Особенности экспрессии рецепторов пролактина в опухолях печени разного клеточного происхождения
реклама
На правах рукописи Остроухова Татьяна Юрьевна Особенности экспрессии рецепторов пролактина в опухолях печени разного клеточного происхождения Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Cпециальность 03.00.13 – физиология, 03.00.03 – молекулярная биология Москва – 2008 1 Работа выполнена в лаборатории эндокринологии кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; в лаборатории молекулярной эндокринологии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: Ольга Вячеславовна Смирнова доктор биологических наук Петр Михайлович Рубцов доктор биологических наук, профессор ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Владимир Борисович Кошелев доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной и патологической физиологии ГУНУ факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова Василий Николаевич Бабичев доктор биологических наук, профессор, заместитель директора по научной работе ФГУ Эндокринологического научного центра Росмедтехнологий ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Научно-исследовательский институт канцерогенеза Российского онкологического научного центра имени Н.Н. Блохина РАМН Защита состоится 24 марта 2008 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании диссертационного Ученого Совета Д501.001.93 биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, ауд. М-1. С диссертацией можно ознакомится в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Автореферат разослан 24 февраля 2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук 2 Б.А. Умарова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Болезни печени включают в себя обширную полиэтиологическую группу заболеваний человека, в которую входят такие поражения печени как холецистит, холелитиаз, печеночноклеточная недостаточность, гепатиты, цирроз и опухоли печени. Эти заболевания приводят как к значительному ухудшению качества жизни пациентов, так во многих случаях и к смерти. В разных странах злокачественные новообразования печени составляют от 2% до 50% всех опухолей, и при этом доля их постоянно увеличивается (Aguayo and Patt, 2001, Patel, 2002, Slattery and Sahani, 2006). За последние десятилетия уровень смертности от рака печени также растет, при этом данный тип заболевания наиболее трудно диагностируется и плохо поддается лечению. Пролактин, гормон передней доли гипофиза, регулирует широкий спектр функций различных типов клеток, и может секретироваться местно как аутокринный регулятор многих типов клеток, включая опухолевые (Bole-Feysot et al., 1998, Clevenger et al., 2003). В организме млекопитающих пролактин участвует в регуляции роста, дифференцировки, размножения, метаболизма, поведения, иммуномодуляции и осморегуляции (Bole-Feysot et al., 1998). Пролактин является также важным регулятором функций печени, где он индуцирует пролиферацию гепатоцитов и холангиоцитов (Орлова с соавт, 1999б, Piccoletti et al, 1997, Orlova et al, 1998, Smirnova and Orlova, 1999), регулирует рост и дифференцировку гепатоцитов (Розен и др., 1991, Zabala and Garcia-Ruiz, 1989, Crowe et al, 1991, Berlanga et al, 1995), осуществляет соматогенные эффекты (Murphy et al, 1988), регулирует обмен и экзокринные функции гепатоцитов (Bole-Feysot et al., 1998). Пролактин реализует свои эффекты, взаимодействуя с рецепторами (РПрл), относящимися к семейству рецепторов цитокинов (Смирнов, 2006). У млекопитающих описано несколько функционально различных изоформ РПрл, образующихся в результате альтернативного сплайсинга (Bole-Feysot et al., 1998). Длинная изоформа РПрл опосредует основные изученные эффекты пролактина посредством активации конститутивно ассоциированной с рецептором тирозинкиназы JAK2 (Janus kinase 2) и транскрипционных факторов STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription). Короткие изоформы РПрл традиционно считаются негативными регуляторами JAK/STAT сигнализации, т.к. не способны активировать STAT белки. С другой стороны, эффекты коротких изоформ РПрл связывают с тканеспецифическими 3 сигналами пролактина (Duan et al, 1997, Nokelainen et al, 1998, Russell and Richards, 1999). При этом функциональные особенности действия пролактина на клетки определяются типом ткани-мишени, а также соотношением изоформ РПрл, характерным для данной ткани. Печень является одной из центральных мишеней пролактина, и экспрессия РПрл в ней находится на высоком уровне, а также зависит от пола: у особей женского пола уровень РПрл выше, чем у мужского (Розен В.Б., 1991, Smirnova et al., 1994). Хорошо известно, что опухолевые процессы в печени характеризуются увеличенной пролиферацией различных клеток печени, изменением соотношения ее клеточных элементов, структуры печеночной дольки и, как следствие, нарушением сложной и многогранной функции печени. В литературе встречаются данные, полученные на человеке и животных, которые свидетельствуют о повышении экспрессии РПрл в клетках печени и изменении их компартментализации, в частности появлении интенсивной экспрессии РПрл в ядрах клеток, в условиях активной пролиферации (Орлова и др., 1998, Смирнова и др., 1998, Garcia-Caballero, 2000). А в последнее время, появились прямые и косвенные доказательства того, что появление рецепторов некоторых факторов роста и цитокинов, в частности, рецепторов родственного пролактину гормона роста, коррелирует с пролиферативным статусом клеток, и конститутивной активацией JAK/STAT пути (Mertani et al., 2003, Conway-Campbell et al., 2007). С другой стороны, роль пролактина в процессе гепатоканцерогенеза остается не изученной. Цель и задачи исследования. Исходя из вышесказанного, целью настоящей работы было исследование особенностей экспрессии рецепторов пролактина в опухолях различных типов клеток печени человека и крыс, как основы для оценки вклада пролактина в развитие этих опухолей. Для реализации поставленной цели нами были сформулированы следующие задачи: 1. Сравнить характер экспрессии РПрл в печени человека при различных заболеваниях печени, таких как холецистит, обструктивный холестаз разной этиологии, первичные и вторичные опухоли печени, для определения объектов дальнейших экспериментальных исследований на моделях животных. Демонстрация того, что в первичных опухолях разных типов клеток печени человека, а также в удаленной от опухоли ткани печени, выявляются значимые изменения как уровня 4 экспрессии РПрл, так и их компартментализации, позволило нам выбрать для дальнейших исследований два типа опухолей печени крыс разного клеточного происхождения: перевиваемые линии гепатоцеллюлярного рака Н27 и холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1, и сформулировать дальнейшие задачи: 2. Охарактеризовать экспрессию мРНК основных маркеров разных типов клеток печени и возможность секреции пролактина в клетках печеночных трансплантатов перевиваемых опухолей печени Н27 и РС-1 крыс. 3. Оценить интенсивность экспрессии РПрл во внутрипеченочных трансплантатах опухолей гепатомы Н27 и слизистого рака РС-1. 