Я. Н. Демурин, А. А. Перстенѐва, ГНУ ВНИИМК

МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского
института масличных культур. Вып. 1 (140), 2009
__________________________________________________________
Я. Н. Демурин,
доктор биологических наук, профессор
А. А. Перстенѐва,
научный сотрудник
ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. Филатова, 17
тел.: (861)274-55-94, факс: (861)254-27-80
e-mail:jakdemurin@jandex.ru
СПОСОБ ОТБОРА ГЕТЕРОЗИГОТНЫХ ИМИДАЗОЛИНОНО-УСТОЙЧИВЫХ
РАСТЕНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА В УСЛОВИЯХ ФИТОТРОНА
Ключевые слова: подсолнечник, генотип, имидазолиноны, гербицидоустойчивость, фитотрон
УДК 633.854.78:575
Введение. Устойчивость к имидазолиноновым гербицидам, обнаруженная в популяции
дикорастущего подсолнечника в 1999 г., привлекла внимание селекционеров во всѐм мире [3]. Мутантный
фермент ALS-синтаза гарантирует устойчивость этой культуры к воздействию гербицидов имидазолинонового ряда, что позволяет использовать их на посевах подсолнечника. Ранее это не удавалось из-за отсутствия
резистентности у обычных генотипов. Наследование признака устойчивости подсолнечника к имидазолиноновым гербицидам осуществляется по типу неполного доминирования [2, 5].
Гербицидоустойчивые генотипы выдерживают обработку 2х (двукратной) рекомендованной дозой
гербицида в полевых условиях. Как правило, для ускорения селекционного процесса ежегодно практикуется
выращивание образцов в камерах фитотрона. Однако в научной литературе отсутствуют сведения об оптимальной дозировке гербицида для обработки растений в условиях искусственного климата.
Рабочая гипотеза основывалась на том, что потенциал генетической устойчивости к гербицидам не
безграничен. Так, летом 2004 г. в теплице ВНИИМК проводился опыт по оценке устойчивости к гербициду
Пивот, ВК различных генотипов подсолнечника. Исследовались два набора генотипов: гербицидоустойчивая
линия НА425, восприимчивая линия ВК876 и F1 НА425×ВК876, а также гербицидоустойчивая линия
RHA426, восприимчивая линия ВК508 и F1 RНА426×ВК508. В двух коробах с почвенно-песчаной смесью
было выращено по 70 растений каждого набора. На стадии двух пар настоящих листьев растения были обработаны раствором гербицида Пивот, ВК (100 г/л, д.в. имазетапир) в дозировке 2х (концентрация – 6 мл Пивота на 1 л воды). Через 10 дней растения всех генотипов, включая гомозиготные имидазолиноноустойчивые НА425 и RHA426, погибли.
В лаборатории генетики ВНИИМК с донорами гербицидоустойчивости ведѐтся работа по двум направлениям: создание новых линий генетической коллекции подсолнечника и аналогов уже существующих
селекционных линий. Так, с 2005 г. создаются имидазолиноно-устойчивые аналоги линий ВК876, ВК678,
ВА93, ВК680, ВК508 и ВА325. Получение аналогов осуществляется путѐм многократного беккроссирования,
т.е. переноса признака с линии-донора на селекционную линию-реципиент. Расщепление в поколениях ВСn
происходит по схеме 1:1 (1 гетерозигота : 1 рецессивная гомозигота). При этом важным этапом в успешном
создании аналогов является обработка гербицидом растений ВСn с целью отбора устойчивых гетерозигот.
В ходе дальнейших предварительных экспериментов в условиях камеры фитотрона выяснилось, что
доза гербицида 1х негативно воздействует на растения ВСn. Даже устойчивые гетерозиготные растения страдают от этой дозы и не переходят в генеративную фазу развития. Поэтому чаще всего создание аналогов линий в фитотроне происходило без обработки гербицидом при гибридизации методом парных скрещиваний,
что увеличивало объѐм опытов в камерах искусственного климата.
