возрастные особенности изменений в системе глутатиона в сердце крыс при иммобилизационном стрессе
реклама
експериментальні роботи УДК [612.17+577·15]:57.042./048 возрастные особенности изменений в системе глутатиона в сердце крыс при иммобилизационном стрессе В. Н. ШВЕЦ1, В. В. ДАВЫДОВ2 Запорожский государственный медицинский университет; Государственное учреждение «Институт охраны здоровья детей и подростков АМНУ»; e-mail: davydov@kharkov.com 1 2 С целью выяснения причин возрастного снижения устойчивости сердца к стрессу было предпринято изучение состояния пула глутатиона и активности ферментов его метаболизма в сердце взрослых и старых крыс при иммобилизационном стрессе. Исследования показали отсутствие различий в состоянии пула глутатиона в миокарде взрослых и старых интактных крыс. При иммобилизационном стрессе у крыс обеих возрастных групп происходит уменьшение содержания восстановленного глутатиона. У взрослых животных параллельно увеличивается содержание окисленного глутатиона в сердце, чего не наблюдается у старых крыс. Обсуждается возможность возрастного изменения преимущественных путей утилизации восстановленного глутатиона в сердце при стрессе. К л ю ч е в ы е с л о в а: старение, миокард, иммобилизационный стресс, пул глутатиона. П ри старении происходит изменение чувствительности тканей к свобод­ норадикальному повреждению [1,2]. Одним из частных проявлений этого являет­ ся возрастная модуляция пероксидного окис­ ления липидов в сердце крыс при стрессе [3], формирование которого, как известно, тесно связано со стимуляцией свободнорадикальных процессов в миокарде [4, 5]. Однако причины возникновения этого феномена до настоящего времени все еще не ясны. Важную роль в защите тканей от свобод­ норадикального повреждения играет антиок­ сидантная система. Особое положение в ней занимает глутатион. Это связано с тем, что он принимает участие в утилизации пероксида водорода и органических пероксидов [6, 7], а также в конъюгации цитотоксических карбо­ нильных продуктов метаболизма [8, 9]. Сущест­ вуют сведения о том, что изменение уровня глу­ татиона выступает в качестве чувствительного маркера оксидативного стресса [10, 11]. Вместе с тем до настоящего времени отсутствуют чет­ кие представления о возрастных особенностях участия глутатиона в антиоксидантной защи­ те клеток, а также проявлении его антистрес­ сорного эффекта при старении. Учитывая это, целью работы явилось изучение содержания глутатиона и активности ферментов его мета­ болизма в сердце взрослых и старых крыс при иммобилизационном стрессе. 