Информационно-справочные материалы о ходе реализации совместного российско-японского космического
реклама
Информационно-справочные материалы о ходе реализации совместного российско-японского космического эксперимента «Кристаллизатор» с использованием японской аппаратуры JAXA-PCG Космический эксперимент «Кристаллизатор» посвящен выращиванию высококачественных протеиновых кристаллов методом встречной диффузии в капиллярах с применением японской научной аппаратуры «JAXA PCG» на борту японского экспериментального модуля «Кибо». Работы проводятся в рамках Соглашения между Роскосмосом и Японским космическим агентством по аэрокосмическим исследованиям (JAXA) от 12.03.2009 № F001092000081. На данный момент проведено 4 сеанса КЭ «Кристаллизатор». В исследованиях принимают участие специалисты из Института кристаллографии им.А.В.Шубникова РАН, Института биохимии им. А.Н.Баха РАН, Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Института физико-химической биологии им.А.Н. Белозерского МГУ. В трех сеансах космического эксперимента удалось закристаллизовать 25белков и для 23 белков и их комплексов установлены пространственные структуры с очень высоким разрешением 0,95…3 Å. В Международный банк белковых данных (PDB) положены координаты 6-ти атомных моделей (РDB ID: 3RFF, 3RHS, 3RBA, 3QNV, 3PRT, 3UC5). Для белка алкогольдегидрогеназы 1998 из термофильной археи Thermococcus sibiricus, кристаллы удалось вырастить только в условиях микрогравитации и впервые получить его структуру. Для белка цитохром с нитритредуктазы из гипертермофильной бактерии Thioalkalivibrio paradoxus (рис. 1, 2) в рамках космического эксперимента впервые удалось получить кристаллы без двойникования, что положительным образом сказалось на качестве полученной структуры. Для уридинфосфорилазы из Shewanella oneidensis получены данные с ультравысоким разрешением – 0,95 Å (рис. 3, 4). Ранее, в земных экспериментах были получены кристаллы, дифрагирующие не выше 1.7А. Полученные в космическом эксперименте данные позволяют получить новые знания в части организации тонкой структуры активного центра фермента, т.к. делают возможным определение положений отдельных атомов водорода (Рис. 5), что невозможно при разрешении выше 1А. Это перспективный фермент для создания биокатализаторов биотехнологического синтеза нуклеозидов потенциальных противовирусных и противораковых лекарств. 1 Рис. 1 Капилляры с кристаллами цитохром с нитритредуктазы из бактерии T.nitratireducens после прилета (капилляр 1) Рис 3 - Кристаллы уридинфосфорилазы из бактерии S.oneidensis после прилета Рис.2 Пространственная структура цитохром с нитритредуктазы из бактерии T.nitratireducens Рис. 4 - Пространственная структура уридинфосфорилазы из бактерии S.oneidensis при разрешении 0,95 Å. Рис. 5 – Электронная плотность в активном центре уридинфосфорилазы при разрешении 0.95Å. 2 Для белка альдегиддегидрогеназы из термофильной археи A.sacharovorans ранее (в наземных экспериментах) были получены наборы с разрешением 2.4А. Данный фермент участвовал в четвертом сеансе эксперимента (JAXA#4). С выращенных в ходе выполнении JAXA#4 кристаллов были сняты наборы до разрешения 1.8А, что является значительным улучшением по сравнению с наземными данными. Большой цикл исследований проведен для таких ферментов и их комплексов с ключевыми лигандами, как фосфопантетеин аденилтрансферазы Mycobacterium tuberculosis (PPAT Mt), карбоксипептидазы Т, тимидинфосфорилазы (рис. 6-11). Рис.6 - Кристалл комплекса РРАТMT/ДФСоА, выращенный в капилляре (JAXA#1). Рис.7 - Фрагмент электронной плотности PPAT Mt|ДФСоА, разрешение 1.5Å (JAXA#1). Рис. 8 - Гексамерная молекула PPAT Mt. 3 Рис. 9 - Тример PPAT Mt с коэнзимом А в активном центре. Рис.10 - Мономер PPAT Mt с коэнзимом А в активном центре. Рис. 11 - Мономер