возможность использования различных антигенов m

22
МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2012 г., ТОМ 12, № 4
ËÀÁÎÐÀÒÎÐÍÀß ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ
ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫЙ ИММУНОСЕНСОР ДЛЯ АНАЛИЗА ПЛАЗМЫ
КРОВИ БОЛЬНЫХ ИНФАРКТОМ МИОКАРДА И РАННЕЙ
КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ1
Л. Е. Агафонова, А. В. Лисица, В. В. Шумянцева, А. И. Арчаков
НИИ биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН, Москва, Россия
© Коллектив авторов, 2012 г.
Введение. Ишемическая болезнь сердца является
одной из главных причин смертности населения
в мире, что заставляет искать новые возможности
диагностики, оценки степени риска, профилактики
и лечения данного заболевания. На сегодняшний
день известно 177 белков — потенциальных кардиомаркеров, уровень которых в крови изменяется при
сердечно-сосудистых заболеваниях, и исследования
в данной области продолжаются [1]. В настоящее
время для диагностики инфаркта миокарда (ИМ)
широкое распространение получили тропонины I
и Т, креатинкиназа-MB, кардиомиоглобин и белок,
связывающий жирные кислоты. Тропонины I и Т
считаются «золотым стандартом» в клинической диагностике, наличие их в плазме крови указывает на
гибель клеток миокарда, а увеличение их концентрации начинается через 4–6 часов после приступа
ИМ. Повышенный уровень кардиотропонина I
(cTn I) в крови после острого периода ИМ сохраняется по крайней мере, в течение 10 дней и даже дольше у пациентов с обширным инфарктом, таким образом, допуская позднюю диагностику. В норме
«пороговое» значение концентрации кардиотропонина I составляет около 20,4 пг/мл [2].
Таким образом, определение белков-кардиомаркеров в крови пациентов является одним из основных критериев при постановке диагноза ИМ, а актуальность создания аналитических устройств
определения биомаркеров для экспресс-диагностики
ИМ не вызывает сомнений.
Экспрессность измерений с использованием иммуносенсоров явилась причиной пристального внимания к ним со стороны специалистов по клинической лабораторной диагностике. Ранее коллективом
лаборатории разработан электрохимический иммуносенсор для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, основанный на количественном определении кардиомиоглобина в плазме крови человека [3].
В последнее десятилетие активно развиваются пьезокварцевые гравиметрические иммуносенсоры, поз1
воляющие интенсифицировать работу при выполнении большого числа анализов, ускорить возможность
оказания врачебной помощи. Они применяются для
определения биомаркеров неферментной природы:
миоглобина, С-реактивного белка, гепарина, антитромбина и др. Так, для определения миоглобина
предложены двухсенсорные системы на основе высокочастотных резонаторов (16,5 МГц) [4]. Сочетание двухсенсорной системы и сэндвич-формата анализа позволило повысить чувствительность
определения С-реактивного белка [5]. В процессе
создания гравиметрических сенсоров в литературе
большое внимание уделяется иммобилизации рецепторных биомолекул при формировании распознающего слоя. Для получения рецепторного покрытия,
как правило, резонатор сначала обрабатывают меркаптопропионовой кислотой, что приводит к функционализации поверхности золотого электрода карбоксильными группами в виде монослоя. Последующее
добавление карбоксидиимида и гидроксисульфосукцинимида обеспечивает активацию карбоксильных
групп. Затем наносят рецепторные биомолекулы.
Одним из приемов иммобилизации биорецепторных
молекул является использование наночастиц различной природы — магнитных [6] или золотых [7],
а также каликсаренов [8].
Таким образом, иммобилизация представляет собой многостадийный процесс, что может привести
к накоплению «ошибок» при проведении измерений.
Цель настоящей работы: изучить методом кварцевых кристаллических микровесов (QCM) кинетику
биоаффинных взаимодействий в системе тропонин I /
антитела в плазме крови человека и на основании полученных данных разработать высокочувствительный
пьезокварцевый иммуносенсор, позволяющий осуществлять прямую регистрацию биохимических взаимодействий без дополнительного введения меток и без
химических модификаций на основе различия кинетических параметров специфических и неспецифических
биоаффинных взаимодействий. Так как химические
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 12-04-31329).
МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2012 г., ТОМ 12, № 4
23
модификации могут приводить к денатурации или
агрегации антител и, как следствие, к снижению аффинности, в работе применили нековалентную иммобилизацию антител на золотом резонаторе без использования дополнительных сшивающих реагентов.
Материалы и методы исследования. В работе использовали следующие реагенты: моноклональные
антитела к кардиотропонину I человека
(USBiological: Biochemicals and Biological Reagents)
концентрацией 118 нг/мкл, периферическую венозную плазму крови информированных добровольцев:
пациентов, больных инфарктом миокарда, и здоровых
доноров (Центральная клиническая больница № 1
ОАО «Российские железные дороги»). Концентрация тропонина I в образцах плазм была предварительно установлена с помощью системы RAMP®
Clinical Reader (Response Biomedical Corp.).
Исследования выполняли на потенциостате/гальваностате AUTOLAB 12 с дополнительным
QCM/EQCM модулем и программным обеспечением NOVA в стационарной ячейке (Eco Chemie,
Utrecht, The Netherlands). Пьезокварцевый иммуносенсор представлял собой аналитическое устройство, чувствительным элементом которого являлся
пьезокварцевый резонатор (ПКР) АТ-среза (номинальная частота колебаний 6 МГц ± 1 Гц) с электродами, покрытыми рецепторными молекулами.
Аналитическим сигналом пьезокварцевого сенсора
служило уменьшение частоты колебаний резонатора
при увеличении массы рецепторного слоя в резуль-
ца. Эксперименты дублировались не менее трех раз,
и проводилась статистическая обработка полученные данных.
Результаты и их обсуждение. Взаимодействие
антиген-антитело является высокоаффинной реакцией с константой ассоциации порядка 109 М-1•с-1,
и поэтому ее изучение с помощью традиционных кинетических методов сильно затруднено [9]. В настоящей работе на золотой электрод пьезокварцевого
резонатора наносили 1 мкл антител, затем добавляли
1 мкл образца плазмы и регистрировали кинетику изменения частоты колебаний резонатора в режиме реального времени. При исследовании образцов плазм
здоровых доноров наблюдался ниспадающий характер кривой зависимости изменения частоты от времени. Анализ полученных данных с образцами плазм
больных инфарктом миокарда показал наличие на
кривой участка с практически постоянным значением
частоты (наличие горизонтального плато), который
свидетельствовал об образовании комплекса антиген-антитело. Плато продолжительностью 10–30
секунд регистрировали по истечении 30–90 секунд
после ввода плазмы. Значения констант скоростей
образования, kо, и разрушения, kр, комплекса и константы аффинности тропонина I с антителами устанавливали по методике Скетчарда из графика зависимости d(Δf)/dt от Δf, учитывая линейный характер
кинетической зависимости изменения частоты колебаний сенсора в начальный момент времени [10]. Результаты анализа представлены в таблице.
тате взаимодействия его с определяемым соединением. ПКР предварительно обезжиривали этанолом,
высушивали, затем на золотой электрод наносили
пираний раствор (H2SO4 : 30% H2O2 составило
7 : 3) и выдерживали в течение 3–5 минут, избегая
контакта со спаями, обильно промывали дистиллированной водой, этанолом и высушивали на воздухе
до постоянной массы. В общей сложности анализ
занимал 10–15 минут и требовал всего 1 мкл образ-
Как видно из таблицы, с увеличением концентрации тропонина I в пробе, введенной на поверхность
пьезокварцевого иммуносенсора, сдвиг частоты колебаний резонатора линейно увеличивается, вместе
с тем значение константы аффинности уменьшается.
Уравнение прямой имеет следующий вид:
Δf/Гц=(71,42894±9,19389)+
+(177,07721±10,35299)×С(cTn I) / нг/мл,
R2=0,98.
24
МЕДИЦИНСКИЙ АКАДЕМИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2012 г., ТОМ 12, № 4
Незначительное уменьшение константы аффинности, вероятно, связано с влиянием диффузии из-за
отсутствия условий идеального перемешивания.
Заключение. Кинетика биоаффинных взаимодействий была изучена на 6 образцах плазм пациен-
тов, больных ИМ. Погрешность определения тропонина I с использованием предложенного сенсора
не превышала 19%. Разработанный иммуносенсор
может быть применен для быстрого и чувствительного скрининга кардиомаркеров в крови пациентов.
