фарма-2020: теõнолоãические аспектû производства некоторûõ

Ôóíäàìåíòàëüíûå èññëåäîâàíèÿ Å. Ê. Êóðáàíîâà1,2,3, Ò. Þ. ×óëêîâà1, Ä. Â. Áûðèõèíà1, À. Î. Äàíî1, Â. À. Íèêîëàåâà1, Ä. À. Ãóñàðîâ1,2 ÔÀÐÌÀ-2020: ÒÅÕÍÎËÎÃÈ×ÅÑÊÈÅ ÀÑÏÅÊÒÛ ÏÐÎÈÇÂÎÄÑÒÂÀ ÍÅÊÎÒÎÐÛÕ ÆÍÂËÏ È ÑÒÐÀÒÅÃÈ×ÅÑÊÈÕ ËÅÊÀÐÑÒÂÅÍÍÛÕ ÑÐÅÄÑÒÂ (îáçîð) Ïîñòóïèëà â ðåäàêöèþ 05.05.12. Ïðèíÿòà ê ïå÷àòè 26.05.12. Â ðàìêàõ ñòðàòåãèè ðàçâèòèÿ ôàðìàöåâòè÷åñêîé ïðîìûøëåííîñòè ÐÔ íà ïåðèîä äî 2020 ã. â Ðîññèè äîëæíî áûòü îðãàíèçîâàíî ïðîèçâîäñòâî øèðîêîé íîìåíêëàòóðû ëåêàðñòâåííûõ ñðåäñòâ, çíà÷èòåëüíóþ ÷àñòü êîòîðûõ ñîñòàâëÿþò ïðîäóêòû áèîôàðìàöåâòè÷åñêîé îòðàñëè. Â äàííîì îáçîðå ïðåäñòàâëåíû ñîâðåìåííûå òåõíîëîãèè ïðîèçâîäñòâà òàêèõ áèîôàðìàöåâòè÷åñêèõ ïðåïàðàòîâ, êàê ïðîèçâîäíûå èíñóëèíà, èíòåðôåðîí áåòà, ýðèòðîïîýòèí, ôîëëèòðîïèí àëüôà, ôàêòîð ñâ¸ðòûâàíèÿ êðîâè IX, ôåðìåíòû èìèãëþöåðàçà è àëüòåïëàçà è ìîíîêëîíàëüíûå àíòèòåëà ãåðöåïòèí, öåòóêñèìàá, ðèòóêñèìàá. Êëþ÷åâûå ñëîâà: ðåêîìáèíàíòíûé áåëîê, áèîàíàëîã, òåõíîëîãèÿ ïðîèçâîäñòâà, õðîìàòîãðàôèÿ. Â íàñòîÿùåå âðåìÿ â íàøåé ñòðàíå ðåàëèçóåòñÿ ñòðàòåãèÿ ðàçâèòèÿ ôàðìàöåâòè÷åñêîé ïðîìûøëåííîñòè íà ïåðèîä äî 2020 ã., ïðèçâàííàÿ îáåñïå÷èòü ëåêàðñòâåííóþ íåçàâèñèìîñòü Ðîññèéñêîé Ôåäåðàöèè. Îäíîé èç ãëàâíûõ öåëåé ýòîé ñòðàòåãèè ñòàëî èìïîðòîçàìåùåíèå, íåîáõîäèìîñòü êîòîðîãî ïðîäèêòîâàíà òîòàëüíîé çàâèñèìîñòüþ âíóòðåííåãî ðûíêà îò çàðóáåæíûõ ïðåïàðàòîâ, äîëÿ êîòîðûõ íà ðûíêå ñîñòàâëÿåò ïîðÿäêà 80 %. Íà ïåðâûé ïëàí â ýòîé ãîñóäàðñòâåííîé ïðîãðàììå âûäâèãàåòñÿ ñîçäàíèå óñëîâèé äëÿ ðàçâèòèÿ èííîâàöèîííîé îòðàñëè ôàðìïðîìûøëåííîñòè, îäíàêî áîëåå ðåàëèñòè÷íûì è íàä¸æíûì âàðèàíòîì èìïîðòîçàìåùåíèÿ, ñïîñîáíûì ñóùåñòâåííî ðàñøèðèòü äîëþ îòå÷åñòâåííûõ ïðåïàðàòîâ íà âíóòðåííåì ðûíêå, ÿâëÿåòñÿ ñîçäàíèå ïðîèçâîäñòâ ýôôåêòèâíûõ ïðåïàðàòîâ-äæåíåðèêîâ (biosimilars, èëè áèîàíàëîãîâ). Ãîñóäàðñòâîì ïîñòàâëåíà çàäà÷à îðãàíèçîâàòü ïðîèçâîäñòâî íå ìåíåå 85 % ïðåïàðàòîâ ïî íîìåíêëàòóðå èç ïåðå÷íÿ ñòðàòåãè÷åñêè âàæ1 2 3 Ìîñêîâñêèé ãîñóäàðñòâåííûé óíèâåðñèòåò òîíêèõ õèìè÷åñêèõ òåõíîëîãèé èì. Ì. Â. Ëîìîíîñîâà, 119571 Ìîñêâà (Ðîññèÿ), ïð-ò Âåðíàäñêîãî, 86. Ôåäåðàëüíîå ãîñóäàðñòâåííîå áþäæåòíîå ó÷ðåæäåíèå íàóêè Èíñòèòóò áèîîðãàíè÷åñêîé õèìèè èì. Àêàäåìèêîâ Ì. Ì. Øåìÿêèíà è Þ. À. Îâ÷èííèêîâà ÐÀÍ, 117997 Ìîñêâà (Ðîññèÿ), óë. Ìèêëóõî-Ìàêëàÿ, 16/10. june90@yandex.ru íûõ ëåêàðñòâåííûõ ñðåäñòâ. Çíà÷èòåëüíóþ ÷àñòü ýòîãî ïåðå÷íÿ ñîñòàâëÿþò áèîôàðìàöåâòè÷åñêèå ïðåïàðàòû, ñðåäè êîòîðûõ ïðîòèâîîïóõîëåâûå ñðåäñòâà, âàêöèíû, ïðåïàðàòû äëÿ ëå÷åíèÿ çàáîëåâàíèé ðàññåÿííîãî ñêëåðîçà è áîëåçíè Ãîøå. Â äàííîé ñòàòüå ïðåäñòàâëåí îáçîð ñîâðåìåííûõ òåõíîëîãèé ïðîèçâîäñòâà ïðåïàðàòîâ, âõîäÿùèõ â ñïèñîê æèçíåííî íåîáõîäèìûõ è âàæíåéøèõ ëåêàðñòâåííûõ ñðåäñòâ (ÆÍÂËÏ), à òàêæå ÷àñòè÷íî â ïåðå÷åíü ñòðàòåãè÷åñêèõ ëåêàðñòâåííûõ ñðåäñòâ. 1. ÏÐÎÈÇÂÎÄÍÛÅ ÈÍÑÓËÈÍÀ Èíñóëèí — ïîëèïåïòèäíûé ãîðìîí, âûðàáàòûâàåìûé â-êëåòêàìè îñòðîâêîâ Ëàíãåðãàíñà ïîäæåëóäî÷íîé æåëåçû. Èíñóëèí âûïîëíÿåò â îðãàíèçìå âàæíûå ôóíêöèè êîíòðîëÿ ìåòàáîëèçìà è ãîìåîñòàçà ãëþêîçû, îêàçûâàÿ âëèÿíèå íà ýêñïðåññèþ áîëüøîãî ÷èñëà ãåíîâ, âîâëå÷åííûõ â ýòè ïðîöåññû [1]. Äåôèöèò èíñóëèíà ìîæåò áûòü âûçâàí ðàçíîîáðàçíûìè ôàêòîðàìè, ñîïðîâîæäàåòñÿ ðàçâèòèåì òÿæåëûõ ïàòîëîãè÷åñêèõ ñîñòîÿíèé îðãàíèçìà, õàðàêòåðèçóþùèõñÿ ïîâûøåíèåì óðîâíÿ ãëþêîçû â ïëàçìå êðîâè, ïîëó÷èâøèõ íàçâàíèå äèàáåòà. Ïî äàííûì Âñåìèðíîé îðãàíèçàöèè çäðàâîîõðàíåíèÿ (ÂÎÇ), áîëåå 340 ìëí ÷åëîâåê âî âñåì ìèðå áîëüíû äèàáåòîì. Ïî ïðîãíîçàì ÂÎÇ, çà ïåðèîä 2005 – 2030 ãã. ÷èñëî ñëó÷àåâ ñìåðòè îò äèàáåòà óäâîèòñÿ [2]. ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 21 Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ Ðèñ. 1. Ñòðóêòóðíàÿ ôîðìóëà èíñóëèíà ëèçïðî. Ðèñ. 2. Ñòðóêòóðíàÿ ôîðìóëà èíñóëèíà àñïàðò. Ðàçâèòèå áèîòåõíîëîãè÷åñêèõ ìåòîäîâ ïîçâîëèëî â ïîñëåäíèå 10 ëåò ñîçäàòü è ââåñòè â ëå÷åáíóþ ïðàêòèêó íîâûå àíàëîãè èíñóëèíà ÷åëîâåêà, îáëàäàþùèå äîïîëíèòåëüíûìè òåðàïåâòè÷åñêèìè ïðåèìóùåñòâàìè ïðè ñîõðàíåíèè ïîëíîöåííîé ãèïîãëèêåìè÷åñêîé àêòèâíîñòè. Ïðèìåðàìè òàêèõ âíåäðåíèé ÿâëÿþòñÿ àíàëîãè èíñóëèíà ñâåðõáûñòðîãî (ëèçïðî è àñïàðò) è ïðîëîíãèðîâàííîãî (ãëàðãèí, äåòåìèð) äåéñòâèÿ. Ëèçïðî — áûñòðîäåéñòâóþùèé àíàëîã èíñóëèíà ÷åëîâåêà, ó êîòîðîãî â àìèíîêèñëîòíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè B-öåïè èíâåðòèðîâàíû îñòàòêè Pro29 è LysB29 (ðèñ. 1). Êîíôîðìàöèîííûå èçìåíåíèÿ C-êîíöåâîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè B-öåïè ãîðìîíà çàìåòíî ñíèçèëè äèìåðèçàöèþ ìîëåêóë áåëêà, õàðàêòåðíóþ äëÿ èíñóëèíà ÷åëîâåêà. Óìåíüøåíèå ñêëîííîñòè áåëêà ê îáðàçîâàíèþ àãðåãàòîâ óâåëè÷èëî ñêîðîñòü àáñîðáöèè èíñóëèíà ëèçïðî ïîñëå èíúåêöèè, îáåñïå÷èëî áîëåå âûñîêèé óðîâåíü ñîäåðæàíèÿ ïðåïàðàòà â ïëàçìå è ñíèçèëî ïðîäîëæèòåëüíîñòü äåéñòâèÿ [3]. Àñïàðò — åùå îäèí èñïîëüçóåìûé â êëèíè÷åñêîé ïðàêòèêå ãåííî-èíæåíåðíûé àíàëîã èí- 22 ñóëèíà áûñòðîãî äåéñòâèÿ. Â ìîëåêóëå àñïàðòà îñòàòîê ïðîëèíà â ïîëîæåíèè 28 B-öåïè çàìåíåí îñòàòêîì àñïàðàãèíîâîé êèñëîòû (ðèñ. 2). Ýòà çàìåíà ñíèçèëà òåíäåíöèþ ìîíîìåðíûõ ìîëåêóë èíñóëèíà ê àãðåãàöèè èç-çà íàðóøåíèÿ âçàèìîäåéñòâèÿ ìåæäó îñòàòêàìè Pro28 è GlyB23 [4]. Ãëàðãèí — ïðîëîíãèðîâàííûé àíàëîã èíñóëèíà ÷åëîâåêà, â ñòðóêòóðå êîòîðîãî îñòàòîê àñïàðàãèíà À21 çàìåíåí íà îñòàòîê ãëèöèíà, à Â-öåïü óäëèíåíà íà äâà ïîëîæèòåëüíî çàðÿæåííûõ îñòàòêà àðãèíèíà ArgB31, ArgB32, áëàãîäàðÿ ÷åìó pI ñìåùàåòñÿ äî 6,7. Èçìåíåíèå èçîýëåêòðè÷åñêîé òî÷êè â èòîãå ïðèâîäèò ê ïðîëîíãàöèè äåéñòâèÿ ïðåïàðàòà. Äåòåìèð — åùå îäèí ãåííî-èíæåíåðíûé àíàëîã èíñóëèíà ïðîëîíãèðîâàííîãî äåéñòâèÿ. Ìîëåêóëÿðíàÿ ñòðóêòóðà äåòåìèðà îòëè÷àåòñÿ îò ñòðóêòóðû ÷åëîâå÷åñêîãî èíñóëèíà îòñóòñòâèåì òðåîíèíà â ïîëîæåíèè Â30 è ïðèñîåäèíåíèåì ê ëèçèíó â ïîëîæåíèè Â29 ìèðèñòèíîâîé êèñëîòû — æèðíîêèñëîòíîãî îñòàòêà èç 14 àòîìîâ óãëåðîäà [5]. Àöèëèðîâàíèå ìîëåêóëû èíñóëèíà æèðíîé êèñëîòîé îáåñïå÷èâàåò ñâÿçûâàíèå ñ àëüáóìèíîì è ïðîëîíãèðóåò âñàñûâàíèå ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ èç ïîäêîæíî-æèðîâîãî ñëîÿ [6], à òàêæå îáåñïå÷èâàåò ðàñòâîðåííîå ñîñòîÿíèå ïðåïàðàòà ïîñëå èíúåêöèè. Íàèáîëüøèé ïðîãðåññ â ïðîèçâîäñòâå èíñóëèíà, êàê è äðóãèõ òåðàïåâòè÷åñêèõ áåëêîâ, áûë äîñòèãíóò ñ ïðèìåíåíèåì ãåííî-èíæåíåðíûõ ìåòîäîâ äëÿ ñîçäàíèÿ ñîîòâåòñòâóþùèõ òðàíñãåííûõ ìèêðîîðãàíèçìîâ [7]. Ðàçâèòèå ãåííî-èíæåíåðíûõ ìåòîäîâ ïðèâåëî ê áîëüøîìó âûáîðó ñèñòåì ýêñïðåññèè, ê ïðèìåðó, àíàëîãè èíñóëèíà ìîæíî ïîëó÷àòü, ïðèìåíÿÿ òàêèå ýêñïðåññèîííûå ñèñòåìû, êàê Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, êëåòêè CHO è äð. [8]. 1.1. Ñòàäèè òåõíîëîãè÷åñêîãî ïðîöåññà Ïðîöåññ ïîëó÷åíèÿ èíñóëèíà è åãî àíàëîãîâ â áàêòåðèàëüíûõ ýêñïðåññèîííûõ ñèñòåìàõ ìîæíî óñëîâíî ðàçäåëèòü íà ñëåäóþùèå ñòàäèè: l ôåðìåíòàöèÿ (âûðàùèâàíèå øòàììà-ïðîäóöåíòà â ôåðìåíòåðå); l îòäåëåíèå áèîìàññû è äåçèíòåãðàöèÿ êëåòî÷íîé ñóñïåíçèè ñ âûäåëåíèåì òåë âêëþ÷åíèÿ; l âûäåëåíèå è î÷èñòêà ðåêîìáèíàíòíîãî áåëêà; l ôåðìåíòàòèâíîå ðàñùåïëåíèå ðåêîìáèíàíòíîãî áåëêà; l õðîìàòîãðàôè÷åñêàÿ î÷èñòêà èíñóëèíà èëè åãî àíàëîãîâ; l ïîëó÷åíèå êðèñòàëëè÷åñêîãî èíñóëèíà èëè åãî àíàëîãîâ. Ïðè èñïîëüçîâàíèè ðåêîìáèíàíòíûõ êëåòîê E. coli äëÿ ïîëó÷åíèÿ àíàëîãîâ èíñóëèíà ïîñëåäíèå íàêàïëèâàþòñÿ â ñîñòàâå ãèáðèäíûõ áåëêîâ â òåëàõ âêëþ÷åíèÿ [9]. Íàèáîëåå îáùàÿ ñòðàòåãèÿ, èñïîëüçóåìàÿ äëÿ ðåíàòóðàöèè íåðàñòâîðèìûõ áåëêîâ, âêëþ÷àåò òðè ýòàïà: 1) âûäåëåíèå è îòìûâêà òåë âêëþ÷åíèÿ; 2) ñîëþáèëèçàöèÿ àãðåãèðîâàííîãî áåëêà; 3) ðåôîëäèíã ñîëþáèëèçèðîâàííîãî áåëêà. Êîíå÷íûé âûõîä öåëåâîãî áåëêà ëèìèòèðóåòñÿ ïîâòîðíîé óêëàäêîé áåëêîâîé ìîëåêóëû (ðåôîëäèíã, èëè ðåíàòóðàöèÿ), ÷òî ñâÿçàíî ñ âîçìîæíîñòüþ îáðàçîâàíèÿ íåàêòèâíûõ ôîðì (ïðîäóêòû íåïðàâèëüíîãî ôîëäèíãà), à òàêæå âûñîêîìîëåêóëÿðíûõ àãðåãàòîâ ïðè ïðèîáðåòåíèè áåëêîì íàòèâíîé êîíôîðìàöèè. Äëÿ ìàñøòàáèðîâàíèÿ íà ïðîèçâîäñòâåííîì óðîâíå ïðîöåññà ðåíàòóðàöèè áåëêîâ íåîáõîäèìûìè óñëîâèÿìè ÿâëÿþòñÿ äîñòèæåíèå âûñîêîé ñòåïåíè ïðàâèëüíî ñâåðíóòîãî (ôîëäèðîâàííîãî) ïðîäóêòà ïðè âûñîêîé êîíöåíòðàöèè; êðîìå òîãî, ïðîöåññ äîëæåí áûòü áûñòðûì, íåäîðîãèì è âûñîêîýôôåêòèâíûì [10]. 1.2. Âûäåëåíèå è î÷èñòêà ðåêîìáèíàíòíîãî èíñóëèíà ëèçïðî Â ðàáîòå [11] ïðèâåäåíà îáùàÿ ñõåìà îäíîãî èç âîçìîæíûõ ìåòîäîâ âûäåëåíèÿ è î÷èñòêè ðåêîìáèíàíòíîãî èíñóëèíà ëèçïðî. Áèîñèíòåç öåëåâîãî áåëêà îñóùåñòâëÿåòñÿ ÷åðåç ãèáðèäíûé ïðåäøåñòâåííèê, ïîëó÷àåìûõ â ïðîäóöåíòå E. coli, òðàíñôîðìèðîâàííîì êîäèðóþùèì àìèíîêèñëîòíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü àíàëîãà ïðîèíñóëèíà ÷åëîâåêà âåêòîðîì. Âûðàùåííóþ è èíäóöèðîâàííóþ áèîìàññó êëåòîê ðàçðóøàþò ñ öåëüþ âûäåëåíèÿ òåëà âêëþ÷åíèÿ ãèáðèäíîãî áåëêà, ðåñóñïåíäèðóþò â Òðèñ-ñîëåâîì áóôåðå, èñïîëüçóÿ ãîìîãåíèçàòîð Niro Soavi. Ïðèìåñíûå áåëêè óäàëÿþò ïîñðåäñòâîì äâóõ ïîñëåäóþùèõ îòìûâîê òåë âêëþ÷åíèÿ Òðèñ/Triton X-100 áóôåðîì, çà êîòîðûìè ñëåäóåò äâå îòìûâêè Òðèñ/Tween-20 áóôåðîì è ôèíàëüíàÿ îòìûâêà Òðèñ/NaCl áóôåðîì. Çàòåì òåëà âêëþ÷åíèÿ ðàñòâîðÿþò â 8 Ì ìî÷åâèíå, ñîäåðæàùåé âîññòàíàâëèâàþùèå àãåíòû (äèòèîòðåèòîë èëè b-ìåðêàïòîýòàíîë). Ïîëíîå ðàñòâîðåíèå äîñòèãàåòñÿ ïðè èçìåíåíèè pH äî 10,5 ñ ïîìîùüþ NaOH. Ïîñëå ðàñòâîðåíèÿ òåë âêëþ÷åíèÿ ïðîâîäÿò ðåôîëäèíã ãèáðèäíîãî áåëêà ðàçáàâëåíèåì â ðåíàòóðèðóþùåì áóôåðå (5 ìÌ CAPS, pH 10,5, ïðè 4 °Ñ) äî ôèíàëüíîé êîíöåíòðàöèè 0,5 ìã/ìë. Ïðîöåññ ïðîâîäÿò â òå÷åíèå 48 ÷ ïðè 2 – 10 °Ñ. Îêèñëåííûé ãëóòàòèîí äîáàâëÿþò â êîëè÷åñòâå, ðàâíîì èñõîäíîìó êîëè÷åñòâó âîññòàíàâëèâàþùåãî àãåíòà â áóôåðå, ïîñëå ÷åãî äîáàâëÿþò 5 Ì NaCl è 1 Ì ôîñôàò íàòðèÿ äî êîíå÷íîé êîíöåíòðàöèè 250 ìÌ è 25 ìÌ ñîîòâåòñòâåííî. Äîâîäÿò pH äî 7,9 ñ ïîìîùüþ 6 Ì HCl. Ðåôîëäèðîâàííûé áåëîê î÷èùàþò àôôèííîé õðîìàòîãðàôèåé ñ èñïîëüçîâàíèåì èììîáèëèçîâàííûõ ìåòàëëîâ: íàíîñÿò ðàñòâîðåííûé ãèáðèäíûé ïðåäøåñòâåííèê àíàëîãà èíñóëèíà íà êîëîíêó, óïàêîâàííóþ ìåòàëë-õåëàòíûì ñîðáåíòîì Ni-sepharose (GE Healthcare, Øâåöèÿ); ýëþèðóþò ãðàäèåíòîì èìèäàçîëà 0 – 400 ìÌ â òå÷åíèå 15 îáúåìîâ êîëîíêè (CV); èñïîëüçóÿ îáðàùåííî-ôàçîâóþ ÂÝÆÕ (ÎÔ ÂÝÆÕ), ïðîâîäÿò âíóòðèïðîèçâîäñòâåííûé êîíòðîëü, îáúåäèíÿÿ ïîäõîäÿùèå ôðàêöèè ñ áåëêîì òðåáóåìîãî óðîâíÿ ÷èñòîòû. Â î÷èùåííûõ ôðàêöèÿõ áåëêà ñìåíÿþò áóôåð, äëÿ ÷åãî ê îáúåäèíåííûì ôðàêöèÿì äîáàâëÿþò ÝÄÒÀ äî êîíöåíòðàöèè 10 ìÌ è äèàôèëüòðóþò íà ìåìáðàíå ñ ïðåäåëîì îòñå÷åíèÿ ïî ìîëåêóëÿðíîé ìàññå (ÏÎÌÌ) 3000 Äà. Ôèíàëüíûé áóôåð äîëæåí áûòü çàìåíåí êàê ìèíèìóì íà 97 % áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 20 ìÌ Òðèñ-HCl, pH 8,0, ïðè 2 – 10 °Ñ. Êîíå÷íàÿ êîí- ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 23 Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ öåíòðàöèÿ áåëêà ñîñòàâëÿåò ïðèìåðíî 20 – 25 ìã/ìë. Äëÿ ïîëó÷åíèÿ öåëåâîãî èíñóëèíîâîãî àíàëîãà ãèáðèäíûé ïðåäøåñòâåííèê ïîäâåðãàþò ôåðìåíòàòèâíîìó ðàñùåïëåíèþ, äîáàâëÿÿ â ðàñòâîð áåëêà òðèïñèí (áåëîê:ôåðìåíò = 2000:1) è êàðáîêñèïåïòèäàçó Â (áåëîê:ôåðìåíò = 1000:1). Ïî îêîí÷àíèè ãèäðîëèç îñòàíàâëèâàþò äîáàâëåíèåì óêñóñíîé êèñëîòû ³700 ìÌ äî pH 3,5. Ïðîöåññ êîíòðîëèðóþò ñ ïîìîùüþ ÂÝÆÕ (÷èñòîòà ïîëó÷àåìîãî ëèçïðî — îêîëî 54 %). Ïîëó÷åííûé â ðåçóëüòàòå ãèäðîëèçà èíñóëèí ëèçïðî íàíîñÿò íà êîëîíêó ñ îáðàùåííî ôàçîâûì ñèëèêàãåëåì (Ñ18) è ýëþèðóþò â èçîêðàòè÷åñêîì ðåæèìå áóôåðîì, ñîäåðæàùåì 23 % àöåòîíèòðèëà, 200 ìÌ ñóëüôàòà íàòðèÿ è 0,16 % ôîñôîðíîé êèñëîòû. Àëüòåðíàòèâíûé âàðèàíò — êîëîíêà ñ ñèëèêàãåëåì Ñ4 è ýëþöèÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì áóôåðà, ñîäåðæàùåãî 22 % àöåòîíèòðèëà, 200 ìÌ ñóëüôàòà íàòðèÿ è 0,16 % ôîñôîðíîé êèñëîòû. Î÷èùåííûå ôðàêöèè áåëêà êîíöåíòðèðóþò è ïåðåáóôåðèâàþò ñ ïîìîùüþ óëüòðàôèëüòðàöèè íà ìåìáðàíàõ ñ ÏÎÌÌ 3000 Äà. Ôèíàëüíûé áóôåð äîëæåí áûòü çàìåíåí êàê ìèíèìóì íà 97 % ðàñòâîðîì, ñîäåðæàùèì 0,1 N ëèìîííóþ êèñëîòó; îáðàçåö äîëæåí áûòü ñêîíöåíòðèðîâàí äî 8 – 12 ìã/ìë. Êðèñòàëëèçàöèÿ: ê èíñóëèíó ëèçïðî äîáàâëÿþò ðàâíûé îáúåì áóôåðà (2,4 Ì NaCl, 0,1 N ëèìîíàÿ êèñëîòà, 6 ìÌ ZnCl2), pH 6,3, îáðàçåö èíêóáèðóþò ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Çàâåðøåíèå êðèñòàëëèçàöèè îïðåäåëÿþò ñ ïîìîùüþ ÓÔ-ñïåêòðîìåòðè÷åñêîãî àíàëèçà íàäîñàäî÷íîé æèäêîñòè. Êðèñòàëëû èíñóëèíà ñîáèðàþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì èëè ôèëüòðàöèåé, îòìûâàþò ýòàíîëîì è âûñóøèâàþò â âàêóóìå äî ïîëó÷åíèÿ ñóõîé àêòèâíîé ôàðìàöåâòè÷åñêîé ñóáñòàíöèè (ÀÔÑ). 