Диссертационная работа Казанкаповой М
реклама
Казахский национальный университет имени аль-Фараби УДК 34.27.39:34.27.51:70.25.17 На правах рукописи КАЗАНКАПОВА МАЙРА КУТТЫБАЕВНА Создание модифицированных углеродминеральных сорбентов для очистки природных объектов от техногенных загрязнений 6D072000 – Химическая технология неорганических веществ Диссертация на соискание ученой степени доктор философии (PhD) Научные руководители доктор технических наук, профессор Наурызбаев М.К. PhD, профессор Технологического Института Стивенса США Вашингтон Брайда Республика Казахстан Алматы, 2013 СОДЕРЖАНИЕ НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ ВВЕДЕНИЕ 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Решение проблемы загрязнения объектов окружающей среды техногенными загрязнителями 1.2 Нефтяные загрязнения сточных вод и почв и их влияние на окружающую среду 1.2.1 Методики анализа суммарного содержания углеводородов в объектах окружающей среды 1.2.2 Отбор проб 1.2.3 Подготовка проб к анализу 1.2.4 Основные методы анализа нефтепродуктов 1.2.4.1 Гравиметрический метод анализа нефтепродуктов 1.2.4.2 Спектральные методы анализа нефтепродуктов 1.2.4.3 Хроматографические методы анализа нефтепродуктов 1.2.4.4 Прочие методы анализа нефтепродуктов 1.2.5 Методы очистки вод и почв, загрязненных нефтью 1.2.6 Адсорбционные методы очистки вод и почв, загрязненных нефтью 1.2.7 Биологические методы очистки вод и почв, загрязненных нефтью 1.3 Загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами 1.3.1 Методы определения тяжелых металлов 1.3.2 Способы очистки воды от тяжелых металлов 1.4 Загрязнения почвы пестицидами 1.4.1 Методы определения пестицидов в почве 1.4.2 Методы очистки почв от пестицидов 1.5 Сорбент, используемый в очистке сточных вод и почв 1.6 Анализ литературного обзора и постановка задач исследования 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1 Оборудование и физико-химические методы анализа 2.2 Характеристика объектов исследования 2.3 Характеристика растворителей, приготовление рабочих растворов 2.4 Питательные среды для культивирования микроорганизмов 2.5 Культивирование микроорганизмов 2.6 Методы исследования морфологических и культуральных свойств микроорганизмов 2.7 Методы генетической идентификации микрорганизмов 2.8 Методы адсорбционной иммобилизации 2.8.1 Иммобилизация микроорганизмов на сорбенте из шунгита для очистки растворов БТЭК (бензол, толуол, этилбензол, ксилол). 2.9 Получение и исследование физико-химических свойств шунгитовых 4 5 8 9 15 15 17 24 25 26 28 28 28 30 32 33 38 41 52 56 57 61 65 66 70 73 75 75 75 78 78 78 79 79 80 81 82 2 пород и сорбентов 2.9.1 Элементный анализ шунгитовых пород 2.9.2 ИК-спектроскопический анализ шунгитовых пород 2.9.3 Сканирующая электронная микроскопия 2.9.4 Раман спектроскопия 2.9.5 Рентгенодифракционный анализ 2.9.6 Адсорбционные методы исследования поверхности. Метод БЭТопределения удельной поверхности и размеров пор 2.10 Определение содержания углеводородов в почве и воде 2.10.1 Флуорометрический метод определения массовой концентрации нефти в воде и почве 2.10.2 Определение содержания углеводородов в почве и воде методом газовой хроматографии 2.10.3 Определение содержания углеводородов в почве ИКспектрометрическим методом 2.11 Определение тяжелых металлов в воде методом ААС 2.12 Определение пестицидов в почве методом газовой хроматографии 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Изучение физико-химических характеристик шунгитовых пород Казахстана и России 3.1.1 Элементный анализ шунгитовых пород 3.1.2 ИК-спектроскопический анализ шунгитовых пород 3.1.3 Сканирующая электронная микроскопия 3.1.4 Раман спектроскопия 3.1.5 Рентгенодифракционный анализ 3.1.6 Метод БЭТ- определения удельной поверхности и размеров пор 3.2 Выделение и идентификация нефтеокисляющих бактерий 3.3 Изучение адсорбционной способности клеток микроорганизмов на сорбентах 3.4 Деструктивная способность иммобилизованных и свободных микробных клеток ЗАКЛЮЧЕНИЕ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 83 84 85 86 88 91 93 94 95 96 96 97 99 99 100 101 102 104 107 108 109 111 113 115 118 3 НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ В настоящей диссертации использованы ссылки на следующие стандарты: ГОСТ 7.1-2003. Библиографическая запись. Библиографическое описание. Общие требования и правила составления. ГОСТ 7.32-2001 Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Отчет по научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления. ГОСТ 7.9-95 Система стандартов по информации, библиотечному и издательскому делу. Реферат и аннотация. Общие требования. ГОСТ 8.315-97. Государственная система обеспечения единства измерений. Стандартные образцы состава и свойств веществ и материалов. Основные положения. ГОСТ 8.417-81 Государственная система обеспечения единства измерений. Единицы физических величин. СТ РК ИСО/МЭК 17025-2007. Государственная система обеспечения единства измерений. Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий. ГОСТ Р 8.563-2009. Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений. ГОСТ 4517-87. Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе. ГОСТ 23932-90 Е. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры. ГОСТ 29252-91. Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Ч.1. Общие требования. ГОСТ 1770-74. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия. ГОСТ 2922-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. ГОСТ 9147-80. Посуда и оборудование лабораторные фарфоровое. Технические условия. ГОСТ 20292-74. Колбы мерные вместимостью 100, 200, 500, 1000 мл. Технические условия. ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. ГОСТ 13646-68. Термометры стеклянные ртутные для точных измерений. ГОСТ 4328-77. Натрий гидроокись. Технические условия. ГОСТ 14261-77. Кислота соляная особой чистоты. Технические условия. ГОСТ 12.1.008-76. Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования. Технические условия. 4 ОПРЕДЕЛЕНИЯ В диссертации применяют следующие термины с соответствующими определениями: Адсорбция растворенных веществ Ассоциация Биокатализатор Биосорбент Биодеструктор Биоремедиация Биостимуляция Биодополнение Биостимуляция in siti (биостимуляция в месте загрязнения) результат перехода молекулы растворенного вещества из раствора на поверхность твердого сорбента под действием силового поля поверхности. При этом наблюдаются два вида межмолекулярного взаимодействия: молекул растворенного вещества с молекулами (или атомами) поверхности сорбента и молекул растворенного вещества с молекулами воды в растворе (гидратация). Разность этих двух сил межмолекулярного взаимодействия и есть та сила, с которой удерживается извлеченное из раствора вещество на поверхности сорбента. объединение двух или нескольких микроорганизмов это система катализирующая тот или иной биохимичесикий процесс это сорбент-носитель с иммобилизованными микроорганизмами деструкторами. ферментативно-окислительный процесс органических веществ, нефти, нефтепродуктов и других ксенобиотиков применение технологий и устройств, предназначенных для биологической очистки почв, т.е. для удаления из почвы уже находящихся в ней загрязнителей активизация деградирующей способности аборигенной микрофлоры внесением биогенных элементов, кислорода, различных субстратов интродукция природных и генноинженерных штаммов-деструкторов чужеродных соединений. этот подход основан на стимулировании роста природных микроорганизмов, обитающих в загрязненной почве и потенциально способных утилизировать загрязнитель, но не способных делать это эффективно из-за недостатка основных биогенных элементов (соединений азота, фосфора, калия и др.) или неблагоприятных физикохимических условий. В этом случае в ходе лабораторных испытаний с использованием образцов загрязненной почвы устанавливают, какие именно компоненты и в каких количествах следует внести в загрязненный объект, чтобы стимулировать 5 рост микроорганизмов, способных утилизировать загрязнитель Биостимуляция in отличие этого подхода в том, что биостимуляция vitro. образцов естественной микрофлоры загрязненной почвы проводится сначала в лабораторных или промышленных условиях (в биореакторах или ферментерах). При этом обеспечивается преимущественный и избирательный рост тех микроорганизмов, которые способны наиболее эффективно утилизировать данный загрязнитель. «Активизированную» микрофлору вносят в загрязненный объект одновременно с необходимыми добавками, повышающими эффективность утилизации загрязнителя Биорекультивация – это многостадийный биотехнологический процесс, нефтезагрязненных включающий физико-химические методы почв детоксикации загрязнителя, применение органических и минеральных добавок, использование биопрепаратов Биологическое количество кислорода, необходимое для потребление биохимического окисления органических веществ, кислорода содержащихся в 1л сточной воды, за определенный интервал времени (аэробной окисление). БПК определяют в термостатированных условиях (инкубация) при 20 0C.В зависимости от продолжительности инкубации различают БПК5 (пятисуточное), БПК10 (десятисуточное) и т.д., и БПК полное. Верхний безопасный минимальный уровень содержания нефтепродуктов в уровень концентрации почвах и грунтах, выше которого наступает ухудшение качества природной среды Десорбция удаление из жидкостей или твердых тел веществ, поглощенных при адсорбции или абсорбции. Применяется при регенерации адсорбентов и абсорбентов путем нагревания, понижения давления, продувки не сорбируемыми газами или парами, обработки растворителями Иммобилизация создание условий для обеспечения неподвижности Иммобилизованные это переход каталитической активности клеток на клетки полное или частичное прикрепленное состояние, обеспечивающее клетке неподвижное условие, эту неподвижность обеспечивают носители Ксенобиотики чужеродные для живых организмов химические вещества, естественно не входящие в биотический 6 круговорот, и, как правило, прямо или косвенно порождѐнные хозяйственной деятельностью человека Ориентировочный нижний допустимый уровень загрязнения, при уровень допустимой котором в данных природных условиях почва в концентрации течение одного года восстановит свою продуктивность, а негативные последствия для почвенного биоценоза могут быть самопроизвольно ликвидированы Химическое количество кислорода, необходимое для окисления потребление органических примесей в 1л сточной воды до СО2, кислорода Н2О, NH3. ХПК сточной воды определяется с целью выявления ее общей загрязненности различными примесями, окисляемыми бихроматом калия при двухчасовом кипячении в кислой среде в присутствии катализатора. В таких условиях значительное число органических веществ окисляется практически полностью (на 95-98%). Исключения составляют бензол и его гомологи, а также азотосодержащие гетероциклические соединения (пиридин, пиррол и т.п.) 7 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ ВЭЖХ ГХ/МС ГОСТ НП НПЗ ПДК ИКС ЯМР БЭТ СЭМ РЭМ РФА ААС КР ПЦР ОДК ТЭК БПК ОПК ХПК ГСО высокоэфективная жидкостная хроматография газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием государственный стандарт нефтепродукты нефтеперерабатывающие заводы предельно-допустимая концентрация инфракрасная спектроскопия ядерно-магнитный резонанс метод Брунауэра-Эммета-Теллера - определения удельной поверхности и размеров пор сканирующая электронная микроскопия растровая электронная микроскопия рентгенофазовый анализ атомно-адсорбционная спектрофотометрия комбинационное рассеяние полимеразная цепная реакция ориентировочный уровень допустимой концентрации топливно-энергетический комплекс биологическое потребление кислорода общее потребление кислорода химическое потребление кислорода государственный стандартный образец 8 ВВЕДЕНИЕ Общая характеристика диссертационного исследования. Диссертация посвящена созданию модифицированных углеродминеральных сорбентов, которые будут использоваться для очистки природных объектов от техногенных загрязнений. Актуальность темы исследования. В последнее время проблема загрязнения природных объектов отходами техногенного происхождения становится все более острой. Различные виды отходов промышленных предприятий отравляют воздушный бассейн, водную акваторию и почву, оказывая пагубное воздействие на обитающие в них живые организмы. Серьезной экологической проблемой, требующей безотлагательного решения, является загрязнение водных ресурсов и почвы нефтью и нефтепродуктами, тяжелыми металлами, пестицидами и др. веществами. Распространенными методами очистки воды, воздуха и почв являются адсорбционные методы. Однако большинство известных сорбентов имеют общие недостатки (высокая стоимость, низкая сорбционная емкость и др.). Производство сорбентов традиционным способом характеризуется многостадийностью, сложностью применяемого оборудования, ограниченностью сырьевой базы и т.д. Поиск и создание новых эффективных сорбционных материалов является актуальной задачей. В настоящее время уделяется много внимания новым, высокоэффективным технологиям, которые базируются на применении биосорбентов, объединяющих достоинства сорбционного и биодеструктивного методов ликвидации нефтяных загрязнений. Биодеструктивные сорбенты локализуют нефтяные загрязнения и разрушают адсорбированные нефтепродукты биологическим методом. При этом достигается эффективная очистка от загрязнений. В природных условиях подавляющее большинство микроорганизмов живет, размножается и проявляет различного рода биохимическую активность в прикрепленном состоянии к минеральным частицам почвы, донных отложений озер, рек, морей, к корням или наземной части растений. Поэтому для создания оптимальных условий развития микроорганизмов-деструкторов, вносимых в загрязненную водную среду, и обеспечения их длительной жизнедеятельности в ней, обычно используют предварительную иммобилизацию клеток на нерастворимых носителях. Источником получения ряда углеродсодержащих материалов (носителей микроорганизмов) могут служить шунгитовые породы, имеющиеся в Казахстане в достаточных для промышленного использования количествах. В связи с этим разработка фундаментальных и технологических основ создания новых углеродсодержащих материалов из казахстанского сырья приобретает особую актуальность. Учитывая сложный минералогический и химический составы углеродсодержащего сырья, получение продуктов заданного состава и свойств становится актуальной проблемой, имеющей как теоретическое, так и практическое значение. 9 Таким образом, подобрав пару носитель - микробная клетка, отвечающую заданным свойствам и удовлетворяющую технологическим требованиям, можно получать высокоэффективные биосорбенты для использования в процессах очистки водных объектов и почв от различных загрязнителей. В связи с вышесказанным, тема диссертационной работы, посвященной решению проблемы загрязненности экосистем техногенными загрязнителями, а также разработке биосорбентов для их очистки с помощью микроорганизмов деструкторов, является актуальной. Цель работы – получение высокоэффективных биодеструкторов токсикантов на основе свободных и иммобилизованных микроорганизмов на шунгитовом сорбенте и выявление возможности использования полученных композитов для решения ряда экологических и технологических задач. Для достижения поставленной цели потребуется поэтапное выполнения следующих задач: - изучить и провести анализ литературных данных по вопросам использования биосорбентов для борьбы с загрязнением почвы и воды; - определить количественный составы токсикантов в почве и воде; - наработать опытные образцы сорбента и определить его основные физико-химические характеристики; - определить основные сорбционные характеристики полученных материалов по отношению к токсикантам; - провести поиск и селекцию природных деструктивных микроорганизмов; - выделить штаммы деструктивных микроорганизмов; - провести идентификацию и скрининг активных штаммов деструкторов; - выбрать наиболее перспективные штаммы-деструкторы; - оптимизировать условия роста и развития углеводородокисляющей микрофлоры в периодических и непрерывных условиях с целью получения активной биомассы для биодеградации токсикантов; - исследовать процесс иммобилизации микроорганизмов – деструкторов на носителях; - изучить сорбционные свойства сорбентов, иммобилизированных биологическими штаммами, по отношению к токсикантам; - определить деструктивную активность сорбента с иммобилизованными клетками микроорганизмов по отношению к токсикантам в процессе биоремедиации почвы; - выявить оптимальные условия реабилитации загрязненных территорий в зависимости от природы и степени загрязнения; - провести дезактивационные работы на ключевых участках, местах пролива загрязнителей. Объекты исследования - модифицированные углеродминеральные сорбенты для очистки природных объектов от техногенных загрязнений; в качестве объектов исследования были использованы шунгитовые породы, отобранные на месторождениях «Бакырчик» (ВКО РК) и «Зажогино» (Россия); активные штаммы микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненной почвы 10 и воды месторождения «Ботахан» Атырауской области: АТ-1 (Pseudomonas stutzeri), АТ-3 (Bacillus atrophaeus), АТ-4 (Isoptericola variabilis); месторождения «Жанаозен» Западно-Казахстанской области г.Актау: АК-1; из шлама Алматинской области Sh-3 (Pantoea vagans), Sh-4 (Pantoea ananatis); из почвы загрязненной пестицидами Балхаш-Алакольского региона: P-1, P-2, P-3, P-4; из аэробного ила HSAAP (Holston Army Ammunition Plant, США): US-2 (Mycobacterium sp.), US-3 (Rhodococcus opacus), US-4 (Rhizobium sp.); аэробный ил HSAAP (Holston Army Ammunition Plant, США); раствор БТЭК (бензол, толуол, этилбензол, ксилол), питьевая вода из водопровода г.Жезказгана (№1, №2), техническая вода из медеплавильного завода ТОО Корпорации КАЗАХМЫС, сточные воды из водохранилища Кенгир, г.Жезказгана. Предмет исследования - количественное определение суммарного содержания углеводородов нефти и нефтепродуктов, пестицидов и тяжелых металлов в почве и воде, их нейтрализация. Методы исследования. В исследовании были использованы известные методы получения сорбентов, методы определения физико-химических и основных адсорбционных свойств сорбентов: ИКС, СЭМ, элементный анализ, Раман спектроскопия, РФА, газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием, метод БЭТ - основанный на определении удельной поверхности и размеров пор, ААС, флуорометрический метод. Методы определения количества клеток высевом на плотные питательные среды и определение нефтеокисляющей активности свободных и иммобилизованных клеток штаммов-деструкторов, определения морфолого-культуральных свойств микроорганизмов, генетическая идентификация бактерий на основании анализа нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена, ПЦР. Научная новизна. 1. Впервые показана возможность использования шунгитового сорбента с иммобилизованными клетками микроорганизмов штаммов АТ-1 (Pseudomonas stutzeri), АТ-3 (Bacillus atrophaeus), АТ-4 (Isoptericola variabilis); АК-1; Sh-3 (Pantoea vagans), Sh-4 (Pantoea ananatis); P1, P-2, P-3, P-4; US-2 (Mycobacterium sp.), US-3 (Rhodococcus opacus), US-4 (Rhizobium sp.); микромицетов Fusarium, Aspergillus, Penicillum, Mucor для биоремедиации природных объектов от техногенных загрязнений. 2. Изученые современными высокоразрешающими физико-химическими методами анализа характеристики шунгитовых пород Казахстана и России позволило установить структурные аналога шунгитовых пород этих месторождений. 3. Изученные иммобилизации клеток различных бактерий на шунгитовых сорбентах Казахстана и России показало что, гранулированные сорбенты являются эффективными носителями для клеток микроорганизмов. 4. Выделено 13, идентифицировано 8 новых штаммов бактерий Pseudomonas stutzeri, Bacillus atrophaeus, Isoptericola variabilis, Pantoea vagans, Pantoea ananatis, Mycobacterium sp.,Rhodococcus opacus, Rhizobium sp. 5. Впервые представлены данные о микроорганизмах, выделенных из сточных вод и почв, проверена их сорбционная и деструктивная активность. 11 6. Изучение биоремедиации почвы и воды с использованием шунгитового сорбента с иммобилизованными микроорганизмами показало, что исследуемые биосорбенты имеют более высокую деструктивную активность по отношению к токсикантам по сравнению со сводными клетками. Обоснованность и достоверность полученных данных подтверждены использованием комплекса современных физико-химических методов анализа и статистической обработкой экспериментальных данных. Для выполнения всех планируемых исследований и химико-биологических испытаний имеются соответствующие сертифицированные методики, стандарты РК и ГОСТы. Используемые в ходе исследований приборы и материалы удовлетворяют требованиям соответствующей нормативно-технической документации. Связь темы с планом научно-исследовательских работ и различными Государственными программами. Настоящая работа выполнялась в рамках Подпроекта «Создание опытно-промышленного производства наноструктурированных углеродсодержащих материалов для химико-технологических процессов», финансируемого в рамках Проекта Коммерциализации Технологий, поддерживаемого Всемирным Банком и Правительством Республики Казахстан. Основные положения, выносимые на защиту: - обоснование использования углерод-минерального сырья в очистке сточных вод и почв от техногенного загрянения, результаты физикохимических исследований шунгитовых пород и концентратов Казахстана и России; - идентификация и скрининг активных штаммов деструкторов техногенных загрязнителей, иммобилизация микробных клеток на шунгитовых сорбентах Казахстана и России; - биосорбенты обеспечивают эффективную адсорбционно-биологическую очистку воды и почвы от техногенного загрязнения. Научно-практическая значимость исследования. Теоретическая значимость работы заключается в создании новых биосорбентов для очистки природных объектов от техногенных загрязнителей. Практическая значимость заключается в разработке высокоэффективной технологии очистки воды и почв от нефти и нефтепродуктов, тяжелых металлов и пестицидов. Иммобилизованные микроорганизмы, перерабатывающие токсичные вещества в безопасные формы, могут найти применение во многих областях химической, аграрной и нефтехимической отраслях промышленности. При реализации предложенной технологии существенно повышается возможность импортозамещения аналогичных видов продукции, что особенно актуально для нашей страны. Данные биосорбенты могут быть использованы для очистки воды и почвы, что актуально для всех регионов республики и позволит решить ряд технологических, социальных и экологических задач. Результаты диссертационной работы внедрены в практику научных исследований лаборатории «Экология биосферы» ДГП Центра физико12 химических методов исследования и анализа, а также в учебный процесс кафедры аналитической, коллоидной химии и технологии редких элементов факультета химии и химической технологии КазНУ им. аль-Фараби. Апробация практических результатов работы. Основные результаты были представлены на следующих международных конференциях, семинарах и форумах: Международная конференция студентов и молодых ученых «Мир науки», посвященная 20-летию независимости Республики Казахстан в свете формирования гражданского общества (Алматы, 18-21 апреля 2011 г.); XIX Менделеевский съезд по общей и прикладной химии «Химия и технология материалов, включая наноматериалы» (Волгоград, 25-30 сентября 2011 г.); ІІІ Международная научно-техническая конференция «Современные методы в теоретической и экспериментальной электрохимии» (Россия, Плес, Ивановская обл., 3-7 октября 2011 г.); IX Международная заочная научно-практическая конференция «Технические науки – от теории к практике», Раздел: Безопасность жизнедеятельности человека, промышленная безопасность, охрана труда и экология (Россия, Новосибирск, 17 апреля 2012 г.); Республиканская научно-практическая конференция молодых ученых «Наука. Образование. Молодежь» (Алматы, 19-20 апреля 2012 г.); Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Мир Науки», приуроченная 20-летию Государственных символов РК. Раздел: Актуальные проблемы экологии (Алматы, 23-26 апреля 2012 г.); Второй семинар конференция «Интеграция химической науки с производством, через инновации к прогрессу» (Алматы, 24-26 мая 2012 г.); Международная научнопрактическая конференция «Инновационное развитие пищевой, легкой промышленности и индустрии гостеприимства», посвященной 55-летию Алматинского технологического университета (Алматы, 12-13 октября 2012 г.); Международная научно-практическая конференция «Наука, технология и высшее образование» (Канада, Вествуд, 11-12 декабря 2012 г.); Международная научная конференция студентов и молодых ученых «Мир Науки» (Алматы, 1719 апреля 2013 г.); Республиканская конференция молодых ученых «Наука. Образование. Молодежь» (Алматы, 18-19 апреля 2013 г.); Международная научная конференция по аналитической химии и экологии, посвященной 110летию со дня рождения академика АН РК М.Т. Козловского (Алматы, 9-11 октября 2013 г.), IV Международная конференция "Наука и образование" (Германия, 30-31 октября 2013 г). Публикации. Результаты вполненной работы отражены в 28 научных работах, в том числе: - в 4 статьях, опубликованных в журналах, рекомендованных Комитетом по контролю в сфере образования и науки Министерства образования и науки Республики Казахстан; - в 1 статье, опубликованной в международном научном издании имеющем, по данным информационной базы компании Scopus, ненулевой импакт-фактор; 13 - в 16 материалах и тезисах международных и республиканских научных семинаров и конференций, из них 4 в материалах зарубежных конференций. Личный вклад автора заключается в теоретическом обосновании задач, в выборе направления и постановке исследований, в разработке экспериментальных подходов, интерпретации и обобщении полученных результатов, а также непосредственном участии при проведении всех экспериментов и опытно-промышленных испытаний. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 3 разделов, заключения, списка использованных источников и приложений. Содержит 135 страниц машинописного текста, 14 таблиц, 20 рисунков. Список цитируемой литературы включает 281 наименований. 14 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Решение проблемы загрязнения объектов окружающей среды техногенными загрязнителями Экологическая напряженность, возникшая в последние десятилетия, может быть снята посредством последовательного практического решения экологических проблем. В связи с этим ключевое значение приобретает переосмысление всех сфер человеческой деятельности и, в первую очередь, науки, как решающего фактора социально-экономического развития страны. Загрязнение поверхностных вод и почвы различными токсикантами – один из ярких показателей общего ухудшения состояния природной среды. Скорость накопления загрязнителей в водных и почвенных экосистемах в результате техногенной деятельности значительно опережает скорость их биодеградации естественным путем, а существующие технологии не позволяют справляться с такими загрязнениями быстро и эффективно. Интенсивное загрязнение воздуха, воды и почв, деградация животного и растительного мира, истощение природных ресурсов привели к разрушению экосистем, опустыниванию и значительным потерям биологического и ландшафтного разнообразия. В результате антропогенных нагрузок практически на всей территории страны нарушены естественная способность природной среды обеспечивать будущее экономическое и социальное развитие страны. Имеющаяся статистика отмечает рост токсичных отходов. За последние годы их ежегодное образование возросло в разы. Они сосредоточены преимущественно в Карагандинской - 29,4%, Восточно-Казахстанской - 25,7%, Костанайской - 17% и Павлодарской-14,6% областях. Тяжелыми металлами и нефтепродуктами загрязнены также земли Южно-Казахстанской, Кызылординской, Атырауской, Актюбинской и Западно-Казахстанской областей. Стоки, попадающие в поверхностные воды, содержит бензин, керосин, топливные и смазочные масла, бензол, толуол, ксилолы, жирные кислоты, фенолы, глицериды, стероиды, пестициды, и металлоорганические соединения. Перечисленные соединения составляют около 90% и выше от суммарного количества всех органических примесей. В числе других веществ, загрязняющих окружающую среду, можно назвать нитросоединения, асфальты, воски, твердые парафины, карбонильные и сернистые соединения, хлорированные углеводороды и бифенилы. Распространенными методами очистки воды, воздуха и почв являются адсорбционные методы. Однако большинство известных сорбентов имеют общие недостатки (высокая стоимость, низкая сорбционная емкость и др.). Производство сорбентов традиционным способом характеризуется многостадийностью, сложностью применяемого оборудования, ограниченностью сырьевой базы и т.д. В целях ликвидации последствий техногенного загрязнения окружающей природной среды и предотвращения новых загрязнений возникает задача поиска и создания эффективных модифицированных биологическими штаммами адсорбентов для 15 обезвреживания токсикантов на поверхности воды и почвы, возникающих в результате техногенной деятельности человека. Известные способы очистки сточных вод (механические, химические и физические) не всегда эффективны, а зачачтую экологически небезопасны. Применение природных минералов в очистке сточных вод приемлемо с экологической и экономической точек зрения, но как правило такие материалы обладают недостаточно емкими сорбционными свойствами и их необходимо химически модифицировать. В результате модифицирования получаются сорбенты с отличной от исходного минерала поверхностью и сочетают в себе полезные свойства исходного материала и синтетических сорбентов. В связи с этим перспективным способом очистки сточных вод и почвы от техногенных загрязнителей является использование комплекса мер, с обязательным включением биотехнологического метода. Для очистки воды и почв, в частности, от нефти и нефтепродуктов, пестицидов и тяжелых металлов эффективными являются микробиологические методы, основанные на интродукции активных микроорганизмов в загрязненную среду. При использовании этого метода на предварительных этапах производят отбор микроорганизмов-деструкторов, которые должны обладать [1]: - способностью деградировать большое количество компонентов загрязнителей; - генетической стабильностью; - жизнеспособностью во время хранения; - быстрым ростом после хранения; - высокой степенью ферментативной активности и роста в окружающей среде; - способностью конкурировать с местными микроорганизмами и др. Для создания преимущественных условий развития микроорганизмадеструктора и обеспечения его длительной жизнедеятельности в воде используют предварительную иммобилизацию клеток. Иммобилизация клеток на носителе в рамках физико-химического подхода – это выяснение оптимальных для сорбции физико-химических параметров системы, где происходит иммобилизация, и подбор наиболее эффективного сорбента, потому что микроорганизмы проявляют большую избирательность в отношении адгезии к различным носителям как в отношении количества микробных клеток, прикрепляющихся к сорбенту, так и в отношении прочности образовавшихся связей [2]. Иммобилизованные клетки вследствие своей жизнеспособности представляют собой более стабильные индукторы окислительновосстановительных превращений. Кроме того, иммобилизованные микроорганизмы, по сравнению со свободными клетками, более активны (в 2-3 раза) и усточивы к действию факторов среды: температуры, рН, ксенобиотиков [3]. 16 Вышеописанное свидетельствует о том, что, подобрав пару носительмикробная клетка, отвечающую заданным свойствам и удовлетворяющую технологическим требованиям, можно получать высокоэффективные биосорбенты для использования в процессах очистки водных объектов и почв от различных загрязнителей. Аналогичные направления по изучению нового биопрепарата для очистки почв и воды от техногенных загрязнений методом иммобилизации микроорганизмов существуют в России (Саданов А.К., Шигаева М.Х., Мукашева Т.Д., Жубанова А.А., Мансуров З.А. и др.), в Узбекистане (Андрусенко М.Я., Бильмес Б.И., Джамалов Т.Д., Рунов В.И. и др.), а также в Украине, Болгарии. Известны работы ученых США, Японии, Великобритании, ФРГ (Wilkinson S., Nicklin S., Faul J.L., Tompson I.P., Singer A.C., Bailey M.J., Loynachan T. E.) по очистке промышленных, сточных вод и почв. Сотрудничество ученых химиков и биологов в рамках данной научной работы, использование известных химических и биологических методов создания и изучения иммобилизованных сорбентов для очистки природных объектов от различных загрязнителей, внесут определенный вклад имеющийся научный задел и, надеемся позволят получить конкурентоспособные результаты. 1.2 Нефтяные загрязнения сточных вод и почв и их влияние на окружающую среду Одна из глобальных проблем – загрязнение воды и почвенного покрова нефтью и нефтепродуктами, а разработка новых и совершенствование существующих технологий восстановления загрязненных нефтью воды и земель относится к числу приоритетных. Нефтедобывающая и нефтеперерабатывающая промышленности являются одними из главных составляющих казахстанской экономики. В районах их расположения происходит изменение химического и микробиологического состава подземных и поверхностных вод и грунтов в результате их загрязнения нефтепродуктами, поверхностно-активными веществами, различными химическими реагентами, что представляет большую опасность для среды обитания человека и живой природы [4]. В ходе трансформации углеводородов нефти могут образоваться стойкие к микробиологическому расщеплению еще более токсичные соединения, обладающие канцерогенными и мутагенными свойствами [5]. Эксперименты на растениях и животных показали, что сильные токсические эффекты связаны с соединениями с низкими температурами кипения, особенно сильные ароматическими веществами. Экологические проблемы начинаются уже на стадии добычи нефтяного сырья и его поставки на предприятия. Наиболее характерными загрязнителями окружающей среды являются углеводороды (44,9% от суммарного выброса), оксид углерода (47,4%) и различные твердые вещества (4,3%). Не менее острые проблемы возникают при транспортировке нефти на нефтеперерабатывающие предприятия. Нефть транспортируется по трубопроводам, подверженным коррозии, отложениям смол и парафинов внутри труб. Ежегодно происходит 17 более 60 крупных аварий и около 20 тыс. случаев, сопровождающихся значительными разливами нефти, попаданием ее в водоемы, гибелью людей, большими материальными потерями. Несмотря на принятую еще в 1954 году Международную конвенцию по предотвращению загрязнения моря нефтью, эти загрязнения до сих пор наносят огромный вред состоянию вод Мирового океана посредством влияния на формирование и протекание естественных гидрохимических и гидрологических процессов в морях, океанах и внутренних бассейнах. Значительные поступления нефти в морскую среду в результате разведывательных работ, добычи, транспортировки, переработки черного золота, а также аварий, происходящих на морских нефтепромыслах и танкерах, вызывают уничтожение растительности, разрушение мест обитания животных и соответственно уменьшение их численности, загрязнение питьевой воды, приводящее к росту заболеваемости населения [6]. Антропогенный прессинг вызывает нарушение равновесного состояния экосистемы в целом, сопровождающееся отклонениями в развитии различных представителей флоры, фауны и самого человека. Негативное влияние нефтяного загрязнения характеризуется: нарушением естественных ландшафтов местности и потерей сельскохозяйственных земель; нарушением в нефтезагрязненных почвах важнейших генетических показателей: изменение естественного морфологического профиля, химических и биологически свойств, формирование плотных битумных корок, непроницаемых для корней растений и микроорганизмов; - загрязнением воздушного бассейна, вследствие испарения углеводородов вокруг нефтепромыслов; - загрязнением промышленных зон нефтепромыслов сероводородом, меркаптанами, аммиаком, сернистым ангидридом и другими токсичными веществами, вызывающими у живых организмов серьезные заболевания; - повышением уровня подземных вод и, как следствие, образованием мелких засоленных озер; - изменением плотности, уменьшением прозрачности воды, гибелью рыбы, водоплавающих птиц и мелких животных. В мировой нефтяной экономике за единицу измерения объема нефти принят 1 баррель (159 л). Предполагается, что 2020 г. объем мирового потребления нефти составит 110 млн. баррелей в сутки, что на 35 млн. баррелей выше нынешнего уровня [7]. Разработка нефтяных и газовых месторождений, бесспорно, является важным звеном народно-хозяйственного комплекса многих развитых стран, в том числе и Казахстана. Во всех регионах Казахстана установлены нефтегазопроявления, почти 62% территории Казахстана можно отнести к нефтегазоносным. Особое место среди зон экологического напряжения, занимает часть Прикаспийского региона Атырауской области [8]. Атырауская область является самым крупным нефтедобывающим и 18 нефтеперерабатывающим районом (на промыслах Восточного Прикаспия добывается более 60% всей казахстанской нефти и более 50% газа). Вследствие деятельности действующих в регионе крупнейших нефтегазовых комплексов компании «Тенгизшевройл», разработки месторождения Кашаган компанией «Аджип ККО», реконструкции Атырауского НПЗ, эксплуатации трубопровода КТК («Тенгиз-Новороссийск») в регионе сложилась довольно сложная экологическая обстановка [9]. Идет процесс интенсивного загрязнения атмосферы, поверхностных вод, атмосферных осадков, снежного покрова, а через них почвенного и растительного покрова, в которых накапливаются углеводороды нефти, тяжелые металлы, радионуклиды и другие вредные вещества. В соответствии с материалами Международной конвенции об оценке воздействия на окружающую среду (1981 г) эти территории отнесены к экологически опасным объектам для биоты. Загрязнение почв углеводородами нефти отмечено на территориях всех нефтегазовых промыслов Атырауской области и на всех стадиях разработки месторождений, начиная с поискового бурения, строительства нефтегазодобывающих скважин, эксплуатации, транспортировки сырья и кончая условиями их хранения. По экспертным оценкам на нефтепромыслах теряется до 3,5 % от всего объема добываемой нефти, причем большая часть выделяемых загрязняющих веществ - до 75 % поступает в атмосферу, 20 % - в водные источники и 5 % - в почву. Основной поток нефтяных загрязнений около (2-3)x107 т ежегодно обусловлен техногенными источниками. В окружающую среду в результате прижизненных выделений растительными и животными организмами, а также их посмертного разложения поступает примерно 6x105 т в год углеводородных загрязнений. Часть их поступает со дна океана из естественных источников [10]. В процессе добычи нефти в среду с пластовыми и промывными водами попадают соли натрия (особенно NaCI). Содержание ионов натрия достигает 25-35% от суммы поглощенных катионов, в результате чего возникает техногенное солонцевание почв. В почву вместе с нефтью и пластовыми водами попадают содержащиеся в них тяжелые металлы [10-11]. Отдельного внимания требует проблема загрязнения гидросферы нефтью и нефтепродуктами. Существует серьезная проблема загрязнения водного бассейна, начиная от небольших водоемов и рек и заканчивая великими реками и Мировым океаном. Ежегодно в океан сбрасывается 10 млн. т нефти. К сожалению, в настоящее время не существует научно обоснованного четкого определения- какую концентрацию нефтепродуктов или нефти следует считать катастрофической для водоема в зависимости от его объема, гидродинамических характеристик и биоресурсов. По существующим международным нормативам авария на море определяется как утечка более 50 т нефти. Известно, что одна тонна нефти способна загрязнить до 12 км2 морской поверхности. Ежегодно выводятся из нормального функционирования порядка 120 млн. км2 морской поверхности или 1/6 часть Мирового океана. С 19 образованием нефтяной пленки уменьшается испарение с поверхности воды на 60%. Глобальные последствия образования пленок следующие: - снижение количества осадков над континентами и, как следствие, увеличение пустынь и участков суши, непригодных для сельского хозяйства; - более частое возникновение циклонов, изменение метео-обстановки; - сокращение (вырождение) численности рыб и планктона; - нефтяная пленка способствует гибели птиц и морских млекопитающих [7]. В настоящее время экосистема Каспийского моря оценивается как предкризисная и может ухудшиться в результате крупномасштабного вторжения в природную среду планируемого освоения мелководий северовосточной части для добычи нефти. За последние десятилетия под воздействием антропогенных и биохимических факторов резко ухудшилось состояние экосистемы в целом, и особенно северо-восточной части моря. Существует несколько предпосылок высокого уровня загрязнения Каспия. К ним относятся наличие значительных запасов углеводородного сырья под дном моря, высокая плотность населения и промышленности, интенсивное сельскохозяйственное освоение в долинах впадающих рек, отсутствие четко выраженного геохимического барьера «река-море», замкнутость бассейна и др. Так в результате естественных процессов (грязевулканическая деятельность, разложение органики на дне и т.