Экспрессия рецепторов эстрогенов и прогестерона как критерий

Ýêñïðåññèÿ ðåöåïòîðîâ ýñòðîãåíîâ è
ïðîãåñòåðîíà êàê êðèòåðèé îöåíêè
áèîëîãè÷åñêîé ýôôåêòèâíîñòè ãåëÿ
ìèêðîíèçèðîâàííîãî ïðîãåñòåðîíà 8%
(Êðèíîí®) â òåðàïèè ãèïåðïëàçèè ýíäîìåòðèÿ
В.А. Потапов, Е.И.Ханина
Кафедра акушерства и гинекологии ДГМА, Днепропетровск
Г
иперплазия эндометрия (ГЭ) – распространенная гине"
кологическая патология, частота которой значительно
возрастает к периоду перименопаузы. Постарение населе"
ния, связанное с увеличением средней продолжительности
жизни, и увеличение количества женщин, достигших пери"
ода перименопаузы, потенциальный риск малигнизации
(8–50%) и рецидивов заболевания (74–93%) обусловливают
в последние годы повышенный интерес исследователей и
практикующих врачей к проблеме гиперпластических про"
цессов эндометрия [2–4, 6].
Долгое время единственно эффективным и онкопревен"
тивным методом лечения гиперпластических процессов эн"
дометрия была гистерэктомия. Значительный прогресс в по"
нимании этого патологического гормонозависимого процес"
са и накопленный мировой клинический опыт позволяют
предложить альтернативные гистерэктомии патогенетичес"
кие консервативные методы лечения, алгоритм которых, в
зависимости от морфологической формы гиперплазии и воз"
раста женщины, изложен в клиническом протоколе «Гипер"
плазия эндометрия» (приказ МЗ Украины № 676 от
31.12.2004 г.) [1].
Основу концепции лечения морфологически верифици"
рованной гиперплазии эндометрия (после хирургического
удаления измененного эндометрия) составляет гормональ"
ная терапия, направленная на супрессию эндометрия.
В течение всего репродуктивного периода жизни женщи"
ны в эндометрии происходят регулярные циклы периодичес"
кой пролиферации, дифференцировки, отторжения и регене"
рации, четко сопряженные с гормональной активностью го"
над. Под воздействием эстрогенов в слизистой оболочке мат"
ки доминируют процессы пролиферации, что приводит к уве"
личению ее структурных элементов и массы. Переход эндо"
метрия из фазы пролиферации в секреторную обеспечивает
прогестерон, который в природном цикле вырабатывается
желтым телом, образованным пустым фолликулом после
овуляции. Патогенез гиперплазии эндометрия связывают с
абсолютной или относительной гиперэстрогенемией, обычно
возникающей на фоне недостаточности лютеиновой фазы.
Известно, что эстрогены и прогестерон реализуют свое
влияние на отдельные клеточные элементы эндометрия че"
рез связь со специфическими рецепторами – ядерными ре"
цепторами эстрогенов (РЭ) и рецепторами прогестерона
(ПР). В течение нормального менструального цикла содер"
жание в эндометрии РЭ и ПР претерпевает закономерные
колебания, синхронные с изменением концентрации эстра"
диола и прогестерона в общем и маточном кровотоке.
Установлено, что эстрадиол стимулирует синтез рецеп"
торов к эстрадиолу и прогестерону, а прогестерон подавляет
этот процесс, хотя в последнее время появились данные о
162
способности прогестерона повышать количество собствен"
ных рецепторов [5]. С этой точки зрения наиболее естествен"
ным путем достижения супрессии эндометрия является мо"
дификация рецепторов эстрогена и прогестерона в эндомет"
рии, что может быть достигнуто при медикаментозном ис"
пользовании в терапии гиперплазии эндометрия аналогов
прогестерона (прогестинов), которые действуют как анта"
гонисты эстрогенов, подавляя образование ЭР. Кроме того,
прогестины могут потенцировать активность ферментов
17β"дегидрогеназы и сульфотрансферазы, которые участ"
вуют в превращении эстрадиола в слабоактивные метабо"
литы – эстрон и эстрона сульфат.