1.3. Ïîëó÷åíèå èíñóëèíà àñïàðòà Ïðåäøåñòâåííèêè èíñóëèíà àñïàðòà ìîãóò áûòü áèîñèíòåçèðîâàíû ìåòèëîòðîôíûìè äðîææàìè Pichia pastoris. Èñïîëüçîâàíèå ìåòèëîòðîôíûõ äðîææåé â êà÷åñòâå ýêñïðåññèîííûõ ñèñòåì äëÿ ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíûõ áåëêîâ èìååò ïðåèìóùåñòâî, ïîçâîëÿÿ äîñòèãàòü âûñîêèõ âûõîäîâ ïðîäóêòà è âûñîêîé ïëîòíîñòè êóëüòóðû â ôåðìåíòåðå [12]. Ïðè ýòîì âûñîêîé ïëîòíîñòè êóëüòóðû êëåòîê ìîæíî äîáèòüñÿ ïðè ìèíèìàëüíîì ðàñõîäå ïèòàòåëüíûõ âåùåñòâ. Òàêæå â ýòèõ ñèñòåìàõ îòñóòñòâóåò íåîáõîäèìîñòü ïðîâåäåíèÿ ðåàêöèé òðàíñïåïòèäàöèè, òàê êàê B-öåïü ñèíòåçèðóåòñÿ ïîëíîñòüþ. Êðîìå òîãî, äðîææè íå ñîäåðæàò òîêñè÷íûõ ýíäîòîêñèíîâ è ïèðîãåíîâ êëåòî÷íîé ñòåíêè â 24 îòëè÷èå îò ïðîêàðèîòîâ; âî-âòîðûõ, ñèíòåçèðîâàííûå ðåêîìáèíàíòíûå áåëêè áîëåå äîñòóïíû äëÿ âûäåëåíèÿ, òàê êàê îíè íàêàïëèâàþòñÿ â öèòîïëàçìå ëèáî ñåêðåòèðóþòñÿ â ïèòàòåëüíóþ ñðåäó [12]. Ïðè ýòîì ñåêðåòîðíàÿ ñèñòåìà äðîææåé äåìîíñòðèðóåò áîëüøîå ñõîäñòâî ñ ñîîòâåòñòâóþùåé ñèñòåìîé ìëåêîïèòàþùèõ, îáåñïå÷èâàÿ ïðàâèëüíûé ôîëäèíã è ïðîòåîëèòè÷åñêèé ïðîöåññèíã ñåêðåòèðóåìûõ áåëêîâ [13]. Òàêèì îáðàçîì, ïðè èñïîëüçîâàíèè äðîææåâûõ ñèñòåì îòñóòñòâóåò íåîáõîäèìîñòü ïðèìåíåíèÿ ñòàäèé ðåíàòóðàöèè, ÷òî ÿâëÿåòñÿ ñóùåñòâåííûì äîñòîèíñòâîì ïðèìåíåíèÿ ïîñëåäíèõ. Îïèñàíà òåõíîëîãèÿ ïîëó÷åíèÿ íîâîãî øòàììà-ïðîäóöåíòà ðåêîìáèíàíòíîãî ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà àñïàðòà â P. pastoris [14]. Íîâûé øòàìì-ïðîäóöåíò ïîëó÷àþò ìåòîäàìè îäíîâðåìåííîé è ïîñëåäîâàòåëüíîé òðàíñôîðìàöèè øòàììà-ðåöèïèåíòà GS115 P. pastoris (His4) ïëàçìèäàìè pPIC9InsAspRWR è pPICZaAInsAspRWR. Ïðîìûøëåííóþ ôåðìåíòàöèþ ýòîãî øòàììà ïðîâîäÿò ñëåäóþùèì îáðàçîì. Íà ïåðâîì ýòàïå êîëáû, ñîäåðæàùèå 0,4 ìë ïîñåâíîãî ìàòåðèàëà, îòòàèâàþò è çàòåì êóëüòèâèðóþò â ïèòàòåëüíîé ñðåäå YPD (20 ã/ë ãëþêîçû, 20 ã/ë ïåïòîíà, 10 ã/ë äðîææåâîãî ýêñòðàêòà). Êóëüòóðó èíêóáèðóþò â îðáèòàëüíîì øåéêåðå â òå÷åíèå 8 ÷ ïðè 30 °Ñ. Ïðîìûøëåííàÿ ôåðìåíòàöèÿ ñîñòîèò èç òðåõ ðàçëè÷íûõ ôàç: ïåðèîäè÷åñêîé ïîäà÷è ãëèöåðèíà, ñìåøàííîé ïîäïèòêè (àäàïòàöèè ê ìåòàíîëó) è èíäóêöèè ìåòàíîëîì. Èíîêóëÿò ïåðåíîñÿò â 2,5 ë ôåðìåíòåð, ñîäåðæàùèé 1,5 ë îñíîâíîé ñîëåâîé ïèòàòåëüíîé ñðåäû, ñëåäîâûå ñîëåé PTM4 è ðàñòâîðà D-áèîòèíà. Äëÿ áîðüáû ñî âñïåíèâàíèåì ïåðèîäè÷åñêè äîáàâëÿþò ðàñòâîð ïåíîãàñèòåëÿ. Íà âñåì ïðîòÿæåíèè ôåðìåíòàöèè ðàñòâîðåííûé êèñëîðîä ïîääåðæèâàþò íà óðîâíå 35 % äîáàâëåíèåì âîçäóõà ñ ïîñòîÿííîé ñêîðîñòüþ, èñïîëüçîâàíèåì ïðîòèâîäàâëåíèÿ è ïåðåìåøèâàíèÿ. Â ïåðâóþ ôàçó ôåðìåíòàöèè, ôàçó ïåðèîäè÷åñêîé ïîäà÷è ãëèöåðèíà, ôîðìèðóåòñÿ áèîìàññà. Ôåðìåíòåð ðàáîòàåò äî èñ÷åðïàíèÿ ãëèöåðèíà â ïèòàòåëüíîé ñðåäå, ÷òî îáíàðóæèâàþò ïî ïèêó êèñëîðîäà, âûçâàííîìó ïðåêðàùåíèåì ìåòàáîëèçìà ãëèöåðèíà. Ïîñëå çàâåðøåíèÿ ïåðâîé ôàçû íàñòóïàåò ôàçà ñìåøàííîé ïîäïèòêè: äîáàâëÿþò ñìåñü 43,5 % îá. ãëèöåðèíà è 5 % îá. ìåòàíîëà, à òàêæå ñëåäîâûå êîëè÷åñòâà ñîëè PTM4 è ðàñòâîðà D-áèîòèíà. Âî âðåìÿ ïðîâåäåíèÿ ñòàäèè ñêîðîñòü ðîñòà êóëüòóðû ñîñòàâëÿåò 0,065 ë/÷. Ïîñëå 15 ÷ ïåðèîäè÷åñêîé ôåðìåíòàöèè ñ ïîäïèòêîé ââîäÿò èíäóêòîð. Âî âðåìÿ ôàçû èíäóêöèè ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ êîëè÷åñòâî äîáàâëÿåìîé ñìåñè ãëèöåðèíà è ìåòàíîëà óìåíüøàþò, ÷òîáû äîñòèãíóòü ñêîðîñòè ðîñòà êóëüòóðû 0,005 ë/÷. Â òî æå âðåìÿ íà÷èíàþò ïîäïèòêó ÷èñòûì ìåòàíîëîì ñ äîáàâëåíèåì ñëåäîâûõ êîëè÷åñòâà ñîëåé PTM4 è ðàñòâîðà D-áèîòèíà. Ïðè ïîäà÷å ìåòàíîëà ïðèäåðæèâàþòñÿ êîíöåíòðàöèè 0,2 % îá., êîòîðûå îïðåäåëÿþò ìåòîäîì ãàçîâîé õðîìàòîãðàôèè. Ôàçà èíäóêöèè äëèòñÿ 24 ÷, è îïòè÷åñêàÿ ïëîòíîñòü áèîìàññû ñîñòàâëÿåò ÷óòü ìåíüøå 200 îïò. åä. ïðè l=600 íì. Ïðîäóêöèþ êîíòðîëèðóþò, îïðåäåëÿÿ êîíöåíòðàöèþ â íàäîñàäêå æèäêîé ïèòàòåëüíîé ñðåäû, èçìåðåííóþ îáðàùåííî-ôàçîâûìè Ñ8 è Ñ18 êîëîíêàìè. Â ðåçóëüòàòå äîñòèãàþò âûõîä ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà àñïàðòà ïîðÿäêà 400 ìã/ë. Âî âðåìÿ âûäåëåíèÿ ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà àñïàðòà îò ôðàãìåíòîâ êëåòîê ðàçáàâëåííûé ïðîäóêò ïðîïóñêàþò ÷åðåç êàòèîíîîáìåííóþ êîëîíêó ñ SP-Sepharose FF (GE Healthcare, Øâåöèÿ) èëè êîëîíêó ñ ñîðáåíòîì ãèäðîôîáíîãî âçàèìîäåéñòâèÿ ïðè ñêîðîñòè îò 60 äî 100 ñì/÷ è pH îò 3 äî 6. Æèäêóþ ñðåäó ôåðìåíòàöèè ðàçáàâëÿþò î÷èùåííîé âîäîé äî òåõ ïîð, ïîêà ïðîâîäèìîñòü íå äîñòèãàåò £12 ìÑì/ñì. Êîëîíêó óðàâíîâåøèâàþò 2 CV ñîëåâîãî áóôåðà, êîòîðûé èìååò ïðîâîäèìîñòü 6 – 12 ìÑì/ñì. Ýëþèðóþò óâåëè÷åíèåì êîíöåíòðàöèè ñîëè â ýëþèðóþùåì áóôåðå îò 0,1 äî 1 Ì NaCl. Àâòîðû ïðåäëàãàþò äâà ñïîñîáà ïðîâåäåíèÿ ôåðìåíòàòèâíîãî ðàñùåïëåíèÿ ïðåäøåñòâåííèêà àñïàðòà. Ôåðìåíòàòèâíûé ïðîöåññ ïðè îäíîâðåìåííîé îáðàáîòêå ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà àñïàðòà òðèïñèíîì è êàðáîêñèïåïòèäàçîé B. Êîíöåíòðàöèþ ïðåäøåñòâåííèêà óñòàíàâëèâàþò (ðàçáàâëÿÿ èëè êîíöåíòðèðóÿ óëüòðàôèëüòðàöèåé) îò 1 äî 10 ìã/ìë ïðè äîáàâëåíèè òðèïñèíà â êîíöåíòðàöèè îò 0,001 äî 0,01 ìã/ìë è êàðáîêñèïåïòèäàçû B â êîíöåíòðàöèè îò 1:500 äî 1:2000, òåìïåðàòóðå îò 20 äî 30°C, pH 9 – 11,5, è ïðîâîäèìîñòè îò 10 äî 25 ìÑì/ñì. Ðåàêöèþ êîíòðîëèðóþò ñ ïîìîùüþ ÂÝÆÕ è ñ÷èòàþò çàâåðøåííîé, êîãäà ñîäåðæàíèå öåëåâîãî âåùåñòâà ñîñòàâëÿåò ïî êðàéíåé ìåðå 75 %. Äâóõýòàïíûé ôåðìåíòàòèâíûé ïðîöåññ. Ïðåäøåñòâåííèê èíñóëèíà àñïàðòà (â êîíöåíòðàöèè îò 1 äî 10 ìã/ìë) îáðàáàòûâàþò âîäíûì ðàñòâîðîì òðèïñèíà â êîíöåíòðàöèè îò 0,01 äî 0,1 ìã/ìë ïðè òåìïåðàòóðå îò 15 äî 30 °Ñ, pH 9 – 11,5, è ïðîâîäèìîñòè îò 10 äî 25 ìÑì/ñì. Ðåàêöèþ êîíòðîëèðóþò ñ ïîìîùüþ ÂÝÆÕ; çàâåðøàþò åå äîáàâëåíèåì 7,5 Ì óêñóñíîé êèñëîòû, êîãäà ñîäåðæàíèå ÷àñòè÷íî ãèäðîëèçîâàííîãî ïîëóïðîäóêòà ñîñòàâëÿåò ïî êðàéíåé ìåðå 75 %. ×àñòè÷íî ãèäðîëèçîâàííûé ïîëóïðîäóêò íàíîñÿò íà êîëîíêó ñ ñèëüíîé êàòèîíîîáìåííîé ñìîëîé è ýëþèðóþò ñ óâåëè÷åíèåì êîíöåíòðàöèè ñîëè â ýëþèðóþùåì áóôåðå îò 0,1 äî 1 Ì NaCl. Ïðîäóêò ãèäðîëèçóþò ðàñòâîðîì êàðáîêñèïåïòèäàçû B ïðè ñîîòíîøåíèè ôåðìåíò – ñóáñòðàò îò 1:200 äî 1:2000. Ðåàêöèþ ïðîâîäÿò îò 4 äî 12 ÷ ïðè òåìïåðàòóðå îò 15 äî 30 °Ñ, pH 9 – 11, è ýëåêòðîïðîâîäíîñòè îò 10 äî 25 ìÑì/ñì. Ãèäðîëèç êîíòðîëèðóþò ÂÝÆÕ è ñ÷èòàþò çàâåðøåííûì, êîãäà ñîäåðæàíèå öåëåâîãî âåùåñòâà ñîñòàâëÿåò 85 – 95 %. Çàòåì àñïàðò î÷èùàþò îò âîçìîæíûõ ïðèìåñíûõ êîìïîíåíòîâ. Ðàñòâîð îáðàçöà íàíîñÿò íà êîëîíêó ñ ñèëüíûì àíèîíèòîì è ýëþèðóþò óâåëè÷åíèåì êîíöåíòðàöèè ñîëè îò 0,1 äî 1 Ì NaCl. Ýëþöèþ êîíòðîëèðóþò ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè ïðè 280 íì è ñ ïîìîùüþ ÂÝÆÕ, ïîñëå ÷åãî âûáèðàþò ôðàêöèè íåîáõîäèìîé ñòåïåíè ÷èñòîòû. Î÷èùåííûå ôðàêöèè êðèñòàëëèçóþò äîáàâëåíèåì 6 % îá. ýòàíîëà, 50 % óêñóñíîé êèñëîòû â ñîîòíîøåíèè 6 ìë íà êàæäûé ãðàìì ïðîäóêòà, pH ïðèäåðæèâàþò îò 6,5 äî 7,2. Çàòåì äîáàâëÿþò 0,2 ã ZnCl2 íà 1 ã ïðîäóêòà. Êðèñòàëëû îòìûâàþò ýòàíîëîì, âûñóøèâàþò ïîä âàêóóìîì äî ïîëó÷åíèÿ ñóõîé ÀÔÑ. 1.4. Òåõíîëîãèÿ ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíîãî èíñóëèíà ãëàðãèíà Îïèñàíà òåõíîëîãèÿ ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíîãî èíñóëèíà ãëàðãèíà ñ èñïîëüçîâàíèåì ìåòèëîòðîôíûõ äðîææåé Pichia pastorus â êà÷åñòâå ïðîäóöåíòà [15]. Åãî ïîëó÷àþò ìåòîäàìè òðàíñôîðìàöèè øòàììà-ðåöèïèåíòà GS115 P. pastorus ïëàçìèäàìè pPIC9K. Ïëàçìèäà ñîäåðæèò ãåí óñòîé÷èâîñòè ê ãåíèòèöèíó äëÿ ïîñëåäóþùåé ñåëåêöèè òðàíñôîðìàíòîâ. Øòàìì êóëüòèâèðóþò â ñðåäå, ñîñòîÿùåé èç îðòîôîñôîðíîé êèñëîòû, ñóëüôàòà êàëèÿ, ãèäðîêñèäà êàëèÿ, ñóëüôàòà ìàãíèÿ, ñóëüôàòà êàëüöèÿ, ãëèöåðèíà è áèîòèíà, â êà÷åñòâå èíäóêòîðà èñïîëüçóþò ìåòàíîë. Â õîäå îòäåëåíèÿ ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà ãëàðãèíà îò ôðàãìåíòîâ êëåòîê ðàçáàâëåííûé ïðîäóêò ïðîïóñêàþò ÷åðåç êîëîííó, óïàêîâàííóþ ñîðáåíòîì SP Sepharose FF (GE Healthcare, Øâåöèÿ) è óðàâíîâåøåííóþ 50 ìÌ óêñóñíîé êèñëîòîé ïðè çíà÷åíèè pH â îáðàçöå 3,8. Ýëþèðóþò àöåòàòîì àììîíèÿ. Öåëåâîé ãëàðãèí ïîëó÷àþò èç ïðåäøåñòâåííèêà ìåòîäîì ôåðìåíòàòèâíîãî ðàñùåïëåíèÿ. Ãèäðîëèç ïðîâîäÿò â ïðèñóòñòâèè âîäîðàñòâîðèìûõ îðãàíè÷åñêèõ ðàñòâîðèòåëåé, òàêèõ êàê ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 25 Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ ÄÌÑÎ, ÄÌÔÀ, ýòàíîë, àöåòîí, àöåòîíèòðèë, ýòèëàöåòàò è äð. (íàèëó÷øèõ ðåçóëüòàòîâ äîáèâàþòñÿ â ÄÌÔÀ è ÄÌÑÎ). Ñîäåðæàíèå îðãàíè÷åñêîãî ðàñòâîðèòåëÿ ñîñòàâëÿåò 40 – 60 % ïî îáúåìó ðåàêöèîííîé ñìåñè. Êîíöåíòðàöèþ ïðåäøåñòâåííèêà ïîääåðæèâàþò ðàâíîé 10 ã/ë (ðàçáàâëÿÿ èëè êîíöåíòðèðóÿ óëüòðàôèëüòðàöèåé) ïðè äîáàâëåíèè òðèïñèíà ñ êîíöåíòðàöèåé 50 ìã/ë. Ïðîöåññ âåäóò ïðè òåìïåðàòóðå 6 ± 2 °Ñ ïðè ìåäëåííîì ïåðåìåøèâàíèè. Ïðåâðàùåíèå êîíòðîëèðóþò êàæäûé ÷àñ, îöåíèâàÿ ïðîöåíòíîå ñîäåðæàíèå ðåêîìáèíàíòíîãî èíñóëèíà ãëàðãèíà è íåïðîðåàãèðîâàâøåãî ïðåäøåñòâåííèêà ñ ïîìîùüþ àíàëèòè÷åñêîãî ìåòîäà ÎÔ ÂÝÆÕ (Ñ18). Ðåàêöèÿ ïðîòåêàåò ìåíåå ÷åì çà 10 ÷. Ãèäðîëèç îñòàíàâëèâàþò äîâåäåíèåì pH äî 5,0 ëåäÿíîé óêñóñíîé êèñëîòîé, êîãäà ïðîöåíò íåãèäðîëèçîâàííîãî ïðåäøåñòâåííèêà ñîñòàâëÿåò ìåíåå 5 %. Âñå òðè ñòàäèè õðîìàòîãðàôè÷åñêîé î÷èñòêè ïðîâîäÿò íà ÂÝÆÕ êîëîííå, óïàêîâàííîé ñîðáåíòîì C8 Daisogel (Daiso, ßïîíèÿ). Íà ïåðâîì ýòàïå î÷èñòêè êîëîííó óðàâíîâåøèâàþò 10 % àöåòîíèòðèëîì (áóôåð Â) â 250 ìÌ óêñóñíîé êèñëîòå (áóôåð À). Ðàñòâîð ïîñëå îáðàáîòêè òðèïñèíîì ðàçáàâëÿþò â 5 ðàç âîäîé. Äëÿ ýëþöèè èñïîëüçóþò ëèíåéíûé ãðàäèåíò ñ ïîâûøåíèåì ñîäåðæàíèÿ áóôåðà Â. Íà âòîðîé ñòàäèè êîëîííó ïðåäâàðèòåëüíî óðàâíîâåøèâàþò 10 % àöåòîíèòðèëîì (áóôåð Â) â 200 ìÌ àöåòàòå íàòðèÿ äî pH 5 (áóôåð À). Ýëþàò ïîñëå ïðåäûäóùåé ñòàäèè äîëæåí ñîäåðæàòü 10 % àöåòîíèòðèëà äëÿ íàíåñåíèÿ íà êîëîííó (äëÿ ÷åãî îáðàçåö ðàçáàâëÿþò áóôåðîì À). Áåëîê ýëþèðóþò áóôåðîì Â â ëèíåéíîì ãðàäèåíòå. Äëÿ çàâåðøàþùåé ñòàäèè î÷èñòêè êîëîííó óðàâíîâåøèâàþò 6 % ýòàíîëîì (áóôåð Â) â 50 ìÌ óêñóñíîé êèñëîòå (áóôåð À). Ýëþàò ïîñëå ïðåäûäóùåé ñòàäèè ðàçáàâëÿþò â 3 ðàçà âîäîé. Ýëþèðóþò áåëîê â ëèíåéíîì ãðàäèåíòå áóôåðà Â. Ïîëó÷àþò öåëåâîé áåëîê ñ âûõîäîì ïðèìåðíî 85 % è ÷èñòîòîé 99,4 % è âûøå. Î÷èùåííûé ñ ïîìîùüþ òðåõ ñòàäèé ÂÝÆÕ ãëàðãèí îñàæäàþò äîáàâëåíèåì áóôåðà ëèìîííîé êèñëîòû (15,4 ã/ë ëèìîííàÿ êèñëîòà, 90 ã/ë ãèäðîôîñôàò íàòðèÿ) è ðàñòâîðà ZnCl2. Äîâîäÿò ðÍ äî 6,3. Ïîñëå îñàæäåíèÿ îñàäîê áåëêà îòäåëÿþò îò íàäîñàäêà öåíòðèôóãèðîâàíèåì è âûñóøèâàþò ïîä âàêóóìîì. Âûõîä âñåãî ïðîöåññà ñîñòàâëÿåò 85 – 90 %; ÷èñòîòà ÀÔÑ îêîëî 99 %. 1.5. Ïîëó÷åíèå èíñóëèíà äåòåìèðà Îïèñàíà òåõíîëîãèÿ ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíîãî èíñóëèíà äåòåìèðà áèîñèíòåçîì â äðîææàõ S. cerevisiae [16]. 26 Äëÿ ýêñïðåññèè öåëåâîãî áåëêà èñïîëüçóþò ïëàçìèäû òèïà Ñ-POT, ñîäåðæàùèå Schizosaccharomyces pombe TPI (triose phosphate isomerase) ãåí c öåëüþ îòáîðà ïëàçìèä, S. cerevisiae TPI ïðîìîòîð è òåðìèíàòîð. Ôðàãìåíò EcoRIXbaI ïëàçìèäû pKFN1003 çàìåíÿåòñÿ íà ôðàãìåíò, êîäèðóþùèé æåëàåìûé ïðåäøåñòâåííèê èíñóëèíà. Øòàìì S. cerevisiae MT663 ñ ïëàçìèäîé âûðàùèâàþò íà ñðåäå YPD â òå÷åíèå 72 ÷ ïðè 30 °Ñ. Âûõîä ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà êîëè÷åñòâåííî îöåíèâàþò ñ ïîìîùüþ ÎÔ ÂÝÆÕ, èñïîëüçóÿ â êà÷åñòâå ñòàíäàðòà ÷åëîâå÷åñêèé èíñóëèí. Âûäåëåíèå îäíîöåïî÷å÷íîãî ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà. Ïîñëå ôåðìåíòàöèè óäàëÿþò êëåòêè äðîææåé öåíòðèôóãèðîâàíèåì. Ïðåäøåñòâåííèê âûäåëÿëè ïîñðåäñòâîì êàòèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè: îáðàçåö íàíîñÿò ïðè pH íèæå pI, ýëþèðóþò ïðè pH âûøå pI; pI ïðåäøåñòâåííèêà 4,5 – 5,5, ñâÿçûâàíèå ñ ñîðáåíòîì ïðîèñõîäèò ïðè pH îêîëî 3, à ýëþöèÿ ïðè pH îêîëî 6 (ýëþåíò — ñìåñü âîäû è ýòàíîëà). Äàëåå ïðîâîäÿò èçîýëåêòðè÷åñêîå îñàæäåíèå èç 17 % ýòàíîëà. Äàëüíåéøåå âûäåëåíèå öåëåâîãî äåòåìèðà âêëþ÷àåò ñëåäóþùèå ñòàäèè: ðàñùåïëåíèå îäíîöåïî÷å÷íîãî ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà ïî îñòàòêó ëèçèíà Â29 ñ ïîìîùüþ ïðîòåàçû Achromobacter lyticus, àöèëèðîâàíèå äâóõöåïî÷å÷íîãî èíòåðìåäèàòà, ðàñùåïëåíèå òðèïñèíîì. Ðàñùåïëåíèå ïðåäøåñòâåííèêà èíñóëèíà ïðîâîäÿò ñëåäóþùèì îáðàçîì. Âíà÷àëå áåëîê äèñïåðãèðóþò â âîäå ñ äîáàâëåíèåì NaOH ïðè pH 9,7. Ê ðàñòâîðó äîáàâëÿþò ïðîòåàçó Achromobacter lyticus (ìàññîâîå ñîîòíîøåíèå áåëêà ê ôåðìåíòó 200:1). Ïîääåðæèâàþò pH â èíòåðâàëå 9,7 – 10,0. Ïðîöåññ ïðîòåêàåò 5 ÷, êîíòðîëèðóþò ñ ïîìîùüþ ÂÝÆÕ. Äëÿ î÷èñòêè ðàñòâîð íàíîñÿò êîëîíêó, ñîäåðæàùóþ ñèëèêàãåëü Ñ18. Ýëþèðóþò â ãðàäèåíòå ýòàíîëà îò 25 äî 33 % îá. çà 12 CV. Äëÿ ðàñòâîðåíèÿ èñïîëüçóþò áóôåð (0,2 Ì KCl, 0,02 Ì CaCl2, 0,01 Ì òðèýòàíîëàìèí, pH 7,4). Öåëåâîé êîìïîíåíò ýëþèðóþò ïîñëå øåñòè CV ýëþåíòà. Öåëåâûå ôðàêöèè îñàæäàþò ïðè pH 5,0 ïðè 4 °Ñ, îñàäîê îòäåëÿþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì. Äâóõöåïî÷å÷íûé èíòåðìåäèàò ðàñòâîðÿþò â ñèñòåìå âîäà–àöåòîíèòðèë (50/50 ïî îáúåìó), pH äîâîäÿò äî 10,4, äîáàâëÿþò N-ãèäðîêñèñóêöèíèìèäíûé ýôèð ìèðèñòèíîâîé êèñëîòû (0,354 ìÌ). Ðåàêöèþ àöèëèðîâàíèÿ îñòàíàâëèâàþò äîáàâëåíèåì ýòàíîëàìèíà. Àíàëèç ÂÝÆÕ ñâèäåòåëüñòâóåò î òîì, ÷òî 94 % ñîåäèíåíèé èìååò çàìåùåíèå â ïîëîæåíèè Â29. Ñâèíîé òðèïñèí (0,5 % ïî îáúåìó ïî îòíîøåíèþ ê äâóõöåïî÷å÷íîìó èíòåðìåäèàòó) ðàñ- ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ òâîðÿþò â âîäå è äîáàâëÿþò ê ðåàêöèîííîé ñìåñè. Äëÿ àíàëèçà ïðîòåêàíèÿ ïðîöåññà èñïîëüçóþò ÎÔ ÂÝÆÕ ïðè íåéòðàëüíûõ çíà÷åíèÿõ pH. Öåëåâîå âåùåñòâî (80 %) ýëþèðîâàëîñü ïîñëå ìîíîçàìåùåííîãî èíòåðìåäèàòà èíñóëèíà â ïîëîæåíèè Â29 è ïåðåä äèçàìåùåííûìè ïðîèçâîäíûìè. Íå áûëè îáíàðóæåíû ïðîäóêòû ðàñùåïëåíèÿ ìåæäó àðãèíèíîì â ïîëîæåíèè Â22 è ãëèöèíîì â ïîëîæåíèè Â23. Ôèíàëüíóþ î÷èñòêó öåëåâîãî áåëêà ïðîâîäÿò ñ ïîìîùüþ àíèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè. Îáðàçåö áåëêà íàíîñÿò íà êîëîíêó, óïàêîâàííóþ ñîðáåíòîì Source 30Q (GE Healthcare, Øâåöèÿ). Ýëþèðóþò áóôåðîì (42,5 % îá. ýòàíîë, 0,02 Ì Òðèñ-HCl, pH 7,5) ñ ëèíåéíûì ãðàäèåíòîì àöåòàòà àììîíèÿ îò 0,03 äî 0,16 Ì. Äåòåìèð ýëþèðóþò ïî÷òè â ñàìîì êîíöå ãðàäèåíòà. ×èñòîòà ïðîäóêòà 99 %. Ê î÷èùåííîìó áåëêó äîáàâëÿþò ðàñòâîð, ñîäåðæàùèé 0,02 Ì àììèàê, 0,06 % ïî îáúåìó ôåíîë, 1 ìÌ àöåòàò öèíêà; äîâîäÿò pH äî 8,0; îñàæäàþò ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå â òå÷åíèå 18 ÷ è çàòåì ïðè 4 °Ñ â òå÷åíèå 18 ÷. Ïðîäóêò îòäåëÿþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì, îòìûâàþò õîëîäíîé âîäîé è âûñóøèâàþò ïîä âàêóóìîì. Âûõîä ïîñëå òðåõ ñòàäèé ñîñòàâëÿåò 50 %; ÷èñòîòà îêîëî 99,5 %. 2. ÈÍÒÅÐÔÅÐÎÍ ÁÅÒÀ ×åëîâå÷åñêèé èíòåðôåðîí áåòà (ðÈÍÔ áåòà) ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ãëèêîïðîòåèí ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé îêîëî 20 êÄà. Ïåïòèäíàÿ ÷àñòü ðÈÍÔ áåòà ïðåäñòàâëåíà 166 à.î. è ñîäåðæèò òðè öèñòåèíîâûõ àìèíîêèñëîòíûõ îñòàòêà, äâà èç êîòîðûõ îáðàçóþò îäèí âíóòðèìîëåêóëÿðíûé äèñóëüôèäíûé ìîñòèê. ðÈÍÔ áåòà îáëàäàåò èììóíîìîäóëèðóþùåé, àíòèïðîëèôåðàòèâíîé, àíòèâèðóñíîé è àíòèìèêðîáíîé àêòèâíîñòüþ. Ñóùåñòâóþò ëåêàðñòâåííûå ôîðìû íà îñíîâå ðÈÍÔà áåòà-1à, â ÷àñòíîñòè Àâîíåêñ (Gedeon Richter, Âåíãðèÿ). ÐÈÍÔ áåòà-1à ïîëíîñòüþ èäåíòè÷åí ïðèðîäíîìó ðÈÍÔ áåòà, îí ãëèêîçèëèðîâàí è èìååò ïðèðîäíóþ ÀÊ-ïîñëåäîâàòåëüíîñòü. Óñòàíîâëåíî, ÷òî ãëèêîçèëèðîâàíèå íå ÿâëÿåòñÿ îáÿçàòåëüíûì äëÿ áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòè ðÈÍÔ áåòà, ïîýòîìó ãîðàçäî âûãîäíåå èñïîëüçîâàíèå áàêòåðèàëüíîé ýêñïðåññèè âçàìåí äîðîãîñòîÿùåé ýêñïðåññèè â êëåòêàõ ìëåêîïèòàþùèõ. ÐÈÍÔ áåòà-1b ÷åëîâåêà — ýòî èñêóññòâåííî ñîçäàííàÿ, àäàïòèðîâàííàÿ äëÿ ýêñïðåññèè â áàêòåðèÿõ, íåãëèêîçèëèðîâàííàÿ ôîðìà ðÈÍÔ áåòà. Îò ïðèðîäíîãî áåëêà îí îòëè÷àåòñÿ çàìåíîé öèñòåèíà â ïîëîæåíèè 17 íà ñåðèí è äåëå- öèåé N-êîíöåâîãî ìåòèîíèíà. Òàêàÿ çàìåíà óñòðàíÿåò ïðè÷èíó îáðàçîâàíèÿ äèìåðîâ çà ñ÷åò äèñóëüôèäíûõ ñâÿçåé, ÷òî ñóùåñòâåííî óïðîùàåò òåõíîëîãèþ ïîëó÷åíèÿ ëåêàðñòâåííûõ ïðåïàðàòîâ íà åãî îñíîâå [17]. Íà ìèðîâîì ðûíêå íàèáîëüøåå ðàñïðîñòðàíåíèå ïîëó÷èë ïðåïàðàò ðåêîìáèíàíòíîãî ðÈÍÔà áåòà-1b ïîä òîðãîâîé ìàðêîé Áåòàôåðîí (Schering AG, Ãåðìàíèÿ). 