одной или
нескольких копий. Системы распределения обеспечивают попадание в дочерние клетки
хотя бы одной копии плазмиды. Они включают белки, функция которых схожа с
функцией эукариотических центромер.
12
В
плазмидах
могут
переносится
гены
устойчивости
к
антибиотикам,
вирулентности, синтеза, деградации ксенобиотиков и азотфиксирующих ферментов.
Рисунок 1. Структура F-плазмиды. Показаны инсерционные последовательности
необходимые для интеграции плазмиды [Joanne M. Willey et al. 2008].
Горизонтальный перенос генов прокариот.
Горизонтальный перенос генов – перенос генов между 2 прокариотическими
организмами. Важный механизм увеличения генетического разнообразия у прокариот.
Часть геном – экзогенот переноситься от донора к реципиенту и интегрируется в
эндогенот. Мерозигот временное диплоидное состояние части наследственного
материала прокариот. Бактерии способны обмениваться участками наследственного
материала, в том числе генами устойчивости к антибиотикам. Обмен может происходить
между непатогенными и патогенными формами.
•
Конъюгация. Прямой перенос ДНК во время физического контакта клеток.
•
Трансформация.Перенос свободных молекул ДНК.
•
Трансдукция. Перенос молекул ДНК с участием бактериальных вирусов.
13
Конъюгация бактерий.
бактерий Конъюгация – перенос генетического материала между
бактериальными клетками при помощи прямого клеточного контакта. Включает Fфактор (F-плазмиду), половые пили и систему секреции IV типа.
Рисунок 1. Эксперимент Д. Ледерберга и Э. Тэйтума (1946), доказавший явление
конъюгации [Joanne M. Willey et al. 2008].
Рисунок 1. Эксперимент Б. Дэвиса, показавший роль физического контакта при
конъюгации (слева) и микрофотография конъюгации
к
E.coli [Joanne
Joanne M. Willey et al. 2008].
При F+ X F- конъюгации,
конъюгации F-плазмида
плазмида существует независимо от бактериальной
хромосомы и переносится в клетку реципиента целиком, гены донора обычно не
переносятся. При Hfr-конъюгации
конъюгации,, происходит частичная репликация донорской ДНК,
переноситься только
ко цепь ДНК (Hfr),
( ), содержащая гены плазмиды и хозяина, F-плазмида
интегрирована в хромосому хозяина и не переносится целиком.
14
Рисунок 1. Схема процесса F+ X
F- конъюгации coli [Joanne
Joanne M. Willey
et al. 2008].
15
Hfr-конъюгация.
Инсерция F-плазмиды в бактериальную хромосому с образованием Hfr-клетки.
Затем происходит конъюгация Hfr-клетки с новым реципиентом.
Рисунок 1. Схема процесса Hfr-конъюгации E. coli [Joanne M. Willey et al. 2008].
Трансформация.
Впервые явление трансформации описано Ф. Гриффитом в 1928. Включает перенос
ДНК без участия дополнительных структур. Внесенная ДНК включается в геном и может
наследоваться.
Часто фрагменты ДНК выходят во внешнюю среду при лизисе клетки, при
попадании в «компетентную» клетку вызывают трансформацию. Средняя частота
трансформации «компетентных клеток» 10-3. Компетентность зависит от размеров
16
популяции, при достижении больших размеров 107-108 кл./мл., на поверхности
экспрессируется белок отвечающий за трансформацию. Происходит в почвенных и
водных экосистемах. Трансформация может осуществляться фрагментами ДНК и
плазмидами.
Рисунок 1. Трансформация фрагментами ДНК и плазмидами [Joanne M. Willey et al.
2008].
Процесс трансформации требует наличия компетентных бактериальных клеток.
Компетентность может быть вызвана искусственно при воздействии физических или
химических агентов, либо природной: индуцибельной (например. S.pneumoniae) или
конститутивной (например, Neisseria gonorrhoeae).
Процесс формирования компетентности относительно хорошо изучен у бактерия
B.subtilis. Первый этап – связывание ДНК с поверхностными структурами, облегчающими
проникновение через оболочку. Далее цепи связанной ДНК подвергаются разрезанию с
образованием фрагментов определенной длины. Затем молекула ДНК поглощается
клеткой со скоростью 50-200 нуклеотидов в секунду. Интеграция в геном происходит с
помощью RecE-зависимой рекомбинации. Процесс схож с гомологичной рекомбинацией у
Ecoli, интегрируется примерно 75% ДНК.
17
У Streptococcus pneumonia появление компетентности связано с накоплением в
культуральной
жидкости
фактора
компетентности
(С ).
(СF).
Это
основной
белок,
взаимодействующий с рецепторами клеточной стенки. Поглощение одной из цепей
сопровождается ее деградацией.
Трансформация бактерий Streptococcus pneumonia.Генетический
Генетический материал от
клеток s-формы,
формы, убитых нагреванием попадает в живые
живые клетки R-формы, вызывая их
трансформацию в патогенную S-форму [Joanne M. Willey et al.. 2008]
2008].