п.) некоторое количество таких загрязнителей как нефть и фенолы попадает в морскую воду. Загрязнение нефтью наносит жестокий удар по биологическому равновесию моря: пятно не пропускает солнечные лучи, замедляет обновление кислорода в воде и снижается биологическая продуктивность. Таким образом ядовитые компоненты нефти становятся причиной гибели рыбы, морских птиц, отрицательно влияют на вкусовые качества мяса морских животных. С увеличением концентрации нефти опасность отравления ею возрастает. Для водных образцов принятое ПДК суммарного содержание нефтепродуктов составляет 0,05 мг/л [12]. Нефть это продукт длительного распада довольно быстро покрывающий поверхность вод плотным слоем нефтяной пленки. Со временем концентрация нефти в воде под действием испарения наиболее летучих компонентов, растворения, окисления, эмульгирования и биодеградации уменьшается. Окисленная нефть оседает на дно водоемов. В результате, нефтяное загрязнение нарушает многие естественные процессы и взаимосвязи, существенно изменяет условия обитания всех видов живых организмов и накапливается в биомассе. Меры, предотвращающие загрязнения гидросферы: - увеличение капиталовложений в новые технологии транспорта, добычи и переработки нефти; -совершенствование международного экологического законодательства; - разработка новых приемов и активных веществ для очистки водной поверхности; -повышение надежности систем очистки сточных вод нефтехимических производств, автотранспортных предприятий и нефтехранилищ; 20 - рациональное размещение предприятий ТЭК с учетом особенностей природных систем [7]. Загрязнение почвы нефтью и нефтепродуктами в результате хозяйственной деятельности также становится одним из важнейших факторов воздействия на окружающую среду. Почвенный покров – основной элемент ландшафта – первым принимает на себя «экологический удар». В связи с механическим нарушением и нередко химическим загрязнением происходит постепенная деградация почв, которая стала одной из основных экологических проблем нефтегазового комплекса. Нефтепродукты благодаря высокой адсорбирующей способности почвы длительное время сохраняются в ней, изменяя при этом ее физико-химические и биологические свойства. Нефтяное загрязнение подавляет микробиологические и биохимические процессы, вызывает изменение структуры биоценозов, активности направленности почвообразовательных процессов [13, 14]. Наибольший ущерб природе наносят аварии на магистральных нефте- и газопроводах. Так, при одном порыве нефтепровода выбрасывается в среднем 2 т нефти, что выводит из строя 1000 м³ земли, а в результате аварии на газоконденсатопроводе на землю в среднем попадает не менее 2 млн. т/год нефтепродуктов. Аварийные разливы нефти зачастую приводят к формированию техногенных пустынь, процесс самовосстановления которых, по мнению большинства исследователей, длится более 15-25 лет [15-18]. Известно, что почва является одним из наиболее уязвимых компонентов биосферы и ее можно рассматривать как промежуточную среду между водной и воздушной субстанциями. Изучение почвенного покрова на разных месторождениях Атырауской области показало, что воздействие нефти и нефтепродуктов приводит к негативным изменениям физико-химических и химических свойств почвы. Глубина нефтяного загрязнения на старейших нефтепромыслах Доссор, Макат, Искене, Косчагыл и др. достигает до 5-10 м [19, 20]. На сильно нарушенных участках обнажаются и образуются такыровидные и такырные поверхности, усиливаются процессы засоления. Данные гранулометрического состава техногенно-нарушенных почв свидетельствуют о высокой степени распыления, пылевато-иловатом составе гумусового горизонта и возрастании степени карбонатности почв. По данным химических анализов почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, установлено, что в нефтезагрязненных почвах в 1,5-2,0 раза меньше накапливается нитратного азота, снижается рН почвенного раствора и интенсивность ферментной активности почвы. Таким образом, нефть, попадая в почву, приводит к значительным, а порой и к необратимым изменениям, при этом усиливаются нежелательные природные процессы, такие как: эрозия почв, дефляция, криогенез [21]. ПДК нефтепродуктов для почвы составляет 0,1 мг/кг [22]. 21 Процесс естественного фракционирования и разложения нефти начинается с момента ее поступления на поверхность почвы. Выделяют три наиболее общих этапа трансформации нефти в почвах: 1) физико-химическое и частично микробиологическое разложение алифатических углеводородов; 2) микробиологическое разрушение главным образом низкомолекулярных структур разных классов, новообразование смолистых веществ; 3) трансформация высокомолекулярных соединений; смол, асфальтенов, полициклических углеводородов. Загрязнение нефтью оказывает отрицательное воздействие на химические, физические и биологические свойства почв. Под влиянием нефти и ее компонентов изменяется численность микроорганизмов основных физиологических групп, ухудшаются агрофизические, агрохимические свойства почвы, снижаются активность окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов, обеспеченность почвы подвижными формами азота и фосфора. На разложение нефти в почве решающим образом влияет функциональная активность комплекса почвенных микроорганизмов, обеспечивающих полную минерализацию нефти и нефтепродуктов до углекислого газа и воды. На первой стадии изменение почвенной биоты характеризуется массовой гибелью мезо- и микрофауны; на второй стадии – «бумом» микробиологической активности специализированных микроорганизмов и последующей постепенной эволюцией биоценоза, коррелирующей с постоянно изменяющейся геохимической ситуацией в почве. В работе Н. А. Киреевой [23] показана токсичность ароматических углеводородов для микроорганизмов почвы и их негативное воздействие на ферментативную активность. Наиболее чувствительными к загрязнению ароматическими углеводородами являются нитрифицирующие и целлюлозоразрушающие микроорганизмы, которые могут служить индикаторами загрязнения почв. Загрязнение нефтью существенно изменяет комплекс почвенных актиномицетов, снижая их численность и обедняя видовой состав. Кроме того, в загрязненной нефтью почве возрастает число фитопатогенных и фитотоксичных видов микроскопических грибов. Развитие фитотоксичных форм грибов может усилить отрицательное воздействие на почву нефтяного загрязнения. Показано, что загрязнение нефтью приводит к существенному (на два порядка) снижению численности гетеротрофной части микробного комплекса, отмеченного на начальных этапах воздействия нефти. Через три месяца происходит восстановление численности гетеротрофов. Первоначально, в интервале концентраций нефти соответствующих зоне гомеостаза (до 1 мл/кг), она не оказывает существенного влияния на почвенную микробиоту, выступает как биологический стимулятор. Более высокие дозы (зона стресса 1-30 мл/кг) 22 приводят к необратимым изменениям микробиологических свойств почвы, а в дальнейшем, - к нарушению еѐ водно-воздушного режима. Затем, в зоне резистентности, она становится основным трофическим субстратом для углеводородокисляющих микроорганизмов, одновременно угнетая жизнедеятель-ность других гетеротрофных микроорганизмов, растений и животных. Наконец, при ещѐ больших дозах, в зоне репрессии, нефть выступает как ингибитор биологической активности почвы. Изменения микробиологических параметров почвы первыми рассматриваются как значимые экологические нарушения. Они зафиксированы при концентрациях нефти более 1-5 мл/кг в зависимости от типа почвы. Предельно допустимые концентрации нефтяных загрязнений в почвах зависят от вида нефтепродуктов (НП) и составляет для почвы 0,1 мг/кг. Однако ПДК суммарного содержания нефтепродуктов в почве не стандартизовано; установлены ПДК для некоторых видов нефтепродуктов: бензол – 0,3 мг/кг, толуол – 0,3 мг/кг, ксилол – 0,3 мг/кг. В обзоре МакДжила (McGill, 1977) приводятся данные исследователей из разных стран по установлению безопасных пределов содержания нефти и НП в почвах. Эти оценки существенно расходятся по причине резко различных климатических и почвенных условий тех районов, где проводились эксперименты. При нефтяном загрязнении взаимодействуют три группы экологических факторов, которые приходится учитывать при оценке последствий загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами: 1) сложность, поликомпонентность состава нефти, находящейся в процессе постоянного изменения, наличие в ее составе токсичных веществ; 2) сложность, гетерогенность состава и структуры самой почвенной экосистемы, находящейся в процессе эволюционного развития; 3) многообразие и изменчивость внешних факторов (температуры, влажности, состояния атмосферы, количества осадков). Уровень допустимой концентрации нефти и нефтепродуктов в почве не может быть единым для всех типов почв и природных зон. Он зависит от факторов, определяющих влияние вещества на свойства почв, от потенциала самоочищения почв от данного вида загрязнения. Главные из таких факторов – химический состав загрязняющего вещества, свойства и состав почв, физико-географические (главным образом, климатические) условия данной территории. По химическому составу нефть и нефтепродукты представляют собой сложную многокомпонентную систему, состоящую из углеводородных и неуглеводородных компонентов, которые обладают различной способностью к окислению и разложению, по-разному воздействуют на почвы и живые организмы. Нефть и продукты его переработки представляют с собой чрезвычайно сложную, непостоянную и разнообразную смесь углеводородов различного строения и высокомолекулярных смолисто-асфальтеновых веществ. Соотношение их и соответственно нефтепродуктов варьирует в нефти различных видов из разных пластов и залежей. 23 Ароматические углеводороды – наиболее токсичные компоненты нефти. В концентрации всего 1% в воде они убивают все водные растения; нефть, содержащая 38% ароматических углеводородов, значительно угнетает рост высших растений. С увеличением ароматичности нефти увеличивается ее гербицидная активность. Содержание ароматических углеводородов в нефти изменяется от 5 до 55%, чаще всего от 20 до 40%. Основную массу ароматических структур составляют моноядерные углеводороды – гомологи бензола. Полициклические ароматические углеводороды, т. е. углеводороды, состоящие из двух и более ароматических колец, содержатся в нефти в количестве от 1 до 4%. Бензол и его гомологи оказывают более быстрое токсическое действие на организм, чем полициклические ароматические углеводороды. Последние действуют медленнее, но более длительное время, являясь хроническими токсикантами. Ароматические углеводороды трудно поддаются разрушению. Обычно они окисляются микроорганизмами. В качестве примесей в нефти содержатся соединения азота, серы, кислорода (NSO-соединения), вода, соли и микроэлементы, включая тяжелые металлы (Pb, Hg, Cd, V, Ni, Fe). В сернистой нефти часто обнаруживают сероводород, меркаптаны, сульфиды, дисульфиды, тиофены, тиофаны и свободную серу. Сернистые соединения оказывают вредное влияние на живые организмы. Особенно сильным токсическим действием обладают сероводород и меркаптаны. 1.2.1 Методики анализа суммарного содержания углеводородов нефти в объектах окружающей среды Определение нефтепродуктов в объектах окружающей среды является достаточно сложным процессом, так как последние представляют собой не одно определенное вещество, а сложную смесь множества разных соединений, к тому же не имеющую постоянного состава. Анализ природных объектов на наличие в них нефтепродуктов зачастую предполагает определение в них суммарного содержания углеводородов нефти. Нефтепродукты не одно определенное вещество, а сложная смесь множества разных соединений, к тому же не имеющая постоянного состава. В связи с этим определение нефтепродуктов в объектах окружающей среды, должно обеспечивать получение суммарного аналитического сигнала, соответствующего большей группе веществ, перекрывающий весь мыслимый спектр по летучести, полярности и специфическим химическим свойствам. Под определение "нефтепродукты" попадают не только нефть и продукты ее первичной переработки, но и продукты нефтехимических производств. В 1968 г. рабочая группа экспертов стран СЭВ по унификации методов анализа природных и сточных вод в практических целях приняла решение считать нефтепродуктами лишь составную часть сырой нефти и продуктов ее переработки, которая представляет собой неполярные и малополярные соединения, растворимые в гексане или четыреххлористом углероде. Это понятие включает алифатические, циклические и ароматические углеводороды, которые по сумме составляют 7024 90% нефти и нефтепродуктов [24, 25]. Введение данного определения упростило задачу проведения химико-аналитического контроля нефтяного загрязнения объектов окружающей среды, поскольку появилась возможность применять интегральные методы. Методы анализа нефти и нефтепродуктов в объектах окружающей среды можно разделить на фотоколориметрические, хроматографические, оптические, спектральные, рентгеноспектральные, масс-спектрометрические, спектроскопические методы ядерного и электронного парамагнитного резонансов, комбинированные и специальные химические, основанные на косвенном определении углеводородов, после их перевода в СО2, включающие титриметрию, фотометрию, потенциометрию, кулонометрию, кондуктометрию и др. Основным и важным этапом большинства этих аналитических методик является пробоподготовка, которая включает несколько методических приемов, таких как отделение мешающих определению веществ, экстрагирование анализируемого компонента из пробы, концентрирование, перевод в удобную форму для проведения количественного определения. Поэтому данный этап является самым трудоемким, что сказывается на общей продолжительности анализа. Однако корректное проведение пробоподготовки необходимо для получения достоверных результатов определений, но на сегодняшний день химики-аналитики при разработке новых методик стремятся к сокращению указанных стадий для сокращения времени анализа. 1.2.2 Отбор проб Принимая во внимание многообразие методик, также различаю методы отбора проб для анализа нефтепродуктов различных объектов окружающей среды - достоверность определения нефтяных загрязнений во многом зависит от способа пробоотбора. Отбор проб в каждом случае строго индивидуален и определяется целями, задачами и характером исследования, однако общие требования к отбору проб определенных объектов нормированы законодательством. Основная цель любого пробоотбора – получить представительную порцию образца. Для обеспечения получения надежных результатов необходима стратегия пробоотбора, включающая в себя детальный план. Для разработки эффективной стратегии пробоотбора в экологическом анализе необходимо иметь ответы на большое число вопросов. Начинать пробоотбор можно только после того, как на все поставленные вопросы получены ответы. Вода Методология отбора проб для определения нефтяных загрязнений в водной среде описана в работах [26-28]. Наиболее распространенным методом пробоотбора является отбор проб воды в герметичную емкость. Одним из основных и общих требований к отбору проб воды является отсутствие воздуха в наполняемой емкости во избежание протекания возможных процессов окисления. 25 Однако схемы отбора проб воды могут существенно различаться в зависимости от определяемого загрязнителя, а также от типа водного источника (питьевая, сточная, грунтовая и т.д.). Согласно методике пробоотбора могут потребоваться специальные условия: - использование специальных инертных резервуаров; - добавка определенных реагентов для консервирования; - определенная температура хранения; - ограниченное время хранения; - другие специальные требования. Несоблюдение условий, указанных в методике, может значительно повлиять на точность выполняемого определения. В этом плане для отбора водных образцов, загрязненных нефтепродуктами, удобны патроны или колонки с сорбентами, которые пригодны для концентрирования микропримесей из больших объемов воды, что обеспечивает улучшение метрологических характеристик анализа. Почва Отбор проб почв является также важным этапом, который влияет на контроль общего и локального загрязнения почвы в районах воздействия промышленных, сельскохозяйственных, хозяйственно-бытовых и транспортных источников загрязнения [29, 30]. Отбор проб почвы осуществляется, как правило, в специальные контейнеры, либо в пакеты. В зависимости от определяемых веществ, а также типа почвы могут предъявляться дополнительные требования к пробопотбору: 1) специальный материал контейнера для отбора; 2) температура хранения; 3) дополнительная обработка образца реагентом; При анализе загрязнения почвы легколетучими или химически нестойкими веществами точечные пробы отбирают по всей глубине почвенного профиля и помещают в стеклянные емкости, закрывающиеся герметично крышками. Однако процесс пробоотбора почв загрязненных нефтяными углеводородами отличается от других объектов. Для определения уровня загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами, целесообразно начинать с изучения морфологии почвенного профиля и определения количественного содержания загрязнителей в почвенных образцах [31]. 1.2.3 Подготовка проб к анализу Подготовка проб к анализу следует за пробоотбором и предшествует непосредственно определению. В связи с бурным развитием и совершенствованием приборной базы в настоящее время в анализе объектов окружающей среды одной из наиболее важных и трудоемких стадий является 26 пробоподготовка. Наибольшая часть ошибки всего анализа в основном приходится именно на подготовку проб. К основным требованиям пробоподготовки относится минимизация потерь определяемых веществ, времени и материальных затрат, а также увеличение чувствительности и селективности определения. Перечисленные факторы также зависят друг от друга. Например, сокращением числа стадий можно уменьшить потери определяемого вещества, однако это может привести к потере чувствительности и селективности метода. Как правило, пробоподготовка включает в себя следующие стадии: - извлечение; - очистка; - дериватизация; - концентрирование. Однако данная классификация является условной, поскольку в зависимости от конкретной методики, последовательность этих стадии может меняться, повторяться, быть интегрирована одна в другую или вообще отсутствовать. В мировой аналитической практике используются следующие виды извлечения загрязнителей из твердой матрицы: - перемешивание с растворителем на встряхивателе; - экстракция в аппарате Сокслета; - экстракция суперкритическим флюидом; - экстракция в ультразвуковом поле; - термодесорбция. Все перечисленные методы извлечения нашли свое применение, однако наиболее распространенными вследствие своей доступности являются первые два. Когда твердый, либо жидкий образец не может быть проанализирован напрямую проводится стадия извлечения. Так для извлечения нефтепродуктов из жидкой или твердой матрицы применяется экстракция органическим растворителем, избирательное растворение, хроматодистилляция и сорбционные методы. Для жидкостной экстракции и концентрирования углеводородов нефти и нефтепродуктов в качестве экстрагентов наиболее часто применяются такие вещества, как хлороформ, четыреххлористый углерод, тетрахлорметан, фреон, петролейный эфир, ацетон, гексан. Затем для отделения от полярных соединений практически во всех известных методиках полученный экстракт пропускают через колонку с окисью алюминия. Далее для количественного определения нефтепродуктов применяют различные методы, такие как гравиметрия, ИК- и УФ-спектроскопия, флуориметрия, хроматография. Неотъемлемой частью пробоподготовки большинства методик анализа нефтепродуктов является концентрирование, при которой широко применяются различные типы экстракции. Однако сочетание концентрирования и количественного определения, являющихся частями единого аналитического цикла является весьма рациональным. Тем не менее, еще более перспективным 27 является разработка методов анализа нефтепродуктов, исключающих стадию пробоподготовки, которые преобладали бы экспрессностью, но также не уступали бы по точности. 1.2.4. Основные методы анализа нефтепродуктов Определение нефти и нефтепродуктов в воде можно осуществлять дифференциальными (газовая, газожидкостная и высокоэффективная жидкостная хроматография, хромато-масспектрометрия) или интегральными (гравиметрия, УФ- и ИК-спектрофотометрия, люминесценция) методами, причем интегральные методы проще и удобнее для проведения наблюдений за состоянием нефтяного загрязнения водоемов и в основном применяются в рутинном анализе. Однако ни один из перечисленных методов не позволяет получить полную картину качественного состава НП, присутствующих в природных водах. Для исчерпывающей оценки нефтяного загрязнения необходимо применять группу методов. Вместе с тем для практических целей часто бывает вполне достаточно применение какого-либо одного интегрального метода, например ИК-спектрофотометрического или гравиметрического [11]. В настоящее время область аналитического контроля загрязнений объектов окружающей среды нефтепродуктами может быть отнесена к достаточно хорошо обеспеченному в методическом плане разделу аналитической химии. 1.2.4.1 Гравиметрический метод анализа нефтепродуктов Гравиметрический метод основан на экстракции нефтепродуктов из матрицы органическим растворителем, отгонке растворителя небольшим объемом, пропускании экстракта через колонку с сорбентом для отделения полярных соединений, упаривании элюата досуха и взвешивании остатка. Гравиметрический метод является стандартным методом [32] Международного комитета по стандартизации [33] и включен во многие руководства по анализу вод [33, 34]. Метод применяют преимущественно при анализе почв [35, 36]. При анализе водных образцов несовершенство данного метода - это невысокая точность и низкий предел обнаружения (от 0,3-0,5 мг/л). Помимо этого метод требует больших объемов проб воды (3-5 дм3), расходует много реактивов и времени а также в результате потери летучих компонентов увеличивается погрешность. Хотя гравиметрический метод предназначен для сильно загрязненных образцов, содержащих нефтепродукты, несомненным достоинством данного метода является то, что не требуется предварительная градуировка средств измерений. Поэтому метод принят в качестве арбитражного. 1.2.4.2 Спектральные методы анализа нефтепродуктов Метод инфракрасной спектрофотометрии Для анализа нефтей и нефтепродуктов, среди методов исследования, большая роль принадлежит методу ИК спектроскопии [37], т.к. ИКспектроскопия - один из наиболее информативных и чувствительных методов 28 анализа сложных смесей органических соединений, какими являются нефть и ее фракции. Метод инфракрасной спектрофотометрии основан на получении спектров поглощения экстракта нефтепродуктов в области 4000-600 см-1. Методика анализа включает операции экстракции нефтепродуктов из воды четыреххлористым углеводородом [38-42], или хладоном [45,46], предварительного разделения путем пропускания экстракта через колонку с окисью алюминия [38-42] или флорисилом [43] и при необходимости, осушении экстракта безводным сульфатом натрия. Превосходство данного метода в том, что он более чувствителен по сравнению с весовым методом (предел обнаружения до 0,01 мг/л), возможность определения летучих составляющих нефтепродуктов и использования для градуировки стандартных смесей (гексан, изооктан, бензол) [44, 45]. Однако несмотря на ряд достоинств, ИК-метод определения нефтепродуктов имеет недостатки, такие как трудоемкость, большие затраты времени, неэкологичность, обусловленная применением высокотоксичных растворителей. Метод флуоресцентной спектрометрии Метод основан на измерении интенсивности флуоресценции экстракта, возникающей в результате оптического возбуждения. Метод флуориметрического анализа нефтепродуктов заключается в экстракции нефтепродуктов гексаном и очистке. Следует учитывать что при анализе нефтепродуктов, в формировании аналитического сигнала участвуют только ароматические углеводороды [46]. Так как ароматические углеводороды обладают различными условиями возбуждения и регистрации флуоресценции, наблюдается изменение спектра флуоресценции пробы в зависимости от длины волны возбуждающего света. При возбуждении в ближней ультрафиолетовой и видимой областях спектра наблюдается очень сильная зависимость аналитического сигнала от типа нефтепродукта [47], что делает непригодным использования флуориметрического метода для массовых аналитических измерений. Поэтому в большинстве случаев для этой цели выбирают возб. = 310 нм, а градуировку проводят по хризену, флуоресценция которого возбуждается при той же длине волны, как и у многих флуоресцирующих веществ, содержащихся в сырой нефти и продуктах ее переработки [48-50]. Методики анализа нефтепродуктов флуориметрическим методом описаны в нормативных документах [51, 52]. Метод отличается экспрессностью, высокой чувствительностью (0,0005 мг/дм3), малыми объемами анализируемой пробы. Как отмечено в работе [53] в настоящее время методы количественного определения нефтяных компонентов в почвах разработаны недостаточно. Не существует универсального метода, удовлетворяющего требованиям доступности, безопасности, экспрессности и т.д. Образцы сравнения для определения НП в почвах отсутствуют. В работе [54] для извлечения НП из почвы навеску пробы 0,5–5,0 г (использование навесок выше 5,0 г нежелательно из-за затруднения экстракции НП) помещают 29 в коническую колбу и добавляют 10 см3 гексана, встряхивают на механическом встряхивателе в течение 10–15 мин (при комнатной температуре извлекается 95–97% НП). Полученный экстракт фильтруют через фильтр ―белая лента‖ в мерную колбу на 25 см3. Экстракцию повторяют еще 2 раза порциями гексана 10 и 5 см3. Раствор в мерной колбе доводят гексаном до метки, перемешивают и фотометрируют при 200, 225 и 250 нм. Этот экспрессный и чувствительный спектрофотометрический метод позволяет определять разнообразные НП и их смеси в почвах после экстракционного извлечения гексаном. Относительные стандартные отклонения составляют 10%, 8% и 5% при содержании НП 70, 300 и 600 мг/кг соответственно. 1.2.4.3 Хроматографические методы анализа нефтепродуктов Для анализа нефти и нефтепродуктов наиболее эффективными являются хроматографические методы с различным детектированием: газовая хроматография (ГХ), газожидкостная хроматография (ГЖХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ) и другие. Большие возможности хроматографии способствовали быстрому распространению и активному практическому применению этого метода для анализа таких сложных объектов, как нефть и продукты нефтепереработки. Данный метод с высокой степенью точности позволяет не только определять суммарное содержание этих приоритетных загрязнителей, но и идентифицировать индивидуальные органические загрязнители в сложных смесях углеводородов нефтяного происхождения, которые являются экологически наиболее опасными. Газовая хроматография Метод газовой хроматографии основан на различном распределении молекул разделяемых компонентов между движущейся газовой фазой и неподвижной фазой. С использованием метода газовой хроматографии разработаны стандартные методики определения суммарного содержания нефтепродуктов в воде [55], а также их идентификации посредством сравнения полученных хроматограмм с хроматограммами нефтепродуктов различных типов [56] (метод "отпечатков пальцев"). Идентификация углеводородов методом "отпечатков пальцев" позволяет сделать вывод о загрязнении объекта конкретным видом нефтепродукта, что приводит к упрощению процедуры установления источника загрязнения. Метод [57] основан на разделении углеводородов нефти на неполярной фазе в режиме программирования температуры. Нефтепродукты экстрагируют из пробы органическими растворителями, экстракт очищают оксидом алюминия и анализируют. Аналитическим сигналом является суммарная площадь пиков на хроматограмме, начиная с пика н-декана и кончая пиком н30 тетраконтана. Нижняя граница диапазона 0,1 мг/дм3, градуировка проводится с использованием смеси дизельного топлива и смазочного масла. Стандартный метод определения суммы неполярных и малополярных углеводородов [55] в питьевой, природных, сточных водах с концентрацией нефтепродуктов не менее 0,02 мг/дм3 основан на экстракционном извлечении нефтепродуктов из пробы воды экстрагентом, очистке экстракта от полярных соединений сорбентом, анализе полученного элюата на газовом хроматографе, суммировании площадей хроматографических пиков углеводородов в диапазоне времен удерживания равным и (или) более н-октана (С8Н18) и расчете содержания нефтепродуктов в воде по установленной градуировочной зависимости. Метод пригоден для анализа нефтепродуктов на уровне ПДК. Газохроматографический метод идентификации и определения нефтепродуктов в природных и сточных водах позволяет установить углеводородный состав и суммарное содержание нефтепродуктов, а также содержание в пробе воды отдельных нефтяных фракций и дает возможность с высокой точностью установить тип нефтепродукта [58, 59]. Газожидкостная хроматография Газожидкостная хроматография основана на хроматографическом разделении углеводородов экстракта нефтепродуктов на неполярной жидкой неподвижной фазе в режиме программирования температуры. Расчет фракционного состава выполняется на основании линейной зависимости между временем удерживания углеводородов и температурой их кипения [60-64]. Чувствительность метода в значительной мере зависит от типа используемого прибора и колонок (набивных или капиллярных) и колеблятся в широких пределах (0,1-1,6 мг/л). Переход от набивных колонок к капиллярным позволяет получить большое количество (до сотен) хорошо разрешенных пиков. В основном алифатических углеводородов с прямой цепью и, частично, разветвленных углеводородов. Для анализа суммарного содержания нефтепродуктов применение метода газожидкостной хроматографии не всегда оказывается оправданным, но его целесообразно использовать при установлении качественного состава нефтепродуктов и источника загрязнения [65-67]. Несовершенством метода является жесткое воздействие на пробу в ходе анализа. Высокие температуры, при которых ведется газохроматографический анализ, могут вызвать различного рода процессы хемосорбции, а также химические реакции (разложения, конденсации, полимеризации, циклизации и др.), существенно изменяющие не только количественный, но и качественный состав анализируемых компонентов, что неизбежно повлечет за собой и искажение результатов идентификации [68, 69]. Тонкослойная хроматография Тонкослойная хроматография в основном используется при идентификации тяжелых смазочных масел, моторных масел, топлив смазок, угольных остатков, входящих в состав сырой нефти и продуктов его 31 переработки, а также при анализе сбросов очистных сооружений, нефтеперерабатывающих предприятий. Метод основан на разделении компонентов смеси на отдельные зоны на пластинке с сорбентом в процессе движения по ней органического растворителя. Визуализацию и количественный обсчет пятен проводят, облучая пластинку УФ-светом. В аппаратном отношении тонкослойная хроматография (ТСХ) намного проще колоночной хроматографии. Для проведения анализа методом ТСХ не требуется ни насоса, ни приточного детектора, поскольку элюация совершается за счет движения жидкости в капиллярах, а хроматографические зоны легко обнаружить путем непосредственного прокрашивания тонкого слоя проявляющими реагентами [70-72]. Для экспрессной хроматографической идентификации и улучшения метрологических характеристик метода ТСХ, авторы [73,74] разработали так называемую «проточную тонкослойную хроматографию» (ПТСХ) с непрерывным фотометрированием. В классическом ТСХ разделение завершается когда растворитель достигает края пластинки, в ПТСХ растворитель движется через пластинку непрерывно и с постоянной скоростью. Детектирование компонентов смеси осуществляется непосредственно в слое сорбента в процессе разделения. С помощью ПТСХ можно не только определить содержание нефтепродуктов, но и определить их тип по сопоставлению относительных интенсивностей флуоресценции и поглощения. Метод является своеобразным сочетанием колоночной и тонкослойной хроматографии. 1.2.4.4 Прочие методы анализа нефтепродуктов Ядерный магнитный и электронный парамагнитный резонанс В связи с тем, что в составе нефти насчитывается более 1000 индивидуальных соединений идентификация хроматографических пиков представляет очень трудную задачу. Поэтому разработаны комплекс-тандемы, состоящие из универсального высокоэффективного хроматографа и детектора в виде масс-спектрометра или ЯМР-спектрометра высокого разрешения [55, 75]. Когда требуются высокая чувствительность и высокая селективность, использование масс-спектрометра в качестве детектора для хроматографии при анализе смеси нефтепродуктов наиболее эффективно. Сочетание хроматографии с ЯМР устранило недостатки обоих методов – относительно низкую чувствительность метода ЯМР и трудности идентификации природы отдельных компонентов в классической хроматографии. Внедрение такого метода в широкую практику имеет значительные трудности, обусловленными сложностью и высокой стоимостью аппаратуры, высокими требованиями к квалификации обслуживающего и научного персонала. Существует метод применения атомно-эмиссионной спектроскопии (АЭМС) с индукционной плазмой (ИНП) и масс-спектрометрии (МС) с ИНП для непосредственного анализа летучих углеводородов и нефтепродуктов [76]. 32 Для экспресс-анализа нефтяных загрязнений в целях выявления их происхождения существует метод ЭПР. Метод может быть использован как оперативный простейший тест для определения происхождения нефти и как источник нефтяного месторождения ко всей гамме нефтепродуктов: от легких дистиллятов до тяжелых смазочных масел и остатков перегонки. Установлено, что легкие фракции не дают сигнала ЭПР; в этом случае наиболее результативным является метод ЯМР. Регистрируемые спектры ЭПР в варианте нефть+почва близки к спектру исходной нефти. Отношение их интенсивностей отличалось от исходного значительно меньше, чем в варианте экстракции из почвенных смесей, однако наблюдались некоторые изменения. Отсюда следует, что задача идентификации нефтяных загрязнений воды, требует проведения серьезной работы по выбору и изучению относительной информативности различных параметров спектров ЭПР [77,78]. Итак, для определения нефтепродуктов в объектах окружающей среды различной научно-технической и нормативно-аналитической документацией рекомендованы гравиметрический, ИК-спектроскопический, флуориметрический и газо-хроматографический методы анализы, которые в достаточной степени обеспечены в методическом, метрологическом и аппаратурном плане. Наиболее широко применяют для определения обобщенного показателя ―нефтепродукты‖ гравиметрию и ИК-спектроскопию. Эти методы недостаточно чувствительны и проблемны для определения НП на уровне и ниже ПДК. Масштабы применения ИК-спектроскопии будут существенно ограничены из-за запрета во всем мире производства CCl4. Высокочувствительный флуориметрический метод, в котором аналитический сигнал определяют только ароматические углеводороды (но не насыщенные УВ, составляющие основную часть НП), не может быть использован для массового экологического контроля. Можно утверждать, что в контроле загрязнений ООС нефтепродуктами наиболее востребованным и эффективным будет метод капиллярной газовой хроматографии с пламенно-ионизационным или масс-спектральным детекторами, который позволяет не только достигать необходимой чувствительности, но и определять широкий спектр индивидуальных компонентов НП. В большинстве случаев это необходимое и достаточное условие для решения сложных задач идентификации нефтяных загрязнений. 1.2.5 Методы очистки вод и почв, загрязненных нефтью Загрязнение почв и воды нефтью и нефтепродуктами - одна из сложных и многоплановых проблем экологии и охраны окружающей среды. В настоящее время успешно развиваются технологии биоремедиации нефтезагрязненных территорий. При этом решение проблемы достигается за счет стимуляции микробных ценозов путем внесения удобрений, микроорганизмов, которые способны наиболее эффективно утилизировать данный загрязнитель или путем внесения различных биопрепаратов. 