Использование радионуклидов для изучения обмена веществ в

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ
ФГОУ ВПО «МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ
ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ
им. К.И. СКРЯБИНА»
Пак В.В.
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАДИОНУКЛИДОВ
ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ
В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ
Учебное пособие
Допущено Учебно-методическим объединением высших
учебных заведений Российской Федерации по образованию в области
ветеринарии и зоотехнии в качестве учебного пособия для студентов
высших учебных заведений, обучающихся по специальности
«Ветеринария» и «Зоотехния»
Москва - 2008
2
УДК 619:-616-073.916 (07)
Пак Василий Васильевич. – Использование радионуклидов для изучения обмена веществ в организме животных. -Учебное пособие. -М.:ФГОУ
ВПО МГАВМиБ, 2008, 44 с.
Предназначено
для
студентов
факультетов:
ветеринарнобиологического, ветеринарной медицины, зоотехнологий и агробизнеса
Изложены принципиальные основы радиоиндикаторного метода, сжато
и вместе с тем доступно даны необходимые сведения из области радиометрии, организации и проведения работ с радиоактивными индикаторами. Подобраны эксперименты, выполнение которых с достаточной полнотой знакомит студентов с практическим применением радионуклидов для изучения
основных видов обмена веществ – минерального, белкового и нуклеинового.
Рецензенты: доктор биологических наук, засл. деятель науки РФ,
профессор Журавлев А.И., доктор химических и биологических наук, профессор Зайцев С.Ю., доктор биологических
наук, профессор Котов Н.Н.
3
1. ОРГАНИЗАЦИЯ И ПРОВЕДЕНИЕ РАБОТ
С РАДИОАКТИВНЫМИИНДИКАТОРАМИ
Радионуклидный метод в современной науке служит одним из главных
инструментов научного познания. Ему обязаны многие важнейшие достижения биологии, медицины и сельского хозяйства. В данном учебном пособии
изложены принципиальные основы радионуклидного метода. Большое внимание уделено вопросам подготовки проб радиоактивного материала для радиометрии, а также планированию радиоиндикаторных экспериментов. В
первой части сжато и вместе с тем доступно для биологов изложены основные способы расчета активности радионуклидов так как при работе с радионуклидами необходимо учитывать изменение их активности со временем.
Поэтому в первой лабораторной работе подробно изложены методы расчета
активности и предлагается решить ряд задач, которые помогут получить первые навыки работы с радиоактивными веществами.
Во второй части подобраны эксперименты, выполнение которых с достаточной полнотой знакомит студентов с практическим применением радионуклидов для изучения основных видов обмена веществ в организме животных – минерального, белкового и нуклеинового.
Учитывая особую важность организационных мероприятий при работе
с радиоактивными веществами ниже приведены основные этапы организации
и проведения работ. В целях приобретения практических навыков работы с
радионуклидами следует выполнить ряд лабораторных работ, приведенных
ниже.
Лабораторная работа 1. Методы расчета активности и приготовление рабочих растворов радионуклидов.
Цель занятия – освоить методы расчета активности (количества) радионуклидов на заданное время и поправки на радиоактивный распад, а также приобрести практические навыки работы с открытыми радиоактивными
веществами.
При работе с радиоактивными веществами необходимо учитывать изменение активности их излучения со временем. Для этого нужно вводить поправку на радиоактивный распад. Учет поправки позволяет дозировать количество изотопа, подлежащего введению в исследуемую систему.
Часто бывает нужно иметь суждение о теоретически ожидаемой активности данного препарата в данный момент с тем, чтобы исключить влияние
распада, подметить специфику перераспределения изотопа, изменение интенсивности обмена и т. д.
Иногда с большим трудом решается вопрос о том, надо или не надо
вносить поправку на радиоактивный распад для данного изотопа, обладающего периодом полураспада, соизмеримым с длительностью эксперимента, и
если надо, то какую именно.
4
Правильное и быстрое производство расчетов, необходимых для решения этих задач, связано в первую очередь с быстрым вычислением величины
поправочного коэффициента на радиоактивный распад.
Обычно в литературе приводится уравнение радиоактивного распада и
значение константы распада: Nt = No•e-λt. λ = 0,693/T, где T – период полураспада.
Исходя из этих двух уравнений, каждому представляется возможность
самому определить величину поправочного коэффициента на радиоактивный
распад.
Можно видеть, что вычисление величины поправки, равной - e-λt является довольно сложным, так как связано с производством ряда математических действий.
Существующие методы (метод Хевеши по изотопам фосфора, натрия,
калия, активность которых им принята как исходной, равной 10.000 имп/мин,
по радону, активность излучения которого исчисляется по истечении каждого часа и принимается равной единице) очень громоздки.
Верховская И.Е. предлагает новый метод вычисления поправочного коэффициента на радиоактивный распад.
Этот метод является универсальным, так как позволяет вычислить значения поправок для всех радиоактивных изотопов, обладающих различными
периодами полураспада.
При разработке метода использовано универсальное уравнение радиоактивных превращений: Nt=No•e-λt,/1/
где Nt – число атомов простого радиоактивного вещества в момент
времени t; No – исходное число атомов простого радиоактивного вещества в
момент времени t = 0(No > Nt); е-основание натуральных логарифмов; λ–
постоянная распада данного изотопа; t–время.
Суть предложенного Верховской И.Е. метода заключается в том, что
при расчетах поправочного коэффициента К на радиоактивный распад
К  е 0,693t / T она выражает время t в долях периода полураспада Т, т. е. по существу определяется значение К= 0,693•t/T, где отношение t к Т [t/Т] является отвлеченным числом, не зависящим от того, в каких единицах измеряется
время (при нахождении величины отношения t/Т, конечно, t и Т должны выражаться в одних единицах измерения времени – секундах, минутах, днях,
годах).
Значения коэффициента К, вычисленные для различных значений времени t, являются универсальными, т. е. применимыми ко всем радиоактивным изотопам.
Для того чтобы рассчитать активность на заданное время необходимо
начальную активность (No) разделить на поправочный коэффициент (К): Nt =
No/К;
Для того, чтобы определить сколько было радионуклида, нужно имеющуюся активность умножить на коэффициент К: Nt = No•К.
5
Значения поправочного коэффициента (К) на радиоактивный распад
для различных значений времени (t) выраженного в долях периода полураспада (t/Т), находят по таблице.
Для приобретения практических навыков расчета активности, вычисления поправочного коэффициента на радиоактивный распад и приготовления рабочих растворов радионуклидов предлагается выполнить ряд упражнений.
Упражнение 1. Решить несколько задач разных типов, связанных с
учетом явления радиоактивного распада.
Типовая задача №1
Найти поправку на радиоактивный распад К, если от начала опыта
прошло время t.
Пример. Имеем препарат радиоактивного натрия (Т = 14,8 часов). Какую оправку надо внести по истечении 4 часов?
Решение. Определим, какую часть периода полураспада составляет 4
часа?
t/T = 4:14,3 = 0,27 (периода полураспада).
По таблице находим значение поправки К, соответствующее времени t
= 0,27 периода полураспада. Она равна 1,20.
Типовая задача №2.
Найти активность излучения препарата (NТ) через интервал времени Т,
если его исходная активность была No.
Пример. Предложим, что мы имеем препарат радиоактивного Вr86 (Т =
34ч). Исходная активность излучения препарата (No), была равна 1200
имп/мин. Требуется найти его активность через 26 часов.
Решение. Выражаем время t = 26 часами в долях периода полураспада
t/T 26:34 = 0,76 (периода полураспада).
По таблице находим поправку на радиоактивный распад К. Она равна
1,69. Рассуждаем следующим образом. Исходная активность (No) была равна
1200 имп/мин., а к моменту времени t = 26 часам = 0,76 периода полураспада,
т. е. уменьшилась в 1,69 раза. Следовательно, No/Nt=1,69; откуда Nt = No =
710 имп/мин.
Итак, искомая активность Nt = 710 имп/мин.
Типовая задача №3.
Определить исходную активность излучения радиоактивного изотопа
(No) необходимую для постановки длительного эксперимента.
Пример. Какую исходную активность (No) препарата радиоактивного
фосфора надо взять (Т = 14, 3 дня) с тем, чтобы через 56 дней (время t) иметь
активность этого препарата, равную 75 имп/мин.
Решение. Время t = 1 месяц 26 дней = 56 дней.
Какому числу периодов полураспада (Т) это соответствует? 56:14,3 =
3,92 (периода полураспада).
По таблице находим соответствующее значение поправки К. Она равна
14,88. Следовательно, для того чтобы наблюдать желаемую активность Nt =
75 имп/мин через интервал времени t = 3,92 периода полураспада, мы долж-
6
ны ввести в объект следующую исходную активность: No/ Nt = К, откуда
No=Nt•К = 75•14,88 = 1116 имп/мин.
Итак, исходная активность No = 1116 имп/мин ≈ 1100 имп/мин.
Типовая задача №4.
Определить время t, по истечении которого надо вносить поправку на
радиоактивный распад данного изотопа.
Прежде всего определим для себя точность, с которой мы хотим работать. Если при работе будут учитываться интервалы времени Δt = 0,01 Т, то
точность, с которой будут производиться вычисления поправочного коэффициента К, будет не больше 0,7% (при t = 0,01 Т, коэффициент К, равен =
1,007).
Если будут учитываться интервалы времени Δt = 0,05 Т, то точность, с
которой будут производиться вычисления поправочного коэффициента К будет не больше 3% (при t = 0,05 Т, коэффициент К = 1,03).
И наконец, если будут учитываться интервалы времени Δt = 0,1 Т, то
точность, с которой будут производиться вычисления поправочного коэффициента, будет не больше 7% (при t = 0,1 Т, коэффициент К = 1,07).
Упражнение 2. Рассчитать радиоактивность на заданное время пользуясь уравнением закона радиоактивного распада Nt = No * e-0,693*t/T, а также по
методу предложенному Верховской И.Е.
Задача 1.
На 15 декабря 2004 г. исходная активность (No) радионуклида фосфора–32 была равна 40 МБк/мл. Определить радиоактивность (Nt) фосфора–32
на 25 декабря 2004 г. Период полураспада (Т) фосфора – 32 = 14,3 дня.
Задача 2.
Радиоактивность йода – 131 на сегодняшний день (No) составляет 400
МБк/мл. Определить активность этого радионуклида (Nt) через 8, 16 и 80 суток. Период полураспада йода–131 = 8,1 дня.
Задача 3.
Мясо крупного рогатого скота имеет удельную активность (No) на 1
мая 2001 г. 1000 Бк/кг (по цезию –137). Какова активность мяса (Nt) будет 1
мая 2005 г. и 2010 г. Период полураспада (Т) для цезия–137 = 28 лет.
Задача 4.
Грубые корма загрязнены радиоактивными стронцием–90 и цезием–
137. Удельная активность (No) стронция–90 = 5000 Бк/кг, цезия–137 = 2500
Бк/кг. Определить какова активность кормов (Nt) будет через 10 мес., 2 года и
5 лет. Период полураспада стронция-90 = 28 лет, цезия–137 = 37 лет. Можно
ли будет скармливать эти корма мясному и молочному скоту и в каком количестве (ДУ загрязнения грубых кормов (сено, солома) по стронцию–90 = 180
Бк/кг, по цезию–137 = 250 Бк/кг).
Задача 5.
Овечья шерсть имеет удельную активность (No) 25 МБк/кг (радионуклид сера–35). Рассчитать какая удельная активность шерсти была 120 и
230 суток тому назад и какая будет через 60 и 500 дней. Период полураспада
серы–35 = 87,1 сут.
7
Задача 6.
При закладке силоса трава была загрязнена радиоактивным йодом–131
(Т = 8,1 дня) в количестве 37000 Бк/кг. Рассчитать какова удельная активность силоса будет через 25, 45 и 80 суток.
Задача 7.
Ягель загрязнен полонием–210 в количестве 480 000 Бк/кг (Т = 138,3
дня). Определить удельную активность ягеля через 75, 150 и 1200 суток.
Задача 8.
Для радиоиммунного анализа получен гормон щитовидной железы тироксин меченный радионуклидом йод–125 (Т = 60 суток) активностью 8
МБк/мл (No). Рассчитать удельную радиоактивность через 30, 90 и 300 суток.
Задача 9.
Комбикорм загрязнен цезием–144 (Т = 282 дня). Удельная активность
равна 3000 Бк/кг. Рассчитать какая удельная активность комбикорма была
140 дней тому назад и какая будет через 50, 170 и 850 суток.
Задача 10.
Молоко загрязнено радионуклидом йод–131 (Т = 8,1 сут.). Удельная активность равна 1500 Бк/л. Рассчитать удельную активность молока через 12
часов, 8, 24 и 60 суток и можно ли использовать его в пищу людям, если ВДУ
для молока равен 375 Бк/л.
Задача 11.
Сгущенное молоко загрязнено радиоактивным стронцием–90 (Т = 28
лет) и цезием–137 (Т = 30 лет). Удельная активность равна 20000 Бк/кг.
Определить удельную радиоактивность сгущенного молока через 12 мес, 1 и
4 года.
Приготовление растворов радионуклидов. Радионуклиды поставляют обычно в виде растворов или порошков с высокой удельной активностью,
и перед работой их необходимо разбавлять: если радионуклиды поставляют в
растворах кислот, то для их разбавления пользуются кислотами примерно
той же нормальности, какая указана в паспорте радионуклида. Для удобства
расчета разбавление проводят до такого объема, чтобы активность 1 мл раствора составляла 37 МБк. Разбавленные растворы радион6уклидов хранят в
пробирках объемом 5-10 мл плотно закрытых резиновыми пробками. Радионуклиды, поставляемые в виде порошков, растворяют в зависимости от их
химических свойств в концентрированных или разбавленных кислотах. Концентрированные кислоты обычно используют для растворения окисей элементов. Радионуклиды, находящиеся в виде солей, растворяют в разведенных
кислотах. Для этой цели применяют те кислоты, солями которых являются
данные нуклиды. Порошки растворяют непосредственно в пробирках, в которых они поставляются, а затем полученный раствор переносят в пробирки
большего объема.