74 Материалы и методы Работа выполнена на 48 крысах-самцах линии Вистар 12- и 24-месячного возраста. Все животные были поделены на 2 подгруппы: 1 – интактные и 2 – крысы, подвергнутые им­ мобилизационному стрессу путем фиксации на спине в течение 30 минут. Развитие стресса контролировали по уровню 11-оксикортико­ стероидов [12] и адреналина [13] в крови. Животных декапитировали под легким эфирным наркозом. Извлекали сердце. Вы­ деляли миокард левого желудочка, который гомогенизировали в стеклянном гомогениза­ торе Поттера–Эльвейема в среде выделения, содержащей 0,25 М сахарозы и 0,01 М трис (рН 7,4). Гомогенат фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали в течение 10 минут при 1000 g. Полученный супернатант повтор­ но центрифугировали в течение 20 минут при 10 000 g. Супернатант использовали в качест­ ве постмитохондриальной фракции миокарда. Фракционирование проводили при 4–6 °С. В постмитохондриальной фракции опре­ деляли активность глутатионпероксидазы [14], глутатион-S-трансферазы [15] и глутатионре­ дуктазы [16], а также измеряли содержание карбонилированных протеинов [17]. Для определения концентрации глутатио­ на миокард гомогенизировали с 1 н раствором охлажденной хлорной кислоты. Полученный гомогенат центрифугировали при 5000 g в те­ ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6 В. Н. ШВЕЦ, В. В. ДАВЫДОВ чение 15 минут. Супернатант нейтрализовали и использовали для определения содержания окисленного и восстановленного глутатиона [18]. Расчеты проводили по калибровочной кривой. Содержание восстановленного глута­ тиона определяли также и в депротеинизиро­ ванных пробах постмитохондриальной фрак­ ции. Содержание протеина определяли по ме­ тоду Лоури. Полученные данные подвергали статисти­ ческой обработке с использованием непарамет­ рического метода Вилкоксона–Манна–Уитни. При иммобилизационном стрессе у 12-ме­ сячных крыс возрастает концентрация окис­ ленного глутатиона на 67% по сравнению с та­ ковой у интактных животных. Одновременно у них уменьшается уровень восстановленности пула глутатиона (GSH/GSSG) в сердце в 2,2 раза по сравнению с его исходной величиной. У старых крыс, подвергнутых 30-минут­ ной иммобилизации, происходит уменьшение концентрации восстановленного глутатиона в сердце на 23% по сравнению с его исходным уровнем. Однако изменения концентрации окисленного глутатиона и уровня восстанов­ ленности пула глутатиона в миокарде у них не происходит. Сходные результаты получены и при из­ мерении концентрации восстановленного глу­ татиона в постмитохондриальной фракции миокарда взрослых и старых крыс после их 30‑минутной иммобилизации (рис. 1). Для оценки причин возникновения обна­ руженных сдвигов у крыс исследованных групп было проведено определение глутатионперок­ сидазной, глутатионтрансферазной и глутати­ онредуктазной активности в сердце животных. Исследования показали, что как у взрослых, так и у старых крыс, после 30-минутной иммо­ билизации изменения глутатионпероксидазной и глутатионтрансферазной активности в пост­ Результаты и обсуждение Результаты определения концентрации окисленного и восстановленного глутатио­ на в сердечной мышце крыс представлены в табл. 1. Из нее видно, что у старых (24-месяч­ ных) животных концентрация окисленного и восстановленного глутатиона в миокарде со­ ответствует ее величине у взрослых 12-месяч­ ных крыс. Аналогичным образом активность