Загрузить (1458 КБ)

2013 ВЕСТНИК НОВГОРОДСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА
№71 Т.1
ТЕРАПИЯ
УДК 616.12-07:616.127-004:616-08-07
РОЛЬ ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ МИОКАРДА В ФИБРОБЛАСТИЧЕСКОМ ПРОЦЕССЕ
ПРИ АДРЕНЕРГИЧЕСКОМ И ХОЛИНЕРГИЧЕСКОМ ВАРИАНТАХ ОСТРОГО СТРЕССА
В.Р.Вебер, Ю.В.Лобзин*, В.Е.Карев*, С.В.Жмайлова, Е.Е.Румянцев
Институт медицинского образования НовГУ, zhmailova.svetlana@yandex.ru
*НИИ Детских инфекций ФМБА России, Санкт-Петербург
Статья посвящена изучению участия эндотелиоцитов в развитии фибротического процесса при остром стрессе.
Авторы исходят из того, что эндотелиоциты кровеносных сосудов миокарда играют значительную роль в развитии фиброза
миокарда. Экспрессия эндотелиоцитами фактора роста FGF-2 влияет на активацию фибробластов, вырабатывающих TGF-β1,
который является одним из основных регуляторов кардиофиброза.
Ключевые слова: артериальная гипертензия, холодовой стресс, психоэмоциональная проба, диастолическая
функция сердца, парасимпатическая нервная система, симпатическая нервная система, амлодипин
The article is devoted to the investigation of the endotheliocytes’ role in the fibrous degeneration process in acute stress. The
authors’ hypothesis is based on the statement that myocardium blood vessel endotheliocytes play a significant role in the development
of fibroid heart. The expression of growth factor FGF-2 by the endotheliocytes affects the activation of the TGF-β1-producing fibroblasts,
which is one of the main regulators of cardio-fibrosis.
Keywords: myocardium endotheliocytes, acute stress, FGF-2, TGF-β1, endothelial-mesenchymal transition, cardio-fibrosis
Эндотелиоциты кровеносных сосудов миокарда играют значительную роль в развитии фиброза
миокарда. Эндотелиоциты вырабатывают факторы
роста фибробластов [1-3]. Экспрессия эндотелиоцитами фактора роста FGF-2 влияет на активацию фибробластов, вырабатывающих TGF-β1, который является одним из основных регуляторов кардиофиброза.
Известно, что одним из самых радикальных изменений эндотелиоцитов является эндотелиальномезенхимальная трансформация при патологических
процессах, в результате которой эндотелиоциты дополняют пул фибробластов миокарда [4-6]. Безусловно,
представляет интерес участие эндотелиоцитов в развитии фибротического процесса при остром стрессе.
Цель исследования: изучить роль эндотелия сосудов миокарда в фибробластическом процессе при
адренергическом и холинергическом вариантах острого стресса.
мента моделировался острый адренергический стресс
(АС) путем однократного интраперитонеального введения крысам адреналина из расчета 50 мкг/кг (доза
адреналина подбиралась эмпирически, и главным условием было отсутствие при данной дозе некроза
кардиомиоцитов); у крыс II серии — однократным
интраперитонеальным введением антихолинэстеразного препарата прозерин из расчета 20 мкг/кг моделировался острый холинергический стресс (ХС). Через 2 часа, 6 часов, 24 часа и через один месяц после
однократного введения адреналина и прозерина под
эфирным наркозом проводилась декапитация и забор
материала на исследование.
В качестве контроля исследованы 10 крыс соответствующего возраста и массы, не повергавшиеся
медикаментозным и стрессовым воздействиям.
Кусочки тканей фиксировали в 10%-м растворе
нейтрального формалина, дегидратировали в спиртах
возрастающей концентрации и заливали в парафин.
Парафиновые срезы для морфологического исследования окрашивали гематоксилином и эозином и по
Ван-Гизону. С помощью сетки Г.Г.Автандилова [7]
проводилась морфометрия в 45 полях зрения в каждом желудочке сердца, в каждой серии эксперимента.