Способы введения радионуклидов в организм животных. Пути введения радионуклидов в организм зависят от конкретных задач эксперимента.
Мышам радионуклиды вводят подкожно, но чаще внутрибрюшинно (последний путь по скорости всасывания приближается к внутривенному), кроликам
8
и крысам можно вводить внутрибрюшинно, подкожно или внутривенно
(кроликам в ушную вену, крысам в хвостовую).
Необходимое количество радионуклида для введения мелким животным должно быть в объеме от 0,2 до 1 мл. Перед введением радионуклидов в
организм животных следует проверять рН полученного раствора индикаторной бумагой. При очень кислой реакции перед введением раствор нужно
нейтрализовать 1—2 каплями 20 % раствора гидроксида натрия до рН 5—6.
Упражнение 3. Приготовить 10 мл рабочего раствора радионуклида
14
С (гидролизат белка) и определить эффективность счета радиометрической
установки для данного радионуклида.
Материалы и оборудование: Радионуклид 14С (гидролизат белка),
колбочки на 50 мл – 2 шт., микропипетки на 1 – 100 мкл – 2 шт., чашки
Пэтри – 10 шт., пинцеты – 10 шт., мишени из фольги – 30 шт., фильтровальная бумага, резиновые перчатки, пакеты для отходов, салфетки для рук, радиометры.
Порядок работы.
1. Ознакомиться с сертификатом на радионуклид (меченое соединение) и
записать в рабочую тетрадь основные сведения: номер сертификата,
номер контейнера, удельную и общую активность радионуклида, объем
раствора, наличие примесей и др.
2. Рассчитать удельную и общую активность радионуклида на день опыта
исходя из данных сертификата (см. упр. 1).
3. Рассчитать во сколько раз надо разбавить исходный раствор радионуклида, чтобы получить рабочий раствор с активностью 100 000
Бк/мл.
4. Внести в стеклянную колбочку необходимое количество раствораразбавителя (чаще физраствор), а затем туда же микропипеткой необходимый объем исходного раствора радионуклида, перемешать.
5. Для определения эффективности счета приготовить из рабочего раствора эталонные счетные образцы. Для этого в стеклянную колбочку
внести 9 мл дистиллированной воды и 1 мл рабочего раствора радионуклида. Получим раствор с активностью 10 000 Бк/мл.
6. Из приготовленного раствора нанести на мишени из фольги по 0,1 и 0,2
мл, равномерно распределить по площади мишени и определить скорость счета сырого образца, затем высушить и снова определить скорость счета. Время счета определить по таблице Бэлла с ошибкой 5 %.
7. Рассчитать эффективность счета радиометрической установки.
8. Рассчитать какое количество радионуклида надо ввести животному
массой 20 г из расчета 3700 Бк/г массы и в каком объеме рабочего раствора содержится это количество.
Приготовление проб биологического материала для радиометрии.
В качестве проб для исследования с применением радионуклидов используют кровь, мочу, воду, молоко, ткани животных, выделенные из тканей белки,
нуклеиновые кислоты, липиды и т. д. В большинстве случаев такие пробы
нельзя считать непосредственно, их необходимо превратить в более удобную
9
для счета форму. Выбор формы пробы для счета зависит от нескольких связанных между собой факторов. Если проба твердая, то ее нужно распределить равномерно и воспроизводимым способом, что особенно важно для
альфа- или бета - излучающих радионуклидов с низкой энергией. При содержании в крови или моче бета - излучателя низкой энергии необходимо учитывать самопоглощение, из-за которого снижается эффективность счета и
получается плохая воспроизводимость. Это обычно требует превращения
проб в стандартную и наиболее подходящую для счета форму. Биологические пробы, содержащие гамма - излучающие радионуклиды, можно измерять непосредственно только после минимальной предварительной обработки. Оптимальную форму пробы для счета определяет тип счетчика. Предварительная обработка биологических проб для последующего измерения радиоактивности заключается в уменьшении объема материала и получении
его в гомогенном виде.
В зависимости от метода анализа иногда нужно пробу перевести в более удобное физическое состояние, нередко выделяют соединение из большого объема материала (ткань, кал, кровь и т. д.). Наиболее практичный метод концентрирования радионуклида — озоление пробы (сухое или мокрое).
Большинство методов мокрого озоления представляют вариации хорошо известного метода Къельдаля. Успешно используют для сжигания различные
комбинации азотной, серной, соляной и хлорной кислот. Ткани в гомогенный
раствор превращают с помощью формамида или гиамина.
Расчет количества радионуклида для введения подопытному животному. Количество радиоактивного нуклида определяется задачей эксперимента, но оно должно быть по возможности меньшим, чтобы не вызвать
побочных лучевых воздействий на организм подопытного животного и вместе с тем обеспечить достоверную регистрацию радиоактивного вещества в
исследуемом органе или ткани. В этом случае скорость счета от препарата
должна превышать скорость счета фона минимум в 2 раза. Так, если уровень
фона при работе со счетчиком МСТ-17 составляет приблизительно 25
имп/мин и для радиометрии будут приготовлены препараты массой 100 мг из
органов подопытного животного (например, мыши массой 20 г), то скорость
счета от такого препарата не должна быть менее 50 имп/мин, или 0,5 имп. от
1 мг навески. Следовательно, мыши массой 20 г (20 000 мг) при условии равномерного распределения радионуклида в организме необходимо ввести радиоактивный препарат из расчета скорости счета от всей мыши 10000
имп/мин. Но поскольку можно предполагать, что фосфор распределяется в
организме животного неравномерно, то количество вводимого радионуклида
для исследования его в некоторых (не тропных) тканях следует увеличить
примерно в 3 раза. Тогда в нашем случае мыши массой 20 г необходимо ввести 10000-3 = 30000 имп/мин. Вместе с тем при исследовании органов и тканей, избирательно накапливающих радиоактивное вещество, количество вводимого радионуклида можно уменьшить.
Далее следует учесть эффективность счета. Известно, что для счетчиков МСТ-17 она равна в среднем 20 %. Это заставляет увеличить количество
10
вводимого мыши радионуклида еще в 5 раз, то есть 30000-5-150 000
имп/мин.
Индикаторное количество радионуклида зависит от степени резорбции
его в ЖКТ, скорости выведения, избирательности накопления в органах и
тканях, от вида и энергии излучения, периода полураспада, от чувствительности регистрирующей аппаратуры. Все же, несмотря на эти многочисленные факторы, определяющие количество радионуклида, в острых опытах,
продолжающихся не более недели, для большинства радионуклидов достаточна активность 1 МБк на 1 кг массы животного.
Приготовление рабочего раствора радионуклида и введение его
подопытным животным. Для приготовления рабочего раствора следует
определить массу животного, а также количество радионуклида, которое
нужно ввести одному животному. При установлении радиоактивности 1 мл
имеющегося раствора радионуклида (исходя из данных сертификата на Радионуклид, см. выше) разведение делают с таким расчетом, чтобы необходимая
активность для введения одному животному равнялась 0,2—1 мл раствора.
Исходный радиоактивный раствор разводят до необходимой концентрации
на кювете, покрытой фильтровальной бумагой, под тягой в специальном защищенном боксе или за экраном из оргстекла с помощью механических пипеток (пипетка с грушей). Раствор радионуклида чаще вводят внутрибрюшинно. Мышей и крыс помещают в широкогорлые стеклянные банки, а
крупных животных содержат в отдельном специально оборудованном помещении.
Подготовка рабочего места. Стол и специальную кювету с защитным
экраном из оргстекла покрывают фильтровальной бумагой. На кювету поставить препаровальную ванночку (можно чашку Петри) и маленький кюветик
(также чашку Петри) для сбрасывания отходов (кювету также застилают бумагой). На большую кювету положить ножницы большие и глазные, два
скальпеля, два анатомических пинцета, пинцет Кохера. На отдельную кювету
поместить торзионные весы и пинцет для работы с ними. Нарезать кусочки
кальки для взвешивания ткани, мишени-подложки для радиометрии биологических препаратов приготовить площадью 2 см2 из алюминиевой фольги с
помощью специального штампа. Для взятия проб крови вырезать из фильтровальной бумаги диски такого же размера, как мишени-подложки из фольги.
2. РАДИОНУКЛИДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МИНЕРАЛЬНОГО
ОБМЕНА У ЖИВОТНЫХ
Интенсивность обмена минеральных веществ в организме сельскохозяйственных животных исключительно высока. В практике животноводства
при недостаточном или неправильном минеральном питании и вследствие
нарушения минерального обмена нередко встречаются случаи заболевания
животных рахитом, остеомаляцией и т. д.
11
В настоящей лабораторной работе предлагается выполнить несколько
упражнений, которые дают практические навыки использования радионуклидов для изучения минерального обмена у животных. Одной из часто
встречающихся задач являются изучение усвоения из кормов фосфора, кальция и минеральных подкормок, исследование динамики накопления, характера распределения и перераспределения минеральных веществ в организме
и их выделение из организма с мочой и фекалиями, выдыхаемым воздухом и
т. д.
Лабораторная работа 2. Исследование характера распределения,
миграции, накопления и выведения фосфора в организме животных.
Для выполнения данного упражнения отбирают подопытных животных
(крыс или мышей), вводят подкожно или внутрибрюшинно соединения, содержащие фосфор-32 (чаще Na2H32PO4). Через различные промежутки времени после введения радионуклида проверяют радиоактивность мочи и кала,
затем животных убивают и исследуют различные органы на содержание радиоактивного фосфора с помощью радиометрических методов.
Данная работа описывается нами весьма подробно потому, что основные приемы работы с радионуклидами остаются неизменными при проведении большинства опытов.
Материалы и оборудование: радионуклид 32Р, подопытные животные,
бачок для отходов, шприцы на 1 мл, пипетки на 0,1 и 5 мл, пинцет Пеана,
скальпель, ножницы, пинцет анатомический, кювета, защитный экран из оргстекла, банки или клетки для содержания животных, весы, спецодежда (фартук, нарукавники, перчатки), чашки Петри, мишени из фольги, гомогенизатор стеклянный, пробирки стеклянные, эфир, вата, бумага фильтровальная.
Получение гомогената, приготовление препаратов для радиометрии и
проведение заключительных мероприятий. Перед началом занятий включить
муфельную печь, чтобы она успела достаточно нагреться к тому моменту,
когда надо будет прокаливать кость. Установить температуру порядка 300
°С.
Через 1—2 ч после введения нуклида мышь убить декапитированием.
Кровью каждого животного пропитать 2—3 взвешенных диска из фильтровальной бумаги, которые поместить на предварительно взвешенные мишени
из фольги. Разница между массой мишени вместе с диском из бумаги и массой мишени с кровью составит навеску крови. Можно кровь отбирать микропипеткой.(0,1 мл) и пропитывать ею бумажный диск, в этом случае не
нужно взвешивать препараты, а результаты выражать на объем крови. После
взятия крови мышь поместить в препаровальную ванночку (чашку Петри) и
вскрыть. Радиоактивность фосфора-32 определить в крови, печени, мозге, костях и легких. От каждого органа брать две параллельные пробы.
Навески ткани 200—300 мг (или более) гомогенизировать в дистиллированной воде в соотношении 1 : 4, гомогенат наносить пипеткой на мишень
12
в объеме 0,2—0,4 мл. Масса препарата мозга обычно меньше 100 мг, поэтому
приходится ограничиваться изготовлением одного препарата без параллельной пробы. Если в лаборатории нет условий для проведения гомогенизации
ткани, можно навески 200 мг поместить на мишени из фольги, измельчить их
до кашицеобразной консистенции, распределить по всей площади мишени.
Кости конечностей очистить от мышц, взвесить и поместить в фарфоровых тиглях в муфельную печь на 1—2 ч. Прокаленные кости измельчить в
тигле при помощи стеклянных палочек и перенести на мишени из фольги.
Мишени из фольги с приготовленными препаратами поместить на
стандартные алюминиевые подставки или приклеить на предметные стекла, а
затем перенести в радиометрическую комнату. Если радиометрия и препаративная работа ведутся в одной и той же комнате, то перед началом счета из
помещения удаляют радиоактивные отходы.
Тушки животных и другие отходы положить в специальные пластиковые мешки и держать в холодной комнате. Трупы животных можно класть в
закрывающиеся ванны и заливать формалином или спиртом-сырцом. В таком
виде отходы сохраняются до вывоза в места захоронения или до полного
распада радионуклида. После инактивации радионуклида радиоактивные отходы утилизируют как обычные отходы. Препаровальные инструменты,
шприцы и другие загрязненные предметы помещают в стеклянных сосудах в
ванну для мойки радиоактивной посуды под проточную воду на несколько
часов (для снижения уровня радиоактивности).
После окончания работы инструменты вынуть из воды, осушить фильтровальной бумагой и проверить их чистоту при помощи лабораторного переносного радиометра. Таким же способом проверить чистоту перчаток и
рук. В случае необходимости перчатки и руки вымыть водой или моющими
средствами, высушить фильтровальной бумагой и снова проверить чистоту
радиометрами СЗБ-04, РУП-1 КРБ-1 и др. В заключение проверить чистоту
рабочих мест, полов и т. д.
Радиометрия препаратов. Подготовить к работе радиометрическую
установку, определить время счета фона и препарата с точностью до 5 %. Для
этого устанавливают скорость счета фона и скорость счета препарата с фоном за 1 мин. Измерения проводят в одинаковых геометрических условиях.