В связи с этим целью наших исследований было изучение влияния различных доз гербицида в зависимости от генотипа растений в условиях фитотрона. С помощью предполагаемой оптимальной дозы должны визуально дифференцироваться гетерозиготы и рецессивные гомозиготы, что позволит использовать
метод отбора гетерозиготных растений при создании аналогов селекционных линий подсолнечника.
Материалы и методы. Опыт по выявлению оптимальной дозировки гербицида в условиях фитотрона проводился в камере искусственного климата ЦЭБ ВНИИМК с 18 ноября по 29 декабря 2008 г. Использовались светильники Фотос. 4 с лампами ДРИ-2000-6, обеспечивающие освещѐнность 25 килолюкс при 16часовом световом дне и дневной температуре воздуха около 20˚С. Заделка семян в почву осуществлялась в
два короба с почвенно-песчаной смесью (2:1) на глубину 2-3 см. В эксперименте использовалась американская линия-донор признака гербицидоустойчивости RHA426, селекционная R-линия ВНИИМК ВК508 и гибрид F1 этих линий. RHA426 гомозиготна по гену устойчивости (Imr Imr), ВК508 является рецессивной
гомозиготой (imr imr) и растения F1 ВК508×RHA426 гетерозиготны по изучаемому признаку (Imr imr). Перед
обработкой гербицидом была измерена высота растений.
Растения опрыскивали ручным пульверизатором на стадии трѐх пар настоящих листьев (V6 – по международной номенклатуре) гербицидом пульсар, ВР (40 г/л, д.в. имазамокс) из группы имидазолинонов.
Для работы был выбран ряд логарифмически снижающихся доз [1], где процент снижения концентрации (Р) составил 50 %: обработка гербицидом в дозировках 1х (3 мл/л), 0,5х (1,5 мл/л), 0,25х (0,75 мл/л) и
контроль (опрыскивание водой). Приготовление рабочих растворов гербицида осуществлялось методом последовательного разведения.
Через 14 дней после обработки на стадии развития растений V10 была произведена оценка влияния
гербицида на растения и повторно измерена их высота. Прирост растений рассчитывался как разница высоты
растения до и после обработки гербицидом:
h V10 – h V6 ,
(1)
где h – высота растения, V6 и V10 – фаза онтогенеза растения.
Степень поражения гербицидом оценивалась с помощью модифицированной шкалы определения
индекса фитотоксичности, где 0% – растения без поражений (контрольные, или не обработанные гербицидом
растения); градация 10-30% показывает различную степень хлороза, 40% – полное пожелтение листьев. Интервал 50-90% – повышение степени некроза листьев, а индекс 100% характеризует полностью погибшие от
гербицида растения [4].
Эффект действия гербицида на прирост растений различных генотипов рассчитывался по формуле
[1], модифицированной в лаборатории генетики ВНИИМК с целью учѐта направления (знака) влияния:
Э 100
Роп
Рк
100,
(2)
где Роп и Рк – соответственно показатель состояния тест-объекта в опыте с гербицидом и в контроле.
Результаты и обсуждение. Эффект действия гербицида пульсар на растения отмечался на качественном и количественном уровне во всех вариантах опыта.
Растения линии RHA426 были устойчивы при всех дозах пульсара. При дозе 0,5х и 1х наблюдалось
незначительное пожелтение листьев и точки роста. Растения неустойчивой линии ВК508 погибли при всех
дозах (рис. 1).
RHA426 (Imr Imr)
F1 (Imr imr)
ВК508 (imr imr)
Рисунок 1 – Влияние гербицида пульсар на растения различных генотипов подсолнечника в условиях
фитотрона через 14 дней после обработки
Слева-направо: контроль, дозы гербицида: 0,25х, 0,5х и 1х
Гетерозиготные растения F1 выжили при всех вариантах опыта, но при этом с увеличением дозы
происходило повышение степени хлороза листьев. При дозе гербицида 0,25х индекс фитотоксичности у гетерозиготных растений составил 10%, но точка роста сохранила свою жизнеспособность (табл. 1).