4. Исследовать характер компартментализации РПрл во внутрипеченочных трансплантатах опухолей гепатомы Н27 и слизистого рака РС-1. 5. Проанализировать зависимость от пола экспрессии РПрл во внутрипеченочных трансплантатах Н27 и РС-1. 6. Изучить в ткани печени животного-реципиента взаимное влияние клеток опухолей и клеток окружающей ткани на экспрессию и характер компартментализации РПрл. 7. Исследовать уровень мРНК РПрл и соотношение ее изоформ в клетках гепатомы Н27 и слизистого рака РС-1. Научная новизна. Установлено, что у человека уровень экспрессии РПрл в первичных опухолях печени разного клеточного происхождения выше, чем при других заболеваниях печени. Внутрипеченочные трансплантаты гепатоцеллюлярной карциномы Н27 и холангиоцеллюлярного рака РС-1 крыс, представляющие собой животные модели разных типов рака печени, также характеризуются повышенной экспрессией РПрл, по сравнению с клетками печени интактных животных. Обнаружено, что в клетках внутрипеченочного трансплантата РС-1, в отличие от Н27, возможна аутокринная регуляция развития опухоли пролактином. Показано, что внутрипеченочные трансплантаты холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1 характеризуются интенсивной аккумуляцией РПрл в ядрах клеток. Выявлено также, что характерная для печени половая дифференцировка экспрессии РПрл с преобладанием у самок сохраняется как в опухолевых клетках внутрипеченочных трансплантатов гепатомы Н27 и холангиокарциномы РС-1, так и в окружающих и удаленных от опухолей гепатоцитах. Данная тенденция в целом наблюдается и у человека при различных заболеваниях печени. В клетках гепатомы Н27 при 5 внутрипеченочной трансплантации выявляется «классическая» для нормальных гепатоцитов гормональная регуляция экспрессии РПрл, позитивно зависимая от эстрогенов, и негативно – от андрогенов. Кроме того, присутствие внутрипеченочного трансплантата опухолей Н27 или РС-1 в значительной степени влияет на окружающие и удаленные от опухоли ткани, а характер влияния зависит от типа опухоли и пола животного-реципиента, при этом аналогичные данные получены и на человеке. Показано, что ткань печени значительно влияет на опухоль в зависимости от ее типа: в случае РС-1 индуцирует увеличение экспрессии РПрл и аккумуляцию их в ядрах опухолевых клеток, а в опухоли Н27 у животных обоих полов индуцирует увеличение доли мРНК длинной изоформы РПрл, при сравнении с культурой клеток гепатомы Н27. Установлено, что доля мРНК длинной изоформы РПрл растет в клетках внутрипеченочного трансплантата Н27 у крыс обоего пола, а в клетках внутрипеченочного трансплантата РС-1 - только у самцов, по сравнению с печенью интактных животных. Теоретическая значимость работы определяется тем, что в ней наглядно продемонстрирована возможность и важность участия пролактина в патогенезе различных типов заболеваний и опухолей печени человека и крыс; установлена половая дифференцировка экспрессии РПрл в опухолях печени; показано также взаимовлияния опухоли и ткани печени. Практическая значимость работы состоит в том, что результаты исследования позволяют обосновать новые подходы для зависимой от пола терапии опухолей печени, аккумуляции РПрл а также при возможности диагностике использования холангиокарциномы, признака и ядерной лечения этого заболевания с помощью лекарств на основе прямой ядерной доставки в клетки опухоли. Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 8ой Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2001), 11ой Европейской неделе по гастроэнтерологии (Мадрид, 2003), Двухгодичных научных встречах международной ассоциации по изучению печени (Сан-Сальвадор, 2004), 3ем Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), Iом съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), 12ом Международном симпозиуме, посвященном вирусному гепатиту и болезням 6 печени (Париж, 2006) и на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (Москва, 2007). Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на включает страницах, содержит 16 таблиц и 31 рисунок. Список литературы источников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Биопробы печени человека. В настоящей работе использовали биоптический и резекционный материал ткани печени человека при различных заболеваниях печени, включая гепатоцеллюлярный и холангиоцеллюлярный рак, всего 35 биопроб. Животные. Работа проводилась на половозрелых самцах и самках беспородных белых крыс весом 180-250 г; интактных животных, с ложными операциями, а также через 14 дней после гонадоэктомии; всего 76 животных. Подкожное поддержание штаммов опухолей гепатомы Н27 и РС-1 Штаммы опухолей Н27 и РС-1 поддерживали подкожной трансплантацией один раз в 12-14 дней в случае гепатомы Н27, и в 21-24 дня в случае холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1. Внутрипеченочная перевивка штаммов опухолей гепатомы Н27 и РС-1 Внутрипеченочную трансплантацию проводили наркотизированным крысам пункцией центральной доли печени суспензии опухолевых клеток, взятых из подкожного трансплантата. Через 25-30 дней печень с опухолью изолировали и выделяли для дальнейших исследований ткань опухоли, ткань, окружающую опухоль (в случае опухоли РС-1) и ткань из лопасти печени, не затронутой опухолью, в дальнейшем называемую нативной. Дифференциальное выделение гепатоцитов и холангиоцитов. Часть экспериментов проводили на двух типах клеток печени: гепатоцитах и холангиоцитах. Способ выделения фрагментов желчных протоков основан на методе предложенном группами проф. Альпини и Альваро (Alpini, Phillips et al, 1994, Alpini, Ulrich et al, 1994, Mennone et al, 1995, Alvaro et al, 1997). Контроль качества разделения проводили по морфологии и экспрессии дифференциальных маркеров (рис. 1): для гепатоцитов – это глюкозо-6-фосфатаза, а для холангиоцитов – цитокератин 19 (Alpini et al, 1994). 