33 Единственным реальным в настоящее время способом борьбы с последствиями разлива нефти и нефтепродуктов является комплекс работ, включающий механическое или физико-химическое удаление разлитых нефтепродуктов с последующей очисткой остающейся в почве нефти биологическими методами при помощи биодеструкции нефтеокисляющими микроорганизмами. В то же время существующие в настоящее время препараты оказываются недостаточно эффективными в различных экстремальных почвенноклиматических условиях различных регионов, в связи с чем для ликвидации масштабных последствий разливов нефти в настоящее время необходим активный поиск и выделение аборигенных штаммов и разработка новых препаратов. Проблема нефтяного загрязнения почв и воды в настоящее время в нашей стране практически не решается. Работы по очистке нефтяных загрязнений с использованием микроорганизмов не координируются, их научный и технологический уровень невысокий. Таким образом, проблема загрязнения нефтью и нефтепродуктами почв и воды стоит в настоящее время как никогда остро и для поиска путей разрешения всех ее аспектов необходима координируемая концентрация усилий всех заинтересованных правительственных, научных и производственных организаций. Методы очистки сточных вод можно разделить на механические, физикохимические и биохимические. В процессе очистки сточных вод образуются осадки, которые подвергаются обезвреживанию, обеззараживанию, обезвоживанию, сушке, возможна последующая утилизация отходов. Если по условиям сброса сточных вод в водоем требуется более высокая степень очистки, то после сооружений полной биологической очистки сточных вод устраивают сооружения глубокой очистки. В соответствии с «Правилами охраны поверхностных вод от загрязнения сточными водами» сточные воды после очистки перед сбросом в водоем подвергают обеззараживанию с целью уничтожения патогенных микроорганизмов. Сооружения механической очистки сточных вод предназначены для задержания нерастворенных примесей. К ним относятся решетки, сита, песколовки, отстойники и фильтры различных конструкций. Для очистки производственных сточных вод, содержащих специфические загрязнения, применяют сооружения, называемые жироловками, нефтеловушками, масло- и смолоуловителями и др. Сооружения механической очистки сточных вод являются предварительной стадией перед биологической очисткой. При механической очистке городских сточных вод удается задержать до 60% нерастворенных загрязнений. Физико-химические методы очистки городских сточных вод с учетом технико-экономических показателей используют весьма редко. Эти методы в основном применяют для очистки производственных сточных вод. К методам физико-химической очистки производственных сточных вод относятся: 34 реагентная очистка, сорбция, экстракция, эвапорация, дегазация, ионный обмен, озонирование, электрофлотация, хлорирование, электродиализ и др. Биологические методы очистки сточных вод основаны на жизнедеятельности микроорганизмов, которые минерализуют растворенные органические соединения, являющиеся для микроорганизмов источниками питания. Сооружения биологической очистки условно могут быть разделены на два вида. К первому виду относятся сооружения, в которых процесс биологической очистки протекает в условиях, близких к естественным (поля фильтрации и биологические пруды). В сооружениях второго вида аналогичная очистка осуществляется в искусственно созданных условиях-в аэротенках и биофильтрах. Глубокая очистка сточных вод может потребоваться, если в сточной воде после полной биологической очистки перед сбросом в водоем необходимо снизить концентрацию взвешенных веществ. Для глубокой очистки от растворенных органических веществ применяют сорбционные, биосорбционные, озонаторные и другие установки. Глубокая очистка точных вод от соединений азота и фосфора может осуществляться физикохимическими и биологическими методами. Дезинфекция сточных вод является заключительным этапом их обработки перед сбросом в водоем. Цель дезинфекции-уничтожение патогенных микроорганизмов, содержащихся в сточной воде. Наибольшее распространение получил способ дезинфекции путем введения в воду газообразного хлора. Возможно обеззараживание сточных вод озоном, используются бактерицидные ультрафиолетовые лампы [79]. Рекультивация земель – это комплекс мероприятий, направленных на восстановление продуктивности и хозяйственной ценности нарушенных и загрязненных земель. Задача рекультивации – снизить содержание нефтепродуктов и находящихся с ними других токсичных веществ до безопасного уровня, восстановить продуктивность земель, утерянную в результате загрязнения. В настоящее время разработан ряд методов ликвидации нефтяных загрязнений почвы, включающих механические, физико-химические, биологические методы (таблица1). Таблица 1 - Методы ликвидации нефтяных загрязнений почвы Методы Механические Способы ликвидации Обвалка загрязнения, откачка нефти в ѐмкости Замена почвы Особенности применения Первичные мероприятия при крупных разливах при наличии соответствующей техники и резервуаров (проблема очистки почвы при просачивании нефти в грунт не решается) Вывоз почвы на свалку для естественного разложения 35 Физикохимические Сжигание Предотвращение возгорания Промывка почвы Дренирование почвы Экстракция растворителями Сорбция Термическая десорбция Экстренная мера при угрозе прорыва нефти в водные источники. В зависимости от типа нефти и нефтепродукта уничтожается от 50 до 70% разлива, остальная часть просачивается в почву. Из-за недостаточно высокой температуры в атмосферу попадают продукты возгонки и неполного окисления нефти; землю после сжигания необходимо вывозить на свалку При разливе легковоспламеняющихся продуктов в цехах, жилых кварталах, на автомагистралях, где возгорание опаснее загрязнения почвы; изолируют разлив сверху противопожарными пенами или засыпают сорбентами Проводится в промывных барабанах с применением ПАВ, промывные воды отстаиваются в гидроизолированных прудах или ѐмкостях, где впоследствии проводятся их разделение и очистка Разновидность промывки почвы на месте с помощью дренажных систем; может сочетаться с использованием нефтеразлагающих бактерий Обычно проводится в промывных барабанах летучими растворителями с последующей отгонкой их остатков паром Разливы на сравнительно твѐрдой поверхности (асфальт, бетон, утрамбованный грунт) засыпают сорбентами для поглощения нефтепродукта и снижения пожароопасности при разливе легковоспламеняющихся продуктов Проводится редко при наличии соответствующего оборудования, позволяет получать полезные продукты вплоть до мазутных фракций 36 Биологические Биоремедиация Фиторемедиация Применяют нефтеразрушающие микроорганизмы. Необходима запашка культуры в почву. Периодические подкормки растворами удобрений, ограничение по глубине обработки, температуре почвы (выше 15ºС), процесс занимает 2-3 сезона Устранение остатков нефти путѐм высева нефтестойких трав (клевер ползучий, щавель, осока и др.), активизирующих почвенную микрофлору, является окончательной стадией рекультивации загрязнѐнных почв При ликвидации последствий аварий на трубопроводах часто используются приемы, которые еще больше усугубляют экологическую ситуацию. В настоящее время основным способом ликвидации нефтяных разливов на местности является их механический сбор, в ряде случаев с использованием сорбентов, с последующим выжиганием или захоронением остатков путем отсыпки песком или торфом. При этом местность загрязняется токсичными и канцерогенными продуктами горения. Выжигание (особенно на поверхности почвы) является наиболее опасной формой ликвидации загрязнения окружающей среды, поскольку из-за неполного сгорания нефти образуются стойкие канцерогенные вещества, которые разносятся по большой площади и, попадая в пищевые цепи растительных и животных сообществ, в конечном счете, приводят к резкому возрастанию числа онкологических заболеваний местного населения. Не менее актуальна проблема выбросов газов и пыли. Так, нефтеперерабатывающими предприятиями выбрасывается в атмосферу свыше 1050 тыс. т загрязняющих веществ, при этом доля улова на фильтрах составляет только 47,5%. Основной состав выбросов предприятий в атмосферу: 23% - углеводороды; окислы: 16,6%-серы, 7,3% -углерода, 2%азота. Непоправимый вред окружающей среде наносит факельное хозяйство НПЗ. При сжигании топлива в факельных печах образуются аэрозольные частицы – продукты конденсации углерода и канцерогенные углеводороды типа бенз(а)пирена [8]. Очистка почв и грунтов в специальных установках путем пиролиза или экстракции паром дорогостояща и малоэффективна для больших объемов грунта. Требуются большие земляные работы, в результате чего нарушается естественный ландшафт, а после термической обработки в очищенной почве могут остаться новообразованные полициклические ароматические углеводороды – источник канцерогенной опасности. Землевание замедляет процессы разложения нефтяных углеводородов, приводит к образованию внутрипочвенных потоков нефти, пластовой жидкости 37 и загрязнению грунтовых вод. Складирование загрязненной почвы создает очаги вторичного загрязнения. Существует технология очистки почв и грунтовых вод путем промывания их поверхностно-активными веществами. Этим способом можно удалить до 86% нефти и нефтепродуктов. Применять его в широких масштабах вряд ли целесообразно, так как поверхностно-активные вещества сами загрязняют среду и появится проблема их сбора и утилизации. 1.2.6 Адсорбционные методы очистки вод и почв, загрязненных нефтью Сорбционные методы относятся к наиболее эффективным для глубокой очистки сточных вод от растворенных органических веществ. Сорбционная очистка может применяться самостоятельно или совместно с другими методами предварительной и глубокой очистки сточных вод. Преимуществами этих методов являются возможность адсорбции веществ из многокомпонентных смесей и высокая эффективность при малых концентрациях загрязняющих веществ сточных вод. Сорбционные методы весьма эффективны для извлечения из сточных вод ценных растворенных веществ с их последующей утилизацией и использованием очищенных сточных вод в системе оборотного водоснабжения промышленных предприятий [80]. Адсорбция – это практически единственный метод, позволяющий очищать сточные воды от нефтепродуктов до любого требуемого уровня без внесения в воду каких-либо вторичных загрязнителей [81]. В зависимости от времени, прошедшем между аварийным нефтяным разливом и началом проведения работ по его ликвидации, осуществляется либо весь комплекс мероприятий, либо отдельные его блоки. Анализ способов очистки нефтяных загрязнений вод показывает, что качественное удаление нефтяных загрязнений не обходится без применения различных сорбентов. Но практически на всех этапах целесообразно применение нефтепоглащающих сорбентов. Разработкой нефтепоглощающих сорбентов занимаются во многих странах, но внимание специалистов все в большей степени привлекает направление с разработкой сорбентов из растительных отходов. В первую очередь это связано с экологической безвредностью, ввиду их естественного происхождения, и одновременным решением проблемы утилизации отходов сельскохозяйственного производства. Нефтепоглощающие сорбенты представляют собой высокопористые вещества, обладающие гидрофобностью и высокими сорбционными свойствами по отношению к нефти и нефтепродуктам. Способность поглощать загрязняющие вещества в количествах, превышающих по массе массу самого сорбента, обусловлена их развитой сорбционной поверхностью и большим поровым объемом. Сорбенты растительного происхождения характеризуется сорбционной поверхностью от 3 до 10 м2/г и временем насыщения сорбента до 30 мин. Как правило, они не токсичны, пожаро и взрыво- безопасны, 38 насыщенный нефтепродуктами сорбент не тонет и легко собирается с водной поверхности, в течение нескольких лет сохраняет свои свойства. Качественное удаление нефтяных загрязнителей при высоких уровнях загрязнения зачастую не обходится без применения различного рода сорбентов. Среди возможного сырья для производства сорбентов наиболее привлекательными являются естественное органическое сырье и отходы производства растительного происхождения. К такому сырью относятся торф, сапропели, отходы переработки сельскохозяйственных культур и др. На базе такого сырья разработаны, например, такие сорбенты, как «Сорбест», «РС», «Лессорб» и др. В качестве сорбентов применяют природные материалы, отходы некоторых производств, активные угли синтетические сорбенты. Природные пористые материалы, такие как торф, активные глины и производственные отходы (зола, коксовая мелочь, силикагели, алюмогели), обладают малой сорбционной емкостью, которая характеризуется количеством поглощаемого вещества на единицу объема или массы сорбента. Для производства растительных сорбентов пригодны рисовая и гречишная шелуха, уже имеются разработки, а в Тунисе их производят из отходов производств оливкового масла. Выход готового сорбента из исходного сырья составляет примерно 30-50%. Если учесть, что в Казахстане имеют место сотни тысяч тонн невостребованной пшеничной и рисовой шелухи, кукурузных початков и т.д., есть смысл подумать о производстве собственных сорбентов. На сегодня не существует единого способа полной ликвидации нефтяного загрязнения, как с водной поверхности, так и с поверхности суши. Сорбционные способы на основе химически нейтральных материалов позволяют решать проблемы устранения нефти экологически чистыми методами. Нефтепоглощающие сорбенты могут быть использованы как при очистке сточных вод, так и на всех этапах борьбы с нефтяными разливами [82]. Выпускаемые промышленностью адсорбенты должны удовлетворять определенным стандартным показателям, в числе которых прочность на истирание, сорбционная емкость и др. Так, для очистки и доочистки сточных вод от нефтепродуктов используют асбестосодержащий материал – отход производства асбестовых бумаг и картона (регенерация прокаливанием) [83]; пористый полимерный сорбент-сополимер стирола и дивинилбензола (нефтепродукты могут быть элюированы растворителем) [84], пенополиуритан, в который введены гранулы ферромагнитного материала размером 0,01-0,1 мм в количестве 0,02-0,08% для фильтрования в магнитном поле (регенерация отжимом) [85]; сорбент на основе базальтового волокна и гидрофобизатора – кремний или органические гидрофобизирующие соединения – 2-15% (регенерация – отжим или сжигание углеводородов, позволяет многократное использование) и другие материалы [86]. Чаще других сорбентов используется, однако, гранулированный активный уголь, имеющий частицы размером более 0,10 мм на 85-99%, состоящий из углерода и способный самопроизвольно отделяться от воды [87-93]. Исходным 39 сырьем для получения активного угля служат практически любые углеродсодержащие материалы: уголь, торф, древесина, и др. [94-102]. Процесс изготовления высококачественных активных углей сложен и длителен, поэтому стоимость их достаточно высока. Это приводит к необходимости многократного использования активных углей. Пористость этих углей составляет 60-70%, а удельная поверхность 400-900 м2/г. Адсорбционные свойства активных углей в значительной мере зависят от структуры пор, их величины, распределения по размерам. В зависимости от преобладающего размера пор активные угли делятся на крупно- и мелкопористые и смешанного типа. Поры по размеру подразделяют на три вида: макропоры размером 0,1-2 мкм, переходные размером 0,004-0,1 мкм, микропоры размером менее 0,004 мкм. Макропоры и переходные поры играют, как правило, роль транспортирующих каналов, а сорбционная способность активных углей определяется в основном микропористой структурой. Растворенные органические вещества, имеющие размеры частиц менее 0,001 мкм, заполняют объем микропор сорбента, полная емкость которых соответствует его поглощающей способности [80]. Для сорбирования нефти в мировой практике широко используются синтетические поглотители типа активированного угля, пенопласта, поглотителей «Ресорб», «Пламилон», гидрофобизированный вспученный перлит, гелеобразователи и различные отвердители. В США разработан препарат из структурированного сополимера полиакриламида и бутадиена (25%) , поликарбоксилметилцеллюлоза (25%) , белой сажи (10%), и полиэлектролита (5%) в растворенном виде,который эффективно связывает нефтяную жидкость в гелеобразную массу, легко сгребаемую для механического удаления. Академией Наук и Институтом нефти и газа РФ разработан реагент «Биотемпоскрин», способный преобразовать углерод нефти и нефтепродуктов в белок. Японскими учеными получен препарат, обезвоживающий сырую нефть до трудно разделимой водо-нефтяной эмульсии, которая легко удаляется путем сжигания. Кроме того, нефтяные пленки на поверхности толщиной 1 мм уничтожаются простыми поглотителями из торфа, соломы, древесных стружек, пемзой, птичьими перьями и др. [103]. Аппаратурное оформление сорбционной очистки – общепринятые в химической технологии – напорные фильтры с плотным слоем гранулированных активных углей, перед которыми расположены механические фильтры. Двухступенчатое фильтрование применяется при глубокой очистке сточных вод, содержащих эмульгированные и растворенные нефтепродукты (очистка до 0,1-2 мг/л). Пористые сорбенты имеют низкую механическую прочность. Потери сорбентов за один цикл на истирание или промывку достигают 0,1-2% учитывая это, а также стоимость сорбентов, большое значение имеет регенерация сорбентов и возможность их многократного использования [104]. 40 1.2.7 Биологические методы очистки вод и почв, загрязненных нефтью Сточные воды, содержащие 15-25 мг/л нефтепродуктов, после механической и физико-химической очистки перед сбросом в водоем направляют на биохимическую очистку, заключающуюся в окислении органических загрязнений микроорганизмами [105]. В настоящее время одной из наиболее перспективных технологий очистки нефтезагрязненных почв считается интродуцирование в почву различных комплексов микроорганизмов, отличающихся повышенной способностью к биодеструкции тех или иных углеводородных компонентов нефти и нефтепродуктов. Разработаны и активно внедряются большое количество коммерческих микробиологических препаратов иностранного и отечественного производства, таких как «Дестройл», «Путидойл», «Деворойл» и др. Однако в природных условиях биодеградация протекает под воздействием всего комплекса почвенной биоты, неотъемлемой частью которой являются и дождевые черви. В связи с этим можно было предположить, что вермикультура окажется перспективной и для интенсификации переработки нефтезагрязненных материалов. Биотехнологии, основанные на использовании различных групп микроорганизмов, находят все большее применение при добыче нефти и очистке объектов окружающей среды от нефтяного загрязнения. Важным направлением биотехнологических исследований является разработка новых технологий защиты окружающей среды от загрязнения отходами различных промышленных производств и очистка уже загрязненных территорий. Влиянию микрофлоры наиболее подвержены углеводороды легких и средних фракций. Биохимическое окисление в первую очередь затрагивает н-алканы, затем разветвленные парафины и нафтены, и наконец, ароматические углеводороды. Параллельно с исчезновением алканов в нефтях падает доля кислот нормального строения и алифатических серосодержащих компонентов [106]. На решение данной проблемы направлены значительные усилия ученых разных стран. Среди них важное место занимают биологические методы очистки загрязнений, включающие биоремедиацию и фиторемедиацию [107110], создание консорциумов штаммов микроорганизмов-деструкторов, в т.ч. иммобилизованных [106-108]. В настоящее время большим спросом пользуются так называемые «бактериальные коктейли», в широком ассортименте предлагаемые биотехнологическими компаниями Европы, США, и Японии. Но, как свидетельствует практика, применение зарубежных бактериальных препаратов оказывается малоэффективным по причине различий климатических и экологических условий. Кроме того, неконтролируемое внесение в открытые экосистемы микробных популяций, зачастую неизвестного состава, может представлять значительную опасность как для функционирования почвенных биоценозов, так и для здоровья людей, занятых в технологическом процессе. Поэтому разработка отечественных 41 биопрепаратов для очистки и восстановления природных объектов Казахстана является актуальной задачей. В настоящее время для деструкции углеводородов нефти в окружающей среде используется широкий спектр микроорганизмов, включающий в себя бактерии родов Pseudomonas, Mycobacterium, Micrococcus и др. и дрожжи Candida [114]. Большого внимания заслуживают ассоциации микроорганизмов [115]. Развиваясь в ассоциациях, микробы вступают в сложные взаимоотношения. Наиболее активные из них разлагают более сложные углеводороды. В природных условиях подавляющее большинство микроорганизмов живет, размножается и проявляет различного рода биохимическую активность в прикрепленном состоянии к минеральным частицам почвы, донных отложений озер, рек, морей, к корням или наземной части растений. Поэтому для создания оптимальных условий развития микроорганизмов-деструкторов, вносимых в загрязненную водную среду, и обеспечения их длительной жизнедеятельности в ней обычно используют предварительную иммобилизацию клеток на нерастворимых носителях [116]. В работах [117-119] представлены результаты исследований иммобилизации дрожжей и бактерий на зауглероженных носителях, полученных на основе виноградных косточек, грецких, кокосовых орехов и стружек березы и аккумуляции ими ионов цинка, никеля, кадмия, свинца, кобальта и меди. Показана эффективность использования для иммобилизации микроорганизмов углеродных носителей, способных сорбировать различные металлы, а также органические и неорганические загрязнители, уменьшать запах и цвет сточной воды. Известен ряд публикаций, касающихся разработки методов активации аборигенной микрофлоры путем улучшения аэрации загрязненной почвы, изменения водного и температурного режима; активизации аборигенной микрофлоры путем рыхления, внесения биогенных элементов в виде минеральных и органических удобрений; внесения зеленой массы различных видов растений; внесения эмульгаторов [120-125]. Основными факторами, влияющими на ход биоразрушения органических загрязнителей, являются их химическая природа (которая обусловливает возможные пути биотрансформации), концентрация и взаимодействие с другими загрязнителями (на уровне их непосредственного взаимодействия или взаимного влияния на трансформацию). К неблагоприятным физико-химическим условиям, лимитирующим деградацию микроорганизмами ксенобиотиков в окружающей среде, можно отнести низкую или чрезмерную влажность почвы, недостаточное содержание кислорода, неблагоприятную температуру и рH, низкую концентрацию или доступность ксенобиотиков, наличие альтернативных, более предпочтительных субстратов и т.д.. Среди биологических факторов отмечены поедание интродуцируемых микроорганизмов простейшими, обмен генетической информацией в популяции, физиологическое состояние и плотность 42 интродуцируемой микробной популяции. Некоторые из перечисленных проблем могут быть решены путем создания генетически сконструированных штаммов-деструкторов и их консорциумов, усовершенствования методов интродукции, оптимизации условий существования природных микробных популяций. Таким образом, интродукция микроорганизмов приводит к положительным результатам только при создании соответствующих условий для развития внесенной популяции, для чего необходимо знать физиологические особенности интродуцента, а также учитывать складывающиеся микробные взаимодействия. Способность усваивать углеводороды нефти присуща микроорганизмам, представленным различными систематическими группами. К ним относятся различные виды микромицетов, дрожжей и бактерий. Наиболее активные деструкторы нефти встречаются среди бактерий. Они характеризуются способностью к усвоению широкого спектра углеводородов, включая и ароматические, обладают высокой скоростью роста и, следовательно, представляют большой практический интерес. Углеводородокисляющая группа микроорганизмов природного происхождения таксономически очень разнообразна. Наиболее активные бактериальные штаммы относятся к родам: Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus, Acinetobacter, Flavobacterium, Corynebacterium, Xanthomonas, Alcaligenes, Nocardia, Brevibacterium, Mycobacterium, Beijerinkia, Bacillus, Enterobacteriaceae, Klebsiella, Micrococcus, Sphaerotilus. Среди актиномицетов внимание привлекает многочисленный род Streptomyces. Из дрожжей выделяют род Candida и Torulopsis. Постоянными и доминирующими компонентами естественных биоценозов нефтяных загрязнений являются родококки, их основная экологическая функция – аккумуляция газообразных н-алканов, жидких углеводородов нефти и трансформация их в биомассу. Бактерии этого рода отличаются высокой жизнестойкостью при действии неблагоприятных факторов – низкой температуры, солнечного ультрафиолета, длительного отсутствия питательных веществ. Естественная нефтеокисляющая микрофлора нефтезагрязненной тундровой почвы представлена главным образом бактериями R. Erythropolis. В связи с этим понятен интерес к родококкам – деструкторам нефти. Т. В. Коронелли с соавторами с целью выбора штамма, сохраняющего в наибольшей степени углеводородокисляющую активность при низких температурах, провели скрининг всей коллекции углеводородокисляющих бактерий (роды Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus) в среде агар-агара среде с парафином при температуре плюс 6°С. Отобранные таким образом 17 штаммов выращивали в жидкой среде с нефтью при плюс 8°С. Через 14 суток определяли концентрацию нефтяных углеводородов методом ИКспектроскопии. Оказалось, что 12 штаммов использовали от 13 до 36% внесенной нефти, два штамма – 5-6%, а три были неэффективными. Все 12 43 штаммов являлись представителями рода Rhodococcus: 11 принадлежали к виду R. Erythropolis; один – к виду R. Maris. Немалый интерес представляют спорообразующие бактерии, так как они наиболее устойчивы к различным неблагоприятным воздействиям окружающей среды. В настоящее время активно ведѐтся поиск микроорганизмов, разрушающих нефть, в особенности при низких температурах. Активные формы микроорганизмов выделяются из разнообразных водных и почвенных экосистем, особенно загрязнѐнных углеводородами или нефтью, а также из микрофлоры нефти и пластовых вод нефтяных месторождений. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородных загрязнений должен производиться с учетом ряда требований. При поиске микроорганизма-деструктора необходимо учитывать, что вносимая в почву микробная биомасса не должна быть чужеродной для почвенной микрофлоры. Еще одним важным требованием к вносимым в почву микроорганизмам является их непатогенность. В связи с тем, что технология микробиологической очистки загрязненных почв предусматривает аэробные условия, необходимо вести выбор микроорганизма-деструктора среди аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов. Микробные клетки могут подвергаться воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, следовательно микроорганизм-деструктор должен обладать высокой жизнестойкостью. Институтом Микробиологии АН России совместно с Научно – производственным предприятием «Биотехинвест» разработан микробиологический препарат «Деворойл». Препарат предназначен для биодеградации нефти и нефтепродуктов при загрязнении почв, водоемов, поверхностей акваторий, а также внутренних поверхностей танков нефтеналивных судов и прочих резервуаров. Микробиологический препарат «Деворойл» состоит из тщательно подобранного сообщества углеводородоокисляющих бактерий и дрожжей. В состав ассоциации входят вегетативные клетки непатогенных штаммов культур родов Rhodococcus, Pseudomonas и Yarovvia. Бактерии способны окислять нефтяные n – алканы длиной цепи С9 – С30 и ароматические углеводороды. Удачно подобранная ассоциация микроорганизмов дает препарату множество принципиальных преимуществ. Также для ликвидации нефтяных загрязнений почвы используется препарат «Дестройл». Коммерческий препарат, выпускаемый Бердским заводом биологических препаратов, полученный на основе выделенной из природы микробной культуры Acinetobacter sp. Обладает высоковыраженной активностью в отношении углеводородов нефти и нефтепродуктов, вызывая в них глубокие необратимые процессы деградации до остаточных продуктов, относящихся к экологически нейтральным соединениям. Скорость разрушения нефти в почвах и очищение поверхности загрязненной нефтью зависит от климата, механического состава, обеспеченности гумусом, элементами минерального питания, стимулирующих 44 жизнедеятельность углеродокисляющих микроорганизмов. Состав микрофлоры бурых пустынных почв районов нефтегазовых месторождений формируют, в основном, грибы рода пенициллиум, аспергиллус, а также темноцветые. Летом в сильно иссушенной почве доминирует малотребовательные в влаге актиномицеты, весной и осенью-бактерии [126]. В засушливых условиях пустыни самоочищение нефтезагрязненных почв протекает медленно, что связано с их низким естественным плодородием и засолением. Применение на промыслах механического способа очистки нефтезагрязненной поверхности путем сгребания бульдозером замазученной массы и вывоза на полигон – мероприятие мало эффективное, ведет к полному уничтожению почвенного покрова- основы функционирования биоценоза. Необходимо внедрение на предприятиях нефтедобычи более перспективных агрофитомелиоративных, микробиологических и других методов реабилитации почв на фоне полива и использования качественных сорбентов нефти. Как было отмечено выше, в загрязненных нефтепродуктами почвах создаются крайне неблагоприятные эдафические условия для жизнедеятельности почвенных микроорганизмов, нарушается режим их азотного и фосфорного питания, интенсивность окислительно-восстановительных и ферментативных процессов [127,128]. В местах аварийного сжигания нефти и газа генетические горизонты почвы обугливаются и становятся биологически безжизненными. Исследованиями установлено, что в естественных условиях нефть в профиле почв трансформируется очень медленно. Просачиваясь вглубь по профилю нефтепродукты дифференцируются в зависимости от физикохимических свойств: в верхних горизонтах аккумулируются в основном высокомолекулярные смолисто-асфальтеновые вещества и циклические углеводороды, в более глубокие горизонты просачивается растворимые в воде низкомолекулярные элементы. Деградация и поглощение углеводородов в профиле почвы осуществляется в основном углеродокисляющими микроорганизмами, которые разлагают нефть дао конечных продуктов метаболизма – СО2 и Н2. При этом выделяемая углекислота связывается в карбонатах и воде, кислородсодержащие соединения (спирты, кислоты, альдегиды, кетоны и др.) частично растворяются и удаляются из профиля почвы, в остатках образуются твердые корочки высокомолекулярных компонентов нефти. Высокие летние температуры и ультрафиолетовая радиация нефтегазовых регионов, при создании оптимальных условий увлажнения и аэрации, будут способствовать интенсивному биологическому разложению нефтепродуктов в почвах до полного их окисления и минерализации. В связи с этим микробиологическая мелиорация загрязненных нефтью почв основывается на принципе активизации адаптированных к условиям среды местных видов микроорганизмов путем внесения в почву питательных веществ, выделение из почв новых штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов и их интродукция. Разнообразие ферментативных систем, быстрая адаптация к изменяющимся условиям среды делают микроорганизмы способными 45 возвращать в биологические циклы в безвредной форме продукты углеводородной трансформации, что определяет их ведущую роль в процессах очищения нефтезагрязненных почв. Мировой опыт также свидетельствует об эффективности микробной очистки нефтезагрязненных почв. Известные фирмы «Оксидентал кемикл» (США), «Бейстритент» (Англия), «Биодетокс» (ФРГ) и другие успешно используют приемы микробной технологии очистки нефтезагрязненных почв. Созданы новые биопрепараты «Путидоил», «Биодеструктор», «Noggies», «Hydrobak» и другие, предназначенные для очистки нефти в различных природных условиях. Большое значение имеет выделение новых местных штаммов микробных культур с высокой метаболической активностью, способных утилизировать нефтяные углеводороды в условиях Мангышлак-Прикаспийского региона, создавать благоприятные условия для их жизнедеятельности путем обильного удобрения, оптимального увлажнения и аэрации. Микробиологами Казахстана в настоящее время изучен, выделен и рекомендован для практического использования ряд новых штаммов микроорганизмов-деструкторов углеводородного сырья, способные утилизировать сырую нефть на 84-98%, бензин и дизельное топливо [129]. Созданный микробиологический препарат «Мунайбак» для очистки загрязненной почвы и воды утилизирует нефтепродукты на 32-36% [130]. Как показали, исследования Института МОН НАН РК выделенные ими новые штаммы микроорганизмов-деструкторов нефти устойчиво проявляют способность к утилизации углеводородов, особенно в период от одного до семи суток. При этом в нефтях присходит рост кислородсодержащих структур как эфирного, так и кислотного типов, что свидетельствует об интенсивности окислительных процессов. Отмечается также резкое уменьшение длинноцепочных парафинов. Таким образом, выделенные виды микроорганизмов-деструкторов нефти могут служить основой для разработки биотехнологии мелиорации нефтезагрязненных почв Мангышлак-Прикаспийского региона. Агротехнические методы, такие как, рыхление, частые вспашки, дискование, распашка загрязненных нефтью почв являются благоприятным фактором, стимулирующим процессы биодеградации нефти в почвах. При этом происходит активизация жизнедеятельности углеводородокисляющих микроорганизмов, улетучиваются летучие фракции нефти, уменьшается глыбистость почвенных частиц, улучшается водно-воздушный режим, пористость почвы и ее биохимическая активность [131, 132]. Решение этой проблемы состоит в учете потенциала самоочищения почв, который зависит от свойств самих почв, климатических факторов и свойств почвенной микрофлоры [133]. Самоочищение поверхностных вод и почвы от нефтяного загрязнения протекает под действием физических, химических и биологических факторов. Однако у первых двух происходят лишь частичные изменения в составе нефти и нефтепродуктов, полной деструкции не наблюдается. В комплексе процессов 46 самоочищения окружающей среды ведущая роль, принадлежит нефтеокисляющим микроорганизмам [133-136]. Основным, экологически очень важным свойством, присущим нефтеокисляющим микроорганизмам, является их способность усваивать углеводороды в качестве единственного источника углеродного питания [137, 138]. Для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов требуются не только органические вещества, но и биогенные элементы (N, P, K, Ca, F, CI и др.), источником которых в данном случае могут быть бытовые сточные воды. Оптимальное количество бытовых сточных вод для разбавления нефтесодержащих производственных стоков зависит от состава последних и определяется в каждом случае экспериментально, так как ненормированное использование бытовых стоков может привести к деградации (или ослаблению) адаптированной к данным загрязнениям микрофлоры [139]. Биохимическое окисление проводят как в естественных условиях на полях фильтрации, орошения и биологических прудах, так и в искусственно созданных условиях на биофильтрах и в аэротенках. Поля фильтрации, поля орошения и биофильтры функционируют за счет почвенных биоценозов; биологические пруды и аэротенки – за счет биоценозов водоемов [140]. Интенсификация процесса биологической очитки нефтесодержащих и других промышленных стоков возможна за счет внесения в сточные воды необходимых микрофлоре активного ила, макро- и микроэлементов, способствующих построению, росту, размножению микробной клетки; использования биокатализаторов, витаминов, ферментов; применения устойчивых к токсикантам микроорганизмов; обогащения активного ила микроорганизмами – деструкторами [141]. Интересная разработка ВНИИВОДГЕО предложена в работе [142]. Это конструкция компактного закрытого сооружения для аэробной биоочистки нефтесодержащих сточных вод с плавающей насадкой из гранул полиэтилена. Эта загрузка хорошо отмывается и не склеивается. Эксперименты на стендовой, пилотной и опытно-промышленной установках (производительность 20-60 л/ч) показали возможность очистки воды, прошедшей только механическую очистку. Концентрация нефтепродуктов в исходной воде составляла 150 мг/л, тогда как в сточных водах, подаваемых на очистку в аэротенк, содержание нефтепродуктов не должно превышать 25 мг/л. Эффективность очистки по нефтепродуктам составляет 82% [140]. Использование малой установки рационально там, где при дефиците площадей есть острая необходимость решать проблемы загрязнения окружающей среды, а применять типовые аэротенки с отстойниками не представляется возможным [140]. Использование природных микроорганизмов для биоремедиации было продемонстрировано при ликвидации загрязнения нефтью берегов Аляски после печально известной катастрофы танкера, в результате которой 11 млн галлонов нефти вылилось в море. Около 1,5 тыс км береговой линии оказалось загрязнено нефтью. Было привлечено около 11 тыс. рабочих, разнообразное 47 оборудование и техника, затрачивалось по 1 млн дол. в день. Процедура биоремедиации береговой линии состояла во внесении в почву азотсодержащего удобрения, стимулирующего метоболизм природных микроорганизмов, способных к деградации содержащихся в нефти углеводородов. Оказалось, что этот метод в 3-5 раз ускоряет процесс деградации нефти. В результате проведенной биоремедиации отрицательный эффект от загрязнения нефтью, который, по расчетам, продлился бы 10 лет, был сокращен до 2 лет. Что касается затрат на биоремедиацию, то они составили менее 1 млн. доллар США [143]. Существует ряд технологий обработки загрязненных грунтов. Наиболее распространены сжигание, захоронение и биоокисление является наиболее дешевым, экологически безопасным и перспективным методом. В литературе для обозначения этого процесса используются термины «биодеградация», «биовосстановление», «биорекультивация» и «биоремедиация». Одним из современных методов, используемых при разработке экологически чистых технологий защиты окружающей среды и восстановления природных ресурсов, является биоремедиация – наиболее щадящий метод сохранения биоразнообразия и обеспечения устойчивости очищающих биоценозов. Метод биоремедиации заключается в интродукции в загрязненные экосистемы ремедиационных ценозов различных уровней сложности, в которые могут входить гетеротрофные микроорганизмы различных классов, активно разрушающие ксенобиотик: цианобактерии и микроводоросли-фотосинтетики, высшие растения. Для более эффективной работы этих биоценозов по очистке воды необходимы системы их жизнеобеспечения: иммобилизация компонентов биоценоза, ввод элементов питания и регуляция реакции среды. В основу очистки нефтяных загрязнений методами биоокисления положена биохимическая деятельность нефтеокисляющих микроорганизмов, которые довольно широко распространены в природе. Притом очевидно, что для эффективной очистки нефтяных загрязнений необходимо использовать быстрорастущие штаммы микроорганизмов, интенсивно потребляющих углеводородные субстраты. Биодеградация углеводородов природными популяциями представляет собой один из основных природных механизмов самоочищения окружающей среды, и интенсивность этого процесса в решающей степени зависит от обилия микроорганизмов-биодеструкторов загрязняющих веществ. Однако скорость процессов самоочищения чрезвычайно мала, часто на это требуется десятки лет; к тому же потенциальные возможности экосистем к самоочищению небезграничны, при экологических бедствях структура и численность природных популяций микроорганизмов изменяются, что ведет к резкому снижению интенсивности самоочистки и консервации загрязнителя. Современное состояние экологических проблем в местах расположения предприятий нефтегазового комплекса требует скорейшей разработки и внедрения новых научно-технологических решений по ликвидации углеводородного загрязнения. Наиболее перспективным, экологически чистым 48 и часто единственно возможным способом решения данных экологических проблем является применение биологических технологий, основанных на использовании микробных биопрепаратов, изготовленных из активной биомассы углеводород окисляющих микроорганизмов. Для таких микроорганизмов углеводороды служат естественным источником питания, поэтому в процессе жизнедеятельности они активно размножаются, потребляя загрязнения вплоть до их полного исчерпания. Технология очистки заключается во внесении препарата на загрязненную территорию или его смешивании с источником загрязнения в присутствии биогенных элементов (азота, фосфора, калия и др.) в виде обычных минеральных удобрений. Наиболее эффективными биопрепаратами для ликвидации углеводородного загрязнения являются биопрепараты серии «Биодеструтор» («Валентис», «Лидер», «Торнадо», «МАГ», «Аллерго» и др.), которые используются ООО «ВНИИГАЗ» для очистки почв, водоемов, амбаров, резервуаров от газового конденсата и др. нефтепродуктов. Ценность и уникальность биологических технологий, основанных на применении препаратов серии «Биодеструктор», обусловливаются рядом факторов: • они могут применяться как самостоятельно, так и в качестве дополнительного способа для завершения очистки после предварительного применения физических и механических способов; так, собранная механическим путем загрязненная почва подвергается очистке с помощью биопрепаратов, а затем возвращается на место выемки; нефтепродукты, разлитые на водной поверхности, могут быть собраны адсорбентами или нефтесборщиками, а их остатки и водно-нефтяная эмульсия утилизируются биопрепаратами; • биотехнологию рекомендуется использовать для очистки территорий предприятий с непрерывным циклом работ, а также в местах со сложным рельефом, куда доступ техники для вывоза грунта затруднен; • в отличие от физических и механических, биологические технологии обеспечивают полную ликвидацию углеводородного загрязнения, при этом конечными продуктами биохимических реакций являются углекислый газ и вода; • увеличивающаяся при утилизации углеводородов биомасса микроорганизмов при исчерпании источника загрязнения отмирает и превращается в гумус (если призводится очистка почвы) или в донный ил (в случае водоемов); таким образом, в отличие от других способов, применение биопрепаратов оказывает положительное воздействие на природную среду: увеличение запасов гумуса восполняет почвенное плодородие, а отмершая биомасса повышает продуктивность водоемов. • степень очистки при однакраатной обработке биопрепаратами состовляет 60-100%, при этом процесс очистки занимает период от нескольких часов до нескольких месяцев, что зависит как от вида загрязнителя, его концентрации, количества вносимого биопрепарата, так и от физико-химических и 49 климатических факторов: температуры (+10-50 0С, оптимум 25-300С), рН (3,09,5, оптимум 6,8-7,2), аэрации (0,5-1,5 м3 воздуха/ м3 почвы или воды) и влажность в пределах 60-65%. Для эффективной очистки при оптимальных условиях расход препаратов на 1 т сырой нефти и нефтепродуктов составляет от 0,5 до 2,0 кг; из этого исходят при расчете потребности в биопрепаратах для подготовки к работам по ликвидации нефтяных разливов на почвах, водной поверхности или для очистки резервуаров. Очистка почвы. Загрязнения почв подразделяется на поверхностное, подповерхностное (глубина проникновения загрязнителя 5-30 см), глубинное (загрязнения 30 см -1 м) и загрязнения нижних слоев почвы (проникновение загрязнителя до уровня грунтовых вод 1-5 м и более). При ликвидации загрязнения на поверхности почвы для обеспечения аэрации проводят рыхление: при больших площадях загрязнения – с помощью трактора с подвесными орудиями (плуги, бороны, культиваторы), на небольших площадях - вручную; таким же образом производят внесение суспензии биопрепаратов, при очистке значительных территорий возможно применение дождевальных установок, поливочных и пожарных машин или сельскохозяйственной авиации. Биопрепараты для практических целей применяются в течение 10 лет в различных регионах России и за рубежом. Для иллюстрации эффективности очистки с помощью биологических препаратов приведем краткое изложение некоторых результатов, полученных при практических работах на реальных объектах. 