При помощи таблицы Белла (см. приложение 2) находят время счета препарата и фона. Однако если для достижения 5 % точности потребуется более 10
мин, ограничиваются 10-минутным счетом, оговаривая это в записи результатов. Результаты измерения занести в таблицу и для удобства сравнения
сделать пересчет на одинаковую навеску, например 100 мг или 1 г сырой
ткани. Если точно известна эффективность счета, то можно рассчитать истинную активность всех препаратов. Тогда для записи истинной активности в
таблицу вводят дополнительную графу. Форма записи результатов представлена ниже (табл.1)
13
Таблица 1
Результаты радиометрии препаратов
Препарат
Масса препарата, мг
Скорость счета, имп.
За 1 мин
За 1 мин без
фона
Удельная активность
Расп/мин
Расп/мин/г
или мг
Печень-1
Печень-2
Кровь-1
Кровь-2 и т.д.
При наличии времени на занятии эту работу можно поставить более
широко, проследить в органах и тканях животного динамику фосфора при
недостатке его в рационе.
Упражнение 1. Исследование обмена кальция в скелете животных.
Для определения скорости обмена кальция в скелете применяют самые
разнообразные методы с использованием радионуклидов. Изучают динамику
выделения радиоактивного кальция с экскрементами после однократной инъекции радионуклида и по этим данным устанавливают биологический период
полуобновления кальция в скелете (без убоя животных). Время обновления
кальция в скелете можно рассчитать на основании определения содержания
радиоактивного кальция в скелете нескольких групп животных, забитых в
разные сроки, после однократного введения радионуклида всем животным.
В настоящем упражнении предлагается выполнить эксперимент по
изучению удельной радиоактивности различных участков скелета в разные
сроки после однократного введения им радиоактивного кальция-45.
Материалы и оборудование: подопытные животные (крысы или мыши), радионуклид 45Са, кювета с защитным экраном, скальпели, ножницы,
пинцеты, банки или клетки для содержания животных, спецодежда (фартук,
нарукавники, перчатки), чашки Петри, бачок для отходов, шприц на 1 мл с
иглой, пипетки на 1 и 5 мл, колбы на 100 мл, муфельная печь, фарфоровые
тигли, мишени из фольги.
Необходимо приготовить рабочий раствор радионуклида (кальций-45)
и ввести его подопытным животным. Крысам вводят препарат в виде хлористого кальция. Расчет активности на день опыта и количество радионуклида
для введения животным, приготовление рабочего раствора проводят способом, описанным в упражнении 1.
Раствор вводят внутрибрюшинно в объеме 1 мл. Время экспозиции 1, 2,
5 ч, а при возможности и несколько суток.
14
Приготовление препаратов для определения радиоактивности. По
прошествии определенного времени с момента введения радионуклида животных дезактивируют. Кости из различных участков скелета очистить от
мышц, взвесить и поместить в фарфоровых тиглях в муфельную печь на 1—2
ч при 400—500 °С. Прокаленные кости измельчить в тигле при помощи стеклянных палочек, перенести на мишени из фольги.
Радиометрия препаратов и выражение результатов. Радиометрию
препаратов проводят с точностью до 5 % тем же способом, что и в упражнении 1. Для удобства сравнения результаты выражают в имп/мин/г сырой кости. Если точно известна эффективность счета, то можно рассчитать истинную активность всех препаратов. Для записи результатов можно использовать форму в указанную в лаб. работе 1.
Упражнение 2. Исследование распределения фосфора в фосфорсодержащих соединениях печени крыс.
В работе определяют, какую часть печени составляет кислоторастворимый фосфор, фосфор липидов, фосфор нуклеиновых кислот и какая часть
фосфора сохраняется в сухом остатке после извлечения трех перечисленных
фракций. Эта работа дает представление о простейших биохимических исследованиях, проводимых с использованием радиоактивного фосфора.
Материалы и оборудование: центрифуга, штатив для центрифужных
пробирок, ножницы, пинцеты, корнцанги, кюветы с защитными экранами,
подставки для кьельдалевских колб, асбестовые сетки, водяные бани, мишени из фольги, шприц на 1—2 мл, весы, пробирки конические центрифужные,
пипетки на 1, 2 и 5 мл, пробирки с делениями, пастеровские пипетки, микропипетки, кьельдалевские колбы, колбы круглодонные, стаканы химические,
мерные цилиндры на 1000 и 500 мл, чашки Петри, гомогенизатор, бачок для
радиоактивных отходов, стеклянные палочки, предметные стекла, склянки
для реактивов по 0,5 л, мерные колбы на 100 и 500 мл, реактивы на одно рабочее место — 0,6 н. хлорная или 5 % трихлоруксусная кислота (200—300
мл), этиловый спирт (200 мл), эфир, радиоактивный фосфор 32Р, дистиллированная вода, 0,2 М NaCl.
Крысам вводят препарат двузамещенного фосфата натрия, меченного
радиоактивным фосфором 32Р, внутрибрюшинно в объеме 1 мл. Расчет количества изотопа, необходимого для введения животному, проводят тем же порядком, что и в упражнении 1. Время экспозиции после введения радиофосфора зависит от конкретной цели опыта, однако для изучения динамики
включения 32Р необходимо выбрать несколько (по возможности больше) экспозиций, например 1, 2, 4, 6 ч и т. д.
Извлечение органов и получение гомогенатов. По прошествии определенного времени с момента введения радионуклида животных убить декапитацией, вскрыть брюшную полость, извлечь печень и после охлаждения на
льду определить ее массу. Взять навески печени (0,5—1,0 г), гомогенизировать в стеклянном гомогенизаторе с 4—5 или 9 мл холодной 0,6 н. хлорной
или 5 % трихлоруксусной кислоты на льду или в холодной комнате.
15
Получение фракций кислоторастворимых соединений фосфора. Из
промытого от кислоты осадка фосфолипиды экстрагировать различными органическими растворителями в аппарате Сокслета или путем кипячения в
колбе на водяной бане с последующим центрифугированием. В последнем
случае осадок перенести в круглодонную колбу с обратным холодильником и
залить 20— 30 мл смеси спирта с эфиром (3:1). Колбу нагреть на водяной
бане при кипячении смеси в течение 10—15 мин. После некоторого охлаждения содержимое колбы перенести в центрифужную пробирку, осадок отцентрифугировать при 2000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость
слить в чистую колбочку, осадок повторно обработать 20—30 мл смеси
спирт — эфир (1:1) при кипячении и вновь центрифугировать при тех же
условиях.
Оба экстракта объединить и выпарить в колбе Къельдаля под тягой на
водяной бане (фракция фосфолипидов).
Получение фракции фосфора нуклеиновых кислот. Пробирки с осадками ткани обмыть снаружи теплой водой, чтобы удалить из осадка остатки
эфира. Делать это надо очень осторожно, так как, если вода будет слишком
горячая, осадок может оказаться выброшенным из пробирки и тогда весь
опыт будет испорчен. После исчезновения запаха эфира пробирки поместить
на кипящую водяную баню и при прошествии около 2 мин прилить к осадкам
2 мл 10%-ного раствора хлористого натрия. Пробирки закрыть маленькими
воронками и оставить на кипящей водяной бане на 2 ч. После этого из пробирок пипетками осторожно отсосать раствор хлористого натрия, стараясь
отобрать по 2 мл, то есть количество, которое было налито в пробирки. Растворы слить в пронумерованные цилиндрики.
Сухой остаток извлечь из пробирок полностью и разместить на нескольких чашечках-мишенях из алюминиевой фольги для счета. Чтобы слой
вещества был очень тонким, используют не менее 2—3 чашек (если брали 0,5
г ткани), иначе даже в хорошо просушенных препаратах будет происходить
большое самопоглощение. Следует отметить, что именно самопоглощение
чаще всего бывает причиной неудачи в проведении описываемого опыта.
Таким образом, мы получаем следующие фракции для измерения радиоактивности: 1) гомогенат 100—150 мг сырой ткани в 5 мл 0,2 М хлористого натрия (общий фосфор ткани); 2) общий кислоторастворимый фосфор;
3) фосфор фосфолипидов (выпаренный экстракт); 4) фосфор нуклеиновых
кислот; 5) сухой остаток.
Приготовление препаратов для определения радиоактивности. В пронумерованные мишени из алюминиевой фольги поместить диски фильтровальной бумаги и механической пипеткой внести по 0,3 мл экстракта из соответствующих пробирок (две параллельные пробы). Содержимое на мишенях подсушить при комнатной температуре или под лампой, но не при слишком высокой температуре. Таким же образом приготовить несколько эталонных препаратов из стандартного раствора изотопа. Радиоактивность всех
препаратов измерить при строго одинаковых условиях. При помощи таблицы
16
Белла определить, сколько времени надо считать каждый препарат, чтобы
получить результаты с точностью до 5 %.
Для записи полученных экспериментально и рассчитанных данных составить таблицу с указанными названиями граф: 1) № п/п; 2) название фракции; 3) общий объем фракции (мл); 4) какому количеству ткани соответствует общий объем фракции; 5) радиоактивность 0,3 мл фракции, взятых для
счета (имп/мин); 6) удельная активность фракции (имп/мин/г сырой ткани).
Упражнение 3. Исследование накопления калия в мышцах при физической нагрузке.
Известно, что во время работы скелетные мышцы поглощают из внутренней среды организма большое количество калия. Для доказательства этого положения в данном упражнении предлагается использовать радиоактивный калий-42.
Материалы и оборудование: подопытные животные (крысы), радионуклид калий-42, шприц на 1 мл, скальпель, ножницы, пинцет, кювета с
экраном из оргстекла, весы, стеклянные банка или ведро, спецодежда, чашки
Петри, мишени из фольги, радиометрическая установка.
Выполнение работы.
1. Введение калия-42 животным, создание физической нагрузки. Двум
крысам вводят подкожно раствор радиоактивного калия-42 в количестве
0,05—0,07 МБк на 100 г массы. Расчет активности на день опыта и количество радионуклида для введения животным проводят тем же порядком, что и
в упражнении 1. Через 10 мин после инъекции одну из крыс помещают в сосуд с водой (например, в наполовину налитое ведро), в котором она будет
плавать 30—40 мин. Вторая крыса остается в это время в клетке в спокойном
состоянии.
2. Приготовление препаратов мышц для радиометрии, измерение радиоактивности. Через 30—40 мин или раньше (если плавающая крыса
начинает тонуть) обоих крыс убивают декапитацией. Из мышц бедра берут
несколько навесок по 100 мг, тщательно измельчают, равномерно распределяют на мишенях из фольги, подсушивают и измеряют радиоактивность с
помощью счетчика СБМ-20 или МС-6 с точностью до 5 %. Радиометрию
препаратов проводят способом, описанным в упражнении 1.
Выражение результатов опыта. Для удобства сравнения результаты
радиометрии выражают в импульсах, распадах в минуту на 1 г ткани или рассчитывают, во сколько раз больше калия поглощает работающая мышца, чем
мышца покоя. Для записи результатов удобно пользоваться формой указанной в лаб. работе 1.
3. РАДИОНУКЛИДЫ В ИЗУЧЕНИИ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА
Лабораторная работа 3. Изучение белкового обмена у животных с помощью меченых аминокислот.
17
Белковый обмен — один из основных видов обмена веществ. Любое
заболевание всегда в той или иной степени отражается на состоянии белкового обмена. Многие заболевания являются следствием расстройства этого
обмена. В исследовании белкового обмена решающее значение имеет радионуклидный метод. Типичный опыт с мечеными аминокислотами состоит в
том, что соответствующую аминокислоту вводят животным через рот, подкожно или внутривенно. Через разные сроки после этого животных убивают,
выделяют из тканей белки и исследуют их радиоактивность. Такие опыты
показали, что меченые аминокислоты входят в белки всех органов и тканей,
но не в одинаковых количествах и с разной скоростью.
Радионуклидный метод вместе с другими методами позволяет выяснить индивидуальную судьбу каждой аминокислоты в организме и даже проследить за поведением каждого атома, занимающего определенное место в
молекуле кислоты. В этом его несомненная ценность при выяснении механизмов нарушений как белкового, так и тесно с ним связанных других видов
обмена.
В настоящей лабораторной работе предлагается выполнить упражнения, которые дают практические навыки использования меченых аминокислот в изучении белкового обмена.
Упражнение 1. Включение меченых аминокислот в тканевые белки животных.
Для выполнения данного упражнения необходимо подробно ознакомиться с методикой выделения белка, провести подготовительные мероприятия к опыту, исходя из данных паспорта рассчитать активность и количество
радионуклида, необходимое для введения каждому животному.
К данному упражнению необходимо приготовить несколько растворов.
Биуретовый реагент. Растворить 1,5 г сульфата меди и 6 г натрий-калий
виннокислый (сегнетова соль) NaKC4H4O6 в 500 мл дистиллированной воды.
Прилить при помешивании 300 мл 10 % NaOH, свободного от СО2, и разбавить в 1л пластиковой бутыли. Добавить 0,1 % KJ и оставить при комнатной
температуре. Этот реактив устойчив до 6 мес.
Белковый стандарт. Растворить 200 мг сывороточного альбумина в 20
мл 0,3 н. КОН (1 мл — 10 мг альбумина). Приготовленный раствор использовать для построения калибровочного графика (см. ниже).
Стандарт РНК и ДНК. Растворить 20 мг РНК или ДНК в 100 мл 0,3 н.
КОН. Приготовленные растворы РНК и ДНК использовать для построения
калибровочного графика, разбавляя их хлорной кислотой, как описано ниже.
Радиоактивный углерод 14С. Растворить смесь меченных С-14 аминокислот 0,86 NaCl до концентрации 0,5 МБк на 1 мл, если работа проводится
на крысах, и до 0,1 МБк в 1 мл, если работа проводится на мышах.
Сцинтилляционная среда. Растворить 6 г 2,5 дифенилоксазола (РРО),
0,1 г 1,4-ди-(4-метил-5-фенилоксазол) -бензол- (диметил) (РОРОР) в 80 г
нафталина в 1 л толуола.