Таблица 1 – Индекс фитотоксичности1 исследуемых генотипов, %
Краснодар, ЦЭБ ВНИИМК, 2008 г.
Генотип
Вариант
RHA426
ВК508
F1(ВК508×RHA426)
Контроль
0
0
0
Доза 0,25х
0
70
10
Доза 0,5х
10
100
20
Доза 1х
20
100
30
Примечание: 1 – 0 % − растения без поражений;
10-30 % − повышение уровня хлороза;
40 % − полное пожелтение листьев (без некрозов);
50-90 % − полное пожелтение и повышение степени некроза листьев;
100 % − полностью погибшие растения (некротизированные).
Результаты измерения высоты растений на стадиях V6-V10 показали негативное влияние различных
концентраций гербицида на прирост у выживших растений RHA426 и F1. Растения линии ВК508 прекратили
рост после обработки гербицидом и погибли. Л ю бо п ы т но о тм е т и ть, ч то пр ир о ст в 1 0 ,6 см у го м о зи го т н ы х р ас те н и й л и н и и RH A4 2 6 пр и о бр або т ке 0 ,2 5 х (0,75 мл/л) был достоверно выше прироста в 8,3 см в контроле (табл. 2), т.е. слабая концентрация гербицида оказала стимулирующее действие на рост
растений (рис. 2).
40
20
0
ЭД гербицида, %
контроль
0,25х
0,5х
1х
-20
RHA426
ВК508
-40
F1
-60
-80
-100
-120
Доза гербицида
Рисунок 2 – Эффект действия гербицида (ЭД) на прирост растений подсолнечника, %, 2008 г.
Доминантная гомозигота RHA426 показала прирост растений во всех вариантах опыта. В случае дозы 0,25х прирост превысил таковой по сравнению с контролем (табл. 2).
Таблица 2 – Высота и прирост растений подсолнечника, гомозиготного по гену Imr генотипа RHA426
Период после
всходов, дни
Фаза
онтогенеза
20
V6
34
V10
20
V6
34
V10
20
V6
34
V10
20
V6
34
V10
Доза
гербицида
Контроль
0,25х
0,5х
1х
Краснодар, ЦЭБ ВНИИМК, 2008 г.
Средняя высота
Средний
растения, см
прирост растения,
см
17,6
8,3*
25,9
15,2
25,8
10,6*
13,0
17,6
4,6*
15,9
19,3
3,4*
НСР05=1,8; * – различия достоверны (р<0,05)
Рецессивная гомозигота ВК508 показала прирост растений лишь в контроле (табл. 3). Все три дозы
гербицида остановили рост растений и привели к их гибели – тотальному некрозу тканей.
Таблица 3 – Высота и прирост растений подсолнечника селекционной линии ВК508 (imr imr)
Период после
всходов, дни
Фаза
онтогенеза
Доза
гербицида
20
V6
Контроль
34
V10
20
V6
0,25х
34
V10
20
V6
0,5х
34
V10
20
V6
1х
34
V10
НСР05=1,8; * – различия достоверны (р<0,05)
Краснодар, ЦЭБ ВНИИМК, 2008 г.
Средняя
Средний
высота растеприрост
ния, см
растения, см
12,5
20,1
7,6 *
14,2
14,6
0,4
10,7
10,1
-0,6
13,9
13,5
-0,4
Гетерозиготное поколение показало прирост растений, но в вариантах с гербицидом он был меньше
по сравнению с контрольными растениями (табл. 4). Однако степень хлороза у обработанных растений была
незначительна (см. табл. 1).
Таблица 4 – Высота и прирост растений генотипа F1 (RHA426×ВК508)
Краснодар, ЦЭБ ВНИИМК, 2008 г.