Оценивалось количество (в объемных процентах,
об.%) кардиомиоцитов, коллагена, сосудов и объема
внеклеточного пространства.
Иммуногистохимические исследования проводились с использованием автоматической установки
для иммуногистохимического и иммуноцитологического окрашивания препаратов Autostainer 360 (Thermo
Shandon, Великобритания). Использовались мышиные
моноклональные антитела к TGF β1 (TB21) в разведении 1/100, кроличьи поликлональные антитела к FGF-
Материал и методы
Эксперимент проводился на крысах-самцах линии Вистар, сопоставимых по возрасту и массе, в соответствии с Европейской конвенцией о защите животных, используемых в эксперименте (Директива
86/609/ЕЕС). Протокол эксперимента, содержание животных и выведение их из опыта были составлены в
соответствии с принципами биоэтики, изложенными в
«Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003
«Об утверждении правил лабораторной практики».
Острый эксперимент проводился на 2 сериях
крыс (по 20 крыс в каждой серии). В I серии экспери-
5
2013 ВЕСТНИК НОВГОРОДСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА
2(147) в разведении 1/400 производства Santa Cruz Biotechnology, Inc., США, антитела к коллагену I типа, а
также полимерная иммуногистохимическая система
визуализации EnVision (DAKO, США) в соответствии
с рекомендациями производителей реагентов. В качестве оптически плотной метки, визуализирующей продукт иммуногистохими-ческой реакции, использовался
диаминобензидин. После проведения иммуногистохимической реакции гистологические препараты докрашивались гематоксилином. Учет результатов иммуногистохимической реакции проводился с использованием светооптического бинокулярного микроскопа
AxioscopeA1 (Carl Zeiss, Германия), TGF β1, FGF-2 и
коллаген I — позитивные клетки имели отчетливое
коричневое окрашивание. В 9 полях зрения миокарда
левого желудочка (ЛЖ) и правого желудочка (ПЖ)
каждой крысы в проводимом эксперименте рассчитывался индекс экспрессии (ИЭ) — количество TGF β1 и
FGF-2 позитивных клеток в 1 мм2 миокарда. Площадь
1 поля зрения, с учетом увеличения микроскопа
(×400), составляла 0,088 мм2 (из расчета длина изображения 0,355 мм, умноженная на ширину изображения 0,248 мм). Так же определялся индекс активности
(ИА) эндотелиоцитов, который рассчитывался как
процент эндотелиоцитов, экспрессирующих факторы
роста фибробластов от общего количества клеток, экспрессирующих фактор роста фибробластов (%).
№71 Т.1
1
Рис.2. Миокард правого желудочка через 2 часа после однократного введения прозерина. ИГХ реакция, ув. ×400, TGF-β1
окрашен маркером (DAB) в коричневый цвет. Эндотелиоциты
(1) с экспрессией TGF-β1 разной степени выраженности. Сильная и средняя экспрессия TGF-β1 наблюдается и в других непаренхиматозных клетках миокарда
Через 24 часа после введения адреналина эндотелиоцитов, экспрессирующих TGF-β1 в ЛЖ, также
было значительно больше и доля их составила 24%,
тогда как в ПЖ таких эндотелиоцитов с сильной и
средней экспрессией выявлено не было. При ХС в
контрольной точке 24 часа ситуация противоположная — в ЛЖ эндотелиоцитов с сильной и средней экспрессией не было выявлено, определялись только
клетки со слабой экспрессией, тогда как в ПЖ при
ХС экспрессирующих TGF-β1 эндотелиоцитов (сильная и средняя экспрессия) было 56%.
Таким образом, анализ полученных данных
показал, что при остром стрессе, независимо от его
варианта, выявляются эндотелиоциты, экспрессирующие фактор роста TGF-β1. Максимальное количество эндотелиоцитов, экспрессирующих TGF-β1,
отмечено через 24 часа при АС в ЛЖ — 24%, а при
ХС максимальная экспрессия TGF-β1 эндотелиоцитами отмечена через 24 часа в ПЖ — 56% (рис.3,4).