Материалы и оборудование: мыши или крысы, гомогенизатор стеклянный, центрифуга для малых объемов (3—6 тыс. об/мин), спектрофотометр,
18
фотоэлектрокалориметр, термостат на 37 °С, холодильник, весы торзионные
или аналитические, приборчик для получения стандартных осадков, водоструйный насос, радиометр, шприц на 1—2 мл, зажимы — корнцанги или
др., ножницы большие и малые, скальпели, штативы для центрифужных пробирок, груши для пипеток, широкогорлые банки для животных, колбы Бунзена, центрифужные пробирки на 10 мл, пипетки на 1,2 и 5 мл, мерные колбы
на 100 и 500 мл, стеклянные палочки, предметные стекла, бачок для радиоактивных отходов, колбочки плоскодонные на 100 мл, чашки Петри, радиоактивный углерод 14С (меченые аминокислоты), хлористый натрий 0,85 %,
сульфат меди, натрий-калий виннокислый, едкий натр 10 %, калий йодистый,
трихлоруксусная кислота (ТХУ) 50, 20 и 10 %, насыщенный ацетатом натрия
этиловый спирт, этиловый спирт 95 %, эфир, едкое кали (0,3 н.), сывороточный альбумин, толуол, нафталин сцинтилляционный, РРО, РОРОР, марля,
лед, фильтровальная бумага, нитроцеллюлозные фильтры № 2 или 4, фильтры «синяя лента», индикаторная бумага, клей, карандаш по стеклу, линейка,
порошок «Защита», салфетки бумажные для вытирания рук, вата.
Выполнение работы.
1.Введение радионуклида, извлечение органов и получение гомогената.
Приготовить рабочий раствор смеси аминокислот (или одной аминокислоты), меченных углеродом-14 или серой-35, удельной активностью 0,1—0,5
МБк/мл (зависит от массы животного). Приготовленный раствор меченых
аминокислот ввести животным (мыши или крысы) внутрибрюшинно с помощью шприца на 1—2 мл из расчета 0,4 МБк на 100 г массы животного. Через 1—2 ч после введения радионуклида животных убить декантированием,
взять пробы различных тканей в чашки Петри, находящиеся на льду. Навески
ткани (0,5—1,0 г) гомогенизировать в холодной дистиллированной воде 1:4
(1 г ткани + 4 мл дистиллированной воды), гомогенат заморозить. Затем образцы оттаять и добавить 8 мл холодной 10 % трихлоруксусной кислоты
(ТХУ) на 1 мл гомогената.
Образовавшийся осадок отделить центрифугированием в течение 10
мин при 2000 об/мин и 4 °С. Осадок последовательно промыть 2 раза 5 мл
холодной 10 % ТХУ. Для удаления остатков ТХУ и липидов осадок экстрагировать 5 мл 95 % этанола, насыщенного ацетатом натрия. Дополнительную
экстракцию липидов провести 5 мл смеси спирт — эфир (3:1) и 5 мл эфира.
Остаток эфира удалять с помощью высушивания осадка на воздухе в течение
5—10 мин. К влажному осадку добавить 4 мл 0,3 н. КОН и поместить в термостат на 1 ч при 37 °С. Полученный гидролизат использовать для определения концентрации белка, нуклеиновых кислот и радиоактивности белка.
2 Определение концентрации белка. В стеклянные пробирки отобрать 1
мл гидролизата, туда же прибавить 4 мл биуретового реагента, оставить на
30—40 мин в затемненном месте. Интенсивность окраски измерить при 540
нм (зеленый светофильтр) на ФЭК-М или СФ-16 с лампой накаливания. В
качестве контроля использовать 1 мл 0,3 н. КОН + 4 мл биуретового реагента. Общее количество белка определить по калибровочному графику. Для его
построения растворить 20 мг сывороточного альбумина в 20 мл 0,3 н. КОН
19
(белковый стандарт). В 10 стеклянных пробирок отобрать белковый стандарт
в объеме от 0,1 до 1 мл, в каждую пробирку добавить 0,3 н. КОН до 1 мл и 4
мл биуретового реагента. Через 30 мин измерить интенсивность окраски при
540 нм (зеленый светофильтр) на ФЭК-М или СФ-16 с лампой накаливания.
Оставшиеся 3 мл гидролизата использовать для определения радиоактивности белка и концентрации нуклеиновых кислот.
3.Определение радиоактивности белка. Для определения радиоактивности белка отобрать 1 мл гидролизата в стеклянные пробирки, добавить 50
% трихлоруксусную кислоту до конечной концентрации 5—10 %. Через 5
мин осадок отфильтровать через миллипоровые нитроцеллюлозные фильтры
(0,45 мкм) на специальном приборчике для получения стандартных осадков
с подключением вакуума (водоструйный насос). Чтобы фильтр не прорвался,
под основной диск подложить фильтр из обычной фильтровальной бумаги.
Осадок на фильтре трижды промыть 10 % раствором ТХУ и 1 раз 70 % этанолом. Фильтры с равномерным слоем осадка поместить в сцинтилляционные флаконы, высушить на воздухе, прилить 5—10 мл сцинтилляционной
жидкости (1 л толуола, 6 г РРО, 0,1 г РОРОР и 80 г нафталина) и измерить
радиоактивность с помощью сцинтилляционных счетчиков. Если последних
в лаборатории нет, радиоактивность белка можно определить на обычных
радиометрах с торцовым счетчиком. Радиоактивность всех препаратов измеряют на одной и той же установке в одинаковых геометрических условиях и
выражают в импульсах в минуту на 1 мг белка.
4.Определение концентрации нуклеиновых кислот. Для разделения РНК
и ДНК отобрать 2 мл гидролизата, добавить 1 мл холодной 60 % хлорной
кислоты. Через 5 мин образовавшийся осадок отцентрифугировать при 2000
об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость осторожно перелить в чистые стеклянные пробирки и использовать для определения концентрации
РНК. Осадок промыть 2 раза 5 мл холодной 5 % хлорной кислотой, залить 96
% этанолом и оставить для определения концентрации ДНК.
Для определения концентрации РНК отобрать 1 мл надосадочной жидкости в стеклянные пробирки и разбавить до 10 мл 0,5 н. раствором хлорной
кислоты, измерить оптическую плотность на спектрофотометре при 260 нм.
В качестве контроля использовать 0,5 н. раствор хлорной кислоты. Общее
количество РНК определить по калибровочному графику (см. ниже).
Для определения концентрации ДНК к оставшемуся осадку добавить
1,5 мл 0,5 н. хлорной кислоты и поместить в термостат при 96 ± 1°С на 45
мин для гидролиза. Затем образцы охладить, отцентрифугировать при 2000
об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость слить в калиброванные
пробирки, осадок промыть 2 раза 1 мл 0,5 н. хлорной кислоты. Промывные
жидкости объединить с надосадочной жидкостью и довести объем до 10 мл.
Измерить оптическую плотность на спектрофотометре при 265 и 290 нм против (Контроля (0,5 н. хлорная кислота, прогретая таким же образом, как пробы). Общее количество ДНК определить по калибровочному графику.
Для построения калибровочного графика на РНК и ДНК растворить 20
мг РНК или ДНК в небольшом количестве 0,3 н. раствора КОН, поместить в
20
колбочку на 100 мл и разбавить до метки 0,3 н. раствором КОН. Из этих
стандартных растворов отобрать в 10 стеклянных пробирок объемы от 0,1 до
1 мл, в каждую пробирку добавить 0,3 н. раствор КОН до 1 мл и 9 мл 0,5 н.
раствора хлорной кислоты. Измерить оптическую плотность на спектрофотометре при 260 нм для РНК и 265 и 290 нм для ДНК.
Упражнение 2. Использование 14С-аминокислот для определения
белоксинтезирующей активности изолированных клеточных ядер.
Для выполнения данного упражнения необходимо подробно ознакомиться с методами выделения клеточных ядер из печени и определения белоксинтезирующей активности, провести подготовительные мероприятия к
опыту, рассчитать количество радионуклида, необходимое для внесения в
пробу. После этого убить животных декапитацией, извлечь печень, выделить
клеточные ядра, инкубировать их с 14С-аминокислотами и измерить радиоактивность кислотнорастворимой фракции.
Материалы и оборудование: натрий хлористый, сахароза, магний хлористый, калий фосфатный буфер с рН 6,5, кальций хлористый, трихлоруксусная кислота, меченые аминокислоты, сывороточный альбумин, глюкоза,
центрифуга с охлаждением, радиометр, водоструйный насос, пробирки центрифужные, термостат на 37°С, водяная баня, приборчик для получения
стандартных осадков, фильтры «Сынпор» с диаметром пор 0,24 мкм, колба
Бунзена.
Выполнение работы.
1. Выделение клеточных ядер. После убоя животных (крыс) извлечь
печень, промыть ее охлажденным физиологическим раствором, поместить в
чашку Петри, освободить от сосудов и соединительной ткани, измельчить
ножницами и гомогенизировать. Делают это в среде выделения в соотношении 1 : 10 с помощью стеклянного гомогенизатора с тефлоновым пестиком.
Средой выделения служит 0,20 М раствор сахарозы (рН 7,4), содержащий
0,02 М ЭДТА. Гомогенат отфильтровать через 2 слоя марли, перенести в
центрифужный стакан и отцентрифугировать на ЦЛР-1 при 2500—3000
об/мин в течение 10 мин. Осадок дважды гомогенизировать в 30 мл среды
выделения и центрифугировать при тех же условиях. После последнего центрифугирования осадок ядер растворить в 5 мл среды выделения, перенести в
стеклянные пробирки и использовать для определения белоксинтезирующей
активности.
2. Определение белоксинтезирующей активности клеточных ядер. Из
суспензии клеточных ядер отобрать в конические центрифужные пробирки
такие количества, в которых содержалось бы 100 мкг ДНК. Отцентрифугировать при 2500 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбросить, осадок суспендировать в 0,5 мл 0,1 М калийфосфатного буфера (рН
7,5), содержащего 0,25 М сахарозы, добавить 0,4 мл 0,1 М раствора глюкозы,
содержащего 0,025 М магния хлористого. Туда же добавить 1 мл 2 М раствора хлористого кальция и 3,7104 Бк 14С-аминокислот (гидролизат белка). Общий объем суспензии 2 мл.
21
Пробы поместить в термостат при 37 °С на 1 ч. Затем смесь охладить,
добавить 10 мкг бычьего альбумина и 2 мл 20 % раствора ТХУ. Через 5 мин
смесь отцентрифугировать, надосадочную жидкость слить. Осадок суспендировать в 10 мл 20 % раствора ТХУ и поместить в кипящую водяную баню на
15 мин. Смесь охладить и отфильтровать через мембранные фильтры «Сынпор», диаметр пор 0,24 мкм. Осадок на фильтре промыть 2—4 раза 5 мл 5 %
раствора ТХУ. Фильтры высушить на воздухе, измерить радиоактивность на
сцинтилляционном счетчике и выразить результаты (в имп/мин) на взятое в
пробу количество ДНК.
4. РАДИОНУКЛИДЫ В ИЗУЧЕНИИ ОБМЕНА НУКЛЕИНОВЫХ
КИСЛОТ
Лабораторная работа 4. Исследование биосинтеза (по скорости включения 32Р) высоко - и низкополимерных фракций РНК у животных в
норме и при действии ионизирующей радиации
Цель: Ознакомить студентов с применением радиоактивного фосфора Р для изучения одной из центральных проблем биохимии — обмена
нуклеиновых кислот клетки и проследить изменения, которые происходят
в обмене нуклеиновых кислот при действии ионизирующей радиации. Изучение этих изменений представляет большой интерес и при других патологиях животных, т. к. нуклеиновые кислоты принимают непосредственное
участие во многих важнейших процессах жизнедеятельности клетки.
Содержание занятия. Перед началам работы студенты должны
внимательно прочитать предлагаемую методику, составить план предстоящей работы, подготовить рабочие места, необходимые реактивы, рассчитать активность и приготовить рабочий раствор радиофосфора (см. выше,
лаб. Работа 1). После введения животным радиофосфора убить их декапитироваиием, отобрать пробы тканей, выделить и очистить соответствующие фракции РНК, определить их концентрацию, а затем приготовить
счетные образцы РНК для намерения радиоактивности.
Порядок выполнения работы.
Приготовить рабочий раствор радиоактивного фосфора 32Р (можно
использовать отдельные нуклеотиды, меченные углеродом 14 С или тритием 3 Н) активностью 4— 20 МБк/мл (зависит от массы животного), ввести
приготовленный раствор радиоизотопа животным, (мыши или крысы)
внутрибрюшинно с помощью шприца на 1—2 мл из расчета 20—40 кБк на
грамм массы животного (время введения записать).
Через час после введения изотопа животное убить декапитацией, из
брюшной полости извлечь печень и поместить ее в чашки Петри, находящиеся на льду. Скальпелем или ножницами печень измельчить и гомогенизировать в стеклянном или тефлоновом гомогенизаторе в десятикратном объеме охлажденного 0,01 М ацетатного буфера рН = 5,1, содер32
22
жащего 0,5 % додецилсульфата натрия (лучше все эти операции проводить в холодной комнате при температуре 2—4°С либо на льду).
Гомогенат слить в колбу на 300 или 100 мл, смешать с равным объемом свежеперегнанного фенола, после чего смесь инкубировать на
водяной бане при 60° в течение 5 мин при постоянном встряхивании.
Затем смесь охладить и центрифугировать на холоду 15 - 20 мин при 2500
об/мин. Верхнюю фазу осторожно перенести в чистые колбы на 100 или
300 мл и осадить РНК тремя объемами холодного этилового спирта. Осадок РНК отделить центрифугированием при условиях, описанных выше, и
растворить в 10 мл дистиллированной воды. К раствору РНК добавить
NaCl до конечной концентрации 0,15 М и РНК вновь осадить тремя объемами холодного спирта. Такое переосаждение повторить еще два раза.
