модификация генетических и метаболических последствий

1
МОДИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И МЕТАБОЛИЧЕСКИХ
ПОСЛЕДСТВИЙ ВОДНОГО СТРЕССА У РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ
Н.А Набиева, gen_eht@yahoo.com
Институт Генетических Ресурсов
Национальной Академии Наук Азербайджана, Баку
Изучена стабилизирующая роль альфа-токоферола в регуляции генетических и
метаболических последствий водного стресса в динамике зеленения
растений
пшеницы
Устойчивость, как одно из проявлений надежности организма, означает
выживаемость
биологического
объекта
и
вероятность
эффективного
его
функционирования в изменяющихся условиях среды и во времени [3]. Ее
напряженность, которая порой отклоняется от нормы, достигая стрессовых уровней,
детерминируется интенсивностью воздействия нерегулируемых
и регулируемых
факторов физической, химической и биологической природы. Все возрастающее
поступление их в экосферу от техногенных и естественных источников, а также
кумуляция в ней в значительных количествах делают их постоянными и
долгосрочными компонентами среды обитания. Особую тревогу вызывает тот факт,
что наряду с прочими, проявляющимися на различных уровнях структурнофункциональной
организации
живых
систем
негативными
последствиями,
упомянутые факторы экстремальности обладают генотоксичными свойствами. В
результате возникают повреждения, приводящие к изменению генетически
детерминированного адаптивного потенциала [11,14,8], и, как следствие, к
нарушению биологического равновесия в экосистемах, частичному или полному
разрушению
биоценозов,
сопровождающихся
сокращением
генетической
информации и уменьшением разнообразия [12,10,2]. В этой связи решающее
значение в практической реализации задач растениеводства принадлежит прежде
2
всего, увеличению общей и специфической адаптивной устойчивости растений. В
рассматриваемом
аспекте
особое
внимание
заслуживают
исследования,
направленные на познание механизмов генотоксичности изменяющихся условий
существования
биологических
видов
во
взаимосвязи
с
их
влиянием
на
определяющие мутабильность клеток процессы клеточного метаболизма, а также на
выявление на этом фоне особенностей управления генетической устойчивости
организма [5,7,13]. Несмотря на достигнутые в последние годы успехи, в этом
направлении исследований, на сегодняшний день еше недостаточно ясен вопрос
взаимодействия
и
взаимосвязи
эволюционно
сформированных
адаптивных
механизмов с повышением генетической устойчивости растительных организмов к
воздействию экстремальных факторов – в том числе водного стресса на уровне
совокупности процессов, направленных на поддержание целостности генома.
Требует дальнейшего изучения и характер влияния на эти процессы зависимых от
воздействия факторов внутренней и внешней среды особенностей резервирования
эндогенных метаболитов, а также регуляторная роль экзогенных корректоров
мутагенеза. Исследование именно этих вопросов являлось основной целью
настоящей работы, в которой в качестве регулятора устойчивости апробирован
биоантиоксидант–альфа-токоферол,
обладающий
высокоэффективным генозащитным свойством [1].
плейотропным
В качестве критериально
значимого метода оценки устойчивости растений к анализируемому экстремальному
фактору по вариантам экспериментов использован анализ частоты структурных
перестроек хромосом в клетках меристемы листьев пшеницы. Наряду с этим,
проводили анализ продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), индуцируемых
в листьях растений водным стрессом, на основании результатов которого также
судили об особенностях протекторного действия альфа-токоферола во взаимосвязи
со стабилизацией им процессов клеточного метаболизма.
Материал
и
методы
исследования:
Объектом
исследования
служили
постэтиолированные проростки пшеницы сорта Grecum 75/50 (Triticum aestivum L.) ,
инкубируемые на воде в течение 5 суток при 27oС в полной темноте. По истечении
3
этого времени опытные партии проростков в темноте переводили на 3 часа в
растворы альфа-токоферола с различной концентрацией (0,001-1,0 мкг/мл). Затем
их подвергали трехчасовому воздействию водного стресса ПЭГ 6000 (-10 бар,
17,2%-ный раствор). После воздействия, растения выносили на свет (5000 лк) и
проращивали при температуре 270С на воде до момента фиксации. Материал через
2,4,6,12,24 и 48 часов зеленения фиксировали и готовили для анализа. Контролем
служили постэтиолированные проростки, зеленеющие в аналогичные сроки при
температуре 27oС. Оценка
генетических
нарушений
проводилась
по
тесту
хромосомных аберраций в митотических клетках [6]. Об интесивности ПОЛ
судили по содержанию малонового диальдегида (МДА) [4]. Все полученные
экспериментальные данные обрабатывали с использованием t-критерия Стъюдента,
Х-критерия Ван-дер-Вардена и W (Т) Вилкоксона.
