Изменение показателей гуморального иммунитета у пациентов

Здоровье и окружающая среда: сб. науч. тр. / Респ. науч.-практ. центр гигиены; гл. ред. Г.Е.
Косяченко. – Минск, 2013. – Вып. 23. – С. 206 – 210.
УДК 616.24-036.12-097
ИЗМЕНЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У ПАЦИЕНТОВ
С ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ
Кадушкин А.Г.
УО «Белорусский государственный медицинский университет», г. Минск
Резюме
Проведена оценка особенностей количественного изменения В-клеток в общей популяции лимфоцитов крови, а также измерена концентрация общего иммуноглобулина Е (Ig E) в
плазме крови у курящих и некурящих пациентов с хронической обструктивной болезнью
легких (ХОБЛ). Были обследованы 21 некурящий пациент с ХОБЛ, 20 курящих пациентов с
ХОБЛ, 20 некурящих здоровых людей и 21 здоровый курильщик. Анализ популяции лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии. Cодержание общего Ig E в плазме крови
определяли методом иммуноферментного анализа. Не было выявлено статистистически значимых различий доли В-лимфоцитов между всеми исследуемыми группами. В крови пациентов с ХОБЛ обнаружено увеличение концентрации общего Ig E. Данное изменение было
особенно выражено у некурящих людей. Установлена положительная корреляционная связь
средней силы между уровнем общего Ig Е в плазме крови и индексом курения у курящих пациентов с ХОБЛ. Результаты исследования свидетельствуют о роли Ig E в развитии ХОБЛ.
Ключевые слова: хроническая обструктивная болезнь легких, проточная цитометрия,
В-лимфоциты, общий иммуноглобулин E, некурящие люди.
Введение.
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) входит в группу ведущих причин
заболеваемости и смертности взрослого населения во всем мире. В нашей стране насчитывается около 60 тысяч пациентов с ХОБЛ. Курение сигарет признается главным фактором риска развития ХОБЛ. Однако результаты обследований населения в разных странах мира показали, что до 68,6 % пациентов, страдающих ХОБЛ, никогда не курили. Значительная доля
случаев заболевания обусловлена длительным контактом с производственной пылью и химикатами, перенесенной в раннем детстве тяжелой респираторной инфекцией, вдыханием
дыма биоорганического топлива.
1
Одной из проблем ХОБЛ являются трудности лечения. Постепенное ухудшение функции легких и развитие сопутствующих заболеваний можно ожидать даже на фоне оптимальной терапии ХОБЛ. Поэтому продолжают изучаться механизмы развития этого заболевания.
Несмотря на значительные успехи в изучении Т-клеточного иммунного ответа при ХОБЛ,
практически не изучено состояние гуморального звена иммунитета.
Популяцией лимфоцитов, отвечающей за гуморальный иммунитет, являются В-клетки.
Их фенотипирование основано на определении В-клеточного рецепторного комплекса (Вклеточный рецептор, BCR), который принимает участие в распознавании антигена. В его состав входят мембранные маркеры и иммуноглобулины. Одним из мембранных маркеров
BCR является интегральный негликозилированный белок CD20. Он представляет собой Ca2+
канал и участвует в активации и пролиферации В-клеток. Молекула CD20 присутствует на
всех нормальных В-лимфоцитах периферической крови, но отсутствует на плазматических
клетках.
Имеющиеся в литературе сведения об относительном количестве В-лимфоцитов в крови при ХОБЛ противоречивы. По некоторым данным, доля В-клеток у курильщиков с ХОБЛ
ниже, чем у здоровых людей (курильщиков и некурящих) [5]. В другом исследовании не было выявлено статистически значимых различий процента В-лимфоцитов у пациентов с ХОБЛ
(курильщиков и некурящих) по сравнению с соответствующей группой здоровых людей [3].
Плазматические клетки, которые являются конечным этапом дифференцировки Bлимфоцита, синтезируют белки иммуноглобулины (Ig). В организме они выполняют функцию антител. Различают несколько классов Ig – A, D, E, G, M. Особое место среди них занимают IgE. Они осуществляют защиту слизистых оболочек верхних и нижних дыхательных
путей от инфекционных агентов и чужеродных веществ. Поэтому определение их концентрации при ХОБЛ приобретает патогенетическое значение.