7 Рис. 1. Дифференциальное выделение клеток печени. Микрофотография неокрашенных препаратов: а - изолированный фрагмент желчного протока; б изолированные гепатоциты; в - окраска бромистым этидием продуктов ПЦР на кДНК гепатоцитов (дорожки 1,2) и холангиоцитов (дорожки 3,4) интактной самки. Дорожки 1,4 – продукты амплификации со специфическими олигонуклеотидами на глюкозо-6-фосфатазу (621 н.п.); 2,3 - продукты амплификации со специфическими олигонуклеотидами на цитокератин 19 (310 н.п.). Полуколичественное цитофотометрическое определение интенсивности РПрл-позитивного окрашивания в срезах печени человека и крысы. Локализацию РПрл в срезах печени человека и крысы определяли непрямым иммунопероксидазным методом (Smirnova et al, 1994) с использованием мышиных моноклональных антител (клон U5) против РПрл крысы, перекрестно реагирующих с РПрл человека. Интенсивность экспрессии РПрл определяли путем полуколичественного анализа изображений участков срезов, полученных на микроскопе Axioplan (Zeiss) с помощью камеры KAF 400 («Photometrics», США) с охлаждаемой ПЗС-матрицей. Обработку изображений проводили с помощью компьютерной программы «PMIS 2.1», по разнице между уровнями градации серого в опытных и контрольных срезах, пропорциональной относительной концентрации меченого соединения (Smolen, 1990). В некоторых случаях иммунопозитивное окрашивание на РПрл анализировали не только в целом по клетке, а также отдельно в ядре и цитоплазме. Установлено, что большая часть данных не подчиняется нормальному распределению, поэтому результаты выражали в относительных единицах как медианы и верхняя и нижняя квартили. Определение стабильности экспрессии мРНК β-актина как гена внутреннего контроля. Проводили амплификацию фрагментов кДНК β-актина и еще двух стабильно экспрессируемых в печени генов «домашнего хозяйства» - кДНК гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы и кДНК фосфоглицераткиназы 1 8 (Pohjanvirta et al., 2006), методом полимеразной цепной реакции в «реальном» времени (ПЦР-РВ) в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I, на приборе для проведения ПЦР-РВ Rotor-Gene 3000 («Corbett-Research», Австралия). Для определения стабильности экспрессии мРНК β-актина использовали программу BestKeeper (версия 1) (http://www.gene-quantification.info/), которая определяет стабильность экспрессии генов «домашнего хозяйства» на основе пороговых циклов (Сt), полученных в ходе эксперимента (Pfaffl et al., 2004). В результате проведенного анализа показали, что экспрессия гена β-актина в группах: 1) гепатоцитов и холангиоцитов нормальных крыс; 2) интактной печени и гепатоцитах нормальных крыс; 3) в опухоли РС-1 и холангиоцитах нормальных крыс стабильна, т.е. сравнение относительного количества изоформ РПрл внутри перечисленных групп является корректным, а в клетках опухоли Н27 крыс - нестабильна даже внутри группы одного пола, а также при объединении одной из групп с чистой культурой клеток Н27. В связи с этим, в группах крыс с внутрипеченочной опухолью Н27, мы ограничились лишь сравнением соотношения короткой и длинной изоформ РПрл. Полимеразная цепная реакция в «реальном» времени (ПЦР-РВ) с использованием зондов TaqMan. ПЦР-РВ с использованием зондов TaqMan проводили в стандартной инкубационной смеси для ПЦР-РВ, содержащей праймеры к кДНК одной из изоформ РПрл, праймеры к кДНК β-актина, а также зонды к кДНК РПрл (общий для двух изоформ) и к кДНК β-актина. Для определения относительного количества мРНК изоформ РПрл и их соотношения с использованием гена «домашнего хозяйства» β-актина в качестве внутреннего контроля и нормирования при помощи калибратора, как внешнего стандарта, использовали стандартный сравнительный ΔΔСt метод (Livak and Schmittgen, 2001, Bustin, 2004, Roche Applied Science, Technical Note No.LC13/2001, 2001). В каждом из опытов кДНК калибратора была включена в анализ, что обеспечивало постоянную точку для калибровки всей серии экспериментов и возможности сравнения их результатов между собой. Уровень экспрессии мРНК каждой из изоформ РПрл выражался в относительных единицах (о.е.). Уровень экспрессии мРНК данной изоформы в калибраторе принят за 1. Статистическая обработка данных. Статистический анализ результатов проводили с помощью программы Statistica 6.0 («Statsoft Inc.», США). Проверку соответствия выборок нормальному распределению проводили с использованием 9 критериев Шапиро-Уилкса и Хи-квадрат. Для определения достоверности различий использовали непараметрические критерии Манна-Уитни и Крускалл-Уоллиса, а также Медианный тест. Статистически значимыми считали различия, для которых уровень значимости по соответствующему критерию был меньше 0,05 (р<0,05) (Гланц, 1999). РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Анализ экспрессии РПрл при заболеваниях печени человека Особенности экспрессии РПрл при различных заболеваниях печени человека исследовали, разделив их по степени тяжести поражения печеночной ткани. По сравнению с холестазом разной этиологии, сопровождающимся желтухой, первичным или вторичным раком печени желчнокаменную болезнь без желтухи, т.