После третьего перосаждения РНК снова растворить в дистиллированной
воде (5 мл), к раствору PHK добавить равный объем 3 М NaCl, раствор
перемешать и оставить в холодильнике на ночь.
На следующее утро выпавший осадок высокополимерной РНК собрать
центрифугированием (15 мин 2500 об/мин), растворить в дистиллированной воде (5 мл). Иногда можно провести еще одно переосаждение спиртом. Надосадочную жидкость слить в колбы на 100 мл и залить тремя
объемами холодного этанола (для осаждения низкополимерной РНК
клетки), поместить в холодильник на 1—2 часа, после чего центрифугировать в тех же условиях и растворить в 5 мл дистиллирован мой
воды.
Хранить растворы в закупоренных пробирках в замороженном состоянии. Из полученных растворов РНК отбирать пробы для определения концентрации РНК и ее удельной радиоактивности.
Определение концентрации высокополимерной и низкополимерной РНК.
В соответствующее количество пробирок (удобно пользоваться градуированными пробирками) налить 5,9 мл дистиллированной воды. Микропипеткой в каждую из пробирок внести по 0,1 мл соответствующего раствора РНК. Содержимое пробирок тщательно перемешать, затем произвести измерение поглощения ультрафиолетового излучения полученными
растворами при длинах волн 260 и 290 им на спектрофотометре. В контрольной кювете — дистиллированная вода. Измерения проводить в
средней части шкалы прибора (Е = 0, 1 — 0,8). Расчет концентрации РНК в
растворах, непосредственно поступающих на фотометриравание, произвести по следующей формуле: с = ∆260х40, где с—концентрация РНК
в фотометрируемом растворе в γ на мл, ∆260 — разность экстинкций при
260 и 290 нм, 40 — эмпирический коэффициент. Концентрацию РНК в исходном растворе рассчитать с учетом разведений по формуле:
С
с  5(10)
0,1
23
Где:
С — концентрация РНК в исходном растворе в  на мл;
с—концентрация РНК в непосредственно фотометрируемом растворе
(см. выше);
5 —объем непосредственно фотометрируемого раствора в мл;
0,1 —количество исходного раствора, взятого для приготовления
фотометрируемого раствора в мл.
Определение удельной радиоактивности растворов РНК
Из растворов РНК с известной концентрацией отобрать пипеткой в
чистые пробирки объем, содержащий около 1мг РНК. Взятые объемы записать. Объемы жидкости в пробирках довести до 2 мл дистиллированной
водой и охладить в ледяной бане. РНК осадить 50 % трихлоруксусной
кислотой (ТХУ вносить с таким расчетом, чтобы конечная ее концентрация в пробирке составила 5 %).
После 5 минутного стояния в ледяной воде осадки отфильтровать через
миллпоровые фильтры с диаметром пор 0,45мк (под фильтр подкладывается кусочек обычной фильтровальной бумаги) на специальном приборчике
для получения стандартных осадков.
Осадок на фильтре 3—4 раза промыть холодной 5 % хлорной или
трихлоруксусной кислотой и один раз холодным спиртом. После этого
фильтр с осадком осторожно снять и наклеить резиновым клеем на плотную бумагу или предметное стекло. Радиоактивность всех приготовленных
счетных образцов определить на одной и той же радиометрической установке в одинаковых геометрических условиях и выразить в имп/мин. Рассчитать удельную активность РНК в имп/мин/мг.
Определение нуклеотидного состава РНК
а) Гидролиз РНК
После определения радиоактивности нитроцеллюлозные фильтры с
осадками РНК поместить в малые центрифужные пробирки с коническим
дном, где РНК освобождается от материала фильтра, который хорошо растворам в ацетоне. Для этого в пробирку налить 1 мл ацетона и содержимое пробирки перемешать. Осадок РНК отделить центрифугированием
(10—15 мин, 3000 об/мин). Обработку ацетоном повторить еще один два раза.
Осадки РНК подсушить в термостате при 37 °С, залить 5,0 мл 0,5 н
КОН и осторожно перемешать запаянным капилляром или тонкой стеклянной палочкой, пробирки закрыть пробками и поместить в термостат при
37 °С на 18 часов. Удобно оставлять пробирки в термостате с 3 часов дня
до 9 часов утра.
б) Подготовка гидролизата к хроматографии
При щелочном гидролизе РНК расщепляется до хорошо растворимых
мононуклеотидов; не гидролизовавшиеся примеси (полисахариды, ДНК)
осадить добавлением в гидролизат 57 % хлорной кслоты до рН = 3 на холоду. Во избежание избытка кислоты последнюю вносить очень небольшими
24
порциями, с помощью пастеровской пипетки, затем кислоту осторожно выдуть в гидролизат. После перемешивания осторожным пробулькиванием
той же пипеткой гидролизат нанести на узенькую (1мм) полоску универсальной индикаторной бумажки. Кислоту добавлять до порозовения бумажки при
очередной пробе. Пробирки поместить на 5 минут в ледяную воду, затем
осадок отделить центрифугированием (10—15 мин, 3000 об/мин). Надосадочную жидкость (гидролизат) пастеровской пипеткой перенести в чистую
малую центрифужную пробирку, нейтрализовать до рН = 7,0 сначала 5 н,
а затем 0,6 н раствором КОН. Раствор щелочи вносить пастеровской пипеткой, рН определить универсальной индикаторной бумажкой до желтой
окраски, как описано выше. Нейтральный гидролизат выдержать в холодильнике в течение нескольких часов, посте чего выпавший осадок перхлората калия отделить центрифугированием и отбросить. Гидролизат снять с
осадка соли пастеровской пипеткой и хранить в закупоренной пробирке в
замороженном состоянии.
Концентрацию нуклеотидов в полученном гидролизате определить на
спектрофотометре. Для этого пипеткой на 0,1 мл отобрать 0,01 мл гидролизата, кончик пипетки осторожно обтереть кусочком фильтровальной бумаги и взятый объем внести в пробирку с 5,0 мл дистиллированной воды. Раствор перемешать и спектрофотометрировать при длине волны 260
и 290 нм. Для нанесения на стартовое пятно хроматограммы необходимо
брать такое количество гидролизата (X), которое соответствует разности
поглощений при длинах волн 260 и 290 нм, примерно 0,7, т. е.
Х 
0,01  0,7
 260
Разделение нуклеотидов
Разделение нуклеотидов можно производить с помощью ионообменной хроматографии на колонках или тонкослойной хроматографии на целлюлозе. Однако при использовании данных методов возникают трудности
определения радиоактивности нуклеотидов. Эти трудности отпадают если
разделение нуклеотидов проводить с помощью хроматографии или электрофореза на бумаге. Поэтому ниже дается описание этих методов.
а) Разделение рибомононуклеотидов с помощью хроматографии на
бумаге.
Перед использованием бумагу разрезать на листы размером 20 х 55
см, поместить в специальную ванночку из плексигласа с дырчатым дном
(типа воронки Бюхнера) и промыть сначала 2 н раствором уксусной
кислоты, а затем до нейтральной реакции дистиллированной водой. Для
промывания 20 листов бумаги указанного выше формата, как правило, достаточно 1,5—2 л 2 н раствора СН3СOОH при медленном пропускании уксусной кислоты через слой листов бумаги. На промытой и высушенной на
воздухе бумаге разметить простым карандашом (вдоль листа) 4 полосы
шириной 5 см и в середину 3 полос (одна остается контрольной) на расстоянии 8—10 см от верхнего края листа небольшими порциями при под-
25
сушивании нанести 100—1000 мкл раствора рибомононуклеотидов в виде
пятна диаметром около 1см.
Разделение нуклеотидов производят путем последовательного пропускания в одном и том же направлении двух различных растворителей
(нисходящая хроматография).
Первый растворитель состоит из этанола (4 объема), бутанола (1
объем) и 1 М ацетатно-аммониевого буфера рН = 3,7—3,8 (2 объема).
После пропускания этого растворителя в течение 20-24 часов (на вытекание) хроматограмму высушить на воздухе и поместить во второй растворитель — изомасляную кислоту, насыщенную водой при температуре 15 °С
и доведенную до рН = 3,5—4,0 концентрированным аммиакам.
В этой системе разделение нуклеотидов продолжать в течение 20—
24 часов при комнатной температуре. В результате пропускания этих растворителей происходит разделение рибомононуклеотидов в следующем порядке (сверху вниз): гуаниловая, уридиловая, цитидиловая, аданиловая кислоты.
б) Разделение рибомононуклеотидов с помощью электрофореза на
бумаге
Для электрофореза использовать хроматографическую бумагу Б
(быстрая). Бумагу предварительно промыть точно таким же образом, как
описано ранее (см. «Разделение рибомононуклеотидов с помощью хроматографии на бумаге»), разрезать на 4 полоски шириной 4 см и закрепить в
специальной камере для электрофореза.
На смоченную буферным раствором полоску бумаги (4,0 см) и 8
см от катодного конца микропиеткой нанести в один прием 100—400 мкл
раствора, содержащего рибомононуклеотиды. Нанесение такого большого
количества жидкости на влажную полоску бумаги без подсушивания возможно благодаря тому, что раствор наносят между двумя поперечными линиями, очерченными мягким простым карандашом, в результате графит
препятствует растеканию жидкости на бумаге. При нанесении такого
большого количества раствора с подсушиванием или просто на сухую бумагу удовлетворительного разделения нуклеотидов не происходит.
В настоящее время используют самые различные условия электрофоретического разделения рибомононуклеотидов на бумаге. Однако опыт показывает, что наиболее надежное и сравнительно быстрое разделение рибомононуклеотидов происходит в течение 5 часов в 0,05—0,07 М ацетатноаммониевом буфере рН = 3,5 при градиенте напряжения 16—18 в/см.
Ацетатно-аммониевый буфер готовят титрованием 2 М раствора уксусной кислоты (химически чистой) концентрированным аммиаком до рН =
3,5. В таком виде буферная смесь может относительно долго храниться
при комнатной температуре без существенного изменения. Перед употреблением буферный раствор разбавить водой до концентрации 0,05-0,07М.
В указанных выше условиях электрофореза нуклеотиды четко разделяются между собой и отделяются от пигментированных веществ. Поря-
26
док расположения нуклеотидов от катода к аноду следующий: цитидиловая, адениловая, гуаниловая и уридилоая кислоты.
Определение радиоактивности отдельных нуклеотидов РНК
Пятна нуклеотидов на хроматограммах или электрофореграммах обнаружить с помощью ультрахемископа по поглощению ультрафиолетового совета. При этом следует избегать смотреть незащищенными глазами
на свет ультрахемископа. Пятна очертить карандашом и затем аккуратно
вырезать. Радиоактивность нуклеотидов может быть определена непосредственно в пятнах или в растворе после элюции.
В первом случае из центра пятна круговым ножом вырезать диск пo
размеру окна детектора (площадь~ 2,5 см 2). Оставшиеся обрезки пятна
симметрично положить поверх диска, прижать к нему и в таких условиях
произвести измерение радиоактивности нуклеотида. Если активность достаточно велика (более 500—1000 имп/мин на пятно), ее можно измерить
после элюции.
Для элюции пятна нарезать мелкими кусочками, поместить в пробирки на 8—10 мл с пробками и залить 5 мл фосфатного буфера рН = 7 (1 М
для хроматограмм, 0,5 М — для электрофореграмм). Элюцию проводить в
термостате при 37 °С в течение ночи. Элюаты просветлить центрифугированием, нанести на мишени из фольги по 0,5 мл, выпарить под лампой и
просчитать радиоактивность. При этом ошибка определения скорости счета не должна превышать 5 %.
Отношение активности четырех нуклеотидов, определенной в одинаковых геометрических и прочих условиях, соответствуют нуклеотидному
составу вновь образованной РНК данной фракции. Результаты измерения
скорости счета нуклеотидов и соответствующих расчетов вносятся в приведенную ниже таблицу.
Определение нуклеотидного состава общей РНК данной фракции.
В условиях данного опыта нуклеотидный состав - вновь образованной
ядерной РНК не должен существенно отличаться от нуклеотидного состава всей РНК соответствующей фракции. Поэтому, определив нуклеотидный состав общей РНК и сравнив его с соответствующей величиной вновь
образованной РНК, можно проконтролировать правильность полученных в
предыдущем разделе результатов. Для определения нуклеотиднсго состава
общей РНК фракции элюаты нуклеотидов спектрофотометриравать при
следующих длинах волн: гуаниловая кислота при 255 и 290, адениловая —
260 и 290, цитидилавая — 270 и 290, уридиловая 260 и 290 нм.
В контрольную кювету налить элюаты с соответствующих контрольных участков хроматограмм. Для расчета количества нуклеотидов
пользуются следующими коэффициентами:
Нуклеотиды
А
Расчетные коэффициенты для нуклеотидов
Количество нуклеотидов в мкМ на 5 мл элюата
0,470х255
27
Г
0,363х260
Ц
0,730х270
У
0,515х260
 - разность между поглощением при указанной длине волны и при 290
нм.
Результаты внести в таблицу:
№п/п
Название
фракции
Концентрация
РНК в готовых растворах,
Объем, взятый
для приготовления препарата в мл
Концентрация
РНК,
мг
в /мл
Скорость
счета в
имп/мин
Удельная
ативность
РНК,
имп/мин
на 1 мг
Относите
ошибка
Оснащение занятия
Необходимое оборудование. Центрифуга для больших объемов (3000
об/мин). Центрифуга для малых объемов (6000 об/мин). Шюттель-аппарат.
