015992 B1 015992 B1 (11) 015992
реклама
Евразийское патентное ведомство (19) (12) (45) Дата публикации и выдачи патента Номер заявки 200802005 (22) 015992 (13) B1 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ 2012.01.30 (21) (11) Дата подачи заявки (51) Int. Cl. A61K 39/395 (2006.01) C07K 16/20 (2006.01) C07K 16/24 (2006.01) C07K 16/28 (2006.01) C12P 21/00 (2006.01) G06F 17/00 (2006.01) 2007.03.19 (54) СТАБИЛИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО И МНОГОВАЛЕНТНАЯ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩАЯ МОЛЕКУЛА НА ЕГО ОСНОВЕ, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВЫШЕНАЗВАННОГО СТАБИЛИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА B1 015992 Изобретатель: (74) Представитель: Демарест Стивен, Глейзер Скотт, Миллер Брайан Роберт, Ву Сюфен, Снайдер Вильям Б., Ван Норман, Кроунер Лиза Дж., Луговской Алексей Александрович (US) Попеленский Н.К. (RU) (56) WO-A2-2003/025018 LU D. et al. Acquired antagonistic activity of a bispecific diabody directed against two different epitopes on vascular endothelial growth factor receptor 2. J. Immunol Methods, 1999 Nov 19; 230(1-2):159-71, реферат [он-лайн] [найдено 2009-01-21]. Найдено из базы данных PubMed SONG L.P. et al. A new model of trispecific antibody resulting the cytotoxicity directed against tumor cells. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghal), 2003 Jun; 35(6):503-10, реферат (57) Изобретение основано, по крайней мере, частично на разработке стабилизированных связывающих молекул, состоящих из или включающих стабилизированные молекулы scFv, а также способы приготовления таких стабилизированных молекул. B1 (72) [он-лайн] [найдено 2009-01-21]. Найдено из базы данных PubMed CARONTI В. et al. Anti-beta 2-glycoprotein I antibodies bind to central nervous system. J. Neurol Sci, 1998 Apr 1; 156(2):211-9, реферат [он-лайн] [найдено 2009-01-21]. Найдено из базы данных PubMed HARRISON A. et al. Recognizing the fold of a protein structure. Bioinformatics, 2003 Sep 22; 19(14): 1748-59, реферат [он-лайн] [найдено 2009-01-21]. Найдено из базы данных PubMed ROGUSKA A. MICHAEL et al. Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 91, p. 969-973, February 1994, Biochemistry, с. 970, правая колонка, абзацы 1, 2, реферат HALABY D.M. et al. The immunoglobulin fold family:sequence analysis and 3D structure comparisons, Protein Engineering, vol. 12, no. 7, p. 563-571, 1999, реферат, с. 566, фиг. 2 WO-A2-2005/121177 JUNG S. et al. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol Biol, 1999 Nov 19; 294(1):163-80, реферат [он-лайн] [найдено 2009-01-21]. Найдено из базы данных PubMed TSE E. et al. Intracellular antibody capture technology: application to selection of intracellular antibodies recognising the BCR-ABL oncogenic protein. J. Mol Biol, 2002 Mar 15; 317(1):85-94, реферат, [он-лайн] [найдено 2009-01-21]. Найдено из базы данных PubMed MOK Y.K. et al. Dramatic stabilization of an SH3 domain by a singl substitution: roles of the folded and unfolded states. J. Mol Biol, 2001 Mar 30; 307(3):913-28, реферат [он-лайн] [найдено 2009-01-21]. Найдено из базы данных PubMed 015992 60/783,622; 60/812,688; 60/873,802; 60/873,996 (32) 2006.03.17; 2006.06.09; 2006.12.08; 2006.12.08 (33) US (43) 2009.06.30 (86) PCT/US2007/006883 (87) WO 2007/109254 2007.09.27 (71)(73) Заявитель и патентовладелец: БАЙОДЖЕН АЙДЕК ЭМЭЙ ИНК. (US) (31) 015992 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к стабилизированным молекулам scFv, содержащим ее химерным белкам и стабилизированной многовалентной антигенсвязывающей молекуле, популяции стабилизированных молекул scFv, популяциям стабилизированных многовалентных антигенсвязывающих молекул, молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей стабилизированную молекулу scFv, и клетке-хозяину, включающей вектор с указанной нуклеиновой кислотой, способу получения стабилизированной связывающей молекулы, способу получения стабилизированной молекулы scFv (варианты), способу стабилизации молекулы scFv, способам получения стабилизированного химерного белка, способу получения стабилизированного многовалентного антитела, способу повышения стабильности многовалентной молекулы, способу получения библиотеки, включающей стабилизированную молекулу scFv, способу получения полипептида надсемейства иммуноглобулинов и полипептиду, полученному вышеуказанным способом, способу получения антитела или модифицированного антитела с повышенной стабильностью, способу прогнозирования стабильности белка-кандидата, способу лечения субъекта с помощью связывающей молекулы, а также графическому интерфейсу для пользователя. Сведения о предшествующем уровне техники В настоящее время признано, что стабильность белков является центральной проблемой при разработке и масштабировании белков, например молекул антител. Тяжелые и легкие цепи вариабельных последовательностей