PPAT Mt с дефосфокоэнзимом А в активном центре. Исследования с этими белковыми комплексами были продолжены и во время сеанса JAXA#4 , проводившегося в период 28 экспедиции на МКС с 21 июня по 16 сентября 2011 года. В эксперименте JAXA#4 изучались белки: PPAT Mt; PPAT Mt в комплексе с 4'-фосфопантетеином и в комплексе с 4'-фосфопантетеином и ATP; карбоксипептидаза Т мутант; карбоксипептидаза из Termoactinomyces vulgaris, WT; тимидинфосфорилаза с ингибитором, фруктозо-1,6-бисфосфат альдолаза I E.coli; фруктозо-1,6-бисфосфат альдолаза I в комплексе с неорганической пирофосфотаза E.coli; антитела на фуллерен С60; алкогольдегидрогеназа из T.sibiricus в комплексе с 1.6-гександиолом; никотинамидаза из A.sacharovorans; лакказа из B.aclada; альдегиддегидрогеназа из Pyrobacullum sp.; ДНК-лигаза из F.fontis в комплексе с АТФ и олигонуклеотидами; бета-гликозидаза из A.sacharovorans. Всего для исследований было подготовлено 20 белков и белковых комплексов с лигандами для 51 условия кристаллизации (характеристики данных биообъектов приведены на стр. 7-8, рис. 12-19), 17 из которых удалось закристаллизовать в ходе выполнения космического эксперимента. Было заправлено 90 капилляров для космического эксперимента и 60 – для наземного параллельного контроля. В результате проведения рентгеноструктурного анализа было получено 37 наборов дифракционных данных с разрешением 1,29 – 2,9 Å, пригодных для проведения дальнейшего структурного анализа. Практически для всех исследованных комплексов наборы данных были получены впервые, для ряда 4 белков кристаллы, выращенные в космосе, обладали существенно лучшими характеристиками (например, для нового белка карбоксипептидазы B), а некоторые комплексы кристаллов (например, PPAT Mt c АТФ) удалось вырастить только в космосе. Исследования, связанные с кристаллизацией белков в условиях невесомости с использованием японского кристаллизатора, являются для российских ученых важными и результативными. Прежде всего, необходимо отметить, что благодаря принятой в рамках Соглашения с 2009 г. организации работ по реализации КЭ, существенно повысилась эффективность исследований. Ключевыми моментами здесь являются: - передача российским ученым технологии кристаллизации белков по методу встречной диффузии - использование хорошо отработанных методов кристаллизации в космосе и технологии подготовки и проведения космического эксперимента; - использование значительно меньших количеств дорогостоящих белковых препаратов (на 1-2 порядка) для проведения исследований по сравнению с отечественными установками (Модуль-1, Луч), что позволяет снизить стоимость программы в целом и расширить номенклатуру исследуемых белков; - получение телеметрической информации о ходе проведения эксперимента; - гарантированная возможность в достаточно короткие сроки после окончания космического эксперимента проведения работ по получению дифракционных наборов данных на японском оборудовании (синхротрон последнего поколения SPRing-8). Исследования по кристаллизации белков получили поддержку на государственном уровне. Одним из важных этапов в обеспечении задач, связанных с исследованием белков, является начало работы отдела «Белковая фабрика», организованного в НБИК-Центре Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» и имеющего, в частности, роботизированную систему скрининга условий кристаллизации белков. Это позволит расширить и удешевить исследования по белковой кристаллографии, в том числе на борту МКС. Учитывая высокий научно-технический и организационный потенциал Центра можно надеяться на повышение эффективности как уже ведущихся работ в этой области космических исследований, так и планируемых в ближайшей перспективе. 