БЮЛЛЕТЕНЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЫ

БЮЛЛЕТЕНЬ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ
БИОЛОГИИ
И МЕДИЦИНЫ
3
2009
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2009, Том 147, № 3
341
МОРФОЛОГИЯ И ПАТОМОРФОЛОГИЯ
ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРОВ РОСТА В ЭНДОТЕЛИОЦИТАХ ПРИ
СОСУДИСТЫХ МАЛЬФОРМАЦИЯХ
К.А.Павлов*, Е.А.Дубова*, А.И.Щёголев*'**, О.Д.Мишнёв*'**
*Отдел патологической анатомии (зав. — проф. А.И.Щёголев) Института
хирургии им. А.В.Вишневского; **кафедра патологической анатомии (зав. —
проф. О.Д.Мишнёв) лечебного факультета РГМУ, Москва
Иммуногистохимическими методами проведено изучение экспрессии факторов роста
и пролиферации эндотелиоцитов при сосудистых мальформациях. Выявленные особенности экспрессии факторов роста в эндотелии венозных и артериовенозных мальформаций, по-видимому, отражают различия в патогенезе данных образований. Повышенная
пролиферативная активность эндотелия в наблюдениях ангиодисплазий обоих типов
может лежать в основе развития рецидивов заболевания.
Ключевые слова: пролиферация, сосудистые мальформации, факторы роста, эндотелиоциты
Патогенез сосудистых мальформации (ангиодисплазий) во многом обусловлен нарушением нормального взаимодействия между основными медиаторами ангиогенеза. Несмотря на то, что в
настоящее время имеется большое количество
работ, посвященных молекулярным механизмам
ангиогенеза [13], вопрос о роли ключевых ангиогенных цитокинов и факторов роста, а также об
их взаимодействии в развитии некоторых видов
мальформации остается недостаточно изученным.
В частности, представляет интерес выяснение
особенностей медиаторных взаимодействий при
артериовенозных, венозных и смешанных ангиодисплазиях. Большинство исследователей подтверждают, что знание молекулярных основ патогенеза основных типов сосудистых мальформации будет способствовать разработке новых
таргетных методов лечения заболеваний данной
группы.
Перспективным методом современной патологической анатомии является иммуногистохимический, позволяющий прицельно изучить экспрессию медиаторов ангиогенеза и его рецепторов.
Кроме того, результаты иммуногистохимического исследования сосудистых образований могут
использоваться для дифференциальной диагностики сосудистых мальформации гемангиом.
Адрес для корреспонденции: pavlovka@ixv.comcor.ru Павлов К.А.
Целью работы являлось выяснение особенностей экспрессии ангиогенных медиаторов в
эндотелиоцитах, а также их пролиферативной
активности в артериовенозных и венозных мальформациях.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
В основу работы положен анализ операционного
материала 13 больных (7 женщин и 6 мужчин) в
возрасте 22-67 лет с сосудистыми мальформациями периферической локализации, находившихся
на лечении в Институте хирургии им. А.В.Вишневского с 2004 по 2007 г. В 7 наблюдениях диагностированы артериовенозные мальформации (4
женщины и 3 мужчины), в 6 — венозные мальформации (3 женщины и 3 мужчины).
Полученные кусочки ткани фиксировали в
10% растворе нейтрального формалина. Гистологическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 5 мкм, окрашенных гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое
исследование экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста (ЭФР; "DBC", 1:50), трансформирующего фактора роста β3 (ТФР-β3; "DBC",
1:100), основного фактора роста фибробластов
β-ФРФ; "BioGenex", 1:30) и маркера пролиферации Ki-67 ("BioGenex", 1:30) проводили иммунопероксидазным методом с докраской ядер гематоксилином. Результаты реакции с антителами
342
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2009, Том 147, № 3
к факторам роста оценивали полуколичественным
методом с учетом интенсивности окрашивания
цитоплазмы эндотелиоцитов и выражали в баллах: 0 — отрицательная реакция, 1 балл — слабая
реакция, 2 балла — реакция средней интенсивности, 3 балла — интенсивная реакция. Оценку
числа Ki-67 позитивных клеток проводили с помощью телевизионного анализатора изображения "МЕКОС-Ц" и выражали в процентах от
общего количества эндотелиоцитов.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Патологоанатомическая диагностика сосудистых
мальформаций имеет особенности в зависимости от вида, однако при развитии рецидивов возникают разнообразные вторичные изменения,
затрудняющие проведение дифференциальной
диагностики [1,2].