2.1. Ïðîöåññ «up-stream» Ñóùåñòâóåò íåñêîëüêî ñïîñîáîâ ïîëó÷åíèÿ ðÈÍÔ áåòà, è âñå îíè íå ëèøåíû íåäîñòàòêîâ. Íàïðèìåð, ïîëó÷åíèå ðåêîìáèíàíòíîãî ðÈÍÔà áåòà-1à â êëåòêàõ ÿè÷íèêà êèòàéñêèõ õîìÿ÷êîâ õàðàêòåðèçóåòñÿ äëèòåëüíûì âðåìåíåì ýêñïðåññèè (4 – 6 ñóòîê) è íèçêèì âûõîäîì öåëåâîãî áåëêà (200 – 600 ìëí Åä/ë êóëüòóðû êëåòîê) [18]. Èçâåñòåí ñïîñîá ïîëó÷åíèÿ ðÈÍÔà áåòà-1b ïîñðåäñòâîì êîíñòðóèðîâàíèÿ ïëàçìèäû pSY2501 è ïðîäóöåíòà, ïîëó÷åííîãî òðàíñôîðìàöèåé øòàììà E. coli MM294 ýòîé ïëàçìèäîé [19, 20]. Ïëàçìèäà pSY2501 íåñåò ïîä òðèïòîôàíîâûì ïðîìîòîðîì ïðèðîäíûé ãåí ðÈÍÔ áåòà ñ çàìåíîé Ò ® À äëÿ çàìåíû öèñòåèíà 17 íà ñåðèí. Íåäîñòàòêàìè ïëàçìèäû pSY2501 è ïðîäóöåíòà íà åå îñíîâå ÿâëÿþòñÿ ìóòèðîâàííûé ïðèðîäíûé ãåí ðÈÍÔ áåòà è òðèïòîôàíîâûé ïðîìîòîð. Ïðèðîäíûé ãåí ñîäåðæèò ðåäêî âñòðå÷àþùèåñÿ â ãåíàõ Escherichia coli (ìèíîðíûå) êîäîíû, ÷òî ïðèâîäèò ê ñíèæåíèþ óðîâíÿ áèîñèíòåçà áåëêà, ñîñòàâëÿþùåãî 600 ìëí Åä/ë êóëüòóðû êëåòîê. Èñïîëüçîâàíèå òðèïòîôàíîâîãî ïðîìîòîðà îãðàíè÷èâàåò èñïîëüçîâàíèå ïèòàòåëüíûõ ñðåä äëÿ ôåðìåíòàöèè òîëüêî ñðåäàìè, íå ñîäåðæàùèìè òðèïòîôàí, è çíà÷èòåëüíî óâåëè÷èâàåò âðåìÿ ôåðìåíòàöèè (äî 15 – 25 ÷). Èçâåñòåí ñïîñîá ïîëó÷åíèÿ ðÈÍÔ áåòà-1b ñ ïîìîùüþ âûñîêîïðîäóêòèâíîãî øòàììà E. ñoli BDEES6, òðàíñôîðìèðîâàííîãî ðåêîìáèíàíòíîé ïëàçìèäíîé ÄÍÊ pES6-1 (ðèñ. 3), ïîçâîëÿþùåãî ïîëó÷àòü öåëåâîé áåëîê ñ âûñîêèì âûõîäîì (170 – 200 ìã, 5,3 – 6,4 ìëðä Åä/ë êóëüòóðû êëåòîê) è ïî óïðîùåííîé òåõíîëîãèè çà ñ÷åò óìåíüøåíèÿ îáùåãî âðåìåíè ôåðìåíòàöèè äî 8 ÷ [21]. Ïîäîáíûõ ðåçóëüòàòîâ óäàëîñü äîñòè÷ü ñ ïîìîùüþ êîíñòðóèðîâàíèÿ ïëàçìèäû, ñîäåðæàùåé îïòèìàëüíûå ðåãóëÿòîðíûå ýëåìåíòû, êîíòðîëèðóþùèå ýêñïðåññèþ áåëêà. Îíà ñîñòîèò èç èñêóññòâåííîãî ãåíà ðÈÍÔ áåòà-1b, ôëàíêèðîâàííîãî ñàéòàìè ðåñòðèêòàç NdeI è HindIII, NdeI/HindIII-ôðàãìåíòà ÄÍÊ ïëàçìèäû ðÅÒ22b(+), ñîäåðæàùåãî ïðîìîòîð è âûñîêîýôôåêòèâíûé òåðìèíàòîð òðàíñêðèïöèè Ò7-ÐÍÊïîëèìåðàçû è óñèëèòåëü òðàíñëÿöèè ãåíà 10 ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 27 Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ Ðèñ. 3. Ñõåìà ðåêîìáèíàíòíîé ïëàçìèäû pES6-1. ôàãà Ò7, à òàêæå ãåí áåòà-ëàêòàìàçû, äåòåðìèíèðóþùåé óñòîé÷èâîñòü òðàíñôîðìèðîâàííûõ ïëàçìèäîé pES6-1 êëåòîê Å. coli ê àìïèöèëëèíó. Êëåòêè ïðîäóöåíòà âûðàùèâàþò ïðè 37 °Ñ â 100 ìë YT-áóëüîíà (ðÍ 7,0) ñ 50 ìêã/ìë àìïèöèëëèíà â òå÷åíèå 2 ÷ íà êà÷àëêå ñî ñêîðîñòüþ âðàùåíèÿ 190 îá./ìèí äî îïòè÷åñêîé ïëîòíîñòè À550 0,7 – 0,8, çàòåì ââîäÿò èíäóêòîð (èçîïðîïèëòèî-áåòà-D-ãàëàêòîçèä, ÈÏÒÃ) äî êîíöåíòðàöèè 0,2 ìÌ è ïðîäîëæàþò ïðîöåññ åùå 6 ÷; òàêèì îáðàçîì, îáùåå âðåìÿ ôåðìåíòàöèè ñîñòàâëÿåò 8 ÷. Øòàìì-ïðîäóöåíòà E. coli BDEES6/pES6-1 îáåñïå÷èâàåò ñèíòåç ðåêîìáèíàíòíîãî ðÈÍÔà áåòà-1b â êîëè÷åñòâå 10 – 12 % îò ñóììàðíîãî ñîäåðæàíèÿ áåëêà êëåòîê. 2.2. Ýòàïû «downstream» Èçâåñòåí ñïîñîá î÷èñòêè ðÈÍÔ áåòà-1b ñ èñïîëüçîâàíèåì äåòåðãåíòà äîäåöèëñóëüôàòà íàòðèÿ ïðè ïîëó÷åíèè áåëêà â âèäå òåë âêëþ÷åíèÿ [22]. Îäíàêî äàííîå ñîåäèíåíèå âûçûâàåò çíà÷èòåëüíóþ äåíàòóðàöèþ öåëåâîãî áåëêà, åãî íå óäàåòñÿ óäàëèòü èç ðàñòâîðà, ÷òî â ñâîþ î÷åðåäü äåëàåò íåâîçìîæíîé ïîñëåäóþùóþ èîíîîáìåííóþ õðîìàòîãðàôèþ, íåîáõîäèìóþ äëÿ äàëüíåéøåé î÷èñòêè áåëêà. Èñïîëüçîâàíèå â êà÷åñòâå äåòåðãåíòà öâèòòåðãåíòà 3 – 14 ïîçâîëÿåò èçáåæàòü óêàçàííûõ íåäîñòàòêîâ [23]. Çàÿâëÿåìûé â ðàáîòå [24] ñïîñîá î÷èñòêè ðåêîìáèíàíòíîãî ðÈÍÔ áåòà-1b èç òåë âêëþ÷åíèÿ E. coli ïðåäóñìàòðèâàåò îïòèìèçàöèþ ñòàäèé îòìûâêè òåë âêëþ÷åíèÿ, ðàñòâîðåíèÿ è ðåôîëäèíãà öåëåâîãî áåëêà, äàëåå ìíîãîñòàäèéíóþ õðîìàòîãðàôè÷åñêóþ î÷èñòêó. Â õîäå îòìûâêè ðàçìîðîæåííûå òåëà âêëþ÷åíèÿ ðåñóñïåíäèðóþò â 2 %-íîì âîäíîì ðàñòâîðå öâèòòåðãåíòà 3 – 14 ñ ïîñëåäóþùèì óäàëåíèåì íåðàñòâîðèâøåãîñÿ ìàòåðèàëà öåíòðè- 28 ôóãèðîâàíèåì. Â ïðîöåññå ðàñòâîðåíèÿ òåë âêëþ÷åíèÿ èñïîëüçóþò áóôåð ñëåäóþùåãî ñîñòàâà: 7 Ì ãóàíèäèí-ãèäðîõëîðèä, 20 ìÌ äèòèîòðåèòîë (DTT) è 0,5 ìÌ ôåíèëìåòàíñóëüôîíèëôòîðèä (PMSF). Ðàñòâîð äëÿ ðåôîëäèíãà öåëåâîãî áåëêà ñîäåðæàë 20 ìÌ Òðèñ-HCl, pH 9,0, 0,2 % ïîëèýòèëåíãëèêîëü (PEG) 3550, 300 ìÌ NaCl, 2 ìÌ âîññòàíîâëåííîãî ãëóòàòèîíà (GSH), 1 ìÌ îêèñëåííîãî ãëóòàòèîíà (GSSG), 2 ìÌ ýòèëåíäèàìèíòåòðàóêñóñíîé êèñëîòû (ÝÄÒÀ), 0,05 % öâèòòåðãåíòà 3 – 14. Ðàñòâîðåííûå òåëà âêëþ÷åíèÿ èíêóáèðóþò â ïîëó÷åííîì ðàñòâîðå ïðè 10 °Ñ â òå÷åíèå íî÷è. Â õîäå ïðåäõðîìàòîãðàôè÷åñêîé ïîäãîòîâêè îáðàçöà èñïîëüçóþò áóôåð ñëåäóþùåãî ñîñòàâà: 25 ìÌ Òðèñ-HCl, pH 8,0, 0,05 % öâèòòåðãåíò 3 – 14, 0,5 ìÌ PMSF, äëÿ ðàçâåäåíèÿ îáðàçöà ïåðåä íàíåñåíèåì íà êîëîíêó. Â ïðîöåññå õðîìàòîãðàôèðîâàíèÿ èñïîëüçóþò áóôåðû: à) 25 ìÌ Òðèñ-HCl, pH 8,0, 0,05 % öâèòòåðãåíò 3 – 14, 0,5 ìÌ PMSF; á) 25 ìÌ Òðèñ-HCl, pH 8,0, 50 ìÌ NaCl, 0,05 % öâèòòåðãåíò 3 – 14, 0,5 ìÌ PMSF; â) 25 ìÌ Òðèñ-HCl, pH 8,0, 1 Ì NaCl, 0,05 % öâèòòåðãåíò 3 – 14, 0,5 ìÌ PMSF. Õðîìàòîãðàôè÷åñêàÿ î÷èñòêà ðåêîìáèíàíòíîãî áåëêà âêëþ÷àåò â ñåáÿ íåñêîëüêî ñòàäèé: êàòèîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ íà HyperD Ceramic S (Pall, ÑØÀ), çàòåì íà Source S30 (GE Healthcare, Øâåöèÿ); ãåëü-ôèëüòðàöèÿ îêèñëåííîãî áåëêà íà Superdex 75 Prep grade (GE Healthcare, Øâåöèÿ); àíèîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ íà Source Q30 (GE Healthcare, Øâåöèÿ) è ôèíàëüíàÿ ãåëü-ôèëüòðàöèÿ íà Sephacryl S200HR (GE Healthcare, Øâåöèÿ). Ïîäãîòîâëåííûé îáðàçåö ðàñòâîðåííûõ òåë âêëþ÷åíèÿ íàíîñÿò (3 ìë/ìèí) íà êîëîíêó HyperD Ceramic S, óðàâíîâåøåííóþ 10 CV áóôåðà (à). Îïòè÷åñêóþ ïëîòíîñòü ýëþàòà êîíòðîëèðóþò ñïåêòðîôîòîìåòðè÷åñêè ïðè äëèíå âîëíû 280 íì. Ïðîñêîê â îáúåìå íàíåñåííîãî îáðàçöà ñîáèðàþò, è ñâÿçàâøèåñÿ ïðèìåñíûå âåùåñòâà óäàëÿþò ïðîìûâêîé 3 CV áóôåðà (â). Ïîðöèþ îáðàçöà íàíîñÿò íà êîëîíêó Source S30 (10/100 ìì, ìàêñèìàëüíîå äàâëåíèå 30 àòì, 2,5 ìë/ìèí), óðàâíîâåøåííóþ 10 îáúåìàìè áóôåðà (à), ñîáèðàÿ ïðîñêîê. Êîëîíêó ïðîìûâþò 2 – 5 îáúåìàìè áóôåðà (à) è ýëþèðóþò ñâÿçàâøèéñÿ ìàòåðèàë ãðàäèåíòîì êîíöåíòðàöèè NaCl (0 – 500 ìÌ, 5 îáúåìîâ êîëîíêè, 3 ìë/ìèí). Ñîáèðàþò ôðàêöèþ, âûõîäÿùóþ â 150 – 200 ìÌ NaCl. Ïåðåä íàíåñåíèåì ñëåäóþùåé ïîðöèè îáðàçöà êîëîíêó ðåãåíåðèðóþò 1 îáúåìîì 100 ìÌ NaOH è óðàâíîâåøèâàþò ñòàðòîâûì áóôåðîì (à). Ïðîöåäóðó ïîâòîðÿþò äëÿ îáúåäèíåííîãî ïðîñêîêà ñ êîëîíêè Source S30. ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ Ñîáðàííûå ôðàêöèè ðÈÍÔ áåòà-1b îáúåäèíÿþò è â ïîëó÷åííûé ðàñòâîð äîáàâëÿþò öèñòåàìèí/öèñòàìèí äî êîíöåíòðàöèè 1/0,1 ìÌ. Îáðàçåö èíêóáèðóþò â òå÷åíèå íî÷è ïðè 4 °Ñ, öåíòðèôóãèðóþò (12000g, 4 °Ñ, 10 ìèí), è ñóïåðíàòàíò êîíöåíòðèðóþò íà óëüòðàôèëüòðàöèîííîé ìåìáðàíå ÐÌ-10 (Amicon, ÑØÀ). Îáðàçåö îêèñëåííîãî ðÈÍÔ áåòà-1b íàíîñÿò íà êîëîíêó Superdex 75 Prep grade (16/500 ìì, 13000 ò.ò./ì, ìàêñèìàëüíîå äàâëåíèå 5 àòì), óðàâíîâåøåííóþ áóôåðîì (á). Ãåëü-ôèëüòðàöèþ ïðîâîäÿò â áóôåðå (á) ïðè ñêîðîñòè 30 ñì/÷. Îáðàçåö ðÈÍÔ áåòà-1b íàíîñÿò íà êîëîíêó Source Q30 (10/100 ìì, ìàêñèìàëüíîå äàâëåíèå 30 àòì, 2,5 ìë/ìèí), óðàâíîâåøåííóþ 10 CV áóôåðà (á), ñîáèðàÿ ïðîñêîê. Êîëîíêó ïðîìûâàþò 2 – 5 CV áóôåðà (á) è ýëþèðóþò ñâÿçàâøèéñÿ ìàòåðèàë ãðàäèåíòîì êîíöåíòðàöèè NaCl (50 – 1000 ìÌ, 10 îáúåìîâ êîëîíêè, 4 ìë/ìèí). Ñîáèðàþò ôðàêöèþ, âûõîäÿùóþ â 200 – 300 ìÌ NaCl. Ñîáðàííóþ ôðàêöèþ êîíöåíòðèðóþò íà óëüòðàôèëüòðàöèîííîé ìåìáðàíå ÐÌ-10. Îáðàçåö ðÈÍÔ áåòà-1b (1 ìë) íàíîñÿò íà êîëîíêó Sephacryl S200HR (16/600 ìì, >5000 ò.ò./ì, ìàêñèìàëüíîå äàâëåíèå 1,5 àòì), óðàâíîâåøåííóþ áóôåðîì (á). Ðàçäåëåíèå ïðîâîäÿò â áóôåðå (á) ïðè ñêîðîñòè 15 ñì/÷. Ïðîäåìîíñòðèðîâàíî, ÷òî òàêîé ñïîñîá î÷èñòêè ïîçâîëÿåò ïîëó÷èòü ñóáñòàíöèþ ðÈÍÔ áåòà-1b ñî ñëåäóþùèìè ïîêàçàòåëÿìè: âûõîä öåëåâîãî áåëêà — 10 %; ñîäåðæàíèå àãðãåãàòîâ (àíàëèç: ãåëü-ôèëüòðàöèÿ) — <5 %; ðîäñòâåííûå áåëêè (àíàëèç: ÎÔ ÂÝÆÕ, ÄÑÍ-ÏÀÀÃ) — <5 %; áåëêè øòàììà-ïðîäóöåíòà (àíàëèç: ÈÔÀ) — <5 íã/ìã; ýíäîòîêñèíû (àíàëèç: ËÀË-òåñò) — <5 ÝÅ/ìã; óäåëüíàÿ àêòèâíîñòü — 32 ìëí ÌÅ/ìã. 3. ÈÌÈÃËÞÖÅÐÀÇÀ Áîëåçíü Ãîøå — íàèáîëåå ÷àñòàÿ ôîðìà íàñëåäñòâåííûõ ôåðìåíòîïàòèé, îáúåäèíåííûõ â ãðóïïó ëèçîñîìíûõ áîëåçíåé íàêîïëåíèÿ [25]. Â îñíîâå çàáîëåâàíèÿ — íàñëåäñòâåííûé äåôèöèò àêòèâíîñòè b-ãëþêîöåðåáðîçèäàçû — ëèçîñîìíîãî ôåðìåíòà, ó÷àñòâóþùåãî â äåãðàäàöèè ïðîäóêòîâ êëåòî÷íîãî ìåòàáîëèçìà. Îòñóòñòâèå èëè íèçêàÿ àêòèâíîñòü êèñëîé b-ãëþêîöåðåáðîçèäàçû ïðèâîäèò ê íàêîïëåíèþ â ëèçîñîìàõ ìàêðîôàãîâ íåóòèëèçèðîâàííûõ ëèïèäîâ è îáðàçîâàíèþ õàðàêòåðíûõ êëåòîê íàêîïëåíèÿ, èëè êëåòîê Ãîøå. Êëèíè÷åñêèå ñèìïòîìû âêëþ÷àþò ñåðüåçíóþ ãåïàòîñïëåíîìåãàëèþ, àíåìèþ, òðîìáîöèòîïåíèþ è ïîâðåæäåíèå ñêåëåòà. Ëå÷åíèå áîëåçíè Ãîøå çàêëþ÷àåòñÿ â ïîæèçíåííîì íàçíà÷åíèè çàìåñòèòåëüíîé ôåð- ìåíòíîé òåðàïèè ðåêîìáèíàíòíîé ãëþêîöåðåáðîçèäàçîé (rGCR, èìèãëþöåðàçà, Öåðåçèì™). Ïîñêîëüêó ôàãîöèòû èìåþò ðåöåïòîðû ìàííîçû, êîòîðûå ðàñïîçíàþò ãëèêîïðîòåèíû è ãëèêîïåïòèäû ñ îëèãîñàõàðèäíûìè öåïÿìè, íà êîíöå êîòîðûõ ðàñïîëîæåíû îñòàòêè ìàííîçû, óãëåâîäíîå ìîäèôèöèðîâàíèå ãëþêîöåðåáðîçèäàçû (íåçàùèùåííûå êîíöåâûå îñòàòêè ìàííîçû) óëó÷øèëî íàöåëèâàíèå ôåðìåíòà íà äàííûå êëåòêè [26]. Ãëèêîçèëèðîâàíèå èãðàåò ðåøàþùóþ ðîëü â ôåðìåíòàòèâíîé àêòèâíîñòè GCR. Îíî îêàçûâàåò ÷ðåçâû÷àéíîå âëèÿíèå íà àêòèâíîñòü, ñêëàä÷àòîñòü, ñòàáèëüíîñòü, ðàñòâîðèìîñòü, âîñïðèèì÷èâîñòü ê ïðîòåàçàì, ñêîðîñòü âûâåäåíèÿ èç êðîâè è àíòèãåííûé ïîòåíöèàë áåëêîâ. Ôåðìåíò GCR ÷åëîâåêà ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ìîíîìåðíûé ãëèêîïðîòåèí, â ñîñòàâ êîòîðîãî âõîäÿò 497 à. î. è 4 ñàéòà ãëèêîçèëèðîâàíèÿ [27]. Áåëêè äëÿ ôàðìàöåâòè÷åñêîãî ïðèìåíåíèÿ òðàäèöèîííî ïðîäóöèðóþòñÿ â ñèñòåìàõ ýêñïðåññèè ìëåêîïèòàþùèõ è áàêòåðèé. Óñòàíîâëåíî, ÷òî GCR, ýêñïðåññèðóåìûé â E. coli, íå ÿâëÿåòñÿ àêòèâíûì èç-çà îòñóòñòâèÿ ïîñòòðàíñëÿöèîííûõ ìîäèôèêàöèé â ýòîé ñèñòåìå. Â ïîñëåäíåå äåñÿòèëåòèå ðàçðàáîòàíà íîâàÿ ñèñòåìà ýêñïðåññèè â ðàñòåíèÿõ. Â äàííîé ìåòîäîëîãèè èñïîëüçóåòñÿ Agrobacterium — áàêòåðèÿ, ñïîñîáíàÿ âñòðàèâàòü ìîëåêóëû îòäåëüíûõ öåïåé ÄÍÊ (òÄÍÊ) â ðàñòèòåëüíûé ãåíîì. Âñëåäñòâèå îòíîñèòåëüíîé ïðîñòîòû ââåäåíèÿ ãåíîâ äëÿ ìàññîâîãî ïðîäóöèðîâàíèÿ áåëêîâ è ïåïòèäîâ äàííàÿ ìåòîäîëîãèÿ ñòàíîâèòñÿ âñå áîëåå ïîïóëÿðíîé â êà÷åñòâå àëüòåðíàòèâíîé ñèñòåìû ýêñïðåññèè áåëêà [28]. Íî ïðè ïðîäóöèðîâàíèè â ðàñòåíèÿõ ñëåäóåò ïðèíèìàòü âî âíèìàíèå ïîòåíöèàëüíûå ðàçâåòâëåíèÿ ðàñòèòåëüíîãî ãëèêîçèëèðîâàíèÿ [26]. Îïèñàí ñïîñîá ïîëó÷åíèÿ èç òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê ìîðêîâè, òàêæå èçâåñòíû ñïîñîáû ïîëó÷åíèÿ èìèãëþöåðàçû èç ìåæêëåòî÷íîé æèäêîñòè òàáàêà, â êëåòêàõ íàñåêîìûõ (ñ äàëüíåéøåé ìîäèôèêàöèåé îëèãîñàõàðèäîì), â êëåòêàõ ÿè÷íèêîâ êèòàéñêîãî õîìÿ÷êà. 3.1. Ïðîèçâîäñòâî èìèãëþöåðàçû èç òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòîê ìîðêîâè Âåêòîð ýêñïðåññèè öåëåâîãî áåëêà ñîñòîèò èç ôðàãìåíòà ïëàçìèäû pGREENII, ñîäåðæàùåãî ãåí NPTII, ïðèäàþùåãî óñòîé÷èâîñòü ê êàíàìèöèíó è êàññåòû ýêñïðåññèè CE-T, ñîäåðæàùåé èñêóññòâåííûé ãåí GCR è òàêèå ðåãóëÿòîðíûå ýëåìåíòû, êàê NOS (íîïàëèí-ñèíòåòàçà) ïðîìîòîð, ýíõàíñåð è òåðìèíàòîð òðàíñêðèïöèè [26]. Òðàíñôîðìàöèþ êëåòîê ìîðêîâè ïðåäâàðèòåëüíî ïðîâîäÿò ñ èñïîëüçîâàíèåì Agrobacteri- ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 29 Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ um â êà÷åñòâå íîñèòåëÿ âåêòîðà ýêñïðåññèè [29]. Ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûå êëåòêè ìîðêîâè âûñåâàþò íà àãàðîâîé ñðåäå Murashige è Skoog, ñîäåðæàùåé àíòèáèîòèêè äëÿ îòáîðà òðàíñôîðìàíòîâ. Ñðåäè ðàçëè÷íûõ ïðîòåñòèðîâàííûõ êàëëóñîâ îäèí áûë îòîáðàí äëÿ ìàñøòàáèðîâàííîãî ðîñòà è î÷èñòêè áåëêà. Êëåòêè êóëüòèâèðóþò ïðè âñòðÿõèâàíèè â êîëáàõ Ýðëåíìåéåðà äî òåõ ïîð, ïîêà îáùèé îáúåì íå îêàçûâàåòñÿ äîñòàòî÷íûì äëÿ èíîêóëèðîâàíèÿ áèîðåàêòîðà. Íà 17-é äåíü êóëüòèâèðîâàíèÿ, êîãäà êîëè÷åñòâî ïðîäóöèðîâàíèÿ rGCR â êëåòêàõ ìîðêîâè äîñòèãàåò ìàêñèìóìà, êëåòêè ñîáèðàþò, ôèëüòðóÿ êóëüòóðó ÷åðåç ñåòêó ñ äèàìåòðîì ÿ÷ååê 150 ìêì (òàêæå ìîæíî èñïîëüçîâàòü öåíòðèôóãèðîàâíèå). Îñàäîê êëåòîê, ñîäåðæàùèõ rGCR, ìîæíî õðàíèòü â çàìîðîæåííîì ñîñòîÿíèè. 3.2. Ñòàäèè î÷èñòêè Óñòàíîâëåíî, ÷òî rGCR, ýêñïðåññèðóåìàÿ â òðàíñôîðìèðîâàííûõ êëåòêàõ ìîðêîâè, ñâÿçàíà ñ âíóòðåííèìè ìåìáðàíàìè êëåòîê è íå âûäåëÿåòñÿ â ñðåäó [26]. Ìåõàíè÷åñêè ðàçðóøåííûå êëåòêè îñòàâëÿþò rGCR, ñâÿçàííóþ ñ íåðàñòâîðèìûìè äåáðèñàìè ìåìáðàíû; rGCR ðàñòâîðÿþò ñ èñïîëüçîâàíèåì ìÿãêèõ äåòåðãåíòîâ è îòäåëÿþò îò êëåòî÷íûõ äåáðèñîâ è äðóãèõ íåðàñòâîðèìûõ êîìïîíåíòîâ öåíòðèôóãèðîâàíèåì. Ðàñòâîðèìûé ôåðìåíò äàëåå î÷èùàþò ñ èñïîëüçîâàíèåì êàòèîíîîáìåííîé è ãèäðîôîáíîé õðîìàòîãðàôèè. Äëÿ îòäåëåíèÿ ñðåäû îò íåðàñòâîðèìîé rGCR çàìîðîæåííûé îñàäîê êëåòîê îòòàèâàþò ñ ïîñëåäóþùèì öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 17000g â òå÷åíèå 20 ìèí ïðè 4 °Ñ. Íåðàñòâîðèìûå ìàòåðèàëû è íåðàçðóøåííûå êëåòêè ïðîìûâàþò ñ ïîìîùüþ ïîâòîðíîãî ñóñïåíäèðîâàíèÿ â áóôåðå (20 ìÌ ôîñôàòà íàòðèÿ, pH 7,2, 20 ìÌ ÝÄÒÀ) è îñàæäåíèÿ öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 17000g â òå÷åíèå 20 ìèí ïðè 4 °Ñ; rGCR ýêñòðàãèðóþò è ñîëþáèëèçèðóþò ãîìîãåíèçàöèåé îñàäêà â ýêñòðàãèðóþùåì áóôåðå (20 ìÌ ôîñôàòà íàòðèÿ, pH 7,2, 20 ìÌ ÝÄÒÀ, 1 ìÌ PMSF, 20 ìÌ àñêîðáèíîâîé êèñëîòû, 3,8 ã ïîëèâèíèëïèððîëèäîíà (PVPP), 1 ìÌ DTT, 1 % Tritonx-100). Ãîìîãåíàò âñòðÿõèâàþò â òå÷åíèå 30 ìèí ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå è îñâåòëÿþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 17000g â òå÷åíèå 20 ìèí ïðè 4 °Ñ; pH ñóïåðíàòàíòà äîâîäÿò äî 5,5 äîáàâëåíèåì êîíöåíòðèðîâàííîé ëèìîííîé êèñëîòû. Ìóòíîñòü, âîçíèêàþùóþ ïîñëå äîâåäåíèÿ pH, óáèðàþò öåíòðèôóãèðîâàíèåì â òåõ æå óñëîâèÿõ, êàê îïèñàíî âûøå. Íà ïåðâîé ñòàäèè î÷èñòêè îñâåòëåííûé ýêñòðàêò íàíîñÿò íà êîëîíêó (2,6 ´ 20 ñì), ñîäåðæàùóþ ñèëüíûé êàòèîíèò Macro-Prep high-S 30 (Bio-Rad, ÑØÀ), óðàâíîâåøåííûé ñèñòåìîé (25 ìÌ öèòðàò íàòðèÿ, pH 5,5). Êîíòðîëü ïðîâîäèìîñòè, pH è ïîãëîùåíèÿ ïðîâîäÿò ïðè 280 íì. Îáðàçåö íàíîñÿò ïðè ñêîðîñòè 20 ìë/ìèí, ïîñëå ÷åãî êîëîíêó ïðîìûâàþò óðàâíîâåøèâàþùèì áóôåðîì (25 ìÌ áóôåð öèòðàòà íàòðèÿ, pH 5,5) ïðè ñêîðîñòè ïîòîêà 12 ìë/ìèí. Ýëþèðóþò rGCR ñ èñïîëüçîâàíèåì áóôåðà, ñîäåðæàùåãî 600 ìÌ NaCl. Ñîáðàííûå ôðàêöèè ðàçáàâëÿþò âîäîé (1:5), ñîäåðæàùåé 5 % ýòàíîëà, è äîâîäÿò pH äî 6,0 ñ èñïîëüçîâàíèåì NaOH. Äàëåå îáðàçåö íàíîñÿò íà âòîðóþ êîëîíêó (1,6 ´ 20 ñì), óïàêîâàííóþ òåì æå ñîðáåíòîì. Êîëîíêó óðàâíîâåøèâàþò 20 ìÌ öèòðàòíîãî áóôåðà, pH 6,0, ñîäåðæàùåãî 5 % ýòàíîëà. Ïîñëå çàãðóçêè îáðàçöà êîëîíêó ïðîìûâàþò óðàâíîâåøèâàþùèì áóôåðîì è rGCR ýëþèðóþò áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 20 ìÌ öèòðàòíîãî áóôåðà, pH 6,0, 5 % ýòàíîëà è 1 Ì NaCl. Ñîáðàííûå ôðàêöèè ïîñëå âòîðîé ñòàäèè î÷èñòêè íàíîñÿò íà êîëîíêó (1,6 ´ 20 ñì), óïàêîâàííóþ ñîðáåíòîì Toypearl Phenyl-650C (Tosoh, ßïîíèÿ). Êîëîíêó óðàâíîâåøèâàþò 10 ìÌ öèòðàòíîãî áóôåðà, pH 6,0, ñîäåðæàùåãî 5 % ýòàíîëà. Îáðàçåö íàíîñÿò ïðè ñêîðîñòè 6 ìë/ìèí ñ ïîñëåäóþùåé ïðîìûâêîé óðàâíîâåøèâàþùèì áóôåðîì. rGCR ýëþèðóþò 10 ìÌ öèòðàòíûì áóôåðîì, ñîäåðæàùèì 50 % ýòàíîëà, îáúåäèíÿþò ÷èñòûå ôðàêöèè è õðàíÿò ïðè –20 °Ñ. ×èñòîòà ïîëó÷åííîãî áåëêà ñîñòàâëÿëà áîëåå 95 %. 