Роль курения и заболевания в изменении содержания общего Ig E в крови при ХОБЛ
остается невыясненной. Показано повышение концентрации общего Ig E у курящих пациентов с ХОБЛ по сравнению с некурящими здоровыми людьми [9]. По другим данным, не было выявлено различий концентрации Ig E у курящих пациентов с ХОБЛ по сравнению с курящими пациентами без ХОБЛ [4, 8].
Целью настоящего исследования явилась оценка доли В-лимфоцитов в общей популяции лимфоцитов крови и определение концентрации общего иммуноглобулина Е в плазме
крови у курящих и некурящих пациентов с ХОБЛ.
Материал и методы исследования.
2
Обследованы 21 некурящий пациент с ХОБЛ, 20 курящих пациентов с ХОБЛ, 20
некурящих здоровых людей и 21 здоровый курильщик. Характеристика участников исследования представлена в табл. 1. К некурящим мы относили, согласно определению ВОЗ, людей, которые выкурили менее 100 сигарет за жизнь. Все курящие пациенты с ХОБЛ и здоровые курильщики имели индекс курения более 10 пачек/лет. Индекс курения рассчитывали по
формуле: (стаж курения (годы) × количество выкуриваемых сигарет в день) / 20.
Таблица 1. Характеристика участников исследования.
Показатель
n
Возраст, годы
Пол, м/ж
Некурящие
Курящие
пациенты с
пациенты с
ХОБЛ
ХОБЛ
21
Некурящие
Курящие здо-
здоровые
ровые
20
20
21
64,0
64,5
62,0
61,0
(61,0–68,0)
(62,0–67,0)
(59,0–64,5)
(59,0–63,0)
12/9
18/2
3/17
14/7
-
12/8
-
13/8
Статус курения (курящие/бывшие курильщики)
Индекс курения, пачек/лет
0
43,2
(21,3–50,3)
0
29,0
(20,0–37,5)
Индекс массы тела,
30,8
25,4
27,0
28,7
кг/м2
(26,0–35,3)
(23,2–27,7)
(23,8–31,2)
(26,1–31,1)
54,0
49,5
101,0
96,0
(41,0–61,0)
(35,5–65,5)
(92,0–110,0)
(88,0–106,0)
62,0
56,5
87,5
85,0
(56,0–65,0)
(51,0–65,0)
(82,0–94,0)
(80,0–89,0)
5,0 (3,0–6,0)
4,5 (3,0–6,0)
-
-
ОФВ1, % от должн.
ОФВ1/ФЖЕЛ, %
Прирост ОФВ1 после ингаляции бронхолитика, %
Критерием включения в исследование было отсутствие симптомов обострения ХОБЛ
в течение последних 2 месяцев до взятия крови. Из исследования были исключены пациенты
3
с наличием в анамнезе бронхиальной астмы, атопии, аллергического ринита, принимавшие
системные глюкокортикостероиды как минимум за 2 месяца до настоящего исследования,
пациенты, неспособные правильно выполнить дыхательный маневр при тестировании функции внешнего дыхания.
Диагностика ХОБЛ, включая оценку ее степени тяжести, осуществлялась на основании критериев GOLD 2011. Преобладали пациенты со среднетяжелой и тяжелой степенью
ХОБЛ. В контрольные группы вошли условно здоровые добровольцы с нормальным уровнем
объема форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1) и отношения объема форсированного выдоха за первую секунду к форсированной жизненной емкости легких
(ОФВ1/ФЖЕЛ), не имевшие в анамнезе патологии бронхолегочной системы и других хронических заболеваний. Все испытуемые дали письменное добровольное согласие на участие в
исследовании.
Спирометрия проводилась по стандартной методике на аппарате SpiroUSB с использованием программного обеспечения Spida5 (Micro Medical Limited, Англия) в соответствии
с объединенными рекомендациями Американского торакального и Европейского респираторного сообществ.