При гистологическом исследовании артериовенозных мальформаций нами выявлены беспорядочные скопления сосудов артериального и венозного типа диаметром 5-15 мкм (рисунок, а).
Внутренняя эластическая мембрана артерий характеризовалась неравномерным распределением
эластических волокон и их очаговым "разволокнением". Кроме того, отмечалась очаговая субинтимальная гиперплазия гладкомышечных клеток, а также очаговый склероз стенок сосудов
венозного типа. По периферии ангиодисплазий
наблюдались скопления плотной волокнистой
соединительной ткани.
Гистологическая картина венозных мальформаций была представлена преимущественно тонкостенными кавернами с разными размером и
формой (рисунок, б). Отмечалась неравномерность толщины стенок этих каверн: в участках
истончения определялось снижение числа мышечных клеток, в участках утолщения число мышечных клеток было увеличенным. Вокруг венозных
мальформаций отмечались участки плотной волокнистой соединительной ткани и очаги кровоизлияний разного размера.
При иммуногистохимическом исследовании
во всех наблюдениях артериовенозных и венозных мальформаций в эндотелиоцитах выявлена
умеренно повышенная экспрессия ТФР-β (таблица). При этом уровень экспрессии ТФР-β был
выше в эндотелии артериовенозных мальформаций по сравнению с венозными (рисунок, в).
Нами отмечена умеренно повышенная экспрессия сосудистого ЭФР в эндотелии венозных и
артериовенозных ангиодисплазий. При этом экспрессия ЭФР также была несколько выше в эндотелиоцитах артериовенозных мальформаций
(рисунок, г). Экспрессия (β-ФРФ в эндотелиоцитах венозных и артериовенозных мальформаций
была низкой или незначительно повышенной,
при этом она была более высокой в эндотелии
венозных мальформаций (рисунок, д). Индекс
пролиферации эндотелиоцитов сосудов крупного
и среднего диаметра артериовенозных и венозных мальформаций был низким (наблюдались
лишь единичные экспрессирующие Ki-67 клетки — 0.1%), однако пролиферативная активность
сосудов мелкого диаметра, расположенных в периферических отделах мальформаций, была умеренно повышена (от 2 до 4%; рисунок, е).
Система ТФР-β и его рецепторов (ALK1,
ALK5 и др.) играет важную роль на разных стадиях ангиогенеза, включая васкулогенез. В раннем эмбриогенезе экспрессия ТФР-β характерна
для многих тканей, включая эндотелиальные и гемопоэтические клетки-предшественники. Инактивация ТФР-β, у зародышей мышей ведет к их
гибели (в 50% случаев — у гетерозигот и в 25% —
у гомозигот) на ранних сроках беременности
[13]. Непосредственной причиной гибели этих
эмбрионов являлись нарушения в системе васкуляризации и гемопоэза желточного мешка.
Несмотря на то, что при отсутствии экспрессии
ТФР-β, начальные этапы дифференцировки мезодермальных клеток-предшественников в эндотелиоциты протекают нормально, последующее
их развитие с формированием капилляроподобных трубочек ведет к образованию аномальных
сосудов с дефектами стенок. Отсутствие у мышей рецептора ТФР-β 2-го типа ведет к развитию сходных аномалий, что также доказывает
важную роль системы ТФР-β—ТФР-β-рецептор
в формировании целостной сосудистой стенки
[13,15].
Роль системы ТФР-β в патогенезе сосудистых мальформаций до конца не выяснена. Между тем, имеются данные об ее участии в развитии
ангиодисплазий и их рецидивов после хирургических вмешательств. Установлено, что рост эндотелиоцитов артериовенозных мальформаций не
изменяется при введении в их культуру ТФР-β,
тогда как темпы роста эндотелиоцитов нормальных тканей замедляются и клетки подвергаются
апоптозу. Кроме того, выявлено умеренное, а в
некоторых случаях значительное повышение экспрессии ТФР-β, и его рецептора ALK5, а также
их матричной РНК эндотелиоцитами артериовенозных мальформаций головного мозга [3].
На операционном материале нами отмечена
умеренно повышенная экспрессия ТФР-β в эндотелиоцитах венозных мальформаций, что, возможно, свидетельствует о слабом влиянии этого
МОРФОЛОГИЯ И ПАТОМОРФОЛОГИЯ
фактора в патогенезе данного типа ангаодисплазий.
В эндотелиоцитах артериовенозных мальформаций нами также отмечена умеренно повышенная
экспрессия указанного фактора, однако в 3 слу-
343
чаях она была высокой, что подтверждает предположение о возможном влиянии ТФР-β на развитие и профессию именно артериовенозного
типа сосудистой аномалии.