ферментов метаболизма глутатиона (глутатион­ пероксидазы, глутатион-S-трансферазы и глу­ татионредуктазы) в постмитохондриальной фракции сердечной мышцы у старых крыс не отличается от ее величины у взрослых живот­ ных (табл. 2). Т а б л и ц а 1. Возрастные особенности изменения концентрации глутатиона в сердце (мкмоль/мг белка) крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу (M ± m) Группа животных Глутатион восстановленный (GSH) Глутатион окисленный (GSSG) GSH/GSSG Взрослые Старые Интактные Стресс Интактные Стресс 2,9 ± 0,1 2,6 ± 0,1 3,1 ± 0,2 2,4 ± 0,1* 0,093 ± 0,020 0,151 ± 0,002* 0,122 ± 0,023 0,104 ± 0,004 36 ± 9 17 ± 1* 31 ± 3 24 ± 3 Примечание. В исследованиях использовалось 5 – 6 крыс. * Р < 0,05 по сравнению с интактными Т а б л и ц а 2. Активность ферментов метаболизма глутатиона в постмитохондриальной фракции сердца взрослых и старых крыс (нмоль/мин на 1 мг белка), подвергнутых иммобилизационному стрессу (M ± m) Группа животных Глутатион-пероксидаза Глутатион-S-трансфераза Глутатион-редуктаза Взрослые Старые Интактные Стресс Интактные Стресс 25,5 ± 2,3 25,5 ± 0,7 22,5 ± 1,7 20,5 ± 1,5 6,7 ± 0,6 6,0 ± 0,3 5,5 ± 0,7 7,0 ± 0,7 0,57 ± 0,10 0,55 ± 0,06 0,43 ± 0,05 1,2 ± 0,2* В исследованиях использовалось 5 – 6 крыс. * Р < 0,05 по сравнению с интактными ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6 75 експериментальні роботи нмоль/г протеина утилизации восстановленного глутатиона. Ха­ рактер обнаруженных изменений концентра­ ции окисленного и восстановленного глутатио­ на, позволяет высказать предположение, что у старых крыс, в отличие от взрослых животных, ɢɧɬɚɤɬɧɵɟ * * повышается интенсивность использования ɫɬɪɟɫɫ восстановленного глутатиона для конъюгации с карбонильными продуктами свободноради­ кального окисления. Обращает на себя внима­ ние тот факт, что появление этих особенностей не связано с модуляцией глутатионперокси­ дазной и глутатионтрансферазной активности ɜɡɪɨɫɥɵɟ ɫɬɚɪɵɟ в кардиомиоцитах. ɢɧɬɚɤɬɧɵɟ * * Можно предположить, что одной из воз­ интактные крысы в состоянии стресса ɢɧɬɚɤɬɧɵɟ ɫɬɪɟɫɫ * можных причин появления возрастных разли­ ɫɬɪɟɫɫ чий в уровне снижения концентрации восста­ Рис. 1. Концентрация восстановленного глутановленного глутатиона в сердце при стрессе тиона в постмитохондриальной фракции мио­ является изменение скорости глутатионре­ карда взрослых и старых крыс, подвергнутых Ɋɢɫ.1. Ʉɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɹ ɜɨɫɫɬɚɧɨɜɥɟɧɧɨɝɨ ɝɥɭɬɚɬɢɨɧɚ (ɧɦɨɥɶ/ɝ ɛɟɥɤɚ) ɜ Однако отсутствие разли­ дуктазной реакции. иммобилизационному стрессу. В экспериментах в содержании использовалось по 5–6 крыс. *ɦɢɨɤɚɪɞɚ Р < 0,05 по сравɜɡɪɨɫɥɵɟ ɫɬɚɪɵɟ ɩɨɫɬɦɢɬɨɯɨɧɞɪɢɚɥɶɧɨɣ ɮɪɚɤɰɢɢ ɜɡɪɨɫɥɵɯ ɢчийɫɬɚɪɵɯ ɤɪɵɫ, восстановленного NADP в серд­це взрослых и старых крыс, подвергнутых нению с интактными ɫɬɚɪɵɟ иммобилизации [19], а также до­ ɩɨɞɜɟɪɝɧɭɬɵɯ ɢɦɦɨɛɢɥɢɡɚɰɢɨɧɧɨɦɭ ɫɬɪɟɫɫɭ. ȼ 30-минутной ɷɤɫɩɟɪɢɦɟɧɬɚɯ стоверное повышение глутатионредуктазной ɢɫɩɨɥɶɡɨɜɚɥɨɫɶ ɩɨ 5 – 6 