Обычно при назначении гестагенов учитываются их
фармакологические свойства, оценка побочных действий и
возможных рисков. В большинстве случаев препаратами вы"
бора являются: 12,5% 17"оксипрогестерон капронат, медрок"
сипрогестерона ацетат, микронизированные формы нату"
рального прогестерона, дидрогестерон [6]. С каждым годом
арсенал препаратов – аналогов прогестерона расширяется,
однако доказательная база о их антипролиферативной ак"
тивности, особенно инновационных форм их введения (вну"
тривлагалищные и внутриматочные), явно недостаточная.
Клиническими критериями оценки эффективности гес"
тагенов при лечении гиперплазии эндометрия обычно слу"
жат стабилизация или ликвидация гиперпластического про"
цесса при контрольных повторных патогистологических ис"
следованиях биоптатов эндометрия после второго этапа ле"
чения (в соответствии с отраслевым клиническим протоко"
лом) [1]. И если для рутинной медицинской практики мор"
фологического исследования эндометрия более чем доста"
точно для выбора дальнейшей стратегии терапии, то для
сравнения биологической и клинической эффективности то"
го или иного гестагена целесообразна разработка более объ"
ективных критериев оценки их антипролиферативной ак"
тивности.
Необходимо отметить, что гиперплазия эндометрия яв"
ляется исключительно удачной естественной моделью для
проведения подобных исследований, т.к. биопсия и гистоло"
гическое исследование эндометрия, которые проводятся в
соответствии с клиническим протоколом (при подозрении
на гиперплазию эндометрия и через 3 и 6 мес после курса ле"
чения гестагенами для оценки терапевтического эффекта),
позволяют параллельно провести в тканях биоптата имму"
ногистохимическое исследование состояния РЭ и РП. Это
дает юридические основания и доказательную базу для
оценки биологической активности любого препарата прогес"
терона без дополнительной агрессивной инвазии.
Цель исследования – оценить биологическую эффектив"
ность геля микронизированного прогестерона 8% (Кринон®)
ЗДОРОВЬЕ ЖЕНЩИНЫ №7 (43)/2009
в терапии гиперплазии эндометрия по результатам исследо"
вания экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона
после 3"месячного курса лечения.
Кринон® (гель прогестерона) представляет собой биоад"
гезивный вагинальный гель, содержащий микронизирован"
ный прогестерон в виде эмульсии; гель вводится с помощью
одноразовых цельных полиэтиленовых аппликаторов. Носи"
телем действующего вещества является эмульсия типа «мас"
ло в воде», содержащая нерастворимый, но разбухающий в
воде полимер – поликарбофил. Прогестерон в препарате ча"
стично растворен как в масляной, так и в водной фазе носи"
теля, причем большая часть прогестерона находится в виде
суспензии. Каждый аппликатор предназначен для доставки
1,125 г геля Кринон®, содержащих 90 мг прогестерона (8%
гель) в гелевой основе, состоящей из глицерина, минераль"
ного масла, поликарбофила, карбомера 934Р, гидрогенизи"
рованных глицеридов пальмового масла, сорбиновой кисло"
ты, натрия гидроксида и очищенной воды. Кринон® 8% (гель
прогестерона) вводится вагинально 1 или 2 (при полной не"
достаточности лютеиновой фазы) раза в день женщинам, ко"
торые требуют проведения заместительной терапии с приме"
нением прогестерона [3].
Преимущество препарата Кринон® перед другими геста"
генами в том, что отсроченное высвобождение, обусловлен"
ное биоадгезивной системой доставки, обеспечивает биодо"
ступность прогестерона на протяжении не менее 48 ч после
одноразового вагинального введения, что, в свою очередь,
позволяет проводить эффективное введение препарата с ча"
стотой 1 раз в день. Несмотря на то, что специфические ме"
ханизмы действия Кринона (геля прогестерона) при ваги"
нальном введении неизвестны и сывороточные концентра"
ции, которые достигаются при применении Кринона, обыч"
но являются субфизиологическими, отмечено, что отклик
эндометрия на внутривагинальное введение прогестерона
является физиологическим и сопровождается его типичной
секреторной трансформацией, что позволяет предположить
существование «маточного эффекта первого пути метабо"
лизма». При этом для диффузии прогестерона из шейки до
дна матки в условиях ex"vivo перфузионной ее модели и,
следовательно, для достижения равновесных тканевых уров"
ней требуется около 5 ч [3].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследование были включены 13 женщин в возрасте
44–54 лет (средний возраст 47,3±5,4 года) с верифицирован"
ной впервые простой неатипичной гиперплазией эндомет"
рия при патоморфологическом исследовании биоптатов.