5 Фотографии кристаллов белков, полученных в ходе выполнения JAXA-PCG#4 Рис. 12 - Капилляр с кристаллами лакказы из B.aclada. Рис. 13 - Капилляр с кристаллами альдегиддегидрогеназы из Pyrobacullum sp. Рис. 14 - Капилляр с кристаллами бетагликозидазы из A.sacharovorans. Рис. 15 - Капилляр с кристаллами алкогольдегидрогеназы из T.sibiricus в комплексе с гександиолом. Рис. 15 - Капилляр с кристаллами комплекса TP с ингибитором 2. Рис. 16 - Капилляр с кристаллами CPT wt в комплексе с сульфамоил фенилаланином. 6 Рис. 17 - Капилляр с кристаллами фруктозо1,6-бисфосфат альдолазы I в комплексе с неорганической пирофосфатазой E.coli. Рис. 18 - Капилляр с кристаллами мутанта CPT в комплексе с сульфамоил фенилаланином. Характеристика биообъектов в КЭ JAXA-PCG #4 . Фосфопантетеин аденилилтрансфераза Mycobacterium tuberculosis (РРАТ Mt) участвует в биосинтезе кофермента А (СоА), необходимого для жизнедеятельности микобактерии, которая вызывает заболевание туберкулезом. Поскольку ингибирование действия этого фермента прекращает размножение бактерии, РРАТ Mt является подходящей мишенью для поиска ингибиторов фермента – потенциальных антитуберкулезных лекарств. Полученные в результате кристаллизации и последующего рентгеновского исследования атомные координаты молекулы РРАТ и её комплексов с субстратами и продуктами реакции служат структурной основой для рационального конструирования новых антитуберкулезных лекарств. Карбоксипептидаза Т. Белки семейства карбоксипептидаз находят широкое применение в ряде биотехнологических процессов. Например, свиная карбоксипептидаза В применяется при получении генноинженерного инсулина. Замена свиной карбоксипептидазы на бактериальную могла бы значительно удешевить процесс. Однако бактериальные ферменты гораздо менее специфичны. Конструирование ферментов с измененной субстратной специфичностью является одной из важных задач инженерной энзимологии и требует детального изучения факторов, влияющих на специфичность фермента. Бактериальная карбоксипептидазаТ (КПТ), обладающая широкой специфичностью действия, является удобной моделью для таких исследований. Изучение пространственной структуры нативной КПТ и ряда ее мутантных форм позволит выявить элементы структуры, от которых зависит избирательность действия фермента. Результаты исследования могут быть использованы для приготовления фермента с заданной специфичностью. Тимидинфосфорилаза с ингибиторами (ТФ) успешно применяется для биохимического синтеза ряда лекарственных препаратов противовирусного и противоракового действия. Фруктозо-1,6-бисфосфат альдолаза (Fba, E.C. 4.1.2.13) участвует в важнейших метаболических путях, гликолизе и глюконеогенезе. Fba присутствуют во всех известных организмах, от бактерий до высших эукариот. Гомологичный нашему объекту белок, Fba человека, имеет важное медицинское значение. Измерение альдолазной активности в сыворотке крови является стандартной диагностической процедурой в клинической 7 практике, т.к. повышение активности Fba является маркером ряда заболеваний (гепатит, инфаркт миокарда и т.п.). В печени Fba - основной фермент метаболизма фруктозы, недостаток его активности служит причиной тяжелого заболевания (наследственной непереносимости фруктозы). В зависимости от механизма катализа, различают Fba I или II классов. Первые характерны для эукариот и архебактерий, вторые – для эубактерий. E.coli – одна из редких эубактерий, в которой, кроме типично бактериальной Fba-II, экспрессируется также Fba-I. Этот белок имеет невысокую гомологию с Fba-I других подклассов (из архей и из эукариот), поэтому по наложению их аминокислотных последовательностей нельзя идентифицировать остатки активного центра. Кристаллическая структура для Fba-I из эубактерий пока не решена. Ее решение позволит сделать выводы относительно остатков активного центра и механизма катализа, отнести Fba-I из E.coli к одному из известных подклассов (архейного или эукариотического типа). Алкогольдегидрогеназа из T.sibiricus в комплексе с гександиолом - фермент из гипертермофильной бактерии. Функционален при температуре 90С. Имеет широкую субстратную специфичность, в связи с чем перспективен для биотехнологии (детоксификация). Ранее была получена структура этого фермента в апо-форме. Представляет интерес посмотреть механизм связывания субстрата в активном центре. Никотинамидаза из A.sacharovorans. Данный фермент перспективен для медицины, т.