1га почвы Рузаевской нефтебазы, загрязненной 12,5 т сырой нефти, обрабатывали 12 кг биопрепарата и 20 кг аммофоски. Через 7 сут. на поверхности почвы визуально наблюдаются следующие изменения: маслянистая поверхность становится матовой, пронизывается мелкими порами за счет выделения углекислого газа, цвет меняется от черного до серого и затем темно-желтого. Агрегатный состав почвы из вязкой илообразной консистенции становится комковатым с характерным гнилостным запахом. Через 14 сут. комочки почвы становятся негорючими, через 21 сут. нефтепродукты при химическом анализе не обнаруживаются, состав микрофлоры не отличаются от состава незагрязненной (нативной) почвы. Степень очистки составила практически 100 %. Работа по очистке от углеводородного загрязнения территории одной из нефтяных скважин (г. Новый Уренгой) обей площадью 35 га проводилась в течение 5 недель. Степень очистки на отдельных участках составила 65-95% [144]. Очистка водоемов. Загрязненный участок ограждают оперативными плавающими средствами. При значительной толщине «пятна» производят сбор нефти с помощью нефтесборщиков и других средств в специально подготовленные резервуары для разделения водно-нефтяной смеси, отделения слоя нефти и дальнейшей очистки оставшейся в резервуаре воды с помощью биопрепаратов. Обработку рабочими суспензиями небольших водных поверхностей производят с берегов водоемов с помощью пожарных шлангов, а 50 при значительных – водную поверхность обрабатывают или с борта судов, или с помощью сельскохозяйственной авиации. Аэрация загрязненного перемешивания; в небольших водоемах производится барботаж воздуха. Территория гавани г. Ларнака (Республика Кипр) была загрязнена смесью мазута, бензина, керосина, машинного масла, концентрация составила 12 мг/л. Обработка водной поверхности суспензией биопрепаратов позволило очистить водоем до концентрации 1 мг/л в течение суток [144]. Очистка нефтешламов. Распространенным видом отходов являются нефтяные шламы, выход которых составляет 7 кг на 1 т перерабатываемой нефти [8]. Эти отходы представляют собой амфотерные или мелкокристаллические массы, содержащие 20–80 % воды. Химический состав нефтешламов предельно сложен и включает предельные и ароматические углеводороды, карбоновые кислоты, асфальтены, гудроны, ионы металлов, механические примеси и радиоактивные элементы. Утилизация нефтешламов и нефтесодержащих осадков производится по технологической схеме, принятой для очистки почв и водоемов. Однако в связи с тем, что эти отходы содержат фракции нефтепродуктов, прочно адсорбированных на механических компонентах и практически не подвергающиеся эмульгированию в воде при обычных условиях, иногда прибегают к их предварительной подготовке для последующей обработки биопрепаратами. Чтобы осуществить десорбцию углеводородов и перевод их в углеводородные эмульсии рекомендуется, например, предварительно обрабатывать нефтешламы органическими растворителями или жидким парафином, которые одновременно являются соокислителем тяжелых фракций углеводородов. При этом для утилизации жидких или твердых отходов применяются технологии, изложенные выше. Нефтешламы, находящиеся в шламонакопителях на нефтеперерабатывающем заводе на о. Тайвань (Китай), предварительно обрабатывали жидким парафином, после чего полученную реакционную смесь помещали в биореактор с водой и добавляли биопрепараты; ферментацию проводили при интенсивной аэрации и температуре 32-370С в течение 72 час. После полной утилизации углеводородов отмершая микробная масса вместе с адсорбированными на ней тяжелыми металлами частично выпадала в осадок и всплывала, причем верхний слой представлял собой активную микробную биомассу, которая использовалась для очистки новых порций нефтешламов нефтезагрязненных территорий [144]. Опыт применения биопрепаратов свидетельствует, что биологические технологии являются наиболее эффективными, экологически чистыми и экономически выгодными, что делает их незаменимыми при ликвидации загрязнений углеводородами др. вредными токсическими веществами. В настоящее время использование биопрепаратов и переход к повсеместному применению биологических технологий в целях защиты окружающей среды на предприятиях нефтегазового комплекса является актуальным и наиболее перспективным. 51 Все вышесказанное указывает на острую необходимость проведения исследований, направленных на борьбу с нефтяным загрязнением и его последствиями. В результате приведенного выше обзора, было показано, что в настоящее время уделяется много внимания новым, высокоэффективным технологиям, которые базируются на применении биосорбентов, объединяющих между собой достоинства сорбционного и биодеструктивного методов ликвидации нефтяных загрязнений. Биодеструктивные сорбенты локализуют нефтяные загрязнения и разрушают адсорбированные нефтепродукты биологическим методом. При таком сочетании методов можно достичь весьма высокой эффективности очищения загрязнений при оптимальных условиях [145-147]. В настоящее время в РК имеется ряд патентов по штаммам бактерий, используемых для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов и способов биоремедиации нефтезагрязненных почв, а также биопрепараты «Экобак», «Бакойл» и «Dietzia» в виде пасты на основе нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки почв от нефтяных загрязнений [148-155]. Результаты патенто-информационного поиска показали, что все биопрепараты и способы очистки направлены только для очистки почвы. Предлагаемые нами биосорбенты являются эффективными для очистки как почв, так и для сточных вод. 1.3 Загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами Еще одна категория весьма опасных загрязнителей вод и почв – тяжелые металлы. Тяжелые металлы занимают одно их лидирующих мест среди всех загрязнителей окружающей среды. Многие представители данной группы веществ, такие как свинец, медь, цинк, кадмий, даже в очень малых количествах, способны вызывать иммунологические, онкологические и другие виды заболеваний. В результате исследований, проводимых учеными разных стран доказано, что около 70% тяжелых металлов поступает с продуктами питания в организм человека [156]. Как правило, загрязнение территории тяжелыми металлами носит локальный характер. Максимальное загрязнение почв наблюдается вблизи крупных автомагистралей, промышленных центров и мегаполисов. Находясь в пределах урбанизированных территорий, подвергающихся высокой степени антропогенного воздействия, сельскохозяйственные зоны городов не являются исключением. Основные источники антропогенного поступления тяжелых металлов в почву сельскохозяйственной территорий – тепловые электростанции, транспорт, химические средства защиты сельскохозяйственных культур от болезней и вредителей. Растениеводческая продукция, выращенная на таких территориях, накапливает тяжелые металлы в концентрациях выше предельно-допустимых концентраций (ПДК) и максимально допустимых уровней (МДУ). Цинк, свинец и кадмий относительно легкодоступны для растений, поэтому именно для этих элементов наиболее высоки риски накопления в опасных концентрациях [156]. Фоновое 52 содержание их в природной среде настолько мало, что большинство таких элементов, как свинец, ртуть, кадмий, хром и многие другие обнаруживаются лишь в следовых количествах или вообще не обнаруживаются самыми чувствительными современными методами. Некоторые тяжелые металлы, например медь, цинк, ванадий и ряд других, необходимы живым организмам в качестве микроэлементов, хотя уже в микромолярных концентрациях их в воде они становятся токсичными, а это в некоторых случаях ведѐт к мутации организмов и чаще всего к начальной стадии гибели флоры и фауны данного водоѐма. Попадание в воду тяжелых металлов связано с деятельностью целого ряда отраслей промышленности (таблица 2). Таблица 2 - Отрасли промышленности, загрязняющие природную среду тяжѐлыми металлами Название отрасли Целлюлозно-бумажная промышленность Горнодобывающая промышленность Производство хлора и щелочей Производство удобрений Очистка нефти Производство стали Цветная металлургия Авто- и авиастроение Стекло, цемент, керамика Текстильная промышленность Кожевенная промышленность Паросиловые установки Cd Cr Cu Hg Pb Ni + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Sn Zn + + + + + + + + + + + + + + + + + Поскольку тяжелые металлы содержатся также в малых концентрациях и в бытовых отходах, существует опасность, что они могут попадать из свалок в грунтовые воды и далее в водоемы. Должно быть категорически запрещено использование соединений, содержащих тяжелые металлы, которые начали применять еще в 1970-е годы для защиты растений и лесов. Попавшие тем или иным способом в воду соединения тяжелых металлов сравнительно быстро распространяются по большому объему. Частично они выпадают в осадок в виде карбонатов, сульфатов или сульфидов, частично адсорбируются на минеральных или органических осадках. Поэтому содержание тяжелых металлов в отложениях постоянно растет. Особенно напряженная ситуация может возникнуть, если адсорбционная способность осадков будет исчерпана. Необходимое для этого время нельзя установить с точностью, однако, когда будет достигнута адсорбционная емкость, тяжелые металлы начнут из осадков поступать в воду. Но еще задолго до наступления насыщения тяжелые металлы из отложений могут переходить в воду, оказывая 53 вредное воздействие на окружающую среду. Например, частично этот процесс наблюдается в половодье (при таянии снегов), когда течение воды уносит донные отложения. Если рН воды окажется меньше 7, то осажденные тяжелые металлы могут переходить в воду. Значение рН уменьшается при попадании кислот в реки и в сильно заросшие водоемы, когда в результате активной деятельности растущих микроорганизмов выделяется особенно много CO2. Кроме того, переходу металлов в воду способствует образование хелатов с ионами этилендиаминтетраацетата и нитрилтриацетата, которые содержатся в очищающих препаратах в моющих средствах. Наряду с этими давно известными путями попадания в воду тяжелых металлов обнаружены реакции, в результате которых они из донных отложений растворяются в воде либо в липидах (маслах и жирах), включаясь затем в цикл питания и проникая в организм. Для ртути и олова было обнаружено, что в морских анаэробных условиях, т.е. в отложениях отмерших водорослей, они, присоединяя водород, переходят в летучие соединения. Такого рода гидрирование может осуществляться и с другими тяжелыми металлами. Эти реакции показывают, что на отдельных участках водоѐмов, покрытых обильной растительностью, покров из водорослей не только угрожает морским обитателям, но и повышает «активность» тяжелых металлов, переводя их в форму летучих соединений, в которой они покидают воду. Марганец при окислении в водной среде оседает в донных отложениях в виде нерастворимого МnО2, который в анаэробных условиях, вероятно с помощью микроорганизмов, переходит в водорастворимый ион Мn2+. Хотя марганец и относится к числу жизненно необходимых элементов, однако лишь при следовых его концентрациях в организме он может участвовать в окислительно-восстановительных процессах. При высоких концентрациях этот элемент является очень токсичным. Для некоторых тяжелых металлов установлена возможность микробиологического алкилирования. Таким образом, они могут включаться в цикл питания; метилирование характерно для мышьяка и ртути. У мышьяка наблюдается переход арсената в арсенит, а затем при метилировании в метилмышьяковую и в диметилмышьяковистую кислоту. В аэробных условиях образуется триметиларсин, а анаэробных — диметиларсин. В случае олова при участии микробов возможно метилирование соединений олова (IV) с образованием диметил-триметил-оловохлоридов. Металлическая ртуть может метилироваться в две стадии: Hg → CH3Hg+ → (CH3)2Hg . Как ионы метилртути, так и диметилртуть сорбируются живым организмом. Еще не установлено связано ли появление алкилсвинцовых соединений в организмах с микробиологическими процессами; его причиной может быть и тетраэтилсвинец, содержащийся в этилированном бензине. Совсем другой путь для попадания в цепь питания обнаружен у кадмия и некоторых других тяжелых металлов. Кадмий может замещать цинк в 54 цинксодержащих ферментах (гидроксилазах). После этого фермент становится неактивным, а организмы, в которые попал кадмий, могут служить пищей для других организмов, таким образом, Cd внедряется в общую цепь питания. Экологическое значение тяжелых металлов или других устойчивых токсинов в цепи питания можно продемонстрировать на примере ртути — первого металла, для которого было обнаружено биоконцентрирование. Ртуть, о чем первоначально и не подозревали, микробиологическим путем превращается в метилртуть, которая через планктон, моллюсков и рыб, в конце концов, попадает в пищу. В этом цикле ртуть постепенно концентрируется и в конце цепи, дойдя до человека, достигает токсичной концентрации. Такого рода кумуляция возможна только тогда, когда токсин поступает в организм быстрее, чем выводится из организма. Несмотря на единообразные первичные условия протекания биохимических процессов, различные тяжелые металлы оказывают разное действие на организм, вызывая те или иные симптомы заболеваний, что в первую очередь связано с различиями в характере распределения отдельных металлов в организме. При этом избирательно повреждаются различные органы и ткани. Так, например, кадмий преимущественно отлагается в костях, метилртуть — в клетках центральной нервной системы, хром (VI) блокирует многие ферменты печени. Наряду с этими предпочтительными органами воздействия присутствие тяжелых металлов можно установить и во многих других тканях (Таблица 3). Таблица 3 - Последствия воздействия некоторых тяжелых металлов на здоровье человека Элементы Ртуть (Hg) Мышьяк (As) Свинец (Pb) Медь (Cu) Последствия воздействия Источники элементов Повышенные концентрации Нервнопаралитические Загрязнные почвы, расстройства (болезнь поверхностные и Минамата); нарушение функций подземные воды желудочно-кишечного тракта, почек; изменение в хромосомах Раковые заболевания кожи, Загрязненные почвы, интоксикация, периферические протравленное зерно невриты Разрушение костных тканей, Загрязненные почвы, задержка синтеза протеина в поверхностные и крови, нарушение нервной подземные воды системы и почек Органические изменения в Загрязненные почвы, тканях, распад костной ткани, поверхностные и гепатит подземные воды 55 Кадмий (Cd) Цирроз печени, нарушение функций почек, протеинурия Загрязненные почвы У растений устойчивость к действию тяжелых металлов выше, чем у людей и животных. В растениях тяжелые металлы могут отлагаться в клеточных стенках (целлюлоза) или в легочных вакуолях с образованием хелатов. В этих случаях тяжелые металлы становятся физиологически неактивными. Поэтому необходимо обращать особое внимание на содержание тяжелых металлов в растениях, употребляемых в пищу. Растения могут нормально развиваться благодаря их специфическому механизму обеззараживания и даже при таких концентрациях тяжелых металлов, которые для человека являются токсичными [157,158]. 1.3.1. Методика определения тяжелых металлов В настоящее время существуют две основные группы аналитических методов для определения тяжелых металлов: электрохимические и спектрометрические методы. В последнее время с развитием микроэлектроники электрохимические методы получают новое развитие, тогда как ранее они постепенно вытеснялись спектрометрическими методами. Среди спектрометрических методов определения тяжелых металлов первое место занимает атомно-абсорбционная спектрометрия с разной атомизацией образцов: атомно-абсорбционная спектрометрия с пламенной атомизацией (FAAS) и атомно-абсорбционная спектрометрия с электротермической атомизацией в графитовой кювете (GF AAS). Основными способами определения нескольких элементов одновременно являются атомная эмиссионная спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ICP-AES) и масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS). За исключением ICP-MS остальные спектрометрические методы имеют слишком высокий предел обнаружения для определения тяжелых металлов в воде. Определение содержания тяжѐлых металлов в пробе производится путем перевода пробы в раствор – за счет химического растворения в подходящем растворителе (воде, водных растворах кислот, реже щелочей) или сплавления с подходящим флюсом из числа щелочей, оксидов, солей с последующим выщелачиванием водой. После этого соединение искомого металла переводится в осадок добавлением раствора соответствующего реагента – соли или щелочи, осадок отделяется, высушивается или прокаливается до постоянного веса, и содержание тяжѐлых металлов определяется взвешиванием на аналитических весах и пересчетом на исходное содержание в пробе. При квалифицированном применении метод дает наиболее точные значения содержания тяжѐлых металлов, но требует больших затрат времени. Для определения содержания тяжѐлых металлов электрохимическими методами пробу также необходимо перевести в водный раствор. После этого содержание тяжѐлых металлов определяется различными электрохимическими методами-полярографическим, потенциометрическим, кулонометрическим, 56 кондуктометрическим и другими, а также сочетанием некоторых из перечисленных методов с титрованием. С помощью этих методов можно определять тяжѐлые металлы до 10-9 моль/л. Эта группа методов позволяет определять содержание различных тяжѐлых металлов в широком диапазоне концентраций с удовлетворительной точностью. Достаточно разнообразна группа спектральных методов определения содержания тяжѐлых металлов. В нее входят, в частности, различные методы определения тяжѐлых металлов из анализа характеристических спектров электромагнитного излучения атомов – атомный эмиссионный анализ, атомный абсорбционный анализ, спектрофотометрия, масс-спектрометрия, спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ISP-спектрометрия), рентгеноспектральный анализ. Содержание радиоактивных тяжѐлых металлов в очень малых (примесных) концентрациях определяется рядом методов ядерной спектрометрии (бета-, гамма-спектрометрии, а также нейтронноактивационного анализа). В некоторых случаях содержание тяжѐлых металлов определяется комплексными методами, сочетающими спектральные и электрохимические – например, спектрополяриметрией. К преимуществам спектральных методов относится их высокая чувствительность и, как следствие, небольшие количества пробы, необходимые для анализа содержания тяжѐлых металлов в пробе. Вместе с тем, для осуществления ряда из них (атомный абсорбционный анализ, спектрофотометрия, спектрополяриметрия) пробу необходимо перевести в раствор, что обуславливает довольно высокую трудоемкость таких анализов на содержание тяжѐлых металлов. Методы ядерной спетрометрии для анализа содержания тяжѐлых металлов довольно специфичны [159]. 1.3.2 Способы очистки воды от тяжелых металлов Питьевая вода является стратегическим ресурсом, обеспечивающим жизнедеятельность человека. Общие мировые запасы питьевой воды составляют всего около 4% от всех ресурсов воды на планете. Этим объясняется большой интерес, проявляемый во всем мире к разработке способов очистки воды. Для очистки сточных вод, содержащих тяжелые металлы, основными физико-химическими методами считаются реагентные, мембранные, электрохимические, биохимические и сорбционные методы [160–164]. Ионный обмен и электролиз, при несомненных достоинствах, имеют ряд существенных недостатков [90]. Ионный обмен сопровождается образованием требующих утилизации растворов солей тяжелых металлов (элюатов) и высоким расходом реагентов. Электрохимический метод не всегда позволяет провести глубокую очистку и требует больших затрат на электроэнергию [165]. Различные аспекты очистки производственных сточных вод от тяжелых металлов рассмотрены в в монографиях [166–169]. 57 Для биологической очистки применяют следующие сооружения: аэротенки, биофильтры с загрузкой для предварительной или окончательной очистки, традиционные биологические фильтры, байолит-фильтры для основной очистки или доочистки, лагуны с перемешиванием или аэрацией для доочистки [170]. Ионы тяжелых металлов оказывают токсическое действие на биоценоз активного ила, поэтому очень важным является соблюдение нормативов по сбросам и максимально возможная очистка от металлов стоков, поступающих на городские очистные сооружения. Сорбционное извлечение металлов из сточных вод получило достаточно широкое распространение вследствие высокой эффективности и отсутствия вторичных загрязнений. Сорбционные материалы поглощают из водных растворов металлы практически до любых остаточных концентраций [171]. В зависимости от механизма взаимодействия сорбента с сорбатом сорбционные процессы подразделяются на следующие типы [172]: адсорбция – концентрирование компонентов на поверхности химического инертного сорбента вследствие межмолекулярного взаимодействия; экстракция – растворение компонентов в растворителе, нанесенном на сорбент; ионный обмен – обратимая химическая реакция компонентов электролита с подвижными катионами или анионами ионита; осадкообразование – образование компонентами раствора малорастворимых соединений при взаимодействии с химически активными веществами, находящимися в порах сорбента. При адсорбции загрязнений, содержащихся в сточных водах, имеют место три процесса: внешняя диффузия молекул из жидкой фазы к поверхности адсорбента, осуществляемая за счет броуновской диффузии или перемешивании жидкости за счет турбулентной диффузии; внутренняя диффузия молекул по макропорам к поверхности микропор, скорость которой определяется строением адсорбента и размером молекул сорбируемого вещества; собственно адсорбция молекул растворенного вещества. При адсорбции играют роль как физические, так и химические взаимодействия между адсорбентом и адсорбируемым веществом [173]. В случае физического взаимодействия загрязнения задерживаются на поверхности сорбента за счет слабых Ван-дер-Ваальсовых сил притяжения. Задержание же загрязнений при химическом взаимодействии является результатом образования прочной связи между активными участниками на поверхности сорбента с загрязнениями [174]. Таким образом, эффективность сорбента зависит от наличия достаточной площади поверхности и присутствия активных, по отношению к загрязнениям сточных вод, участков на этой поверхности. Эффективность процесса адсорбции зависит не только от свойств и количества сорбента, но и от химической природы и концентрации адсорбируемых веществ. Чем выше концентрация вещества, тем большее его количество будет адсорбировано на каждый грамм сорбента. Скорость процесса адсорбции обусловлена скоростью диффузии растворенного вещества к поверхности сорбента через жидкостную пленку, которая окружает частицы сорбента и может быть увеличена 58 перемешиванием, при этом возрастает скорость диффузии растворенного вещества с поверхности в поры. На скорость адсорбции влияют также размер частиц сорбента, скорость потока жидкости через сорбционную загрузку, концентрация загрязнений, температура, реакция среды. Вещества, обладающие меньшей растворимостью, адсорбируются сильнее [175, 176]. При адсорбции из растворов, наряду с поглощением нейтральных молекул, может происходить адсорбция ионов, содержащихся в растворе. При этом ион, заряженный положительно, адсорбируется преимущественно на сорбентах с отрицательно заряженной поверхностью, и наоборот. Эти процессы обычно сопровождаются явлением обмена ионами между адсорбентом и раствором – так называемой ионообменной адсорбцией [177]. Чаще всего сорбционными методами производится доочистка загрязненных сточных вод. Процесс сорбции может осуществляться в статических условиях (аппараты с перемешивающими устройствами), а также в динамических условиях (фильтры, аппараты с псевдосжиженным слоем) [178–181]. Сорбция в статических условиях осуществляется путем интенсивного перемешивания обрабатываемой воды с сорбентом в течение определенного времени и последующего отделения сорбента от воды отстаиванием или фильтрованием. При последовательном введении новых порций сорбента в очищаемую воду можно очистить ее от загрязняющих веществ до любой концентрации. Сорбция в динамических условиях осуществляется в адсорберах различной конструкции. Очистка воды на гранулированных сорбентах ведется в аппаратах с плотным, взрыхленным, движущимся и псевдосжиженным слоем. Одно- и многослойные адсорберы с плотным слоем сорбента работают с восходящим и нисходящим потоками воды, по параллельной и последовательной схемам [182]. В промышленной практике используются различные сорбенты, которые разделяют на углеродные и минеральные. К первым относятся активные угли, торф и другие материалы, получаемые в основном при переработке различных органических материалов, ко вторым – силикагели, алюмогели, цеолиты. Все сорбенты в той или иной мере проявляют активность к поглощению как нефтепродуктов, так и ионов металлов. Основным материалом, использующимся в качестве сорбента в настоящее время, являются активированные угли (АУ). Исходным сырьем для получения АУ может служить практически любой углеродсодержащий материал: уголь, древесина, полимеры, отходы пищевой, целлюлозно-бумажной, микробиологической и других отраслей промышленности [183–186]. Сорбционными свойствами обладают многие природные материалы, такие как цеолиты, сапропели, торфы и т.д. Стоимость природных сорбентов в десятки раз ниже, чем искусственных, поэтому часто их не регенерируют. Биосорбционное фильтрование на природных цеолитах или других сорбентах используется для интенсификации биологической очистки хозяйственно-бытовых и промышленных сточных вод [187]. Сорбция тяжелых 59 металлов из растворов с применение биотехнологий – интенсивно развивающаяся область исследований [188–191]. Несмотря на разнообразие применяемых адсорбентов, многие из них не удовлетворяют всему комплексу требований, предъявляемых к материалам подобного типа, в связи с чем поиск и разработка новых сорбционных материалов ведется постоянно [192, 193]. Особо приоритетным является получение сравнительно дешевых сорбционных материалов на базе отходов промышленности, поскольку при этом отходы вторично используются [194, 195]. Отходы производства в качестве адсорбентов дешевы. Как углеродные сорбенты могут использоваться резиновая крошка и шинный кокс, образующийся после пиролиза отработанных покрышек. Ферриты переходных металлов находят все большее применение в современных технологиях. Одним из направлений использования ферритов является сорбция из жидких и газовых сред. Способность ферритов адсорбировать ионы тяжелых металлов используется для очистки воды от стронция и урана [196]. Порошки ферритов, полученные из гальванических шламов, используются для извлечения сероводорода из выбросов после сжигания каменного угля [197]. Исследованы закономерности процессов адсорбции-десорбции олеиновой, линолевой и линоленовой кислот из органических сред на поверхности магнетита и ферритов железа, марганца и меди [198]. Интенсификация процессов осаждения ионов металлов и других загрязняющих веществ из гальванических сточных вод осуществляется дополнительным введением в очищаемые сточные воды флокулянтов. В мировой практике очистки воды большое распространение получили природные [199] и синтетические полимерные флокулянты, в частности полиакриламид [170]. Адсорбция и структура адсорбционного слоя существенно зависит от молекулярной массы полимера и молекулярно-массового распределения. Толщина адсорбционного слоя с увеличением молекулярной массы увеличивается [200]. В Японии, США и других странах большое внимание уделяется применению для очистки воды от ионов тяжелых металлов отработанных алюмосиликатных катализаторов и сорбентов. В работах показано, что карбонизацией при 400-5000С глины, отработанной в процессе очистки масел, получен сорбент с удельной поверхностью 40-50 м2/г, который эффективно удаляет из сточных вод ионы ртути, цинка, кадмия, меди. В последнее время наибольшее внимание уделяется природным каркасным алюмосиликатам, особенно их разновидности, называемой цеолитами. Эти материалы имеют отрицательно заряженный трехмерный алюмосиликатиый каркас со строго регулярной тетраэдрической структурой. В промежутках каркаса находятся гидратированные положительные ноны щелочных металлов, компенсирующие заряд каркаса, и молекулы воды. При нагревании цеолитов из них выделяется вода (цеолит — «кипящий камень»), и образуются адсорбционные полости, соединяющиеся между собой и с внешним 60 пространством входами-окнами малых размеров. По этой причине цеолиты сорбируют лишь молекулы веществ, критический размер которых меньше эффективного размера входного окна; от этого и их второе название — молекулярные сита. Нагревание клиноптилолита до 170°С вызывает десорбцию гидратной воды, содержание которой достигает 13% масс. Нагревание выше 450°С приводит к снижению способности цеолита сорбировать воду, а обработка его при температуре выше 750°С обеспечивает полную устойчивость клиноптилолита в воде. Для получения прочных и водостойких фильтрующих материалов из природных цеолитов их, так же как глины, нагревают в печах с хлоридом и карбонатом натрия при 1000°С. Если нагревание вести быстро, то они вспениваются, в результате чего пористость и объем цеолитов увеличиваются в 5—20 раз. Природные цеолиты используются в виде порошков и фильтрующих материалов для очистки воды от синтетических ПАВ, ароматических и канцерогенных органических соединений, красителей, пестицидов, коллоидных и бактериальных загрязнений. В США выпускается более 30 видов «фильтрующих порошков» из природных сорбентов для очистки воды. Решить вопросы сохранения и восстановления природной среды можно только на основе широкого использования доступных, дешевых и эффективных сорбентов. Этим требованиям во многом отвечают природные неорганические сорбенты по ряду факторов: месторождения природных сорбционных материалов составляют миллионы тонн; они гораздо дешевле синтетических сорбентов; они обладают высокой температурной и радиационной стойкостью по сравнению с ионообменными смолами. 1.4 Загрязнения почвы пестицидами Pагрязнение почв и растений пестицидами применяемыми для борьбы с сорняками, вредителями и болезнями сельскохозяйственных и лесных культур, вредителями и микроорганизмами, вызывающими порчу сельскохозяйственной продукции, материалов и изделий, а также для борьбы с паразитами и переносчиками заболеваний человека и животных. В случае их чрезмерного применения они представляют серьезную опасность для здоровья человека. Согласно данным американских ученых, по степени загрязнения биосферы пестициды в целом занимают 9-е место после промышленных загрязнений газами, ртутью, свинцом, кадмием, нефтью и фосфатами главным загрязнителем вод в реках и озерах. Тем не менее, необходимо располагать системой мероприятий, позволяющей свести к минимуму или совершенно исключить одно из нежелательных последствий применения пестицидов, загрязнение почвенного покрова. Попадая в окружающую среду, хлорорганические инсектициды не разлагаются в течение десятков лет. Казалось бы, такая устойчивость полезна. На обработанном болоте малярийные комары не скоро появятся вновь. Однако несколько десятилетий использования этих средств обернулись тяжелыми 61 последствиями для окружающей среды. Ведь они попадают в водоемы, в Мировой океан и распространяются по всей Земле. Эти соединения плохо растворимы в воде, зато хорошо – в жировых тканях животных, где они и задерживаются. Их концентрация в теле рыбы намного выше, чем в воде, в которой она обитает, а в теле водоплавающей птицы, питающейся рыбой, может быть уже в миллион раз больше по сравнению с водой, в которой она обитает. ДДТ был обнаружен даже в Антарктиде – в печени пингвинов. Повышенное содержание ДДТ в рыбе послужило причиной гибели целых популяций водоплавающих птиц. Поэтому сейчас в большинстве стран мира производить и использовать хлорорганические пестициды запрещено. Хотя использование средств защиты растений (пестицидов) ежегодно сокращается с 1989 по 1997 в 4 раза, что значительно уменьшило нагрузку на природную среду, тем не менее, состояние земельного фонда области в 1999 году продолжает ухудшаться, эффективность использования земель падает вследствие ухудшения их качественных характеристик [201]. Систематическое использование в земледелии особо стойких препаратов неизбежно приводит к накоплению их в почве. Они становятся экологическим фактором, формирующим микробиоценозы, источником загрязнения природной среды и продуктов питания. Важной экологической характеристикой пестицидов является их способность мигрировать по профилю почв, а также в растения, воду и воздух. Токсическое действие на почву и растения могут оказывать не только сами препараты, но и продукты их трансформации, обладающие более высокой устойчивостью и токсичностью. В растениях продукты трансформации и метаболизма пестицидов могут обладать не только большой токсичностью, но и другими опасными эффектами действия. Так, превращения фталофоса сопровождаются образованием веществ, вызывающих уродство. Концентрация пестицидов в растениях особенно опасна, поскольку последние входят в пищевой рацион человека и животных. Препараты могут поступать в растения не только через корневую систему из почвы, но и через надземные части растений при обработке их препаратами, проникая вглубь растительных тканей. Нередко под влиянием пестицидов меняется состав витаминов, углеводов, минеральных веществ в плодах, ягодах, молоке, овощах, зерне. Трансформация пестицидов с образованием опасных веществ отмечена не только в почве и растениях, но и в организме человека и животных. Так, токсичные метаболифосфорорганические препараты (корал, трихлорметафос 3), образующиеся в организме животных, являются стойкими, выводятся из организма в течение 8 недель. Остатки этих метаболитов обнаруживаются в крови, мясе, мозгу и печени. В целях эффективного и безопасного для окружающей среды применения пестицидов реализуются различные подходы. Постоянно совершенствуется ассортимент применяемых пестицидов за счет включения в него менее токсичных и персистентных препаратов, разрабатываются и внедряются в практику новые технологии и мероприятия, позволяющие снизить содержание 62 в объектах окружающей среды остатков недостаточно "экологичных" по своим характеристикам пестицидов и их отрицательное воздействие на агрофитоценозы, животных и человека. Важную роль в снижении и предотвращении негативных последствий применения пестицидов в земледелии играет контроль за содержанием их токсичных остатков в объектах окружающей среды, растениеводческой продукции, кормах и продуктах питания растительного происхождения. Учет результатов контроля за остатками пестицидов в объектах окружающей среды при планировании работ по химической защите растений позволяет существенно снизить или устранить полностью негативные последствия применения пестицидов. Забота об охране окружающей среды оказывает влияние на использование пестицидов для защиты растений. Bo многих странах введено строгое регламентирование их применения. Оно позволило в значительной степени предотвратить загрязнение окружающей среды, избежать накопления остатков пестицидов в сельскохозяйственной продукции и в почве, гибели полезных организмов, ущерба здоровью людей. За последнее время усилен контроль за пестицидами со стороны государств. В настоящее время влияние пестицидов на здоровье населения многие ученые приравнивают к воздействию на человека радиоактивных веществ. Достоверно установлено, что при применении пестицидов наряду с некоторым увеличением урожайности отмечается рост видового состава вредителей, ухудшаются пищевые качества и сохранность продукции, утрачивается естественное плодородие и т. д. По мнению ученых, подавляющая часть применяемых пестицидов попадает в окружающую среду (воду, воздух), минуя виды-мишени. Пестициды вызывают глубокие изменения всей экосистемы, действуя на все живые организмы, в то время как человек использует их для уничтожения весьма ограниченного числа видов организмов. В результате наблюдается интоксикация огромного числа других биологических видов (полезных насекомых, птиц) вплоть до их исчезновения. К тому же человек старается использовать значительно больше пестицидов, чем это необходимо, и еще более усугубляет проблему. Среди пестицидов наибольшую опасность представляют стойкие хлорорганические соединения (ДДТ, ГХБ, ГХЦГ), которые могут сохраняться в почвах в течение многих лет и даже малые их концентрации в результате биологического накопления могут стать опасными для жизни организмов. Но и в ничтожных концентрациях пестициды подавляют иммунную систему организма, а в более высоких концентрациях обладают выраженными мутагенными и канцерогенными свойствами. Попадая в организм человека, пестициды могут вызвать не только быстрый рост злокачественных новообразований, но и поражать организм генетически, что может представлять серьезную опасность для здоровья будущих поколений. Вот почему применение наиболее опасного из них — ДДТ в нашей стране и в ряде других стран запрещено. Воздействие пестицидов оказывается весьма негативным не 63 только для человека, но и для всей фауны и флоры. Растительный покров оказался очень чувствительным к действию пестицидов, причем не только в зонах его применения, но и в местах, достаточно удаленных от них, из-за переноса загрязняющих веществ ветром или поверхностным стоком воды (рис.1). Рисунок 1- Движение пестицидов в биосфере. Значительная часть пестицидов не достигает обрабатываемой территории, сносится и оседает в более или менее удаленных экосистемах (по Rudd, 1971; с изменениями) Работами отечественных и зарубежных исследователей неопровержимо доказано, что загрязнение почв пестицидами вызывает не только интоксикацию человека и большого числа видов животных, но и ведет к существенному нарушению воспроизводящих функций и, как следствие, к тяжелым демоэкологическим последствиям. С длительным применением пестицидов связывают также развитие резистентных (устойчивых) рас вредителей и появление новых вредных организмов, естественные враги которых были уничтожены. В отличие от других загрязняющих веществ (радионуклиды, тяжелые металлы, и др.), реальная опасность пестицидов не полностью осознана. Это объясняется тем, что пестициды - это сотни действующих веществ и десятки тысяч препаратов. Методы анализа их в окружающей среде сложны, дороги, трудоемки, несовершенны и не всегда надежны. Отсутствие информации об экотоксикологических свойствах пестицидов - главная причина их опасности. Долговременные экологические последствия применения пестицидов не изучены. Пестициды наиболее устойчивы в почве, период их разложения колеблется от нескольких дней до десятков лет [202]. 