Венозную кровь у обследуемых пациентов забирали рано утром натощак в объеме 3-5
мл в пробирку, содержащую этилендиаминтетраацет калия в качестве антикоагулянта. 100
мкл крови помещали в пробирки, добавляли по 10 мкл моноклональных антител к CD20, меченых флюоресцеинизотиоцианатом (R&D Systems, США). Образцы тщательно перемешивали и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут. После инкубации эритроциты лизировали путем добавления 2 мл лизирующего раствора FACS Lysing
Solution (BD, США). Затем образцы тщательно перемешивали и инкубировали в течение 5-7
минут в темноте. Клетки осаждали центрифугированием (2200 об/мин, 3 мин), надосадочную
жидкость сливали, а осадок встряхивали. Добавляли фосфатно-солевой буфер PBS Cell Wash
(BD, США), процедуру отмывки повторяли два раза. После этого к суспензии клеток добавляли 300 мкл 1%-го раствора параформальдегида. Анализ популяций лимфоцитов проводили
на 5-канальном проточном цитометре Cytomics FC500 с использованием программного
обеспечения CXP («Beckman Coulter», США). Для каждой пробы учитывали не менее 50 000
клеток.
По показателям прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания выделяли регион
лимфоцитов. В пределах этого региона по маркеру СD20 рассчитывали процент В-клеток в
общей популяции лимфоцитов (рис. 1).
4
Рис. 1. Анализ В-лимфоцитов в периферической крови. А. Выделение региона лимфоцитов среди клеток крови. Б. Определение популяции В-лимфоцитов по маркеру CD20.
У всех пациентов также определяли содержание общего Ig E в плазме крови методом
иммуноферментного анализа на иммуноферментом анализаторе «Stat Fax 3200» («Awareness
Technology», США).
Статистическую обработку проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 8.0. Для всех имеющихся выборок данных проверяли гипотезу нормальности распределения по критерию Колмогорова-Смирнова. Поскольку полученные нами данные не подчинялись нормальному распределению, анализ проводили методами непараметрической статистики. Рассчитывались медиана и интерквартильный размах. Для сравнения данных между
группами использовался U-критерий Манна-Уитни. Оценка взаимосвязи двух исследуемых
групп проводилась вычислением коэффициента корреляции по Спирмену (Spearman R). Достоверными считались различия при уровне значимости p менее 0,05.
Результаты и их обсуждение.
В результате проведенных исследований нам не удалось зафиксировать статистически значимых отличий содержания CD20+ В-клеток (в %) у некурящих пациентов с ХОБЛ по
сравнению с некурящими здоровыми людьми, а также у курильщиков с ХОБЛ по сравнению
с курильщиками без ХОБЛ (табл. 2). Эти результаты соответствуют данным, полученным в
других лабораториях [3, 8].
5
Таблица 2. Показатели гуморального иммунитета в периферической крови у пациентов с
ХОБЛ и контрольных групп.
Исследуемый
показатель
Некурящие
ХОБЛ
Контроль
ХОБЛ
Контроль
10,9
15,2
11,8
11,1
(7,1 – 15,5)
(8,6 – 19,7)
(10,1 – 16,6)
(6,6 – 16,7)
820,0
420,0
780,0
370,0
(635,0 – 980,0)*
(200,0 – 735,0)
(307,5 – 980,0)
(285,0 – 980,0)
CD20+ лимфоциты, %
Ig E, МЕ/мл
Курящие
Примечание: данные представлены как медиана и 50% интерквартильный размах — между
25-й и 75-й процентилями; * - p < 0,05 по сравнению со здоровыми некурящими людьми.
По данным нашего исследования, не было выявлено статистистически значимых различий доли лимфоцитов, содержащих В-клеточный рецепторный комплекс, у курящих и
некурящих пациентов с ХОБЛ, а также у здоровых курильщиков и здоровых некурящих людей. В другом исследовании наблюдали снижение В-лимфоцитов у курильщиков с ХОБЛ по
сравнению с некурящими пациентами с ХОБЛ [8]. Однако в изучавшуюся там группу некурящих пациентов с ХОБЛ включались экс-курильщики с длительным стажем курения. Вместе с тем, согласно определению ВОЗ, к некурящим принято относить тех, кто выкурил менее 100 сигарет за жизнь.
