•

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
Выявление нейроспецифических
белков в сыворотке крови и ликворе у
собак при оценке проницаемости ГЭБ
УДК 616-07 :616.8:619
А.М. Арнопольская1, 2, С.А. Ягников2, 3
1
2
3
Лаборатория иммунохимии ГНЦ социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского.
Российский университет дружбы народов.
Клиника экспериментальной терапии ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН.
Ключевые слова: гематоэнцефалический барьер, ди
агностика, иммунохимический анализ, ликвор, собака, сы
воротка крови
Сокращения: ГЭБ — гематоэнцефалический барьер;
ИФА — иммуноферментный анализ; НСБ — нейроспеци
фические белки; СМЖ — спинномозговая жидкость;
ЦНС — центральная нервная система; a24GP — альфа2
кислый протеин; GFAP — глиофибриллярный кислый протеин
Введение
Иммунохимический анализ сыворотки крови и СМЖ на
содержание НСБ — один из новейших диагностических ме
тодов, с помощью которого можно оценить в первую очередь
степень повреждения ГЭБ ( нарушение проницаемости ), что
позволяет прогнозировать исход заболеваний ЦНС. Прогноз
при данных заболеваниях у собак — актуальная проблема,
т.к. у 3 % животных этого вида, поступающих в клинику ,
обнаруживают неврологическую патологию [4].
При исследовании проб СМЖ и сыворотки крови пользуют
ся несколькими методиками ИФА. В лаборатории иммунохимии
ГНЦ социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского раз
работаны специальные методики для количественного определе
ния каждого вида НСБ, содержащихся в биологических образ
цах в очень низких концентрациях. Наибольшая чувствительность
отмечена у метода твердофазного ИФА [3].
Согласно результатам медицинских исследований прони
цаемости ГЭБ наиболее достоверно на его повреждение ука
зывает изменение концентрации в биологических жидкостях
GFAP и α2GP, которые служат маркерами состояния глиаль
ной ткани (астроглии и олигодендроглии) ЦНС. По данным
литературы, любое повреждение ЦНС вызывает гибель и дис
функцию глиальных клеток. Это влечет за собой выход НСБ
в ликвор и затем, через поврежденные капилляры, в крово
ток. НСБ обладают высокой антигенностью, и антитела, вы
рабатываемые иммунной системой, усугубляют функцио
нальные последствия нарушения целостности ГЭБ [2, 3].
По содержанию НСБ в сыворотке крови и ликворе мож
но достоверно судить о степени повреждения ГЭБ и тем са
мым ЦНС, а исследуя концентрацию НСБ в динамике в тече
ние 2 нед, сделать вывод о том, прогрессирует патологичес
кий процесс или восстанавливается барьерная функция ГЭБ.
Цель исследования
Мы ставили перед собой цель изучить прогностическую
значимость иммунохимического анализа СМЖ и сыворотки
крови у собак с неврологическими расстройствами при ком
прессионных заболеваниях спинного мозга. Для этого было
необходимо определить:
• информативность данного метода при оценке тяжести
поражения ГЭБ у собак;
38
• параметры изменения ГЭБ в зависимости от степени не
врологических расстройств;
• возможность прогнозирования исхода заболевания по
результатам исследования в ИФА только сыворотки.
Материалы и методы
СМЖ была получена субокципитальной пункцией (ис
пользовали иглу 0,73 × 40 мм ). Сыворотку крови взяли у 4
собак с неврологическими расстройствами 2, 4 и 6й степе
ни ( классификация по Punzet и Walde) [5]. Пробы хранили
в морозильной камере при –8 °С. Содержание НСБ в био
логических сыворотках определяли посредством твердофаз
ного ИФА , техника которого состояла в следующем. В ячей
ки полистерольных планшетов вносили по 200 мкл раство
ра специфических антител к НСБ ( концентрацию антител
в каждом случае подбирали экспериментально). Раствор
антител оставляли в ячейках планшета на 12 ч при 4 °С для
адсорбции антител на поверхности дна и стенок ячеек. За
тем активизирующий раствор сливали, ячейки промывали
буфером и заполняли исследуемой жидкостью. В отдельные
ряды ячеек (контроль) вносили стандартные пробы с извес
тной концентрацией антигена. Через 2 ч белки, не связав
шиеся с антителами, отмывали с планшета, ячейки заполня
ли конъюгатом фермента с соответствующими антителами
и инкубировали в течение 3 ч, после чего конъюгат отмыва
ли. Активность пероксидазы, связанной с конъюгатом, про
являли 0,8%м раствором 5аминосалициловой кислоты,
содержащей 0,01 % пероксида водорода. Через 1 ч измеряли
оптическую плотность растворов в каждой ячейке на мно
гоканальном фотометре «Titertech Multiscan» фирмы «Flow
Laboratories» (Англия).
Результаты
При сравнении полученных результатов с предыдущи
ми ( нормальный уровень НСБ ) [5] оказалось, что у всех
исследованных собак повышена концентрация GFAP в сы
воротке крови и ликворе и с увеличением степени невро
логических расстройств возрастает содержание НСБ в
крови (таблица). Для оценки степени повреждения ГЭБ
наиболее информативным показателем следует считать
содержание GFAP.