64 Несомненно, от применения химии в сельском хозяйстве человечество отказаться не может – слишком велики будут потери урожая. Однако использовать эти небезопасные вещества следует разумно и только в тех случаях, когда они действительно необходимы. 1.4.1 Методика определения пестицидов в почве Одной из важнейших и сложных задач аналитической химии окружающей среды является осуществление контроля содержания пестицидов в сельскохозяйственной продукции, а также в природных водах, в почве и в атмосфере сельскохозяйственных районов, где эта продукция производится. Поиск оптимальных методов анализа пестицидов – одна из важнейших проблем аналитической химии. С современных позиций к ним, в первую очередь, относятся капиллярная газовая хроматография (ГХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ) и капиллярный электрофорез (КЭ) [203]. Эти методы обладают высокой разделяющей способностью, необходимой при анализе многокомпонентных образцов, и высокой чувствительностью, позволяющей определять пестициды на уровне концентраций 1 мкг/дм3 и ниже [204]. Выбор конкретного метода анализа во многом определяется самой аналитической задачей. К типичным задачам можно отнести следующие: - определение пестицидов на разных стадиях их производства, приготовления готовых форм, при их хранении; − определение остаточных количеств пестицидов в сельскохозяйственной продукции, в почве и в природных водах; − определение пестицидов в биологических образцах; − определение пестицидов в продуктах питания, в атмосфере, в питьевой воде. Две последние задачи являются наиболее сложными, так как они требуют одновременного определения не заведомо известных веществ, а набора соединений из всего списка применяемых на практике пестицидов, количество которых превышает 1000 названий. Задачи такого типа иногда называют скриннинговыми. Их решают, главным образом, с помощью метода ГХ с массспектрометрическим детектированием (ГХ-МС), когда идентификация пестицидов осуществляется по заранее созданной библиотеке масс-спектров [205]. Рассматривая химико-аналитические методы с точки зрения их "универсальности" по отношению к анализу пестицидов, можно сделать следующие замечания. Метод ТСХ достаточно чувствительный и простой в исполнении, однако в силу своей относительно невысокой разрешающей способности "универсальным" быть не может. Метод ГХ обладает очень высокой разрешающей способностью, но его применение ограничивается термической лабильностью ряда пестицидов и необходимостью привлекать различные способы химической дериватизации многих пестицидов для повышения их летучести. Метод КЭ, имея высокую разрешающую способность, не 65 обеспечивает приемлемую концентрационную чувствительность и требует весьма высокую степень концентрирования образца, что часто нельзя осуществить из-за ограниченной растворимости пестицидов. Метод ВЭЖХ обеспечивает для решения многих задач достаточное разрешение, не требует, как правило, предварительной дериватизации и пригоден для анализа термолабильных пестицидов. В сочетании с ГХ он позволяет решить практически все задачи, и именно эти два метода нашли наибольшее распространение в современной экологической аналитической химии. 1.4.2 Методы очистки почв от пестицидов Проблема очистки объектов окружающей среды, загрязненных пестицидами, а также утилизация избыточных количеств этих веществ, находящихся на складах, является чрезвычайно актуальной для современной экологии. По принадлежности к классу химических соединений наибольшее применение получили хлорорганические пестициды. В естественных условиях все химические соединения, используемые в качестве пестицидов, в той или иной мере подвержены деструкции, обусловленной не биотическими и биотическими факторами и процессами. Из биотических факторов ведущая роль в данном процессе принадлежит микрофлоре почвы. Во многих работах подчеркивается большое значение почвенных микроорганизмов в разложении пестицидов. Существует очень мало действующих веществ, не разлагающихся биологическим путем. Разложение действующих веществ пестицидов осуществляется бактериями, грибами и высшими растениями. В настоящее время выделено значительное количество штаммов грибов, бактерий, актиномицетов, водорослей, способных разлагать пестициды до нетоксичных соединений. Активнее в разложении растворимых пестицидов участвуют бактерии, а слаборастворимых - микрогрибы. Продолжительность деструкции пестицидов микроорганизмами может колебаться от нескольких дней до нескольких месяцев, а иногда и десятки лет, в зависимости от химического состава вещества, видов микроорганизмов, свойств почв (температура, аэрация и т.д.). Из всех известных способов дезактивации токсичных органических соединений наиболее перспективными являются биотехнологические способы. Преимущества микробиологических методов дезактивации над другими методами объясняются тем, что микроорганизмы обладают огромным разнообразием ферментных систем и большой лабильностью метаболизма, что позволяет разлагать широкий спектр химически устойчивых соединений. Наиболее эффективным является использование для деструкции пестицидов, не монокультуры, а адаптированной ассоциации микроорганизмов. Ассоциация или консорциум почвенных микроорганизмов имеет метаболические возможности выше и разнообразнее, чем отдельно взятый организм. Совместная деятельность микроорганизмов ассоциации позволяет довести до полной минерализации пестициды, что не всегда может сделать 66 популяция одного вида микроорганизма. Немецкие авторы предлагают способ получения и применения - ассоциацию микроорганизмов для деструкции гексахлорциклогексана и других полихлорированных циклических углеводородов (патент Германии №4212479). Российские авторы предлагают использовать для деструкции пестицидов адаптированную культуру консорциума микроорганизмов, выращиваемую на твердофазных средах, где в качестве субстрата-носителя используются естественные материалы: почва, торф, солома, древесная стружка, опилки и т.д. (Патент 2279325). Сущность предлагаемого способа заключается в следующем: в загрязненную пестицидами почву вносится адаптированная ассоциация микроорганизмов, выделенная из зараженной пестицидом почвы. Сначала получают деструктирующий агент (ассоциацию микроорганизмов) путем культивирования на элективной питательной среде. Следующий этап адаптация выделенной ассоциации микроорганизмов к пестицидам. Адаптация производилась в условиях принудительного перемешивания и аэрации на минеральной среде. В качестве единственного источника углерода вносили раствор пестицида. Известно, что пестициды разлагаются гетеротрофными микроорганизмами в процессе их жизнедеятельности. Для этого им необходим энергетический материал и основные источники питания в виде органических и минеральных соединений, в также соответствующие оптимальные физикохимические условия среды (почвы с слабокислой и нейтральной средой (рН 67), оптимальной влажности 50-70%, диапазон температур от 20-30°С, аэробные условия). Продолжительность процесса деструкции от 14 до 28 суток в зависимости от вариантов экспериментов. Определенное влияние на микробную ассоциацию оказывает сам пестицид. Многие пестициды в высоких концентрациях токсичны и вследствие этого недоступны для микроорганизмов. При высоком содержании пестицидов увеличивается вероятность отравления клеток этими веществами или продуктами их метаболизма. Низкие концентрации, составляющие несколько мкг или нг на кг почвы, могут оказаться ниже порога концентраций, при которых индуцируется синтез соответствующих ферментов, что исключает прямое участие микроорганизмов в деградации этих веществ. Поэтому при очень малых концентрациях эти вещества неспособны индуцировать соответствующие ферменты и разложение имеет случайный характер. Экспериментально установлено, что количество индуктора - пестицида должно находиться в пределах от 10-100 мг/кг исходной смеси. Таким образом, совместное внесение адаптированной ассоциации культур позволяет увеличить степень деструкции пестицидов и сократит время деструкции. Способ микробиологической деструкции хлорорганических пестицидов, отличающийся тем, что процесс разложения пестицидов осуществляют с помощью ассоциации микроорганизмов в условиях аэрации [206]. Широкое применение пестицидов в сельскохозяйственной практике привело к тому, что все страны, так или иначе, сталкиваются с проблемами 67 отходов пестицидов [207]. По данным организации ООН по вопросам продовольствия и сельского хозяйства (FAO), в развивающихся странах в настоящее время накоплено около 100000 тонн непригодных пестицидов [207, 208]. В общем случае способы ликвидации могут быть разделены на три категории: термические, физико-химические и биологические. В табл. 4 приведены способы ликвидации больших запасов непригодных пестицидов, которые, по мнению FAO, являются приемлемыми (или неприемлемыми) для развивающихся стран [209]. Таблица 4 - Методы ликвидации больших количеств непригодных пестицидов в развивающихся странах Приемлемые методы Высокотемпературное сжигание Сжигание в цементных печах Химическая обработка Долгосрочное контролируемое хранение Биоразложение Неприемлемые методы Открытое сжигание (горение) Закапывание в землю Спуск в канализацию Солнечное испарение Расстилание на земле Размещение в глубоких скважинах Методы, разработанные для ремедиации почвы и подземных вод Общие требования, которым должен отвечать способ уничтожения запасов непригодных пестицидов, заключаются в следующем: минимальный риск для окружающей среды, безопасность для человека и экономичность. Наиболее подходящим и эффективным способом ликвидации запасов непригодных пестицидов является их сжигание в специальных высоко-температурных сжигателях. Такие установки имеются в ограниченном количестве в развитых странах [208]. Этот способ особенно подходит для сжигания персистентных, высокохлорированных пестицидов таких, как ДДТ и дильдрин. Существуют программы ООН, которые спонсируют упаковку и перевозку запасов непригодных пестицидов из развивающихся стран в Западную Европу для их окончательного уничтожения [210]. В 1980-х годах была обнаружена способность смеси полиэтиленгликоля (ПЭГ) и гидроксида калия дехлорировать полихлорированные бифенилы (ПХБ) либо в растворах, либо в почве [211, 212]. Этот способ также эффективен для разрушения ПХДД и ПХДФ — известных примесей в старых формуляциях фенокси-гербицидов [213]. Однако в настоящее время EPA не рекомендует использовать этот способ для больших количеств отходов с концентрацией хлорированных органических соединений выше 5% [214]. Очистка почвы от пестицидов представляет собой самый трудный случай избавления от отходов вследствие сложности свойств и разнообразия типов почв и концентраций пестицидов в них [207]. Очищать загрязненную почву 68 необходимо сразу после того, как произошло загрязнение для того, чтобы свести к минимуму загрязнение пестицидами поверхностных и подземных вод в результате поверхностного стока и выщелачивания. Существует два основных варианта очистки загрязненных почв: отделение пестицидов от почвы и прямая обработка почвы. Отделение пестицидов от почвы может осуществляться как на месте загрязнения, так и после выемки почвы и ее транспортирования на место проведения очистки [215]. Для отделения пестицидов от почвы на месте загрязнения используют высокочастотное нагревание, электрокинетическую обработку и смывание (промывку) почвы. После выемки почвы для отделения пестицидов используют промывание почвы, экстракцию растворителем и термическую десорбцию. Для высокочастотного нагревания в почву (буровые скважины) помещают электроды. В результате нагревания пестициды испаряются и концентрируются на какой-либо поверхности. При применении этого способа в США достигнута эффективность удаления из почвы хлорированных циклодиеновых пестицидов на уровне 97—99% [215]. Электрокинетическая обработка почвы близка к высокочастотному нагреванию. В этом случае приложение напаряжения к почве осуществляется путем помещения катода в одну скважину, а анода в другую [216]. Удаление пестицидов при смывании и промывке почвы может быть осуществлено как на месте загрязнения, так и на специальном месте проведения очистки при использовании воды в качестве растворителя [215, 216]. Удаление пестицидов из почвы с помощью экстракции растворителем проводится после выемки почвы и ее транспортировки на место, где имеется соответствующее оборудование. Для экстракции используется либо органический растворитель, либо сверхкритическая вода. Почва может быть также нагрета в закрытой камере для десорбции пестицидов [217]. Было показано, что ДДТ из загрязненной почвы успешно удаляется при термической десорбции при температуре 450—500°С [218]. Следует подчеркнуть, что все вышеперечисленные способы отделения пестицидов от почвы не могут быть применены в небольших фермерских хозяйствах вследствие достаточно высокой стоимости оборудования, необходимого для этих целей. Сжигание в роторном обжиговом сжигателе является способом, который наиболее часто используется для разрушения пестицидов в почве [207]. Сожженная почва может быть возвращена на место ее удаления, если концентрация тяжелых металлов в почве не является проблемой. Описан случай сожжения почвы (около 90,7 тонн), загрязненной пентахлорфенолом и креозотом, изъятой с территории лесопильного завода и деревообрабатывающей фабрики в США [219]. Следует заметить,что этот способ не может использоваться в развивающихся странах ввиду отсутствия необходимых для этого сжигателей. Для очистки почв, загрязненных запрещенными хлорорганическими и циклодиеновыми инсектицидами, может быть применена обработка почвы смесью ПЭГ и КОН [220]. Несмотря на то, что в этом случае эффективность 69 разрушения пестицидов составляет не более 99% этот способ вполне приемлем для развивающихся стран. Полное разрушение пестицидов может быть достигнуто при последующем использовании способов биологической обработки почвы [221]. Для очистки небольших участков (количеств) почвы, загрязненной пестицидами, предпочтительны низкостоимостные технологии, основанные на использовании различных биологических процессов. Микробиологические детоксикационные способы дешевле, чем физические и химические способы, легко транспортабельны, технически не сложны и социально приемлемы [207]. В настоящее время для очистки загрязненных почв с помощью микробиологических технологий могут использоваться следующие способы [222]: - предварительная обработка загрязненной почвы различными реагентами для образования продуктов, которые более легко подвергаются микробной минерализации; - компостирование; - обработка почвы пестицид-разлагающими микроорганизмами и/или энзимами; - добавка к почве питательных веществ или создание физических условий для стимулирования микробного метаболизма; - использование микробной экологии и корневой физиологии либо для метаболизма пестицидов, либо для их иммобилизации растениями с последующим метаболизмом (фиторемедиация); - расстилание загрязненной почвы на поверхности сельскохозяйственных или неиспользуемых для выращивания сельскохозяйственных культур земель для стимуляции разрушения, трансформации или иммобилизации загрязнителей. Из вышеперечисленных биологических способов очистки загрязненных почв пестицидами наиболее подходящими для небольших фермерских хозяйств является компостирование и расстилание. Экономический анализ, проведенный в США, показал, что стоимость последнего способа очистки составляет 2025 $ США за тонну почвы, тогда как сжигание требует 80—90 $ CША за тонну [223]. 1.5 Сорбент, используемый в очистке сточных вод и почв Актуальность изучения новых структурных форм углерода и их свойств, а также существующие геологические проблемы древнейшего углерода объясняют неослабевающий уже третье столетие научный интерес к углероду шунгитовых пород России (месторождение «Зажогино»). Шунгиты различных месторождений характеризуются структурным подобием, но различием объемной морфологии, что служит причиной сравнения надмолекулярных структур шунгитов Карелии и месторождения Бакырчик. Cтруктура шунгита и содержание примесей определяют его уникальные технологические и реологические свойства. В химической технологии шунгит представляет 70 интерес как комплексный сорбент, природный катализатор или носитель катализаторов. На практике шунгит является прекрасным сорбционным материалом и может использоваться для очистки питьевой и сточных вод, широко используется при производстве резины, в медицине, строительстве и.т.д. Шунгит – известен еще с петровских времен. Петр Первый своим указом повелел построить первый российский курорт на месторождении шунгита в Карелии, близ нынешнего Петрозаводска. С тех пор шунгит находит применение в медицине. Особенно активно его используют россияне, которые доказали, что минерал благотворно влияет на все живые организмы, в том числе на человека. Долгое время считалось, что карельское месторождение шунгитов – единственное на земле. В 70-е годы прошлого столетия геологи обнаружили эту разновидность углерода в Восточном Казахстане. Оказалось, что казахстанские залежи – подобие того углерода, что есть под Петрозаводском, то есть шунгитовый углерод. Отличие между ними – возраст (от 2,5 миллиардов лет для месторождения «Зажогино» до 300 миллионов лет для шунгитов месторождения «Бакырчик») и закономерности накопления шунгитового вещества в результате вулканической деятельности [224] . Шунгитовый углерод - это окаменевшая нефть, или аморфный, некристаллизирующийся, фуллереноподобный (т.е. содержащий определѐнные регулярные структуры) углерод, его содержание в породах составляет от 1% до 30%, также в нем присутствуют алюмосиликаты, оксиды щелочных металлов и следовые количества благородных и рассеянных металлов[225]. Шунгитовый углерод образует в породе матрицу, в которой равномерно распределены дисперсные силикаты со средним размером около 1 мкм. Наличие такого набора элементов и структура шунгита определяют его уникальные технологические и реологические свойства. В химической технологии шунгит представляет интерес как комплексный сорбент, природный катализатор или носитель катализаторов [226], обладающий одновременно свойствами углеродных и силикатных материалов. На практике шунгит, является прекрасным сорбционным материалом, может использоваться для очистки сточных вод от нефтепродуктов, фенолов и солей тяжелых металлов [227-230]. Многие авторы рассматривают шунгитовые породы, как эталонный представитель данного класса твердых битумов [231]. На атомно-молекулярном уровне структура карельских и казахстанских шунгитов месторождения «Бакырчик» оказалась аналогичной. По мнению С.Г. Глебашева с соавторами, Бакырчикскую группу шунгит-платиноидно-золото-сульфидных месторождений, выделяют в три типа шунгитоносных породвысокоуглеродистый шунгитовый (Сорг более 25%), среднеуглеродистый шунгитистый (Сорг 5-25%), низкоуглеродистый шунгитсодержащий (Сорг 1-5%), и ряд минеральных разновидностей шунгитоносных руд [232]. Помимо углерода и минеральной фазы, шунгитовые породы обычно содержат в незначительных количествах растворимые органические вещества, представленные соединениями алифатического ряда, прежде всего 71 насыщенными кетонами и эфирами, имеющими разветвленное строение, с очень незначительной примесью ароматических соединений [233]. Новую волну интереса к шунгитовому углероду вызвало обнаружение в шунгитовых породах фуллеренов (методы просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения и масс-спектрометрии) [234]. Эксперименты по экстракции с использованием традиционных органических растворителей не дали ответа на вопрос о нахождении и концентрации фуллеренов в шунгитах [235]. В основе всех этих работ лежало предположение о молекулярном характере связи фуллеренов в шунгитах. В последнее время широко изучаются ковалентные и донорно-акцепторные соединения фуллеренов как результат взаимодействия с нуклеофильными молекулами. Отметим, что следовые количества С60 экстрагируются из шунгитового углерода методом коллоидной экстракции с использованием полярных растворителей [236]. В связи с этим вновь встал вопрос об условиях формирования и консервации фуллеренов и фуллереноподобных структур в природных условиях [237]. Так, выявлено морфологические подобие глобулы шунгитового углерода и фуллеренов: наличие внутренней полости и двухмерная гексагональноподобная ячейка углеродных атомов с характерной анизотропией искажений, понижающей ее симметрию до тригональной [238]. Наноразмерные углеродные частицы (гигантские фуллерены, луковичные частицы, нанотрубки), представляющие собой слоевые структуры с расстоянием между графитоподобными плоскостями 0,35 нм, обнаружены в порошке шунгитового углерода [239]. Многослойные сфероидальные частицы углерода диаметром 100 нм образуют углеродные пленки на поверхности кварцевых зерен лидита (шунгитовая порода с содержанием углерода 3%). Агрегированные наночастицы выделены при автоклавном растворении кварца в липиде [240]. В связи с наличием специфических сложностей, для точной диагностики структурных форм собственно углеродистого вещества комлексно применяются различные методы, а именно рентгеноструктурный, электронографический и электронно-микроскопический. Отметим, что все эти методы характеризуют прежде всего атомарно-молекулярную структуру и ряд других свойств, а также микротекстурные особенности исследуемого объекта. Надмолекулярная структура является одним из характеристических признаков шунгитов, что служит причиной сравнения надмолекулярных структур шунгитов Карелии и шунгитоподобного вещества месторождения Бакырчик [241,242]. 1.6 Анализ литературного обзора и постановка задач исследования Представленный обзор литературы показал, что тема поиска новых биосорбентов для очистки сточных вод и почв от загрязнителей – остается весьма актуальной уже на протяжении многих лет. 72 В то же время казахстанские шунгитовые породы до сих пор не нашли широкого практического применения. Есть попытки использования уникальных свойств этого материала в медицинских целях, в качестве сорбентов. Было впервые проведено исследование местных шунгитовых пород месторождения «Большевик», в сравнении с промышленным техническим углеродом, с целью использования их в качестве заменителя последнего при наполнении композиционных материалов. Установлено, что шунгитовые породы с высоким содержанием углерода (40-50 %) являются более активными наполнителями эластомерных композиций, по сравнению с низкоуглеродистыми породами и даже промышленной сажей. Показана возможность использования казахстанских шунгитовых пород в качестве заменителя технического углерода при производстве композиционных материалов (на примере резиновых смесей) без изменения технологии их изготовления и с перспективой улучшения физико-механических свойств готовых изделий. Исследования показали, что шунгитовый сорбент может служить прекрасным носителем при модифицировании его ионами металлов и использовании в катализе многочисленных химических процессов. В биотехнологии иммобилизация шунгитового сорбента (имеющего развитую поверхность) специально подобранными микроорганизмами открывает широкие возможности для использования в биокаталитических процессах. Выявление возможности использования местного шунгитового сырья в качестве носителя для иммобилизации клеток микроорганизмов с целью очистки природных объектов от техногенных загрязнителей было определено основной целью работы. Достижение поставленной цели требует предварительного решения ряда научных и практических задач таких, как исследование структуры казахстанских шунгитовых пород в сравнении с российским шунгитом; получение из шунгитовых пород углеродного концентрата заданного состава; изучение его физико-химических и технических характеристик; разработка фундаментальных и технологических основ создания новых углеродсодержащих материалов из Казахстанского сырья; выделение из образцов почвы и воды, загрязненных нефтью и пестицидами деструктивных микроорганизмов и их идентификация; исследование способности свободных и иммобилизованных клеток микроорганизмов ассимилировать различные углеводородные субстраты; определение степени очистки загрязненной нефтью, пестицидами и тяжелыми металлами воды и почв иммобилизованными клетками микроорганизмов на модельной лабораторной установке. 73 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1 Оборудование и физико-химические методы анализа В исследовании были использованы известные методы получения сорбентов, методы определения физико-химических свойств сорбентов: ИКС, СЭМ, элементный анализ, Раман спектроскопия, РФА, газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием, метод БЭТ, ААС, флуориметрический метод (таблица 5). Методы определения количества клеток высевом на плотные питательные среды и определение нефтеокисляющей активности свободных и иммобилизованных клеток штаммов-деструкторов, определения морфолого-культуральных свойств микроорганизмов, генетическая идентификация бактерий на основании анализа нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена, ПЦР. 2.2 Характеристика объектов исследования Модифицированные углеродминеральные сорбенты для очистки природных объектов от техногенных загрязнений; в качестве объектов исследования были использованы шунгитовые породы, отобранные на месторождениях «Бакырчик» (ВКО РК) и «Зажогино» (Россия); активные штаммы микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненной почвы и воды месторождения «Ботахан» Атырауской области: АТ-1 (Pseudomonas stutzeri), АТ-3 (Bacillus atrophaeus), АТ-4 (Isoptericola variabilis); месторождения «Жанаозен» Западно-Казахстанской области г.Актау: АК-1; из шлама Алматинской области Sh-3 (Pantoea vagans), Sh-4 (Pantoea ananatis); из почвы загрязненной пестицидами Балхаш-Алакольского региона: P-1, P-2, P-3, P-4; из аэробного ила HSAAP (Holston Army Ammunition Plant, США): US-2 (Mycobacterium sp.), US-3 (Rhodococcus opacus), US-4 (Rhizobium sp.); аэробный ил HSAAP (Holston Army Ammunition Plant, США); раствор БТЭК (бензол, толуол, этилбензол, ксилол), питьевая вода из водопровода г.Жезказгана (№1, №2), техническая вода из медеплавильного завода ТОО Корпорации КАЗАХМЫС, сточные воды из водохранилища Кенгир, г.Жезказгана. 74 Таблица 5 - Физико-химические методы анализа и оборудование № Физикохимические методы анализа Стажировка Испания (университет Сантьяго де Компостелла) 1 Инфракрасная спектроскопия IR-ft 2 Сканирующая электронная микроскопия JSM-6360LV JEOL 3 Элементный анализ 4 Раман спектроскопия ICP-OES Optima 4300 PV, TruSpec CHN Macro, TruSpec AddOn Module S - 6 Рентгенодифра кционный - Стажировка США (Технологический институт Стивенса) FT IR 670 NECUS с микроскопом Thermo Nicolet IB-SEM via VCT-100 SEM ZEISS AURIGA – Oxford instruments X-Max ICP-OES VISTA MRX NICOLET ALMEGA XR ―Dispersiv Raman‖ с микроскопом Ultima IV X-Ray Difractometer Оборудование Казахский национальный АТУ университет имени аль-Фараби Национальная Испытательн Аккредитованная нанотехнологическа ый Центр ИЛ «Пищевая я лаборатория ЦФХМА безопасность» открытого типа (ННЛОТ) FT IR Растровый электронный микроскоп Quanta 200i 3D Рентгенофлуоресце нтный микроанализатор "ФОКУС-М2" - - - - Зондовый сканирующий микроскоп-Integra Spectra - - - - 76 анализ 7 Газовая хроматография - Газовый хроматограф с массспектрометрическим детектированием Varian GS-MS - 8 Метод БЭТ - - 9 Атомноадсорбционная спектрофотоме трия Флуорометриче ский анализ - Micromeritics ASAP 2010 (Accelerated Surface Area and Porosimetry System) - - Газовый хроматограф с массспектрометр ическим детектирован ием Agilent 6890 N Анализатор удельной поверхности - Сорбтометр - - - - - Спектрофотоме трия Тринокулярный микроскоп - - - - 10 11 12 Газовый хроматограф Кристалл 4000 Атомноадсорбционный спектрофотометр Квант Z.ЭТА Анализатор жидкости Флюорат-02 Спектрофотометр UNICO Тринокулярный микроскоп Micros TX 300 со встроенной видеокамерой 77 2.3 Характеристика растворителей, приготовление рабочих растворов В исследование были использованы следующие реактивы: - ГСО «HC BTEX Mix», C=2000mg/l (ppm) в метаноле; - Гексан для УФ-спектроскопии, о.с.ч., производства фирмы «Криохром»; - Хлороформ, х.ч. или ч.д.а. ГОСТ 20015-88; - Кислота соляная, х.ч. ГОСТ 3118-77; - Натрия гидроксид х.ч. ГОСТ 4328-77; - Кислота азотная по ГОСТ 11125, особой чистоты или по ГОСТ 4461, очищенная методом перегонки; - Аргон газообразный высокой чистоты по ГОСТ 10157 или азот газообразный по ГОСТ 9293; - Палладий металлический, порошок (99,94%) по ГОСТ 14836; - Нитрат магния 6-водный по ГОСТ 11088, ч.д.а. - Вода бидистиллированная, в ряде случаев деионизованная (дистиллированная вода по ГОСТ 6709, перегенная повторно или пропущенная через колонку с ионообменной смолой по ГОСТ 202898); -ГСО гексахлорбензол (ГХБ), α-Гексахлорциклогексан (α-ГХЦГ), βГексахлорцикпогексан (β-ГХЦГ), γ-Гексахлорциклогексан (γ-ГХЦГ), ДДТ, гептахлор, альдрин; - Петролейный эфир, температура кипения 40°С - 60°С; - Ацетон по ГОСТ 2603; - н-Гексан; -Диэтиловый эфир по ГОСТ 22300; - Сульфат натрия безводный по ГОСТ 416; - Силикагель по ГОСТ 3956. 2.4 Питательные среды для культивирования микроорганизмов В лабораторных условиях микроорганизмы культивируются в питательных средах. Питательные среды используются с целью исследования обмена веществ культур и получения продуктов их метаболизма, а также для скопления, выделения и хранения микроорганизмов [243-244]. В ходе работы были приготовлены различные питательные среды: - для гетеротрофных микроорганизмов: Мясопептонный бульон (МПБ); - питательная среда для выделения нефтеокисляющих микроорганизмов; -питательная среда для выделения бактерий способных к использованию пестицидов. 2.5 Культивирование микроорганизмов К культуральным, или морфологическим свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. Изучение роста гетеротрофных микроорганизмов проводилось на плотных питательных средах. Для культивирования бактерилогической культуры на плотной питательной среде готовим разведение. Посев. На чашки Петри разливают по 15-20 мл среду агар-агар. После застывания агара из разведений пипеткой сеем 0,1 мл суспензии, стеклянным шпательем (Дригальский шпатель) распределяем по всей поверхности питательной среды. После посева чашки Петри инкубируем в термостате 24 часа при 300 С [245]. 2.6 Методы исследования морфологических и культуральных свойств микроорганизмов В ходе работы используются классические морфолого-культуральные методы микробиологии. Строение и морфология клеток микроорганизмов изучалось с помощью микроскопа [243]. В исследовании морфологии микроорганизмов использовался тринокулярный микроскоп модели Micros TX 300 со встроенной видеокамерой [246]. 2.7 Методы генетической идентификации микрорганизмов ДНК выделялось методом KateWilson [247]. Измеряли концентрацию ДНК спектрофотометрическим методом с использованием спектрофотометра NanoDrop при длине волны 260 нм, а также проводили качественную оценку ДНК электрофоретическим методом [248]. Реакция ПЦР была выполнена с универсальными праймерами [249] 8f5’ – AgAgTTTgATCCTggCTCAg-3 и 806R- 5’ggACTACCAgggTATCTAAT в общем объеме 30 мкл. ПЦР смесь содержала 150 нг. ДНК, 1Ед. MaximaHotStartTaqDNAPolymerase (Fermentas), 0,2 mM каждого дНТФ, 1-х ПЦР буфер (Fermentas), 2,5 mMMgCl2, 10 пмоль каждого праймера. Программа ПЦР амплификации включала длительную денатурацию 95°С в течение 7 минут; 30 циклов: 95°С – 30 секунд, 55°С- 40, 72°С – 1 минута; заключительная элонгация 7 минут при 72°С, ПЦР программа была выполнена с применением амплификатора GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) [248]. Очистку ПЦР продуктов от не связавшихся праймеров проводили, ферментативным методом используя, ExonucleaseI (Fermentas) и щелочную фосфатазу (Shrimp Alkaline Phosphatase, Fermentas) [250]. Реакцию секвенирование проводили с применением BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applide Biosystems) согласно инструкции производителя, с последующим разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе 3730xl DNA Analyzer (Applide Biosystems) [248]. Нуклеотидные последовательности 16S rRNA гена 3 идентифицируемых штаммов были анализированы и объединены в общую последовательность в программном обеспечении SeqScape 2.6.0 (Applide Biosystems). После чего были удалены концевые фрагменты (нуклеотидные последовательности праймеров, фрагменты, имеющие низкий показатель качества) что позволило нам получить нуклеотидную последовательность протяженностью более 650 79 п.н., которые были идентифицированы в [248]. Gene Bank по алгоритму BLAST 2.8 Методы адсорбционной иммобилизации Приготовление носителей. Сорбенты (шунгитовые породы) взвешывали по 1г и распологали в колбы (вместимость 250 мл). Добавляли 100 мл дистиллированной воды и стерилизовали 1 раз (1 атмосфера 30 минут). После стерилизации сорбенты высушиваются в сушильном шкафу до сухой массы Приготовление суспензии. Для получения биомассы микроорганизмов состав среды и температура должны быть оптимальными [251]. Для получения биомассы микроорганизмов в виде суспензии микроорганизмы культивируются в питательном агаре 24 часа при температуре 30°. Поверхность клеток, выросших на плотной питательной среде агара льем физиологический раствор Полученные клетки центрифугируются (5000 об/мин, в течении 6 минут, 3 раза). Супернатант выливаем, оставшуюся массу переносим в стерильную колбу. Туда же добавляется физиологический раствор, измеряется оптическая плотность суспензии клеток на спектрофотометре UNICO, в стандартных кюветах (длина волны 670 нм) между 0,8-1,0. 100 мл суспензии перемешиваем с носителем, колбу ставим на качалку на 24 часа при комнатной температуре, 220 об/мин. Каждые 1, 3, 5, 7, 10, 20 и 24 часа отбирали пробы на измерение оптической плотности суспензии. Чтобы измерить процент иммобилизации используем формулу(1): Dик% = 100 %_ Dоп • 100 (1) Dнач здесь, D% - процент иммобилизации Dнач– начальная оптическая плотность суспензии Dоп – оптическая плотность проб в данное время. Определение десорбционных (не прекрепленные носителям) свойств клеток. Измеряется оптическая плотность на спектрофотометре UNICO и определяется количество не прикрепленных клеток на биокатализаторе (показатель десорбции). К полученному биосорбенту (биокатализатор) добавляем 100 мл физиологического раствора и ставим на качалку на 15 мин, после этого измеряется оптическая плотность суспензии. Показатель десорбции клеток микроорганизмов измеряется формулой (2): (2) Dдес % = Dдес ∙ D ик (24часа) Dоп (24часа) Dдес - показатель оптической плотности десорбции D ик (24ч) – процент иммобилизации Dоп (24ч) – оптическая плотность суспензии [252]. 