4. ÀËÜÒÅÏËÀÇÀ Àëüòåïëàçà — íåïàòåíòîâàííîå ìåæäóíàðîäíîå íàèìåíîâàíèå ðåêîìáèíàíòíîãî ÷åëîâå÷åñêîãî òêàíåâîãî àêòèâàòîðà ïëàçìèíîãåíà, îñíîâíûìè ïðîèçâîäèòåëÿìè êîòîðîãî ÿâëÿþòñÿ íåìåöêàÿ ôèðìà Boehringer Ingelheim Chemicals Inc. (êîììåð÷åñêèé ïðåïàðàò «Actilyse») è àìåðèêàíñêàÿ ôèðìà Genentech, Inc. («Activase»). Àëüòåïëàçà ïðèìåíÿåòñÿ ïðè òðîìáîëèòè÷åñêîé òåðàïèè îñòðîãî èíôàðêòà ìèîêàðäà, îñòðîé ìàññèâíîé ýìáîëèè ëåãî÷íîé àðòåðèè, ñîïðîâîæäàþùåéñÿ íåñòàáèëüíîé ãåìîäèíàìèêîé, è ïðè òðîìáîëèòè÷åñêîé òåðàïèè îñòðîãî èøåìè÷åñêîãî èíñóëüòà. Òêàíåâîé àêòèâàòîð ïëàçìèíîãåíà (tissue plasminogen activator, äàëåå â òåêñòå t-PA) ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ôåðìåíò, ñèíòåçèðóåìûé ýíäîòåëèåì è ñïîñîáíûé ïðåâðàùàòü ïëàçìèíîãåí â ïëàçìèí â ïðèñóòñòâèè ôèáðèíà, îò êîòîðîãî çàâèñèò àêòèâíîñòü ôåðìåíòà. Ïðè ââåäåíèè t-PA íå âûðàáàòûâàþòñÿ àíòèòåëà, åãî ìîæíî ââîäèòü ïîâòîðíî. ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ Íà äàííûé ìîìåíò õîðîøî èçâåñòíû àìèíîêèñëîòíàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ÷åëîâå÷åñêîãî t-PA è íóêëåîòèäíàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü êîäèðóþùåé ÄÍÊ. Áåëîê âïåðâûå áûë âûäåëåí êàê îäíîöåïî÷å÷íàÿ ñåðèí-ïðîòåàçà ñ ìàññîé îêîëî 70 êÄà, ñîñòîÿùàÿ èç 527 à.î. ñ ñåðèíîì â êà÷åñòâå N-òåðìèíàëüíîãî à.î. Ìîëåêóëà èìååò 17 äèñóëüôèäíûõ ñâÿçåé è äîïîëíèòåëüíûé ñâîáîäíûé öèñòåèíîâûé à.î. â ïîçèöèè 83 [30]. 4.1. Êóëüòèâèðîâàíèå 4.1.1. Ýêñïðåññèÿ â êëåòêàõ ìëåêîïèòàþùèõ Îäèí èç îñíîâíûõ êðóïíîìàñøòàáíûõ ïðîèçâîäèòåëåé àëüòåïëàçû — êîìïàíèÿ Genentech Inc. — äëÿ ïðîèçâîäñòâà èñïîëüçóåò ëèíèþ êëåòîê ìëåêîïèòàþùèõ CHO (chinese hamster ovary cells, êëåòêè ÿè÷íèêîâ êèòàéñêîãî õîìÿ÷êà). Êîäèðóþùàÿ ÄÍÊ ïðèðîäíîãî ÷åëîâå÷åñêîãî t-PA ãåíåòè÷åñêè èíòåãðèðîâàíà â êëåòêè CHO. Â ïðîöåññå ïîëóíåïðåðûâíîãî êóëüòèâèðîâàíèÿ àëüòåïëàçà ñåêðåòèðóåòñÿ â êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó, ñîäåðæàùóþ ïèòàòåëüíóþ ñðåäó è àíòèáèîòèê ãåíòàìèöèí â êîíöåíòðàöèè 100 ìã/ë. Ïðè ýòîì ïðèñóòñòâèå àíòèáèîòèêà â êîíå÷íîì ïðîäóêòå íå äåòåêòèðóåòñÿ [31]. Â íàñòîÿùåå âðåìÿ îïèñàí ìåòîä íàðàùèâàíèÿ êëåòîê CHO íà ìàêðîïîðèñòûõ ìèêðîíîñèòåëÿõ äëÿ ïðîèçâîäñòâà ðåêîìáèíàíòíîãî òêàíåâîãî àêòèâàòîðà ïëàçìèíîãåíà [32]. Ìèêðîíîñèòåëè ïðåäñòàâëÿþò ñîáîé ìèêðîñôåðû, ñïîñîáíûå ïðîèçâîäèòü óëó÷øåííûé ñóáñòðàò äëÿ «çàÿêîðåííûõ» êëåòîê â ïåðåìåøèâàþùåéñÿ êóëüòóðå. Íàèáîëåå ÷àñòî èñïîëüçóåòñÿ öèòîäåêñ, âêëþ÷àþùèé â ñåáÿ äåêñòðàíîâóþ ìàòðèöó ñ ïðèêðåïëåííûìè N,N-äèýòèë-àìèíîýòèëîâûìè ãðóïïàìè [33]. Ìàêðîïîðèñòûå íîñèòåëè ïîçâîëÿþò êëåòêàì ïðîíèêàòü âíóòðü ìàòðèöû è çàùèùàþò èõ îò ëþáûõ ñäâèãîâûõ ñèë, ñîçäàâàåìûõ â áèîðåàêòîðàõ. Ìèêðîíîñèòåëè óâåëè÷èâàþò ïðîèçâîäñòâî t-PA â 2,5 ðàçà â ïåðåñ÷åòå íà åäèíèöó îáúåìà ïî ñðàâíåíèþ ñ ñóñïåíçèîííûìè êóëüòóðàìè êëåòîê CHO [34]. Òàêæå ñóùåñòâóåò ðÿä äðóãèõ ðàáîò, îïèñûâàþùèõ ýêñïðåññèþ â êëåòêàõ ìëåêîïèòàþùèõ äëÿ ïðîèçâîäñòâà ðåêîìáèíàíòíîãî t-PA è åãî àíàëîãîâ è ïðîèçâîäíûõ [35, 36]. 4.1.2. Áàêòåðèàëüíàÿ ýêñïðåññèÿ Äëÿ óñòðàíåíèÿ ïðîáëåì, ñâÿçàííûõ ñ ñîëþáèëèçàöèåé è ðåôîëäèíãîì â ïðîöåññå âûäåëåíèÿ ðåêîìáèíàíòíûõ áåëêîâ èç òåë âêëþ÷åíèÿ, èíîãäà èñïîëüçóåòñÿ ñïîñîáíîñòü áàêòåðèàëüíûõ êëåòîê ñåêðåòèðîâàòü áåëêè â ïåðèïëàçìàòè÷åñêîå ïðîñòðàíñòâî. Îäíàêî t-PA, ñåêðåòèðóåìûé â ïåðèïëàçìó E. coli, íåïðàâèëüíî ñâåðíóò è ïðàêòè÷åñêè íåàêòèâåí. Â ðàáîòå R&D îòäåëà ôèðìû Genentech ïðèâîäèòñÿ èíòåðåñíûé ñïîñîá ðåøåíèÿ ýòîé ïðîáëåìû[37]. Íà ïåðâîé ñòàäèè êÄÍÊ, êîäèðóþùóþ ïîëíóþ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü ÷åëîâå÷åñêîãî t-PA, ñøèëè ñ ëèäèðóþùèì ïåïòèäîì stII, îáåñïå÷èâàþùèì ïåðèïëàçìàòè÷åñêóþ ýêñïðåññèþ áåëêîâ â E. coli, è ïîìåñòèëè ïîä ðåãóëÿöèþ pBAD ïðîìîòîðà, èíäóöèðóåìîãî àðàáèíîçîé. Êëåòêè, òðàíñôîðìèðîâàííûå òàêèì âåêòîðîì, èìåëè äîâîëüíî íèçêèé óðîâåíü ýêñïðåññèè t-PA, ïðè÷åì áîëüøàÿ ÷àñòü áåëêà íàêàïëèâàëàñü âíóòðèêëåòî÷íî â ðàñòâîðèìîé, íî íåàêòèâíîé ôîðìå. Äëÿ óâåëè÷åíèÿ âûõîäà àêòèâíîé ôîðìû t-PA èñïîëüçóþò êîýêñïðåññèþ ñ èçîìåðàçîé äèñóëüôèäíûõ ñâÿçåé DsbC (disulfide bond isomerases) ïîä ðåãóëÿöèåé trc ïðîìîòîðà, èíäóöèðóåìîãî ÈÏÒÃ (èçîïðîïèë-b-D-1-òèîãàëàêòîïèðàíîçèä). Èíäóêöèÿ ýêñïðåññèè èçîìåðàçû ïîä âîçäåéñòâèåì 0,05 ìÌ ÈÏÒÃ è ïîñëåäóþùàÿ (÷åðåç 30 ìèí) èíäóêöèÿ ýêñïðåññèè t-PA ñ 0,1 % àðàáèíîçû ïðèâîäèëè ê ìàêñèìàëüíîìó çíà÷åíèþ àêòèâíîñòè t-PA ÷åðåç 2,5 ÷ ïîñëå èíäóêöèè. Â ðåçóëüòàòå êîýêñïðåñèè àêòèâíîñòü t-PA ïîâûøàëàñü áîëåå ÷åì â 100 ðàç [38]. 4.1.3. Äðóãèå ýêñïðåññèîííûå ñèñòåìû Ïîïûòêè ïðîèçâåñòè àêòèâíûé t-PA â Saccharomyces cerevisiae èëè â êëåòêàõ íàñåêîìûõ íå óâåí÷àëèñü óñïåõîì èç-çà ãèïåðãëèêîçèëèðîâàíèÿ, íèçêîãî ýêñïîðòà è íåïðàâèëüíîãî ñâîðà÷èâàíèÿ [39, 40]. Äëÿ ïðîèçâîäñòâà òêàíåâîãî àêòèâàòîðà ïëàçìèíîãåíà òàêæå ñóùåñòâóåò ìåòîä, çàêëþ÷àþùèéñÿ â èñïîëüçîâàíèè âåêòîðà ýêñïðåññèè, ñîäåðæàùåãî êîðîâûé ïðîìîòîð, êÄÍÊ è ñèãíàëüíûé ïåïòèä BLG äëÿ ïîäãîòîâêè òðàíñãåííîé ìûøè; îòáèðàþò ëèìôîöèòû èëè ýïèòåëèàëüíûå êëåòêè ìîëî÷íîé æåëåçû òðàíñãåííîé ìûøè è îáúåäèíÿþò ñ ðàêîâûìè êëåòêàìè äëÿ ïîëó÷åíèÿ ãèáðèäîìû. Òðàíñãåííàÿ ãèáðèäîìà t-PA èíäóöèðóåòñÿ ïðîëàêòèíîì è ñíîâà îòáèðàåòñÿ äëÿ ïîëó÷åíèÿ âûñîêî-ýêñïðåññèðîâàííîãî êëåòî÷íîãî øòàììà. Çàòåì ýêñïðåññèðîâàííûå êëåòêè ïîäâåðãàþò òðàíñôåêöèè è ñíîâà îòáèðàþò äëÿ òîãî, ÷òîáû ïîëó÷èòü âûñîêî-ýêñïðåññèðîâàííûé øòàìì ãèáðèäîìû. Êëåòêè ñ âûñîêèì óðîâíåì ýêñïðåññèè ïðèâèâàþò â áðþøíóþ ïîëîñòü BALB/C ìûøè â ïåðèîä ëàêòàöèè, çàòåì àñöèòíóþ æèäêîñòü îòáèðàþò äëÿ ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíîãî òêàíåâîãî àêòèâàòîðà ïëàçìèíîãåíà. Òàêèì îáðàçîì, ñåáåñòîèìîñòü ïðîèçâîäñòâà çíà÷èòåëüíî ñíèæàåòñÿ ïî ñðàâíåíèþ ñ ìåòîäîì ñ èñïîëüçîâàíèåì êëåòî÷íûõ êóëüòóð è óïðîùàåòñÿ ïðîèçâîäñòâî [41]. ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 31 Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ Òàêæå ïðîâîäÿòñÿ ïîïûòêè ýêñïðåññèè t-PA â òðàíñãåííûõ ðàñòåíèÿõ (òàáàê) [42]. Òàêèì îáðàçîì, íåñìîòðÿ íà ìíîãîîáðàçèå ñîâðåìåííûõ ðåêîìáèíàíòíûõ òåõíîëîãèé ïðîèçâîäñòâà òêàíåâîãî àêòèâàòîðà ïëàçìèíîãåíà, åãî îñíîâíûå ïðîèçâîäèòåëè, êîìïàíèè Genentech Inc. è Boehringer Ingelheim Chemicals Inc, èñïîëüçóþò ýêñïðåññèîííûå ñèñòåìû â CHO è E coli, ðàçðàáîòàííûå â íà÷àëå 90-õ ãîäîâ ïðîøëîãî ñòîëåòèÿ. 4.2. Âûäåëåíèå è î÷èñòêà Ñïåöèàëèñòû êîìïàíèè GENENTECH Inc. öåëåâîé ãëèêîïðîòåèí t-PA âûäåëÿþò èç êóëüòóðàëüíîé ñðåäû ñ èñïîëüçîâàíèåì õîðîøî èçâåñòíûõ ìåòîäîâ [43]. Íà ïåðâîì ýòàïå ïîñëå êóëüòèâèðîâàíèÿ ïðèìåíÿþò òàíãåíöèàëüíóþ ôèëüòðàöèþ ïðè âûñîêîì äàâëåíèè, ÷òîáû îòäåëèòü ñðåäó, ñîäåðæàùóþ t-PA, îò êëåòîê è îäíîâðåìåííî ñêîíöåíòðèðîâàòü. Ðàñòâîð, ïîëó÷åííûé ïîñëå ìèêðîôèëüòðàöèè, íàíîñÿò íà àôôèííóþ êîëîíêó, ñïîñîáíóþ ñåëåêòèâíî ñâÿçûâàòü t-PA, çàòåì t-PA ýëþèðóþò áóôåðîì ïðè pH 5,0 – 9,0. Ïîäõîäÿùèìè êîëîíêàìè ìîãóò áûòü: Lysinec CPG™ (Bioprocessing, ÑØÀ), ECH Lysine CL™ (GE Healthcare, Øâåöèÿ) è Lysine Hyper D™ (Pall, Ãåðìàíèÿ). Êîëîíêó ïðåäâàðèòåëüíî óðàâíîâåøèâàþò ðàñòâîðîì 50 ìÌ NaH2PO4 èëè K2HPO4 (pH 7,5). Ýëþèðóþùèé áóôåð îáû÷íî ñîäåðæèò 200 ìÌ àðãèíèíà, 50 ìÌ NaH2PO4 èëè K2HPO4 (pH 7,5). Æåëàòåëüíî, ÷òîáû ýëþèðóþùèé áóôåð òàêæå ñîäåðæàë ïðîïèëåíãëèêîëü â êîíöåíòðàöèè ïðèáëèçèòåëüíî îò 2,5 äî 20 %. Äàííàÿ î÷èñòêà íå ïîçâîëÿåò èçáàâèòüñÿ îò âûñîêîé êîíöåíòðàöèè ÄÍÊ êëåòîê-õîçÿèíà, ïîýòîìó äàëüíåéøóþ î÷èñòêó ïðîâîäÿò ñ ïîìîùüþ àíèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè íà DEAESepharose Fast Flow (GE Healthcare, Øâåöèÿ). Íà ñëåäóþùåì ýòàïå ïðîèñõîäèò èíàêòèâàöèÿ ðåòðîâèðóñîâ, êîòîðûå ìîãóò íàõîäèòüñÿ â èñïîëüçóåìîé êëåòî÷íîé êóëüòóðå ìëåêîïèòàþùèõ. Äëÿ ýòàïà óäàëåíèÿ âèðóñîâ ñóùåñòâóåò çíà÷èòåëüíîå ÷èñëî äîñòóïíûõ ìåòîäîâ: íàíîôèëüòðàöèÿ; îáðàáîòêà õàîòðîïíûìè àãåíòàìè, íàïðèìåð ìî÷åâèíîé èëè ãóàíèäèí-ãèäðîõëîðèäîì; êðèòè÷åñêèå çíà÷åíèÿ pH; äåòåðãåíòû; íàãðåâàíèå; õèìè÷åñêàÿ äåðèâàòèçàöèÿ, íàïðèìåð ôîðìàëüäåãèäîì; îáðàáîòêà ïðîòåàëèòè÷åñêèìè ôåðìåíòàìè; òðàäèöèîííûå ðàçäåëåíèÿ, òàêèå êàê èîíîîáìåííàÿ èëè ýêñêëþçèîííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ, îðãàíè÷åñêèìè ðàñòâîðèòåëÿìè è ò. ä. Ïî ñóòè, íå òàê âàæíî, êàêèå øàãè âûáðàíû äëÿ óäàëåíèÿ âèðóñîâ, à âàæíî èñïîëíåíèå ñëåäóþùèõ óñëîâèé: 32 1. t-PA äîëæåí áûòü óñòîé÷èâ ê âîçäåéñòâèÿì, òîãäà êàê öåëåâîé âèðóñ äîëæåí áûòü ÷óâñòâèòåëåí ê âîçäåéñòâèÿì. 2. Ïîêàçàòåëè äîñòèãàåìîé ÷èñòîòû äîëæíû áûòü ìàêñèìàëüíûìè. Îïèñàííûì ìåòîäîì ðåêîìáèíàíòíûé t-PA ìîæíî âûäåëèòü è î÷èñòèòü ñ ÷èñòîòîé îêîëî 97 – 99 %. Åñëè íåîáõîäèìî, äàëüíåéøàÿ î÷èñòêà ìîæåò áûòü îñóùåñòâëåíà äîïîëíèòåëüíûì ýòàïîì êàòèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè. Òàêèì îáðàçîì ïîëó÷àþò ïðåïàðàò àëüòåïëàçû, ãîòîâûé ê òåðàïåâòè÷åñêîìó èñïîëüçîâàíèþ. Äî íåäàâíåãî âðåìåíè t-PA î÷èùàëè, èñïîëüçóÿ ðàçëè÷íûå òèïû àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè. Íàïðèìåð, ýêñïðåññèðóåìûé E. coli â âèäå òåë âêëþ÷åíèÿ è çàòåì ïåðåâåäåííûé â ðàñòâîðèìóþ ôîðìó ïîñëå ðåôîëäèíãà t-PA îáû÷íî âûäåëÿþò ïðè ïîìîùè ëèçèí-àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè. Äðóãèå òèïû àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè, ïðèìåíÿåìûå äëÿ âûäåëåíèÿ t-PA, âêëþ÷àþò êîíêàíàâàëèí À — ñåôàðîçó; ñåôàðîçó, èììîáèëèçîâàííóþ èíãèáèòîðîì òðèïñèíà êîðàëëîâîãî äåðåâà (erythrina trypsin inhibitor); IgG àíòèòåëà ê t-PA, èììîáèëèçîâàííûå íà ñåôàðîçå è ôèáðèí-ñåôàðîçå [35, 38, 44 – 46]. Îäíàêî èñïîëüçîâàíèå àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè â ïðîèçâîäñòâå ôàðìàöåâòè÷åñêèõ ïðåïàðàòîâ ñâÿçàíî ñ èçâåñòíûìè çàòðóäíåíèÿìè, òàêèìè êàê ñìûâàíèå èììîáèëèçîâàííîãî ëèãàíäà è ïîÿâëåíèå íåæåëàòåëüíûõ ãåòåðîàíòèãåííûõ áåëêîâ. Â äîïîëíåíèå ê ýòîìó â íåêîòîðûõ ñëó÷àÿõ èçìåíåíèÿ pH èëè òåìïåðàòóðû â ïðîöåññå àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè ïðèâîäÿò ê äåíàòóðàöèè öåëåâûõ áåëêîâ [47]. Â ïàòåíòå [48] ïðåäñòàâëåíà óëó÷øåííàÿ ìåòîäèêà î÷èñòêè ðåêîìáèíàíòíîãî t-PA, êîòîðàÿ ïîçâîëÿåò èçáåæàòü ïðîáëåì, âîçíèêàþùèõ ïðè èñïîëüçîâàíèè òðàäèöèîííûõ ìåòîäîâ î÷èñòêè ýòîãî áåëêà. Ïðåäëîæåí îäíîñòàäèéíûé õðîìàòîãðàôè÷åñêèé ïðîöåññ î÷èñòêè t-PA, ñâÿçàííûé ñ èçìåíåíèåì êîíöåíòðàöèè àðãèíèíà â áóôåðå äëÿ ðåôîëäèíãà è áóôåðàõ, èñïîëüçóåìûõ äëÿ õðîìàòîãðàôèè; ïîäîáðàíà îïòèìàëüíàÿ êîíöåíòðàöèÿ àðãèíèíà äëÿ èîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè. Òàêèì îáðàçîì, ïðÿìîé ðåôîëäèíã, ñëåäóþùèé ñðàçó çà ðàñòâîðåíèåì òåë âêëþ÷åíèÿ áåç êàêèõ-ëèáî õðîìàòîãðàôè÷åñêèõ ýòàïîâ, ñîêðàùàåò ïîòåðþ áåëêà. Ïîñëå ðåôîëäèíãà ýôôåêòèâíåå èñïîëüçîâàòü îäíîøàãîâóþ èîíîîáìåííóþ õðîìàòîãðàôèþ âìåñòî àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè â íåñêîëüêî ýòàïîâ. Èñïîëüçîâàíèå àðãèíèíà â êîíöåíòðàöèè 0,5 Ì îáåñïå÷èâàåò âûñîêóþ ïðîâîäèìîñòü ïðè êàòèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè, íî íå ïðåïÿòñòâóåò ñâÿçûâà- ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ íèþ áåëêîâ è óìåíüøàåò ïîòåðè áåëêà â ïðîöåññå ïðåöèïèòàöèè. ïàòèòà è ÂÈ×, ïîâûøàåòñÿ âîçìîæíîñòü àëëåðãèçàöèè. 5.1. «Up-stream» ïðîöåññ 5. ÝÐÈÒÐÎÏÎÝÒÈÍ Ýðèòðîïîýòèí (ÝÏÎ) — ãîðìîí, êîíòðîëèðóþùèé ïðîäóêöèþ êðàñíûõ êðîâÿíûõ òåëåö, íàçûâàåìóþ ýðèòðîïîýçîì. Îí ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ãëèêîïðîòåèí ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé 30,4 êÄà, ñîñòîèò èç 165 à.î. è óãëåâîäíîé ÷àñòè, ê êîòîðîé ïðèñîåäèíåíû îòðèöàòåëüíî çàðÿæåííûå îñòàòêè N-àöåòèëíåéðàìèíîâîé êèñëîòû. Ìîëåêóëû áåëêà ñ ìàêñèìàëüíûì ñîäåðæàíèåì ñèàëîâûõ êèñëîò ëó÷øå ñòèìóëèðóþò ýðèòðîïîýç. Â çàâèñèìîñòè îò ñòåïåíè ãëèêîçèëèðîâàíèÿ ðàçëè÷àþò íåñêîëüêî ôîðì ÝÏÎ. Íàèáîëüøåå ðàñïðîñòðàíåíèå ïîëó÷èëè àëüôà è áåòà ôîðìû ÝÏÎ, êîòîðûå îáëàäàþò ïðèìåðíî îäèíàêîâîé áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ [49]. ÝÏÎ — ÷ðåçâû÷àéíî àêòèâíûé ãîðìîí, îêàçûâàþùèé ñâîå äåéñòâèå â îðãàíèçìå â ïèêîìîëÿðíûõ êîíöåíòðàöèÿõ. Ïîêàçàíèÿìè ê ïðèìåíåíèþ ìîãóò ñëóæèòü àíåìèÿ ó áîëüíûõ ñ õðîíè÷åñêîé ïî÷å÷íîé íåäîñòàòî÷íîñòüþ, â òîì ÷èñëå íàõîäÿùèõñÿ íà ãåìîäèàëèçå, ïðîôèëàêòèêà è ëå÷åíèå àíåìèé ó áîëüíûõ ñ ñîëèäíûìè îïóõîëÿìè, ÂÈ×-èíôèöèðîâàííûõ áîëüíûõ (ÑÏÈÄ), áîëüíûõ ñ ìèåëîìíîé áîëåçíüþ, íåõîäæñêèíñêèìè ëèìôîìàìè íèçêîé ñòåïåíè çëîêà÷åñòâåííîñòè, õðîíè÷åñêèì ëèìôîëåéêîçîì, ó áîëüíûõ ñ ðåâìàòîèäíûì àðòðèòîì, ó íåäîíîøåííûõ äåòåé, à òàêæå äëÿ óìåíüøåíèÿ îáúåìîâ ïåðåëèâàåìîé êðîâè ïðè îáøèðíûõ õèðóðãè÷åñêèõ âìåøàòåëüñòâàõ è îñòðûõ êðîâîïîòåðÿõ, ïðè ïîäãîòîâêå ê îáøèðíûì õèðóðãè÷åñêèì âìåøàòåëüñòâàì ñ öåëüþ óìåíüøåíèÿ îáúåìîâ ïåðåëèâàåìîé êðîâè; óâåëè÷åíèå îáúåìà êðîâè, ïðåäíàçíà÷åííîé äëÿ àóòîòðàíñôóçèè. ÝÏÎ ÿâëÿåòñÿ ýôôåêòèâíûì òåðàïåâòè÷åñêèì ñðåäñòâîì, îäíàêî ïîëó÷åíèå åãî â äîñòàòî÷íûõ êîëè÷åñòâàõ èç ïðèðîäíûõ èñòî÷íèêîâ (ñûâîðîòêà êðîâè æèâîòíûõ ñ èíäóöèðîâàííîé àíåìèåé è äð.) ÿâëÿåòñÿ íåðåàëèçóåìîé çàäà÷åé â ñâÿçè ñ êðàéíå íèçêèì ñîäåðæàíèåì ãîðìîíà â ñûðüå è ñëîæíîñòüþ òåõíîëîãèè î÷èñòêè. Àëüòåðíàòèâîé ÿâëÿåòñÿ ïðîèçâîäñòâî ÝÏÎ ñ ïîìîùüþ ãåííî-èíæåíåðíîé òåõíîëîãèè. Â íàñòîÿùåå âðåìÿ ìåòîäîì ãåííîé èíæåíåðèè äëÿ êëèíè÷åñêîãî ïðèìåíåíèÿ ïîëó÷åí ðÿä ðåêîìáèíàíòíûõ ïðåïàðàòîâ ÝÏÎ ÷åëîâåêà. Íàèáîëüøåå ðàñïðîñòðàíåíèå ïîëó÷èë ð÷ÝÏÎàëüôà è ð÷ÝÏÎ-áåòà. Ðåêîìáèíàíòíàÿ àëüôàôîðìà îòëè÷àåòñÿ îò áåòà-ôîðìû ñîäåðæàíèåì ñûâîðîòî÷íîãî àëüáóìèíà ÷åëîâåêà. Â ýòîì ñëó÷àå ïðèñóòñòâóåò ðèñê çàðàæåíèÿ âèðóñàìè ãå- Øèðîêîå ðàñïðîñòðàíåíèå ïîëó÷èëè òåõíîëîãèè èçãîòîâëåíèÿ ýêçîãåííîãî ÝÏÎ ñ ïîìîùüþ ðåêîìáèíàíòíûõ êëåòî÷íûõ ëèíèé æèâîòíûõ, ñïîñîáíûõ ñåêðåòèðîâàòü ÷åëîâå÷åñêèé ÝÏÎ ïðè êóëüòèâèðîâàíèè èõ in vitro íà ñèíòåòè÷åñêèõ ïèòàòåëüíûõ ñðåäàõ. Ïðè ýòîì óðîâåíü ïðîäóêöèè ýðèòðîïîýòèíà îáû÷íî ñîñòàâëÿåò åäèíèöû èëè äåñÿòêè ìèêðîãðàììîâ â ìèëëèëèòðå ïèòàòåëüíîé ñðåäû, à ñîäåðæàíèå ïîñòîðîííåãî áåëêà â íåé âî ìíîãî ðàç âûøå ñîäåðæàíèÿ ÝÏÎ. Â ñèëó ýòîãî äëÿ ïîëó÷åíèÿ ñóáñòàíöèè ÝÏÎ, ïðèãîäíîé äëÿ ïðèãîòîâëåíèÿ ïðåïàðàòà ìåäèöèíñêîãî íàçíà÷åíèÿ, òðåáóåòñÿ ïðîâåäåíèå ãëóáîêîé î÷èñòêè [50]. Äëÿ ïîëó÷åíèÿ æèäêîé ëåêàðñòâåííîé ôîðìû ðåêîìáèíàíòíîãî ÝÏÎ ÷åëîâåêà èñïîëüçóþò âûñîêîî÷èùåííûé ïðåïàðàò, âûäåëåííûé èç êîíäèöèîíèðîâàííîé êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè êëåòîê ÑÍÎ è íå ñîäåðæàùèé çàìåòíûõ ïðèìåñåé îëèãîìåðíûõ ôîðì, ïðîäóêòîâ ïðîòåîëèçà è ïðèìåñåé áåëêîâ êëåòîê-ïðîäóöåíòîâ. Ïðåäâàðèòåëüíî íàêîïëåííóþ ñóñïåíçèþ êëåòîê êóëüòèâèðóþò â ðîñòîâîé ïèòàòåëüíîé ñðåäå (50/50 ñìåñü ãîòîâûõ ñðåä RPMI 1640 è DMEM, ñîäåðæàùèõ ýìáðèîíàëüíóþ ñûâîðîòêó òåëÿò, ãëóòàìèí è ãåíòàìèöèí) â êóëüòóðàëüíûõ ôëàêîíàõ. Ôëàêîíû èíêóáèðóþò ïðè 37 °C â òå÷åíèå 3 ñóòîê â ñòàöèîíàðíûõ óñëîâèÿõ. Ïî îêîí÷àíèè èíêóáàöèè ðîñòîâóþ ïèòàòåëüíóþ ñðåäó âî ôëàêîíàõ çàìåíÿþò íà ýêâèâàëåíòíûé îáúåì íàêîïèòåëüíîé ñðåäû (Fetaclone II, ãëóòàìèí, HEPES, ñìåñü ðàâíûõ äîëåé ñðåä RPMI 1640 è DMEM), èíêóáàöèþ ôëàêîíîâ ïðè 37 °C ïðîäîëæàþò åùå 2 ñóòîê. Ïî îêîí÷àíèè èíêóáàöèè íàêîïèòåëüíóþ ñðåäó èç ôëàêîíîâ ñîáèðàþò â åìêîñòü, äîáàâëÿþò ôåíèëìåòèëñóëüôîíèëôòîðèä (PMSF) è ïîìåùàþò íà õðàíåíèå ïðè 4 °Ñ. Âî ôëàêîíû ñ êëåòî÷íîé êóëüòóðîé âíîñÿò ñâåæóþ ïîðöèþ íàêîïèòåëüíîé ñðåäû, è âåñü öèêë íàêîïëåíèÿ ÝÏÎ ïîâòîðÿþò. Ñîáðàííóþ íàêîïèòåëüíóþ ñðåäó ñîõðàíÿþò òàê æå, êàê è íà ïðåäûäóùåì öèêëå, ïðîâîäÿò íåñêîëüêî öèêëîâ. Ïî îêîí÷àíèè íàêîïèòåëüíîãî ïåðèîäà êëåòêè èç êàæäîãî ôëàêîíà ñîáèðàþò ïîñëå îáðàáîòêè êëåòî÷íîãî ìîíîñëîÿ ñìåñüþ òðèïñèí/âåðñåí (50/50) ðåñóñïåíäèðîâàíèåì â íàêîïèòåëüíîé ñðåäå è èõ êîíöåíòðàöèþ îïðåäåëÿþò ñ ïîìîùüþ ãåìîöèòîìåòðà. Ñîáðàííóþ íàêîïèòåëüíóþ ñðåäó ïîäâåðãàþò î÷èñòêå. Äëÿ ýòîãî êóëüòóðàëüíóþ æèäêîñòü î÷èùàþò ìèêðîôèëüòðàöèåö ÷åðåç ìåìáðàííûå ôèëüòðû ñ ðàçìåðîì ïîð 0,8 ìêì äî ãîìîãåííîãî ñîñòîÿíèÿ [51]. ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 33 Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ 5.2. Õðîìàòîãðàôè÷åñêàÿ î÷èñòêà ÝÏÎ 6. ÔÀÊÒÎÐ IX Î÷èñòêà áåëêà ìîæåò ïðîâîäèòüñÿ ïðè ïîìîùè ïîäõîäÿùåé êîìáèíàöèè õðîìàòîãðàôè÷åñêèõ ìåòîäîâ, òàêèõ êàê èîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ íà íîñèòåëå Q-Sepharose FF (GE Healthcare, Øâåöèÿ) â ñèñòåìå óêñóñíàÿ êèñëîòà – ãëèöèí – ìî÷åâèíà ñ ïîñëåäóþùåé ýëþöèåé ðàñòâîðîì õëîðèäà íàòðèÿ; õðîìàòîãðàôèÿ ãèäðîôîáíûõ âçàèìîäåéñòâèé, îñàæäåíèå ñóëüôàòîì àììîíèÿ, ãåëü-ôèëüòðàöèÿ, àôôèííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ (ñ èñïîëüçîâàíèåì íèêåëåâûõ è êîáàëüòîâûõ ñîðáåíòîâ, ñîðáåíòîâ ñ èììîáèëèçîâàííûìè àíòèòåëàìè è/èëè ñîðáåíòîâ ñ èììîáèëèçîâàííûìè ëèãàíäàìè è ðåöåïòîðàìè) [52]. Â êà÷åñòâå àíòèòåë â èììóíîàôôèííîé õðîìàòîãðàôèè èñïîëüçóþò ìîíîêëîíàëüíûå àíòèòåëà, êîòîðûå èììîáèëèçóþò íà áèîñîâìåñòèìîé íåðàñòâîðèìîé ìàòðèöå Sepharose FF, àêòèâèðîâàííîé áðîìöèàíîì, óðàâíîâåøåííîé ôîñôàòíûì áóôåðîì. ×åðåç êîëîíêó ïðîïóñêàþò ïðåäâàðèòåëüíî îñâåòëåííóþ ìèêðîôèëüòðàöèåé êóëüòóðàëüíóþ æèäêîñòü, ñîäåðæàùóþ ðåêîìáèíàíòíûé ÝÏÎ. ÝÏÎ, ñîðáèðîâàííûé íà èììóíîñîðáåíòå, ýëþèðóþò êèñëûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì, íàïðèìåð 0,1 Ì ðàñòâîðîì ëèìîííîé êèñëîòû, 0,1 Ì ãëèöèíîâûì áóôåðîì, pH 3,5. Ýëþåíò è ðàñòâîðû äëÿ ïðîìûâêè ìîãóò ñîäåðæàòü 0,01 — 0,05 % íåèîííîãî äåòåðãåíòà Tween-20 èëè Nonidet Ð-40. Òàêæå èçâåñòåí ñïîñîá î÷èñòêè ðåêîìáèíàíòíîãî ÝÏÎ ÷åëîâåêà, âêëþ÷àþùèé ñòàäèè îñàæäåíèÿ áåëêà ýòàíîëîì, ôðàêöèîíèðîâàíèÿ íà ÄÝÀÝ-àãàðîçå, ðàçäåëåíèÿ íà ñèëüíîì êàòèîíèòå SP-Sephadex (GE Healthcare, Øâåöèÿ), ãåëü-ôèëüòðàöèè íà Sephadex G-100 (GE Healthcare, Øâåöèÿ), õðîìàòîãðàôèè íà ãèäðîêñèàïàòèòå, êîíöåíòðèðîâàíèÿ ëèîôèëèçàöèåé è ÎÔ ÂÝÆÕ íà Vydac Ñ-4 (Grace, Ãåðìàíèÿ) â ñèñòåìå âîäà – òðèôòîðóêñóñíàÿ êèñëîòà – àöåòîíèòðèë [53]. Äëÿ ïîëó÷åíèÿ ñòàáèëüíîé ÃËÔ èñïîëüçóþò äîáàâêè ìî÷åâèíû è ðàçëè÷íûõ àìèíîêèñëîò. Ìî÷åâèíà èñïîëüçóåòñÿ â êîëè÷åñòâå 5 – 50 ã/ë, ïðåäïî÷òèòåëüíî 10 – 15 ã/ë. Â êà÷åñòâå àìèíîêèñëîò ïðèìåíÿþò, íàïðèìåð, ãëèöèí, L-àëàíèí, L-àðãèíèí, L-ëåéöèí, L-èçîëåéöèí, L-2-ôåíèëàëàíèí, L-ãëóòàìèíîâóþ êèñëîòó èëè L-òðåîíèí â êîëè÷åñòâàõ 0,5 – 50 ã/ë, ïðè÷åì îáùåå êîëè÷åñòâî äîëæíî ñîñòàâëÿòü ïðåäïî÷òèòåëüíî 5 – 25 ã/ë. Áèîëîãè÷åñêóþ àêòèâíîñòü êîíòðîëèðóþò in vitro ìåòîäîì îöåíêè ñòèìóëÿöèè ïðîëèôåðàöèè êëåòîê êðîâè ïîëèöèòåìè÷åñêèõ ìûøåé â ïðèñóòñòâèè ÝÏÎ. Ãåìîôèëèÿ òèïà Â — íàñëåäñòâåííîå çàáîëåâàíèå, îáóñëîâëåííîå äåôèöèòîì ïëàçìåííîãî ôàêòîðà ñâåðòûâàíèÿ IX è õàðàêòåðèçóþùååñÿ êðîâîòî÷èâîñòüþ ãåìàòîìíîãî òèïà. Â 2005 ã. Âñåìèðíàÿ ôåäåðàöèÿ ãåìîôèëèè îïóáëèêîâàëà îò÷åò î ïîïóëÿöèîííîì èññëåäîâàíèè, âêëþ÷èâøåì 98 ñòðàí íà âñåõ êîíòèíåíòàõ è 88 % âñåãî íàñåëåíèÿ Çåìëè. Áûëî âûÿâëåíî 131264 áîëüíûõ ãåìîôèëèåé òèïîâ À è Â [54]. Ïðåïàðàòû IX ôàêòîðà ñâåðòûâàíèÿ ïëàçìû êðîâè ÷åëîâåêà ïðèìåíÿþò äëÿ ëå÷åíèÿ ãåìîôèëèè òèïà B, èõ ïîëó÷åíèå ÿâëÿåòñÿ îäíîé èç îñíîâíûõ öåëåé ïðîìûøëåííîãî ôðàêöèîíèðîâàíèÿ ïëàçìû êðîâè âî âñåì ìèðå. Êîàãóëÿöèîííûé ôàêòîð IX (FIX, àíòèãåìîôèëè÷åñêèé ôàêòîð B, ôàêòîð Êðèñòìàñà) — âèòàìèí Ê-çàâèñèìûé ïëàçìåííûé ãëèêîïðîòåèí, öèðêóëèðóþùèé â êðîâè, êàê çèìîãåí ñåðèíîâîé ïðîòåàçû [55, 56]. Âèòàìèí Ê íóæåí äëÿ âíåäðåíèÿ âòîðîé êàðáîêñèëüíîé ãðóïïû â íåêîòîðûå îñòàòêè ãëóòàìèíîâîé êèñëîòû ìîëåêóëû ôàêòîðà IX. Ýòà ïîñòòðàíñëÿöèîííàÿ ìîäèôèêàöèÿ îáåñïå÷èâàåò ñâÿçûâàíèå èîíîâ êàëüöèÿ è àäñîðáöèþ íà ôîñôîëèïèäíûõ ìåìáðàíàõ. Ôàêòîð IX ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé îäíîöåïî÷å÷íûé ïðîôåðìåíò, ìîëåêóëÿðíûé âåñ êîòîðîãî, ïî äàííûì ðàçíûõ àâòîðîâ, âàðüèðóåòñÿ îò 55 äî 57 êÄà. Äëÿ ëå÷åíèÿ ãåìîôèëèè èñïîëüçóþò ïîñòîÿííîå ââåäåíèå íåäîñòàþùåãî ôàêòîðà ñâåðòûâàíèÿ. Íàèáîëåå ïðåäïî÷òèòåëüíûì äëÿ ëå÷åíèÿ êðîâîòå÷åíèé ïðè ãåìîôèëèè ÿâëÿåòñÿ ïðèìåíåíèå êîíöåíòðàòîâ ôàêòîðîâ ñâåðòûâàíèÿ. Èõ èçãîòàâëèâàþò èç ïðåïàðàòîâ äîíîðñêîé êðîâè, à òàêæå ãåííî-èíæåíåðíûì ñïîñîáîì. 34 6.1. Ïîëó÷åíèå ôàêòîðà IX èç ïëàçìû êðîâè Ñóùíîñòü èñïîëüçóåìîãî â íàñòîÿùåå âðåìÿ ìåòîäà çàêëþ÷àåòñÿ â ïîëó÷åíèè êîíöåíòðàòà ôàêòîðà IX ñâåðòûâàíèÿ êðîâè, ïðåäñòàâëÿþùåãî ñîáîé ïðîòðîìáèíîâûé êîìïëåêñ. Òåõíè÷åñêèì ðåçóëüòàòîì ÿâëÿåòñÿ ïîëó÷åíèå î÷èùåííîãî êîíöåíòðàòà ôàêòîðà IX ñâåðòûâàíèÿ êðîâè, îáëàäàþùåãî âûñîêîé óäåëüíîé ñïåöèôè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ, êîòîðûé ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàí äëÿ ëå÷åíèÿ áîëüíûõ ãåìîôèëèåé. Ñïîñîá îñóùåñòâëÿþò ñëåäóþùèì îáðàçîì [57]. Êðèîñóïåðíàòàíò ïîëó÷àþò èç ñâåæåçàìîðîæåííîé ïëàçìû êðîâè åå ðàçìîðîçêîé ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå, ãîìîãåíèçàöèè â õèìè÷åñêîì ðåàêòîðå ñ ìåøàëêîé è òåïëîîáìåííèêîì, ãäå ïëàçìà ðàçîãðåâàåòñÿ äî 0,5 °Ñ. Ðàñòîïëåííóþ ïëàçìó öåíòðèôóãèðóþò íà ïðîòî÷íîé öåíòðèôóãå, â ðåçóëüòàòå ïîëó÷àÿ êðèîñóïåð- ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ íàòàíò (íàäîñàäî÷íàÿ ôðàêöèÿ) è êðèîïðåöèïèòàò (îñàäîê); pH êðèîñóïåðíàòàíòà äîâîäÿò äî 7,2 – 7,8 ðàñòâîðîì NaOH è Òðèñ-HCl ñòàðòîâûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì, ñîäåðæàùèì òðåõçàìåùåííûé öèòðàò íàòðèÿ è ãëèöèí, äî êîíöåíòðàöèè áåëêà 5 – 6 %. Ïîëó÷åííûé ðàñòâîð öåíòðèôóãèðóþò, ïðîïóñêàþò ÷åðåç êàñêàä ôèëüòðîâ ñ ðàçìåðîì ïîð 2, 1 è 0,22 ìêì è ïîäàþò ñ ëèíåéíîé ñêîðîñòüþ 50 – 90 ñì/÷ íà êîëîíêó ñ àíèîíîîáìåííèêîì DEAE-Toyopearl (Tosoh, ßïîíèÿ), óðàâíîâåøåííóþ ñòàðòîâûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì. Íåñâÿçàííûå áåëêè óäàëÿþòñÿ ïðè íàíåñåíèè è ïåðåóðàâíîâåøèâàíèè. Ýëþèðóþò ïðîòðîìáèíîâûé êîìïëåêñ â ñòóïåí÷àòîì ãðàäèåíòå èîííîé ñèëû 200 – 360 ìÌ Na+/ë Òðèñ-HCl ýëþèðóþùèì áóôåðíûì ðàñòâîðîì, ñîäåðæàùèì ãëèöèí è òðåõçàìåùåííûé öèòðàò íàòðèÿ. Çàòåì îòáèðàþò ôðàêöèè ñî ñïåöèôè÷åñêîé àêòèâíîñòüþ íå íèæå 2 ÌÅ/ìë. Ïîëó÷åííûé ñóììàðíûé ýëþàò ðàçâîäÿò ñòàðòîâûì áóôåðîì äî êîíöåíòðàöèè áåëêà 0,3 – 0,5 %. Íå ñòîèò çàáûâàòü ïðî âàæíûé ýòàï — âèðóñíóþ èíàêòèâàöèþ. Ìåòîä âèðóñíîé èíàêòèâàöèè — ñîëüâåíò-äåòåðãåíòíûé (S/D ìåòîä). Ýòîò ìåòîä ÿâëÿåòñÿ íåñïåöèôè÷åñêèì è ïîçâîëÿåò èíàêòèâèðîâàòü âñå âèðóñû ñ ëèïèäíîé îáîëî÷êîé, â ÷àñòíîñòè ÂÈ×, âèðóñû ãåïàòèòà Ñ è Â, à òàêæå âîçìîæíûå íåèçâåñòíûå âèðóñû ñ ëèïèäíîé îáîëî÷êîé. Âèðóñû ÂÈ×-èíôåêöèè, ãåïàòèòîâ Â è Ñ ÿâëÿþòñÿ íàèáîëåå ïàòîãåííûìè, ïîñêîëüêó èìåþò îòíîñèòåëüíî ñëîæíîå ñòðîåíèå è ëåã÷å ïðåîäîëåâàþò èììóííûé áàðüåð. Îäíàêî S/D îáðàáîòêà ñòîëü äåéñòâåííà, ÷òî âèðóñíàÿ íàãðóçêà â 1 000 000 000 ÷àñòèö/ìë óñòðàíÿåòñÿ ìåíåå ÷åì çà 2 ìèí. Ïðèìåíÿåìûå äåòåðãåíòû Tween-80 èëè Òðèòîí-Õ-100 â ñî÷åòàíèè ñ ãèäðîôîáíûì ðàñòâîðèòåëåì òðè-í-áóòèëôîñôàòîì (TNBP) ðàçðóøàþò ëèïîïðîòåèíîâûå ìåìáðàíû. Îñòàâøèåñÿ ôðàãìåíòû íóêëåèíîâîé êèñëîòû íå îáëàäàþò ïàòîãåííûì äåéñòâèåì. Â ïðèñóòñòâèè äåòåðãåíòà íåâîçìîæíû îáðàòíûå ñîåäèíåíèÿ èëè ðåãåíåðàöèÿ ìåìáðàí. Ýôôåêòèâíîñòü S/D ìåòîäà çàâèñèò îò òåìïåðàòóðû è âðåìåíè âîçäåéñòâèÿ [58, 59]. Â îñíîâó îáåñïå÷åíèÿ âèðóñíîé áåçîïàñíîñòè ïîëó÷àåìûõ ïðåïàðàòîâ òàêæå ïîëîæåíà ñèñòåìà ìåð, âêëþ÷àþùàÿ îáñëåäîâàíèå äîíîðîâ ïåðåä äîíàöèåé, ïîñëåäóþùóþ êàðàíòèíèçàöèþ çàãîòîâëåííîé ñâåæåçàìîðîæåííîé ïëàçìû, ïîâòîðíûé âèðóñîëîãè÷åñêèé êîíòðîëü êàæäîé äîçû ïóëèðóåìîé ñâåæåçàìîðîæåííîé ïëàçìû è âèðóñîëîãè÷åñêèé êîíòðîëü ãîòîâîé ëåêàðñòâåííîé ôîðìû. Ïîñëå îòäåëåíèÿ äåòåðãåíòà ïîëó÷åííóþ ôðàêöèþ ïîäâåðãàþò ãåïàðèí-àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè. Ñïåöèôè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü ôàêòîðà IX, ïîëó÷åííîãî äàííûì ñïîñîáîì, ñîñòàâëÿåò 13 – 20 ÌÅ/ìë, âûõîä äîñòèãàåò 74 – 81 %. Ïîëó÷åííûé ðàñòâîð ïîäâåðãàþò ñòåðèëèçóþùåé ôèëüòðàöèè ÷åðåç ïîðèñòûå ôèëüòðû, ðîçëèâó â ñòåðèëüíûå ôëàêîíû ïî 20 ìë è ëèîôèëèçàöèè [57]. Ãèáêîñòü õðîìàòîãðàôè÷åñêèõ òåõíîëîãèé ïîçâîëÿåò ðàçðåøèòü ïðîáëåìó ñíèæåíèÿ ñòîèìîñòè ïðåïàðàòîâ ïëàçìû, âî-ïåðâûõ, ïîëó÷åíèåì âîçìîæíî áîëüøåãî êîëè÷åñòâà ïðåïàðàòîâ èç åäèíèöû ñûðüÿ; âî-âòîðûõ, ïîâûøåíèåì âûõîäà áåëêà â ïðîöåññå âûäåëåíèÿ. Ýòè ìåðû òåîðåòè÷åñêè äîëæíû ñîêðàòèòü ïðîèçâîäñòâåííûå ïîòåðè äîðîãîñòîÿùèõ áåëêîâûõ ñóáñòàíöèé ïîëó÷àåìûõ ëåêàðñòâåííûõ ñðåäñòâ è ïîâûñèòü ýôôåêòèâíîñòü èñïîëüçîâàíèÿ äîðîãîñòîÿùåãî óíèêàëüíîãî ñûðüÿ, êàêîâûì ÿâëÿåòñÿ ïëàçìà äîíîðñêîé êðîâè. 6.2. Ïîëó÷åíèå ôàêòîðà IX ñ ïîìîùüþ òåõíîëîãèè ðåêîìáèíàíòíûõ ÄÍÊ Ñ ðàçâèòèåì áèîòåõíîëîãèè ñòàëè êîììåð÷åñêè äîñòóïíû áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûå ïðåïàðàòû êîàãóëÿöèîííîãî ôàêòîðà êðîâè, ïîëó÷åííûå ñ ïîìîùüþ òåõíîëîãèè ðåêîìáèíàíòíûõ ÄÍÊ. Ïðè èñïîëüçîâàíèè ðåêîìáèíàíòíûõ ôàêòîðîâ ïî÷òè îòñóòñòâóåò âîçìîæíîñòü ïåðåäà÷è èíôåêöèé ÷åëîâåêà. Ïðè ïîëó÷åíèè ôàêòîðà IX òåõíîëîãèåé ðåêîìáèíàíòíîé ÄÍÊ èñïîëüçóþò ðàçíîîáðàçíûå ýêñïðåññèîííûå ñèñòåìû: áàêòåðèàëüíûå, äðîææåâûå è òàêèå ýóêàðèîòè÷åñêèå ñèñòåìû, êàê êëåòêè íàñåêîìûõ è ìëåêîïèòàþùèõ. Ýêñïðåññèîííûå ñèñòåìû íà îñíîâå êëåòîê ìëåêîïèòàþùèõ ÿâëÿþòñÿ íàèáîëåå ÷àñòî ïðèìåíÿåìûìè ñèñòåìàìè äëÿ ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíîãî ôàêòîðà IX. Ïðèìåðàìè òàêèõ êëåòî÷íûõ ëèíèé ÿâëÿþòñÿ VERO è HeLa êëåòêè, êëåòî÷íûå ëèíèè CHO, MDCK è äð. Ýêñïðåññèîííûå âåêòîðà äëÿ ïîäîáíûõ ñèñòåì îáû÷íî âêëþ÷àþò ó÷àñòîê èíèöèàöèè ðåïëèêàöèè, ïðîìîòîð, ðåãóëèðóþùèé ýêñïðåññèþ ãåíà ôàêòîðà IX, ó÷àñòîê ñâÿçûâàíèÿ ðèáîñîìû, à òàêæå ðåãóëÿòîðíûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè, ñîäåðæàùèå ñàéòû òåðìèíàöèè è ïîëèàäåíèëèðîâàíèÿ. Ýêñïðåññèîííûå âåêòîðà, èñïîëüçóåìûå äëÿ òðàíñôîðìàöèè êëåòîê ìëåêîïèòàþùèõ, çà÷àñòóþ èìåþò âèðóñíóþ ïðèðîäó. Íàïðèìåð, øèðîêî èñïîëüçóþòñÿ òàêèå ïðîìîòîðû, ïîëó÷åííûå èç ãåíîìîâ âèðóñîâ, êàê âèðóñ ïîëèîìû, àäåíîâèðóñ è âèðóñ SV40. Âåêòîðíûå ÄÍÊ òàêæå äîëæíû ñîäåðæàòü ñåëåêòèâíûå ìàðêåðíûå ãåíû: ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 35 Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ äåãèäðîôîëàòðåäóêòàçû èëè òèìèäèíêèíàçû [60]. Íà äàííûé ìîìåíò åäèíñòâåííûì ïðåïàðàòîì ðåêîìáèíàíòíîãî ôàêòîðà IX, èìåþùèìñÿ â ïðîäàæå, ÿâëÿåòñÿ ÁåíåÔÈÊÑ (Pfizer, ÑØÀ). Ýòîò ïðåïàðàò ïðîèçâîäèòñÿ ïî òåõíîëîãèè ðåêîìáèíàíòíûõ ÄÍÊ ñ èñïîëüçîâàíèåì ïðîöåññîâ ïðîèçâîäñòâà è î÷èñòêè áåç ýêçîãåííûõ ïðîäóêòîâ ÷åëîâå÷åñêîãî è æèâîòíîãî ïðîèñõîæäåíèÿ. Ê îñíîâíûì õàðàêòåðíûì ÷åðòàì äàííîãî ïðîèçâîäñòâà ìîæíî îòíåñòè ñëåäóþùèå: â êëåòî÷íîé êóëüòóðå è êîíå÷íîì ïðîäóêòå îòñóòñòâóåò àëüáóìèí, îòñóòñòâóåò íåîáõîäèìîñòü â ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåëàõ, â ïðîöåññàõ î÷èñòêè ïðèìåíÿåòñÿ ìíîãîñòàäèéíàÿ õðîìàòîãðàôèÿ è íàíîôèëüòðàöèÿ [61]. Êëþ÷åâûìè ñòàäèÿìè ïðîèçâîäñòâà ðåêîìáèíàíòíîãî ôàêòîðà IX (ÁåíåÔÈÊÑ) ÿâëÿþòñÿ: l ñòàáèëüíîå âíåäðåíèå ãåíîâ ôàêòîðà IX â êëåòêè CHO; l îòáîð êëåòî÷íîé ëèíèè, ñïîñîáíîé ýêñïðåññèðîâàòü áîëüøèå êîëè÷åñòâà àêòèâíîãî ðåêîìáèíàíòíîãî ôàêòîðà IX ïðè ðîñòå â áèîðåàêòîðàõ â ïèòàòåëüíîé ñðåäå, ïîëíîñòüþ ñâîáîäíîé îò ïðîäóêòîâ êðîâè èëè ïëàçìû; l ñòàäèè õðîìàòîãðàôèè, íè îäíà èç êîòîðûõ íå òðåáóåò ïðèìåíåíèÿ ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë; ñòàäèÿ î÷èñòêè íàíîôèëüòðàöèåé âêëþ÷åíà êàê äîïîëíèòåëüíûé óðîâåíü âèðóñíîé áåçîïàñíîñòè. Ê ïðèìåðó, íà äàííîì ýòàïå ìîãóò áûòü ïðèìåíåíû ôèëüòðû ñ ìåìáðàíîé ðàçìåðîì 70, îòôèëüòðîâûâàþùèå êðóïíûå áåëêè è âèðóñíûå ÷àñòèöû >70 êÄà. Ïðè ïîëó÷åíèè âèòàìèí K-çàâèñèìûõ áåëêîâ ðåêîìáèíàíòíûìè òåõíîëîãèÿìè äîñòèæåíèå âûñîêèõ óðîâíåé àêòèâíûõ áåëêîâ ëèìèòèðóåòñÿ ñòðóêòóðíîé ñëîæíîñòüþ ýòèõ áåëêîâ è îòñóòñòâèåì êëåòî÷íûõ ñèñòåì, îáåñïå÷èâàþùèõ ýôôåêòèâíóþ è ïîëíîöåííóþ ïîñòòðàíñëÿöèîííóþ ìîäèôèêàöèþ. Ïðåïàðàòû ôàêòîðà IX, ïîëó÷åííûå â êëåòêàõ CHO, íå ñòîëü ýôôåêòèâíû äëÿ ëå÷åíèÿ ãåìîôèëèè B, ïîñêîëüêó â ýòîé ñèñòåìå íå ïðîèñõîäèò íàäëåæàùåãî ïðîöåññèíãà è, ñëåäîâàòåëüíî, áèîäîñòóïíîñòü ïðåïàðàòà õàðàêòåðèçóåòñÿ âàðèàáåëüíîñòüþ. Íèçêîå ñîäåðæàíèå àêòèâíîé ôîðìû ôàêòîðà IX ïðè åãî ïîëó÷åíèè â êëåòêàõ CHO îáóñëîâëåíî îãðàíè÷åííîé ñïîñîáíîñòüþ ýòèõ êëåòîê ê ïîëíîöåííîìó ãàììà-êàðáîêñèëèðîâàíèþ ïåðâûõ 12 à.