Результаты исследования
В процессе анализа полученных данных были
выявлены эндотелиоциты, экспрессирующие факторы
роста фибробластов FGF-2 (рис.1) и TGF-β1 (рис.2).
Помимо макрофагов и фибробластов, в фибротическом процессе участвуют эндотелиоциты, экспрессирующие как факторы роста фибробластов, так и коллаген I типа. Доля эндотелиоцитов, экспрессирующих
TGF-β1 при АС (рис.3) в ЛЖ в контрольной точке 2
часа, составляла 20%, тогда как в ПЖ — 6%
(χ2 = 11,681, р = 0,001). При ХС в контрольной точке
2 часа так же было больше эндотелиоцитов, экспрессирующих TGF-β1, в ЛЖ нежели в ПЖ: 12% и 1%
соответственно (χ2 = 8,444, р = 0,004) (рис.4).
2
1
Рис.1. Миокард правого желудочка через 1 месяц после однократного введения прозерина. ИГХ реакция, ув. ×400, FGF2 окрашен маркером (DAB) в коричневый цвет. Эндотелиоциты с экспрессией FGF-2 разной степени выраженности: 1 —
сильной, 2 — средней. Средняя и слабая экспрессия FGF-2
наблюдается и в других немногочисленных непаренхиматозных клетках миокарда
Рис.3. Индекс активности эндотелиоцитов по TGF-β1 в левом
и правом желудочках при адренергическом варианте стресса
6
2013 ВЕСТНИК НОВГОРОДСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА
№71 Т.1
прессирующих FGF-2, наблюдалась через 6 часов после введения прозерина и составила 6%. Через месяц
после однократного введения прозерина индекс активности эндотелиоцитов, экспрессирующих FGF-2, также оставался примерно на уровне значений в контрольной точке 2 часа и не превышал 4% (рис.6).
Рис.4. Индекс активности эндотелиоцитов по TGF-β1 в левом
и правом желудочках при холинергическом варианте стресса
Причина выявленной разницы в активности
эндотелиоцитов ПЖ и ЛЖ, синтезирующих фактор
роста TGF-β1, требует дополнительного анализа.
Активность эндотелиоцитов, экспрессирующих FGF-2, при остром адренергическом стрессе
практически не менялась и даже через месяц после
однократного введения адреналина как в ПЖ, так и в
ЛЖ оставалась на уровне контрольной точки 2 часа,
не более 7% (рис.5).
Рис.6. Индекс активности эндотелиоцитов по FGF-2в левом и
правом желудочках при холинергическом варианте стресса
То есть, как при адренергическом, так и при
холинергическом остром стрессе отдаленные последствия были аналогичны: через месяц после однократного введения препаратов часть эндотелиоцитов продолжала вырабатывать FGF-2, поддерживая фибробластические процессы в миокарде.
Интересно отметить, что через месяц после
введения адреналина индекс активности эндотелиоцитов, экспрессирующих TGF-β1, в обоих желудочках был равен 0, т. е. через месяц наблюдения экспрессирующих TGF-β1 эндотелиоцитов вообще найдено не было. При ХС индекс активности эндотелиоцитов, экспрессирующих TGF-β1, как в ЛЖ, так и в
ПЖ составил 13% и 12% соответственно. То есть выработка TGF-β1 продолжалась и через месяц после
однократного введения прозерина.
Если учесть, что TGF-β1 стимулирует выработку
FGF-2, а также непосредственно участвует в эндотелиально-мезенхимальной трансформации [1,2,6], то можно
предположить, что острый стресс запускает профибротические процессы в миокарде, которые продолжаются
и через месяц после однократного введения препаратов.