Результаты
и
их
обсуждение:
В
динамике
48-часового
зеленения
постэтиолированных проростков пшеницы при участии в схеме экспериментов
альфа-токоферола и в вариантах без его использования в них в качестве стресспротектора выявлены некоторые закономерности формирования генетической
устойчивости растительного организма в условиях водного стресса с осмотическим
потенциалом –10 бар (рис.1). Прежде всего, установлено, что между контрольными
значениями частоты структурных перестроек хромосом по участкам временных
кривых в динамике 48-часового зеленения интактных проростков пшеницы
статистически значимых различий нет и они находятся на примерно одинаковом
низком уровне. Отсутствие статистически значимых различий в регистрируемых
показателях
по
участкам
временных
кривых
экспозиции
на
свету
постэтиолированных проростков пшеницы указывает на то, что настоящие
экспериментальные условия без участия в них водного стресса не оказывают
существенного
влияния
на
образование
генетических
изменений
в
меристематических клетках их листьев, когда частота аберраций хромосом
возникающих у исследуемого объекта колеблется в низких эволюционно
сформированных пределах. В опытных вариантах, в митотических клетках листьев
4
обнаруживается
4-х
кратный
прирост
хромосомных
повреждений,
свидетельствующий о возрастании мутационной активности в генетической
системе. Но этот наблюдаемый в динамике зеленения листьев прирост генетических
нарушений носит неравномерный характер. Он зависит
от продолжительности
экспозиции растений на свету. Наиболее высокий уровень хромосомных аберраций
16
12
10
Часы
зеленения
Аберрации хромосом,%
14
8
6
4
2
0
контроль
-10бар
0,001
0,01
0,1
1
Рис.1
Дозозависимая коррекция α-токоферолом генетической устойчивости к водному
стрессу (ПЭГ-10бар) клеток меристемы листьев пшеницы в динамике их зеленения
отмечается в ранние часы пребывания проростков на свету. С увеличением
продолжительности
зеленения
листьев,
частота
генетических
нарушений
уменьшается и стабилизируется на определенном, относительно низком уровне.
Выявленная закономерность представляется весьма важной, так как в рамках
выполненного исследования делает возможной детерминацию особенностей
генетической устойчивости используемого объекта исследования к воздействию
экстремального фактора, заключающуюся в тесной сопряженности
путей
формирования устойчивости пигментного аппарата и генома в единой системе
растительного организма.
Обращает на себя внимание тот факт, что в данном
5
случае устойчивость растений к генотоксическому воздействию водного стресса
монотонно нарастает практически с первых часов зеленения растений на свету. К 12
часовому периоду зеленения она значительно повышается, достигая максимума в
период 48 часового зеленения, когда, пигментная система наиболее устойчива и
нативна. Трехчасовая темновая предобработка проростков пшеницы альфатокоферолом в концентрациях 0,001-1,0 мкг/мл с разной эффективностью
модифицирует частоту индуцированных аберраций хромосом. Но в концентрации
0,1 мкг/мл применяемый препарат повышает по механизму профилактической
стабилизирующей надежности адаптивную устойчивость клеточного генома к
водному стрессу -10 бар (таблица). При этом в опытных вариантах с альфатокоферолом отмечается 2-х кратное падение частоты хромосомных аберраций по
сравнении с индуцированным уровнем мутабильности в начальные часы зеленения.