к гомологичен ферменту из возбудителя туберкулеза. Также может быть использован в тонком органическом синтезе. Выделен из термофильной археи, что предполагает его высокую термостабильность. Лакказа из B.aclada. Данный класс ферментов имеет широкое биотехнологическое применение: биосенсорные технологии, целлюлозно-бумажная промышленность, ремедиация сточных вод, детоксификация и пр. Данный фермент интересен тем, что имеет низкую гомологию по аминокислотной последовательности с ферментами данного класса, а также не содержит один из трех необходимых ионов меди, оставаясь при этом активным. Альдегиддегидрогеназа из Pyrobacullum sp Фермент выделен из термофильной археи. Представляет научный интерес, т.к. в настоящее время неизвестна структурная организация архейных ферментов такого класса. Также перспективен в биотехнологии для утилизации альдегидов. ДНК-лигаза из F.fontis в комплексе с АТФ и олигонуклеотидами. Данный класс ферментов имеет жизненно важное значение для живых организмов, т.к. отвечает за устранение одно-и двуцепочечных разрывов в ДНК. Несмотря на имеющиеся литературные данные, ряд вопросов, связанных со структурными деталями молекулярного механизма действия этого фермента остается невыясненным. Может быть использован в лигазной цепной реакции (более чувствительный аналог ПЦР). Структура комплекса интересна механизмом связывания лигандов. Бета-гликозидаза из A.sacharovorans используется в качестве лекарственного препарата в качестве терапии болезни Гоше. Фермент также имеет широкий биотехнологический потенциал, связанный с окислением полисахаридов. Особую ценность придает возможность функционирования фермента при высокой температуре, т.к. он выделен из термофильного организма. 8 Сведения о публикациях результатов исследований, полученных в ходе выполнения программы совместного КЭ «Кристаллизатор» с использованием НА «JAXA-PCG». Опубликовано. 1. 2. 3. 4. И. Тимофеев, Е. А. Смирнова, Л. А. Чупова, Р. С. Есипов, И. П. Куранова, «Приготовление кристаллического комплекса фосфопантетеин аденилилтрансферазы MycobacteriumTuberculosis с коферментом А и исследование его пространственной структуры при разрешении 2.1 Å.», Кристаллография, 2010, том 55, № 6, с. 1058-1056. И. П. Куранова, Е. А. Смирнова, Ю. А. Абрамчик, Л. А. Чупова, Р. С. Есипов, В. Х. Акпаров, В. И. Тимофеев, М. В. Ковальчук, «Выращивание кристаллов фосфопантетеин аденилилтрансферазы, карбоксипептидазы Т и тимидинфосфорилазы на Международной космической станции методом встречной диффузии в капилляре», Кристаллография, 2011, том 56, № 5, с. 944–951. V. Kh. Akparov, A. M. Grishin, , V. I. Timofeev, I. P. Kuranovа, «Preparation, Crystallization, and Preliminary X-ray Diffraction Study of Mutant Carboxypeptidase T Containing the Primary Specificity Pocket of Carboxypeptidase B», Crystallography Reports, 2010, Vol. 55, No. 5, pp. 802–805. V. I. Timofeev, E. A. Smirnova, L. A. Chupova, R. S. Esipov, I. P. Kuranova, «Preparation of the Crystal Complex of Phosphopantetheine Adenylyltransferase from Mycobacterium tuberculosis with Coenzyme A and Investigation of Its Three-Dimensional Structure at 2.1-Å Resolution», Crystallography Reports, 2010, Vol. 55, No. 6, pp. 1050–1059. Готовятся к публикации. 1. 2. 3. 4. В.И.