Механизмы перенос
ереноса ДНК в бактериальную клетку. форму [Joanne M. Willey et al.
2008].
18
Для переноса ДНК через клеточные оболочки имеются сложные системы,
включающие ферменты нуклеазы, транслоказы и другие, а также некоторые структурные
белки образующие канал для перемещения ДНК. Один из таких механизмов – система
секреции IV типа.
Трансдукция.
Трансдукцию
осуществляют
бактериофаги,
переносящие
невирусную информацию. Фаги – вирусы бактерий, используют аппарат синтеза белка и
репликации ДНК клетки. Профаг – внедренный в хромосому геном вируса. Ошибки в
жизненном цикле фага могут приводить к попаданию в капсид вируса фрагментов ДНК
бактерии. В зависимости от особенностей жизненного цикла фаги делятся на 2 группы.
Вирулентные фаги вызывают лизис клетки после увеличения количества фаговых частиц
в клетке – литический цикл. Умеренные фаги внедряются в геном хозяина, совместно
реплицируются длительное время – лизогенный цикл.
Общая трансдукция. Описана в 1951г. Дж.Ледербергом и Н.Циндером.
Представляет неспецифический перенос разнообразных генов хозяина. Во время лизиса
клетки-хозяина обломки ДНК хозяина (0,5 – 2,5 %) укладываются под капсидную
оболочку вместе с ДНК фага. Подобная трансдукция характерна для литических циклов.
Под капсидную оболочку попадают случайные фрагменты ДНК, образовавшиеся при
лизисе. Наследование внесенной ДНК происходит только при условии успешной
гомологичной рекомбинации с ДНК клетки-хозяина. Если ген не может быть
интегрирован в геном хозяина – абортивная трансдукция.
Специфическая трансдукция. Представляет собой перенос ограниченного числа
генов, расположенных в участке включения ДНК фага в хромосому бактерии. Происходит
в результате ошибки лизогенного цикла, когда профаг покидает хромосому хозяина, при
этом вырезание может быть неточным, захватывая участок ДНК хозяина (5-10%).
Наиболее известный пример – фаг лямбда, который размножается 2 способами: при
литическом цикле присутствует в виде автономной молекулы ДНК, которая обеспечивает
синтез фаговых частиц. В инфицированной клетке образуются сотни фаговых частиц,
которые освобождаются при лизисе.
При лизогенном цикле ДНК фага интегрирована в хромосому. Большая часть
генома фага инактивирована общим репрессором и реплицируется пассивно вместе с
бактериальной хромосомой. Дефектный фаг может содержать гены, следующие на
хромосоме за точкой внедрения и профагом.
19
Включение фага лямбда в бактериальную хромосому происходит путем сайтспецифической рекомбинации в специальных сайтах фага attP фага и attB бактериальной
хромосомы.
Адаптация у бактерий (Флуктационный тест Лурии и Дельбрюка).
В 1943 г. С. Лурия и М. Дельбрюк доказали спонтанное возникновение мутантов
бактерий с помощью флуктуационного теста. В эксперименте с участием бактериофага
Т1, обладающего высокой вирулентностью в отношении бактерий E. coli, исследовался
процесс возникновения резистентности у данных бактерий к фагу. Рассматривались две
рабочие гипотезы: Дарвиновский механизм, согласно которому мутации предсуществуют
в
бактериальной
приспособленные
колонии,
формы
и
будут
Ламарковский
возникать
механизм,
согласно
непосредственно
при
которому
воздействии
неблагоприятного фактора.
В ходе эксперимента чувствительных к фагу бактерий заселяли в пробирки с
жидкой питательной средой (всего 20 пробирок), в которой проходило несколько циклов
деления. Содержимое каждой пробирки высевается на питательную среду, содержащую
бактериофаг, каждая устойчивая клетка образует колонию, все чувствительные клетки
погибают.
Принцип флуктуационного теста заключается в следующем: если устойчивые
мутанты возникают при контакте с фагом, то каждая культура независимо от того, из
какой части она была взята, должна содержать приблизительно одинаковое количество
устойчивых клеток. В этом случае в каждом повторе появляются устойчивые клетки, при
этом количество колоний на каждой чашке будет приблизительно одинаковым,
приближаясь к нормальному распределению («Ламарковский» механизм). Полученные
результаты будут отражать определенную среднюю вероятность адаптации к новым
условиям (рисунок 1 А).
Если же устойчивые бактерии возникли спонтанно, до обработки фагом, то в
зависимости от времени возникновения устойчивой клетки в пробирке с клеточной
суспензией будет находиться разное число устойчивых клеток. Например, рассмотрев 4
цикла делений, в которых образуется 24 = 16 клеток в 3 пробирках, можно получить
следующие результаты:
1 пробирка. Устойчивой клетки не возникло на протяжении 4 делений, число
устойчивых колоний при посеве на среду с фагом = 0 (рисунок 1 Б).