ɤɪɵɫ. митохондриальной фракции миокарда не про­ активности в постмитохондриальной фракции исходит. У взрослых крыс этом не изменя­ миокарда старых иммобилизированных живот­ * - Ɋ < 0,05 ɩɨ ɫɪɚɜɧɟɧɢɸ ɫ при ɢɧɬɚɤɬɧɵɦɢ ется и глутатионредуктазная активность. В то ных, противоречат данному предположению. ɰɟɧɬɪɚɰɢɹ ɜɨɫɫɬɚɧɨɜɥɟɧɧɨɝɨ ɝɥɭɬɚɬɢɨɧɚ (ɧɦɨɥɶ/ɝ ɛɟɥɤɚ) ɜ Другой возможной причиной появле­ же время у старых, подвергнутых 30-минутной ɟɧɧɨɝɨ ɝɥɭɬɚɬɢɨɧɚ (ɧɦɨɥɶ/ɝ ɛɟɥɤɚ) ɜ ния возрастных различий в снижении уров­ иммобилизации животных, наблюдается по­ ɚɥɶɧɨɣ ɮɪɚɤɰɢɢ ɦɢɨɤɚɪɞɚ ɜɡɪɨɫɥɵɯ ɢ ɫɬɚɪɵɯ ɤɪɵɫ, ня восстановленного глутатиона в сердце при вышениеɢ глутатионредуктазной на ɨɤɚɪɞɚ ɜɡɪɨɫɥɵɯ ɫɬɚɪɵɯ ɤɪɵɫ, ȼ активности ɢɦɦɨɛɢɥɢɡɚɰɢɨɧɧɨɦɭ ɫɬɪɟɫɫɭ. ɷɤɫɩɟɪɢɦɟɧɬɚɯ стрессе могут быть различия в интенсивности 179% по сравнению с ее исходной величиной. ɭ ɫɬɪɟɫɫɭ. ȼ ɷɤɫɩɟɪɢɦɟɧɬɚɯ стимуляции свободнорадикальных процес­ Полученные результаты свидетельствует о ɩɨ 5 – 6 ɤɪɵɫ. сов в миокарде взрослых и старых крыс при том, что, несмотря на отсутствие возрастных их иммобилизации. Однако наши данные 5 ɩɨ ɫɪɚɜɧɟɧɢɸ ɫ ɢɧɬɚɤɬɧɵɦɢ различий в состоянии пула глутатиона в мио­ свидетельствуют о том, что у взрослых крыс ɤɬɧɵɦɢ карде интактных крыс, при иммобилизацион­ при иммобилизации происходит значительно ном стрессе у взрослых и старых животных более выраженное снижение концентрации имеются некоторые особенности в изменении восстановленного глутатиона в миокарде, чем содержания окисленного и восстановленно­ у старых животных. Согласно существующим го глутатиона в сердце. Так, у взрослых крыс, представлениям, снижение концентрации это­ иммобилизация сопровождается выраженным го метаболита отражает интенсивность прояв­ снижением уровня восстановленности пула ления оксидативного стресса [10, 11]. Выска­ глутатиона, о чем свидетельствует уменьшение занному предположению противоречат также соотношения индекса GSH/GSSG в миокарде. сведения об одинаковом уровне накопления в Возникновение этого сдвига связано с увели­ постмитохондриальной фракции миокарда у чением концентрации окисленного глутатиона взрослых и старых иммобилизированных крыс в сердце. карбонилированных протеинов (рис. 2), ко­ У старых крыс, в отличие от взрослых, в торые являются чувствительными маркерами сердце при иммобилизационном стрессе про­ оксидативного стресса [20]. исходит значительное уменьшение концентра­ Изложенное выше позволяет предполо­ ции восстановленного глутатиона. И, что ха­ жить, что в процессе онтогенеза происходит рактерно, этот сдвиг не сопровождается у них изменение роли глутатиона в антиоксидантной увеличением концентрации окисленного глу­ защите миокарда при стрессе. По всей вероят­ татиона в миокарде. ности, при старении она существенно выше, Анализ полученных результатов свиде­ чем в более молодом возрасте, когда повыша­ тельствует о том, что при иммобилизационном ется значение других антиоксидантов в защите стрессе в клетках миокарда формируются не­ миокарда от действия повреждающих факто­ которые возрастзависимые особенности путей ров стресса. 