î. N-êîíöåâîãî ó÷àñòêà áåëêà. Ïîòåðÿ òðåõ êàðáîêñèëüíûõ ãðóïï ïðèâîäèò ê çíà÷èòåëüíîìó óìåíüøåíèþ àêòèâíîñòè ôàêòîðà IX. Â ðàáîòå [60] îïèñàí ìåòîä ïîëó÷åíèÿ áèîëîãè÷åñêè àêòèâíûõ ðåêîìáèíàíòíûõ âèòàìèí K-çàâèñèìûõ áåëêîâ, â ÷àñòíîñòè ôàêòîðà IX. 36 Ýêñïðåññèîííûìè ñèñòåìàìè, ïðèìåíÿåìûìè â ýòîì ìåòîäå, ÿâëÿþòñÿ êëåòî÷íûå ëèíèè CHO è HEK 293. Ìåòîä îñíîâàí íà êîýêñïðåññèè îäíîãî èëè áîëåå ôàêòîðîâ ïðîöåññèíãà, íàïðèìåð, âèòàìèí K-ýïîêñèä-ðåäóêòàçû è âèòàìèí Ê-çàâèñèìîé ãàììà-ãëóòàìèë êàðáîêñèëàçû. Ýïîêñèä-ðåäóêòàçà âèòàìèíà K ïåðåâîäèò íåàêòèâíóþ (îêèñëåííóþ) ôîðìó âèòàìèíà K, ïîñòóïàþùóþ â îðãàíèçì, â àêòèâíóþ (ðåäóöèðîâàííóþ) ôîðìó, ó÷àñòâóþùóþ â ïîñòòðàíñëÿöèîííîì êàðáîêñèëèðîâàíèè âèòàìèí K-çàâèñèìûõ áåëêîâ. Âèòàìèí K-çàâèñèìàÿ ãàììàãëóòàìèë êàðáîêñèëàçà — ôåðìåíò, êàðáîêñèëèðóþùèé îñòàòêè ãëóòàìèíîâîé êèñëîòû. Òàêèì îáðàçîì, äàííûé ìåòîä îáåñïå÷èâàåò ýôôåêòèâíóþ ïîñòòðàíñëÿöèîííóþ ìîäèôèêàöèþ âèòàìèí K-çàâèñèìûõ áåëêîâ ðåêîìáèíàíòíûìè êëåòêàìè è ïîçâîëÿåò ïîëó÷àòü ôàêòîð IX ñ âûñîêèì ñîäåðæàíèåì àêòèâíîé ôîðìû. Î÷èñòêó ðåêîìáèíàíòíîãî ôàêòîðà IX ïðîâîäÿò ñòàíäàðòíûìè õðîìàòîãðàôè÷åñêèìè ìåòîäàìè. Ïîñëå ïðîöåññà ôåðìåíòàöèè êëåòêè îòäåëÿþò îò êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè ìåòîäîì òàíãåíöèàëüíîé ôèëüòðàöèè. Îñíîâíûìè ýòàïàìè ïðîöåññà âûäåëåíèÿ è î÷èñòêè â ðàáîòå [62] ÿâëÿþòñÿ: l î÷èñòêà ôàêòîðà IX ïñåâäî-àôôèííîé õðîìàòîãðàôèåé íà Q-Sepharose FF (GE Healthcare, Øâåöèÿ), ïðè êîòîðîé ñîðáöèÿ îñóùåñòâëÿåòñÿ â êëàññè÷åñêîì ðåæèìå èîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè íà àíèîíèòå, à äåñîðáöèÿ - çà ñ÷åò êîíôîðìàöèîííûõ èçìåíåíèé ìîëåêóëû ôàêòîðà IX ïðè ñíèæåíèè êîíöåíòðàöèè õëîðèäà êàëüöèÿ äî 10 ìÌ; l äëÿ íàèáîëåå ïîëíîé î÷èñòêè ôàêòîðà IX îò ïðèìåñíûõ áåëêîâ èñïîëüçóþò õðîìàòîãðàôèþ íà ñîðáåíòå Matres Cellufine Sulfate (Chisso, ßïîíèÿ), êîòîðûé ÿâëÿåòñÿ àíàëîãîì ñîðáåíòà ñ èììîáèëèçîâàííûì ãåïàðèíîì; l õðîìàòîãðàôèÿ íà ãèäðîêñèàïàòèòíîé êåðàìèêå, ïðèìåíÿåìàÿ äëÿ îòäåëåíèÿ íåàêòèâíûõ ôîðì ôàêòîðà IX è îñòàâøèõñÿ ïðèìåñåé, à òàêæå äëÿ çàìåíû áóôåðà; l îêîí÷àòåëüíàÿ î÷èñòêà áåëêà ìåòîäîì ìåòàëë-õåëàòíîé àôôèíîé õðîìàòîãðàôèè; l ñî÷åòàíèå ñòàäèé óëüòðàôèëüòðàöèè/äèàôèëüòðàöèè äëÿ êîíöåíòðèðîâàíèÿ è ïåðåáóôåðèðîâàíèÿ ôàêòîðà IX. Òàêèì îáðàçîì, ðåêîìáèíàíòíûå ïðåïàðàòû áåçîïàñíû ñ ýïèäåìèîëîãè÷åñêîé òî÷êè çðåíèÿ, çíà÷èòåëüíî ñíèæàþò ðèñê ïàòîãåííûõ êîíòàìèíàöèé, âîçíèêàþùèé â ñëó÷àå êîììåð÷åñêèõ ïðåïàðàòîâ âûñîêîé ÷èñòîòû, ïîëó÷åííûõ èç äîíîðñêîé êðîâè. ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ 7. ÔÎËËÈÒÐÎÏÈÍ Ôîëëèêóëîñòèìóëèðóþùèé ãîðìîí (ôîëëèòðîïèí, ÔÑÃ) — ãëèêîïðîòåèä ñ ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé îêîëî 30 êÄà. Åãî ìîëåêóëà ñîñòîèò èç a- è b-öåïåé (ñóáúåäèíèö): a-öåïü àíàëîãè÷íà a-öåïè ëþòåèíèçèðóþùåãî ãîðìîíà (ËÃ) è íå îáëàäàåò ãîðìîíàëüíîé àêòèâíîñòüþ. Ñïåöèôè÷åñêîå ãîðìîíàëüíîå äåéñòâèå ñâÿçàíî ñ b-öåïüþ, îäíàêî äëÿ ïðîÿâëåíèÿ ãîðìîíàëüíîé àêòèâíîñòè íåîáõîäèìû îáå ñóáúåäèíèöû. ÔÑÃ ñåêðåòèðóåòñÿ áàçîôèëüíûìè êëåòêàìè àäåíîãèïîôèçà â îòâåò íà ñåêðåöèþ ãîíàäîòðîïèí-ðèëèçèíã ôàêòîðîâ ãèïîòàëàìóñà. Ó æåíùèí ÔÑÃ êîíòðîëèðóåò öèêëè÷åñêèå èçìåíåíèÿ ÿè÷íèêîâ âî âðåìÿ íîðìàëüíîãî ìåíñòðóàëüíîãî öèêëà. Ñòåðîèäû ÿè÷íèêîâ ìîäåëèðóþò ñåêðåöèþ ÔÑÃ, êîòîðàÿ â ñâîþ î÷åðåäü ðåãóëèðóåò ìåíñòðóàëüíûé öèêë. Ó ìóæ÷èí ÔÑÃ, ËÃ è òåñòîñòåðîí ñòèìóëèðóþò ñïåðìàòîãåíåç â ñåìåííûõ êàíàëüöàõ ÿè÷åê. Ôîëëèòðîïèí-a — ðåêîìáèíàíòíûé ÔÑÃ, ïîëó÷åííûé ìåòîäîì ãåííîé èíæåíåðèè èç êëåòîê ÑÍÎ, ñòèìóëèðóåò îáðàçîâàíèå ôîëëèêóëîâ. Îäíèì èç ïðèìåðîâ ýêñïðåññèè ÔÑÃ ñ èñïîëüçîâàíèåì ðåêîìáèíàíòíîé òåõíîëîãèè ÿâëÿåòñÿ òðàíñôåêöèÿ ýóêàðèîòè÷åñêèõ êëåòîê ñ ÄÍÊ ïîñëåäîâàòåëüíîñòüþ, êîäèðóþùåé a- è b-ñóáúåäèíèöû ÔÑÃ. 7.1. Âåêòîð ýêñïðåññèè ðåêîìáèíàíòíîãî ôîëëèòðîïèíà Òàê êàê ÔÑÃ ñîñòîèò èç a- è b-ñóáúåäèíèö, òî äëÿ ýêñïðåññèè îáåèõ ñóáúåäèíèö íåîáõîäèì ëèáî îäèí âåêòîð, ñîäåðæàùèé ïðîìîòîð äëÿ êàæäîé èç íèõ, ëèáî äâà âåêòîðà äëÿ êàæäîé ñóáúåäèíèöû â îòäåëüíîñòè. Êðîìå òîãî, êàæäûé âåêòîð ýêñïðåññèè ìëåêîïèòàþùèõ ñîäåðæèò ýëåìåíòû, êîòîðûå ìîãóò ïðèñóòñòâîâàòü íà îäíîì èëè íåñêîëüêèõ âåêòîðàõ, âêëþ÷àÿ ýíõàíñåðû è ïðîìåæóòî÷íûå ïîñëåäîâàòåëüíîñòè â îêðóæåíèè äîíîðíûõ è àêöåïòîðíûõ ñàéòîâ ñïëàéñèíãà äëÿ ÐÍÊ [63]. Âûñîêîýôôåêòèâíàÿ òðàíñêðèïöèÿ ìîæåò áûòü äîñòèãíóòà ïî ñðåäñòâàì ïðîìîòîðîâ èç SV40, äëèííûõ êîíöåâûõ ïîâòîðîâ îò ðåòðîâèðóñîâ, íàïðèìåð, RSV, HTLVI, HIVI è ïðîìîòîðà öèòîìåãàëîâèðóñà (ÖÌÂ). Òàêæå ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû êëåòî÷íûå ýëåìåíòû (íàïðèìåð, ÷åëîâå÷åñêèé ïðîìîòîð àêòèíà). Â êà÷åñòâå êëåòîê-õîçÿèíà ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû êëåòêè ìëåêîïèòàþùèõ, ñîäåðæàùèå ÷åëîâå÷åñêèé Hela 293, H9 è Jurkat, ìûøèíûé NIH3T3 è C127, êëåòêè Cos 1 Cos 7 è CV 1, ïåðåïåëèíûå QC1 – 3, êëåòêè ìûøåé L è êëåòêè ÑÍÎ. Òðàíñôåêòíàÿ ÄÍÊ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü äëÿ ñóáúåäèíèö ìîæåò áûòü óñèëåíà äëÿ òîãî, ÷òîáû òðàíñëèðîâàòü áîëüøåå êîëè÷åñòâî çàêîäèðîâàííîãî ïîëèïåïòèäà. Ìàðêåð DHFR (äèãèäðîôîëàòðåäóêòàçà) íåîáõîäèì äëÿ ðàçðàáîòêè êëåòî÷íûõ ëèíèé, êîòîðûå ïåðåíîñÿò íåñêîëüêî ñîòåí èëè äàæå íåñêîëüêî òûñÿ÷ êîïèé ÄÍÊ. Ôåðìåíò ãëþòàìèí ñèíòàçû (GS) òàêæå ÿâëÿåòñÿ íåîáõîäèìûì [64]. Èñïîëüçóÿ ýòè ìàðêåðû, êëåòêè ìëåêîïèòàþùèõ ðàñòóò â ñåëåêòèâíûõ ñðåäàõ, à çàòåì èç íèõ âûäåëÿþòñÿ êëåòêè ñ âûñîêîé ðåçèñòåíòíîñòüþ. Ýòè êëåòî÷íûå ëèíèè ñîäåðæàò óñèëåííûé ãåí, èíòåãðèðîâàííûé â õðîìîñîìó. Êëåòêè ÑÍÎ ÷àñòî èñïîëüçóåòñÿ äëÿ ïðîèçâîäñòâà áåëêîâ è ïîëèïåïòèäîâ. Ýêñïðåññèîííàÿ ïëàçìèäà äëÿ ÔÑÃ ïðîèçâîäèòñÿ êëîíèðîâàíèåì êîìïëåìåíòàðíîé ÄÍÊ, êîäèðóþùåé ÔÑÃ â âåêòîð ýêñïðåññèè pcDNAI / Amp èëè pcDNAIII (êîòîðàÿ ìîæåò áûòü ïîëó÷åíà îò Invitrogen, Inc., ÑØÀ) Êàê óïîìèíàëîñü ðàíåå, êàæäàÿ ñóáúåäèíèöà òðåáóåò ýêñïðåññèè äëÿ ïîëó÷åíèÿ ôóíêöèîíàëüíîãî ãåòåðîäèìåðà ëèáî èç íåçàâèñèìîãî ââåäåíèÿ îòäåëüíûõ âåêòîðîâ â êëåòêè-õîçÿèíà, ëèáî èç îäíîãî âåêòîðà, ýêñïðåññèðóþùåãî a- è b-ñóáúåäèíèöû. Êàññåòà âåêòîðà ýêñïðåññèè ñîäåðæèò êîäèðóþùèå ÄÍÊ ïîñëåäîâàòåëüíîñòè äëÿ a-ñóáúåäèíèöû — SEQ ID NO: 5; äëÿ a-ñóáúåäèíèöû — SEQ ID NO: 11 è íàõîäÿòñÿ ïîä êîíòðîëåì äâóõ ðàçíûõ ïðîìîòîðîâ: CMV äëÿ b-ñóáúåäèíèöû è EF1 äëÿ á-ñóáúåäèíèöû. Êàæäàÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòü a- è b-ñóáúåäèíèöû èñïîëüçóåò áû÷èé ãîðìîí ðîñòà ïîëèÀ. Êðîìå òîãî, âåêòîð ñîäåðæèò ãåí ãëóòàìèí ñèíòåòàçû, óïðàâëÿåìûé ïðîìîòîðîì SV40 è ñîäåðæàùèé õâîñò ïîëèÀ SV40, è èñïîëüçóåòñÿ â êà÷åñòâå ñåëåêòèâíîãî ìàðêåðà. Ýòîò âåêòîð áûë èñïîëüçîâàí äëÿ òðàíñôåêöèè CHO-Ê1 êëåòîê [65]. Ëèíèÿ êëåòîê âûðàùèâàåòñÿ â GibcoBRL CD ÑÍÎ ïîä ñåëåêòèâíûì äàâëåíèåì L-ìåòèîíèí ñóëüôîêñèìèíà. ÈÔÀ èñïîëüçóåòñÿ äëÿ îïðåäåëåíèÿ ÔÑÃ. 7.2. Î÷èñòêà ðåêîìáèíàíòíîãî ÔÑÃ Î÷èñòêà ãåòåðîäèìåðà ÔÑÃ, ñîñòîÿùåãî èç a- è b-ñóáúåäèíèö, ìîæåò áûòü îñóùåñòâëåíà èç ìîíîñëîÿ èëè ñóñïåíçèîííîé êóëüòóðû êëåòîê CHO-Ê1 ðÿäîì ìåòîäîâ. Óêàçàííûì íèæå ñïîñîáîì î÷èñòêè ìîæíî ïîëó÷èòü ðåêîìáèíàíòíûé ÔÑÃ ìàêñèìàëüíî âûñîêîé ÷èñòîòû, êîòîðûé ìîæåò áûòü ïðåäñòàâëåí â ãîòîâîì ëåêàðñòâåííîì ñðåäñòâå, íàïðèìåð, Ãîíàë-Ô (Serono-Merck, Ãåðìàíèÿ, Øâåéöàðèÿ). Ýòîò ìåòîä èìååò ïðåèìóùåñòâî îáåñïå÷èâàòü âûñî- ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 37 Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ êóþ ñòåïåíü ÷èñòîòû áåç èñïîëüçîâàíèÿ èììóíîàôôèííîé õðîìàòîãðàôèè [66]. Àíòèîêñèäàíò ïðèñóòñòâóåò â ëþáîì èç áóôåðîâ, èñïîëüçóåìûõ äëÿ î÷èñòêè è / èëè êîíöåíòðàöèè è / èëè ôèëüòðîâàíèè ÔÑÃ. Àíòèîêñèäàíò ïðåäîòâðàùàåò îêèñëåíèå ÔÑÃ âî âðåìÿ îáðàáîòêè. Ïðåäïî÷òèòåëüíûì àíòèîêñèäàíòîì ÿâëÿåòñÿ L-ìåòèîíèí, êîòîðûé ïðåäïî÷òèòåëüíî èñïîëüçîâàòü â êîíöåíòðàöèè 10 – 100 ìÌ. Òàêæå â êà÷åñòâå àíòèîêñèäàíòîâ ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàí òðåò-áóòèë-4-ìåòîêñèôåíîë, 2,6-áèñ(1,1-äèìåòèëýòèë)-4-ìåòèëôåíîë, áèìåòàáèñóëüôèò íàòðèÿ èëè êàëèÿ, áèñóëüôèò íàòðèÿ. Ïðèìåðàìè ñâîáîäíûõ àìèíîêèñëîò è äèïåïòèäîâ ñ àíòèîêñèäàíòíûì ýôôåêòîì ÿâëÿþòñÿ ãèñòèäèí, òàóðèí, ãëèöèí, àëàíèí, êàðíîçèí, 1-ìåòèëãèñòèäèí èëè èõ êîìáèíàöèè [67]. Êàê ïðàâèëî, èñõîäíûé ìàòåðèàë î÷èùàþò, à çàòåì, ïî âîçìîæíîñòè, êîíöåíòðèðóþò, íàïðèìåð, óëüòðàôèëüòðàöèåé è äèàôèëüòðàöèåé. Íà ñòàäèè î÷èñòêè ïðèìåíÿþò àôôèííóþ õðîìàòîãðàôèþ ñ èñïîëüçîâàíèåì êðàñèòåëÿ ãîëóáîãî (íàïðèìåð, Blue Dye Sepharose, GE Healthcare, Øâåöèÿ), õðîìàòîãðàôèþ ãèäðîôîáíûõ âçàèìîäåéñòâèé (ÕÃÂ) è ÎÔ ÂÝÆÕ. Ïåðâûì ýòàïîì ÿâëÿåòñÿ àôôèííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì êðàñèòåëÿ. Â äàííîì ñëó÷àå îíà îñóùåñòâëÿåòñÿ ñ ïîìîùüþ ìàòðèöû, èìåþùåé â êà÷åñòâå èììîáèëèçîâàííûõ ëèãàíäîâ øèðîêî èçâåñòíîå êðàñÿùåå ñîåäèíåíèå, Cibacron Ñèíèé F3G-A. Õðîìàòîãðàôèÿ òàêæå ìîæåò áûòü âûïîëíåíà ñ àëüòåðíàòèâíûìè âèäàìè ìàòðèö, èìåþùèìè àíàëîãè÷íûå õàðàêòåðèñòèêè. Ïðèìåðàìè àëüòåðíàòèâíûõ ìàòðèö ÿâëÿþòñÿ: Toyopearl AF-blue-HC-650M (Tosoh, ßïîíèÿ), Toyopearl SuperButyl 550 (Tosoh), Toyopearl Phenyl 650 (Tosoh), ñèíèé Cellthru BigBead (Sterogene, ÑØÀ), SwellGel Blue (Pierce, ÑØÀ), Cibachrome Blue3GA-àãàðîçû 100 (Sigma, Ãåðìàíèÿ), AffiGel Blue (Bio-Rad, ÑØÀ), Econo-Pac blue cartridges (Bio-Rad), Blue sepharose HP (GE Healthcare), Cibacron Ñèíèé 3GA (Sigma). Êóëüòóðó êëåòîê, ñîäåðæàùóþ ÔÑÃ, íàíîñÿò íåïîñðåäñòâåííî íà ìàòðèöó. Ïîñëå íàíåñåíèÿ ñîðáåíò ïðîìûâàþò óðàâíîâåøèâàþùèì áóôåðîì, à çàòåì ýëþèðóþò ôîñôàòíûì áóôåðîì, ïðåäïî÷òèòåëüíåå ôîñôàòîì íàòðèÿ; pH ýëþåíòà ïîääåðæèâàþò 6,0 – 8,0. Áóôåð äëÿ ýëþèðîâàíèÿ äîëæåí ñîäåðæàòü ñîëè, ïðåäïî÷òèòåëüíî NaCl, äëÿ óâåëè÷åíèÿ ïðîâîäèìîñòè, à òàêæå àíòèîêñèäàíò, íàïðèìåð L-ìåòèîíèí. Ïåðâûé ýòàï î÷èñòêè îñóùåñòâëÿåòñÿ ïðè 2 – 8 °Ñ. Âòîðîé øàã — ÕÃÂ. Â ïðåäïî÷òèòåëüíîì âàðèàíòå ÕÃÂ îñóùåñòâëÿþò íà ñîðáåíòå áóòèë 38 Toyopearl 650M (Tosoh) ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Òàêæå ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû àëüòåðíàòèâíûå òèïû ìàòðèö, èìåþùèå àíàëîãè÷íûå õàðàêòåðèñòèêè: Phenyl Sepharose 6 Fast Flow; Butyl Sepharose 4 Fast Flow; Octyl Sepharose 4 Fast Flow; Source 15PHE (GE Healthcare). Ñâÿçûâàíèå â ÕÃÂ ïðîâîäÿò â áóôåðå ñ âûñîêîé ïðîâîäèìîñòüþ (âûñîêîé êîíöåíòðàöèåé NaCl, (NH4)2SO4 èëè Na2SO4). Ýëþèðóþò íà ýòàïå ÕÃÂ ïðåèìóùåñòâåííî çà ñ÷åò ñíèæåíèÿ ïðîâîäèìîñòè ïîäâèæíîé ôàçû (ñíèæåíèÿ êîíöåíòðàöèè ñîëåé) áóôåðîì ñ pH 6 – 8, ïðè÷åì íàèáîëåå ïðåäïî÷òèòåëüíî çíà÷åíèå äëÿ pH îêîëî 7,0. Â êà÷åñòâå áóôåðà èñïîëüçóþò ôîñôàò íàòðèÿ èëè ñóëüôàò àììîíèÿ, òàêæå áóôåð äîëæåí ñîäåðæàòü àíòèîêñèäàíò, íàïðèìåð L-ìåòèîíèí. Çàêëþ÷èòåëüíûì ýòàïîì ÿâëÿåòñÿ ÎÔ ÂÝÆÕ, êîòîðóþ ïðåäïî÷òèòåëüíî ïðîâîäèòü íà ñîðáåíòå SOURCE 30 RPC (GE Healthcare) ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå ñ èñïîëüçîâàíèåì ñëåãêà ùåëî÷íîé ìîáèëüíîé áóôåðíîé ôàçû, íàïðèìåð àöåòàòà àììîííèÿ, pH 7,0 – 8,5. Áóôåðíûé ðàñòâîð íà äàííîì ýòàïå î÷èñòêè ñîäåðæèò îðãàíè÷åñêèå ìîäèôèêàòîðû, êîíöåíòðàöèÿ êîòîðûõ èçìåíÿåòñÿ äëÿ ðàçëè÷íûõ ýòàïîâ õðîìàòîãðàôèè (óðàâíîâåøèâàíèå êîëîíêè, íàíåñåíèå îáðàçöà, ýëþèðîâàíèå è ðåãåíåðàöèÿ). Â êà÷åñòâå îðãàíè÷åñêèõ ìîäèôèêàòîðîâ èñïîëüçóþò âîäîðàñòâîðèìûå îðãàíè÷åñêèå ðàñòâîðèòåëè, íàïðèìåð ñïèðòû (ìåòàíîë, ýòàíîë è äð.), ÷àùå âñåãî èçîïðîïàíîë. Äîïîëíèòåëüíî òàêæå ïðîâîäÿò î÷èñòêó ìåòîäîì àíèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè, ãäå â êà÷åñòâå ñîðáåíòà èñïîëüçóþò Q Sepharose FF (GE Healthcare). Èîíîîáìåííóþ õðîìàòîãðàôèþ ïðåäïî÷òèòåëüíî ïðîâîäèòü ñ èñïîëüçîâàíèåì áóôåðà ñ óìåðåííî ùåëî÷íîé ñðåäîé (pH îêîëî 8,5). Ïîäõîäÿùèìè áóôåðàìè ÿâëÿþòñÿ, íàïðèìåð, áîðàòíûé áóôåð, òðèýòàíîëàìèí/Tris, àöåòàò àììîíèÿ, áèöèí, TES, HEPES. Íàèáîëåå ïðåäïî÷òèòåëüíûì ÿâëÿåòñÿ áîðàòíûé áóôåð, pH 8,5. Ýëþèðîâàíèå äîñòèãàåòñÿ çà ñ÷åò óâåëè÷åíèÿ ýëåêòðîïðîâîäíîñòè ïîäâèæíîé ôàçû çà ñ÷åò äîáàâëåíèÿ ñîëè NaCl. Äî øàãà èîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè, ìîæåò áûòü ïðîâåäåíà óëüòðàôèëüòðàöèÿ (èëè äèàôèëüòðàöèÿ), êîòîðóþ ïðåäïî÷òèòåëüíî ïðîâîäèòü ñ èñïîëüçîâàíèåì ìåìáðàí ñ ïðåäåëîì îòñå÷åíèÿ 8 êÄà ïðè 2 – 8 °Ñ. Äîïîëíèòåëüíî ïðîâîäÿò åùå îäèí øàã î÷èñòêè — âòîðîé ýòàï àíèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè. ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ Â êà÷åñòâå ïîëèìåðà èñïîëüçóþò Fractogel EMD TMAE HICAP (Merck, Ãåðìàíèÿ). Êðîìå òîãî, âòîðîé ýòàï àíèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè ìîæåò áûòü îñóùåñòâëåí íà Q Sepharose FF. Äîïîëíèòåëüíûì ýòàïîì âûäåëåíèÿ ÿâëÿåòñÿ óëüòðàôèëüòðàöèÿ/äèàôèëüòðàöèÿ [68]. Â îäíîì èç ìåòîäîâ î÷èñòêè ïîñëå ëþáîé èç ñòóïåíåé õðîìàòîãðàôèè (îñîáåííî ïîñëå ÎÔ ÂÝÆÕ) îáðàçåö ÔÑÃ ïîäâåðãàþò êîíöåíòðèðîâàíèþ ïðåäïî÷òèòåëüíî óëüòðàôèëüòðàöèåé, ïðîâîäèìîé ñ èñïîëüçîâàíèåì ìåìáðàí ñ ïðåäåëîì îòñå÷åíèÿ 5 êÄà. Âñå ïåðå÷èñëåííûå ýòàïû î÷èñòêè ÔÑÃ æåëàòåëüíî ïðîâîäèòü â ñëåäóþùåì ïîðÿäêå: 1. Óëüòðàôèëüòðàöèÿ (ìåìáðàíà ñ ïðåäåëîì îòñå÷åíèÿ 8 êÄà). 2. Àíèîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ (ñ èñïîëüçîâàíèåì Q Sepharose FF). 3. Àôôèííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì êðàñèòåëÿ (Blue Dye Sepharose FF). 4. ÕÃÂ ñ èñïîëüçîâàíèåì Phenyl Toyoperl 650M. 5. ÎÔ ÂÝÆÕ (Source 30RPC). 6. Àíèîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ (Fractogel END TMAE HICAP). 7. Óëüòðàôèëüòðàöèÿ (ìåìáðàíà ñ ïðåäåëîì îòñå÷åíèÿ 5 êÄà). Äëÿ óäàëåíèÿ âèðóñîâ, ñíèæåíèÿ ðèñêà çàãðÿçíåíèÿ ÔÑÃ âèðóñàìè èç êëåòî÷íîé êóëüòóðû íåîáõîäèìî ïðîâîäèòü íàíîôèëüòðàöèþ. Åå ìîæíî ñäåëàòü íà ëþáîé ñòàäèè ïðîöåññà î÷èñòêè ïðè 2 – 8 °Ñ, îäíàêî ëîãè÷íåå âñåãî ïîñëå 2-ãî ýòàïà èîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè èëè ïîñëå ÎÔ ÂÝÆÕ [67]. Î÷èùåííûå ôðàêöèè ÔÑÃ çàìîðàæèâàþò è ëèîôèëèçèðóþò äëÿ ïîëó÷åíèÿ ïîëíîöåííîé ÀÔÑ [69]. èçáàâèòñÿ îò ïðèìåñåé, ñâÿçàííûõ ñ òåõíîëîãè÷åñêèì ïðîöåññîì [73]. 8. ÌÎÍÎÊËÎÍÀËÜÍÛÅ ÀÍÒÈÒÅËÀ 8.1.1 Ïîëó÷åíèå ÌÀÁ Îñîáóþ ãðóïïó òåðàïåâòè÷åñêèõ áåëêîâ ñîñòàâëÿþò ìîíîêëîíàëüíûå àíòèòåëà (ÌÀÁ) áëàãîäàðÿ îñîáåííîñòÿì èõ ñòðîåíèÿ è ïðîèçâîäñòâà. Â íàñòîÿùåå âðåìÿ ðàçðàáîòàí îáùèé ïîäõîä ê ïðîèçâîäñòâó è î÷èñòêå ÌÀÁ, êîòîðûå ìîãóò áûòü ïîëó÷åíû ñ èñïîëüçîâàíèåì ãèáðèäîìíîé òåõíîëîãèè (êàê, íàïðèìåð, Öåòóêñèìàá), à òàêæå ñ ïîìîùüþ ëèíèé êëåòîê ÑÍÎ, ñîäåðæàùèõ âåêòîð ýêñïðåññèè öåëåâîãî áåëêà (Ðèòóêñèìàá, Ãåðöåïòèí). Î÷èñòêà îñóùåñòâëÿåòñÿ ñî÷åòàíèåì ìåòîäîâ âèðóñíîé àêòèâàöèè è õðîìàòîãðàôè÷åñêèõ ìåòîäîâ. Ïðåæäå âñåãî ýòî àôôèííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ äëÿ çàõâàòà ðåêîìáèíàíòíûõ ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë èç êóëüòóðàëüíîé ñðåäû è èîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ, ïîçâîëÿþùàÿ 8.1. Öåòóêñèìàá Öåòóêñèìàá (ëàòèíñêîå íàçâàíèå Erbitux ) ðàçðàáîòàí Merck KGaA (Ãåðìàíèÿ) è ImClone Systems Incorporated/Bristol-Myers Squibb (ÑØÀ) äëÿ ëå÷åíèÿ íåêîòîðûõ âèäîâ ðàêà ó ÷åëîâåêà, â òîì ÷èñëå êîëîðåêòàëüíîãî ðàêà, ïëîñêîêëåòî÷íîãî ðàêà ãîëîâû è øåè, ðàêà íîñîãëîòêè, ïîäæåëóäî÷íîé æåëåçû, ðàêà ÿè÷íèêîâ è íåìåëêîêëåòî÷íîãî ðàêà ëåãêîãî. Ñòîèìîñòü ëå÷åíèÿ äàííûì ïðåïàðàòîì îáõîäèòñÿ ïàöèåíòàì ïðèìåðíî â 30 000$ â òå÷åíèå âîñüìè íåäåëü êîìïëåêñíîãî ëå÷åíèÿ [69]. Öåòóêñèìàá ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ðåêîìáèíàíòíûå ÌÀÁ, êîòîðûå ñïåöèôè÷åñêè ñâÿçûâàþòñÿ ñ âíåêëåòî÷íûì äîìåíîì ÷åëîâå÷åñêîãî ðåöåïòîðà ýïèäåðìàëüíîãî ôàêòîðà ðîñòà (EGFR, HER1, ErbB1) [70, 71]. Ðåöåïòîð ýïèäåðìàëüíîãî ôàêòîðà ðîñòà ÿâëÿåòñÿ êëèíè÷åñêè ïîäòâåðæäåííîé ìîëåêóëÿðíîé «ìèøåíüþ». Ñâÿçûâàíèå Öåòóêñèìàáà ñ ðåöåïòîðîì âûçûâàåò äèìåðèçàöèþ ðåöåïòîðà, ýíäîöèòîç è ðàçðóøåíèå êîìïëåêñà àíòèòåëî–àíòèãåí, â ðåçóëüòàòå ÷èñëî ðåöåïòîðîâ íà ïîâåðõíîñòè îïóõîëåâîé êëåòêè óìåíüøàåòñÿ [72]. Öåòóêñèìàá ñîñòîèò èç âàðèàáåëüíûõ ôðàãìåíòîâ ìûøèíûõ àíòèòåë è òÿæåëûõ è ëåãêèõ öåïåé ÷åëîâå÷åñêîãî IgGl è ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé ÷åòûðå ïîëèïåïòèäíûå öåïè: äâå èäåíòè÷íûå òÿæåëûå (g) öåïè, êàæäàÿ èç êîòîðûõ ñîñòîèò èç 449 à.