е. при относительно небольшом холестазе, вызывающем умеренные изменения пролиферативной активности клеток печени можно считать наиболее легким поражением печени, поэтому мы приняли его за условный контроль. Данное заболевание сочеталось с наименьшим уровнем иммунопозитивного окрашивания на РПрл, по сравнению с другими исследованными заболеваниями (табл. 1). Таблица 1. Интенсивность экспрессии РПрл при различных заболеваниях печени у женщин: при желчнокаменной болезни (ЖКБ), обструктивной желтухе разной этиологии, вторичном раке печени и гепатоцеллюлярной карциноме (ГЦК). Женщины ЖКБ (без желтухи) Гепатоциты/ /нативная ткань1 92 (54;149) Холангиоциты/ /нативная ткань 210** (156; 319) Опухолевые клетки (центр опухоли) - Обструктивный холестаз 213* (140; 303) 552** (429; 640) - Вторичные опухоли 280* (229; 360) 361** (294; 418) + ГЦК 315* (223; 379) 446 (191; 685) 217* (159; 302) 1 нативная ткань – ткань печени, значительно удаленная от опухоли; + - в зависимости от типа вторичной опухоли РПрл-позитивное окрашивание отсутствовало или было равно в среднем 229 (159; 297); * - р< 0,001 по сравнению с гепатоцитами пациенток с желчнокаменной болезнью без желтухи; ** - р< 0,001 по сравнению с гепатоцитами соответствующей группы пациенток. При обструктивном холестазе пролиферативные процессы сочетаются с некротическими и/или апоптотическими: для холангиоцитов характерна мощная пролиферация, а для гепатоцитов сочетание пролиферации и некроза/апоптоза (Miyoshi et al, 1999, Wang et al, 2003). Обструктивный холестаз, сопровождающийся желтухой, характеризуется существенно 10 увеличенной экспрессией РПрл в гепатоцитах и холангиоцитах, что аналогично данным полученным на животных (Орлова и др., 1999а, Смирнова и др., 1998). Нами выявлена также повышенная экспрессия РПрл в гепатоцитах у женщин, по сравнению с мужчинами, что согласуется с данными, полученными на гепатоцитах животных (Розен и др., 1991). Из всех рассмотренных нами типов заболеваний, максимальная интенсивность экспрессии РПрл наблюдалась в клетках желчных протоков при обструктивной желтухе разной этиологии, что сочеталось с увеличением числа желчных протоков, последнее является косвенным показателем наиболее высокой степени их пролиферации. Таким образом, высокая экспрессия РПрл при данном заболевании позволяет рассматривать этот рецептор как объект для фармакологического воздействия на данный патологический процесс. В клетках вторичных опухолей иммунопероксидазная идентификация РПрл выявлялась не всегда, но если выявлялась (только у женщин, в 60% случаев), то в одних случаях окрашивание было равномерным по всей клетке, а в других преобладало мембранное окрашивание. Уровень РПрл-позитивного окрашивания опухолевых клеток был ниже, или сравним с таковым нормальных гепатоцитов. Гепатоциты больных с вторичными опухолями печени характеризовались высокой экспрессией РПрл, которая еще более возрастала по мере удаления от центра вторичного опухолевого узла. Интенсивность экспрессии РПрл в гепатоцитах женщин, страдающих вторичным раком печени, была выше, чем у мужчин. Таким образом, учитывая нестабильную и относительно низкую экспрессию РПрл в клетках вторичных опухолей, можно заключить, что роль пролактина в прогрессии печеночных метастазов невелика. В то же время, печеночная ткань активно реагирует на наличие вторичной опухоли в печени человека: значительно увеличивает экспрессию РПрл в гепатоцитах, прямо не соприкасающихся с опухолевыми клетками, и в меньшей степени в холангиоцитах. Одной из причин этого может быть увеличение у таких больных обоего пола сывороточной концентрации эстрогенов, которые являются позитивными регуляторами РПрл (Kuper et al., 2001). С другой стороны, этот факт может быть также следствием пролиферативного, но в данных условиях протекторного действия пролактина на клетки печени, окружающие опухолевые узлы, которые растут и вытесняют нормальные клетки печени. 11 Клетки гепатоцеллюлярного рака характеризовались высокой интенсивностью экспрессии РПрл. При этом для нас было неожиданным, что экспрессия РПрл у мужчин была выше, чем у женщин, не только в клетках опухоли, но и в ткани печени, окружающей опухоль, что может быть связано с трудностями получения однородных выборок при работе с тканями человека. По мере удаления от очага опухоли, манифестация РПрл в ткани печени пациентов с диагнозом гепатоцеллюлярный рак печени, усиливается, при этом даже в большей степени, чем при других рассмотренных нами заболеваниях. В ткани печени, удаленной от опухоли, экспрессия РПрл у женщин выше, чем у мужчин, что также характерно для нормальной половой дифференцировки печени у животных. У пациенток с диагнозом холангиоцеллюлярный рак печени экспрессия РПрл в малигнизированных холангиоцитах в центре опухолевого узла была особенно высокой, но снижалась по мере удаления от центра опухоли. У одной из пациенток с высокодифференцированной холангиокарциномой, ядра малигнизированных холангиоцитов экспрессировали РПрл на более высоком уровне, чем цитоплазма (рис. 2). Рис. 2. Иммунопероксидазная идентификация РПрл в ткани центра опухоли у пациенток с диагнозом гепатоцеллюлярная карцинома (а), холангиоцеллюлярная карцинома (б). МГеп – малигнизированные гепатоциты, ХкцС – «холангиоцеллюлярные» структуры, Я – ядра, Сл слизь. Цена деления: а – 30 мкм, б - 50 мкм. В гепатоцитах пациенток с холангиоцеллюлярной карциномой, при удалении от центра опухоли, экспрессия РПрл была очень индивидуальна и подвергалась значительным колебаниям, но оставалась на очень высоком уровне. Таким образом, исходя из полученных результатов, мы предположили, что степень экспрессии РПрл в гепатоцитах и холангиоцитах пациентов с описанными 12 заболеваниями отражает степень пролиферативных процессов происходящих в данных типах клеток. Поскольку самый высокий уровень экспрессии РПрл наблюдается в первичных опухолях печени разного клеточного происхождения, а роль пролактина в гепатоканцерогенезе остается плохо изученной, мы предприняли попытку изучить роль РПрл в опухолях печени на моделях перевиваемых опухолей двух типов у крыс. 2. Сравнительный анализ особенностей перевиваемых опухолей печени крыс: гепатомы Н27 и холангиокарциномы РС-1 Гистологические особенности опухолей Н27 и РС-1 Гистологическая структура гепатомы Н27 характеризуется тем, что в ней можно выделить центральные и периферические опухолевые клетки: центральные клетки меньше по размеру, чем периферические, (которые, в свою очередь, также меньше, чем гепатоциты нормальных животных). Кроме того, центральные опухолевые клетки располагаются диффузно, не образуют оформленных структур. Для периферических опухолевых клеток характерно образование розеточных структур. В связи с описанными гистологическими особенностями мы рассматривали экспрессию РПрл в центральных и периферических клетках гепатомы Н27 по отдельности. Гистологическая структура холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1 характеризуется тем, что ткань опухоли представляет собой кластеры из нескольких опухолевых клеток или отдельные клетки, взвешенные в слизистом секрете. У самок клетки неоплазмы больше по размеру, чем у самцов. Границы между клетками плохо просматриваются. Основное внутреннее пространство клетки заполнено огромными вакуолями со слизью (Трещалина и др., 2001), а цитоплазма оттеснена к периферии. Особенности экспрессии мРНК глюкозо-6-фосфатазы и цитокератина 19 Мы предприняли попытку охарактеризовать гепатоцеллюлярную карциному Н27 и холангиоцеллюлярный слизистый рак РС-1 при внутрипеченочной трансплантации с точки зрения экспрессии мРНК главных маркеров гепатоцитов – глюкозо-6-фосфатазы и холангиоцитов - цитокератина 19. Известно также, что экспрессия цитокератина 19 характерна для овальных (стволовых) клеток печени, а также для многих опухолевых клеток разного происхождения, в том числе для клеток гепатоцеллюлярных карцином (Ali et al., 2006, Alison and Lovell, 2005, Alsaad et al., 13 2007, Jakubowski et al., 2005, Park et al., 2007). Выявлено, что у самцов с внутрипеченочной опухолью Н27, происходит изменение дифференцировки клеток опухоли Н27 в большей степени, по сравнению с самками, т.