Термостатический аппарат для встряхивания. Спектрофотометр. Радиометрическая установка. Хроматографические камеры. Ультрахемисокоп. рНметр. Термостат на 37° С. Холодильник. Весы торзионные или аналитические. Приборчик для получения стандартных осадков. Водоструйный
насос. Стеклянный или тефлоновый гомогенизатор. Эмалированные кюветы. Шприц на 1—2 мл. Зажим-корнцанги или др. Ножницы большие и малые. Скальпели. Штативы для пробирок. Микропипетки на 50 – 1000 мкл.
Бачок для отходов.
Посуда. Широкогорлые банки для животных, колба Бунзена, центрифужные пробирки всех размеров, центрифужные пробирки конические, микропипетки на 0,1—0,2 мл. Пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл, пастеровские пипетки (много), мерные колбы на 100, 500 и 200 мл. Колбы конические на 100, 300, 500 мл (несколько), стеклянные палочки, агрегат для перегонки фенола, предметные стекла.
Реактивы. Радиоактивный фосфор, бутиловый спирт, свежеперегнанный фенол, додецилсульфат натрия, бидистиллят, доведенный до- рН = 7,0
(КНСОз), хлористый натрий х. ч. кристаллический, трихлоруксусная кислота 50% и 5%, РНК-носитель (р-р 1 мг/мл делается перед употреблением), едкий калий 0,5н, ацетатный буфер 0,01 М рН = 5,1, этиловый спирт,
ацетон.
28
Лабораторная работа 5. Применение радионуклидов для изучения
биосинтеза цитоплазматических и ядерных фракций РНК в организме
облученных животных
Цель занятия: С помощью радиоактивных изотопов(32Р или меченых
предшественников) изучить радиационно-биохимические изменения, которые происходят в цитоплазматических и ядерных фракциях РНК печени
облученных животных.
Содержание занятия. Данная работа выполняется после подробного
изучения на предыдущих занятиях основных приемов работы с радиоактивными веществами и теории данного вопроса. Основные приемы работы с радиоактивными веществами студенты осваивают на предыдущих
занятиях (лаб. работа 1).
При выполнении данной работы предстоит проделать довольно
длинный ряд препаративных манипуляций по выделению и очистке соответствующих фракций РНК. Перед началом работы внимательно прочитать предлагаемую методику, ознакомиться с приведенной литературой
и составить план предстоящей работы. Следует помнить, что небрежность,
допущенная в процессе работы, может свести на нет результаты многодневного труда.
Соблюдать необходимые меры предосторожности!
Порядок выполнения работы.
1. Приготовление раствора радиофосфора и затравка животных
Рассчитать активность и приготовить рабочий раствор радиофосфора
(или меченых нуклеотидов, см. лаб работу 1) активностью 110 6 - 5106
Бк/мл. Ввести приготовленный раствор радиоизотопа животным (мыши или крысы) внутрибрюшинно с помощью шприца на 1—2 мл из расчета 0,510 4 Бк на грамм массы животного (время введения записать).
2. Получение гомогената
Через час после введения радиофосфора животных убить путем декапитации (обезглавливания), у крыс вскрыть брюшную полость и провести обескровливание печени введением физиологического раствора. Затем
печень извлечь и охладить на льду, либо заморозить сухим льдом или
жидким азотом. Охлажденную печень измельчить скальпелем или ножницами, замороженную печень осторожно растереть в ступке.
В стеклянный или тефлоновый гомогенизатор налить охлажденный
0,14 М раствор хлористого натрия и порциями поместить предварительно
измельченную печень. Гомогенизацию провести в несколько приемов с механическим приводом или от руки. Гомогенат быстро отфильтровать через 2 слоя марли, марлю промыть небольшой порцией (20—30 мл) 0,14
хлористого натрия.
3. Разделение цитоплазматических и ядерных фракций РНК
29
К гомогенату печени добавить paвный объем охлажденного свежеприготовленного водонасыщенного фонола, доведенного 0,5 н КОН до
pH=6,0. Смесь в закрытой колбе поместить в аппарат для встряхивания и встряхивать в течение 15—25 мин на холоду. Затем водную и
фенольную фазы разделить центрифугированием при 2500 об/мин в
течение 30 мин.
Верхний водный слой содержит РНК цитоплазмы и полисахар иды, промежуточная белая прослойка — ядерный материал (фенольные
ядра), в фенолом слое сосредоточены белки.
Верхний водный слой перенести пипеткой в коническую колбу.
Промежуточный слой осторожно отделить палочкой от стенок пробирки
и перенести в другую коническую колбу. Фенольный слой отбросить.
Водную фазу и промежуточный слой использовать для дальнейшей работы, которая может вестись параллельно с обеими фракциями.
4. Выделение цитоплазматических РНК (высокополимерной и низкополимерной)
Для выделения цитоплазматических фракций РНК можно использовать около трети полученного водного экстракта, так как этого количества достаточно для измерения удельной активности РНК и входящих в ее
состав нуклеотидов. Для дополнительной депротеинизации РНК K водному
экстракту добавить равный объем водонасыщенного фенола рН = 6,0, смесь
взболтать в течение 15—30 мин и центрифугировать 30 мин при 2600
об/мин. Водную фазу отделить пипеткой и на холоду к ней добавить 1,5—2
объема спирта.
Через 0,5—1,0 час выпавший осадок отделить центрифугированием
(15 мин, 3000 об/мин) в больших пробирках. Для лучшего удаления
надосадочной жидкости пробирки с осадком перевернуть на фильтровальную бумагу и оставить так на несколько минут, следить, чтобы не сполз
осадок. Затем РНК растворить в 5 мл бидистиллята рН = 7,0 при тщательном перемешивании палочкой и перенести в центрифужные пробирки на 10
мл.
К раствору РНК, если нужно осветленному центрифугированием, добавит кристаллический хлористый натрий с таким расчетом, чтобы конечная концентрация хлористого натрия в растворе составляла 2 М (580 мг
хлористого натрия на 5 мл раствора РНК). Соль растворить перемешиванием. Пробирки оставить на ночь в холодильнике. В 2 М хлористом
натрии выпадает в осадок цитоплазматическая РНК (главным образом
с-РНК или акцепторная РНК). Осадок высокополимерной РНК отделить
центрифугированием (5000 об/мин 15 мин), надосадочную жидкость
слить в чистую центрифужную пробирку.
Низкополимерную РНК осадить из надосадочной жидкости добавлением 2-х объемов спирта на холоду. Через 0,5—1 час осадок низкополимерной РНК отделить центрифугированием (15 мин 3—5 тыс. об/мин).
Для лучшей очистки полученных фракций от фенола, продуктов деградации и ДНК, РНК подвергнуть следующим переосаждениям. Выеокопо-
30
лимерную РНК растворить в 3—5 мл бидистиллята (pH = 7) и осадить
двумя объемами спирта на холоду. Через час осадок отделить центрифугированием. Цикл переосаждений хлористым натрием-спиртом можно
повторить еще один-два раза. При этом нужно следить, чтобы раствор
хлористого натрия после соответствующих осаждений РНК и отделения
осадка удалялся, как можно более полно. В противном случае РНК плохо
растворяется в бидистилляте. Низкополимерную РНК 1—3 раза переосадить спиртом. Все переосаждения удобно проводить одновременно с аналогичной работой с ядерной РНК (см. след. раздел). После осаждения обе
фракции цитоплазматической РНК растворить точно в 5 мл. бидистиллята
рН = 7,0, раствор осветлить центрифугированием (10 мин, 3000 об/мин) и
хранить для дальнейшей работы в замороженном виде или в виде осадка под спиртом.
5. Выделение ядерной РНК
Ядерный материал, содержащийся в промежуточном слое (см. раздел
3) .может быть использован для выделения ДНК и фракций ядерной РНК.
В настоящей работе предлагается провести фракционное выделение ядерной PHK, основанное на преимущественной экстракции фенолом M-PHK
(информационной РНК) при температуре 60—65 °С, а РНК-смеси предшественника и истинно рибосомальной РНК при температуре 40-45 оС.
В промежуточном интервале температур экстрагируется смешанная фракция
РНК. Промежуточный слой «фепольных ядер» повторно обработать фенолом
на холоду для более полной очистки от низкополимерной РНК. Для этого к
нему добавить водонасыщенный фенол рН = 6,0 в объеме, равном половине
первоначального, и такой же объем 0,14 М раствора хлористого натрия. Затем повторить операции, описанные в разделе 3. Для дальнейшей работы
собирать только промежуточный слой. К промежуточному слою «фенольных ядер», помещенному в коническую колбу на 300—500 мл, добавить
40—50 мл смеси водонасыщеиного фенола (рН=6,0)—0,14 М хлористого натрия ( 1 : 1 ) . Содержимое колбы энергично встряхнуть и колбу поместить в термостатический аппарат для встряхивания при температуре 45
°С на 15 мин. Затем смесь охладить и центрифугировать 30 мин при 3—
5 тыс. об/мин. Водный слой перенести пипеткой в чистую колбу, к нему
добавить равный объем охлажденного водонасыщенного фенола (рН = 6,0),
смесь взболтать 15 мин на холоду, центрифугировать и вновь отбирать
водный слой. Последняя обработка фенолом производится для депротеинизации экстракта рибосомальной РНК.
Промежуточный ядерный слой использовать для аналогичной экстракции фенолом три температуре 50 °С (смешанная фракция) и при
температуре 65 °С (м-РНК). В учебных целях можно провести две экстракции—при 45 °С и 65 °С, либо одну экстракцию суммарной ядерной
РНК при 60 °С. В последнем случае количество животных, используемых
в опыте, следует уменьшить в 2—3 раза.
Оставшийся ядерный материал (промежуточный слой) может быть
использован для выделения ДНК. РНК после фенольной депротеинизации
31
осадить из водного слоя добавлением 2 объемов спирта на холоду. Сформировавшийся осадок (через час или более) отделить центрифугированием в больших пробирках (15 мин 3—5 тыс. об/мин). После сливания
надосадочного раствора пробирки поставить вверх дном на фильтровальную бумагу для полного удаления жидкости (следить, чтобы не сполз
осадок). Затем в пробирки пипеткой добавить 0,5—1,0 мл бидистиллята pH
= 7,0 и РНК растворить при осторожном вращении или помешивании.
Раствор пастеровской пипеткой количественно перенести в малую центрифужную пробирку с коническим дном. Большую пробирку ополоснуть
еще 0,5 мл бидистиллята, который также переносится в малую пробирку.
Чтобы очистить полученную РНК от примеси ДНК и сравнительно низкомолекулярных продуктов деградации, произвести переосаждение РНК
2—2,5 М хлористым натрием. Для этого в пробирку с раствором РНК
добавить 150 мг кристаллического натрия хлористого на 1 мл раствора,
соль растворить и пробирки оставить в холодильнике на ночь. Выпавший
осадок отделить центрифугированием (15 мин 6000 об/мин) и переосадить
спиртом. Примесь ДНК в солевой надосадочной жидкости можно обнаружить добавлением к ней 2 объемов спирта. Выпадение нитевидного
осадка, прилипающего к палочке, указывает на присутствие в первоначальном экстракте ДНК (навивная ДНК растворима в 2 М растворе хлористого натрия, но не растворима в спирте). В случае заметного количества ДНК цикл переосаждений «соль—спирт» нужно повторить еще 1—2
раза. Однако абсолютная очистка РНК от ДНК достигается лишь обработкой ферментом дезокеирибонуклеазой. После последнего осаждения
ядерную РНК растворить точно в 3 мл бидистиллята, раствор осветлить
центрифугированием (10 мин 3000 об/мин) и хранить в замороженном состоянии.
6. Определение концентрации растворов фракций РНК
В результате проведенной работы должны быть получены следующие фракции РНК:
1. Цитоплазматическая высокополимерная РНК (главным образом рPHK);
2. Цитоплазматическая низкополимериая РНК (главным образом сPHK);
3. 1 — фракция ядерной РНК (предшественник и собственно р-РНК);
4. 2— промежуточная фракция ядерной РНК;
5. 3 — фракция ядерной РНК (главным образом M-PHK).
В соответствующее количество пробирок (удобно пользоваться градуированными пробирками) налить 9,9 мл 0,14 М. хлористого натрия для
цитоплазматических фракций и 4,9 мл 0,14 М хлористого натрия для
ядерных фракций. Микропипеткой в них внести по 0,1 мл соответствующих
растворов РНК. Содержимое пробирок тщательно перемешать, затем
произвести измерение поглощения ультрафиолета полученными растворами при длине волны 290 и 260 нм на спектрофотометре. В контрольную кювету налить 0,14 М раствор хлористого натрия. Измерения про-
32
изводить в средней части шкалы прибора (Е=0,1—0,8). Если этого сделать не удается, необходимо приготовить новый раствор РНК соответственно большей или меньшей концентрации. (Величину разведения записать). Расчет концентрации РНК в растворах, которые непосредственно
поступали на фотометрирование, произвести по следующей формуле:
с=∆260х40,
Где: с – концентрация РНК в γ/мл;
∆260 – разность экстинций при 260 и 290 нм;
40 – эмпирический коэффициент.
Концентрация РНК в исходном растворе рассчитывается с учетом
последующих разведений. Например:
С
с 5
0,1
Где:
С- концентрация РНК в исходном растворе в γ на мл;
5 – общий объем раствора после разведения, в котором определена
концентрация с в γ/мл;
0,1 – количество исходного раствора, взятое для разведения, в данном
случае до 5 мл (в мл).
7. Определение удельной радиоактивности полученных фракций РНК
Провести описанным выше способом. (Лабораторная работа 4).
8. Определение нуклеотидного состава и радиоактивности отдельных нуклеотидов. Работу провести по методу, описанному выше (лаб. работа 4).
