Современные подходы к анализу мочи
реклама
Технология и автоматизация анализа мочи Основные принципы цитофлуориметриии в анализе мочи Исследования мочи – общий подход 1. Метод сита: 2. Химия мочи + исследования осадка (по Нечипоренко) 2 Точная количественная оценка – трудно реализуема ручным методом... ● Концентрационный фактор? • Первичный объем? • Эффективность седиментации? • Остаточный объем? ● Анализируемый объем? • Объем суспензии осадка?? • Объем на поле зрения? ● Аналитика • Точность подсчета при малых значениях? • Субъективность классификации? 3 «Референс-метод»– микроскопия осадка Источники ошибок CV [%] ● Объем суспензии осадка 3 ● Ошибка толщины поля зрения 10 ● Диаметр поля зрения 1 ● Ошибка счета лейкоцитов на поле зрения 17 ● Ошибка остаточного объема 50 ● Ошибка первоначального объема 3 ● Ошибка пересчета лейкоцитов на мкл в нативной моче 32 ● Ошибка эффективности центрифугирования 19 Общая ошибка подсчета лейкоцитов в нативной моче 136% 4 Анализ частиц мочи – Первая попытка стандартизации Идеальный образец для анализа мочи (NCCLS GP 16-A, 1995) ● 12 мл мочи ● Центрифугирование 5 минут при 1500 об/мин и радиусе ротора 15.9 см ● 11.8 мл супернатанта удаляются ● Счетная камера 22 x 22 mm покрывается стеклом, ● 20 мкл распределяются в камеру (эквивалентно 1.2 мл нативной мочи) ● Счет/поле зрения x 4,2 = счет/мкл (площадь поля зрения - 0,096 мм2) 5 Анализ частиц мочи – Стандартизация невозможна Потери при центрифугировании (RBC) (мониторинг с помощью UF-100): Нативная моча 1,428 400 17,030 45 через 5 мин 1,370 191 318 27 через 20 мин 123 45 1 19 6 Современное искусство подсчета частиц в моче .... 7 Цели анализа осадка мочи Метод фокусируется на: • Выделении отрицательных образцов • Разделении патологических образцов на • Инфекции мочевыводящих путей • Гематурии • Почечная • Внепочечная Заболевания почек Гематурия/ Инфекции мочевыводящих путей Отрицательные образцы UF-1000i: современная технология и ее преимущества ● UF-1000i – полный анализ осадка мочи ● Скорая готовность результата позволяет: • Отсортировать отрицательные образцы • Отменить ненужные исследования • Сократить слепое, без необходимости, назначение антибиотиков UF-1000i: современная технология и ее преимущества ● UF-1000i это: • Технологии проточной цитофлуориметрии, кондуктометрии и гидродинамической фокусировки • Два независимых канала: для бактерий и для частиц осадка • Полный подсчет с дифференцировкой в моче: » Лейкоцитов, эритроцитов, клеток плоскоклеточного эпителия, мелких круглых клеток (переходный и почечный эпителий) » Бактерий, дрожжеподобных клеток, сперматозоидов » Кристаллов, почечных цилиндров, слизи • Скорость до 100 образцов в час Результат в течение короткого времени Все параметры готовы для оценки через 1 минуту Принцип измерения Основа – стандартизация обработки образца ● Автоматическое перемешивание, аспирация и впрыск порции мочи ● Аспирируемый объем 800µL ● Разведение и окрашивание ● Фиксированные концентрации • 1:4 для анализа осадка • 1:8 для подсчета бактерий ● Инкубация при определенной температуре Специальная система реагентов обеспечивает: • Обеспечение определенного уровня pH • Предобработку клеточных мембран • Предотвращение неспецифического окрашивания • Ускорения специфического окрашивания • Растворения солей • Оптимальную температуру для окрашивания Специальная система реагентов обеспечивает: ● Окрашивание полиметиновым красителем, идеально соответствующим лазерной технологии. Полиметиновые красители: • Привлекательны за счет интересных оптических и фотоэлектрических свойств. • Используются как крайне эффективные лазерные красители • Имеют высокую световую абсорбцию