к. лишь 20% образцов опухоли у самцов (80% у самок) экспрессируют мРНК глюкозо-6-фосфатазы, характерную для гепатоцитов, но при этом 75% (20% у самок) - мРНК цитокератина 19, характерного для клеток желчных протоков и для овальных клеток. Кроме того, в образце первичной культуры гепатомы Н27 обнаруживается мРНК только цитокератина 19, но не глюкозо-6-фосфатазы. В отношении внутрипеченочных трансплантатов опухоли РС-1 выявляется обратная, по сравнению с гепатомой Н27, картина: у самок изменение дифференцировки клеток опухоли выражено сильнее, чем у самцов, т.к. лишь 60% образцов опухолей у самок (86% у самцов) экспрессируют цитокератин 19, а 80% глюкозо-6-фосфатазу (17% у самцов). Особенности экспрессии мРНК пролактина Для установления возможности аутокринной регуляции пролиферации клеток опухолей Н27 и РС-1 под действием пролактина, мы проверили наличие экспрессии мРНК пролактина во внутрипеченочных трансплантатах опухолей Н27 и РС-1. Экспрессия мРНК пролактина не была обнаружена ни в одном из образцов внутрипеченочной гепатомы Н27, а также в культуре клеток Н27, в то же время экспрессия мРНК пролактина была выявлена в нескольких образцах ткани опухоли РС-1: лишь у 1ой самки крысы, и в 4ех образцах опухолей у самцов. Таким образом, можно предположить, что аутокринная регуляция пролиферации клеток гепатомы Н27 под действием пролактина исключена, а клеток опухоли РС-1 - возможна. 3. Особенности экспрессии РПрл по целой клетке во внутрипеченочных трансплантатах Н27 и РС-1 Иммуногистохимический анализ экспрессии РПрл в клетках опухолей Н27 и РС-1 выявил мощное повышение экспрессии РПрл и в Н27, и в РС-1, по сравнению с гепатоцитами и холангиоцитами интактных животных (рис. 3) (табл. 2). В случае гепатомы Н27 центральные опухолевые клетки характеризовались более высоким уровнем РПрл-позитивного окрашивания, чем периферические. 14 Рис. 3. Иммунопероксидазная идентификация РПрл в печени интактной самки крысы (а), в центральных клетках гепатомы Н27 (б) и клетках холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1 (в). ЖП – желчный проток, Геп – гепатоциты, ЦОК – центральные опухолевые клетки, Цена деления – 30 мкм. Таблица 2. Сравнение интенсивности РПрл-позитивного окрашивания (в о.е.) клеток опухоли при внутрипеченочной трансплантации (в/п) гепатомы Н27 и холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1 самцам и самкам крыс. Представлены измерения по целой клетке. Медиана (нижняя квартиль; верхняя квартиль). Группа животных Гепатоциты Клетки опухоли Холангиоциты Клетки опухоли Н271 РС-1 Интактные самцы 61,5 (33; 103) - 57 (14; 106) - Самцы с в/п - 103,5* (69; 138) - 119* (90; 151) Интактные самки 81+ (46; 122) - 106+ (52; 164) - Самки с в/п - 268,5*Х (227; 336) - 208*Х (159; 288) трансплантатом опухоли трансплантатом опухоли 1 – Центральные опухолевые клетки; * - p<0,001 по сравнению с гепатоцитами (для Н27) или холангиоцитами (для РС-1) интактных животных соответствующего пола; p<0,001 по сравнению с соответствующим типом клеток интактных самцов; Х + - - p<0,001 по сравнению с клетками соответствующей опухоли самцов. 4. Особенности компартментализации экспрессии РПрл во внутрипеченочных трансплантатах Н27 и РС-1 Внутрипеченочные трансплантаты опухолей Н27 и РС-1 отличались по компартментализации РПрл. Для гепатомы Н27 свойственна равномерная экспрессия РПрл в ядре и цитоплазме. Опухоль РС-1 характеризуется гетерогенным субклеточным распределением РПрл (рис. 4). Нами показано, что повышение РПрл- 15 позитивного окрашивания в цитоплазме, а также в целом по клетке, оказалось слабее, чем в ядрах, т.е. клетки опухоли РС-1 аккумулируют РПрл в ядрах (табл. 3). Таблица 3. Интенсивность иммунопозитивного окрашивания на РПрл (в о.е.) в ядрах гепатоцитов и холангиоцитов интактных животных, клетках внутрипеченочной (в/п) опухоли РС-1 и нативной ткани печени. Медиана (нижняя квартиль; верхняя квартиль). Группа Холангиоциты Клетки опухоли Гепатоциты Гепатоциты Ядра РС-1 нативной1 ткани Интактные самцы 47 (0; 104) 40 (26; 90) Интактные самки 113* (47; 194) 59** (41; 101) РС-1 в/п самцы 191* (119; 288) 202* (145; 293) РС-1 в/п самки 408#+ (256; 555) 427#Х (260; 578) 1 нативная ткань – ткань печени, значительно удаленная от опухоли; * - p<0,001, ** p<0,05 по сравнению с соответствующим типом клеток интактных самцов; # - по сравнению с соответствующим типом клеток интактных самок; + - p<0,001 – по сравнению с клетками опухоли РС-1 самцов; Х – по сравнению с гепатоцитами нативной ткани самцов. 5. Особенности половой дифференцировки экспрессии РПрл во внутрипеченочных трансплантатах Н27 и РС-1 Оба типа опухолей сохранили половую дифференцировку, характерную для нормальных клеток соответствующего типа: повышенную экспрессию РПрл у самок по сравнению с самцами. Периферические и центральные опухолевые клетки гепатомы Н27 нормальным также сохранили гепатоцитам (см. половую табл. дифференцировку, 2). Гонадоэктомия свойственную животных продемонстрировала «классическую» для нормальных гепатоцитов гормональную регуляцию экспрессии РПрл и в клетках Н27, обусловленную позитивным действием эстрогенов, и негативным – андрогенов, на экспрессию РПрл: кастрация самцов вызывала повышение экспрессии РПрл, а овариэктомия – снижение экспрессии РПрл в обоих типах клеток гепатомы Н27 (рис. 4). 