Полученные результаты внести в следующие таблицы:
Таблица 1. Удельная радтоактивность РНК
№ Название Концентрация Объем, взятый Количество
п/п фракций
РНК в готодля приготовРНК, мг
вых растволения препарах «С», в
рата,
в мл
/мл
Скорость Удельная Относит
счета в ативность ошибка
имп/мин
РНК,
%
имп/мин
на 1 мг
Таблица 2. Нуклеотидный состав тотальной ядерной РНК
Фракции
ядерной
РНК
Нуклеотиды
Г
Ц
А
У
Поглощение
в УФ
соответст.
дл. волны
К-во
нуклеотидов
на 5 мл
элюата
Молярные
%%
Коэффициент
специфичности
Г+Ц/А+У
33
Таблица 3. Нуклеотидный состав вновь образованной ядерной РНК
Фракция
ядерной
РНК
Нуклеотиды
Активность в
имп/мин на
мкМоль
Ошибка
опред.,
в %%
Молярные Коэффициент
%%
специфичности
Г+Ц/А+У
Необходимое оборудование. Центрифуга для больших объемов (3000
об/мин). Центрифуга для малых объемов (до 6000 об/мин). Шюттельаппарат. Термостатический аппарат для встряхивания. Спектрофотометр.
Радиометрическая установка. Аппарат для высоковольтного электрофореза с выпрямителем. Ультрахемископ. рН-метр. Термостат на 37 °С. Холодильник. Весы торзионные или аптекарские. Весы для уравновешивания
центрифужных пробирок. Приборчик для получения стандартных осадков. Водоструйный насос. Стеклянный или тефлоновый гомогенизатор.
Посуда. Ванночка для промывания хроматографической бумаги.
Эмалированные кюветы. Шприц на 1—2 мл. Шприц на 20 мл с широкой
иглой. Зажимы-корнцанги или др. Линейка. Круговой нож для вырезания
дисков из фильтровальной бумаги. Скальпели. Штативы для центрифужных пробирок. Груши для пипеток. Широкогорлые банки для животных.
Воронки Бюхнера. Колбы Бунзена. Кристаллизаторы для льда. Центрифужные пробирки конические с притертой пробкой на 8 мл. Центрифужные пробирки всех размеров. Градуировнные пробирки на 10 мл с притертой пробкой.
Пробирки обычные. Микропипетки на 0,1 и 0,2 мл. Пипетки на 1 – 2 мл. Пастеровские пипетки. Мерные колбы на 100, 50, и 25 мл. Конические колбы на 300 – 500 мл с пробками. Фарфоровые ступки средних размеров.
Стеклянные палочки. Аппарат для перегонки фенола. Предметные стекла.
Реактивы и материалы. Радиоактивный фосфор. 0,14 М раствор
натрия хлористого. 5 % раствор цитрата натрия (рН=7). Свежеперегнанный
фенол с рН = 6. Бидистиллят, доведенный КНСОз до рН = 7,0. Х.ч. кристаллический хлористый натрий. 50 % раствор трихлоруксусной кислоты. 7 %
раствор хлорной кислоты. 5 % раствор хлорной кислоты. PHK- носитель
(раствор I мг/мл делается перед употреблением). 0,5 н раствор едкий калийя.
5 н раствор едкого калия. 2 М раствор приготовленный из х.ч. уксусной
кислоты. Ацетатно – аммонийный буфер pH = 3,5; 0,05-07М (СН3СООН+Н).
1М Фосфатный буфер рН=7,0. Этиловый спирт. Ацетон. Марля. Лед. Листы фильтровальной бумаги. Калька. Плотная бумага. Миллипоровые
фильтры 0,45 микрон. Фильтры «синяя лента» Универсальная индикаторная бумага. Хроматографическая бумага (быстрая). Резиновый клей или
другой. Мягкий простой карандаш. Карандаши по стеклу разных цветов
или маркеры.
Животные. Мыши или крысы
34
5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИИ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Лабораторная работа 6. Определение функционального состояния щитовидной железы IN VITRO по поглощению трийодтиронина, меченного 125j
эритроцитами
Метод основан на способности экзогенного трийодтиронина, меченного 125J, включаться в эритроциты исследуемой крови, причем степень
включения прямо зависит от функциональной активности железы. Чем
больше исследуемого гормона связано с тироксинсвязывающим глоб улином, тем меньше свободных мест связывания останется для экзогенного меченого гормона, и последний будет включаться в эритроциты.
Проведение анализа.
1. В пробирку, смоченную гепарином (2 %), вносят 2 мл крови.
2. Добавляют 0,1 мл 125J-трийодтиронина активностью 0,2 мкКи, осторожно перемешивают при 37 °С 45 мин. Во время инкубирования кровь
необходимо периодически встряхивать (через каждые 10—15 мин) и выдерживать в термостате строго определенное и всегда постоянное время,
так как длительное инкубирование или запаздывание с отмыванием эритроцитов может повысить включение в них 125J-трийодтиронина.
3.Через 45 мин измеряют радиоактивность крови в сцинтилляционном
гамма-счетчике.
4. Затем кровь центрифугируют в течение 10 мин при 1500 об/мин,
плазму удаляют, а осадок эритроцитов промывают от невключившейся радиоактивности (3—4 раза) физраствором, объем которого должен превышать
в 2—3 раза объем эритроцитов. Центрифугируют содержимое пробирок
каждый раз по 5 мин при 1500 об/мин.
5. Отмытые от плазмы эритроциты снова радиометрируют на гаммасчетчике. Рассчитывают процент поглощения эритроцитами трийодтиронина (ПЭТ) по формуле:
ПЭТ 
А  100
ВН
Где:
А — радиоактивность отмытых эритроцитов, имп/мин;
В — радиоактивность цельной крови, имп/мин;
Н — гематокрит исследуемого животного.
Гематокрит (процентное содержание форменных элементов крови)
определяют в специальных капиллярах центрифугированием в течение 4
мин на гематокритной центрифуге. Поскольку определение гематокрита
усложняет методику, многие исследователи считают необязательным
учитывать поправку на гематокрит, так как при заболеваниях щитовидной железы он относительно стабилен.
35
ПЭТ 
А  100
В
Тест ПЭТ прост в выполнении, является достаточно точным критерием функционального состояния щитовидной железы, позволяет следить за
динамикой тиреотоксикоза и судить об эффективности его лечения. Диагностическая точность методики при тиреотоксикозах 91,35 %.
Однако при оценке функции щитовидной железы по ПЭТ могут возникать ошибки, обусловленные гемолизом эритроцитов, снижением связывающей способности их при длительном хранении крови. Меченый
трийодтиронин следует использовать не более 3—4 недель при хранении в
условиях пониженной температуры.
Известно, что при нормальном функционировании щитовидной железы у людей включение 125J-трийодтиронина в эритроциты колеблется в
пределах 10-17 %, при гиперфункции 16-34 %, а при гипофункции 5-11 %.
6. ПРИМЕНЕНИЕ РАДИОНУКЛИДОВ В ГИСТОАВТОРАДИОГРАФИИ
Лабораторная работа 7. Изучение авторадиограмм мазков крови и срезов тканей животных и определение локализации радионуклида в клетках.
Авторадиографический метод позволяет решать ряд вопросов при исследовании обмена веществ на клеточном уровне. Основана авторадиография
на получении отпечатка на фотопластинках или слое фотоэмульсии в местах
локализации приложенного к этому фотоматериалу слоя биологического или
другого материала, содержащего радионуклиды. Их излучение воздействует
на зерна бромистого серебра, которые при последующем проявлении образуют картину распределения радионуклидов или меченных радионуклидами
соединений.
Наилучшие автографы можно получить при использовании альфаизлучателей. Пробег альфа-частиц в фотоматериалах мал, а плотность ионизации наибольшая. Однако альфаизлучателей, которыми можно метить биологические соединения, нет. Поэтому, для авторадиографии применяют радионуклиды, излучающие бета-частицы. Наиболее широко используют нуклиды, излучающие бета-частицы низкой энергии: сера-35, углерод-14 и тритий в количестве 20—40 МБк на 1 г массы животного. Эти нуклиды вызывают на пути следования в фотоматериалах более плотную ионизацию, поэтому
и более отчетливый, а при использовании трития — даже точечный след.
Сроки убоя животных после введения радионуклидов зависят от
скорости всасывания и отложения радионуклидов в тканях. Всасывание 3Нтимидина при внутрибрюшинном введении мышам в объеме 0,25 мл завершается в течение 15—20 мин. Что же касается других нуклидов, например
используемых для изучения минерального обмена или обмена микроэлементов, то практически уже через сутки процесс их депонирования в тканях за-
36
вершается. Поэтому в экспериментах животных можно забивать через сутки
после введения радионуклидов. При работе с некоторыми мечеными соединениями, особенно с 3Н-тимидином, необходимо иметь в виду возможность
их реутилизации. Однако если животных забивают в первые три дня после
введения тимидина, то процесс реутилизации можно не учитывать.
Изготовление гистологических срезов тканей. Для получения высокой разрешающей способности при авторадиографии делают достаточно
тонкие срезы органов и тканей, структуры которых содержат радиоактивную
метку. Чем тоньше срез, тем точнее может быть определена в структурах
клетки локализация меченых соединений или радионуклидов. В этом отношении удобнее работать с кровью и костным мозгом: весь процесс изготовления из них материала для исследований ограничивается нанесением на хорошо обезжиренные предметные стекла тонких мазков крови или костного
мозга с последующей сушкой в течение 5 мин.
Приготовление гистологических срезов органов и тканей общепринятым методом требует значительного времени и труда.
Фотоматериалы. Для авторадиографии применяют специальные фотопластинки и жидкие фотоэмульсии. Основное преимущество фотопластинок перед фотоэмульсиями состоит в том, что они имеют слой фоточувствительного материала довольно равномерной толщины. Однако на фотопластинки трудно монтировать срезы тканей в условиях слабого освещения фотолаборатории. Кроме того, толщина светочувствительного материала на
пластинках больше, чем толщина слоя, который получается при нанесении
фотоэмульсии на приклеенный к предметному стеклу срез ткани.
Для авторадиографии альфа-излучающих радионуклидов используют
фотопластинки А 2, для бета-частиц — фотопластинки типа МР и МК (Московский завод технических пластинок). Чаще применяют жидкие фотоэмульсии Р-НИКФИ, М-НИКФИ, ПР-9 и ПР-2. Последние две эмульсии можно
хранить в холодильнике в течение нескольких месяцев. Фотоэмульсия ПР-9
обладает более мелким зерном, чем эмульсия ПР-2, и пригодна для использования в электронной авторадиографии.
Методы нанесения фотоэмульсии на препараты. Фотоэмульсию
наносят на предметные стекла со срезами тканей путем погружения их в стаканчик с расплавленной эмульсией (со стороны, свободной от среза, эмульсию удаляют) или посредством нанесения ее на предметные стекла в определенном количестве. Перед использованием эмульсию расплавляют в ультратермостате при температуре 40—42 °С. После этого разбавляют эмульсию
смесью дистиллированной воды с глицерином (99 мл дистиллированной воды + 1 мл глицерина) в соотношении 1: 6. Разведенную эмульсию нагревают
в течение часа при 40—42 °С, осторожно помешивая палочкой. После этого в
эмульсию погружают предметное стекло, вынимают его, протирают одну
сторону марлей и рассматривают слой эмульсии при зеленом свете. Если на
стекле нет непрозрачных комочков и неравномерного распределения эмульсии, то она готова к употреблению. В противном случае продолжают нагревание и помешивание до готовности.
37
Экспозиция препаратов. При авторадиографии экспозиция для радионуклида подбирается в зависимости от его удельной активности и периода
полураспада. Для короткоживущих радионуклидов экспозиция более трех
периодов полураспада нецелесообразна. Чем больше удельная активность
среза ткани, тем меньше должна быть экспозиция. Время экспозиции можно
определить эмпирически. Для этого делают по три дубликата каждого препарата и проявляют их через различные сроки после начала экспозиции,
например через 1, 2 или 4 недели. Экспозиция может значительно варьировать, но она должна быть одинаковой для всей серии опытов.
Необходимо учитывать, что при очень продолжительной экспозиции на
автографах образуется вуаль.
Проявление радиоавтографов. За сутки до проявления радиоавтографов готовят проявитель. Время проявления 30 мин при температуре 18 °С.
Для фотообработки радиоавтографов удобно использовать 4 специальных
сосуда, вмещающих одновременно по 20 предметных стекол. В первый сосуд
наливают проявитель (метол — 1 г, Na2SO4 кристаллический — 75, гидрохинон — 4, Na2SO3 кристаллический — 55, KBr — 2,5 г, дистиллированная вода — 1 л), во второй — останавливающий раствор (5 % раствор уксусной
кислоты), в который после промывания помещают на 1 мин радиоавтографы,
в третьем сосуде промывают автографы водой в течение 30 с. Закрепление
осуществляют в четвертом сосуде 20 % раствором гипосульфита до просветления фотоэмульсии (примерно 5—8 мин). После фиксирования автографы
промывают в проточной воде 30 мин.
Окраска радиоавтографов. Проявленные влажные препараты окрашивают: мазки крови или костного мозга по Романовскому — Гимзе, срезы
тканей — гематоксилин-эозином. Разведение краски по методу Романовского
— Гимза подбирают опытным путем. В ряде случаев готовый фабричный
краситель разводят в 2 раза, а время окраски составляет 5 мин. После окраски
препараты промывают водой, проводят через 2 порции 96 % этилового, спирта и 2 порции ксилола (каждый по 5 мин), затем заливают канадским бальзамом и накрывают покровным стеклом. Мазки крови и костного мозга после
окраски ополаскивают дистиллированной водой и сушат в вертикальном положении на подставке.