Результаты исследования показали, что в период как адренергического, так и холинергического острого стресса появляются эндотелиоциты, экспрессирующие коллаген I типа. Максимум ИЭ коллагена I
приходился на контрольную точку 2 часа после введения препаратов (рис.7,8,10), за исключением правого
желудочка, где максимальная экспрессия коллагена
эндотелиоцитами отмечалась в контрольной точке 6
часов при адренергическом варианте стресса (рис.9).
Рис.5.Индекс активности эндотелиоцитов по FGF-2 в левом и
правом желудочках при адренергическом варианте стресса
При остром холинергическом стрессе в ЛЖ индекс активности эндотелиоцитов, экспрессирующих
FGF-2, также оставался примерно на одном уровне в
контрольных точках 2, 6, 24 часа и не превышал 5%. В
ПЖ максимальная активность эндотелиоцитов, экс-
7
2013 ВЕСТНИК НОВГОРОДСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА
№71 Т.1
Значения ИЭ коллагена I эндотелиоцитами в
обоих желудочках при адренергическом и холинергическом вариантах стресса в контрольной точке 2 часа были примерно одинаковы. Можно предположить, что
механизм эндотелиально-мезенхимальной трансформации и, как следствие, выработка коллагена эндотелиоцитами-фибробластами (клетками, производными этой
трансформации) запускается в первые часы стресса вне
зависимости от его варианта. Можно отметить тенденцию к повышению ИЭ коллагена I типа эндотелиоцитами в контрольной точке 2 часа при холинергическом
варианте стресса (рис.8,10) по сравнению с АС (рис.7,9).
ИЭ коллагена I типа эндотелиоцитами сводится практически до минимума через 24 часа. При холинергическом варианте стресса резкое снижение
индекса экспрессии коллагена I эндотелиоцитами наблюдается уже в контрольной точке 6 часов (в 4,3
раза в ЛЖ и в 2,7 в ПЖ по сравнению с 2 часами).
Рис.9. Индекс экспрессии коллагена I эндотелиоцитами
(сильная и средняя) и FGF-2, TGF-β1 (сильная) клетками в
правом желудочке при адренергическом варианте стресса
Рис.7. Индекс экспрессии коллагена I эндотелиоцитами
(сильная и средняя) и FGF-2, TGF-β1 (сильная) клетками в
левом желудочке при адренергическом варианте стресса
Рис.10 Индекс экспрессии коллагена I эндотелиоцитами
(сильная и средняя) и FGF-2, TGF-β1 (сильная) клетками в
правом желудочке при холинергическом варианте стресса
Через месяц после острого адренергического
стресса 2,5 кл./мм2 эндотелиоцитов в ЛЖ продолжали
вырабатывать коллаген I типа (рис.7), в ПЖ таких
клеток не было найдено (рис.9).
Анализ отдаленных последствий острого ХС
показал, что и через месяц в миокарде наблюдались
эндотелиоциты-«фибробласты»,
продолжающие
вырабатывать коллаген I типа: в миокарде ЛЖ —
0,3 кл./мм2 , а в ПЖ — 2,5кл./мм2. Через 1 месяц
после введения прозерина ИЭ коллагена I эндотелиоцитами в ПЖ в 8,3 раза выше, чем в левом, что,
вероятно, связано с особенностями дренажной системы ПЖ и более медленным их выведением из
сосудистого русла и внеклеточного пространства
ПЖ.
Рис.8. Индекс экспрессии коллагена I эндотелиоцитами
(сильная и средняя) и FGF-2, TGF-β1 (сильная) клетками в
левом желудочке при холинергическом варианте стресса
8
2013 ВЕСТНИК НОВГОРОДСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА
4.
5.
1
6.
7.
№71 Т.1
Watabe. TGF-b-induced mesenchymal transition of MS-1
endothelial cells requires Smad-dependent cooperative
activation of Rho signals and MRTF-A // J. Biochem. 2012.
V.151. №2. P.145-156.
Damian Medici, Scott Potenta and Raghu Kalluri.