16 Рис. 4. Интенсивность экспрессии РПрл в клетках гепатомы Н27 у животных с интактными гонадами (затемненный маркер) и у гонадоэктомированных животных (незатемненный маркер). Представлены измерения по целой клетке. Медиана (нижняя квартиль; верхняя квартиль). * - p<0,001, ** - p<0,01 по сравнению с соответствующим типом клеток животного с интактными гонадами. Клетки опухоли РС-1 также как и Н27, характеризуются повышенной экспрессией РПрл у самок по сравнению с самцами (см. табл. 2). 6. Влияние внутрипеченочных трансплантатов Н27 и РС-1 на экспрессию РПрл в печени Установлено, что интенсивность влияния внутрипеченочного трансплантата на ткань и, следовательно, функции печени, существенно зависит от типа опухоли. Развитие гепатомы Н27 не отразилось на экспрессии РПрл в нативной лопасти печени у самок, но в 1,5 раза снизило экспрессию РПрл в аналогичной лопасти у самцов (табл. 4). Половая дифференцировка экспрессии РПрл, характерная для печени нормальных животных, сохраняется в нативной ткани печени крыс с внутрипеченочными трансплантатами Н27. Таблица 4. Интенсивность иммунопозитивного окрашивания на РПрл (в о.е.) в гепатоцитах интактных животных и нативной ткани печени в присутствии внутрипеченочных трансплантатов Н27 и РС-1. Представлены результаты измерений по целой клетке. Медиана (нижняя квартиль; верхняя квартиль). Пол Гепатоциты интактных животного животных Самцы 61,5 (33; 103) Самки + 81 (46; 122) Гепатоциты нативной1 Гепатоциты нативной ткани в присутствии Н27 ткани в присутствии РС-1 41** (20;65) # 80 (56;122) 17 170* (138; 215) 194*# (144; 238) 1 нативная ткань – ткань печени, значительно удаленная от опухоли; * - p<0,001, **- p<0,05 по сравнению с гепатоцитами интактных животных соответствующего пола; p<0,001 по сравнению с гепатоцитами интактных самцов; # + - - p<0,001 по сравнению с гепатоцитами нативной ткани самцов с в/п трансплантатом соответствующей опухоли. Окружающая и удаленная от опухоли РС-1 ткани печени у самцов и самок имели гистологические особенности: у самок гепатоциты данных типов тканей были значительно более вакуолизированы, чем у самцов. Присутствие внутрипеченочного трансплантата РС-1 индуцировало увеличение РПрл-позитивной иммунореактивности в гепатоцитах окружающей и нативной тканей печени, по сравнению с гепатоцитами интактных крыс обоих полов (табл. 4). Присутствие внутрипеченочного трансплантата РС-1 вызывало аккумуляцию РПрл в соседних с опухолью, а также отдаленных гепатоцитах преимущественно в ядрах клеток. Кроме того, половая дифференцировка экспрессии РПрл сохранялась как в окружающей, так и в нативной ткани печени крыс-опухоленосителей, во всех рассмотренных компартментах. Таким образом, печеночная ткань активно реагирует на рост внутрипеченочной опухоли РС-1, при этом, особенно сильному влиянию опухоли подвержена печень самок крыс: экспрессия РПрл в окружающей ткани в целом по клетке усиливалась в большей степени у самок, чем у самцов. 7. Влияние печени на экспрессию РПрл во внутрипеченочных трансплантатах РС-1 На примере РС-1 выявлено и обратное влияние ткани печени на опухоль. При подкожной трансплантации РС-1, которая считается аналогом культуры клеток, экспрессия РПрл была низкой, сохраняла половую дифференцировку и в ядрах была повышена только у самцов, по сравнению с холангиоцитами интактных животных (табл. 5). Таким образом, печеночная ткань индуцирует мощное повышение экспрессии РПрл в клетках холангиокарциномы РС-1. Таблица 5. Интенсивность иммунопозитивного окрашивания на РПрл (в о.е.) в холангиоцитах интактных животных и клетках подкожной опухоли РС-1. Медиана (нижняя квартиль; верхняя квартиль). 18 Пол животного, Холангиоциты Подкожная Внутрипеченочная клеточный интактных животных трансплантация рака трансплантация рака РС-1 РС-1 Самки Самцы компартмент Целая клетка 57 (14; 106) 30* (6; 60) 119* (90; 151) Ядра 47 (0; 104) 57*** (28; 104) 191* (119; 288) Цитоплазма 47 (4; 97) 14* (0; 42) 88 ** (64; 135) Целая клетка 106* (52; 164) 44+Х (26; 74) 208+ Х (159; 288) Ядра 113* (47; 194) 63+ (38; 97) 408+ Х (256; 555) Цитоплазма 92** (44; 149) 38+ Х (18; 58) 234++ Х (157; 331) *p<0,001, **p<0,01, ***p<0,05 по сравнению с соответствующим компартментом холангиоцитов интактных самцов; +p<0,001, компартментом холангиоцитов интактных ++ p<0,01 по сравнению с соответствующим самок; Х р<0,001 по сравнению с соответствующими компартментом и видом трансплантации самцов. 8. Особенности экспрессии мРНК изоформ РПрл и их соотношения во внутрипеченочных трансплантатах Н27 и РС-1 В клетках опухолей Н27 и РС-1 выявляются мРНК обеих изоформ РПрл. Анализ соотношения уровней мРНК короткой и длинной изоформ РПрл в гепатоме Н27 показал, что в опухоли это соотношение «смещается» в сторону увеличения экспрессии длинной изоформы РПрл, как у самцов, так и у самок (рис. 5). При этом половая дифференцировка соотношения уровней изоформ, характерная для нормальной печени, исчезает, и у самцов начинает доминировать доля мРНК длинной изоформы РПрл. Интересно отметить также, что в культуре клеток гепатомы Н27 соотношение короткой и длинной изоформ РПрл особенно высокое. 19 Рис. 5. Соотношение уровней мРНК короткой и длинной изоформ РПрл в печени и холангиоцитах интактных животных, и в опухолях Н27 и РС-1. * - р<0,05, ** - р<0,01. При сравнении соотношения изоформ РПрл в холангиоцитах и опухоли РС-1 у животных обоего пола, мы не выявили достоверных различий (р>0,05), хотя и наблюдали его слабый рост (рис. 5). Половая дифференцировка соотношения изоформ РПрл внутри групп сохраняется: у самцов в опухоли РС-1, также как и в холангиоцитах интактных животных, доминирующей остается длинная изоформа РПрл, а у самок – короткая. В экспрессии мРНК короткой изоформы РПрл в опухоли РС-1 у самцов не было выявлено достоверных отличий по сравнению с холангиоцитами нормальных животных, в то же время, экспрессия мРНК длинной изоформы РПрл возросла (р<0,05) (рис. 6а). У самок в опухоли РС-1 наблюдается значительный разброс в экспрессии мРНК обеих изоформ РПрл, и как следствие, достоверных отличий в экспрессии мРНК изоформ РПрл выявлено не было (рис. 6б). Таким образом, предполагается, что в опухолях РС-1 у самок повышается чувствительность к пролактину за счет небольшого и относительно равномерного усиления экспрессии обеих изоформ РПрл. В то же время, у самцов, чувствительность к пролактину возрастает главным образом за счет увеличения уровня длинной изоформы РПрл. 20 Рис. 6. Содержание мРНК короткой (а) и длинной (б) изоформ РПрл в холангиоцитах интактных животных и опухоли РС-1. * - р<0,05. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате проведенного нами исследования особенностей экспрессии РПрл при различных заболеваниях печени человека, мы установили, что в первичных опухолях разного клеточного происхождения, а также в удаленной от опухоли ткани печени, происходят особенно значимые изменения как уровня экспрессии РПрл, так и их компартментализации. Мы предположили, что степень экспрессии РПрл в клетках разного типа у пациентов с данными заболеваниями может быть связана с пролиферативными процессами, происходящими в данных типах клеток. Таким образом, очевидно, модели перевиваемых опухолей двух типов клеток печени крыс являются адекватными для экспериментального исследования особенностей экспрессии РПрл при гепатоканцерогенезе. Установлено, что клетки внутрипеченочных опухолей Н27 и РС-1 частично теряют маркеры, соответствующие нормальным типам клеток: для гепатоцитов – это глюкозо-6-фосфатаза, а для холангиоцитов – это цитокератин 19. Причем степень потери зависит от пола и типа опухоли: в гепатоме Н27 у самцов наблюдается изменение дифференцировки клеток в большей степени, чем у самок, а в холангиокарциноме РС-1, наоборот – у самцов. Известно, что многие опухоли характеризуются аутокринной стимуляцией роста и прогрессии (Abou-Shady et al., 1999, Sirica et al., 2001, Park et al., 1999). Экспрессия мРНК пролактина была обнаружена в клетках холангиокарциномы РС-1, 21 но не гепатомы Н27. Таким образом, предполагается, что клетки опухоли РС-1, в отличие от гепатомы Н27, могут аутокринно регулировать собственный рост и прогрессию пролактином. Обнаружено повышение экспрессии РПрл в клетках гепатомы Н27 и холангиокарциномы РС-1 по сравнению с клетками соответствующего типа нормальных животных. При этом внутрипеченочные трансплантаты опухолей Н27 и РС-1 отличались по компартментализации РПрл: для гепатомы Н27 свойственна равномерная экспрессия РПрл в ядре и цитоплазме, а клетки опухоли аккумулируют РПрл в ядрах. Таким образом, мы предполагаем, что для клеток холангиокарциномы РС-1 прямой ядерный путь действия пролактина важен в большей степени, чем для клеток гепатомы Н27. В то же время вопрос о том, какой вариант пути – про- или антионкогенный осуществляется пролактином в случае прямого ядерного воздействия на клетки опухоли остается открытым, т.к. пролактин способен запускать как пролиферативные (через циклофиллин В), так и антипролиферативные (через ядерный транскрипционный фактор NF1-C2) прямые ядерные каскады (Fritsche et al., 1998, Rycyzyn and Clevenger, 2002, Johansson et al., 2003, Johansson et al., 2005, Nilsson et al., 2006). Мы выявили взаимовлияния опухолевых клеток обоего типа и клеток печени реципиентов, которые заключаются в изменениях уровня и/или компартментализации РПрл как в опухолевых клетках, так и в клетках печени, и зависящие от типа опухоли и пола животного-реципиента. Что касается внутрипеченочного трансплантата РС-1, то его присутствие индуцировало не просто увеличение экспрессии РПрл, но и аккумуляцию их в ядрах гепатоцитов окружающей и нативной тканей печени, по сравнению с гепатоцитами интактных крыс. Таким образом, печеночная ткань активно реагирует на рост внутрипеченочной опухоли РС-1. Мы предполагаем, что особенность холангиокарциномы РС-1: характерная ядерная аккумуляции РПрл не только в клетках опухоли, но и в ткани печени, может быть использована для диагностики - как маркер развития холангиокарциномы, а также служить базой для поиска новых лекарств на основе прямой доставки их в ядра опухолевых клеток. Кроме того, если пролактин способен в данных условиях осуществлять проведение пролиферативных сигналов в ткани удаленной от опухоли, то, можно предположить, что таким образом он может играть протекторную роль, стимулируя пролиферацию не малигнизированных гепатоцитов печени, способствуя реализации ее нормальных 22 физиологических функций, и, отчасти сдерживая, тем самым, рост опухоли. Следует учесть также что, во-первых, повышение экспрессии РПрл в клетках слизистого рака РС-1 индуцируется именно при внутрипеченочной трансплантации опухоли, по сравнению с подкожной. Во-вторых, из литературы известно, что при подкожной трансплантации опухоли РС-1 скорость роста опухолевых узлов выше, а продолжительность жизни крыс ниже, чем при внутрипеченочной трансплантации. Можно предположить, что ткань печени каким-то образом сдерживает развитие холангиокарциномы РС-1. Несмотря на различную направленность взаимовлияний в системе «опухоль-печень» в данных типах рака печени, наши результаты согласуются с мнением многих исследователей о важности микроокружения при росте и прогрессии опухолей разного типа. В клетках обеих типов опухолей выявлялись мРНК обеих изоформ РПрл. Учитывая, что во внутрипеченочных трансплантатах гепатомы Н27 доля мРНК длинной изоформы РПрл увеличивается у животных обоих полов, при этом половая дифференцировка соотношения, характерная для нормальной печени исчезает, мы предполагаем, что в клетках гепатомы Н27 доля JAK-STAT каскада повышается, причем равномерно по всей клетке. В культуре клеток гепатомы Н27 доминирует короткая изоформа РПрл, что является подтверждением влияния ткани печени на опухоль. Что касается экспрессии мРНК изоформ РПрл в опухоли РС-1, то достоверных отличий в экспрессии мРНК короткой изоформы РПрл не было выявлено у животных обоих полов, по сравнению с холангиоцитами нормальных крыс. В то же время, экспрессия мРНК длинной изоформы РПрл возросла у самцов, но не у самок. Таким образом, предполагается, что в опухолях РС-1 у самок повышается чувствительность к пролактину за счет небольшого и относительно равномерного усиления экспрессии обеих изоформ РПрл. В то же время, у самцов, чувствительность к пролактину возрастает главным образом за счет увеличения уровня длинной изоформы РПрл, обеспечивающей JAK-STAT сигнализацию. При внутрипеченочной трансплантации Н27 и РС-1, а также при подкожной трансплантации, в случае РС-1, клетки опухолей, а также ткань печени, удаленная от опухоли сохранили половую дифференцировку, характерную для нормальных клеток соответствующего типа: повышенную экспрессию РПрл у самок по сравнению с самцами. В клетках Н27 гонадоэктомия животных продемонстрировала «классическую» для нормальных гепатоцитов гормональную регуляцию экспрессии 23 РПрл. Таким образом, мы предполагаем несомненное наличие рецепторов эстрогенов в гепатоме Н27, а также в холангиокарциноме РС-1. Известно, что риск опухолей печени, значительно выше у мужчин, чем у женщин. Учитывая, что сигнальные пути эстрогенов и пролактина находятся в тесном перекрестном взаимодействии, полученный результат очень важен для понимания роли пролактина в прогрессии опухолей печени. Таким образом, очевидно, что пролактин активно участвует в процессе гепатоканцерогенеза. В то же время, роль его как про- или антионкогена остается не ясной, т.