К концу же анализируемого срока уровень хромосомных повреждений падает до
Таблица
Влияние альфа-токоферола на мутагенное воздействие водного стресса
в динамике зеленения этиолированных растений
Частота аберраций хромосом
Время зеленения
в меристематических клетках листьев, %
проростков после
этиоляции,
α - токоферол
Контроль
ПЭГ-10 бар
(часы)
(0,1 мкг/мл)
+ ПЭГ -10 бар
М ± m
М ± m
М ± m
2
3,88 ± 0,67
13,62 ± 1,18
7,84 ± 0,92
4
3,80 ± 0,66
13,13 ± 1,18
7,38 ± 0,91
6
3,68 ± 0,65
12,41 ± 1,13
7,11 ± 0,88
12
3,85 ± 0,68
11,88 ± 1,14
6,20 ± 0,83
24
2,99 ± 0,59
9,52 ± 1,02
5,16 ± 0,77
48
3,01 ± 0,59
8,31 ± 0,96
4,74 ± 0,75
6
спонтанного уровня мутабильности. Такое стабилизирующее влияние
токоферола
связано прежде всего с
альфа -
его антиоксидантными свойствами. Эти
свойства он проявляет благодаря уникальной способности стабилизировать в
биомембранах пространственную структуру ненасыщенных жирных кислот. Для
исследования возможных путей предотвращения последствий водного стресса
биоантиоксидантом, в адекватных экспериментальных условиях параллельно с
анализом частоты перестроек хромосом в структурных элементах генетической
системы проводилось количественное измерение одного из промежуточных
продуктов ПОЛ - МДА. Результаты исследования приводятся на рис.2 . Как видно
6
МДА, мкмоль/г
5
4
3
2
1
0
2
4
6
12
24
48
часы зеленения
Примечание:
контроль
-10бар
0,001
0,01
0,1
1
Рис.2
Изменение содержания МДА в постэтиолированных листьях пшеницы под воздействием
водного стресса (-10 бар) и при предстрессовой обработке альфа-токоферолом в динамике их
зеленения
7
из данных, содержание МДА в контрольных образцах по срокам анализа находятся
в пределах низких эволюционно сформированных для данного растения значениях.
Водный стресс, индуцируя
приводит к увеличению
по
интенсивность
сравнению
перекисного окисления
с
контрольным
липидов,
показателем,
количественного содержания МДА в постэтиолированных листьях пшеницы. Но
при этом сохраняется тенденция к его понижению в динамике зеленения. То есть, в
опытных вариантах обнаруживаются различия по амплитуде содержания МДА в
зависимости
от
длительности
освещения.
Интенсивность перекисного
окисления липидов при водном стрессе была более значительной в начальные часы
зеленения
растений на свету, а
в последние часы анализа содержание МДА
несколько снижается, достигая самого низкого уровня Альфа-токоферол при его
введении в среду инкубации семян пшеницы до воздействия водного стресса
замедляет процесс накопления МДА, нейтрализуя тем самым негативное действие
водного дефицита. Этот эффект проявляется уже в первые часы пребывания
проростков растений на свету. После обработки проростков альфа-токоферолом в
дозах
0,001; 0,01; и 1,0 мкг/мл содержание продуктов перекисного окисления
снижалось с несколько меньшей эффективностью, но при высоких значениях
достоверности (Р<0,001). Самое низкое содержание МДА отмечено при обработке
проростков альфа-токоферолом в дозе 0,1 мкг/мл.
При сопоставлении результатов генетического и биохимического анализов
обнаружен параллелизм между уменьшением содержания МДА в динамике
зеленения постэтиолированных листьев со снижением частоты регистрируемых
генетических изменений. Максимальный прирост хромосомных аберраций и
содержания МДА приходится на начальные часы зеленения. В этот период
энерготрансформирующая система, как известно еще не сформирована и
имеющиеся на этот момент энергетические ресурсы не могут обеспечить
восстановления после стрессового дисбаланса в липидном обмене. В результате
сохраняется высокий уровень индуцированных стрессом процессов свободнорадикального цепного
окисления. Взаимосвязь указанных процессов можно
8
рассматривать в ракурсе участия МДА в мутационном процессе, который
образуется
в
цепных
реакциях
окисления
свободными
радикалами
полиненасыщенных жирных кислот и легко вступает в реакции с макромолекулами.
В вариантах с применением альфа-токоферола в различных концентрациях
отмечается параллелизм относительного уменьшения показателей эффективности
защиты генома со снижением эффективности стабилизации МДА измененных под
воздействием водного стресса. Альфа-токоферол сам по себе практически не влияет
ни на содержание МДА, ни на частоту аберраций хромосом, зарегистрированных по
срокам анализа в контрольных образцах. Однако, в условиях водного стресса с
интенсивностью
–10
бар,
в
зависимости
от
используемой
дозы
и
продолжительности зеленения постэтиолированных проростков, предотвращает
изменения в показателях регистрируемых критериев, которые в его отсутствие и под
воздействием водного стресса проявляются в увеличении содержания МДА и
частоты генетических изменений. Эти данные подтверждают известные из
литературы генопротекторные свойства альфа-токоферола [9] и позволяют
установить пути их метаболической реализации.