80 2.8.1 Исследование очистки раствора BTEX (бензол, толуол, этилбензол, ксилол) с иммобилизованными на шунгит микроорганизмами Для построения изотерм в образцы шунгита (0,05 г) добавляли раствор BTEX в разных соотношениях и размещали на шейкер. Для измерения концентрации BTEX в газовом хроматографе после 3 и 10 дней отбирали пробы. Иммобилизация микроорганизмов на сорбенте шунгита проводилась в специальных колонках (d=20 см, l=1,5 см) (рис.7). Колонки заполнялись на 75% объема концентратом шунгита. Для жизнедеятельности микроорганизмов объемом на 1 л колбы приготавливалось оптимальная питательная среда (K2HPO4=0,5 г, NH4Cl=1,0г, MgSO4•7H2O=0,2 г, FeSO4•7H2O=0,01г, CaCl2•7H2O =0,01 г, глюкоза=10 г, вода=1000 мл, раствор микроэлементами =1 мл). В соотношениях 5:1 питательная среда и микроорганизмы перемешивались, и со скоростью 0,3 мл/мин опускались в колонки с помощью специальных трубочек. Длительность процесса иммобилизации были 3 дня. После окончания иммобилизации проверялась способность очистки раствора BTEX (рис.8). Для этого на 1 и 2 колонки были добавлены иммобилизованный микроорганизмами концентрат шунгита, а 3, 4 и 5 колонки был добавлен концентрат шунгита. Заполненные концентрат шунгитом колонки 1-4 также добавили раствор BTEX концентрацией С=80 мг/л, а в 5 колонку только воду. Регистрировали изменения концентрации БТЭК по времени. Общая схема иммобилизации микроорганизмов и очистки раствора BTEX с сорбентами и биосорбентами приведена ниже (рис. 2, 3). 75% шунгит 1 2 3 4 Рисунок 2 - Иммобилизация микроорганизмов на шунгите 1,2- шунгит; 3-насос; 4- питательная среда+микроорганизмы 81 6 Cf (время) Cf (время) 1 2 Cf (время) 3 Cf (время) 4 Cf (время) 5 9 7 8 Рисунок 3 - Очистка от БТЭК с использованием сорбентов 1,2- шунгит + микроорганизмы; 3,4,5- шунгит; 6- БТЭК; 7,8- насос; 9-вода 2.9 Исследование физико-химических свойств шунгитового сорбента Для определения насыпной плотности н сорбент, высушенный при температуре 110 С, насыпали порциями по 20 см3 в цилиндр объемом 100 см3 (Н=240 мм); цилиндр постукивали дном о деревянный диск в течение 0,5 минут в наклонном положении; затем цилиндр взвешивали с точностью до 50 мг [253]. Суммарный объем пор определяли объемом воды, заполняющей поры при кипячении. Для определения 10 см3 сорбента известной массы кипятили в течение 15 мин с 100 см3дистиллированной воды с последующим охлаждением и доведением объема смеси до исходного значения. Затем суспензию фильтровали на воронке Бюхнера в течение 3 мин. Влажный сорбент взвешивали и по разности определяли массу воды в порах [253]. Удельную поверхность образцов определяли на анализаторе удельной поверхности – Сорбтометр, а так же методом БЭТ на приборе Micromeritics ASAP 2010. рН водной вытяжки определяли при 3-минутном кипячении 5 г предварительно тонкоразмолотого сорбента в 50 см3 дистиллированной воды с обратным холодильником, с последующим фильтрованием суспензии через бумажный фильтр и охлаждении ее перед измерением рН [253]. Влажность сорбента определяли по разнице масс исходного образца массой 1 г и высушенного при 110 С в течение 1 ч в бюксе по формуле (3): Х m1 m 2 100% , m1 (3) где m1 - масса навески образца до высушивания, г; m2 - масса навески образца после высушивания, г. Зольность сорбента определяли по разнице масс исходного образца массой 1 г и прокаленного при 900С в течение 2 ч по формуле (4): Х m1 m 2 100% , m1 (4) 82 где m1 - масса навески образца до прокаливания, г; m2 - масса навески образца после прокаливания, г. Адсорбционную активность по йоду проводили следующим образом: пробу высушивали при 110-115 С в сушильном шкафу до постоянной массы. 1г высушенного образца помещали в коническую колбу емкостью 250 см3, добавляли 100 см3 раствора йода в йодистом калии, закрывали пробкой и встряхивали в течение 30 мин. Затем раствору давали отстояться, осторожно отбирали пипеткой Мора 10 см3, помещали в коническую колбу емкостью 50 см3 и титровали раствором тиосульфата натрия в присутствие крахмала до исчезновения синей окраски. Одновременно проводили определение начального содержания йода в растворе, для этого 10 см3 раствора йода в йодистом калии титровали раствором тиосульфата натрия, добавив в конце титрования раствор крахмала [254]. Адсорбционную активность сорбента по йоду в % вычисляли по формуле (5): X (V1 V2 ) 0,0127 100 100% , 10 m (5) где V1 – объем 0,1 н раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование 10 см3 раствора йода в йодистом калии, см3; V2 – объем 0,1 н раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование 10 см3 раствора йода в йодистом калии после обработки сорбентом, см3; 0,0127 – масса йода, соответствующая 1 см3 0,1 н раствора тиосульфата натрия, г; 100 – объем раствора йода в йодистом калии, взятый для осветления сорбентом, см3; 10 - объем раствора йода в йодистом калии, взятом для титрования, см3; m - масса навески сорбента, г. За результат анализа принимали среднее арифметическое результатов трех параллельных определений, абсолютное расхождение между которыми не превышает допускаемое расхождение, равное 3 % [254]. 2.9.1 Элементный анализ шунгитовых пород Как известно, элементный анализ имеет важнейшее значение в химической технологии. Во время научных исследований очень важно иметь точную картину состава вещества с целью контроля цепи превращений химических реакций. Среди инструментальных методов анализа широко распространены рентгенофлуоресцентная, атомно-эмиссионная (в том числе с индуктивносвязанной плазмой), атомно-абсорбционная спектрометрия, спектрофотометрия и люминесцентный анализ. Электрохимические методы (полярография, потенциометрия, вольтамперометрия и др.), масс-спектрометрия (искровая, лазерная, с индуктивно-связанной плазмой и др.), различные варианты активационного анализа. Методы локального анализа и методы анализа 83 поверхности (электроннозондовый и ионнозондовый микроанализ, ожеэлектронная спектроскопия и т. п.) и др. При выборе метода и методики анализа учитывают структуру анализируемых материалов, требования к точности определения, пределу обнаружения элементов, чувствительности определения, селективности и специфичности, а также стоимость анализа, квалификацию персонала, скорость проведения анализа, уровень необходимой пробоподготовки и наличие необходимого оборудования. В работе проведены элементный анализ шунгитовых пород на оптикоэмиссионном спектрометре ICP-OES Optima 4300 PV (Испания) и ICP-OES VISTA MRX (США). Содержание С, Н, N, S в шунгитовых породах и концентратах определяли методом сжигания на приборах TruSpec CHN Macro и TruSpec Add-On Module S (Испания). Для построения градуировочного графика использовались стандартные растворы Na, K, Ca, Mg, Al, Fe, Ti, Si и Р необходимой концентрации. Для удобства интерпретации результатов диапазон градуировки выбирали таким образом, чтобы ожидаемые концентрации определяемого элемента в исследуемых пробах находились в средней части градуировочного графика. Регистрация аналитического сигнала и обработка результатов градуировки выполнялась на базе программного обеспечения персонального компьютера, связанного с оптико-эмиссионным спектрометром. Градуировочные графики зависимости эмиссионного поглощения от массовой концентрации элементов представлены на рисунке 4. Рисунок 4- Градуировочные графики зависимости эмиссионного поглощения от массовой концентрации элементов Si, P Подготовку проб проводили в микроволновой печи – MarsXpress, с использованием метода кислотного разложения [255]. 2.9.2 ИК-спектроскопический анализ шунгитовых пород Инфракрасная (ИК) спектроскопия является одним основных методов анализа органических соединений. Современная ИК-спектроскопия представляет собой экспресс-метод установления структурных особенностей 84 органических соединений. С помощью ИК-спектроскопии быстро и надѐжно идентифицируются разнообразные функциональные группы: карбонильная, гидроксильная, карбоксильная, амидная, амино, циано и др.; а также различные непредельные фрагменты: двойные и тройные углерод-углеродные связи, ароматические или гетероароматические системы. В ИК-спектрах органических соединений можно выделить три основные области: 1. 4000-2500 см-1. Область валентных колебаний простых связей X–H: O– N–H, C–H, S–H. 2. 2500-1500 см-1. Область валентных колебаний кратных связей X=Y, X≡Y: C=C, C=O, C=N, C≡C, C≡N. 3. 1500-500 см-1. Область валентных колебаний простых связей X–Y: C–C, C–N, C–O и деформационных колебаний простых связей X–H: С–H, O–H, N–H. Эта область также называется ‖областью отпечатков пальцев‖, т.к. положение и интенсивность полос поглощения в этом диапазоне сугубо индивидуальны для каждого конкретного органического соединения. Только по полному совпадению частот и интенсивностей линий в этой области ИК-спектра можно говорить об идентичности сравниваемых объектов. При интерпретации ИК-спектров наиболее информативными являются области 2500-1500 см-1 и 4000-2500 см-1. Анализ первой из них позволяет определить в структуре соединения непредельные фрагменты: C=C, C≡C, C=O, C=N, C≡N, ароматические и гетероароматические ядра. Полосы поглощения в области 4000-2500 см-1 позволяют однозначно идентифицировать такие функциональные группы как O–H, N–H, S–H, а также различные типы связей углерод–водород Csp3–H, Csp2–H, Csp–H, (O=)C–H (альдегид). Поэтому, рекомендуется начинать рассмотрение ИК-спектров именно с этих двух областей. При обнаружении в них характеристичных полос валентных колебаний определенных типов связей рекомендуется дополнительно найти полосы соответствующих деформационных колебаний в области 1500-500 см-1, например, в случае связей O–H, N–H, С–H [256] . ИК-спектроскопический анализ шунгитовых пород проводили на ИКспектрофотометре IR-ft (Испания) и FT IR 670 NECUS с микроскопом Thermo Nicolet (США). Для подготовки твердых образцов, прессовали таблетки KBr, содержащие тонкодисперсный образец исследуемого материала. 2.9.3 Сканирующая электронная микроскопия Известно, что электронная микроскопия является одним из наиболее эффективных методов изучения структуры материалов, составленных частицами малых размеров. Методы сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) для анализа материалов нашли широкое применение в решении конкретных научных и технологических задач вследствие их высокой информативности и достоверности получаемых результатов исследования [257,258]. Известно, что физико-механические свойства материалов определяются их микроструктурой, 85 которая зависит от электронного строения, химического состава и технологии их получения. У исследователей при изучении структурного состояния часто возникают методические трудности при выборе методов и методик исследований, типа прибора и т.д. [259-261]. CЭМ позволяет одновременно исследовать размеры и форму зерен, распределение зерен и фаз по размерам, определить состав фазы и распределение химических элементов по ее площади и по площади исследуемого образца, химическую неоднородность по площади шлифа, а также получить изображение объекта в широком диапазоне увеличений во вторичных и отраженных электронах. Объектом исследования в СЭМ являются такие образцы, как шлиф, излом, порошки различной дисперсности, пленки, покрытия и т.п. [262] Электронные микроскопические снимки полученных материалов на основе шунгитовых пород были выполнены на сканирующем электронном микроскопе JSM-6360LV JEOL (Испания), IB-SEM via VCT-100 SEM ZEISS AURIGA – Oxford instruments X-Max (США), растровом электронном микроскопе Quanta 200i 3D (КазНУ). Подготовка объектов исследования На РЭМ могут исследоваться как шлифы, так и поверхности объектов без предварительной подготовки. Изготовление шлифов к исследованию на РЭМ в общем осуществляется так же, как и для светомикроскопического исследования. Однако есть и некоторые особенности. Большая глубина резкости изображения в РЭМ позволяет получать дополнительную информацию, проводя глубокое травление шлифов. В то же время при получении изображений в отраженных электронах шлифы травлению не подвергаются. Размеры образцов для РЭМ определяются габаритами камеры микроскопа. Образцы должны быть электропроводящими. Для обеспечения их хорошего электрического контакта с предметным столиком и для фиксации образцов при наклоне стола используют специальные токопроводящие клеи. При исследовании не проводящих ток материалов – диэлектриков на их поверхность наносится напылением тонкая пленка электропроводников – золото, графит и т. д. При работе с органическими материалами нужно учитывать, что при длительном контакте зонда с образцом возможно его термическое разрушение. Перед испытанием образцы должны быть тщательно очищены, чтобы не образовывались газообразные продукты, затрудняющие получение требуемого вакуума при откачке микроскопа и загрязняющие его колонну. Рекомендуется проводить очистку образцов в различных растворителях с использованием ультразвука [263]. 2.9.4 Раман спектроскопия Рамановская спектроскопия известна как эффективный неповреждающий подход, дающий детальную информацию на молекулярном уровне. Рамановская спектроскопия широко используется для изучения углерода в различных его кристаллических и аллотропных модификациях. 86 Комбинационное рассеяние света – бесконтактный неразрушающий способ анализа структуры вещества. Основной идеей метода рамановской спектроскопии является регистрация неупруго рассеянного образцом света с последующей расшифровкой полученного спектра путем сравнения полученных частот колебаний с характеристическими, которые уникальны для каждого вещества. Преимущества, связанные со специфической природой метода, делают Рамановскую спектрометрию мощным средством анализа и мониторинга химического состава. Каждое соединение имеет свой уникальный Рамановский спектр. В зависимости от применяемой аппаратуры, эта техника может быть использована для анализа твердых веществ, растворов, а также предоставлять информацию о физических характеристиках исследуемой среды, таких как кристаллическая решетка, ориентация, полиморфные формы и т.д. Спектроскопия комбинационного рассеяния, молекулярная спектроскопия, использующаяся при неупругом рассеянии света, позволяют идентифицировать колебательные состояния молекул (фононы). В результате, спектроскопия комбинационного рассеяния дает бесценный аналитический инструмент для получения «отпечатков пальцев» молекул, а также мониторинг изменений в структуре молекулярных связей (например, изменения состояния и напряжений и деформаций. По сравнению с другими колебательными методами спектроскопии, такими, как ИК-Фурье и БИК, комбинационное рассеяние имеет несколько основных преимуществ. Эти преимущества связаны с тем, что эффект Рамана проявляется в рассеянном, а не в поглощенном образцом свете. В результате, спектроскопия комбинационного рассеяния практически не требует подготовки образцов и нечувствительна к полосе поглощения воды. Это свойство комбинационного рассеяния света облегчает измерение твердых тел, жидкостей и газов, не только напрямую, но и через прозрачные контейнеры, такие как стекло, кварц и пластик. Регистрация спектров комбинационного рассеяния света (КРС) производилась на зондовом сканирующем микроскопе - INTEGRA SPECTRA (КазНУ) и NICOLET ALMEGA XR ―Dispersiv Raman‖ с микроскопом (США). При этом использовался лазер с длиной волны излучения 473 нм. Спектры регистрировались с 20 секундным накоплением. INTEGRA SPECTRA – это уникальная интеграция сканирующего зондового микроскопа с конфокальной микроскопией/спектроскопией люминесценции и комбинационного рассеяния (КР). Отличительной чертой нанолаборатории ИНТЕГРА Спектра является возможность исследовать оптические свойства объектов за пределом дифракционных ограничений. СБОМ и эффекты локального усиления комбинационного рассеяния (TERS — Tip Enhanced Raman Scattering), дают возможность картировать распределение оптических свойств (пропускание, рассеяние, поляризация света и др.), а также осуществлять спектроскопию комбинационного рассеяния с разрешением до 50 нм в плоскости XY. Разработчики НТ-МДТ первыми создали коммерчески 87 доступный прибор для работы с TERS. И нанолаборатория ИНТЕГРА Спектра была награждена R&D 100 Award как лучшая разработка 2006 г [264]. КР - спектроскопия, являясь неразрушающим методом анализа, зарекомендовала себя как эффективный способ изучения реакционноспособных соединений [265–268], открывая широкие возможности исследования агрессивных веществ в среде активных жидкостей и газов, под высоким давлением паров и т.д. По сравнению сомногими другими методами спектрального анализа он не требует специальной пробоподготовки и учѐта возможного взаимодействия материала наполнителя и пробы, а также позволяет исследовать образцы, находящиеся в запаянных стеклянных (кварцевых) трубках и капиллярах, которые обладают высокими коррозионностойкими качествами, могут эксплуатироваться при температурах до 1200 – 1400°С и способны выдерживать, при определѐнных условиях, внутренние давления до 100 –200 атм [269]. Возможность проведения исследования веществ в различных агрегатных состояниях (твѐрдое тело, жидкость, газ) при изменении внешних условий в одной экспериментальной ячейке и анализ получаемых в таких условиях колебательных спектров позволяет провести структурные и аналитические исследования, не доступные другими методами [270]. 2.9.5 Рентгенодифракционный анализ При исследовании многокомпонентных углеродных систем особую роль приобретает рентгенографический количественный фазовый анализ. Этот метод позволяет, наряду с уверенной диагностикой любого углеродного компонента, однозначно определять динамику и механизм фазовых преобразований природных или синтетических углеродных систем в процессе воздействия на них различных физико-химических факторов. Рентгенографический анализ шунгитовых пород осуществляли на приборе Ultima IV X-Ray Difractometer. Кванты отраженного рентгеновского луча возбуждают в счетчике импульсы тока, они преобразуются в импульсы напряжения и подаются на самопишущий прибор – на диаграммной ленте записывается интенсивность импульсов в зависимости от угла поворота счетчика. Общий вид дифрактограммы приведен на рис. 6. Рисунок 6- Рентгенограмма кварца, снятая на дифрактометре 88 Подготовка образцов к анализу Для получения четких рентгенограмм необходимо тщательно готовить образцы для анализа. Самым распространенным является метод порошка, в котором образец растирают в тонкий порошок (до прохождения через сито № 008), который затем наносится на поверхность пластинки из оргстекла с помощью органических клеев (БФ, цапонлак) либо запрессовывается в таблетку. При этом необходимо помнить, что плохо растертый порошок дает нечеткие рентгенограммы. В то же время, при чрезмерном перетирании могут произойти полиморфные превращения или возникнуть напряжения в кристаллах, что приведет к искажению дифракционной картины. Расшифровка рентгенограмм В результате расшифровки рентгенограммы должен быть получен ответ на вопрос: какие кристаллические фазы входят в состав анализируемого материала. Рентгенограмму, полученную на рентгеновском дифрактометре, называют дифрактограммой. Она записана на диаграммной ленте в координатах I – 2, где I – интенсивность дифракционного пика, мм; 2– угол поворота счетчика в угловых градусах; причем отсчет углов на дифрактограмме ведется справа налево. На этой же ленте автоматически проставлены отметки углов – они, как правило, идут через один градус (перед началом расшифровки это следует уточнить по реперным точкам, которые проставлены на диаграммной ленте оператором). Расшифровка дифрактограммы осуществляется в следующей последовательности: – Обнаруживают пики и нумеруют их справа налево. – Через основания пиков проводят базисную линию. Это может быть прямая или ломаная линия, касающаяся максимального количества точек дифрактограммы снизу. – Для каждого пика определяют угол 2 с точностью до 0,01 градуса. Это легко сделать, когда вершина пика совпадает с отметкой угла на диаграммной ленте. Если вершина пика лежит между отметками углов, то доли градусов из пропорции находят, измерив в миллиметрах расстояние между двумя соседними отметками углов и расстояние от правой отметки угла до положения вершины пика. Например, вершина пика находится между 43 и 44 градусами. Следовательно, угол 2 содержит 43 полных градуса. Доля градуса рассчитывается из пропорции отрезков (рис. 7). Угол 2, соответствующий данному пику, равен 43° + х°. 89 Рисунок 7 - Расчет углов на дифрактограмме – Для каждого пика, зная угол поворота счетчика 2, находят угол отражения . – Для каждого пика определяют абсолютную интенсивность (Iабс, мм), измерив его высоту от базисной линии до вершины. Затем находят относительную интенсивность (Iотн, балл), приняв за 10 баллов интенсивность самого высокого пика (Imax) на дифрактограмме. Интенсивность является вспомогательной характеристикой в качественном рентгенофазовом анализе. – Для каждого пика по значениям угла , пользуясь уравнением Вульфа–Брэгга рассчитывают межплоскостное расстояние d с точностью до 0,001 A. Все результаты измерений заносят в таблицы. На этом первичная обработка дифрактограммы заканчивается, и начинается исследование фазового состава материала. Таблица 6- Результаты расшифровки дифрактограммы Определение фазового состава основано на том, что каждое индивидуальное кристаллическое вещество имеет свой набор межплоскостных расстояний d и дает специфическую дифрактограмму с определенным набором пиков. Анализ облегчается, если предположительно известно, какой материал зафиксирован на дифрактограмме. Из справочных таблиц находят рентгеновские константы (межплоскостные расстояния d и относительные интенсивности пиков Iотн), характеризующие предполагаемое вещество (фазу). Идентификацию каждой фазы начинают с пиков наибольшей интенсивности: сравнивают d максимального пика на дифрактограмме с межплоскостным расстоянием наибольшего табличного. Если они совпадают полностью или отличаются незначительно, то продолжают сравнение менее интенсивных пиков. Если на дифрактограмме выявлено 3–5 пиков, принадлежащих одному веществу (фазе), значит можно утверждать, что данное вещество (фаза) присутствует в 90 материале, с которого снята эта рентгенограмма. В столбце 6 таблицы указывают для соответствующих пиков идентифицированную фазу. При идентификации фаз необходимо учитывать следующее: 1) в полиминеральных системах возможны наложения пиков от двух, а иногда и более, фаз; 2) из-за наличия дефектов в кристаллической решетке вещества возможны смещения d в ту или иную сторону; 3) интенсивность пиков зависит от концентрации данного вещества в образце, поэтому некоторые пики, приведенные в стандартной табличной картотеке, могут быть не обнаружены на рентгенограмме из-за малого количества данной фазы; 4) рентгенограммы природных минералов и твердых растворов не обязательно однозначны, отдельные межплоскостные расстояния могут «гулять» в достаточно большом диапазоне вокруг табличных значений; 5) и наконец, существует возможность, что совершенно различные вещества будут иметь похожие рентгенограммы. Все эти обстоятельства указывают на то, что необходимо иметь представление о наличии возможных фаз в исследуемом образце. По окончании работы после заполнения таблицы делается вывод, в котором указывается наличие или отсутствие предполагаемых фаз на дифрактограмме [271]. 2.9.6 Адсорбционные методы исследования поверхности. Метод БЭТоснованный на определении удельной поверхности и размеров пор Адсорбционные характеристики шунгитовых пород изучали методом Брунауэра - Эммета-Теллера (БЭТ) по низкотемпературной адсорбции жидкого азота на американском приборе «Micromeritics ASAP 2010». Адсорбционные методы исследования свойств поверхности позволяют количественно охарактеризовать происходящие при адсорбции межмолекулярные взаимодействия адсорбат-адсорбент и адсорбат-адсорбат, определить термодинамические характеристики адсорбционного равновесия (например, теплоту и энтропию адсорбции), а также исследовать геометрические параметры адсорбента (величину удельной поверхности, объем пор и распределение пор по размерам, характерные для данного материала) [272-274]. Такие исследования необходимы для понимания факторов, управляющих адсорбционными процессами и обеспечивающих возможность выбора и разработки эффективных адсорбентов с необходимыми для решения конкретных задач свойствами. Теоретические модели адсорбции Развитие теории адсорбционных сил еще не достигло такой стадии, когда по известным физико-химическим свойствам газа и твердого тела можно было бы рассчитать изотерму адсорбции, не проводя экспериментальных исследований. Поэтому попыткам описать экспериментальные изотермы с помощью различных теоретических уравнений, которым соответствуют определенные модели адсорбции, посвящено огромное количество работ. Если 91 теоретическое уравнение изотермы адсорбции хорошо воспроизводит экспериментальные данные, то можно рассчитать неизвестные величины адсорбции при разных условиях (р и Т) и определить различные геометрические параметры твердых тел. Модель БЭТ Знаменитая теория полимолекулярной адсорбции Брунауэра, Эммета и Теллера, получившая название теории БЭТ (по первым буквам фамилий ученых), основана на модели адсорбционного процесса, предложенной Ленгмюром. Однако в модели БЭТ учтена возможность адсорбции как на первом, так и на втором, третьем и т.д. слое уже адсорбированных молекул и, следовательно, возможность полимолекулярной адсорбции. Основной практической целью применения метода БЭТ является нахождение площади поверхности пористого твердого тела. Для этого получают экспериментальную зависимость адсорбции от давления при постоянной температуре (изотерма адсорбции), после чего по уравнению БЭТ вычисляют величину и, затем, число молекул в монослое. Зная площадку, занимаемую одной молекулой, можно рассчитать суммарную площадь поверхности адсорбента любой формы и пористости. Принято считать, что метод БЭТ можно использовать для определения площади поверхности с точностью 5–10% в интервале значений относительного давления ( ) 0,05–0,35. Для более детального анализа пористой структуры твердого тела (вычисление доли пор различного диаметра в общей пористой структуре) по изотермам адсорбции используют дополнительные расчетные модели. В методе используются следующие допущения: поверхность адсорбента однородна; взаимодействие адсорбент–адсорбат сильнее, чем адсорбат– адсорбат; взаимодействие адсорбированных молекул учитывается только в направлении, перпендикулярном поверхности, и рассматривается как конденсация. Линейная форма изотермы адсорбции (уравнения БЭТ) имеет вид (6) где — отношение давления в системе к давлению конденсации, — величина адсорбции, — объем монослоя на поверхности адсорбента, C — отношение констант адсорбционного равновесия в первом слое и константы конденсации. При С = 1 и небольших значениях р уравнение БЭТ переходит в уравнение Ленгмюра. В качестве адсорбатов для определения удельной поверхности твердых тел по методу БЭТ из экспериментальных изотерм, измеренных при температуре кипения жидкого азота (77 К), наиболее подходящими являются азот или криптон с "посадочной" площадкой молекулы 0,16 и 0,2 нм2 соответственно. Модель БЭТ неоднократно критиковали, поскольку трудно представить себе абсолютно однородные поверхности. Кроме того, реальные экспериментальные данные свидетельствуют о боковых взаимодействиях адсорбированных молекул между собой. Некоторые 92 исследователи пытались усовершенствовать теорию БЭТ или получить другие модельные изотермы, однако и по сей день метод БЭТ является основным для определения удельной поверхности твердых тел, в том числе адсорбентов и катализаторов. Следует отметить, что адсорбционный метод является практически единственным способом определения величины поверхности непористых порошков и лучшим методом расчета внутренней поверхности пористых твердых тел, если, конечно, поры доступны по своим размерам для адсорбции исследуемых молекул [272-274]. 2.10 Определение содержания углеводородов в почве и воде Нефть и продукты ее переработки – типичные загрязнители окружающей среды. В системах контроля качества природных вод, почв, воздуха их относят к обязательно нормируемым компонентам. Для определения нефтепродуктов (НП) в объектах окружающей среды (ООС) используют достаточно широкий ассортимент методов анализа, приборов и стандартных образцов состава (СО) для их градуировки. Нефть и разнообразные нефтепродукты представляют собой сложные смеси различных по природе компонентов, концентрации которых различаются на несколько порядков. В объектах окружающей среды под действием физических, химических и биологических процессов происходит быстрая трансформация НП. Поэтому задачи определения НП в воде, почве, воздухе, растительном материале, гидробионтах очень сложна и трудоемки. Для их решения привлекают самые разнообразные методы предварительного выделения, разделения, концентрирования и конечного определения НП. В аналитической практике принято считать ―нефтепродуктами‖ сумму неполярных и малополярных углеводородов (алифатических, алициклических, ароматических), растворимых в гексане и не сорбирующихся на оксиде алюминия [8, 9]. Применение методов анализа, в которых за ―нефтепродукты‖ принимают суммарное содержание всех органических веществ, извлекаемых каким бы то ни было растворителем, недопустимо. Следовательно, при определении НП в ООС следует устранить мешающее влияние всех веществ других классов [8]. Определение НП включает, как правило, стадии их концентрирования и отделения мешающих веществ. В литературе описан ряд методов концентрирования НП: жидкофазная, твердофазная, сверхкритическая флюидная и газовая экстракция, различные хроматографические методы (адсорбционная, распределительная, осадочная и газовая хроматография). Мешающие определению НП вещества чаще всего отделяют методом колоночной хроматографии на оксиде алюминия, силикагеле или фторосиле. В методе тонкослойной хроматографии стадии концентрирования НП и отделение мешающих определению веществ сочетаются [10]. Данные о предельно-допустимых концентрациях (ПДК) нефтепродуктов в различных типах вод приведены в табл.7[13]. 93 Таблица 7- Нормативы содержаний НП (мг/дм3) в различных водах [13] По данным [16] содержание НП в грунтах в Украине регламентировано временно допустимой концентрацией, которая по расчетам УкрНИИ почвоведения и агрохимии, Межведомственного экологического центра НАН Украины и Минэкобезопасности Украины составляет 4000 мг/кг. В России в соответствии с СанПин 2.1.7.1287-03 ПДК нефтепродуктов в почве установлена равной 300 мг/кг. Таблица 8- Оценка степени загрязнения почв нефтью и НП 2.10.1 Флуорометрический метод определения массовой концентрации нефти в воде и почве Флуориметрический метод [275] основан на экстракции нефтепродуктов гексаном, очистке при необходимости экстракта с последующим измерением интенсивности его флуоресценции, возникающей в результате оптического возбуждения. Метод отличается высокой чувствительностью (нижняя граница диапазона измерений 0,005 мг/литр), экспрессностью, малыми объемами анализируемой пробы (100 см3) и отсутствием значимых мешающих влияний липидов. Методика определения НП флуориметрическим методом изложена в нормативных документах [276-278]. В формировании аналитического сигнала участвуют только ароматические углеводороды. Поскольку они обладают различными условиями возбуждения и регистрации эмиссии, наблюдается изменение спектра флуоресценции экстракта в зависимости от длины волны возбуждающего света. При возбуждении в ближней УФ, а тем более в видимой области спектра, флуоресцируют только полиядерные углеводороды. 94 Поскольку их доля мала и зависит от природы НП, наблюдается очень сильная зависимость аналитического сигнала от типа НП. При анализе проб неочищенных сточных вод, а также по результатам контроля коэффицента пропускания гексанового экстракта пробы требуется дополнительная очистка экстракта на хроматографической колонке, заполненной оксидом алюминия. Перед выполнением измерений должны быть проведены следующие работы: отбор проб, градуировка анализатора жидкости «Флюорат-02» и контроль чистоты гексана. После этих операции пробу воды 100 см3 перенсли в делительную воронку вместимостью 250 см3. При помощи пипетки отбирали 10 см3 гексана и ополаскивали им сосуд, в котором находилась проба. Смесь экстрагировали, интенсивно встряхивая 1 мин. Дали отстать до появления прозрачного верхнего слоя, который отделяли, перенося в кювету, и измеряли массовую концентрацию нефтепродуктов в экстракте на анализаторе жидкости «Флюорат-02» в режиме «Измерение». Одновременно фиксировали пропускание раствора, которое наряду с измеренным значением массовой концентрации выводится на дисплей анализатора. Если массовая концентрация нефтепродуктов в экстракте выше 10 мг/дм3 или пропускание экстракта менее 0,5 (50 %), то экстракт разбавляют. 2.10.2 Определение содержания углеводородов в почве и воде методом газовой хроматографии Метод ГХ основан на разделении углеводородов нефти на неполярной фазе в режиме программирования температуры. Нефтепродукты экстрагируют из пробы CCl4 или гексаном, полученный экстракт очищают методом колоночной хроматографии на оксиде алюминия и очищенный экстракт анализируют. Градуировка проводится с использованием смеси дизельного топлива и смазочного масла. Нижняя граница диапазона измерений согласно стандарту ISO 9377-2:2000 составляет 0,1 мг/литр, хотя известны методики ГХ определения НП, в которых эта граница составляет 0,02 мг/литр. Таким образом, метод ГХ пригоден для анализа проб, содержащих нефтепродукты на уровне ПДК. Продолжительность регистрации хроматограммы составляет 20– 30 мин. Газовая хроматография с масс-спектральным детектором [279] позволяет не только определять суммарное содержание НП (как другие методы), но и идентифицировать и определять количественно индивидуальные углеводороды, входящие в состав нефтепродуктов. Последнее обстоятельство дает возможность более реально обнаружить источник нефтяного загрязнения (определить тип и марку НП) и принять меры к ликвидации последствий загрязнения [280]. Определение содержания углеводородов в почве и воде осуществляли на приборах: Газовый хроматограф с масс-спектрометрическим детектированием Varian GS-MS; газовый хроматограф с масс-спектрометрическим детектированием Agilent 6890 N; газовый хроматограф Кристалл 4000. 95 2.10.3 Определение содержания углеводородов в почве ИКспектрометрическим методом Для мониторинга нефтяных УВ наиболее распространен метод ИКспектрометрии, который позволяет определять сумму алифатических УВ и ПАУ. При этом измеряют содержание как нефтяных УВ антропогенного происхождения, так и продуцируемых морскими организмами [281]. Соответствующие методики анализа основаны на экстракции НП из пробы органическим растворителем (CCl4 или хладон 113), очистке экстракта от полярных соединений методом колоночной хроматографии на оксиде алюминия и последующей регистрации ИК-спектра в области 2700–3200 см-1, обусловленного валентными колебаниями CH3- и CH2-групп алифатических и алициклических соединений и боковых цепей ароматических углеводородов, а также связей CH ароматических соединений. ИК-спектроскопия применима для анализа природных вод и промышленных стоков при концентрации нефтяных углеводородов от 0,1 до 50 мг/литр (при использовании кюветы с длиной оптического пути 10 мм), не требует отгонки растворителя и нагрева экстракта, что исключает потерю УВ с низкой температурой кипения. Преимущество метода ИК-спектроскопии – меньшие потери легких фракций, чем при определении НП другими способами [280]. Нижняя граница диапазона измерения – 0,05 мг/литр. Основное достоинство метода – слабая зависимость аналитического сигнала от типа нефтепродукта, составляющего основу загрязнения пробы. Трудности, возникающие при использовании этого метода, связаны с мешающими влияниями липидов и других полярных соединений при их высоком содержании, при котором оказывается исчерпанной емкость хроматографической колонки, применяемой для очистки экстракта. Основной недостаток метода – его неэкологичность, обусловленная применяемыми высокотоксичными растворителями. В силу указанных причин можно прогнозировать, что уже в ближайшие годы неизбежна замена ИКспектроскопии другими методами, в первую очередь методом газовой хроматографии. Для определения содержания углеводородов в почве ИКспектрометрическим методом был использован прибор FT-IR. 2.11 Определение тяжелых металлов в воде методом ААС Метод атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС) обладает высокой экспрессностью и точностью, низким пределом обнаружения . Его основное преимущество перед другими методами в высокой селективности, простоте подготовки проб к анализу и возможности определения нескольких элементов из одного раствора по единой методике. Метод позволяет с большой точностью определять в растворах до 70 элементов в малых концентрациях (10-4 – 10-9 % масс.), поэтому он широко применяется в биологии, медицине, геологии, а также в металлургии для контроля технологических процессов. 96 Атомно-абсорбционный спектральный анализ основан на селективном поглощении УФ- или видимого излучения атомами газа. Для перевода пробы в газообразное атомарное состояние применяются два вида устройств атомизации: пламенные и электротермические. В качестве источника излучения обычно применяют лампу с полым катодом из определяемого металла. Интервал длин волн спектральной линии, испускаемой источником света, и линии поглощения того же самого элемента в пламени очень узок, поэтому поглощение других элементов практически не сказывается на результатах анализа. Атомно-абсорбционные элементные анализаторы относятся к современным селективным и высокоточным приборам. Вариантом атомной спектроскопии является атомно-эмиссионная спектроскопия, для которой характерен обратный способ регистрации, т.е. по оптическому спектру испускания возбужденных атомов. Наиболее перспективным считается вариант с индуктивно связанной плазмой (ИСП), не уступающий по чувствительности атомно-абсорбционным атомизаторам, но имеющий в 10 – 100 раз более широкий диапазон определяемых концентраций. При этом атомно-эмиссионные анализаторы позволяют одновременно определять в пробе несколько элементов, но, к сожалению, уступают атомно-абсорбционным спектрометрам по воспроизводимости и селективности. При определении тяжелых металлов в воде был использован атомноадсорбционный спектрофотометр Квант Z.ЭТА. 2.12 Определение пестицидов в почве методом газовой хроматографии Газовая хроматография позволяет точно, быстро и с высокой чувствительностью определять пестициды, экстрагированные из почвы, осадочных пород и тканей растений. После предварительной обработки пробы проводят экстракцию анализируемого образца почвы углеводородным растворителем. Экстракт концентрируют; полярные соединения удаляют пропусканием сконцентрированного экстракта через колонку, заполненную оксидом алюминия. Полученный экстракт концентрируют. Элементарную серу при необходимости удаляют из сконцентрированного экстракта обработкой сульфитом тетрабутиламмония. Экстракт анализируют газохроматографическим методом. Разделение соединений проводят с использованием капиллярной колонки с неподвижной фазой низкой полярности. Детектирование осуществляют электронозахватным детектором (ЭЗД). Для более надежной идентификации детектированных соединений и найденных концентраций необходимо проведение дополнительных исследований. Подтверждение полученных данных можно осуществить повторным проведением газохроматографического анализа с использованием колонки другой полярности и/или проведением анализа методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии (ГХ/МС). Настоящий метод позволяет 97 проведение идентификации и количественного определения прочих нелетучих хлорорганических соединений, например, некоторых хлорбензолов. Определение содержания пестицидов в почве осуществляли на газовом хроматографе Кристалл 4000. 