и сильный уровень флуоресценции • Могут обнаруживаться в крайне низких концентрациях с использованием полупроводниковых лазеров Полиметиновый краситель: Идеальный партнер для лазерной технологии • Количество метиновых групп, длина и структура цепи определяют диапазон световой абсорбции. • UF-1000i – возбуждение при 635 nm • UF-1000i – испускание свыше 660 nm Основа подсчета – проточная цитофлуориметрия Искусство подсчета частиц мочи… Детекция оптических свойств ● Окрашенный образец мочи впрыскивается в проточную камеру ● Под воздействием лазера окрашенные клетки флуоресцируют ● Определяется уровень флуоресценции каждой отдельной клетки ● Параллельно определяется фронтальное светорассеяние – информация о диаметре клетки ● Оптические свойства разнятся от частицы к частице ● Настоящий уникальный «взгляд внутрь» Кластерный анализ UF-1000i: параметры Эритроциты Данные эритроциты, имеющие внепочечное происхождение, нормальны по форме и размеру. В проточной камере они идентифицируются за счет комбинации их низкой флуоресценции (отсутствие ДНК) и незначительного фронтального светорассеяния (малый размер). Данные дисморфные эритроциты имеют, скорее всего, почечное происхождение. Стрелкой показан акантоцит. UF-1000i: Дифференциальная диагностика гематурии ● Распространненность асимптоматической микрогематурии в популяции взрослых мужчин и женщин в постменопаузе составляет от 10% до 20%. ● Гематурия может быть: • Почечной (гломерулярной) • Внепочечной (мочеточники, мочевой пузырь) 21 Гломерулярная гематурия • Осадок мочи пациентов с гломерулярной гематурией характеризуется: • Присутствием разнообразных форм эритроцитов • Выраженной гетерогенностью эритроцитов как по форме, так и по размеру • Возможным присутствием фрагментов клеток * The (fixed) urinary sediment, a simple and useful diagnostic tool in patients with haematuria J. Huussen*, R.A.P. Koene, L.B. Hilbrands 22 Выявление гематурии и относительная информация 23 Дифференциальная диагностика гематурии: эритроциты, их размер и распределение • Чувствительность -100% (лазерная микроскопия 96%) • Специфичность 93% (лазерная микроскопия 93%) при детекции почечных кровотечений Hyodo et al; Jpn J Nephrol 37: 35-43 (1995) • Чувствительсноть 83% , NPV 0.78 (микроскопия 79% , NPV 0.74 ) • Специфичность 94%, PPV 0.95) (микроскопия 90% , PPV 0.79) Apeland et al: Nephr. Dial Transplant (2001) 24 ЛЕЙКОЦИТЫ Лейкоциты классифицируются на основе их уровня флуоресценции (за счет нуклеиновых кислот) и фронтального светорассеяния (средний размер лейкоцита ~10 µm) Специфическое окрашивание бактерий за счет взаимодействия реагентов • Совместное действие дилюента и полиметинового красителя ведет к эффективному окрашиванию исключительно бактерий. Клеточный дербис, часто присутствующий в моче, не окрашивается Эритроциты, лейкоциты и бактерии на скатерограмме UF-1000i: флаг UTI? Подозрение на инфекцию мочевыводящих путей Сообщение об инфекции мочевыводящих путей появляется при комбинации данных подсчета • бактерий • и/или дрожжеподобных клеток • лейкоцитов 28 ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ (EC) Клетки плоскоклеточного эпителия Эпителиальные клетки демонстрируют очень высокий уровень флуоресценции и и высокое фронтальное светорассеяние SRC (мелкие круглые клетки) Клетки переходного эпителия UF-1000 классифицирует переходный эпителий (мочевого пузыря и мочеточника), а также клетки почечных канальцев как мелкие круглые клетки (SRC). Эпителиальные клетки на скатерограмме Параметры анализа мочи поступают от... SPERM Others YLC X’tal Fsc2 EC RBC-Fl-DWSD PROT RBC NIT WBC HGB WBC-M RBC-P70Fsc Fl SRC CASTS Non-Lysed RBC Спасибо за внимание