Морфологическая характеристика сосудистых мальформаций.
а — артериовенозная мальформация, представленная диспластичной артерией крупного размера, окруженной
мелкими венами; б— венозная мальформация, представленная тонкостенными кавернами; в— повышенная
экспрессия ТФР-β в эндотелиоцитах венозной мальформаций; г— повышенная экспрессия ЭФР в эндотелиоцитах артериовенозной мальформаций; д — экспрессия β-ФРФ в эндотелиоцитах венозной мальформаций;
е— экспрессия Ki-67 в ядрах эндотелиоцитов мелких сосудов в периферических отделах венозной мальформаций. а, б— окраска гематоксилином и эозином (х100); в-е — иммунопероксидазный метод (х400).
344
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2009, Том 147, № 3
Семейство сосудистого ЭФР (VEGF) представлено несколькими секреторными гликопротеинами (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D
и VEGF-E). Все представители семейства VEGF
могут связываться с VEGF тирозинкиназными
рецепторами 1, 2 и 3-го типа (VEGFRs). VEGF-A
является одним из наиболее важных регуляторов
процесса ангиогенеза in vivo, особенно на ранних
его этапах. Гиперэкспрессия VEGF-C и VEGF-D
у трансгенных мышей приводит к формированию гиперпластических лимфатических сосудов.
Напротив, подавление этих медиаторов ведет к
остановке роста лимфатических сосудов [5].
Специфическая инактивация гена VEGFR-1
ведет к активации и дифференцировке гемангиобластов, что, в свою очередь, вызывает усиленный
рост эндотелиоцитоподобных клеток и дезорганизацию кровеносных сосудов [4]. Инактивация
гена рецептора VEGFR-2 ведет к нарушению формирования кровяных островков и эмбриональных
кровеносных сосудов, вызывая гибель эмбриона.
Активация рецептора VEGFR-2 усиливает пролиферацию и миграцию эндотелиоцитов, а также
повышает проницаемость кровеносных сосудов.
Отсутствие гена VEGFR-3 обусловливает гибель
эмбриона на ранних сроках гестации вследствие
дефекта процесса ремоделирования первичной
сосудистой сети, ведущей к невозможности нормального развития сердечно-сосудистой системы
еще до начала формирования лимфатических
сосудов [13].
В настоящее время роль нарушений в системе VEGF—VEGFR наиболее полно изучена при
сосудистых мальформациях ЦНС. Так, в эндотелии артериовенозных мальформаций головного
мозга и окружающих астроцитах отмечена повышенная в разной степени экспрессия представителей семейства VEGF (VEGF А, В, С, D) и
их рецепторов (Flk-1, Flt-1 и Flt-4) [6].
В нашем исследовании выявлена умеренно
повышенная экспрессия сосудистого эндотелиального ЭФР в эндотелии как артериовенозных,
так и венозных мальформаций, однако в случае
артериовенозных мальформаций она была несколько выше. При этом экспрессия ЭФР была
особенно высокой в эндотелиоцитах сосудов артериального типа. Указанные особенности экспрес-
сии ЭФР подтверждают его участие в патогенезе
артериовенозных мальформаций периферических
локализаций, однако для подтверждения этого
и выяснения роли ЭФР в развитии рецидивов
ангиодисплазий этого типа необходимо проведение молекулярно-генетических исследований.
Семейство ФРФ (FGF) представлено 22 сходными по структуре полипептидными соединениями. Большинство из них являются митогенами широкого спектра, стимулирующими такие
клеточные функции, как миграция, пролиферация
и дифференцировка. Представители семейства
ФРФ играют важную роль в процессах эмбрионального развития, ангиогенеза, васкулогенеза и
заживления ран [10,11]. Все представители семейства ФРФ воздействуют на клетку путем активации специфических трансмембранных тирозинкиназных рецепторов (FGFR1, FGFR2, FGFR3
и FGFR4). Установлено, что система FGF—FGFR2
играет роль в регуляции миграции эндотелиоцитов в процессе образования новых сосудов [8,9].
Роль системы ФРФ в патогенезе сосудистых мальформаций практически не изучена. Нами выявлена низкая или незначительно повышенная экспрессия (β-ФРФ в эндотелиоцитах изученных
мальформаций, при этом она была выше в эндотелии венозных мальформаций, что может отражать особенности патогенеза.
Для оценки пролиферативной активности
клеток в настоящее время используются два иммуногистохимических маркера — Ki-67 и PCNA.