Тимофеев, Е.А.Смирнова, Л.А.Чупова, Р. С. Есипов*, И.П.Куранова, «Пространственная структура фосфопантетеин аденилилтрансферазы из Мycobacterium tuberculosis в апоформе и в комплексах с коферментом А и с дефосфокоферментом А.», Кристаллография, 2012, том 57, № 1, с. 26–34. Журнал – Biochemistry Mosc. По структуре нитритредуказы (результат JAXA#3). Уже написана. Журнал – Acta Cryst. D. По структуре нитритредуказы в комплексах (результат JAXA#3). В стадии написания. Журнал – Acta Cryst. D. По структуре уридинфосфорилазы (результат JAXA#2). В стадии написания. Доклады на конференциях 1. Куранова И.П. Кристаллизация белков методом встречной диффузии в наземных условиях и в условиях невесомости. XIV Национальная конференция по росту кристаллов, 6-10 декабря 2010 года. 2. Смирнова Е.А., Тимофеев В.И., Чупова Л.А., Есипов Р.С., Куранова И.П. Выращивание кристаллов фосфопантетеинаденилилтрансферазы Mycobacterium tuberculosis (PPAT Mt) в свободном состоянии и в комплексах с функциональными лигандами. XIV Национальная конференция по росту кристаллов, 6-10 декабря 2010 года, Стендовый доклад. 9 3. Тимофеев В.И., Гришин А.М., Акпаров В.Х., Куранова И.П. Выращивание кристаллов мутантной формы рекомбинантной карбоксипептидазы Т из Thermoactinomyces 4. 5. 6. 7. vulgaris в невесомости методом встречной диффузии XIV Национальная конференция по росту кристаллов, 6-10 декабря 2010 года, Стендовый доклад. Куранова И.П., Рентгеноструктурное исследование карбоксипептидазы Т (КПТ) из Thermoactynomyces Vulgaris и ее мутантной формы, VIII Национальная конференция «Рентгеновское синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии», РСНЭ-НБИК 2011, 14-18 ноября 2011 г., Москва, Учреждение РАН Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, НИЦ «Курчатовский институт». Тимофеев В.И., Пространственная структура фосфопантетеин аденилилтрансферазы Mycobacterium Tuberculosis в комплексе с АТФ при разрешении 1.58 Å, VIII Национальная конференция «Рентгеновское синхротронное излучения, нейтроны и электроны для исследования наносистем и материалов. Нано-Био-Инфо-Когнитивные технологии», РСНЭ-НБИК 2011, 14-18 ноября 2011 г., Москва, Учреждение РАН Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, НИЦ «Курчатовский институт». Куранова И.П., Ковальчук М.В., Выращивание кристаллов белков на международной космической станции методом встречной диффузии, Учреждение РАН Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, Москва, V Российский симпозиум белки и пептиды, Петрозаводск, 8-12 августа 2011 г. Акпаров В.Х., Тимофеев В.И., Куранова И.П., Механизм кальций-зависимой регуляции селективности карбоксипептидазы Т из Тhermoactinomyces Vulgaris, Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва; Учреждение РАН Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, Москва, V Российский симпозиум белки и пептиды, Петрозаводск, 8-12 августа 2011 г. 8. Абрамчик Ю.А., Тимофеев В.И., Муравьёва Т.И., Есипов Р.С., Куранова И.П., Выращивание кристаллов рекомбинантной тимидинфосфорилазы E.Coli и ее комплекса с ингибитором методом встречной диффузии в наземных условиях и в условиях невесомости, Учреждение РАН Институт кристаллографии имени А.В. Шубникова РАН, Москва; Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, V Российский симпозиум белки и пептиды, Петрозаводск, 8-12 августа 2011 г. 9. Тимофеев В.И., Смирнова Е.А., Чупова Л.А., Есипов Р.С., Куранова И.П., Рентгеноструктурное исследование фосфопантетеинаденилилтрансферазы из Mycobacterium Tuberculosis в апоформе и в комплексе с коферментом а и с дефосфокоферментом A, Учреждение РАН Институт кристаллографии им. А.В. Шубникова РАН, Москва; Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, V Российский симпозиум белки и пептиды, Петрозаводск, 8-12 августа 2011 г. 10