20
2. пробирка. Устойчивая клетка возникла в 3-м делении, число устойчивых
колоний = 2 (рисунок 1 В).
3 пробирка. Устойчивая клетка клетка возникла в первом делении, число
устойчивых клеток = 8 (рисунок 1 Г).
Рисунок
1.
Предполагаемые
результаты
флуктационного
теста
в
случае
«Ламарковского» и «Дарвиновского» механизма адаптации.
А – в каждой из культур чашек проявляются устойчивые формы (3, 1, 5, 1).
Б, В,Г – устойчивые формы возникают спонтанно, количество устойчивых клеток
зависит от момента их возникновения.
В результате эксперимента Лурии и Дельбрюка (флуктационного теста) были
получены резкие колебания численности устойчивых клеток (0, 1, 3, 5, 6, 35, 64, 107
колоний). Такой результат согласуется с предполагаемым «Дарвиновским» механизмом:
при культивировании в каждой пробирке спонтанно на разных стадиях развития
бактериальных колоний возникают мутации устойчивости к бактериофагу.
Позже результаты опыта были подтверждены в 1949г. в работах Ньюкомба
(перераспределительный тест Ньюкомба). В исследовании сравнивались результаты
21
пересева бактерий E.coli из чашек, где бактерии были перераспределены шпателем с
результатами посева бактерий из контрольных чашек. Перераспределение приводило к
тому, что отдельные колонии, состоящие из устойчивых к фагу мутантных клеток
рассеивались по всей поверхности чашки. Далее чашки засевались фагом, при этом
чувствительные клетки гибли. На чашках, где проводилось перераспределение, число
колоний оказалось значительно больше, в сравнении с контролем. Если бы устойчивые
мутанты возникали только при контакте с фагом, то число колоний в опыте и контроле
было бы примерно одинаковым.
В 1952г. Эстер и Джошуа Ледерберг провели эксперимент по непрямому отбору
фагоустойчивых мутантов методом реплик. Для этого выращивался бактериальный
«газон» из чувствительных клеток, с которого с помощью специальной ворсистой ткани
переносился отпечаток на чашки Петри содержащие бактериофаг. При этом рисунок
расположения отдельных устойчивых колоний был идентичен на все чашках, что
свидетельствует о том, что устойчивые мутанты возникли на исходной чашке засеянной
бактериальным газоном, а на чашках с фагом выросли лишь предсуществующие мутанты.
Эти эксперименты убедительно поддержали «Дарвиновский» механизм возникновения
устойчивых форм.
Опыт Джона Кернса 1988г. задумывался как эксперимент схожий с работами
Лурии и Дельбрюка, однако результаты этого эксперимента были неоднозначны. В работе
использовался мутантный штамм lac- бактерий, неспособных к метаболизму лактозы,
такие бактерии не растут на средах, содержащих лактозу в качестве единственного
источника энергии. При пересеве таких бактерий на среду с лактозой, вырастают только
бактерии-ревертанты lac+. После пересева и суточного роста наблюдалась картина
аналогичная опыту Лурии и Дельбрюка, однако через 2 и 3 суток роста количество
устойчивых колоний значительно возросло. В эксперименте Кернса, lac- бактерии не
погибали при пересеве на среду с лактозой, и часть этих клеток сумела приспособиться к
питанию
лактозой.
Также
необходимо
учесть,
что
мутировавший
фермент
характеризуется небольшой активностью, отличной от нуля. Некоторые бактериальные
клетки за счет дупликации генов могут частично восстановить ферментативную
активность, позволяющую им медленно развиваться на среде с лактозой. Таким образом,
эксперимент Кернса принципиально не противоречит «Дарвиновской» модели, дополняя
ее возможностью изменения характера работы генов в неблагоприятных условиях.
В 2005 году сотрудниками Danisco Рудольфом Барангу и Филиппом Хорватом
проводились опыты с культурами Streptococcus thermophilus. Эти работы имели
22
практическую цель получить штаммы бактерии, применяемой для производства
молочных продуктов, устойчивой к бактериофагам. В результате были открыты CRISPкассеты, участки ДНК содержащие короткие фрагменты (спейсеры) схожие у бактерии и
фага. Считается, что набор спейсеров отвечает за способность фага поражать бактерию.
Повторяя опыт Лурии и Дельбрюка, можно получить штаммы приобретающие
устойчивость к тому штамму фага, которые содержится в чашке Петри, благодаря
уникальной
комбинации
спейсеров.
В
данном
случае
наследование
признака
устойчивости является полностью «Ламарковским».
Изначальная
предпосылка
–
разделение
механизмов
наследования
на
«Дарвиновскую» и «Ламарковскую» модели мало применима для живых объектов, также
не имеет смысла поиск правоты одной из гипотез. Пример прокариотических организмов
убедительно показывает реализацию двух этих механизмов в различных генетических
системах.
23