Биоптат для исследования получали путем фракционного
выскабливания полости матки на 21–23"й день менструаль"
ного цикла. Основанием для диагностического выскаблива"
ния слизистой оболочки матки служили нарушение овари"
ально"менструального цикла (нерегулярные, обильные, дли"
тельные кровотечения, межменструальные кровомазания) и
ультразвуковые признаки гиперплазии эндометрия (толщи"
на слизистой оболочки более 16 мм).
Критерии исключения: сочетание гиперпластического
процесса с миомой матки и эндометриозом, а также прием
гормональной заместительной терапии или КОК в послед"
ние 5 лет.
Кринон 8% назначали с 5"го по 25"й день цикла в дозе
90 мг 1 раз в сутки интравагинально на протяжении трех
менструальных циклов. После окончания 3"месячного кур"
са лечения проводили контрольное патоморфологическое
и иммуногистохимическое исследование биоптата эндоме"
трия.
Фрагменты эндометрия фиксировали в 10% растворе
нейтрального забуференного формалина в течение 12 ч с це"
ЗДОРОВЬЕ ЖЕНЩИНЫ №7 (43)/2009
лью сохранения целостности антигенных детерминант кле"
ток и тканей.
После фиксации и проводки по стандартной методике
материал заливали в парафин. Парафиновые срезы после ок"
раски гематоксилином и эозином подвергали микроскопиче"
скому исследованию в световом микроскопе «Leіca DMLS»
с использованием объективов Ч10, Ч20, Ч40, Ч100.
Для выявления РЭ и РП применяли иммуногистохими"
ческий метод с использованием меченного стрептавидином
биотина и набора реактивов фирмы «Дако» (Дания). Крио"
статные срезы толщиной 4–5 мкм наносили на предметные
стекла, предварительно обработанные адгезивной жидкостью
(poly"L"lysine), затем депарафинировали и дегидрировали со"
гласно принятым стандартам с последующей тепловой ин"
дукцией (HIER) в восстанавливающем буфере на водяной
бане при температуре 90–95 оС в течение 20–30 мин (с целью
обновления структур антигенов перед иммуноокраской).
Дальнейший протокол исследования включал ингибиро"
вание эндогенной пероксидазы и трехэтапную иммунофер"
ментную реакцию. На первом этапе наносили немеченые
первичные моноклональные антитела к РЭ и РП (клоны 1Д5
та 1А6 соответственно). На втором этапе – антитела, связы"
вающие вторичные биотиновые мишени, затем – стрептави"
дин, конъюгированый с пероксидазой хрена. Активность пе"
роксидазы определяли с помощью гистохимической реак"
ции с диаминобензидином. Докрашивание препаратов про"
водили рабочим раствором гематоксилина. Весь ход имму"
ногистохимического исследования контролировали экспо"
зиционно после кажного этапа реакции.
Поскольку РЭ и РП – исключительно ядерные антиге"
ны, при оценке иммуноокрашивания учитывали только
ядерную реакцию, которая проявлялась от желтого до тем"
но"коричневого цвета. Позитивное окрашивание выражали
в проценте клеток, которые отреагировали, а также по выра"
женности реакции в них. В зависимости от варианта окраски
оценку проводили следующим образом: «–» – отсутствие ок"
раски (отсутствие экспрессии) рецепторов, «+» – слабая ок"
раска (слабая экспрессия), «++» – умеренная окраска (уме"
ренная экспрессия) и «+++» – выраженная окраска (выра"
женная экспрессия). Затем вычисляли индекс Н в 100 иссле"
дованных клетках по формуле:
Н=(0 х % неокрашенных клеток) + (1 х % слабо окрашен"
ных клеток) + (2 х % умеренно окрашенных клеток) + (3 х %
интенсивно окрашенных клеток).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты контрольного морфологического исследова"
ния биоптатов эндометрия после 3"месячного курса терапии
препаратом Кринон® у женщин с простой неатипичной ги"
перплазией эндометрия показали, что у 12 (92,3%) из 13
женщин признаки гиперплазии эндометрия не выявлены, в 1
случае были обнаружены явления очаговой простой неати"
пичной гиперплазии, что в целом свидетельствует о положи"
тельных результатах терапии вышеуказанным гестагеном.