Изучение радиоавтографов. В зависимости от поставленной задачи
радиоавтографы оценивают визуально или микроскопически (в том числе и
под электронным микроскопом). Гистологические срезы для обычной микроскопии, а также мазки крови и костного мозга исследуют с помощью иммерсионного объектива. Вначале определяют фон путем подсчета фотоэмульсии
на площади, равной площади клетки или ее ядра. Величина фона зависит от
типа фотоэмульсии, режима проявления, условий экспозиции и т. д. В среднем для ядра клетки принято считать фон, равный 3—5 зернам. Методы
оценки результатов зависят от цели работы, но они всегда должны быть совершенно одинаковыми для контрольной и опытной групп животных.
В большинстве экспериментов наиболее удобно оценивать плотность
зерен проявленного серебра. Наиболее распространенным является визуаль-
38
ный подсчет зерен, но возможно и фотометрическим методом. Результаты
авторадиографического эксперимента подлежат статистической обработке.
Условия правильного обращения с фотоэмульсией: 1) все операции
с фотоэмульсией проводят только в темноте или при актиническом освещении (зеленый или желтый светофильтр); 2) фотоэмульсию, полученную от
изготовителя, расплавляют при 40— 42 °С, остужают и хранят в холодильнике при 2—4 °С; 3) при хранении эмульсии соблюдают защиту от внешних источников облучения, светонепроницаемость, влагонепроницаемость, исключают колебания температуры, доступ паров кислот, перекиси водорода, аммиака и т. д.; 4) при соблюдении перечисленных условий эмульсия М сохраняет свои качества до 4 месяцев, эмульсия Р — до 2 месяцев.
Некоторые условия, обеспечивающие хорошее качество препаратов. В связи с тем, что фотоэмульсии (особенно Р) являются высокочувствительными, следует избегать всех возможных источников возникновения фона
(или так называемых зерен вуали) на приготавливаемых препаратах. Прежде
чем использовать эмульсию, следует проверить ее годность, то есть наличие
«фабричной вуали». Для этого несколько чистых стекол заливают эмульсией,
проявляют через 12 ч и просматривают под микроскопом.
Вся посуда, связанная с фотообработкой, должна быть химически чистой (применение хромпика для ее мытья обязательно). Стекла для срезов и
мазков, а также контрольные стекла должны быть тщательно обезжирены,
поскольку на необезжиренные участки эмульсия не ложится. Неосторожное
перемешивание и резкое погружение стекол могут быть источником сильного фона. Соприкосновение стекол или неосторожный захват стекла могут вызвать нарушение целостности всего слоя эмульсии или создать обширные
участки почернения.
Чтобы избежать порчи препаратов во время экспонирования, следует
соблюдать условия п. 3 (см. выше). Фотоэмульсия (особенно Р) обладает
способностью набухать. Поэтому неосторожное покачивание стекол во время
проявления и закрепления, а также сильная струя или повышенная температура проточной воды при промывании способны вызвать сползание всего
слоя эмульсии.
Подсчет радиоавтографов удобнее проводить с помощью иммерсионных объективов.
В настоящей лабораторной работе предлагается выполнить два упражнения, которые позволяют освоить основные приемы работы при использовании радионуклидов для гистоавторадиографических исследований.
Упражнение 1. Исследование срезов тканей животных гистоавторадиографическим методом.
Животным вводят внутрибрюшинно 3Н-тимидин. Через час животных
убивают декапитацией. Вырезают кусочки печени, селезенки и других органов размером 2х2х2 мм, быстро помещают их в фиксатор Карнуа, затем проводят гистологическую обработку, гистосрезы экспонируют с фотоэмульсией
при 2—4°С в течение 14 суток, затем проводят фотообработку и подсчитывают радиоавтографы под микроскопом.
39
Материалы и оборудование: 3Н-тимидин, подопытные животные, ножницы, скальпели, пинцеты, шприц на 1 мл, вата, бумага фильтровальная, кювета, предметные стекла, химические стаканчики на 1000 мл, ультратермостат, холодильник, зеленый сфетофильтр, вертикальные штативы для предметных стекол, спирт 96 %, хлороформ, парафин, глицерин, ксилол, фотоэмульсии М и Р, проявитель для фотопластинок, фиксаж, краска Романовского—Гимза, дистиллированная вода, эфир, покровные стекла, канадский бальзам.
Выполнение работы.
Животному внутрибрюшинно ввести 3Н-тимидин из расчета 20 МБк/г
массы и через час его убить декапитацией. Из печени и других исследуемых
органов вырезать кусочки (максимальный размер 2х2х2 мм) и быстро поместить их в фиксатор Карнуа (6 частей спирта + 3 части хлороформа + 1 часть
ледяной уксусной кислоты). Провести гистологическую обработку кусочков
тканей по следующей батарее: фиксатор Карнуа — 40 мин, 1-й 96 % спирт—
30 мин, 2-й 96 % спирт —30 мин, 1-й 100 % спирт — 15мин, 2-й 100 %
спирт—15 мин, 1-й хлороформ — 5 мин, 2-й хлороформ— 5 мин, смесь состоящая из 1 части хлороформа и 1 части парафина — 20 мин, 1-й парафин
— 60 мин, 2-й парафин — 60 мин (хлороформ можно заменить ксилолом).
После этого залить кусочки в парафин, приготовить срезы толщиной 2—3
мкм и расположить их на предметном стекле, смазанном белком с глицерином, на расстоянии 1 см от каждого края.
Депарафинировать срезы в следующей батарее: 1-й ксилол — 3 мин, 2й ксилол —3 мин, 3-й ксилол — 3 мин, 1-й 96 % спирт —3 мин, 2-й 96 %
спирт — 3 мин, 70 %спирт — 3 мин, 1-я дистиллированная вода — 3 мин, 2-я
дистиллированная вода — 3 мин.
Провести фотообработку срезов в следующем порядке. Достать эмульсию из холодильника, осторожно отложить нужное количество в химический
стакан и расплавить в ультратермостате при 40—42 °С. Разбавить эмульсию
смесью дистиллированная вода (99 частей) + глицерин (1 часть) в соотношении 1:6. Разведенную эмульсию нагреть в течение часа при 40—42 °С, осторожно помешивая стеклянной палочкой. После этого в эмульсию погрузить
предметное стекло, вынуть его, протереть марлей одну сторону, рассмотреть
слой эмульсии при зеленом свете. Если на стекле не будет непрозрачных комочков и неравномерно распределенной эмульсии, то она готова к употреблению. В противном случае продолжить нагревание и помешивание до готовности. Приготовленные стекла залить готовой эмульсией, осторожно погружая каждое стекло в стаканчик, извлекая его и протирая обратную сторону марлей. Залитые стекла установить в вертикальные штативы и оставить на
ночь для высушивания в защищенном от пыли месте. Избегая соприкосновений, сложить стекла в коробки, обеспечив при этом абсолютную свето- и
влагонепроницаемость (можно использовать СаСl2). Коробки уложить на
экспонирование в холодильник при 2—4°С на 14 сут для М и на 10 сут для Р.
После экспозиции проявить стекла в течение 3,5 мин при комнатной
температуре в следующем проявителе: метол — 1 г, Na2SO4 — 75, гидрохи-
40
нон — 4, Na2SОз — 55, КВг — 2,5 г, дистиллированная вода — 1л. Затем
стекла осторожно ополоснуть дистиллированной водой и держать в течение
10 мин в закрепителе (гипосульфит — 250 г, дистиллированная вода — 1л).
Стекла промыть в слабопроточной холодной воде от 30 мин до 12 ч. Промытые препараты окрасить гематоксилин-эозином, заключить в канадский бальзам и произвести подсчет радиоавтографов.
Упражнение 2. Исследование мазков крови и костного мозга гистоавторадиографическим методом.
Материалы и оборудование: те же, что и в упражнении 1.
Выполнение работы.
Животным вводят внутрибрюшинно 3Н-тимидин из расчета 20 МБк на
1 г массы. Через час берут пробы крови и костного мозга, делают мазки, высушивают их на воздухе и фиксируют в метаноле в течение 5 мин. Нанесение
фотоэмульсий, экспозицию препаратов и их фотообработку делают так же,
как и в упражнении 1. Для окраски мазков по Романовскому — Гимзе используют раствор стандартной краски из расчета 2—3 капли на 1 мл дистиллированной воды. Стекла с мазками помещают в чашки Петри на палочки
(удобно использовать спички) мазками вниз. Затем в чашки наливают краску.
Время окраски (20—40 мин) зависит от качества краски, окружающей температуры, рН воды. Окрашенные мазки обмывают дистиллированной водой,
высушивают на воздухе и исследуют под микроскопом с иммерсионным
маслом.
Контрольные вопросы.
1. Какие основные условия необходимо соблюдать при использовании
радионуклидов в биологических исследованиях?
2. Порядок расчета активности, приготовление растворов радионуклидов для введения в организм подопытных животных.
3. В чем заключается подготовка рабочего места и проведение заключительных мероприятий при проведении экспериментов с радионуклидами?
4. Какие меченые соединения можно использовать для изучения белкового и нуклеинового обмена у животных?
5. Охарактеризуйте способы приготовления счетных образцов из биологических проб для радиометрии.
6. Какие основные преимущества радионуклидных методов исследования по сравнению с обычными.
7. На чем основан авторадиографический метод изучения обмена веществ?
41
7. ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение 1.
Значение поправочного коэффициента К = e0,693•t/T
на радиоактивный распад для различных значений времени t, выраженного в долях периода полураспада (по И.Н. Верховской )
t
T
K
t
T
К
t
T
K
0,00
1,00
0,60
1,52
3,00
8,00
0,02
1,02
0,70
1,62
3,50
11,36
0,04
1,03
0,80
1,73
4,00
16,00
0,06
1,04
0,90
1,86
4, 50
22,65
0,08
1,06
1,00
2,00
5,00
32,00
0,10
1,07
1,25
2,36
6,00
64,00
0,20
1,15
1,50
2,82
7,00
128,00
0,30
1,23
1,75
3,35
8,00
256,00
0,40
1,32
2,00
4,00
9,00
512,00
0,50
1,41
2,50
5,64
10,00
1024,00
42
Приложение 2
К
N (пр  ф)
Nф
1,3
1,5
1,7
2,0
3,0
5,0
10,0
20,0
50,0
100,0
∆= 1 %
Таблица Белла
(по И.Н.Верховской)
∆= 3 %
∆= 2%
∆= 5 %
∆= 10 %
nф
n
nф
n
nф
n
nф
n
nФ
n
240000
89000
47000
24000
11500
2000
500
150
34
11
350000
163500
105000
68000
46000
23000
16000
13000
11900
11200
10000
60000
22000
12000
6000
3000
500
130
40
9
3
90000
41000
26000
17000
11000
5700
4000
3700
3000
2800
2500
27000
10000
5000
3700
1300
200
60
20
4
40000
18000
12000
7600
5100
2600
1800
1500
1300
1200
1100
9500
3600
2000
1000
450
80
20
6
(1,3)
(0,4)
14000
600
4000
2700
1800
900
650
540
480
450
400
2400
900
470
240
115
20
5
(1,5)
(0,34)
3500
1600
1000
710
450
230
160
130
120
112
100
Обозначения:
N пр + ф - количество импульсов фона и препарата в 1 минуту;
N ф количество импульсов фона в 1 минуту ;
n -число импульсов препарата и фона за t минут;
n ф - число импульсов фона а t минут.
43
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ч.Ванг, Д.Уиллис Радиоиндикаторный метод в биологии. – Атомиздат, 1969.
2. Дж. Дэвидсон Биохимия нуклеиновых кислот. М., «Мир», 1976.
3. Методы исследования нуклеиновых кислот. Под ред.
А.Н.Белозерского. М., «Мир», 1970.
4. Н.Г.Гусев и др. Защита от ионизирующих излучений. М., «Энергоатомиздат», 1989, т.2
5. О.И. Епифанов и др. Радиоавтография. М., Высшая школа, 1977.
6. Ю.Ф. Коваль Радиоактивные нуклиды в медико-биологических исследованиях. М.: Атомиздат, 1977.
7. В.Н. Славнов. Радиоизотопные и радиоиммунологические исследования функции эндокринных желез. Киев, Здоровье, 1978.
44
СОДЕРЖАНИЕ
1. ОРГАНИЗАЦИЯ И ПРОВЕДЕНИЕ РАБОТ С РАДИОАКТИВНЫМИ ИНД
ТОРАМИ……………………………………………...
Лабораторная работа 1. Методы расчета активности и приготовление рабочих раст
радионуклидов………………………………
2. РАДИОНУКЛИДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МИНЕРАЛЬНОГО ОБМЕНА У Ж
ВОТНЫХ……………………………………………….
Лабораторная работа 2. Исследование характера распределения, миграции, накопле
выведения фосфора в организме животных……..
3. РАДИОНУКЛИДЫ В ИЗУЧЕНИИ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА……
Лабораторная работа 3. Изучение белкового обмена у животных с помощью меченых
нокислот…………………………………………….
4. РАДИОНУКЛИДЫ В ИЗУЧЕНИИ ОБМЕНА НУКЛЕИНОВЫХ К
ЛОТ………………………………………………………….
Лабораторная работа 4. Исследование биосинтеза (по скорости включения 32Р) вы
- и низкополимерных фракций РНК у животных в норме и при действии иони
ющей радиации………..
Лабораторная работа 5. Применение радионуклидов для изучения биосинтеза
плазматических и ядерных фракций РНК в организме облученных ж
ных…………………………………………….
5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИИ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
Лабораторная работа 6. Определение функционального состояния щитовидной желе
125
VITRO
по
поглощению
трийодтиронина,
меченного
j
эритро
ми…………………………………………………………...
6.
ПРИМЕНЕНИЕ
РДИОНУКЛИДОВ
В
ГИСТОАВТОРАДИО
ФИИ…………………………………………………………...........
Лабораторная работа 7. Изучение авторадиограмм мазков крови и срезов тканей жив
и
определение
локализации
радионуклида
в
ках………………………………………………………………………
7. ПРИЛОЖЕНИЯ………………………………………………
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