Период после
всходов, дни
Фаза онтогенеза
20
V6
34
V10
20
V6
34
V10
20
V6
34
V10
20
V6
34
V10
Доза гербицида
Контроль
Средняя
высота растения, см
16,7
Средний
прирост
растения, см
28,7
12,0 *
16,4
0,25х
22,9
6,5 *
14,3
0,5х
19,9
5,6 *
14,4
1х
19,6
5,2 *
НСР05=1,8; * – различия достоверны (р<0,05)
Полученные данные по приросту растений были обсчитаны с помощью приведѐнной выше формулы
(2). Она позволяет измерить эффект действия гербицида, а знак указывает на то, какое это действие – положительное (+) (стимулирующее) или отрицательное (−) (угнетающее). Например, -100 % у ВК 508 означает,
что гербицид пульсар подействовал отрицательно на линию 100 %, растения прироста не дали
(рис. 2). У
F1 негативное действие гербицида уменьшается со снижением дозировки. Интересен факт, что гербицид в
дозе 0,25х оказал стимулирующий эффект на рост гомозиготных растений RHA426. Положительный эффект
действия гербицида составил +27 %.
В последующих опытах по созданию аналогов селекционных линий подсолнечника в камерах искусственного климата удалось опробовать новую методику на растениях ВС 3. После обработки 0,25х
(0,75
мл/л) раствором гербицида у рецессивных гомозигот наблюдались некрозы листьев и точки роста (рис. 3а).
Гетерозиготные по гену Imr растения восстановились спустя 10 дней после обработки (рис. 3б). С такими
растениями продолжается дальнейшая селекционная работа по созданию поколений ВС4.
гетерозиготное
растение
некроз
тканей
а
б
Рисунок 3 – Растения ВС3 при создании аналога линии ВА93, устойчивого к гербицидам
из группы имидазолинонов
а – гомо- и гетерозиготные растения после обработки гербицидом пульсар;
б – гетерозиготное растение, перешедшее в генеративную фазу развития
МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского
института масличных культур. Вып. 1 (140), 2009
__________________________________________________________
Заключение. Гербицид пульсар, ВР (40 г/л) в ко нц ен тр а ц и я х 3 ,0 ; 1 ,5 и 0,75 мл/л замедляет
рост гербицидоустойчивых гомо- и гетерозиготных растений подсолнечника. Повышение дозы гербицида
при этом увеличивает степень пожелтения листьев. Неустойчивые растения при обработке в изученных дозах погибают. Д о за гер б и ц и да п ул ь сар 0 ,2 5 х ( 0 ,7 5 мл/л) уничтожает неустойчивые гомозиготные
растения, но позволяет выжить гетерозиготам при минимальной степени хлороза листьев, что делает возможным использование этой дозы для отбора гетерозигот в беккроссном потомстве при создании имидазолиноно-устойчивых аналогов селекционных линий в условиях фитотрона.
Благодарности. Авторы выражают признательность заведующему фитотронно-тепличного комплекса ВНИИМК, кандидату с.-х. наук И. И. Ветру и его сотрудникам за техническое содействие в проведении эксперимента.
Литература
1. Практикум по химической защите растений / Под ред. Г. С. Груздева. – М.: Колос, 1992. – 271 с.
2. Демурин, Я. Н. Передача гена устойчивости к имидазолиноновым гербицидам в селекционный материал подсолнечника ВНИИМК /Я. Н. Демурин, А. А. Перстенѐва // Масличные культуры. – 2007. – Вып.
№ 2 (137). – С. 18-23.
3. Al-Khatib, K. Imazethapyr resistance in common sunflower (Helianthus annuus L.) / K. Al-Khatib, J. R.
Baumgartner, D. E. Peterson [et al.] // Weed Science. – 1998. – № 46. – Р. 403-407.
4. Sala, C. Development of CLHA-Plus: a novel herbicide tolerance trait in sunflower conferring superior
imidazolinone tolerance and ease of breeding / C. Sala, M. Bulos, M. Echarte [et al.] // Proc. 17 th ISC – Spain:
Córdoba (7, February, 2008). – P.489-494.
5.Bruniard, J. M. Inheritance of imidazolinone-herbicide resistance in sunflower / J.M. Bruniard, J.F. Miller // Helia.
– 2001. – Vol. 24. – Р. 11-16.