76 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6 В. Н. ШВЕЦ, В. В. ДАВЫДОВ мкмоль/мг протеина * * 5,0 5 4,5 4,0 4 3,5 3 3,0 2,5 2,0 2 1,5 1,0 1 0,5 0 * * * * * ɜɡɪɨɫɥɵɟ в щурів обох вікових груп спостерігається зни­ ження кількості відновленого глутатіону. У до­ рослих тварин паралельно відбувається збіль­ шення вмісту окисленого глутатіону в серці, чого не відмічається у старих щурів. Обгово­ ɢɧɬɚɤɬɧɵɟ рюється можливість вікових змін найважливі­ ɫɬɪɟɫɫ ших шляхів утилізації відновленого глутатіону в серці під час стресу. К л ю ч о в і с л о в а: старіння, міокард, іммобілізаційний стрес, пул глутатіону. ɫɬɚɪɵɟ ɢɧɬɚɤɬɧɵɟ в состоянии стресса ɫɬɪɟɫɫ age-specific peculiarities of changes of glutathione system in rat’s heart under immobilization stress интактные крысы ɢɧɬɚɤɬɧɵɟ ɫɬɪɟɫɫ V. N. Shvets1, V. V. Davydov2 Рис. 2. Изменение концентрации карбонилированных протеинов в постмитохондриальной 1 Zaporozhie State Medical University; фракции сердца взрослых и старых крыс при им2 Institute of Children and Adolescents Health Care, мобилизационном стрессе. В экспериментах исAcademy of Medical Scinces оf Ukraine, Kharkov; пользовалось по 5–6 крыс. * Р < 0,05 по сравнеe-mail: davydov@kharkov.com Ɋɢɫ.2. ɤɚɪɛɨɧɢɥɢɪɨɜɚɧɧɵɯ ɛɟɥɤɨɜ ɜ нию сɂɡɦɟɧɟɧɢɟ интактными ɜɡɪɨɫɥɵɟ ɫɬɚɪɵɟ ɤɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɢ S u m m aɢr yɫɬɚɪɵɯ ɩɨɫɬɦɢɬɨɯɨɧɞɪɢɚɥɶɧɨɣ ɮɪɚɤɰɢɢ ɫɟɪɞɰɚ (ɦɤɦɨɥɶ/ɦɝ ɛɟɥɤɚ) ɜɡɪɨɫɥɵɯ ɫɬɚɪɵɟ ɤɪɵɫ ɩɪɢ ɢɦɦɨɛɢɥɢɡɚɰɢɨɧɧɨɦ ɫɬɪɟɫɫɟ. ȼ ɷɤɫɩɟɪɢɦɟɧɬɚɯ ɢɫɩɨɥɶɡɨɜɚɥɨɫɶ ɩɨ 5 pool and activity of its State of glutathione Особый интерес представляет выяснение metabolism enzymes in the hearts of adult and – 6 ɤɪɵɫ.особенностей путей утилизации восстановлен­ rats during immobilization stress were studied­ aged * - Ɋного < 0,05 ɩɨ ɫɪɚɜɧɟɧɢɸ ɫ ɢɧɬɚɤɬɧɵɦɢ глутатиона (в глутатионтрансферазной и in order to find out the causes of age-dependent глутатионпероксидазной реакциях) в сердце decrease of heart resistance to stress. The study старых иммобилизированных крыс, которые revealed the absence of difference between state могут формировать основу для появления ɧɢɟ ɤɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɢ ɤɚɪɛɨɧɢɥɢɪɨɜɚɧɧɵɯ ɛɟɥɤɨɜ ɜ of glutathione pool in myocardium of adult and возрастных различий в механизме адаптации aged intact rats. Rats of both age groups showed к его свободнорадикальному пов­ ɨɣɤɚɪɛɨɧɢɥɢɪɨɜɚɧɧɵɯ ɮɪɚɤɰɢɢмиокарда ɫɟɪɞɰɚ (ɦɤɦɨɥɶ/ɦɝ ɛɟɥɤɚ) ɛɟɥɤɨɜ ɜ ɜɡɪɨɫɥɵɯ ɢ ɫɬɚɪɵɯ the decrease of reduced glutathione content in the реждению при стрессе. высказанное ɚɰɢɨɧɧɨɦ ɫɬɪɟɫɫɟ. ȼ ɷɤɫɩɟɪɢɦɟɧɬɚɯ ɢɫɩɨɥɶɡɨɜɚɥɨɫɶ ɩɨ 5 heart during immobilization stress. Adult rats had ɦɤɦɨɥɶ/ɦɝ ɛɟɥɤɚ) ɜɡɪɨɫɥɵɯ ɢ ɫɬɚɪɵɯОднако предположение требует тщательной экспери­ ɷɤɫɩɟɪɢɦɟɧɬɚɯ ɢɫɩɨɥɶɡɨɜɚɥɨɫɶ ɩɨ 5 simultaneous increase of oxidized glutathione con­ ментальной проверки. centration in the heart unlike in aged rats. The