к. помимо пролиферативных сигналов, он способен одновременно запускать пути, сдерживающие пролиферацию, и в том числе вызванную им самим. В любом случае, прояснение его роли в прогрессии опухолей печени позволит обосновать новые подходы к зависимой от пола терапии опухолей печени в будущем, а РПрл – может служить одной из потенциальных мишеней терапевтического воздействия. ВЫВОДЫ 1. У человека усиление экспрессии РПрл в гепатоцитах и холангиоцитах при различных заболеваниях печени в целом преобладает у женщин и различается в зависимости от типа поражения печеночной ткани: самый высокий уровень экспрессии РПрл наблюдается в первичных опухолях печени разного клеточного происхождения. 2. В случае внутрипеченочного трансплантата РС-1 возможна аутокринная регуляция развития опухоли пролактином, в отличие от внутрипеченочного трансплантата Н27. 3. Внутрипеченочные трансплантаты гепатомы Н27 и холангиоцеллюлярного рака РС-1 характеризуются увеличенной экспрессией РПрл по сравнению с клетками печени интактных животных, причем в случае РС-1 клетки опухоли интенсивно аккумулируют РПрл в ядрах. 4. РПрл Характерная для нормальной печени половая дифференцировка экспрессии с преобладанием у самок сохраняется как в опухолевых клетках внутрипеченочных трансплантатов гепатомы Н27 и холангиокарциномы РС-1, так и в окружающих и удаленных от опухолей гепатоцитах. 5. Выявлены взаимовлияния опухолевых клеток Н27 и РС-1 и клеток печени реципиентов, которые заключаются в изменениях уровня и/или компартментализации 24 РПрл как в опухолевых клетках, так и в клетках печени. Характер взаимовлияния зависит от типа опухоли и пола животного-реципиента. 6. Доля мРНК длинной изоформы РПрл растет в клетках внутрипеченочного трансплантата Н27 у крыс обоего пола, а в случае РС-1 только у самцов, по сравнению с интактными животными. Половая дифференцировка соотношения мРНК короткой и длинной изоформ РПрл в клетках опухоли РС-1 не изменяется, по сравнению с холангиоцитами интактных животных: доля мРНК короткой изоформы РПрл у самок выше, чем у самцов. 7. Высокий зависимый от пола уровень экспрессии РПрл и изменение путей сигнализации пролактина в опухолях печени разного клеточного происхождения может вносить существенный вклад в гепатоканцерогенез и служить базой для поиска новых путей фармакотерапии. СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Смыслова В.С., Богорад Р.Л., Зенкова Т.Ю., Смирнова О.В. Особенности экспрессии рецепторов пролактина в печени человека при холестазе разной этиологии и развитии опухолевого процесса // Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» выпуск 8. Тезисы - Москва – 2001 – C. 39 2. Зенкова Т.Ю., Куликов А.В., Богорад Р.Л., Розенкранц А.А., Платонова Л.В., Шоно Н.И., Гальперин Э.И., Смирнова О.В Особенности экспрессии рецепторов пролактина в печени человека при холестазе разной этиологии и вторичном раке печени // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины – 2003 - Т.135 - № 6 - С.664-668 3. Zenkova T., KulikovA.V., SmislovaV.S., Galperin E.I., Smirnova O.V. Prolactin receptor (PRLR) of human liver: manifestation under conditions of cholestasis of different etiology and metastatic tumor development // 11th United European Gastroenterology Week. Gut. Abstract book - Madrid – 2003 - V. 52 – s.VI - A178 4. Zenkova T.Yu., Kulikov A., Bogorad R.L., Smyslova V., Galperin E., Smirnova O.V. Prolactin receptor (PrlR) of human liver: manifestation under conditions of cholestasis of different aetiology and metastatic tumor development // Biennial Scientific Meeting of the International Association for the Study of the Liver (IASL). Liver International. Abstract book – 2004 - V.24 s.4 - P.18-19 25 5. Зенкова Т.Ю., Курашова О.А., Смирнова О.В. Особенности экспрессии рецептора пролактина в клетках гепатомы 27 после инокуляции в печень крыс разного пола // Тезисы к докладу 3-го Российского конгресса по патофизиологии. Дизрегуляционная патология органов и систем – Москва – 2004 - C. 245 6. Ostroukhova T.Yu., Kulikov A.V., Kurashova O.A., Smirnova O.V. Hyperexpression of prolactin receptor in two types of liver carcinoma cell lines after hepatic transplantation // Digest. Science. Abstract book - 2005 – V.50, No.10 - P. 1998 7. Остроухова Т.Ю., Кушнарева Н.С., Смирнова О.В. Особенности экспрессии рецепторов пролактина в клетках слизистого рака РС-1 крыс в зависимости от пола и места трансплантации // Научные труды I съезда физиологов СНГ. Тезисы - Сочи, Дагомыс – 2005 – Т.2 - C. 159 8. Остроухова Т.Ю., Гиперэкспрессия Куликов рецепторов А.В., Розенкранц пролактина А.А., при Смирнова О.В. внутрипеченочной трансплантации клеток холангиоцеллюлярного слизистого рака крыс РС-1 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины – 2006 - Т.141 - №3 - C. 341-344 9. Ostroukhova T.Yu., Kurashova O.A., Rozenkrants A.A., Smirnova O.V. Intrahepatic grafts of rat hepatocellular carcinoma H27 with sex dependent hyperexpression of prolactin receptors // Journal of Clinical Virology. 12th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease. Abstract book - Paris – 2006 – V. 36 – P.179 10. Остроухова Т.Ю., Курашева О.А., Розенкранц А.А., Смирнова О.В. Повышенная зависимая от пола экспрессия рецепторов пролактина при внутрипеченочной трансплантации клеток гепатомы H27 крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины – 2007 - Т.143 – С.276-279 11. Smirnova O.V., Ostroukhova T.Yu., Bogorad R.L. JAK-STAT pathway in carcinogenesis: is it relevant to cholangiocarcinoma progression? // World Journal of Gastroenterology – 2007 – V.13 – P.6478-6491 26