Литература
1. Anderson L. Candidate-based proteomics in the search for biomarkers of cardiovascular disease // J. Physiol.— 2005.— Vol. 563, № 1.— P. 23–60.
2. Xu Q., Xu H., Gu H. et al. Development of lateral flow immunoassay system based on superparamagnetic nanobeads as labels for rapid quantitative detection of cardiac troponin I // Materials Science and Engineering C.— 2009.— Vol. 29.— P. 702–707.
3. Suprun E., Bulko T., Lisitsa A. et al. Electrochemical nanobiosensor for express diagnosis of acute myocardial infarction in undiluted plasma //
Biosens. Bioelect.— 2010.— Vol. 25, № 7.— P. 1694–1698.
4. Godber B., Frogley M., Rehak M. et al. Profiling of molecular interactions in real time using acoustic detection // Biosens. Bioelect.— 2007.—
Vol. 22.— P. 2382–2386.
5. McBride D. J., Cooper M. A. A high sensitivity assay for the inflammatory market C-Reactive protein employing acoustic biosensing //
J. Nanobiotechnol.— 2008.— Vol. 6.— P. 1–8.
6. Сhen Z.-G., Tang D.-Y. Antigen-antibody interaction from quartz crystal microbalance immunosensors based on magnetic CoFe2O4/SiO2 composite nanoparticle-functionalized biomimetc interface // Bioprocess and Biosyst. Eng.— 2007.— Vol. 30.— P. 243–249.
7. Tang D., Yuan R., Chai Y. Quartz crystal microbalance immunoassay for carcinoma antigen 125 based on gold nanowire-functionalized biomimetic interface // Analyst.— 2008.— Vol. 133.— P. 933–938.
8. Lee Y., Lee E. K., Cho Y. W. et al. ProteoChip: a highly sensitive protein microarray prepared by a novel method of protein immobilization for
application of protein-protein interaction studies // Proteomics.— 2003.— Vol. 3.— P. 2289–2304.
9. Глинн Л., Стьюард М. Cтруктура и функции антител: пер. с англ.— М.: Мир, 1983.
10. Shihui Si, Li Si, Fenglian Ren et al. Study of Adsorption Behavior of Bilirubin on Human-Albumin Monolayer Using a Quartz Crystal
Microbalance // J. of Colloid and Interface Science.— 2002.— Vol. 253.— P. 47–52.
Контакт: agafonovaluba@mail.ru
ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ АНТИГЕНОВ
M. TUBERCULOSIS В СЕРОДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ
1Е.
В. Васильева, 1В. Н. Вербов, 1А. А. Тотолян, 2А. Б. Беклемишев, 2А. Л. Мамаев, 2А. О. Цырульников
1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург, Россия
2НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск, Россия
© Коллектив авторов, 2012 г.
Введение. В настоящее время отмечается рост
заболеваемости туберкулезом (ТБ) и смертности от
него, особенно в странах Восточной Европы, в том
числе в Российской Федерации. По данным Росстата в 2010 г. в РФ заболеваемость ТБ составила
76,9 на 100 тыс. населения [1]. Для снижения уровня заболеваемости ТБ большое значение имеет
своевременная диагностика этого заболевания.
Из современных лабораторных методов диагностики ТБ наиболее актуальными являются серологические методы (ИФА, иммунохроматография
и др.), так как они наиболее экспрессны, низкозатратны и могут быть автоматизированы. Для методов серологической диагностики ТБ весьма актуальна проблема специфичности и чувствительности.
Она связана с кросс-реактивностью белковых антигенов M. tuberculosis с гомологичными белками других родственных микроорганизмов. Полная расшифровка генома M. tuberculosis [2] показала, что
бактерия способна синтезировать несколько сотен
антигенов. Экспрессия их генов на разных стадиях
инфекции, при легочной и других формах ТБ, а также на фоне иммунодефицитных состояний (например, ВИЧ-инфекции) неодинакова. Неоднократно
было показано, что тест-системы, в которых используется комбинация различных антигенов M. tuberculosis, обладают более высокой чувствительностью
и специфичностью по сравнению с тест-системами,
сконструированными на основе только одного антигена [3–5].