ɪɚɜɧɟɧɢɸ ɫ ɢɧɬɚɤɬɧɵɦɢ possibility of age-specific changes of pathways of ɦɢ вікові особливості змін reduced glutathione utilization’ in the heart during у системі глутатіону в серці stress is discussed. щурів за іммобілізаційного стресу В. М. Швець1, В. В. Давидов2 Запорізький державний медичний університет; 2 Інститут охорони здоров’я дітей та підлітків АМН України, Харків; e-mail: davydov@kharkov.com 1 З метою з’ясування причин вікового зни­ ження стійкості серця до стресу здійснено вивчення стану пула глутатіону та активності ферментів його метаболізму в серці дорослих та старих щурів за іммобілізаційного стресу. Дослідження показали відсутність розбіжнос­ тей у стані пула глутатіону в міокарді старих та інтактних щурів. За іммобілізаційного стресу ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6 K e y w o r d s: ageing, myocardium, immobi­ lized stress, states of glutathione pool. 1. Lakatta E. G. // Circ.Res. – 2001. – 88. – P. 984–986. 2. Lakatta E. G., Sollott S. J., Pepe S. // Novartis Found. Symp. – 2001. – 235. – P. 172–196. 3. Davydov V. V., Shvets V. N. // Exp. Gerontol. – 2001. – 36. – P. 1155–1160. 4. Меерсон Ф. З. Патогенез и предупреждение стрессорных и ишемических повреждений сердца. – М.: Медицина, 1984. – 270 с. 5. Kovacs P., Juranek I., Stankovicova Т., Svec P. // Pharmazie. – 1996. – 51, N 1. – P. 51–53. 6. Dickinson D. A., Forman H. J. // Biochem. Pharmacol. – 2002. – 64. – P. 1019–1026. 77 експериментальні роботи 7. Меньшиков Е. Б., Ланкин В. З., Зенков Н. К. / Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксидант. – М.: Слово, 2006. – 556 с. 8. Cheng J. Z., Yang Y., Singh S. P. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2001. – 282, N 5. – P. 1268–1274. 9. Hiratsuka A., Tobita K., Saito H., Sakamoto Y. // Biochem. J. – 2001. – 355. – P. 237–244. 10. Ozer M. K., Parlakpinar H., Cigremis Y. et al. // Моl. Cell. Biochem. – 2005. – 273, N 1– 2. – P. 169–175. 11. Sahin E., Gtimulu S. // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. – 2007. – 34, N 5–6. – P. 425–431. 12. Резников А. Г. Методы определения гормонов. – К.: Наук. думка, 1980. – 536 с. 13. Atrac C., Madnusson T. A. // Acta Pharmacol. Toxicol. – 1978. – 42. – P. 35–57. 14. Ланкин В. З., Тихазе А. К., Ковалевская А. Л. и др. // Докл. АН СССР. – 1981. – 261, № 6. – С. 1461–1470. 15. Mannervik В., Guthenberg С. / Methods Enzymology. – 1981. – 77. – Р. 231–235. 16. Hong-Gyum К., Sung-Min H., Su-Jung K. et al. // Molecules and Сells. – 2003. – 16, N 3. – P. 278–284. 17. Дубинина Е. Е. // Вопр. мед. химии. – 2000. – № 4. – С. 36–47. 18. Verbunt R. I. A. M., van Dockum W. G., Bastiaanse E. M. L. et al. // Mol. Cell. Cardiol. – 1995. – 144. – P. 85–92. 19. Levine R. L. // Free Radical Biol. Med. – 2002. – 32, N 9. – P. 790–796. 20. Reinheckel Т., Noack H., Lorenz S. et al. // Free Radical. Res. – 1998. – 29, N4. – P. 297–305. Отримано 28.03.2008 78 ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2008, т. 80, № 6