Результаты иммуногистохимического исследования экс"
прессии РЭ в РП в эпителии эндометрия у исследуемых
женщин до и после 3"месячного курса лечения препаратом
Кринон® (8% гель прогестерона) представлены в таблице.
Как следует из данных таблицы, практически у всех па"
циенток при иммуногистохимическом исследовании распре"
деления в эпителии эндометрия стероидных рецепторов от"
мечена достаточно выраженная экспрессия как РЭ, так и РП,
при этом отношение РЭ/РП в среднем составляло 1,1±0,08,
что свидетельствовало о доминировании РЭ.
После 3"месячного курса лечения препаратом Кринон®
(см. рис. 1) в эпителиальных клетках эндометрия наблюда"
163
Òàáëèöà
Номер пробы
Ýêñïðåññèÿ ðåöåïòîðîâ ýñòðîãåíîâ è ïðîãåñòåðîíà â èññëåäîâàííûõ ïðîáàõ ýíäîìåòðèÿ ó æåíùèí
ñ ãèïåðïëàçèåé ýíäîìåòðèÿ äî è ïîñëå ëå÷åíèÿ ïðåïàðàòîì Êðèíîí® (n =13)
Исходные значения
РЭ
После лечения препаратом Кринон®
РП
РЭ
ИнтенсивИнтенсивность
Индекс Н
ность
Индекс Н
окраски
окраски
РЭ/РП
1
+++
230
+++
260
0,88
2
+++
200
+++
220
0,9
3
+++
230
+++
250
0,92
4
+++
230
+++
250
0,92
5
+++
220
+++
230
6
+++
210
+++
200
7
+++
230
+++
8
+++
260
9
+++
240
10
+++
11
12
13
РП
ИнтенсивИнтенсивность
Индекс Н
ность
Индекс Н
окраски
окраски
70
+++
220
0,32
+
90
+++
230
0,39
++
180
+++
260
0,69
++
170
+++
240
0,7
0,95
++
150
+++
250
0,6
1,0
++
120
+++
230
0,52
200
1,1
++
95
+++
230
0,41
+++
215
1,2
+
55
+++
220
0,25
+++
200
1,2
++
100
+++
270
0,37
250
+++
200
1,25
++
150
+++
220
0,68
+++
230
++
180
1,27
+
70
+++
230
0,3
+++
220
++
170
1,29
++
170
+++
250
0,68
++
180
+
70
2,5
+
50
+
70
0,7
лось почти двукратное (на 49,8%) уменьшение экспрессии
РЭ во всех биоптатах, при этом более чем на 50% – в
7 (53,8%) случаях, от 25 до 50% – в 4 (30,8%). Закономерно"
стей в выраженности супрессии экспрессии РЭ в зависимос"
ти от их исходного значения нами не выявлено – она была
достаточно значима после лечения как в случаях с высокой
исходной экспрессией РЭ (Н >220), так и в случаях с уме"
ренными значениями экспрессии РЭ в биоптатах эндомет"
рия (Н <220).
Модификация РП в сторону некоторого снижения их
экспрессии наблюдалось только в 2 случаях. В большинстве
же исследованных препаратов наблюдалась тенденция к по"
вышению экспрессии РП в среднем на (10,3±1,4)%; в 3 (23%)
случаях экспрессия РП увеличилась более чем на 25%.
+
РЭ/РП
Главным же результатом проведенного исследования,
по"видимому, является достигнутая в результате лечения
препаратом Кринон® модификация соотношения экспрес"
сии стероидных рецепторов в эндометрии с достоверным
преобладанием РП над РЭ (соотношение РЭ/РП = 0,5±0,02
против 1,1±0,08 до лечения).