98 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Изучение физико-химических характеристик шунгитовых пород Казахстана и России Методами элементного анализа, ИК-спектроскопии, электронной микроскопии, Раман спектроскопии и рентгенофазового анализа изучены физико-химические характеристики шунгитовых пород Казахстана (месторождение «Бакырчик») и России (месторождение «Зажегино»). Определено содержание углерода в шунгитовых рудах этих месторождений. При исследовании элементного состава было установлено, что минеральная часть шунгитовых пород представлена, в основном, оксидами кремния, алюминия, кальция, магния, калия, натрия, железа и титана. ИКспектроскопические исследования показали, что в концентрате помимо полициклических углеводородов, содержащих метиленовые группы, появляются карбоксильные группы. Методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) выявлено, что в результате флотационного обогащения и термической активации шунгитовых пород по углероду можно получить более развитую поверхностную структуру и пористость. Методом комбинационного рассеяния света показана структурная близость шунгитового углерода стекловидному углероду. Рентгенодифракционный анализ (XRD) природных шунгитовых пород показал, что исследуемые образцы представлены суммой углеродистого вещества и ряда минеральных компонентов: кварц, иллит, бассанит, бургерит, мусковит. Показана идентичность шунгитового углерода месторождения «Бакырчик» с шунгитом месторождения «Зажогино» Россия. Установленные физико-химические характеристики позволяют определить направления использования углеродного концентрата для решения экологических и технологических задач. Обогащение шунгитовых пород Необходимым требованием, предъявляемым к сырьевым материалам, используемым в технологическом переделе, является постоянство химического и гранулометрического составов. По этой причине нами были проведены работы по стабилизации состава шунгитовых материалов путем флотационного обогащения, которое проводили на флотационной машине ФМ2М. Стабилизация состава предусматривает приведение исходной шунгитовой породы, содержание по углероду колеблется от 1,5 до 30 %, к постоянному химическому составу. Установлено, что использование в качестве собирателя – керосина и пенообразователя - Flotol позволяет в одну стадию без дополнительной перечистки увеличивать содержание углерода до 40,0 % . Режимы и результаты флотации представлены в таблице 1. 99 Таблица 9- Реагентные режимы и результаты флотационного обогащения Расход флотореагентов, см3 (на 1 кг породы) № оп регулятор, пенообразова ыт собиратель, жидкое тель, Flotol В а керосин стекло Выхо д конце нтрат а, % 1 2 1 - 40,2 2 2 1 5 40,6 Содержа Извлече ние ние углерода, углерода, % мас. % 44,1* 1,1** 40,9* 1,1** 93,4 93,8 *- содержание углерода в концентрате **- содержание углерода в хвостах Образцы 1 и 2 аналогичные в исходном состоянии различие составляет реагентный режим. 3.1.1 Элементный анализ шунгитовых пород Результаты элементного анализа (табл.10) показывают, что содержание углерода, азота, водорода и натрия в образцах шунгитовох пород месторождения «Бакырчик» после флотационного обогащения заметно увеличивается, а содержание кремния, алюминия, магния, калия, натрия, кальция и железа – соответственно уменьшается. Таблица 10 - Элементный состав шунгитовых пород Компоненты Шунгитовая порода месторождения «Бакырчик» C S N H SiO2 Na2O MgO К2О CaO Fe2O3 + FeO 17,7 0,2 0,3 0,02 52,0 1,4 2,2 2,3 2,8 4,2 Углеродный концентрат шунгитов месторождения «Бакырчик» 45,2 0,8 0,5 0,7 37,3 0,2 1,3 0,2 0,5 3,2 Шунгитовая порода месторождения «Зажогино» 31,3 0,9 0,4 0,1 42,7 2,0 0,2 1,1 0,2 9,5 100 Al2O3 16,3 9,7 11,4 TiO2 P 0,7 0,1 0,3 0,1 0,1 0,1 Данные химического состава шунгитовых пород месторождения «Бакырчик» показывают идентичность со стратифицированными шунгитами месторождения «Зажогино» II разновидности по углероду, а в зависимости от состава силикатной основы с среднекремнистой разновидностью. 3.1.2 ИК-спектроскопический анализ шунгитовых пород ИК-спектроскопическое исследование шунгитов позволило получить дополнительную информацию о структуре шунгитового углерода и качественном составе функциональных групп на их поверхности. ИК-спектры исследуемых образцов представлены соединениями с карбонильной (16001800 см-1), карбоксильной (1000-1300 см-1), гидроксильной (362520 см-1), карбоновых кислот (353020 см-1) и аминной (3500-3300 см-1) группами, что характеризует их сходство с промышленными активированными углями растительного происхождения. На рис. 8 видно, что на ИК-спектрах шунгитовой руды месторождения «Бакырчик» наблюдаются характеристические полосы поглощения ОН гидроксильных групп (3627,43 см-1), NH2 (3412,46, 3480,92 см-1), ОН группы карбоновых кислот (3551,38 см-1), С-Н (2860,74 см-1), С=С (1617,02 см-1), С=О (1637,63 см-1), СН2 (2973,92, 1375,85 см-1), С-С валентные колебания ароматического кольца (1424,51 см-1), С–О (1270,83 см-1), С–ОН (1028,71 см-1), дизамещенного бензола (797,76, 700,57 см-1). В ИК-спектрах углеродных концентратов шунгитов этого месторождения (рис.9) наблюдаются характеристические полосы поглощения ОН группы карбоновых кислот (3551,66 см-1), NH2 (3474,66, 3412,88 см-1), С-Н (2879,45 см-1), С=О (1640,28, 1613,81 см-1), СН2 (2917,55, 1380,12 см-1), С-С валентные колебания ароматического кольца (1413,81 см-1), С–О (1215,37 см-1), С–ОН (1087,69 см-1), С=С ароматического кольца (1024,28 см-1), дизамещенного бензола (793,29, 710,07 см-1). На рис. 10 представлены ИК-спектры шунгита месторождения «Зажогино», на которых наблюдаются характеристические полосы поглощения ОН группы карбоновых кислот (3549,97 см-1), NH2 (3473,68, 3411,58 см-1), С-Н (2870,53 см-1), С=О (1638,93, 1619,86 см-1), СН2 (2960,15, 1379,18 см-1), С-С валентные колебания ароматического кольца (1435,24 см-1), С–О (1207,15 см-1), С–ОН (1085,96 см-1), С=С ароматического кольца (1047,12 см-1), дизамещенного бензола (754,65, 696,06 см-1). 101 Рисунок 8 – ИК-спектры шунгитовой породы месторождения «Бакырчик» Рисунок 9 – ИК-спектры углеродных концентратов шунгитов месторождения «Бакырчик» Рисунок 10 – ИК-спектры шунгитов Карелии месторождения «Зажогино» 3.1.3 Сканирующая электронная микроскопия При исследовании элементного анализа шунгитов Казахстана установлено, что даже при наличии повышенного содержания минеральной составляющей в углеродной матрице, в отличие от карельских шунгитов, поверхность скола по 102 большей части вскрывает именно углеродную матрицу. Сканирующие электронно-микроскопические снимки подобных скоплений частиц представлены на рис. 11,12,13. а б в г д е Рисунок 11 – Фрагменты СЭМ изображения шунгитовой породы месторождения «Бакырчик» при различном увеличении Как видно из рис. 11 образцы представлены плотными образованиями с прочными агломератами. В результате физико-механических воздействий на шунгитовую руду (дробление, измельчение и пенная флотация) происходит изменение поверхностной структуры материала (рис. 12). а б в г д е Рисунок 12 - Фрагменты СЭМ изображений углеродного концентрата шунгитов месторождения «Бакырчик» при различном увеличении 103 Сканирующие электронно-микроскопические исследования казахстанских шунгитов и углеродных концентратов показали схожесть морфологической картины поверхности скола - пластинчато-ступенчатая, в отличие от карельских, имеющих, как правило, округлые формы субмикрообособлений на поверности скола (рис. 13). При этом форма и размеры пластин казахстанских шунгитов были весьма разнообразны – от чешуйчатых до остроугольных. Хотя торцы пластин чаще всего ровные и прямые, отмечаются и зазубренные края с треугольными зубцами. Слои представлены как субпараллельными рядами пластинчатой формы, так и веерообразно-расходящимися. а б в г д е Рисунок 13 - Фрагменты СЭМ изображений шунгитов Карелии Сканирующими электронно-микроскопическими исследованиями шунгитовых пород и концентратов установлено, что в результате физикомеханического воздействия можно получать углеродные материалы с более развитой поверхностной структурой и повышенной пористостью. 3.1.4 Раман спектроскопия Исследование структуры шунгитовой породы проводили также методом комбинационного рассеяния света. На рис. 14, 15, 16 приведены спектры КР шунгитового углерода в интервале волн 200–3200 см-1. Известно, что в спектрах КРС аморфного углерода наблюдаются, как правило, две полосы – G(graphite) полоса с частотой волны около 1560 см-1 и D(diamond) полоса с частотой около 1350 см-1, обуcловленные sp2 связями [19]. G полоса обусловлена растяжением пар sp2 связей в углеродных кольцах и цепях, а D полоса – изменчивостью значений кристаллографических осей Lа, Lс в углеродных цепях. Интенсивность полосы D является в известной степени мерой структурной разупорядоченности углерода [20]. Для шунгитовых пород 104 месторождений «Бакырчик» и «Зажогино» эти полосы наблюдаются на 1353 см1 , 1589 см-1 и 1356 см-1, 1576 см-1 соответственно, т.е. имеет место так называемый «синий сдвиг» для G полосы и «красный» сдвиг для D полосы (рис. 13, 14). Рисунок 13 - Спектр комбинационного рассеяния света шунгитовой породы месторождения «Бакырчик» Колебания в области 2696 см-1, 2935 см-1 и 2704 см-1, 2957 см-1 на спектрах шунгитовой породы месторождения «Бакырчик» и «Зажогино» свидетельствуют о структурной близости шунгитового углерода со стекловидным углеродом. На спектрах шунгитовой породы месторождения «Зажогино» можно увидеть поглощения спектров в области 204 см-1 и 458 см-1 которые встречаются в спектрах наночастиц. Рисунок 14 - Спектр комбинационного рассеяния света шунгитовой породы месторождения «Зажогино» 105 Рисунок 15 - Спектр комбинационного рассеяния света шунгитовых концентратов месторождения «Бакырчик» Интенсивность На спектре углеродных концентратов шунгитов месторождения «Бакырчик» (рис.15) наиболее интенсивными также являются G и D полосы, характерные для углеродных структур. Сопоставление Раман-спектров шунгитовой породы и концентратов месторождений «Бакырчик» (рис. 13, 15) выявляет их сходство. Раман-спектры образцов шунгитового углерода представляет собой типичные спектры углеродных поликристаллов графитовой структуры с малыми размерами зерен и состоят из двух широких полос с максимумами при 13551360 см1 и 15861605 см1, так называемых D и G полос. 4 3 3 2 2 1 1 Волновое число, см-1 (а) (б) 106 Рисунок 16 - Рамановские спектры по данным источника [21], некристаллического (а), по большей части графитообразного углерода и кристаллического графита (б); (а) 1 – древесный уголь, 2 – кокс, 3 – алмазоподобный углерод, 4 – стеклоуглерод; (б) 1 – природный графит, 2 – высокоориентированный пиролитический графит, 3 – поликристаллический графит. Выводы об аморфном состоянии шунгитового углерода, полученные Рамановской спектроскопией, являются подтверждением ранее полученных результатов методом рентгенографического анализа. Данный метод подтверждает вывод о том, что исследуемый материал является аморфным, поскольку кристаллиты ориентированы хаотично и имеют малые размеры. Раман-спектры на рисунке 16 представленны на основании публикации [21,22], для различных форм аморфного углерода. Нетрудно заметить, что в зависимости от структурного состояния углерода на рамановских спектрах изменяются ширина линий и отношение интенсивностей D/G. Например, высоко разупорядоченный углерод, такой как древесный уголь или кокс, имеет очень широкие пики, тогда как пики стеклоуглерода и поликристаллических графитов являются более узкими. На спектре кристаллического графита D полоса вовсе отсутствует. Сопоставление Раман-спектров на рис.10 выявляет сходство спектров шунгитового углерода cо стекловидным углеродом. 3.1.5 Рентгенодифракционный анализ Ранее нами были проведены XRD исследования шунгитовых пород Казахстана и сопоставлены с литературными данными для шунгитов «Зажогино» [21]. Проведение рентгенографических исследований шунгитовых пород было нацелено на изучение структуры и фазового состава шунгитового углерода. Для шунгитового углерода месторождения «Бакырчик» определены следующие рентгенографические параметры: межслоевое расстояние d002, степень графитизации Сг, размеры областей когерентного рассеивания Lа и Lc вдоль кристаллографических осей а и с. Шунгитовый углерод диагностируется по рефлексу с межслоевым расстоянием d002 0,35 нм в районе 18 32 . Были рассчитаны межслоевое расстояние, размеры областей когерентного рассеяния вдоль кристаллографических осей а и с: La - средний диаметр уложенных в пачки плоских фрагментов молекул, Lc - средняя толщина пачек, данные представлены в таблице. Как видно из таблицы 11, шунгитовый углерод характеризуется незначительными размерами областей когерентного рассеяния: в пределах 8,2 нм – по диаметру сетки и 2,6 нм – по толщине пакета. Данные рентгенодифракционного анализа дают право идентифицировать углерод месторождения «Бакырчик», как шунгитовый по структуре схожий с шунгитом месторождения «Зажогино». 107 Таблица 11 - Результаты минералогического состава шунгитов № пробы природны й шунгит d002, нм Lc, нм La, нм 0,348 2,6 - 0,354 2,3 0,34 3,3 рентгенодифракционного и C, % Минералогич еский состав шунгитовых пород 2,00 20,0 Гидрослюды, кварц, пирит, мусковит, бассанит и бургерит 7,0 1,20 60,0 Кварц, гидрослюды, бассанит и бургерит 9,5 - 32,0 Кварц, Мусковит, Углерод Lc 10 2 Cг d 002 3,35 концентра т Шунгит Зажогино⃰ анализа ⃰ - по данным [21]. В составе минеральной части шунгитовой руды и углеродного концентрата месторождения «Бакырчик» содержатся гидрослюды типа гидромусковита (иллита). Кроме связанного в гидрослюдах оксида кремния, в породе обнаруживается кварц, мусковит, бассанит и бургерит. Данные таблицы 3 показывают, что существенных изменений структурных параметров графитоподобной компоненты при использовании указанных выше приемов обогащения практически не происходит. Выявленные структурные и физико-химические особенности шунгитовых пород не вызывают сомнения, что именно суммарный эффект присутствия углерода и минеральных составляющих, обусловливают уникальное сочетание свойств пород в целом, что определяет перспективы их практического использования для эффективного решения экологических и технологических задач [23,24]. Полученные в ходе выполнения научные результаты могут найти применение во многих областях химической, пищевой и нефтехимической промышленностях. Реализация предложенной технологии обогащения шунгитовых пород существенно расширяет сырьевую базу углеродных материалов. 3.1.6 Метод БЭТ-основанный на определении удельной поверхности и размеров пор 108 Были определены физико-химические свойства шунгитового углеродминерального сорбента которые представлены в табл. 12. Таблица 12 – Физико-химические свойства углеродных сорбентов Наименование показателя Насыпная плотность, г/см3 Влажность, % Зольность, % Удельная поверхность, м2/г Удельный объем пор по предельному заполнению, см3/г Адсорбционная активность по йоду, % Средний размер пор, нм Шунгитовый сорбент месторождения «Бакырчик» 0,74 0,17 6,15 42,83 0,018 Шунгитовый сорбент месторождения «Зажегино» 0,70 0,33 10,05 11,671 0,005 24,43 18,31 1,716 1,718 Безвредность шунгитового углерод-минерального сорбента для окружающей среды, его доступность (производится из местного сырья и имеет невысокую себестоимость в отличие от других известных углеродных сорбентов) позволили использовать шунгитовый сорбент в качестве носителя для иммобилизации клеток нефтеокисляющих микроорганизмов с целью очистки природных объектов от нефти. 3.2 Выделение и идентификация нефтеокисляющих бактерий Первоначально были проведены исследования по очистке синтетической сточной воды от органических загрязнителей с помощью микроорганизмов, которые включали в себя: адсорбцию клеток микроорганизмов; получение биокатализаторов на основе адсорбированных клеток; изучение деструктивных свойств полученных биокатализаторов. В результате этих работ были отобраны штаммы микроорганизмов, которые показали активный рост в среде с нефтью. Для получения биокатализаторов необходимо выделять активные штаммы-деструкторы, непосредственно из нефтезагрязненной территории. Нами проведено изучение микрофлоры почв Ботаханского месторождения для выделения активных штаммов нефтеокисляющих микроорганизмов. Из выделенных культур деструктивную способность в отношении к сырой нефти показали 3 штамма. Генетическая идентификация выделенных активных штаммов деструкторов проводилась в НЦБ г. Астана. Альтернативой классической биохимической идентификации могут служить современные молекулярно-генетические методы. В 1980-х годах в практику вошел новый стандарт идентификации бактерий, позволяющий 109 идентифицировать микроорганизмы, не имея представлений о его биологических особенностях. C. Woeseс с сотрудниками установили, что филогенетические отношения бактерий могут быть определены путем сравнения высококонсервативной части генетического кода, что послужило началом развития интенсивно развивающейся универсальной системы идентификации. Высокая идентичность нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена, по сравнению с другими рРНК генами, позволила использовать его как стандартный генетический маркер для идентификации и таксономической классификации бактериальных разновидностей [15]. Идентификация 3 штаммов была осуществлена методом определения прямой нуклеотидной последовательности фрагмента 16S rRNA гена, с дальнейшим определением нуклеотидной идентичности с последовательностями, депонированными в международной базе данных GeneBank. Наименование штаммов и источник выделения представлены в табл. 13. Таблица 13 - Источники выделения и концентрация ДНК Образец Штамм 1 2 3 AT1 AT3 AT4 Источник выделения Почва Почва Почва Концентрация ng/ul 2173,5 591,3 759,9 260/280 1,99 1,91 2,03 В результате выделения ДНК были получены образцы ДНК с высокой концентрацией и хорошего качества. Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) был амплифицирован фрагмент 16S rRNA гена, молекулярной массой около 1000 пар нуклеотидов (п.н.) (рис.17) у всех идентифицируемых штаммов. Продукты ПЦР амплификации были использованы для определения нуклеотидной последовательности. Рисунок 17 – Электрофореграмма ПЦР – продуктов амплификации фрагмента 16SrRNA гена ДНК 1-3 – образцы, нумерация согласно п.н; М – маркер молекулярного веса (Fermentas) (100 – 1000 п.н., от 100 – 1000 шаг 100 п.н.) 110 После удаления концевых фрагментов (нуклеотидные последовательности праймеров, фрагменты, имеющие низкий показатель качества) были получены нуклеотидные последовательности протяженностью более 650 п.н., которые были идентифицированы в GeneBank по алгоритму BLAST [14]. При идентификации с использованием международной базы данных NCBI [16] были взяты виды с максимальной идентичностью. Результаты идентификации приведены в табл. 14. Таблица 14 Результаты идентификации последовательностей в международной базе данных Наименование Штамма АТ1 АТ3 АТ4 нуклеотидных Инвентарный номер Наименование Частота GeneBank штамма по результатам совпадения, идентификации % NC_018028.1 Pseudomonas stutzeri 99 NC_014639.1 Bacillus atrophaeus 100 NC_015588.1 Isoptericola variabilis 97 Официально признано, что идентичность в 97% нуклеотидной последовательности 16S rRNA гена является пороговым значением видовой характеристики [17]. Как видно из результатов, приведенных в таблице 2, идентифицируемые штаммы имеют максимальную идентичность. Таким образом, выделенные штаммы бактерий – нефтедеструкторов идентифицированы нами как представители видов Pseudomonas stutzeri - АТ1, Bacillus atrophaeus - AT3, Isoptericola variabilis - AT4. 3.3 Изучение адсорбционной способности клеток микроорганизмов на сорбентах Иммобилизованные микроорганизмы имеют несколько преимуществ наряду со свободными клетками, поэтому при помощи использования иммобилизованных клеток микроорганизмов в очистке загрязненных экосистем можно достичь высокой эффективности биоремедиации. На рис. 18 и 19 приведена динамика активности адсорбции ассоциации созданной из штаммов АТ1, АТ3 и АТ4 и монокультур к шунгитовым сорбентам Зажегино и Бакырчик. Как видно из данных рис.18, к 6 часам адсорбировалось 90% клеток штамма АТ1, а к концу эксперимента видно, что этот показатель изменился до 84%. В то время как штаммы клеток АТ3 и АТ4 показывает низкие показатели адсорбции (50 и 64% соответственно) по сравнении с АТ1, но к концу анализа повышается до 65% (АТ3) и 92 % (АТ4). Адсорбционная активность ассоциации первые 6 часов показывает 91%, к концу эксперимента этот показатель повышается до 95 %. 111 100 Адсорбированные клетки, % 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Время, час 0 0 5 АТ1 10 АТ3 15 АТ4 20 ассоциация 25 Рисунок 18– Адсорбционная динамика клеток микроорганизмов на сорбенте «Зажегино» Адсорбционная динамика клеток на сорбенте Бакырчик, как видно из данных рис.19, высока. В начале, до 6 часов клетки адсорбируются в следующих количествах: ассоциация – 97%, штамм АТ1 - 94%, штамм АТ3 – 93%, АТ4 - 90% адсорбированных клеток. К концу эксперимента показатели значительно не меняются, адсорбция штамма АТ1 достигает 95%, АТ3 – 98%, АТ4 – 95%, ассоциации – 98%. Адсорбированные клетки, % 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Время, час 0 0 5 АТ1 10 АТ3 15 АТ 4 20 ассоциация 25 Рисунок 19 - Адсорбционная динамика клеток микроорганизмов на сорбенте «Бакырчик» Таким образом, нами было определено что, ассоциация – деструктор, состоящая из штаммов микроорганизмов АТ1, АТ3 и АТ4, активно адсорбировалась на сорбентах Зажегино и Бакырчик – 95 % и 98 % по сравнению с монокультурами микроорганизмов. 112 3.4 Способность свободных микробных клеток к деструкции нефти Последние годы возник интерес к практическому применению микроорганизмов в очистке сточных вод техногенного загрязнения. К механизму очистки относятся биосорбция и взаимодействие нефтезагрязненных объектов с одноклеточными организмами [18]. Повышения эффективности работы биопрепаратов можно достигнуть используя клетки – деструкторы, иммобилизованные на различных носителях. Это связано с тем, что прикрепление клеток к твердым поверхностям обеспечивает высокую концентрацию микробных клеток в зоне их действия, предотвращает их вымывание, защищает от действия высоких концентраций токсичных компонентов нефти и создает возможность для увеличения удельной специфической деструктивной активности микрофлоры. Нами была изучена способность к деструкции органических веществ активных штаммов микроорганизмов, выделенных из месторождения «Ботахан», Атырауской области. В качестве органического вещества использовалась сырая нефть. Измеряли массовую концентрацию нефти на анализаторе жидкости «Флюорат-02». Эксперимент проводился в течение 30 дней в ротационном шейкере при комнатной температуре и скорости 220 об/мин. Начальная концентрация нефти составляла Снач= 4081,25 мг/л. В результате очистки нефтезагрязненной воды иммобилизованными на шунгите микроорганизмами, можно увидеть существенное уменьшение концентрации нефтепродуктов (рис. 20). 19,52 мг/л 20 мг/л 6,32 мг/л 2,74 мг/л 3,28 мг/л 4,3 мг/л 1,75 мг/л 2,45 мг/л Рисунок 20 – Остаточное количество нефти в воде после очистки Как видно из данных рис. 4, из биокатализаторов на основе сорбента Зажегино (Россия): Р АТ-1 и Р АТ-3 показывают высокую деструктивную способность по сравнению с Р АТ-4. Концентрация нефтепродуктов на 30-ые сутки понизилась от 4081,25 мг/л до 6,32 мг/л и 4,3 мг/л соответственно. Деструктивная активность Р-ассоциации высока (2,45 мг/л) по сравнению с биокатализаторами Р АТ-1, Р АТ-3 Р АТ-4. 113 Что касается биокатализаторов на основе сорбента Бакырчик (Казахстан), они показали такие же результаты как и биокатализаторы на основе Зажегино (Россия). Таким образом, проведен скрининг и идентификация активных штаммов микроорганизмов (P.stutzeri, B. аtrophaeus, Isoptericola variabilis), выделенных из почв Ботаханского нефтяного месторождения, района Макат Атырауской области; изучена иммобилизация клеток нефтеокисляющих бактерий на различных сорбентах (РАТ-1, РАТ-3, РАТ-4, КАТ-1, КАТ-3, КАТ-4). Установлено, что биосорбенты на основе штаммов ассоциации имеют более высокую деструктивную активность в отношении нефти по сравнению с монокультурами. В ходе определения деструктивной способности микроорганизмов, было выявлено существенное уменьшение содержания нефтепродуктов в водной среде, что в дальнейшем может служить основой для разработки микробиологического способа очистки водных акваторий от нефтяных загрязнений. 114 ЗАКЛЮЧЕНИЕ На основании полученных данных сделаны следующие выводы: 1. Изученые современными высокоразрешающими физико-химическими методами анализа характеристики шунгитовых пород Казахстана и России позволило установить структурные аналога шунгитовых пород этих месторождений. 2. Установлено, что шунгитовые породы представляют собой многофазную систему, в составе которой содержатся углеродистое вещество и минеральные составляющие. Минеральная часть шунгитовых пород представлена, в основном, оксидами кремния, алюминия, кальция, магния, калия, натрия, железа, титана. 3. Определены технологические параметры процесса обогащения: определен оптимальный фракционный состав исходной шунгитовой породы для получения пульпы обогащения, условия подачи флотореагентов. Использование в качестве флотореагентов собирателя – керосин (250 г/т) и пенообразователя - Flotol B (300 г/т) позволяет в процессе флотации в одну стадию без перечистки увеличивать содержание углерода до 40,0 % независимо от состава исходной шунгитовой породы. Углеродная составляющая шунгитовых концентратов вследствие более высокой адсорбционной активности может вступать в контакт с сорбатом гидрофобной частью, а кислородсодержащие группы при этом будут отвечать за хемосорбционные процессы. 4. Определена структура шунгитового углерода, дифракционная картина которого характерна для турбостратной углеродной структуры, состоящей из поликонденсированных ароматических сеток малого размера, уложенных параллельно в пакеты и азимутально не ориентированных друг относительно друга. Методом сканирующей электронной микроскопии показано, что шунгитовый углерод представляет собой сферические образования изометричной и дендритной формы. Значение межплоскостного расстояния для первого кольца варьирует в зависимости от размера и плотности скопления в пределах от 0,34 до 0,36 нм. 5. Установлено, что шунгит имеет турбостратную структуру подобно кристаллитам сажи, т.е. сложен параллельными графитоподобными слоями, неупорядоченно смещенными относительно друг друга. Показано, что шунгитовый углерод различается по степени упорядоченности графитоподобных слоев, причем наиболее разупорядоченный углерод наблюдается в породах с большим его содержанием. 6. Показана возможность использования шунгитового сорбента с иммобилизованными клетками микроорганизмов штаммов АТ-1 (Pseudomonas stutzeri), АТ-3 (Bacillus atrophaeus), АТ-4 (Isoptericola variabilis); АК-1; Sh-3 (Pantoea vagans), Sh-4 (Pantoea ananatis); P-1, P-2, P-3, P-4; US-2 (Mycobacterium sp.), US-3 (Rhodococcus opacus), US-4 (Rhizobium sp.); 115 микромицетов Fusarium, Aspergillus, Penicillum, Mucor для биоремедиации природных объектов от техногенных загрязнений. 7. Изученные иммобилизации клеток различных бактерий на шунгитовых сорбентах Казахстана и России показало что, гранулированные сорбенты являются эффективными носителями для клеток микроорганизмов. 8. Выделено 13, идентифицировано 8 новых штаммов бактерий Pseudomonas stutzeri, Bacillus atrophaeus, Isoptericola variabilis, Pantoea vagans, Pantoea ananatis, Mycobacterium sp.,Rhodococcus opacus, Rhizobium sp. 9. Представлены данные о микроорганизмах, выделенных из сточных вод и почв, проверена их сорбционная и деструктивная активность. 10. Изучение биоремедиации почвы и воды с использованием шунгитового сорбента с иммобилизованными микроорганизмами показало, что исследуемые биосорбенты имеют более высокую деструктивную активность по отношению к токсикантам по сравнению со сводными клетками. Оценка полноты выполнения поставленных задач. Задачи, поставленные в диссертационной работе, решены полностью, в частности: изучен и проведен анализ литературных данных по вопросам использования биосорбентов для борьбы с загрязнением почвы и воды; определены количественный составы токсикантов в почве и воде; наработаны опытные образцы сорбента и определены его основные физико-химические характеристики; определены основные сорбционные характеристики полученных материалов по отношению к токсикантам; проведены поиск и селекция природных деструктивных микроорганизмов; выделены штаммы деструктивных микроорганизмов; проведены идентификация и скрининг активных штаммов деструкторов; выбран наиболее перспективные штаммыдеструкторы; оптимизирован условия роста и развития углеводородокисляющей микрофлоры в периодических и непрерывных условиях с целью получения активной биомассы для биодеградации токсикантов; исследован процесс иммобилизации микроорганизмов – деструкторов на носителях; изучен сорбционные свойства сорбентов, иммобилизированных биологическими штаммами, по отношению к токсикантам; определен деструктивный активность сорбента с иммобилизованными клетками микроорганизмов по отношению к токсикантам в процессе биоремедиации почвы; выявлен оптимальные условия реабилитации загрязненных территорий в зависимости от природы и степени загрязнения; проведен дезактивационные работы на ключевых участках, местах пролива загрязнителей. Рекомендации по конкретному использованию результатов исследований. Полученные в работе результаты могут быть применены для разработки высокоэффективной технологии очистки воды и почв от нефти и нефтепродуктов, тяжелых металлов и пестицидов. Иммобилизованные микроорганизмы, перерабатывающие токсичные вещества в безопасные формы, могут найти применение во многих областях химической, аграрной и нефтехимической промышленностях, организациях в сфере экологии и охраны 116 природы и др. Внедрение в технологическую схему нового вида биопрепарата позволит снизить экологический ущерб перерабатывающих производств. Технико-экономический и научный уровень в сравнении с лучшими достижениями в данной области. Высокий научно-технический и практический уровень диссертации обеспечивается тем, что разработанные новые биосорбенты на основе шунгитовых пород характеризуются высоким сорбционным свойством по отношению к токсикантам. При реализации предложенной технологии существенно, повышается возможность импортозамещения аналогичных видов продукции, что особенно актуально для нашей страны. Предлагаемые нами биосорбенты могут быть использованы для очистки воды и почвы, что актуально для всех регионов республики и позволит решить ряд технологических и экологических задач. Исследование научно и практически полезен, так как связан с задачей существующей на сегодняшний день не только в Казахстане, но и в большинстве стран из-за постоянного использования в повседневной жизни химических веществ, загрязняющих воду и почву. Работа основана на фундаментальном принципе иммобилизации микроорганизмов, который является хорошо изученной процедурой в новых науках, таких как биотехнология. На сегодняшний день индустриализация привела к производству большого количества загрязняющих веществ, что являются причиной различных проблем возникающих со здоровьем. Преобразование их в нетоксичные полезные метаболиты с помощью микроорганизмов определяет актуальность работы. Высокий научный уровень полученных результатов подтверждается научными публикациями в зарубежных и республиканских научных журналах, а также трудах международных конференций и симпозиумов. 117 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1 Кощеенко К.А. Иммобилизованные клетки микроорганизмов и их применение // Иммобилизованные клетки микроорганизмов. (Теория и практика). – М., 1978. – С. 5-36. 2 Жубанова А.А., Баубекова А.С., Абишева Н.К., Кайырманова Т.К. Иммобилизация клеток дрожжей и бактерий на зауглероженные природные носители // Вестник КазНУ. Сер.экол., 2001. - № 2 (9). – С. 46-50. 3 Звягинцев Д.Г./ Взаимодействие микроорганизмов с твердыми поверхностями. – М.: Изд. МГУ, 1973.- 176 с. 4 Абиева Л.К. Экологическое состояние почвенного покрова территории нефтегазовых промыслов Восточного Прикаспия // «Нефть и газ». – 2004. – № 2. – С.105-109. 5 Ю.С. Другов, А.А. Родин. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов. Москва, БИНОМ. Лаборатория знаний, 2010, С. 6-20. 6 Техногенное загрязнение природных вод углеводородами и его экологические последствия / В.М. Гольдберг, В.П. Зверев, А.И. Арбузов и др. – М.: Наука, 2001 – 125 с. 7 Надиров Н. К. // Нефть и газ Казахстана. –Алматы. -Ч. 1.- 1995.- 400 с. 8 А.А. Абрасимов. Экология переработки углеводородных систем. Москва: Химия, 2002, С. 33-35. 9 Трофимов С.Я., Амосова Я.М., Орлов Д.С. и др. Влияние нефти на почвенный покров и проблема создания нормативной базы по влиянию нефтезагрязнений на почвы // Почвоведение. – 2000. – № 2. – С.30-33. 10 Кузнецов А.Е., Градова Н.Б. Научные основа экобиотехнологии // Москва, Мир, 2006. – 503 с. 11 Леоненко И.И., Антонович В.П., Андрианов А.М., Безлуцкая И.В., Цымбалюк К.К. // Методы определения нефтепродуктов в водах и других объектах окружающей среды (обзор) // Методы и объекты химического анализа, 2010, т.5, №2, с. 58-72. 12 httр://геvоlution.аllbest.ru/есоlogy/00049955_0.html. 13 Киреева Н.А. Использование биогумуса для ускорения деструкции нефти в почве // Биотехнология, 1995. - № 5-6. - С. 32-35. 14 Орлов Д.С., Бочарникова Е.А., Амосова Я.М. Изменение физикохимических свойств почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами // Тез. докл. респ. сем. «Экотоксикология и охрана природы». - Юрмала, Рига, 1988. С. 128-130. 15 Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. Уфа: Недра, 1994. – 171 с. 16 Пиковский Ю.А., Геннадиев А.Н., Чериянский С.С., Сахаров Г.Н. Проблема диагностики и нормирования загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами // Почвоведение, 2003. - № 9. - С. 1132-1140. 17 Oren A., Gurevich P., Azachi M., Henis Y. Microbial degradation of pollutans at high salt consentrations // Biodegradation, 1992. - V. 3. - P. 387-398. 118 18 Самсонова А.С., Семочкина Н.Ф., Алещенкова З.М., Бегельман М.М. // Влияние загрязнений нефтью на микрофлору почвы // Микробиология и биотехнология на рубеже ХХI столетия: Материалы Межд. конф. Нац. Акд. Наук Беларуси. Отд. Биол.наук НАНБ Научный совет по проблем биотехнологии. Белорусское микробиологическое общество. Ин-т микробиологии, Концерн «Белбиофарм». Бел. Гос. Унив. - Минск, 2000. - С. 204-205. 19 Булатов А.И., Макаренко П.П., Шеметов В.Ю. Охрана окружающей среды в нефтегазовой промышленности. – М.: Недра, 1997. – 470 с. 20 Диаров М.Д. Экология и нефтегазовый комплекс. – Алматы: Изд-во «Гылым», 2003. – Том 2, 4. – 832 с. 21 Жумагулов Б.Т. Экологические проблемы нефтегазовой отрасли // «Нефть и газ». – 2005. – № 6. – С.40-45. 22 Исмаилов Н.М. Микробиология и ферментативная активность нефтезагрязненных почв // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. – М., 1988. – С.222-230. 23 Киреева H.A. Использование биогумуса для ускорения деструкции нефти в почве // Биотехнология. 1995. - № 5-6. - С. 32-35. 24 С. П. Пасхальный, Экология нефтегазового комплекса, Тезисы докладов I Всесоюзной конференции, М., 1988, 201-202. 25 Русинов Л.А., Новиков Л.В. Спектральный подход к первичной обработке сигналов аналитических приборов. Л.: ЛГУ, 1984. - 160 с. 26 Горный В.И., Латыпов И.Ш. Экспериментальное подтверждение возможности создания сканирующего радиометра с синтезированной апертурой// Доклады РАН. 2002. - Т. 387. - №1. - С. 102-104. 27 ГОСТ 17.4.4.02-84. Охрана природы. Почва. Методы отбора и подготовки проб почвы для химического, бактериологического и гельминтологического анализа. 28 Унифицированные методы анализа вод/Под ред. Ю.Ю. Лурье. М.: Химия, 1973.-376 с. 29 Хроматографический анализ окружающей среды. Пер. с англ. / под ред. Березкин В.Г. – М.: Химия, 1979. – 606 с. 30 Сердан А.А., Лисичкин Г.В. Концентрирование органических соединений на химически модифицированных кремнеземах // В кн.: Концентрирование следов органических соединений. -М.: Наука, 1990. — Т. 10. - С. 28-43. 31 Другов Ю.С., Родин A.A. Газохроматографическая идентификация загрязнений воздуха, воды и почвы. СПб.: ТЕЗА, 1999. - 624 с. 32 Другов Ю.С., Родин А.А. Пробоподготовка в экологическом анализе. СПб.: Изд-во «Анатолия», 2002. - 755 с. 33 Liu, Y., Lee, M., Hageman, K., Yang, Y, Hawthorne, S. SPME of PAHs from Aqueous Samples, Using Fibers Coated with HPLC Chemically Bonded Silica Stationary Phases // Anal. Chem. – 1997. – Vol.69 (24). – P.5001-5005. 34 Zhang, A., Kopinke, G., Pawliszyn, J. SPME for Determining Distribution of Chemicals in Aqueous Matrixes // Anal. Chem. – 1997. – Vol. 69 (4). – P.597-600. 119 35 Орлова Д.С. Почвенно-экологический мониторинг и охрана почв. - М.: МГУ, 1994. - 272 с. 36 ISO 9377-1 Water quality - determination of hydrocarbon oil index Part 2: Method using solvent extraction and gas chromatography (ISO/FDIS 9377-2:2000) 37 Бродский Е.С., Савчук С.А. Определение нефтепродуктов в объектах окружающей среды//Журнал аналитической химии. 1998. - Т.53. -№12.-С. 12381251. 38 Руководство по методам химического анализа морских вод/Под ред. С.Г. Орадовского. Л.: Гидрометеоиздат, 1977.-С. 118-127. 39 Протопопов Н.Ф. Способ определения содержания нефти и нефтепродуктов в техногенных почвах. Заявка 96113688. Россия, МПК6 Е21В49/00, СОШЗЗ/24. №96113688/103; Заявл. 25.06.1996. Опубл. 27.09.1998. 40 Другов Ю.С., Родин А.А. – Мониторинг органических загрязнений природной среды. Сборник 500 методик. Санкт-Петербург: Наука, 2004, сс. 808. 41 ГОСТ 17.1.4.0.1-80. Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к методам определения нефтепродуктов в природных и сточных водах. 42 Страдомская А.Г., Ляпкина Н.С. Экспрессное определение нефтепродуктов в водных объектах//Гидрохимические материалы. -1991. -Т.100. -С. 147-151. 43 Руководство по химическому анализу морских вод/Под ред. С.Г. Орадовского. СПб.: Гидрометеоиздат, 1993. - С. 126-135. 44 Основы криминалистической экспертизы материалов, веществ и изделий: Учебное пособие/Под ред. В.Г. Савенко. М.: ЭКЦ МВД России, 1993.-208 с. 45 Бродский Е.С., Савчук С.А. Определение нефтепродуктов в объектах окружающей среды//Журнал аналитической химии. 1998. - Т.53. -№12.-С. 12381251. 46 Семенов А.Д., Страдомская А.Г., Павленко Л.Ф. Количественное определение нефтепродуктов в поверхностных водах/Методы анализа природных и сточных вод. Серия «проблемы аналитической химии». Т.5. - М.: Наука, 1977. - С. 203-220. 47 Галишев М.А. Комплексная методика исследования нефтепродуктов, рассеянных в окружающей среде при анализе чрезвычайных ситуаций: Монография/Под общей редакцией B.C. Артамонова. -СПб.: СанктПетербургский институт ГПС МЧС России, 2004. 