Повышенные значения количества В-лимфоцитов в субэпителиальном слое бронхов
при ХОБЛ наблюдали в другой лаборатории [6]. Было бы заманчиво предполагать об усиленном перемещении В-лимфоцитов из кровотока в легкие при ХОБЛ, однако полученные
нами результаты не позволяют подтвердить данную гипотезу.
Исследование общего Ig Е в плазме крови выявило достоверное увеличение концентрации этого показателя в группе некурящих пациентов с ХОБЛ по сравнению с некурящими
здоровыми людьми (табл. 2). О возможности повышения содержания общего Ig Е у некурящих людей, контактировавших с производственными вредностями, свидетельствуют результаты исследования T. Sapigni и соавт. [10]. У курящих пациентов нам удалось выявить только тенденцию к повышению концентрации Ig Е. Другие исследователи также сообщали о ярко выраженной тенденции к повышению концентрации общего Ig E в крови у курящих пациентов с ХОБЛ по сравнению с курящими пациентами без ХОБЛ [4].
6
Из представленных данных о концентрации Ig E у курящих пациентов с ХОБЛ видно, что отсутствие статистически достоверных отличий от значения этого показателя у курящих здоровых людей, обусловлено чрезвычайно высокой вариабельностью результатов в
сравниваемых группах, хотя медиана значений при ХОБЛ значительно выше. Принимая во
внимание данное обстоятельство, можно заключить, что полученные нами результаты совпадают с принципиальной находкой других исследователей об увеличении концентрации
общего Ig Е у пациентов с ХОБЛ по сравнению со здоровыми людьми [1]. Повышение общего Ig Е у пациентов с ХОБЛ связывают с формированием сенсибилизации в результате воздействия химических веществ, компонентов табачного дыма, производственных аэрополлютантов и инфекционных агентов [1].
При проведении корреляционного анализа у курящих пациентов с ХОБЛ обнаружена положительная корреляционная связь средней силы между уровнем общего Ig Е в плазме
крови и индексом курения (рис. 2). Аналогичные данные были получены другими исследователями [7]. Наличие обнаруженной взаимосвязи предполагает, что у курящих пациентов с
ХОБЛ с увеличением стажа и интенсивности курения происходит нарастание в крови уровня
общего Ig E. Это косвенно указывает на то, что у пациентов с ХОБЛ курение усиливает секрецию Ig E плазматическими клетками.
1100
1000
900
Ig E, ME/мл
800
700
600
500
400
300
200
100
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Индекс курения, пачек/лет
Рис. 2. Зависимость концентрации общего Ig E в плазме крови от индекса курения у курящих
пациентов с ХОБЛ (R = 0,49, p < 0,05).
7
Взаимодействие антиген-специфического иммуноглобулина Е с антигеном происходит посредством высокоафинного FcεRI-рецептора на мембранах тучных клеток и базофилов. Такое лиганд-рецепторное связывание является одним из способов активации этих клеток. Результатом активации является секреция биологически активных медиаторов и цитокинов. В частности, тучные клетки и базофилы могут продуцировать ФНО α (фактор некроза
опухоли α), интерлейкин 4 (IL-4), IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, CCL3 и VEGF (англ. vascularendothelial growth factor). Выявленное повышение общего IgE в крови пациентов с ХОБЛ
опосредованно способствует продукции патогенетически значимых цитокинов. Значение их
в патогенезе ХОБЛ было продемонстрировано ранее [2]. Кроме того, медиаторы тучных клеток гистамин и лейкотриены могут активировать легочные макрофаги, что приводит к синтезу ими лизосомальных ферментов и провоспалительных цитокинов, которые самостоятельно
могут влиять на течение ХОБЛ.
Заключение.