Результаты иммуногистохимического исследования РЭ
и РП в биоптатах эндометрия после 3"месячной терапии
препаратом Кринон® свидетельствуют, что гель прогестеро"
на 8% при влагалищном введении обладает выраженным
биологическим эффектом, присущим гестагенам, а именно –
достоверно уменьшает экспресиию РЭ и увеличивает коли"
чество РП в эпителиальных клетках эндометрия. При этом
проиходила существенная модификация соотношения РЭ и
Ðèñ. 1. Ãèñòîãðàììà ìîäèôèêàöèè ðåöåïòîðîâ ýñòðîãåíîâ è ïðîãåñòåðîíîâ ïîñëå 3-ìåñÿ÷íîãî èíòðàâàãèíàëüíîãî ïðèìåíåíèÿ ïðåïàðàòà Êðèíîí®, % (n=13)
164
ЗДОРОВЬЕ ЖЕНЩИНЫ №7 (43)/2009
До лечения
После лечения
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Ðèñ. 2. Ãèñòîãðàììà ñîîòíîøåíèÿ ÐÝ/ÐÏ äî è ïîñëå 3-ìåñÿ÷íîãî èíòðàâàãèíàëüíîãî ïðèìåíåíèÿ ïðåïàðàòà Êðèíîí®,
% (n=13)
РП (рис. 2). Если до начала терапии РЭ в какой"то степени
преобладали над РП (соотношение РЭ/РП = 1,1), то после
терапии препаратом Кринон® это соотношение приблизи"
лось к физиологическим значениям (РЭ/РП=0,5). Наблюда"
емые структурные изменения рецепторного аппарата клеток
эндометрия в процессе лечения препаратом Кринон® у боль"
шинства пациенток сопровождались исчезновением морфо"
логических признаков гиперплазии эндометрия при иссле"
довании биоптатов через 3 мес от начала терапии.
Это обстоятельство дает теоретические и клинические
предпосылки для утверждения, что препарат Кринон® явля"
ется эффективным средством терапии гиперплазии эндоме"
трия. Препарат Кринон®, вероятно, может быть также поле"
зен для лечения патологических состояний, связанных с от"
носительной гиперэстрогенией (миома матки, эндометриоз);
нарушением менструальной функции и бесплодием, обус"
ловленных недостаточностью лютеиновой фазы (ановуля"
торный цикл, овуляторный цикл с недостаточной секретор"
ной трансформацией эндометрия); невынашиванием бере"
менности ранних сроков при недостаточной функции желто"
го тела и низких концентрациях прогестрона в крови.
ВЫВОДЫ
1. Гель прогестерона 8% для влагалищного введения
(Кринон®) селективно уменьшает экспрессию эстрогеновых
рецепторов, потенцирует экспрессию прогестероновых ре"
цепторов и модифицирует их соотношение в эндометрии,
ЗДОРОВЬЕ ЖЕНЩИНЫ №7 (43)/2009
что дает основания для эффективного его использования в
терапии гиперпролиферативных процессов репродуктивных
органов
2. Исследование экспрессии рецепторов эстрогенов и
прогестерона в биоптате эндометрия является обьективным
критерием оценки биологической эффективности препара"
тов гестагенного ряда, а гиперплазия эндометрия является
адекватной моделью для подобной оценки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Наказ МОЗ України № 676 від
31.12.2004 «Про затвердження
клінічних протоколів з акушерської та
гінекологічної допомоги».
2. Выбор метода терапии гиперпла&
зии эндометрия в перименопаузе /
Карпушева Л.М., Комарова С.В., Иб&
рагимова З.А. и др. // Акушерство и
гинекология. – 2005. – № 6. –
С. 37–42.
3. Диагностика и лечение гиперпла&
стических процессов эндометрия /
Коханевич Е.В., Мицкевич В.Е.,
Манжура Е.П. и др. // Здоровье
женщины. – 2005. – № 1 (21). –
С. 234–242.
4. Концепція активної профілактики
та реабілітації – основа сучасної
стратегії при гіперплазії ендометрія /
Венцківський Б.М., Борода А.М.,
Яроцький М.Є. та ін. // Здоровье
женщины. – 2006. – № 2 (26). –
С. 90–94.
5. Кринон® гель прогестерона 8%:
Монография //Merck Serono.
6. Побединский Н.М., Балтуц&
кая О.И., Омельяненко А.И. Стероид&
ные рецепторы нормального эндоме&
трия // Акушерство и гинекология. –
2000. – № 3. – С. 5–8.
7. Татарчук Т.Ф., Бурлака Е.В. Со&
временные принципы диагностики и
лечения гиперпластических процес&
сов эндометрия // Здоровье женщи&
ны. – 2003. – № 4 (16). –
С. 107–114.
165