Обсуждение
При оценке полученных результатов обнаружена корре
ляция между степенью неврологических расстройств, уста
новленной на основании данных неврологического обследо
вания пациентов, и уровнем НСБ в биологических жидкостях.
Анализируя содержание GFAP в сыворотке крови и СМЖ,
можно отметить следующие особенности:
• при усилении неврологической симптоматики возрас
тает концентрация GFAP в ликворе;
• у пациентов с 6й степенью неврологических расстройств
повышено содержание GFAP и в сыворотке крови, что ука
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
Содержание GFAP в зависимости от степени невроло4
гических расстройств (классификация по Punzet
и Walde)
Порядковый
номер
животного
Степень
невроло4
гического
расстройства
Ликвор,
нг/мл
Сыворотка
крови,
нг/мл
1
2
3
4
2
4
6
6
1,8
4,8
5,1
5,1
3,6
7,8
11,6
12,8
2,4
8,1
Норма
зывает на нарушение барьерной функции ГЭБ и выход белка
в кровь. ( По данным статистики, у пациентов с 6й степенью
неврологических расстройств прогноз неблагоприятный.)
На этом этапе исследования нельзя достоверно судить о
степени нарушения барьерной функции ГЭБ у животных, т.к.
еще не накоплено достаточно материала для подобных оце
нок. Кроме того, отмечена тенденция к корреляции содержа
ния НСБ в крови и ликворе. Это дает основание предпола
гать, что оценивать степень нарушения барьерной функции
ГЭБ и прогнозировать исход заболевания можно только по
результатам анализа сыворотки крови, что во много раз дос
тупнее, чем анализ СМЖ.
Выводы
Исходя из результатов исследования можно сделать сле
дующие выводы:
• существует корреляция между изменением концентра
ции НСБ в сыворотке крови и в СМЖ и степенью невроло
гических расстройств. Это позволяет предположить, что дан
ный метод исследования найдет применение при прогнози
ровании исхода компрессионных заболеваний спинного мозга
и других патологий ЦНС;
• с увеличением степени неврологических расстройств
увеличивается и степень поражения ГЭБ;
• вероятно, существует корреляция между показателями
НСБ в сыворотке крови и ликворе.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Березин В.А. Специфические белки нервной ткани в норме и при патоло
гии: Дис. …дра. мед. наук. – Днепропетровск, 1985.
2. Бредбери М. Концепция гематоэнцефалического барьера. – М.: Мир, 1983.
3. Чехонин В.П., Дмитриева Т.Б., Жирков Ю.А. Иммунохимический анализ
нейроспецифических антигенов. – М.: Медицина, 1999.
4. Ягников С.А., Вилковыский И.Ф. и др. Причины неврологических рас
стройств у мелких домашних животных. Материалы XI международного мос
ковского конгресса по болезням мелких домашних животных, Москва 2003.
5. Ягников С.А., Арнопольская А.М., Гурина О.И. Анализ нейроспецифических
белков в спинномозговой жидкости собак. Материалы XII международного мос
ковского конгресса по болезням мелких домашних животных, Москва 2004.
6. Aurell A., Rosengren L.E., Karlsson B., Olsson J.E., Zbornikova V., Haglid
K.G. Determination of S100 and glial fibrillary acidic protein concentrations in
cerebrospainal fluid after brain infarction. Stroke. 1991.
7. Herrmann M., Vos P., Wunderlich M.T., Chris H.M.M. de Bruijn, Lamers K.J.B.
Release of glial tissue – specific proteins after acute stroke/ A comparative analysis of
serum concentration of protein S100B and glial fibrillary acidic protein. Stroke. 2000.
8. Punzet G. und.Walde J. Vergleichende Untersuchungen zur conservativen und
operativen. Behanduiung der thorakolumbalen Enechondrosis intervertebralis
(Dackellahmung) beim Hund. Kleintierpraxis, 1981.
SUMMARY
A.M. Arnopolskaya, S.A. Yagnikov. Determination of neurospecifical proteins in the blood and cerebrospinal fluid of
dogs to value the penetrability of the blood-brain barrier. Authors compared penetrability of the blood-brain barrier with the
concentrations of neurospecifical protein (glial fibrillary acidic protein – GFAP) in the cerebrospinal fluid and blood of dogs with the
different stages of neurological disorders. Thus, there is a high level of GFAP in the cerebrospinal fluid and blood of dogs with the
deep stage of neurological disorder, therefore the deepest disorders of functions of the blood-brain barrier, and so , it is the
unfavorable prognostic factor.There is a correlation between the concentration of GFAP in the cerebrospinal fluid and blood, that
could be used in future for objective diagnostics of some neurological pathologies.
IVIS — сайт в Интернете, предоставляющий доступ к большой библиотеке
учебной и научной литературы по ветеринарии. Доступ на сайт для
ветеринарных врачей и студентов свободный (после регистрации)
The IVIS website provides free access to a large library of
veterinary textbooks and proceedings. Access is FREE for veterinarians and
veterinary students (registration is required)
РВЖ МДЖ №22005
39