î.; äâå èäåíòè÷íûå ëåãêèå (k) öåïè, êàæäàÿ èç êîòîðûõ ñîñòîèò èç 214 à.î. Â ñòðóêòóðå öåïåé ïðèñóòñòâóåò ôóíêöèîíàëüíûé äîìåí ìûøèíîãî àíòèòåëà (Ì225) ê ðåöåïòîðó ýïèäåðìàëüíîãî ôàêòîðà ðîñòà ÷åëîâåêà. Ìîëåêóëÿðíàÿ ìàññà àíòèòåëà îêîëî 152 êÄà. Öåòóêñèìàá ïðîèçâîäÿò â êëåòî÷íîé ëèíèè ìûøèíîé ìèåëîìû. Ãèáðèäíàÿ êëåòî÷íàÿ ëèíèÿ, ïîëó÷åííàÿ â ðåçóëüòàòå ñëèÿíèÿ êëåòîê äâóõ âèäîâ, ñïîñîáíûõ ê îáðàçîâàíèþ àíòèòåë, òàêèõ êàê Â-ëèìôîöèòû èììóíèçèðîâàííîãî æèâîòíîãî è ðàêîâûõ êëåòîê ìèåëîìû, ïîëó÷èëà íàçâàíèå ãèáðèäîìà. Êëåòêè ïîñëå ñëèÿíèÿ ïîääåðæèâàþò â ñðåäå, ñîäåðæàùåé ÍÀÒ, â òå÷åíèå 10 – 14 äíåé. Àìèíîïòåðèí áëîêèðóåò ñèíòåç íóêëåîòèäîâ, ïîýòîìó êëåòêè ìàòåðèíñêîé ìèåëîìû ïîãèáàþò. Â îòëè÷èå îò ìèåëîìû, ãèáðèäíûå êëåòêè è Â-ëèìôîöèòû, èìåþùèå ãåí ã-ãëóòàìèëòðàíñôåðàçû, âûæèâàþò çà ñ÷åò èñïîëüçîâàíèÿ ãèïîêñàíòèíà êàê èñòî÷íèêà ïóðèíîâ, íî ïîñêîëüêó ïðîäîëæèòåëüíîñòü æèçíè îáû÷íûõ ëèìôîöèòîâ îãðàíè÷åíà, ÷åðåç íåñêîëüêî íåäåëü â ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 39 Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ äû áîëüøåé åìêîñòè äëÿ ðàçìíîæåíèÿ, õðàíåíèÿ â æèäêîì àçîòå è ïîëó÷åíèÿ áîëüøåãî êîëè÷åñòâà àíòèòåë äëÿ äàëüíåéøèõ èññëåäîâàíèé. Èç êóëüòóðàëüíîé ñðåäû ìîæíî ïîëó÷èòü îò 1 äî 60 ìã/ìë ÌÀÁ. Áîëüøåå êîëè÷åñòâî ìîæíî ïîëó÷èòü ââåäåíèåì êëåòî÷íîé ñóñïåíçèè â áðþøíóþ ïîëîñòü ìûøåé, ãäå ãèáðèäîìà ðàçìíîæàåòñÿ ïîäîáíî ðàêîâûì êëåòêàì ìàòåðèíñêîé ìèåëîìû, ñåêðåòèðóÿ àíòèòåëà âî âíóòðèïîëîñòíóþ æèäêîñòü ñ îáðàçîâàíèåì àñöèòà. Â îáùåì âèäå ãèáðèäîìíàÿ òåõíîëîãèÿ ïîêàçàíà íà ðèñ. 4. 8.1.2. Âûäåëåíèå è î÷èñòêà öåëåâîãî ïðîäóêòà Ðèñ. 4. Ñõåìà ãèáðèäîìíîé òåõíîëîãèè: 1 — èììóíèçàöèÿ æèâîòíûõ; 2 — âûäåëåíèå Â-ëèìôîöèòîâ èç ñåëåçåíêè; 3 — êóëüòóðà êëåòîê ìèåëîìû; 4 — ñëèÿíèå Â-ëèìôîöèòîâ è êëåòîê ìèåëîìû; 5 — ñåãðåãàöèÿ êëåòî÷íûõ ëèíèé; 6 — ñêðèíèíã è ñåëåêöèÿ ëèíèé, ïðîèçâîäÿùèõ àíòèòåëà; 7 — ðàçìíîæåíèå ãèáðèäîìû in vitro èëè in vivo; 8 — ïîëó÷åíèå àíòèòåë. êóëüòóðå îñòàþòñÿ òîëüêî êëåòêè ãèáðèäîìû. Ïîñêîëüêó íå âñå èç íèõ îáðàçîâàíû ñëèÿíèåì ìèåëîìû ñ ëèìôîöèòàìè, ïðîèçâîäÿùèìè íóæíûå àíòèòåëà, êëåòêè äåëÿò íà ëèíèè, êîòîðûå ïîääåðæèâàþò â îòäåëüíûõ ÿ÷åéêàõ 96-ëóíî÷íûõ ïëàøåê. Äàëåå îòáðàêîâûâàþò êëåòî÷íûå ëèíèè, íå ïðîèçâîäÿùèå àíòèòåëà èëè íåäîñòàòî÷íî áûñòðî ðàçìíîæàþùèåñÿ. Ïðè äîñòàòî÷íî õîðîøåì ðàçâåäåíèè êëåòî÷íîé ñóñïåíçèè â îäíó ëóíêó ïîïàäàåò íå áîëåå îäíîé ãèáðèäíîé êëåòêè, íî äëÿ ãàðàíòèðîâàííîãî êà÷åñòâà è ñòàáèëüíîñòè êóëüòóðû îòîáðàííûå êëåòî÷íûå ëèíèè ìîãóò åùå ðàç êëîíèðîâàíû ñ òåì, ÷òîáû àíòèòåëà ïðîèçâîäèëèñü ïîòîìêàìè îäíîé ãèáðèäíîé êëåòêè, ò.å. áûëè ìîíîêëîíàëüíûìè. Êëîíèðîâàííóþ êóëüòóðó ãèáðèäîìû çàòåì ïåðåñåâàþò èç ëóíêè 96-ëóíî÷íîé ïëàøêè â ñîñó- 40 Êëåòî÷íóþ êóëüòóðó î÷èùàþò ñ ïîìîùüþ ïîäõîäÿùèõ îäíîðàçîâûõ öåëëþëîçíûõ ôèëüòðîâ ñ ýôôåêòèâíîé ïëîùàäüþ ôèëüòðàöèè 650 – 1000 ñì2 è ñ ðàáî÷èì äàâëåíèåì íå áîëåå 2 áàð. Ôèëüòðàò ïðîâåðÿþò íà ìóòíîñòü è ñîäåðæàíèå öåëåâîãî áåëêà. Äëÿ àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè èñïîëüçóþò ñîðáåíò ñ èììîáèëèçîâàííûì áåëêîì À, àôôèííûì ê ëþáîìó IgG-ïîäîáíîìó àíòèòåëó. Ïîñëå òîãî êàê îáðàçåö íàíåñëè íà êîëîíêó, åå ïðîìûâàþò óðàâíîâåøèâàþùèì áóôåðîì (Òðèñ-ÍÑl, pH 7,2 – 7,6), çàòåì áóôåðíûì ðàñòâîðîì 50 ìÌ Òðèñ-ÍCl, 250 ìÌ NaCl, pH 7,4. Áåëîê ýëþèðóþò öèòðàòíûì áóôåðîì, ýëþàò âûäåðæèâàþò ïðè êèñëîì çíà÷åíèè pH â òå÷åíèå 45 – 60 ìèí ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå äëÿ âèðóñíîé èíàêòèâàöèè, çàòåì íåéòðàëèçóþò. Àíèîíîîáìåííóþ õðîìàòîãðàôèþ ïðîâîäÿò äëÿ óäàëåíèÿ ïðèìåñåé, ñâÿçàííûõ ñ òåõíîëîãè÷åñêèì ïðîöåññîì, òàêèõ êàê áåëîê À, âûìûâøèéñÿ ñ ñîðáåíòà â õîäå àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè, ÄÍÊ è áåëêè êëåòîê-õîçÿèíà. Êîëîíêó óðàâíîâåøèâàþò Òðèñ-áóôåðîì, pH 6,8 – 7,2. Äàëåå ñëåäóåò ñòàäèÿ íàíîôèëüòðàöèè äëÿ óäàëåíèÿ âèðóñîâ è ïåðåáóôåðèðîâàíèÿ ñ èñïîëüçîâàíèåì òàíãåíöèàëüíîé ôèëüòðàöèè íà 50 êÄà ìåìáðàíàõ. Äëÿ óëüòðàôèëüòðàöèè èñïîëüçóþò Òðèñ-áóôåð, pH 6,8 – 7,2. Çàòåì ïðîâîäÿò êàòèîíîîáìåííóþ õðîìàòîãðàôèþ áåëêîâîãî ðàñòâîðà ïîñëå óðàâíîâåøèâàíèÿ êîëîíêè Òðèñ-áóôåðîì, pH 6,8 – 7,2. Áåëîê ýëþèðóþò áóôåðîì ñ èñïîëüçîâàíèåì ãðàäèåíòà NaCl äëÿ óäàëåíèÿ ïðèìåñåé, ñâÿçàííûõ ñ òåõíîëîãè÷åñêèì ïðîöåññîì. ×èñòûå ôðàêöèè îáúåäèíÿþò, ïåðåáóôåðèðóþò è êîíöåíòðèðóþò ñ èñïîëüçîâàíèåì òàíãåíöèàëüíîé ôèëüòðàöèè íà ìåìáðàíàõ ñ ïðåäåëîì îòñå÷åíèÿ 50 êÄà. 8.2. Ãåðöåïòèí Ãåðöåïòèí (òðàñòóçóìàá, ðãÌÀò HER2) — ãóìàíèçèðîâàííîå ÌÀÁ ê ðåöåïòîðó 2 äëÿ ýïèäåðìàëüíîãî ôàêòîðà ðîñòà HER2 (human epidermal growth factor receptor 2). Ãåðöåïòèí ñïî- ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ ñîáåí óãíåòàòü ãèïåðýêñïðåññèþ HER2, íàáëþäàþùóþñÿ ó áîëüíûõ îíêîëîãèåé, ÷òî ïðèâîäèò ê ïîäàâëåíèþ ïðîöåññîâ ïðîëèôåðàöèè îïóõîëåâûõ êëåòîê, èõ ìåòàñòàçèðîâàíèÿ, èíäóêöèè ìåõàíèçìà àïîïòîçà êëåòîê-ìèøåíåé [74]. Ìîëåêóëÿðíàÿ ìàññà ãåðöåïòèíà îêîëî 145 êÄà. Ãåðöåïòèí îáû÷íî ñîñòîèò èç ñìåñè íåñêîëüêèõ âèäîâ àíòèòåë è ðàçëè÷íûõ èõ ôîðì, â îñîáåííîñòè êèñëûõ âàðèàíòîâ (äåçàìèäèðîâàííûõ ôîðì). Æåëàòåëüíî, ÷òîáû êîëè÷åñòâî òàêèõ êèñëîòíûõ ôîðì â ñîñòàâå íå ïðåâûøàëî 25 % [75, 76]. Ñóùåñòâóåò ìåòîä ïðîèçâîäñòâà ãåðöåïòèíà ñ èñïîëüçîâàíèåì ãåíåòè÷åñêè ìîäèôèöèðîâàííûõ ðàñòåíèé. Ýòîò ìåòîä ïîçâîëÿåò îáåñïå÷èâàòü íèçêóþ ñåáåñòîèìîñòü, áåçîïàñíîñòü ïðîäóêòà, îäíàêî äàííûé ìåòîä ñëîæåí ââèäó íåîáõîäèìîñòè ïåðåðàáîòêè áîëüøîãî êîëè÷åñòâà áèîìàññû [77]. Äðóãîé ìåòîä ïîëó÷åíèÿ àíòèòåëà îñíîâàí íà èñïîëüçîâàíèè ãåííî-èíæåíåðíîé êóëüòóðû êëåòîê CHO â áåññûâîðîòî÷íîé ñðåäå. Ïðè ïîëó÷åíèè òðàñòóçóìàáà ñ ïîìîùüþ êëåòîê CHO ãëàâíûé è ðàáî÷èé êëåòî÷íûå áàíêè àäàïòèðîâàíû ê ðîñòó â áåññûâîðîòî÷íîé ñðåäå. Äëÿ ââåäåíèÿ ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ÄÍÊ, êîäèðóþùåé ïðîäóêöèþ òðàñòóçóìàáà, â êëåòêè CHO èñïîëüçóþò ñòàíäàðòíóþ ðåêîìáèíàíòíóþ ìåòîäèêó. Ýôôåêòèâíî î÷èñòèòü ÌÀÁ ê HER-2 èç ñóïåðíàòàíòà êóëüòóðû êëåòîê ìîæíî ñ ïîìîùüþ ñëåäóþùåé êîìáèíàöèè õðîìàòîãðàôè÷åñêèõ ìåòîäîâ [78]. Ïåðâûì ýòàïîì âûäåëåíèÿ ÿâëÿåòñÿ ñåëåêòèâíîå ñâÿçûâàíèå öåëåâîãî ñîåäèíåíèÿ ñî ñïåöèôè÷åñêèì àôôèííûì ñîðáåíòîì (èììîáèëèçàöèÿ ãåëÿ áåëêîì À), çàòåì ýëþèðóþò öèòðàòíûì áóôåðîì ïðè pH 3,0 – 3,8 äëÿ èíàêòèâàöèè âèðóñîâ ñ ïîñëåäóþùåé íåéòðàëèçàöèåé. Ïîñëå âûïîëíÿþò ïåðåáóôåðèðîâàíèå ñ ïðèìåíåíèåì òàíãåíöèàëüíîé ôèëüòðàöèè íà 50 êÄà ìåìáðàíàõ, äëÿ ýòîãî èñïîëüçóþò Òðèñ-áóôåð ñ pH 6,8 – 7,2. ÌÀÁ ïîäâåðãàþò äàëüíåéøåé î÷èñòêå ñ ïîìîùüþ èîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè: èñïîëüçóþò êîëîíêó ñ àíèîíîîáìåííèêîì è Òðèñ-áóôåð â êà÷åñòâå ýëþåíòà, pH 6,8 – 7,2, ïîñëå ÷åãî óäàëÿþò âèðóñû ñ ïîìîùüþ ñòàäèè íàíîôèëüòðàöèè. Çàâåðøàþùèì ýòàïîì î÷èñòêè ÿâëÿåòñÿ èîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ íà SP-Sepharose FF (GE Healthcare, Øâåöèÿ). Ñóùåñòâóåò ïîäõîä, âêëþ÷àþùèé â ñåáÿ ÕÃÂ äëÿ óäàëåíèÿ àãðåãàòîâ, ôðàãìåíòîâ è îñòàòî÷íûõ áåëêîâ CHO [79], ýëþèðóþò ãèñòèäèíîì è ïîëèñîðáàòîì, ïîñëå ÷åãî ôèëüòðóþò ÷åðåç 0,2 ìêì ïîëèýôèðñóëüôîíîâóþ ìåìáðàíó. Ïîëó÷åííóþ ìàññó õðàíÿò â àñåïòè÷åñêèõ óñëî- âèÿõ ïðè 2 – 8 °Ñ èëè â çàìîðîæåííîì ñîñòîÿíèè ïðè –20 °Ñ äî íà÷àëà ïðîöåññà ïåðåðàáîòêè â ãîòîâóþ ïðîäóêöèþ. Äàëåå èçìåðÿþò êîíöåíòðàöèþ áåëêà, àíàëèçèðóþò ôèçè÷åñêóþ ñòàáèëüíîñòü, ñîäåðæàíèå ýíäîòîêñèíîâ, îñòàòêè áåëêà À è ÄÍÊ êëåòîê-õîçÿèíà. 8.3. Ðèòóêñèìàá Ðèòóêñèìàá — àêòèâíàÿ ôàðìàöåâòè÷åñêàÿ ñóáñòàíöèÿ, âõîäÿùàÿ â ñîñòàâ êîììåð÷åñêîãî ïðåïàðàòà MabThera®. Îíà ïðåäñòàâëÿåò ñîáîé õèìåðíûå ÌÀÁ, ñîñòîÿùèå èç ãëèêîçèëèðîâàííîãî lgG1/k èììóíîãëîáóëèíà, ñîäåðæàùåãî ëåãêèå è òÿæåëûå öåïè âàðèàáåëüíîãî ðåãèîíà (Fab-äîìåíà) ìûøèíîãî ïðîèñõîæäåíèÿ è k/g1ïîñòîÿííîãî ðåãèîíà (Fc-äîìåí) ÷åëîâå÷åñêîãî ïðîèñõîæäåíèÿ. Ðèòóêñèìàá ñâÿçûâàåòñÿ ñ CD20 òðàíñìåìáðàííûì áåëêîì, ðàñïîëîæåííûì íà ïîâåðõíîñòè ïðå-B è çðåëûõ Â-êëåòîê, ÷òî âåäåò ê èõ ðàçðóøåíèþ è òåì ñàìûì îáóñëàâëèâàåò åãî áèîëîãè÷åñêîå äåéñòâèå. Ïðåïàðàò àïðîáèðîâàí äëÿ ëå÷åíèÿ çàáîëåâàíèé, õàðàêòåðèçóþùèõñÿ áîëüøèì êîëè÷åñòâîì àêòèâíûõ è äèñôóíêöèîíàëüíûõ B-êëåòîê, òàêèõ êàê ëèìôîìû (íàïðèìåð, ôîëëèêóëÿðíàÿ CD20+ íåõîäæêèíñêàÿ ëèìôîìà) è àóòîèììóííûå çàáîëåâàíèÿ (íàïðèìåð, ðåâìàòîèäíûé àðòðèò). MabThera ÿâëÿåòñÿ ýôôåêòèâíûì, êîììåð÷åñêè óñïåøíûì ïðåïàðàòîì, âûïóñêàåìûì êîìïàíèåé «Ô. Õîôôìàíí-Ëÿ Ðîø Ëòä.», Øâåéöàðèÿ. 8.3.1. Ïîëó÷åíèå øòàììà-ïðîäóöåíòà õèìåðíûõ ìîíîêëîíàëüíûõ àíòè-CD20 àíòèòåë Õèìåðíûå àíòè-CD20 àíòèòåëà íàèáîëåå ïðåäïî÷òèòåëüíî ïîëó÷àòü ñ ïîìîùüþ CHO ëèíèé êëåòîê, ïîäâåðãøèõñÿ òðàíñôåêöèè ñ ïîìîùüþ ïðîöåäóðû ýëåêòðîïîðàöèè äëÿ ââåäåíèÿ âåêòîðà ýêñïðåññèè öåëåâîãî ïðîäóêòà [80]. Â êà÷åñòâå âåêòîðà ýêñïðåññèè ìîæåò áûòü âûáðàí TCAE-âåêòîð (tandem chimeric antibody expression) [81], ñõåìà êîòîðîãî ïðåäñòàâëåíà íà ðèñ. 5. Îí ñîäåðæèò NEO-ãåí, îòâå÷àþùèé çà óñòîé÷èâîñòü êëåòîê ê àíòèáèîòèêó G418 è èñïîëüçóþùèéñÿ äëÿ îòáîðà ìóòàíòíûõ êëîíîâ, è DHFR-ãåí äëÿ ðîñòà êëåòîê â ïðèñóòñòâèè ìåòîòðåêñàòà. Íàëè÷èå õèìåðíûõ àíòèòåë â êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè êîíòðîëèðóåòñÿ ñ ïîìîùüþ ìåòîäà ÈÔÀ; êîëîíèè êëåòîê, ïðîèçâîäÿùèå íàèáîëüøåå ÷èñëî àíòèòåë, âûñåâàþò íà ÷àøêè, ñîäåðæàùèå ïèòàòåëüíóþ ñðåäó ïëþñ ìåòîòðåêñàò, ïîäïèòûâàþò êàæäûå äâà-òðè äíÿ. Õèìåðíûå àíòè-CD20 àíòèòåëà î÷èùàþò îò ñóïåðíàòàíòà ñ ïîìîùüþ àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè; î÷èùåííûå àíòèòåëà àíàëèçèðóþò ñ ïîìîùüþ ýëåêòðîôîðåçà â ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå. ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 41 Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ Ðèñ. 5. Ñõåìàòè÷íîå èçîáðàæåíèå TCAE-âåêòðà ýêñïðåññèè, èñïîëüçóþùåãîñÿ äëÿ ïîëó÷åíèÿ àíòè-CD20 àíòèòåë â CHO-êëåòêàõ. Íà äàííûé ìîìåíò â ëèòåðàòóðå ìîæíî íàéòè íåñêîëüêî ìåòîäîâ î÷èñòêè ìîíîêëîíàëüíûõ àíòè-CD20 àíòèòåë. Âñå îíè âêëþ÷àþò â ñåáÿ èììîáèëèçîâàííóþ áåëêîì À àôôèííóþ õðîìàòîãðàôèþ äëÿ ïåðâè÷íîãî âûäåëåíèÿ àíòèòåë èç êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè è èîíîîáìåííóþ õðîìàòîãðàôèþ äëÿ óäàëåíèÿ ïðèìåñåé, ñâÿçàííûõ ñ òåõíîëîãè÷åñêèì ïðîöåññîì. Àôôèííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ ïîçâîëÿåò âûäåëèòü öåëåâîé ïðîäóêò èç êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè ñ ÷èñòîòîé 95 % [82]. Â êà÷åñòâå ñîðáåíòà ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàí áåëîê À, èììîáèëèçîâàííûé íà ñåôàðîçíîé ìàòðèöå ñ ðàçìåðîì ïîð 50 íì [83]. Êàòèîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ äëÿ î÷èñòêè õèìåðíûõ àíòè-CD20 àíòèòåë ïîçâîëÿåò èçáàâèòüñÿ îò òàêèõ ïðèìåñåé, êàê ÑÍÎ-áåëêè, ñîäåðæàùèåñÿ â êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè; áåëîê A, âûìûâøèéñÿ ñ ñîðáåíòà â ïðîöåññå àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè; ÄÍÊ êëåòîê-õîçÿèíà; àãðåãèðîâàííûõ àíòèòåë [84]. Îíà âêëþ÷àåò â ñåáÿ â îáùåì âèäå íåñêîëüêî ïîñëåäîâàòåëüíûõ øàãîâ: à) íàíåñåíèå îáðàçöà â êîëîííó ïðè ïåðâîì çíà÷åíèè pH; 42 á) ïðîìûâêà ìàòåðèàëà ïåðâûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì, pH êîòîðîãî âûøå, ÷åì â ï. à; â) ïðîìûâêà ìàòåðèàëà âòîðûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì ñî çíà÷åíèåì pH ìåíüøå, ÷åì â ï. á; ã) ýëþöèÿ àíòèòåë ñ ñîðáåíòà áóôåðîì ñî çíà÷èòåëüíî áîëüøåé ïðîâîäèìîñòüþ, ÷åì â ï. â. Äëÿ î÷èñòêè Ðèòóêñèìàáà ïðåäëàãàåòñÿ ñëåäóþùåå: íàíåñåíèå ïðè pH îò 4,0 äî 6,0, ïðîìûâêà ïåðâûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì ïðè pH îò 6,8 äî 9,0 ñ ïðîâîäèìîñòüþ îò 0,01 äî 3,0 ìÑì/ñì, ïðîìûâêà âòîðûì áóôåðíûì ðàñòâîðîì ïðè pH îò 5,0 äî 6,0 ñ ïðîâîäèìîñòüþ 0,05 – 3,0 ìÑì/ñì è ýëþöèÿ àíòèòåë ñ êàòèîííîãî ñîðáåíòà áóôåðîì ñ pH 5,0 – 6,0 è ïðîâîäèìîñòüþ îò 10 äî 100 ìÑì/ñì, ïðåäïî÷òèòåëüíî ñ ïðîâîäèìîñòüþ îò 12 – 20 ìÑì/ì, ÷òî ñîîòâåòñòâóåò 150 – 200 ìÌ NaCl. Ïðåäëàãàåòñÿ òàêæå èñïîëüçîâàòü äëÿ õðàíåíèÿ Ðèòóêñèìàáà áóôåð, ñîäåðæàùèé 25 ìÌ HEPES ïðè pH îêîëî 7,8. Äëÿ øàãà á ìîãóò áûòü èñïîëüçîâàíû òàêèå áóôåðû, êàê HEPES, MES, àöåòàòíûé áóôåð, Òðèñ/HCl, òðèýòàíîëàìèíîãèäðîõëîðèä/NaOH, Bicine/HCl, Tricine/HCl, íàïðèìåð, 25 ìÌ HEPES, pH 7,8. Äëÿ øàãà â: MES, óêñóñíàÿ êèñëîòà/àöåòàò íàòðèÿ, äèãèäðîôîñôàò/ãèäðîôîñôàò íàòðèÿ ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ NaH2PO3/Na2HPO4, Bis. Tris/HCl, íàïðèìåð, 19 ìÌ MES, 10 ìÌ NaCl, pH 5,5. Ïîäîáíàÿ î÷èñòêà ïîçâîëÿåò èçáàâèòñÿ îò ÑÍÎ-áåëêîâ, áåëêà A, ãàðàìèöèíà, àãðåãàòîâ è âèðóñîâ. Êîììåð÷åñêè äîñòóïíûå ñîðáåíòû äëÿ êàòèîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè âêëþ÷àþò â ñåáÿ êàðáîêñèìåòèëöåëëþëîçó (íàïðèìåð, Bakerbond ABX, Baker&Bond, Ãîëëàíäèÿ), ñóëüôîïðîïèë-àãàðîçó (íàïðèìåð, SP Sepharose, GE Healthcare, Øâåöèÿ), ñóëüôîíèë-àãàðîçó (S Sepharose, GE Healthcare). Òùàòåëüíàÿ âèðóñíàÿ èíàêòèâàöèÿ äîñòèãàåòñÿ ñòàäèåé íàíîôèëüòðàöèè [85, 86]. Äàííàÿ òåõíîëîãèÿ ÿâëÿåòñÿ, âîçìîæíî, ñàìîé íàäåæíîé äëÿ óäàëåíèÿ âèðóñîâ â íàñòîÿùåå âðåìÿ. Óäàëåíèå äîñòèãàåòñÿ èñïîëüçîâàíèåì ôèëüòðà, ïîðû êîòîðîãî ìåíüøå ýôôåêòèâíîãî äèàìåòðà âèðóñîâ, ôèëüòðû ïîäðàçäåëÿþòñÿ íà äâà âèäà â çàâèñèìîñòè îò ðàçìåðîâ ïîð: 50 è 20 íì. Õîòÿ íàíîôèëüòðàöèÿ — ýòî äîâîëüíî-òàêè ìÿãêèé ìåòîä, àíòèòåëà ïîäâåðãàþòñÿ âîçäåéñòâèþ ïîïåðå÷íûõ ñèë ñäâèãà è ìîãóò áûòü ïîâðåæäåíû [87]. Çàêëþ÷èòåëüíîé ñòàäèåé î÷èñòêè ÿâëÿåòñÿ èîíîîáìåííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ íà Q-ñåôàðîçå è äèàôèëüòðàöèÿ ïðîòèâ áóôåðà õðàíåíèÿ, â êà÷åñòâå êîòîðîãî ìîæåò áûòü èñïîëüçîâàí HEPES [83, 85, 86]. ÇÀÊËÞ×ÅÍÈÅ Â ñòàòüå ðàññìîòðåíû ñîâðåìåííûå ñïîñîáû ïîëó÷åíèÿ òàêèõ ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë, êàê ãåðöåïòèí, öåòóêñèìàá, ðèòóêñèìàá, è òåðàïåâòè÷åñêèõ áåëêîâ, êàê ïðîèçâîäíûå èíñóëèíà, èíòåðôåðîí áåòà, ýðèòðîïîýòèí, ôîëëèòðîïèí àëüôà, ôàêòîð ñâåðòûâàíèÿ êðîâè IX, ôåðìåíòû èìèãëþöåðàçà è àëüòåïëàçà. Ðÿä âåùåñòâ, ê ïðèìåðó, ôàêòîð IX, èìèãëþöåðàçà, âûäåëÿþò èç ïëàçìû è ñûâîðîòêè êðîâè. Íåäîñòàòêîì äàííîãî ìåòîäà ÿâëÿåòñÿ êðàéíå íèçêîå ñîäåðæàíèå öåëåâîãî áåëêà â ñûðüå, à òàêæå ñëîæíîñòü òåõíîëîãè÷åñêîé î÷èñòêè. Äëÿ ïðîèçâîäñòâà àêòèâíûõ òåðàïåâòè÷åñêèõ ñóáñòàíöèé ñóùåñòâóåò áîëüøîé âûáîð ñèñòåì ýêñïðåññèè áëàãîäàðÿ ðàçâèòèþ ãåííîèíæåíåðíûõ ìåòîäîâ. Íåñìîòðÿ íà àëüòåðíàòèâíûå ñèñòåìû ýêñïðåññèè (òðàíñãåííûå ðàñòåíèÿ è æèâîòíûå), ïðîèçâîäèòåëè ïî-ïðåæíåìó èñïîëüçóþò õîðîøî èçó÷åííûå è ðàçðàáîòàííûå ëèíèè êëåòîê ÑÍÎ è E. coli. Îäíàêî èõ íåëüçÿ íàçâàòü èäåàëüíûìè, òàê êàê â ñëó÷àå ñèíòåçà â E. coli âûõîä öåëåâîãî áåëêà ëèìèòèðóåòñÿ ñòàäèåé ðåôîëäèíãà, à â ñëó÷àå êëåòîê ÑÍÎ ôèçèîëîãè÷åñêàÿ àêòèâíîñòü êîíå÷íîãî áåëêà çàâèñèò îò ïðîòåîëèòè÷åñêîãî ïðîöåññèíãà. Äëÿ î÷èñòêè áåëêîâ èñïîëüçóþò ñòàíäàðòíûå õðîìàòîãðàôè÷åñêèå ìåòîäû, ñàìûìè ðàñïðîñòðàíåííûìè ñðåäè êîòîðûõ ÿâëÿþòñÿ èîíîîáìåííàÿ, ãèäðîôîáíàÿ õðîìàòîãðàôèÿ, îáðàùåííî-ôàçîâàÿ ÂÝÆÕ è ãåëü-ôèëüòðàöèÿ. Ïðîèçâîäèòåëè ñòàðàþòñÿ èçáåãàòü àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè ââèäó åå ñëîæíîñòè è äîðîãîâèçíû. Îäíàêî â ñëó÷àå ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë àôôèííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ, êàê ïðàâèëî, ïðîñòî íåîáõîäèìà äëÿ ýôôåêòèâíîé ïåðâè÷íîé î÷èñòêè àíòèòåë èç êóëüòóðàëüíîé æèäêîñòè, à âûñîêàÿ ñòîèìîñòü òàêèõ ïðåïàðàòîâ íà ðûíêå âî ìíîãî ðàç îêóïàåò âñå ïðîèçâîäèòåëüíûå çàòðàòû. Ïðîèçâîäñòâî ìîíîêëîíàëüíûõ àíòèòåë ÿâëÿåòñÿ ñàìûì êîììåð÷åñêè óñïåøíûì â íàñòîÿùåå âðåìÿ, òàê êàê îíè ñîñòàâëÿþò óíèêàëüíûé ñåãìåíò íà ðûíêå ïðåïàðàòîâ è íàõîäÿòñÿ ïîä ïàòåíòíîé çàùèòîé. Ñðîêè ïàòåíòîâ íà ðàññìîòðåííûå â ñòàòüå ìîíîêëîíàëüíûå àíòèòåëà çàêàí÷èâàþòñÿ â 2013 – 2014 ãã. ÑÏÈÑÎÊ ÑÑÛËÎÊ 1. Áàèðàìàøâèëè Ä. È. / Ðîñ. õèì. æ. 2005. Ò. 49. ¹ 1. Ñ. 34 – 45. 