Не выявлено значимых различий относительного (в %) содержания В-лимфоцитов в
периферической крови у пациентов с ХОБЛ и здоровых людей, а также у курящих и некурящих пациентов с ХОБЛ.
В плазме крови пациентов с ХОБЛ увеличена концентрация общего Ig Е. Данное изменение особенно выражено у некурящих людей. Установлена положительная корреляционная
связь средней силы между уровнем общего Ig Е в плазме крови и индексом курения у курящих пациентов с ХОБЛ.
Список литературы.
1. Брыляева, Е. В. Иммунологические аспекты при патологии легких / Е.В. Брыляева,
Н.Н. Крюков, А.В. Жестков // Молодой ученый. – 2011. – №1. – С. 243–244.
2. Barnes, P.J. The cytokine network in chronic obstructive pulmonary disease / P.J. Barnes //
Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. – 2009. – Vol. 41. – P. 631–638.
3. CD4+/CD25+ cells in systemic inflammation in COPD / J. Domagała-Kulawik [et al.] //
Scand. J. Immunol. 2011. – Vol. 73, № 1. – P. 59–65.
4. Comparison of induced sputum with bronchial wash, bronchoalveolar lavage and bronchial
biopsies in COPD / S.R. Rutgers [et al.] // Eur. Respir. J. – 2000. – Vol. 15. P. 109–115.
5. Increased levels of (class switched) memory B cells in peripheral blood of current smokers
/ C.A. Brandsma [et al.] // Respir. Res. – 2009. – Vol. 10: 108.
8
6. Increased number of B-cells in bronchial biopsies in COPD / M.M.E. Gosman [et al.] //
Eur. Respir. J. – 2006. – Vol. 27. – P. 60–64.
7. Inflammatory cells and mediators in bronchial lavage of patients with chronic obstructive
pulmonary disease / A. Pesci [et al.] // Eur. Respir. J. – 1998. – Vol. 12. – P. 380–386.
8. Peripheral blood lymphocyte cell subsets in subjects with chronic obstructive pulmonary
disease: association with smoking, IgE and lung function / J.W. de Jong [et al.] // Respir. Med. –
1997. – Vol. 91, № 2. – P. 67–76.
9. Singh, B. Association of severity of COPD with IgE and interleukin-1 beta. Monaldi Arch.
/ B. Singh, S. Arora, V. Khanna // Chest Dis. – 2010. – Vol. 73, № 2. – P. 86–87.
10. The Po River Delta Respiratory Epidemiological Survey: an analysis of factors related
tolevel of total serum IgE / T. Sapigni [et al.] // Eur. Respir. J. – 1998. – Vol. 11. – P. 278–283.
Summary
Changes in parameters of humoral immunity in patients with chronic obstructive pulmonary
disease
Kadushkin A.H.
Belarusian State Medical University, Minsk, Belarus
The study was undertaken to investigate the changes in the percentage of B-lymphocytes
and concentration of total immunoglobulin E (Ig E) in peripheral blood of never smoking patients
with chronic obstuctive pulmonary disease (COPD) and COPD smokers. We examined 21 nonsmokers with COPD, 20 smokers with COPD, 20 healthy non-smokers and 21 healthy smokers.
The analysis of B-lymphocytes subtype was performed using flow cytometry method. Total plasma
IgE concentration was measured by enzyme linked immunosorbent assay. No differences were
found in the proportion of B-lymphocytes between all groups. Total plasma Ig E was significantly
higher in COPD patients when compared to healthy controls. Moreover, this change was especially
seen in non-smokers. We also observed a significant positive correlation of total plasma Ig E level
and the number of pack-years (R=0,49, p<0.05) in smoking COPD subjects. The results of this
study support the possible role of Ig E in the systemic inflammation in COPD.
Key words: chronic obstructive pulmonary disease, flow cytometry, B-lymphocytes, total Ig
E, non-smokers.
9
Сведения об авторе:
Кадушкин Алексей Геннадьевич – аспирант кафедры биологической химии учреждения образования «Белорусский государственный медицинский университет», г. Минск, email: kadushkyn@gmail.com; тел. (375-17) 272-67-88.
10