При этом Ki-67 выявляет пролиферирующие клетки, находящиеся на разных фазах цикла и отражает весь пул делящихся клеток, являясь наиболее четким маркером пролиферации. Белок Ki-67
является короткоживущим протеином, который
разрушается в течение 1-1.5 ч после начала синтеза, поэтому он не накапливается и не выявляется в покоящихся клетках.
В эндотелиоцитах артериовенозных мальформаций твердой мозговой оболочки наблюдаются умеренная экспрессия PCNA и отсутствие
экспрессии Ki-67 [14]. Это объясняется тем, что
PCNA имеет более длительный период полужизни
(около 20 ч) и в отличие от Ki-67 экспрессируется клетками, находящимися в G0-фазе клеточного цикла. В эндотелии артериовенозных маль-
Иммуногистохимические характеристики эндотелиоцитов при артериовенозных и венозных мальформациях
Тип мальформаций
Интенсивность экспрессии фактора
ЭФР
Артериовенозная
Венозная
2.0
1.7
β-ФРФ
1.1
1.7
ТФР-β
2.1
1.8
Ki-67, %
0.57
1.83
МОРФОЛОГИЯ И ПАТОМОРФОЛОГИЯ
формаций
головного
мозга
показана
умеренная, а в некоторых случаях высокая
экспрессия
Ki-67,
коррелирующая
со
склонностью данных образований к развитию
рецидивов [7,12].
На
основании
проведенных
нами
иммуногисто-химических
исследований
экспрессии
Ki-67
установлена
низкая
пролиферативная активность эндотелиоцитов
периферических
венозных
и
артериовенозных мальформаций. Однако в
отдельных наблюдениях выявлена умеренно
повышенная пролиферативная активность
эндотелия мальформаций обоих типов. У
таких пациентов, на наш взгляд, значительно
повышен
риск
развития
рецидивов
заболевания после хирургического лечения.
Таким образом, выявленные особенности
экспрессии факторов роста в эндотелиоцитах
венозных и артериовенозных мальформаций
отражают различия в морфогенезе и
патогенезе данных образований. Повышенная
пролиферативная активность эндотелия в
наблюдениях мальформаций обоих типов
может лежать в основе развития рецидивов
заболевания.
ЛИТЕРАТУРА
1. Милованов А.П. Патоморфология
ангиодисплазий конечностей. М., 1978.
345
2. Мишнёв О.Д., ЩёголевА.И.//Ангиодисплазий
(врожденные пороки развития сосудов). М.,
2008. С. 34-53.
3. Chen Y.G., Massague J. // J. Biol. Chem.
1999. Vol. 274, N 6. P. 3672-3677.
4. Hiratsuka S., Maru Y., Okada A. et al. // Cancer
Res. 2001. Vol.61, N 3. P. 1207-1213.
5. Karkkainen M.J., Haiko P., Sainio K. et al. //
Nat. Immunol. 2004. Vol. 5, N 1. P. 74-80.
6. Koizumi Т., Shiraishi Т., Hagihara N. et al. //
Neurosurgery. 2002. Vol. 50, N 1. P. 117-124.
7. Meijer-Jorna L.B., van der Loos СМ., de Boer
O.J. etal. II J. Clin. Pathol. 2007. Vol. 60, N 7.
P. 798-803.
8. Murakami M., Nguyen L. Т., Zhang Z. W. et al. 11
J. Clin. Invest. 2008. Vol. 118, N 10. P. 33553366.
9. Nakamura Т., Mochizuki Y., Kanetake H., Karda
S. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. Vol.
289, N 4. P. 801-806.
10.
Poole T.J., Finkelstein E.B., Cox CM. //
Dev. Dyn. 2001. Vol. 220, N 1. P. 1-17.
ll.Presta M., Dell'Era P., Mitola S. et al. 11 Cytokine
Growth Factor Rev. 2005. Vol. 16, N 6. P. 159178.
12.
Sure U., ButzN., SchlegelJ. etal. //J.
Neurosurg. 2001. Vol. 94, N 6. P. 972-977.
13.
Tille J.C, Pepper M.S. 11 Arterioscler.
Thromb. Vase. Biol. 2004. Vol. 24, N 9. P.
1578-1590.
14.
Tirakotai W., Liu-Guan В., Bertalanffy H.
et al. // Chinese Med. J. 2004. Vol. 117. P.
1815-1820.
15.
Uranishi R., Baev N.I., Ng P.Y. et al. //
Neurosurgery. 2001. Vol. 48, N2. P. 359-367.
Получено 14.10.08