Таким образом, применяемый антиоксидантный фактор оказывает не
только прямое генозащитное действие, но также повышает надежность и
эффективность функционирования энерготрансформирующей системы растений на
ранних этапах их онтогенеза. При этом, одним из возможных путей предотвращения
последствий водного стресса биоантиоксидантным фактором является регуляции им
интенсивности
перекисного
окисления
липидов.
Эти
фактические
данные
подтверждают предположение о том, что в основе одного из возможных путей
защитного действия альфа-токоферола лежат его антиокислительные свойства.
Следовательно, профилактическое стабилизирующее влияние альфа-токоферола
может рассматриваться в качестве важного элемента в формировании устойчивости
растений
путем
сохранения
изменяющихся условиях среды.
энергетического
баланса
в
организме
при
9
Литература
1. Алиев А.А. Антимутагенная активность альфа-токоферола и возможность его
практического использования.-Дисс.д.б.н.-Ленинград.-1989.-450 с.
2. Гераськин С.А., Дикарев В.Г., Удалова А.А., Дикарев Н.С. Закономерности
индукции малыми дозами ионизирующего излучения цитогенетических
повреждений в корневой меристеме ячменя. Радиац.биол., радиоэкол.1999.39.-№4.-с.373-383
3. Жученко А.А. Экологическая генетика культурных растений.- Кишинев
«Штиинца».-1980.
4. Лукаткин А.С., Голованова В.С Интенсивность перекисного окисления
липидов в охлажденных листьях теплолюбивых растений.-Физ.раст.-Вып.4.1988.-с.773-779
5. Attaguile G., Russo A., Campisi a., savoca F., Acquaviva R., Ragusa N., Vanella
A. Antooxidant activity and protecive effect on DNA clearage of extract from
Cistus incanus a and Cistus monspeliensis a. //Cell Big. And Toxicol.-2000.-16.№2.-c.83-90
6. Bowker
W.A.,
Hallovan
G.M.
A
method
of
examining
mitosis
in
Graminal//Cytologia.-1981.-V.46.-.№3.-p.37-41
7. Drake
J.W.
The
antievalutionary
component
of
antimutagenesis
and
anticarcinogenesis: where do mutation rates come from and where are they
going?//Mutat.Res.-1996.-V.350.-№1.-p.5-8
8. Levi F., Luccini F., Negri E. The decline in caneer Motality in the European Union.
1988-1996 //Eur.J.,Cancer.-2000.-36.-p.1965-1968
9. Munne-Bosch S., Alerge L. Drought-induced changes in the redox state of αtocopherol,ascorbate,and the
carnosic acid in chloroplasts of labiatae species
differing in carnosic acid contents.Plant Physiol.-April,2003.-Vol.131.-pp.18161825
10
10. Prabhavati P.A., Fatima Sh.K., Padmavathi P., Kusuma K.C. Sister – chromatid
exchanges in nuclear fuel workers // Mutat.Res., Mutat.Res.Lett.-1995.-347.-№1.p.31-35
11. Von Borstel R.C., Drake T. Love I.Foreword // In Fundamental and Molecular
Mechanism of Mutagenesis. Mutat.Res.-1996-V.350.-№1.-p.1-3
12. Waters M.D., Stack H.F., Jackon M.A.B. Inhibitions of genotoxic effects of
mammalian germ cell mutagents // Mutat.Res.Fundam. and Mol.Mech.Mutagen.1999.-402.-№1-2.-p.129-138
13. Weisburger L.W. Antimutagenesis and anticarcinogesis, from the past to the future
// Mutat.Res.-2001.-480.-p.23-35
14. William W., Chulasin M., Waters M.D. The Third International Conference on
environmental mutagens in human populations: 3rd International Conference onn
Environmental
Mutagenesis
in
Human
Populations.-Bangkok
Mutant.Res.Fundam. and Mol.Mech.Mutagen.-1999.-428.-№12.-c.1-3
\\
11