2. URL: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/ ru/index.html. 3. Alastair J. J., Wood M. D. / N. Engl. Med. 1997. V. 337. P. 176 – 183. 4. Setter S. M., Corbett C. F., Campbell P. K., White J. R. / Ann. Pharmacother. 2000. V. 34. P. 1423 – 1431. 5. Markussen J., et al. / Diabetologia. 1996. V. 39. P. 281 – 288. 6. Whittingham J. L., et al. / Biochemistry. 1997. V. 36. P. 2826 – 2831. 7. Chance R. E., DiMarchi R. D., Frank B. H., Shields J. E. Insulin Analogs Modified at Position 29 of the B Chain, United States Patent No. 5514646, 1996. 8. Graumann K., Premstaller A. / J. Biotechnol. 2006. V. 1(2). P. 164 — 186. 9. Winter J., Neubauer P., Glockshuber R., Rudolph R. / J. Boitechnol. 2000. V. 84. P. 175 – 185. 10. Ãèëü÷óê Ï. Â. / Áèîïîëèìåðû è êëåòêè. 2004. Ò. 20. Ñ. 182 – 192. 11. Zimmerman, et al. / Insulin production methods and pro-insulin constructs, United States Patent No. 7790677 B2, 2010. 12. Cregg J. M., et al. / Mol. Cell Biol. 1985. V. 5. No. 12. P. 3376 – 3385. 13. Ïàòðóøåâ Ë. È., Ïàòðóøåâà Í. Ë., Áàèðàìàøâèëè Ä. È., Ìèðîøíèêîâ À. È. / Áèîôàðì. æ. 2010. Ò. 2. ¹ 3. Ñ. 20 – 27. 14. Annibali, et al. Process for obtaining aspart insulin using Pichia pastoris yeast strain, United States Patent No. 0117600 A1, 2011. ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 43 Å. Ê. Êóðáàíîâà, Ò. Þ. ×óëêîâà, Ä. Â. Áûðèõèíà, À. Î. Äàíî, Â. À. Íèêîëàåâà, Ä. À. Ãóñàðîâ 15. Hazra Partha, et al. A process for preparation of insulin compounds, World Intellectual Property Organization Patent Apllication, WO 2009/104199 A1, 2009. 16. Bogsnes A., et al. Process for preparing insulin compounds, World Intellectual Property Organization Patent Apllication, WO 03/044210 A2, 2003. 17. Derynck R., Content J., DeClercq E., Volckaert G., Tavernier J., Devos R., Fiers W. / Nature. 1980. V. 285. P. 542 – 547. 18. Lin L. / Dev. Biol. Stand. 1998. V. 96, P. 97 – 104. 19. McCormick F. P., et al. Human interferon-b produced in chinese hamster ovary (CHO) cells, United States Patent No. 5795779, 1998. 20. Mark D. F., et al. Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteinr depleted muteins of interferon-b, United States Patent No. 4737462, 1988. 21. Áàèðàìàøâèëè Ä. È., Âîðîáüåâ È. È., Ãàáèáîâ À. Ã., Äåìèí À. Â., Ìèðîøíèêîâ À. È., Ìàðòüÿíîâ Â. À., Ïîíîìàðåíêî Í. À., Øóñòåð À. Ì. Ðåêîìáèíàíòíàÿ ïëàçìèäíàÿ ÄÍÊ pES6-1, êîäèðóþùàÿ ïîëèïåïòèä èíòåðôåðîí áåòà-1b ÷åëîâåêà, è øòàìì Escherichia coli BDEES6 — ïðîäóöåíò ðåêîìáèíàíòíîãî èíòåðôåðîíà áåòà-1b ÷åëîâåêà, Ïàòåíò ÐÔ ¹ 2261913, 2004. 22. Ze’ev Shaked, Wolfe S. N. Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins, United States Patent No. 4530787, 1985. 23. Russell-Harde D., Knauf M., Croze E. / J. Interferon Cytokine Res. 1995. V. 15. P. 31 – 37. 24. Âîðîáüåâ È. È., Ïîíîìàðåíêî Í. À., Ìèðîøíèêîâ À. È., Ñìèðíîâ È. Â. Ñïîñîá î÷èñòêè ðåêîìáèíàíòíîãî èíòåðôåðîíà-1b, Ïàòåíò ÐÔ ¹ 2392282, 2008. 25. Ëóêèíà Å. À. / Êëèí. îíêîãåìàòîë. 2009. Ò. 2. ¹ 2. Ñ. 196 – 200. 26. Øààëòèåë É., Áàóì Ã., Áàðòôåëä Ä. è äð. Ïðîäóöèðîâàíèå âûñîêîìàííîçíûõ áåëêîâ â ðàñòèòåëüíûõ êóëüòóðàõ, Ïàòåíò ÐÔ ¹ 2385928, 2004. 27. Furbish F. S., Blair H. E., Shiloacht J., et al. / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 74. ¹ 8. P. 3560 – 3563. 28. Friedman B., Hayes M. Enhanced in vivo uptake of glucocerebrosidase, United States Patent No. 5549892, 1996. 29. Ma J. K. C., Drake P. M. W., Christou P. / Nature Rev. Genet. 2003. V. 4. P. 794 – 805. 30. Pennica D., Holmes W. E., et al. / Nature. 1983. V. 301. P. 214–221. 31. Goeddel D. V., Kohr W. J., Pennica D., Vehar G. A. Human tissue plasminogen activator, United States Patent No. 5702938, 1997. 32. Tharmalingam T., et al. / Mol. Biotechnol. 2008. V. 39. P. 167 – 177. 33. Ng Y. C., Berry J. M., Butler M. / Biotech. Bioeng. 1996. V. 50. P. 627 – 635. 34. Tharmalingam T., et al. / Mol. Biotechnol. 2011. V. 49. P. 263 – 276. 35. Patell V. M. Method for production of a bioengineered form of tissue plasminogen activator, United States Patent No. 0246188, 2009. 36. Prior C. P., Hope J., Tolbert W. R. A process for obtaining higher yields of unaggregated tissue plasminogen activator from cell culture, Eur. Pat. Applic. No. 0309111, 1989. 44 37. Qiu J., Swartz J. R., Georgiou G. / Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 4891 – 4896. 38. Rijken D. C., Collen D. / J. Biol. Chem. 1981. V. 256. P. 7035–7041. 39. Furlong A. M., Thomsen D. R., et al. / Biotechnol. Appl. Biochem. 1988. V. 10. P. 454 – 464. 40. Ogrydziak D. M. / Crit. Rev. Biotechnol. 1993. V. 13. P. 1 – 55. 41. Yong Cheng. Method for producing human tissue plasmin activator, Chin. Pat. Applic. No. 101492662, 2009. 42. Hunh Bum Soo, Kim Yong Hwan, et al. Vector comprising tissue-type plasminogen activator gene, hairy root transformed thereby and method for preparing tissue-type plasminogen activator using the same, Patent KR No. 100887367, 2007. 43. Heussen C., Joubert F., Dowdle E. B. / J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 11635–11638. 44. Randy et. al. / FEBS Lett. 1982. V. 146. P. 289 – 292. 45. Mori T., Yoshizaki H., Hasegawa A. Purified plasminogen activator, process for its production and thrombolytiñ composition containing it, United States Patent No. 4505893, 1985. 46. Morii M., Kawashima N., Mori K., Ohoka M. Method for purifying a crude tissue plasminogen activator preparation, United States Patent No. 5158882, 1992. 47. Sudip K. M., Gita A., Bhavesh S. Process for purufucation of human tissue type plasminogen activator, Eur. Pat. Applic. No. 2193197, 2009. 48. Çàê Ê. Ï., Ãðûöþê Ñ. Í. / Îíêîëîãèÿ. 2001. Ò. 3. ¹ 2 – 3. Ñ. 107 – 109. 49. Áåëÿêîâ Í. Â., Êîðîáèöûí Ë. Ï., Ïèâîâàðîâ À. Ì., Ïðîêîïüåâ À. À. Ñïîñîá î÷èñòêè ðåêîìáèíàíòíîãî ýðèòðîïîýòèíà ÷åëîâåêà, Ïàòåíò ÐÔ ¹ 2145610, 2000. 50. Ãîñóäàðñòâåííûé íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêèé èíñòèòóò îñîáî ÷èñòûõ áèîïðåïàðàòîâ, Òîâàðèùåñòâî ñ îãðàíè÷åííîé îòâåòñòâåííîñòüþ «Ïðîòåèíîâûé êîíòóð». Ñïîñîá ïîëó÷åíèÿ ðåêîìáèíàíòíîãî ÷åëîâå÷åñêîãî ýðèòðîïîýòèíà, øòàìì êóëüòèâèðóåìûõ êëåòîê ÿè÷íèêà êèòàéñêî õîìÿêà — ïðîäóöåíò ýðèòðîïîýòèíà, Ïàòåíò ÐÔ ¹ 2125093, 1999. 51. Artymiuk P., Ross R., Sayers J. Erythropoietin, United States Patent No. 0275564 A1, 2011. 52. Fu-Kuen Lin. Production of erythropoietin, United States Patent No. 5547933, 1995. 53. URL: http://www.medicusamicus.com/index.php? action=2x1854x1 54. Ïîêðîâñêèé Â. Ì., Êîðîòüêî Ã. Ô. / Ôèçèîëîãèÿ ÷åëîâåêà. — Ì.: Ìåäèöèíà, 2003. C. 261 – 271. 55. Owren P. A., Stormorken H. / The Mechanism of Blood Coagulation. — Springer-Verlag, 1973. — 53 p. 56. Äåðåçà Ò. Ë., Ôåòèñîâà Ë. Â., Âÿçîâà Å. Ï., Àæèãèðîâà Ì. À. Êîíöåíòðàò ôàêòîðà IX ñèñòåìû ñâåðòûâàíèÿ êðîâè è ñïîñîá åãî ïîëó÷åíèÿ, Ïàòåíò ÐÔ ¹ 2163140, 2001. 57. Teitel J. M. / Haemophilia. 1998. V. 4. P. 393 – 401. 58. Ðóñàíîâ Â. Ì. / Âåñòíèê ñëóæáû êðîâè Ðîññèè. 2008. Ò. 2. Ñ. 34 – 37. 59. Drohan W. N., et al. Method of producing biologically active vitamin K dependent proteins by ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 ÔÀÐÌÀ-2020: Òåõíîëîãè÷åñêèå àñïåêòû ïðîèçâîäñòâà íåêîòîðûõ ÆÍÂËÏ 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. recombinant methods, United States Patent No. 0045453 A1, 2008 Colvin B. / Âñåðîñ. íàó÷.-ïðàêò. êîíô. ïî ãåìîôèëèè — Ì., 2009. Foster B. W., et al. Factor IX purification methods, United States Patent No. 6627737 B1, 2003. Hoffman J. A., Lu J. FSH and FSH variant formulations, products and methods, United States Patent No. 7563763, 2009. Murphy G., Cockett M. I., Ward R. V., Docherty A. J. / Biochem. J. 1991. V. 227. P. 277 – 279. Muda M., Jiang X., McKenna S. D. FSH mutants, United States Patent No. 7740862, 2010. Lustbader J. Long-acting follicle stimulating hormone analogues and uses thereof, United States Patent No. 7807620, 2010. Samaritani F., Donati P. Liquid pharmaceutical formulations of FSH and LH together with a non-ionic, United States Patent No. 7741268, 2010. Rossi M. Method of purifying FSH, United States Patent No. 7754860, 2010. Samaritani F., Donati P. Freeze-dried FSH / LH formulations, United States Patent No. 7740884, 2010. URL: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR-Scientific_Discussion/human/ 000558/WC500029113.pdf. Ciardiello F., Bianco R., Damiano V., et al. / Clin. Cancer Res. 1999. V. 5. ¹ 4. P. 909 – 916. Goldstein N. S., Armin M. / Cancer. 2001. V. 92. ¹ 5. P. 1331 – 1346. Orton R. J., Sturm O. E., Vyshemirsky V., et al. / Biochem. J. 2005. V. 392. P. 249 – 261. Patell V. M., Guzder S. N., Maity S., Shekar S. A highly efficient process of purification of recombinant cetuximab, World Intellectual Property Organization Patent Apllication, WO 2011/015921 A1, 2011. Vogel C. L., Cobleigh M. A., Tripathy D., et al. / J. Clin. Oncol. 2002. V. 3. Ð. 719 – 726. Basey C. D., Blank G. S. Protein purification, United States Patent No. 6339142, 2002. Bryant J. L. Herceptin aduvant therapy, United States Patent No. 0003217, 2012. 77. McLean M. D., Chen R., Yu D., Mah K. Z., Teat J. / Transgenic research. 2012. — electronic supplementary material (http://www.springerlink.com/content/mu7k002428255jr4/). 78. Patell V. M., Guzder S. N., Maity S., Shekar S. A highly efficient process of purificatiom and production of recombinant trastuzumab, World Intellectual Property Organization Patent Apllication, WO 2011/015920, 2011. 79. Adler M., Grauschopf U., Mahler H. C., Stauch O. B. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof, United States Patent No. 0044977 A1, 2011. 80. Anderson D. R., Hanna N., Newman R. A., Reff M. E., Rastetter W. H. Expression and use of anti-CD20 antibodies, United States Patent No. 7381560, 2008. 81. Reff M., Carner K., Chambers K., et al. / Blood. 1994. V. 83. ¹ 2. P. 435 – 445. 82. Anderson D. R., Hanna N., Leonard J. E., Newman R. A., et al. Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma, United States Patent No. 5736137, 1998. 83. Berthold W., et al. / The Rituxan Story: The Journey of a chimeric antibody at a conference entitled «Recovery of biological products 10: Learning for the future». — Cancun, Mexico, 2001. 84. Lebreton B. A., O’Connor D. A., Safta A., Sharma M. Antibody purification bu cation exchange chromatography, United States Patent No. 0148435, 2009. 85. Adler M., Mahler H., Stauch O. B. Highly concentrated pharmaceutical formulation comprising anti-CD20 antibody, World Intellectual Property Organization Patent Apllication, WO 2011/029892, 2011. 86. Gottschalk U. / Process scale purification of antibodies. — Wiley, 2011. 87. Zhou J. Methods for Removing Viral Contaminants During Protein Purification, United States Patent No. 0132688, 2008. PHARMA-2020: TECHNOLOGICAL ASPECTS OF PRODUCTION OF SOME STRATEGICAL BIOPHARMACEUTICALS (Review) E. K. Kurbanova1,2,3, T. Y. Chulkova1, D. V. Byrikhina1, A. O. Dano1, V. A. Nikolaeva1, D. A. Gusarov1,2 1 2 3 Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Technology, 119571 Moscow (Russia), Vernadskogo av., 86 M. M. Shemyakin and Yu. A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the Russian Academy of Sciences Institute, 117997 Moscow (Russia), Mikloukho-Maklaya st., 16/ 10 june90@yandex.ru Due to the strategy of the pharmaceutical industry of the Russian Federation for the period up to 2020 the production of a wide range of medicines, many of which are products of Biopharma, should be organized in Russia. This review provides modern technologies of production of biopharmaceuticals, such as derivatives of insulin, interferon beta, erythropoietin, follitropin alfa, coagulation factor IX, alteplase, imiglucerase and monoclonal antibodies herceptin, cetuximab, rituximab. Keywords: recombinant protein, biosimilar, production process, chromatography. ÁÈÎÔÀÐÌÀÖÅÂÒÈ×ÅÑÊÈÉ ÆÓÐÍÀË. 2012. Ò. 4. ¹ 3. Ñ. 21 – 45 45

фарма-2020: теõнолоãические аспектû производства некоторûõ

Похожие документы

Разделы

Поддержка

фарма-2020: теõнолоãические аспектû производства некоторûõ

Похожие документы

Добавить этот документ в коллекции

Добавить этот документ в сохраненные

Предложите, как улучшить StudyLib