Transforming growth factor-β2 promotes Snail-mediated
endothelial-mesenchymal transition through convergence of
Smad-dependent and Smad-independent signalling //
Biochem. J. 2011. V.438. P.515-520.
Ghosh A.K., Nagpal V., Covington J.W., Michaels M.A.,
Vaughan D.E. Molecular basis of cardiac endothelial-tomesenchymal transition (EndMT): differential expression of
microRNAs during EndMT // Cell Signal. 2012. V.24. №5.
P.1031-1036.
Piera-Velazquez S., Li Z., Jimenez S.A. Role of endothelialmesenchymal transition (EndoMT) in the pathogenesis of fibrotic
disorders // Am. J. Pathol. 2011. V.179. №3. Р.1074-1080.
Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия: Руководство. М.: Медицина, 1990. С.204-205.
Bibliography (Translitеrated)
Рис.11. Миокард левого желудочка через 2 часа после однократного введения прозерина. ИГХ реакция, ув .×400, коллаген
I типа окрашен маркером (DAB) в коричневый цвет. Эндотелиоциты (1) с экспрессией коллагена I. Экспрессия коллагена I
наблюдается и в других непаренхиматозных клетках миокарда
1.
2.
По существующим сегодня представлениям
трансформация эндотелиоцитов в фибробласты происходит только при патологическом процессе. Существование эндотелиоцитов, продолжающих вырабатывать
коллаген I типа через месяц после острого стресса, позволяет
говорить
о текущей
эндотелиальномезенхимальной трансформации и продолжающемся
патологическом процессе фиброгенеза в миокарде крыс.
3.
4.
5.
1.
2.
3.
Anna Biernacka and Nikolaos G. Frangogiannis. Aging and
Cardiac Fibrosis // Aging and Disease. 2011. V.2. №2. P.158173.
Yasuhiro Yoshimatsu, Tetsuro Watabe. Roles of TGF-β
Signals in Endothelial-Mesenchymal Transition during
Cardiac Fibrosis // International Journal of Inflammation.
2011. V.10. P.1-8.
Hajime Mihira, Hiroshi I. Suzuki, Yuichi Akatsu, Yasuhiro
Yoshimatsu, Takashi Igarashi, Kohei Miyazono and Tetsuro
6.
7.
9
Anna Biernacka and Nikolaos G. Frangogiannis. Aging and
Cardiac Fibrosis // Aging and Disease. 2011. V.2. №2. P.158173.
Yasuhiro Yoshimatsu, Tetsuro Watabe. Roles of TGF-β
Signals in Endothelial-Mesenchymal Transition during
Cardiac Fibrosis // International Journal of Inflammation.
2011. V.10. P.1-8.
Hajime Mihira, Hiroshi I. Suzuki, Yuichi Akatsu, Yasuhiro
Yoshimatsu, Takashi Igarashi, Kohei Miyazono and Tetsuro
Watabe. TGF-b-induced mesenchymal transition of MS-1
endothelial cells requires Smad-dependent cooperative
activation of Rho signals and MRTF-A // J. Biochem. 2012.
V.151. №2. P.145-156.
Damian Medici, Scott Potenta and Raghu Kalluri.
Transforming growth factor-β2 promotes Snail-mediated
endothelial-mesenchymal transition through convergence of
Smad-dependent and Smad-independent signalling //
Biochem. J. 2011. V.438. P.515-520.
Ghosh A.K., Nagpal V., Covington J.W., Michaels M.A.,
Vaughan D.E. Molecular basis of cardiac endothelialtomesenchymal transition (EndMT): differential expression of
microRNAs during EndMT // Cell Signal. 2012. V.24. №5.
P.1031-1036.
Piera-Velazquez S., Li Z., Jimenez S.A. Role of endothelialmesenchymal transition (EndoMT) in the pathogenesis of fibrotic
disorders // Am. J. Pathol. 2011. V.179. №3. R.1074-1080.
Avtandilov G.G. Medicinskaja morfometrija: Rukovodstvo.
M.: Medicina, 1990. S.204-205.