157с. 48 Чешко И.Д. Экспертиза пожаров (объекты, методы, методики исследования). СПб.: СПбИПБ МВД России, 1997. - С. 407-408 49 Гладилович Д.Б. Флуориметрический метод контроля содержания нефтепродуктов в водах // Партнеры и конкуренты. - 2001. № 12. - С. 17—21. 50 Батуева И.Ю., Гайле А.А., Поконова В.В. и др. Химия нефти. – Л.: Химия, 1984. – 359 с. 51 Методическое руководство по анализу сточных вод нефтеперерабатывающих и нефтехимических заводов/Мин. нефт. и нефтехим.пром.СССР. 2-е изд., испр., доп.- М.,-1977. С.324-343. 120 52 ЮС. Manual for monitoring oil and dissolved/dispersed petroleum hydrocarbons in marine waters and on beaches/Manuals and guides №13. -Paris: UNESCO, 1984. 53 Abu-Zeid M.E., Bhatia K.S., Marafi M.A., Makdisi Y.Y., Amer M.F. Measurement of fluorescence decay of crude oil: A potential technique toidentify oil slicks//Environmental Pollution. 1987. - V.46. - №3. - P. 197-207. 54 ПНД Ф 14.1:2:4.128-98. Методика выполнения измерений массовойконцентрации нефтепродуктов в пробах природной, питьевой и сточной воды флуориметрическим методом на анализаторе жидкости Флюорат02». — М. 1998.- 17 с 55 ГОСТ Р 51232-98. Вода питьевая. Общие требования к организации и методам контроля качества. - М.: Изд-во стандартов, 1998. - 8 с. 56 El-Gayar M.Sh. Distribution of biomarkers in highly weathered petroleum residue from mediterranean waters//Petroleum Science and Technology. -2000. V. 18. - №5. - P. 725-741. 57 Экология города: Учебн. пособие под ред. В.В. Денисова. – М.: ИКЦ «МарТ», 2008. – 832 с. 58 Вяхирев Д.В., Шушунов А.Ф. Руководство по газовой хроматографии. – М.,1975. 59 Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. -М.: Химия, 1984.-448 с. 60 Страдомская А.Г., Ляпкина Н.С. Экспрессное определение нефтепродуктов в водных объектах//Гидрохимические материалы. -1991. -Т.100. -С. 147-151. 61 Руководство по химическому анализу морских вод/Под ред. С.Г. Орадовского. СПб.: Гидрометеоиздат, 1993. - С. 126-135. 62 Kreider R.E. Identification of oil leaks and spills//International Oil Spill Conference. 2005. - P. 3598. 63 Flanigan G.A., Frame G.M. Oil spill "fingerprinting" with gas chromatography//RD Res Dev. 1977. - V.28. - №9. - P. 28-36. 64 Brown C.W., Lynch P.F., Ahmadjian M. Applications of infrared spectroscopy in petroleum analysis and oil spill identification//Applied Spectroscopy Reviews. 1975. - V.9. -№2. - P. 223-248. 65 Wilson C.A., Ferrero E.P., Coleman H.J. Crude oil spills research: an investigation and evaluation of analytical techniques//American Chemical Society, Division of Petroleum Chemistry, Preprints. 1975. - V.20. -№3.-P. 613-634. 66 Бродский Е.С., Лукашенко И.М., Калинкевич Г.А., Савчук С.А. Идентификация нефтепродуктов в объектах окружающей среды с помощью газовой хроматографии и хромато-массспектрометрии//Журнал аналитической химии. 2002. - Т.57. - №6. -С. 592-596. 67 Page D.S., Foster J.C., Fickett P.M., Gilfillan E.S. Identification of petroleum sources in an area impacted by the Amoco Cadiz oil spill//Marine Pollution Bulletin.1988.-V.19.-№3.-P. 107-115. 121 68 Glover C.J., Bullin J.A. Identification of heavy residual oils by GC and GCMS//Journal of Environmental Science and Health Part A Environmental Science and Engineering. - 1989. - V.24. - №1. - P. 57-75. 69 Lynch P.F., Brown C.W. Identifying source of petroleum by infrared spectroscopy//Environmental Science and Technology. 1973. - V.7. -№13.-P. 11231126. 70 Воронцов A.M., Корсаков В.Г., Никанорова M.H., Дорохов А.П., Катыхин Г.С., Обидейко В.Р., Халатов А.Н. Тонкослойная хроматография с непрерывной фотометрией как инструмент экологической криминалистики// Оптический журнал. 1998. - Т.65. - №5. - С. 18-24. 71 Van Delft R.J., Doveren A.S.M.J., Snijders A.G. The determination of petroleum hydrocarbons in soil using a miniaturized extraction method and gas chromatography//Fresenius Journal of Analytical Chemistry. 1994. -V.350.-№10-11.P. 638-641. 72 Ruyken М.М.А., Pijpers F.W. Identification of oil spills in harbours by means of pattern recognition//Analytica Chimica Acta. 1987. - V.194. -P. 25-35. 73 Wang Z., Fingas M. Developments in the analysis of petroleum hydrocarbons in oils, petroleum products and oil-spill-related environmental samples by gas chromatography//Journal of Chromatography A. 1997. - V.774. - №1-2. - P. 51-78. 74 ГОСТ 38.01378-85. Охрана природы. Гидросфера. Определение содержания нефтепродуктов в сточных водах методом ИК-спектрофотометрии. - М., 1985.14 c. 75 Способ количественного определения нефтяных углеводородов с использованием численного подиапазонного интегрирования ИК-спектров /С.С. Волкова, А.А. Кудрявцев, Д.В. Мильченко, Ф.Я. Юффа // Заявка 2117933.Россия, МПК6 О 01№21/35. № 96115068/25; Заявл. 25.07.96. Опубл. 20.08.1998. 76 Кулонометрическое определение органического углерода с предварительным термическим окислением / СИ. Петров, А. Фула, П.А. Василенко, В.А.Любименко, Т.И. Жалнина // III Российская конф. с участием зарубеж. специалистов Высокие технологии в промышленности России» Тезисы докл.- М.: Техномаш, 1997. - С. 310-318. 77 ЦВ 2.02.12-91 МВИ содержания нефтепродуктов гравиметрическим методом в пробах сточной воды. ЦИКВ: С.-Пб., 1991. 78 ПНД Ф 16.1.41-04 МВИ массовой концентрации НП в пробах почв гравиметрическим методом 79 Ю.В. Воронов. Водоотведение и очистка сточных вод. Москва, Изд. Ассоциации строительных вузов, 2009, С. 215-223. 80 Ю.В. Воронов. Водоотведение и очистка сточных вод. Москва, Изд. Ассоциации строительных вузов, 2009, С. 413-423. 81 http://www.mediana-eco.ru/information/oil_adsorbtion/ 82 Казанкапова М.К., Самадун А.И., Темирбаев Ж.С. Очистка объектов окружающей среды от нефтяного загрязнения с использованием сорбентов // Международная научная конференция студентов и молодых ученых «МИР НАУКИ» 17-19 апреля, 2013 г., Алматы, с.297. 122 83 А.с. 1451099 СССР, МКИ С 02 Ғ 1/28. Способ очистки вод от нефтепродуктов и масел / Мочаров В.М., Савицкая П.В., Егорова О.А. и др. 84 А.с. 1444307 СССР, МКИ 4 С 02 Ғ 1/28, G 01 N 30/08. Способ концентрирования нефтепродуктов из водных сред / Сенин А.Н., Горчаков В.Д., Денисова М.В. и др 85 А.с. 1452550 СССР, МКИ 4 В 01 Д 35/06, В 03 С 1/100. Способ очистки сточных вод / Беличенко Ю.П., Береза А.П., Рудин Т. Р. и др. 86 Павлик П.Е., Бочманов А.Д. Сорбент для сбора нефти и нефтепродуктов с поверхности воды // 14 Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Т. 2. - М., 1989. - С. 444. 87 Яковлев В.С. Хранение нефтепродуктов. Проблемы защиты окружающей среды. - М.: Химия, 1987. - 152 с. 88 Байкова С.А. Глубокая очистка малоконцентрированных по нефтепродуктам сточных вод фильтрованием: Автореф. дис. канд. техн. наук. М., 1988.-23 с. 89 Тимошенко М.Н., Клеменко Н.А. Применение активных углей в технологии очистки воды и сточных вод // Химия и технология воды. - 1990. - Т. 12, N 8. С. 727-738. 90 Adsorption system // Water Eng. and Manag. - 1989. - Vol. 136, N 9. - Р.61. 91 Najm Jesam N., Shocynik Vernon L., Suidan Makram Т. е.а. Зависимость адсорбционной способности порошкового активированного угля от размеров его частиц и фонового содержания природных органических веществ // J. Amer, Water Works Assoc. - 1990. - Vol. 82, N 1 . - Р. 65-72. 92 Koffskoy W.T., Lykins B.W. Опыт эксплуатации станции очистки поверхностных вод гранулированным активным углем с его регенерацией в печи ИК-нагрева // Там же. - Р. 48-56. 93 Минкова В., Люцканов Л., Анилова Г. Очистка сточных вод, загрязненных нефтепродуктами, при помощи адсорбента из углей // 6 нефтехим. симп. соц. стран, Козубник, 25-30 сент. 1988 г.: Материалы симпоз. - Гливице, 1988. - Т. 3. - С. 766-774. 94 Чистова Л.Р., Рогач Л.М., Пехтерева В.С. и др. Удаление нефтепродуктов из сточных вод // Водоснабжение и санитарная техника. - 1988. - N 8. - С. 22-23. 95 Гусар Ф.Г. О совершенствовании схемы очистки сточных вод от нефтепродуктов // Электр. станции. - 1988. - N 8. - С. 45-48. 96 А.с. 1458321 СССР, МКИ 4 С 02 Ғ 1/28. Способ очистки сточных вод от нефтепродуктов / Черкашин В.Н., Кошутин В.П., Воробьева Л.И. и др. 97 Казначеева З.В. Очистка сточных вод сорбентом, полученным из отходов нефтяного кокса: Автореф. дис.... канд. техн. наук. - М., 1986. - 19 с. 98 А.с. 1433901 СССР, МКИ 4 С 02 Ғ 1/28. Способ очистки сточных вод от нефтепродуктов / Кузнецова Г.В., Соловьева Е.В., Андреева П.П. и др. 99 Хохлова А.Д., Немцев В.А., Тарнопольская М.Г. Выбор минеральных и углеродных сорбентов для извлечения нефтепродуктов из сточных вод на намывных фильтрах // Физико-химическая очистка и методы анализа промышленных сточных вод. - М., 1988. - С. 5-7. 123 100 Ахмедова П.Р., Переяслова Г.А. Очистка сточных вод от нефтепродуктов // Цв. металлургия. - 1988. - N 12. - С. 59-61. 101 Чистова Л.Р., Рогач Л.М., Пехтерева В.С. и др. Удаление нефтепродуктов из сточных вод / // Водоснабжение и сан. техника. - 1988. - N 8. - С. 22-23. 102 Лукин С.И. Интенсификация реагентной очистки сточных вод от эмульгированных нефтепродуктов с использованием полукокса: Автореф. дис. канд. техн. наук. - М., 1984. - 23 с. 103 Фаизов К.Ш., Раимжанова М.М., Алимбеков Ж.С. Экология МангышлакПрикаспийского нефтегазового региона. Алматы, 2003. С.120-128. 104 Кузубов Л.И., Морозов С.В. Очистка нефтесодержащих сточных вод: Аналит. Обзор / СО РАН. ГПНТБ, НИОХ. – Новосибирск, 1992. – C.25-26. 105 Яковлев С.В., Скирдов И.В., Швецов В.Н. и др. Биологическая очистка производственных сточных вод / - М.: Стройиздат, 1985. - 208 с. 106 Казанкапова М.К., Бекжанова А.Ж., Ефремов С.А., Наурызбаев М.К., Лесова Ж.Т. Биологическая очистка объектов окружающей среды от нефтяного загрязнения// Международная научная конференция студентов и молодых ученых «МИР НАУКИ» 17-19 апреля, 2013 г., Алматы, С. 297-298 107 Шаталов А.А., Новиков А.Д., Яненко А.С. Биодеградация нефтяных загрязнений морскими облигатными нефтеокисляющими микроорганизмами // Мат. II-го Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». –М.-Ч. 2.- 2003.– 220 с. 108 Wilkinson S., Nicklin S. // Biotransformations: Bioremediation Tecchnology for Health and environmental Proteсtion / Stapletion Amsterdam; London; New York; Oxford; Paris; Tokio. 2002. 69-100 р. 109 Плешакова Е.В., Матора Л.Ю., Турковская О.В. Нефтеокисляющий штамм Dietzia maris и возможности его использования для биоремедиации загрязненной почвы // Вестник МГОУ. Серия Естественные науки. – 2010. – № 4. – С. 82-89. 110 Dubrovskaya E., Pleshakova E., Turkovskaya O. Using molasses for stimulation of the degradative and activities of the microbial community in soil contaminated with oil shale liquid fuel // Soil Contamination: New Research / Ed. A.N. Dubois. – USA: Nova Science Publishers, 2008. – Р. 121-138. 111 Wuyep P.A. Chuma A.G., Awodi S. and Nok A. J. Biosorption of Cr, Mn, Fe, Ni, Cu and Pb metals from petroleum refinery effluent by calcium alginate immobilized mycelia of Polyporus squamosus. Scientific Research and Essay, 2009. Vol. 2, № 7. - Р. 217-221 112 Сидоров А.В., Морозов Н.В., Гицарева Е.В. Биодеградация нефтесодержащих природных и сточных вод консорциумом углеводородокисляющих микроорганизмов // Пятый международный конгресс по управлению отходами и природоохранными технологиями ВэйсТек – 2007. Москва – 2007. – С. 341-342. 113 Пирог Т.П. Использование иммобилизованных на керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти // Шевчук Т. 124 А., Волошина И. Н., Гречирчак Н. Н. // Прикладная биохимия и микробиология. - Т. 41, № 1 - 2005. - С. 58-63. 114 Полевой эксперимент по очистке почвы от нефтяного загрязнения с использованием углеводородокисляющих микроорганизмов / Сидоров Д.Г., Борзенков И.А., Ибатуллин Р.Р. и др. // Прикладная биохимия и микробиология, 1997. – Т. 33. - № 5. – С. 497-502. 115 Барышникова Л.М., Грименнов В.Г., Аринбасаров М.У., Шкидченко А.Н., Боронин А.М. Биодеградация нефтепродуктов штаммами-деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде // Прикладная биохимия и микробиология, 2001. – Т.37. – № 5. – С. 542-548. 116 Илялетдинов А.Н., Алиева Р.М. Микробиология и биотехнология очистки промышленных сточных вод. – Алма-Ата: Ғылым, 1990. – 224 с. 117 Жубанова А.А., Абишева К.К., Баубекова А.С., Кайырманова Г.К., Шупшибаев К.К. Аккумуляция ионов цинка иммобилизованными клетками дрожжей и бактерий // Вестник КазНУ. Сер. экол., 2001. - № 2 (9). – С. 33-39. 118 Абишева К.К., Кайырманова Г.К., Мансурова Р.М., Жубанова А.А., Мансуров З.А. Получение модифицированных иммобилизованными клетками зауглероженных сорбентов на основе скорлупы грецких орехов для избирательной сорбции ионов металлов из водных растворов // Вестник КазНУ. Сер. экол., 2001. - № 2 (9). – С. 66-71. 119 Оразымбетова А.Б., Тажибаева С.М.. Жубанова А.А.. Мусабеков К.Б. Особенности адсорбции ионов металлов на поверхности дрожжевых клеток // Вестник КазНУ. Сер. экол., 2002. - № 1 (10). – С. 51-54. 120 Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Приемы стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры // Биотехнология, 2005. - № 1. - С. 42-50. 121 Wilkinson S., Nicklin S., Faul J.L. Biotransformations: Bioremediation technology for health and environmental protection –36 / Eds. V.P.Singh, R.D.Stapleton. – Amsterdam, London, New York, Oxford, Paris, Shannon, Tokyo: Elsevier, 2002. 122 Loynachan T. E. Low-temperature mineralization of crude oil in soil // J. Envirn. Qual, 1978. - V. 7. - № 4. - Р. 494 – 500. 123 Исмаилов Н.М., Пиковский Ю.И. Современное состояние методов рекультивации нефтезагрязненных земель // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. М.: Наука, 1988. - С. 222-230. 124 Холоденко В.П., Чугунов В.А., Кобелев В.С. Использование препаратов ―Экойл‖ для очистки почвы и водоемов от нефтяных загрязнений // Международн. конф. «Интродукция микроорганизмов в окружающую среду»: Тез. докл. - М.,1994. - С. 113. 125 Пиковский Ю.И. Природные и техногенные потоки углеводородов в окружающей среды. - М.: Изд-во МГУ , 1993.- С. 201. 126 Митрофанова Н.С. Микрофлора зональных почв Казахстана//АН КазССР, сер.биол., 1971, №6. с. 32-41 125 127 Хазиев Ф.Т., Фатхиев Ф.Ф. Изменение биохимических процессов при нефтяном загрязнении и активация разложения нефти//Агрохимия, 1981, №10. С.102-113. 128 Ауэзова О.Н., Недоводиева Т.П., Петрова Т.Д., Алиева Р.М. Деструкционная способность углероокисляющих микроорганизмов, выделенных из оз. Балхаш//Известия АН КазССР, сер.биол.,1991,№6, с.47-51. 129 Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Микроорганизмы-деструкторы нефти в водных бассейнах. Киев,1961.132 с. 130 Файзулина Э.Р., Шилова Н.К., Алиева Р.М., Бирюкова Л.А. Микробиологическое окисление нефти и нефтепродуктов углеродокисляющими бактериями, входящими в состав препарата «Мунайбак»//Известия НАН РК, сер.биолог., 1995, №5. С.64-68. 131 Середин В.В. Санация территорий, загрязненных нефтью и нефтепродуктами // Геоэкология, 2000. - № 6. - С. 525-540. 132 Хазиев Ф.Х., Тишкина Е.И., Киреева Н.А.. Влияние нефтяного загрязнения на некоторые компоненты агросистемы // Агрохимия, 1988. - № 10. С. 93 – 99. 133 Карасева Э.В., Гирич И.Е., Худокормов А.А., Алешина Н.Ю., Карасев С.Г. Биоремедиация черноземной почвы, загрязненной нефтью // Биотехнология, 2005. – № 2. - С. 67-72 134 Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Микроорганизмы-деструкторы нефти в водных бассейнах. Киев, Наукова Думка, 1981. – 270. С. 135 Tompson I.P., Singer A.C., Bailey M.J. Improving the exploitation of microorganisms in environmental clean-up. Pesticide Behavior in soils an Water: Proceedings of a Symposium, Brigton, 13-15. Nov., 2001 - Farnham, 2001. -P. 197204. 136 Куликова И.Ю. Микроорганизмы в процессе самоочищения шельфовых вод Северного Каспия от нефтяного загрязнения: Автореф. дисс. канд. биол. наук. -М.: МГУ, 2004. - 24. С. 137 Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Трансформация углеводородов нефти в биосфере // Структура и функции микробных сообществ почв с различной антропогенной нагрузкой. –Киев, Наукова Думка, 1982. – С. 5-8. 138 Андрусенко М.Я., Бильмес Б.И., Джамалов Т.Д., Рунов В.И Распространение углеводородокисляющих микроорганизмов в почвах основных нефтеносных месторождений Узбекистана // Микробиология 1969. Т. 28. -Вып. 5. - С. 873-877. 139 Купчинская Е.В., Липунов И.А., Мартынова Ю.Г., Редькина Г.Г. Ультрафильтрационная очистка нефтесодержащих сточных вод заводов ЖБИ / // Химия и технология воды. -1990. - Т. 12, N 6. - С. 555-557 140 Кузубов Л.И., Морозов С.В. Очистка нефтесодержащих сточных вод: Аналит. Обзор / СО РАН. ГПНТБ, НИОХ. – Новосибирск, 1992. –C. 26-29. 141 Варежкин Ю.М., Михайлова А.И., Терентьев А.М. Методы интенсификации процесса биологической очистки сточных вод. Обзор. информ. 126 Сер. "Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов"/ НИИТЭХИМ.. - М., 1987. - 33 с. 142 Шеер М.Г. Опытно-промышленный биореактор для очистки нефтесодержащих сточных вод // Водоснабжение и сан. техника. - 1990. - N 9. С. 25-27. 143 Щеблыкин И.Н., Бирюков В.В. Биоремедиация загрязненных грунтов: технологии и установки// Наука и промышленность Росси.-2002.-№10(66).С.57-59. 144 Тасекеев М.С. Современное состояние биотехнологии и тенденции ее развития. Обзорное исследование. Алматы, 2008. С. 285-305. 145 Аренс В.Ж., Гридин О.М., Яншин А.Л. Нефтяные загрязнения: как решить проблему// Экология и промышленность Росии. – 1999, №9. – с. 33 – 36 146 Бельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы // Биотехнология. 1995. №3 – 4. с. 20-27. 147 Лейкин Ю.А., Черкасова Т.А., Смагина Н.А. Вермикулярный сорбент для очистки воды от нефтяных углеводородов // Сорбционные и хроматографические процессы. 2009. Т. 9. Вып. 1. с. 104-117. 148 Патент №21686 – Консорциум штаммов микроорганизмов-деструкторов, используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. Саданов А.К., Шорабаев Е.Ж., Чукпарова А.У., Кулжанова К.А. 149 Патент №21708 – Штамм бактерий Bacillusthuringiensis А1, используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. Саданов А.К., Шорабаев Е.Ж., Чукпарова А.У., Айтуганов К.А., Кулжанова К.А. 150 Патент №21709 – Штамм бактерий Bacilluspolymyxa ДН, используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. Саданов А.К., Шорабаев Е.Ж., Чукпарова А.У., Кулжанова К.А. 151 Патент №21685 – Способ биоремедиации нефтезагрязненных почв. Саданов А.К., Шорабаев Е.Ж., Чукпарова А.У., Кулжанова К.А., Черемисова Т.Г., Кадралиев А.К. 152 Патент №23489 – Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis Kl 1, используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. Кулжанова К., Туякбаева А., Апендина Г., Саданов А., Чукпарова А. 153 Патент №23490 – Штамм бактерий Rhodococcus rubber Kl 4, используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. Кулжанова К., Туякбаева А., Апендина Г., Саданов А., Чукпарова А. 154 Патент РК №24557 «Штамм бактерий Bacillus aquimaris AE3, используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов». Масалимов Ж.К., Нурлыбеков А.Н., Жамангара А.К. и др. 155 Патент РК №24542 «Штамм бактерий Dietzia maris 2.1, используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов». Туякбаева А.У., Апендина Г.С., Курманбаева А.Б. и др. 156 Костенко Е.А., Лысенко И.О. Оценка содержания тяжелых металлов на территории агротехногенной зоны г. Ставрополя// Научный журнал КубГАУ, №80(06), 2012 г. 10 с. 127 157 Фелленберг Г. Загрязнение природной среды. Изд. Мир, 1997.- С. 116121. 158 Никитин Д.П., Новиков Ю.В. Окружающая среда и человек. М.: Высшая Школа, 1986.- С. 157-194. 159 http://www.o8ode.ru/article/answer/method/metody_obnarugenia_tagelyh_met allov_v_vode.htm 160 Christie C.C. Metals from electroplating sludge // Trans. Inst.Met.Finish. – 1991. – № 2. – P. 2–6. 161 Polljr G.H. From industrial by productcompounds // Products Finishing.– 1990. – № 10. – P. 478– 482. 162 Малкин В.П. Технологичекие аспекты очистки промстоков, содержащих ионы тяжелых металлов. – Иркутск: ИГУ, 1991. – 63 с. 163 Найденко В.В., Губанов Л.Н. Очистка и утилизация промышленных стоков. – Н. Новгород: ДЕКОМ, 1999. – 368 с. 164 Алибяков С.Я., Фоминых В.В. Экологические технологии: интенсификация процесса очистки сточных вод от ионов никеля // Инженерная экология. – 2003. – № 3. – С. 55– 58. 165 Варламова С.И., Климов Е.С. Экологическая безопасность предприятий машиностроения (Обзор современного состояния проблемы) // Изв. вузов. Северо-Кавказский регион. Технические науки. – 2005. – Приложение № 2. – С. 163–168. 166 Евилевич А.З., Евилевич М.А. Утилизация осадков сточных вод. – Л.: Стройиздат, 1988. – 247 с. 167 Туровский И.С. Обработка осадков сточных вод. – М.: Стройиздат, 1988. – 257 с. 168 Бабков В.В., Закиров Д.М., Чулков А.Н. и др. Утилизация осадков сточных вод гальванических производств. – М.: Руда и металлы, 2003.– 272 с. 169 Пальгунов П.П., Сумароков М.В. Утилизация промышленныхотходов. – М.: Стройиздат, 1990. – 352 с. 170 Гвоздев В.Д., Ксенофонтов Б.С. Очистка производственных сточных вод и утилизация осадков. – М.: Химия, 1988. – 112 с. 171 Барак К., Бебен Ж., Бернар Ж. и др. Технические записки по проблемам воды: Пер. с англ. / Под ред. Т.А. Карюхиной, И.Н. Чурбановой. –М.: Стройиздат, 1983. – 997 с.188 172 Чиркст Д.Э. Сорбция железа (2+) железомарганцевыми конкрециями // Журнал прикладной химии. – 2005. – Т. 78. – Вып. 4. – С. 599–605. 173 Смирнов А.Д. Сорбционная очистка воды. – Л.: Химия, 1982. –168 с. 174 Алыков Н.М., Павлова А.В., Нгуэн Кхань Зуй. Сорбционное удаление из воды ионов тяжелых металлов // Безопасность жизнедеятельности. – 2010. – № 4. – С. 17–20. 175 Зыкова И.В., Лысенко И.В., Панов В.П. Адсорбция ионов меди керамической крошкой из бинарных и многокомпонентных растворов // Изв. вузов. Химия и химическая технология. – 2004. – Т. 47. – Вып. 9. –С. 151–152. 128 176 Морозов Д.Ю., Шулаев М.В., Храмова И.А., Хабибуллина Л.И. Исследование адсорбции очистки сточных вод, содержащих ионы тяжелых металлов // Химическая промышленность. – 2007. – Т. 84. – № 3. –С. 141–144. 177 Морозов Д.Ю., Шулаев М.В., Емельянов В.М., Нуруллина Е.Н. Исследование адсорбционной очистки сточных вод, содержащих ионы тяжелых металлов // Вестник Казанского технологического университета. – 2004. – № 1. – С. 95–98. 178 Нестеров А.В. Очистка нефтесодержащих сточных вод сочетанием экстракционных и адсорбционных методов: Автореф. дис… канд. техн. наук. – Иваново, 2008. – 16 с. 179 Когановский А.М, Левченко Т.М., Рода И.Г., Марутовский Р.М. Адсорбционная технология очистки сточных вод. – Киев: Техника, 1981. –175 с. 180 Когановский А.М., Клименко Н.А., Левченко Т.М., Рода И.Г. Адсорбция органических веществ из воды. – Л.: Химия, 1990. – 256 с. 181 Кельцев Н.В. Основы адсорбционной техники. – М.: Химия,1984. – 591с. 182 Ахмадеев В.Я., Савина Н.В. Физико-химические методы и основные теоретические принципы адсорбционной очистки сточных вод от органических соединений. – М.: ЦНИИ «Электроника», 1975. – 60 с. 183 Глазкова, Е. А. Извлечение нефтепродуктов из водных сред многослойными фильтрами: Автореф. дисс... канд. техн. наук. – Томск, 2005. – 25 с. 184 Woolard C. D., Strong J., Erasmus С.R. Evaluation of the use of modified coal ash as a potential sorbent for organic waste streams // Applied Geochemistry. – 2002. – Vol. 17. – № 8. – Р. 1159–1164. 185 Косов В.И., Испирян С.Р. Использование торфа для очистки вод, загрязненных нефтепродуктами // Вода и Экология: проблемы и решения. – 2001. – № 4. – С. 41–46. 186 Grieves С.G., Crame L.W., D.G. Verandos D.G., Wei-Chi-Ying. Powdered versus granular carbon for oil rafmery wastewater treatment // Jornal of Water Pollution Control Federation. – 1980. – № 3. – P. 483–497. 187 Xiaobing L., Chunjuan Z., Jiongtian L. Adsorption of oil from waste water by coal: characteristics and mechanism // Mining Science and Technology. – 2010. – V. 20. – P. 778–781. 188 Nadeem R., Hanif M., Shaheen F. et al. Physical and chemical modification of distillery sludge for Pb(II) biosorption // J. Hazard. Matter. – 2008. – V. 150. – Р. 335–342. 189 Padmavathy V. Biosorption of nickel (II) ions by baker's yeast: Kinetic, thermodynamic and desorption studies // Bioresource. Technol. – 2008. – V. 99. – Р. 3100–3109. 190 Apiratikul R., Pavasant P. Batch and column studies of biosorption of heavy metals by Caulerpa lentillifera // Bioresource. Technol. – 2008. – V. 99. – Р. 2766– 2777. 129 191 Akhtar N., Iqbal M., Zafar S., Iqbal J. Biosorption characteristics of unicellular green alga Chlorella sorokiniana immobilized in loofa sponge for removal of Cr(III) // J. Environ. Sci. – 2008. – V. 20. – Р. 231–39. 192 Алыков Н.М., Павлова А.В., Нгуен Кхань Зуй и др. Новый сорбент для очистки воды от ионов токсичных элементов // Естественные науки. – 2009. – № 4. – С. 150–158. 193 Guixia Zhao, Xilin Wu, Xiaoli Tan, Xiangke Wang. Sorption of Heavy Metal Ions from Aqueous Solutions: A Review // The Open Colloid Science Journal. – 2011. – № 4. – Р.19–31. 194 Халдеев Г.В., Кичигин В.И., Зубарева Г.И. Очистка и переработка сточных вод гальванического производства. – Пермь, ПГУ, 2005. – 124 с. 195 Guo X., Zhang S., Shan X. Adsorption of metal ions on lignin //J. Hazard. Matter. – 2008. – V. 151. – Р. 134–142. 196 Тимошенко Т.Г, Пшинко Г.Н., Корнилович Б.Ю. Очистка радиоактивно загрязненных вод от 90Sr и U ферритным методом // Химия и технология воды. – 2007. – № 5. – С. 449 – 461. 197 Патент 2318737 Россия. Способ комплексной очистки промышленных сточных вод и устройство для его реализации / В.В. Малышев. –2008. 198 Балмасова О.В. Адсорбция жирных кислот из растворов органических растворителей на поверхности ферритов железа, марганца и меди:Автореф. дис… канд. техн. наук. – Иваново, 2010. – 17 с. 199 Dahiya S., Tripathi R.M., Hegde A.G. Biosorption of heavy metals and radionuclide from aqueous solutions by pre-treated arca shell biomass //J. Hazard. Matter. – 2008. – V . 150. – Р. 376–386. 200 Е. С. Климов, М. В. Бузаева. Природные сорбенты и комплексоны в очистке сточных вод.// Ульяновск, УлГТУ. -2011.- 31с. 201 http://www.rae.ru/monographs/31-814 202 Филатов Б.Н., Колодий Т.Н., Кононов В.М., Кононов М.В. Загрязнение хлорорганическими пестицидами сельскохозяйственных угодий и риск для здоровья населения Волгоградской области// Материалы конференции "Национальный план действий по экологически обаснованному управлению диоксинами/фуранами и диоксиноподобными веществами" г. Санкт-Петербург, 2001 г. 245 с. 203 Eash D.T., Bushway R.J. Herbicide and plant growth regulator analysis by capillary electrophoresis. //J. Chromatogr. 2000. V.880. P.281–294. 204 Методы анализа токсикантов в пищевых продуктах. Аналит. обзоры/ГПНТБ СО РАН и др. Новосибирск. 1993. 116 с. (Сер. Экология. Вып. 27) 205 Азарова И.Н. ВЭЖХ метод определения ди (2-этилгексил)фталата для изучения его поведения в экосистеме озера Байкал. Канд. дисс...наук. Лимнологический институт СО РАН. 2003. 206 http://www.findpatent.ru/patent/244/2448786.html 207 Felsot A.S., Racke K.D., Hamilton D.J. // Rev. Environ. Contam. Toxicol. — 2003. —V. 177. —P. 123—200. 130 208 Schimpf W.A. // Chemistry of Crop Protection. Progress and Prospects in Science and Regulation. Ed. G.Voss and G.Ramos. Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KgaA, Weinheim, 2003. —P. 40—53. 209 Food and Agricultural Organization of the United Nations (FAO). Guidelines on Disposal of Bulk Quantities of Pesticides in Developing Countries. FAO, Rome, Italy, 1996. 210 Jensen J.K. // Pesticide Waste Management. Technology and Regulations.Symposium Series 510. American Chemical Society, Washington, DC, 1992. —P. 20—28. 211 Brunelle D.J., Singleton D.A. // Chemosphere. —1985. —V. 14(2). —P. 173— 181. 212 Kornel A., Rogers C.J. // Hazard.Mater. —1985. —V. 1. —P. 161—176. 213 Tiernan T.O., Wagel D.J., Garrett J.H., VanNess G.F., Solch J.G., Harden L.A. // Chemosphere. —1989. —V. 18. —P. 835—841. 214 A citizen's guide to chemical dehalogenation. Technology Fact Sheet. EPA 542-F-96-004. National Center for Environmental Publications and Information. — 1996. Cincinnati, OH. 215 Koustas R.N., Fischer D. // J. Air Waste Manag. Assoc. —1998. —V. 48. —P. 434—440. 216 Rock M.L., Kearney P.C., Helz G.R. // Pesticide Remediation in Soils and Water. Wiley, New York. —1998. —P. 285—306. 217 Troxler W. // Ibid. —P. 105—127. 218 Van Zwieten L.V., Ayres M., Curran P. // Seeking Agricultural Produce Free of Pesticide Residues. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, 1998. —P. 349—357 219 Steverson E.M. // Pesticide Remediation in Soil and Water. Eds. Kearney P., Roberts T. Wiley, New York, 1998. —P. 85—103. 220 Taylor M.L., Wentz J.A., Dosani M.A., Gallagher W., Greber J.S. // Treating Chlorinated Wastes with the KPEG Process. Project Summary, EPA/600/S2-90/026. USEPA, Cincinnati, OH, 1990. 221 Comfort S.D., Shea P.J., Machacek T.A., Gaber H., Oh B.T. // J. Environ. Qual. —2001. —V. 30. —P. 1636—1643. 222 Felsot A.S. // Pesticide Remediation in Soil and Water. Kearney P.S., Roberts T.R. (eds.). Wiley, New York, 1998. —P. 129—160. 223 Andrews Environmental Engineering, Inc. Use of landfarming to remediate soil contaminated by pesticides. HWRIC TR-019 Final Report. Illinois Hazardous Waste Research and Information Center, 1994. Champaign, IL. 224 М.К. Наурызбаев. Самые главные открытия еще впереди // Байтерек. Астана. - 2011.- №10.- С.56-57. 225 Ефремов С.А. Технология производства углерод-минеральных материалов на основе шунгитовых пород // Дисс. докт.хим. наук: 05.17.01. – Алматы, 2010. – 240 с. 131 226 Григорьева Е.Н., Рожкова Н.Н. Поведение шунгитового углерода в реакциях, моделирующих термические превращения угля. // Журнал прикладной химии. 2000. Т. 73 №4 С.600-605. 227 Ануфриева С.И., Исаев В.И. и др. Оценка возможности использования природного материала - шунгита для очистки нефтесодержащих стоков: труды международного симпозиума. - Петрозаводск. Карелия, 2000. - С.156-161. 228 S. Nechipurenko, S. Yefremov, Y.Lyu, M. Nauryzbaev. The Metod of Treatment and Purification of Waste Waters// ―intersol’2010‖ international Conference-Exhibition on Soils, Sediments and Water, Paris-Sud, 2010. 229 Панов П. Б., Калинин А. И., Сороколетова Е. Ф., Кравченко Е. В., Плахотская Ж. В., Андреев В. П. Использование шунгитов для очистки питьевой воды. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007. с.103. 230 Мосин О. В., Игнатов, И. Природный фуллеренсодержащий минеральный сорбент шунгит в водоподготовке и водоочистке/Чистая вода: проблемы и решения. 2012. № 6. С. 109-115. 231 Пеньков В.Ф. Генетическая минералогия углеродистых веществ : учеб. пособие. - М.:Недра, 1996. - 224 c. 232 Глебашев С.Г. Шунгитоносность Кызыловской зоны разломов: дис. канд. геол. мин. наук. - Казань, 1992.-130 c. 233 Н.Н. Рожкова, Г.И. Емельянова, Л.Е. Горленко, В.В. Лунин. Шунгитовый углерод и его модифицирование //Российский химический журнал.-2004.- т. ХLVIII. -№5. – 107с. 234 10. Buseck P.R., Tsipursky S.J., Hettich R. Fullerenes from the geological environment: Science, 1992, v.257, p.215-217 235 Ebbersen T.W., Hiura H., Hedenquist J.W., de Ronde C.E.J., Andersen A., Often M., Melezhik V.A. Origins of fullerenes in rock: Science, 1995, v.268, p.16341635. 236 Н.Н Рожкова, Г.В. Андриевский. Фуллерены в шунгитовом углероде. Сб. научн. трудов междунар. симпозиума ―Фуллерены и фуллереноподобные структуры‖: 5-8 июня 2000, БГУ, Минск, 2000, С. 63-69. 237 Osawa E. Natural Fullerens - Will They Offer a Hint to the Selective Synthesis of Fullerenes. Fullerene Sciece and Technology, 1999, v. 7, №4, p.637-652 238 Зайденберг А.З., Ковалевский В.В., Рожкова Н.Н., Туполев А.Г. О фуллереноподобных структурах шунгитового углерода// Журнал физической химии, 1996, т. 70, с.107-110. 239 Zaidenberg A.Z., Rozhkova N.N., Kovalevski V.V., Lorents D.C., Chevallier J. Physical chemical model of fullerene-like shungite carbon. Mol. Mat., 1996, v.8, p.107-110. 240 Zaidenberg A.Z., Kovalevski V.V., Rozhkova N.N., Spheroidal fullerene-like carbon in shungite rock, Proc.of the ECS Fullerene Symposium, Reno, NJ, May 2126, 1995, p.24–27. 241 Голубев Е.А., Глебашев С.Г. Надмолекулярное строение антраксолита месторождения Бакырчик, Восточный Казахстан // Вестник института геологии Ком. науч. Центра УрО НАН, апрель.- 2006.-№4. – С. 4 - 7. 132 242 Kazankapova M.K., Efremov S.A., Nechipurenko S.V., Nauryzbaev M.K. The study of phyico-chemical characteristics shungite minerals of Kazakhstan// Materials of the international research and practice conference. Vol.II, December 11-12, 2012, Westwood, Canada 2012. Science, Technology and Higher Education. 243 Шигаева М.Х., Канаев А.Т. Микробиология и вирусология. - Алматы. Қазахский университет. 2008. – 114 с. 244 Нетрусова А.И.. Практикум по микробиологиии. М.: 2005. 107, 114-117 с. 245 ГОСТ Р 50595-93. Метод определения биоразлагаемости в водной среде. М.:, Госстандарт России: 1995. 246 Аникиев В.В., Лукомская К.А. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. - М.: Просвещение. 1977. 15-18 с. 247 Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Current Protocols in Molecular Biology. Editors (Editors Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., et al.). - New York: Wiley, 1987.- 650 p. 248 ДудиковаГ.Н., ЯкушеваТ.В., Кудрякова А.В., Жолдыбаева Е.В., Шевцов А.Б. Генетическая идентификация молочнокислых бактерий на основе анализа нуклеотидной последовательности гена 16SrRNA // Биотехнология. Теория и практика. №3. – 2012. – 55 – 64 с. 249 Vegas E. Z. S., Nieves B., Araque M., Velasco E., Ruiz J., Vila J. Outbreak of Infection With Acinetobacter Strain RUH 1139 in an Intensive Care Unit // Infection control and hospital epidemiology. – 2006. - Vol. 27, № 4. - P. 397 – 404. 250 Werle E., Schneider C., Renner M., Völker M., Fiehn W. Convenient singlestep, one tube purification of PCR products for direct sequencing // Nucleic Acids Res. – 1994. – Vol. 22. - P. 4354-4355. 251 Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. Практикум по микробиологии: учеб. пособие для студ.высш.учеб.заведений. – М.: Издательский центр, Академия, 2005. – 608 с. 252 Синицын А.П., Райнина Е.П., Лозинский В.И. и др. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: МГУ, 1994. – 288с. 253 Смирнов А.Д. Сорбционная очистка воды. - Л.: Химия, 1982. - С. 22-24. 254 ГОСТ 6217. Уголь активный древесный дробленный, 2003. – 8 с. 255 Казанкапова М.К., Бекжанова А.Ж., Ефремов С.А., Наурызбаев М.К. Изучение элементного состава углеродминеральных сорбентов используемые для очистки природных объектов. // Пищевая технология и сервис.Раздел – Химическая технология,экология и биотехнология. Алматы: №5. 2011 г.С.4953 256 А. В. Васильев, Е. В. Гриненко, А. О. Щукин, Т. Г. Федулина. Инфракрасная спектроскопия органических и природных соединений// Учебное пособие для студентов химических и химико-технологических специальностей высших учебных заведений. Санкт-Петербург,2007. С.4-20. 257 Гоулдстейн, Дж. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ: в 2 т. / Дж. Гоулдстейн, Д. Ньюбери, П. Эчлин и др. – М.: Мир, 1984. 133 258 2. Weilie Zhou. Scanning Microscopy for Nanotechnology (Techniques and Applications). / Weilie Zhou (Ed.) Zhong Lin Wang (Ed.) Springer. 2006. 522 p. 259 3. Брандон, Д. Микроструктура материалов. Методы исследования и контроля / Д. Брандон, У. Каплан. – М.: Техносфера, 2004. – 384 с. 260 4. Криштал, М.М. Сканирующая электронная микроскопия и рентгеноспектральный микроанализ в примерах практического применения / М.М. Криштал, И.С. Ясников, В.И. Полунин и др. – М.: Техносфера, 2009. – 208 с. 261 5. Быков, Ю. А. Растровая электронная микроскопия и рентгеноспектральный анализ. Аппаратура, принцип работы, применение / Ю. А. Быков, С. Д. Карпухин, М. К. Бойченко и др. Электр. дан. М.: МГТУ им. Н. Э. Баумана, 2003. Режим доступа: http://lab.bmstu.ru/rem/index/htm 262 Г.М. Зеер, О.Ю. Фоменко, О.Н. Ледяева. Применение сканирующей электронной микроскопиив решении актуальных проблем материаловедения// Journal of Siberian Federal University. Chemistry №4.. 2009 .P.287-293 263 А. И. Власов, К. А. Елсуков, И. А. Косолапов. Электронная микроскопия// Под редакцией заслуженного деятеля науки РФ,члена-корреспондента РАН, профессора В. А. Шахнова. Москва, 2011. С. 46-58 264 http://ru.wikipedia.org/wiki 265 Накамото К. ИК -спектры и спектры КР неорганических и координационных соединений. М.: Мир, 1991. 536 с. 266 Brooker M.Н., Papatheodorou G.N. Vibrational spectroscopy of molten salts and related glasses and vapors //Advances in Molten Salt Chemistry. Amsterdam, Oxford et al.: Elsevier, 1983. V.5. P.26–184. 267 Вовкотруб Э.Г., Салюлев А.Б., Стрекаловский В.Н. Исследование методом КР - микроспектроскопии продуктов окисления FeCl2 жидким хлором в плавах с хлоридами одно-и двухвалентных металлов //Аналитика и контроль. 2003. Т.7, No 3. С.227–230. 268 Букалов С.С. Опыт применения рамановских (КР) спектрометров ―Horiba Jobin Yvon ‖ // Аналитика и контроль. 2007. Т.11, No 1. С. 61–63. 269 Леко В.К., Мазурин О.В. Свойства кварцевого стекла. Л.: Наука, 1985. 166 с. 270 А.Б. Салюлев, И.Д. Закирьянова, В.А. Хохлов. КР-спектроскопия легколетучих галогенидов в конденсированном и газообразном состояниях при повышенных температурах и давлениях паров// Вестник СибГУТИ. 2009. No 3. С.57-63. 271 Л.Н. Пименова. Рентгенофазовый анализ//Методические указания к лабораторной работе по дисциплине «Физико-химические методы исследования».- Томск-2005.- C.4-14 272 Брунауэр С. Адсорбция газов и паров. Т. 1. — М.: ИЛ, 1948. — 783 с. 273 Полторак О.М. Термодинамика в физической химии. — М.: Высшая школа, 1991. — 319 с. 274 Карнаухов А.П. Адсорбция. Текстура дисперсных и пористых материалов. — Новосибирск: Наука, 1999. — 470 с. 134 275 Гладилович Д.Б. Флуориметрический метод контроля содержания нефтепродуктов в водах // Партнеры и конкуренты. − 2001. − №12. − С. 11–15. (www.lumex.ru/library/publication1.pdf) 276 ПНД Ф 14.1:2:4.128-98 (2002). Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в пробах природной, питьевой и сточной воды флуориметрическим методом на анализаторе жидкости ―Флюорат-02‖ (взамен ПНД Ф 14.1:2:4.35-95). НПФ ―Люмекс‖. 277 ПНД Ф 16.1:2.21-98 (с изм.). Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в пробах почв и грунтов флуориметрическим методом с использованием анализатора жидкости ―Флюорат-02‖. НПФ ―Люмекс‖. 278 МУК 4.1.1262-03. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовой концентрации нефтепродуктов флуориметрическим методом в пробах питьевой воды и воды поверхностных и подземных источников водопользования. 279 Xie G, Barcelona M.J, Fang J. Quantification and interpretation of total petroleum hydrocarbons in sediment samples by a GC/MS method and comparison with EPA 418.1 and a rapid field method // Anal Chem. – 1999. – 71, № 9. – P. 1899–1904. 280 Родин А.А., Другов Ю.С., Зенкевич И.Г. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов – М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007 – 270 с. 281 Немировская И.А., Аникиев В.В., Теобальд Н., Раве А. Идентификация нефтяных углеводородов в морской среде при использовании различных методов анализа // Журн. аналит. химии. − 1997. − 52, №4. − С. 392-396. 135