доменов антител находятся под селективным давлением, и их последовательность может сильно отличаться от одного антитела к другому (Wu и Kabat, 1970). В геном человека входит множество функциональных вариабельных тяжелых (~40; Tomlinson et al., 1992; Tomlinson et al., 1994; Matsuda and Honjo, 1996), вариабельных каппа (~40; Meindl et al., 1989; Cox et al., 1994; Barbie and Lefranc, 1998) и вариабельных лямбда (~30; Williams et al., 1996; Kawasaki, et al., 1997) генов зародышевой линии. Способность иммунной системы создавать большое количество комбинаций тяжелых и легких вариабельных цепей является одним из механизмов создания многообразия антител (Edelman, 1959; Franek, 1961). Разнообразие достигается также включением вариабельного соединяющего пептидного участка, J-соединяющего пептида (плюс D-соединяющего пептида для тяжелых доменов) между вариабельным и константным доменами (Leder, 1982). После выбора зародышевого антитела против конкретного антигена В-клетки, экспрессирующие антитела с отобранными зародышевыми линиями вариабельного домена и (D-)J-соединяющие пептиды, подвергаются процессу гиперсоматической мутации в вариабельных доменах тяжелых и легких цепей с целью повышения сродства антитела по отношению к антигену (Leder, 1982; Tomlinson et al., 1996). Кроме того, обычно наблюдаются гиперсоматические включения или делеции в вариабельных доменах, хотя и значительно реже гиперсоматических мутаций (de Wildt et al., 1999). Таким образом, созревшее антитело против конкретного антигена характеризуется уникальными последовательностями вариабельных доменов, необязательно оптимизированных в отношении стабильности. Низкая стабильность может повлиять на способность антитела или домена антитела правильно свертываться при экспрессии в различных клеточных системах, например в системах экспрессии бактерий или млекопитающих. Неправильное свертывание или низкая стабильность также могут привести к появлению популяций нефункционального материала (Martsev et al., 1998) и/или антител с тенденцией к образованию больших растворимых агрегатов, потенциально опасных или иммуногенных при терапевтическом применении. Другие связанные со стабильностью проблемы включают рефолдинг, деградацию, нарушения авидности, агрегацию или потерю активности при хранении. Проблемы стабильности не ограничиваются природными антителами, они могут иметь место и в сконструированных антигенсвязывающих молекулах, таких как библиотеки рекомбинантных антител (Hoogenboom, 2005), фрагменты антител (Holt et al., 2003; Todorovska et al., 2001; Worn и Pluckthun, 2001; Reiter и Pastan, 1996), а также сконструированные или гуманизированные терапевтические антитела для производственных и клинических целей (Ewert et al., 2004; Carter and Merchant, 1997). Проблемы стабильности могут возникать также и в поливалентных формах антител, таких как биспецифичные молекулы. Хотя из-за терапевтического применения у людей биспецифичные антитела нежелательны, их образование непредсказуемо. Например, биспецифичные антитела могут приводить к существенному снижению термической стабильности, выходу продукта или образованию агрегатов низкого молекулярного веса. Неестественные изменения доменов VH и VL могут возникать также при гуманизации антител грызунов. Обычно гуманизацию проводят, прививая определяющие комплементарность участки (CDR) грызунов на наиболее похожие человеческие зародышевые домены вариабельных цепей (Hurle и Gross, 1994). Выбранные для гуманизации зародышевые линии могут использоваться иммунной системой не слишком часто, и для достижения адекватного связывания антигена часто бывает необходимо провести изменения в базовой структуре. Нестабильность белков приводит к множеству проблем, включая одну или более из следующих: непригодность для масштабного производства в биореакторах (например, из-за низкого выхода, конечного содержания нежелательных сопутствующих продуктов, таких как несобранный продукт и/или агрегированный материал), трудности очистки, а также непригодность для фармацевтического приготовле-1- 015992 ния и использования (например, из-за большого количества продуктов распада, низкого качества продуктов и/или неблагоприятных фармакокинетических свойств). Нестабильность вариабельных доменов антител, Fabs, Fvs или одноцепочечного Fvs (scFvs) может приводить к множеству таких проблем. Конструкты scFv, в особенности, демонстрируют проблемы стабильности, растворимости, экспрессии, агрегации, образования продуктов распада, а также общей способности к образованию в системах экспрессии бактерий и млекопитающих (см. Worn и Pluckthun, 2001). Кроме того, включение молекул scFv в ранее стабильные рекомбинантные антитела часто приводит к появлению этих нежелательных характеристик у новых продуктов. Таким образом, в настоящее время наблюдается потребность в разработке новых усовершенствованных способов прогнозирования стабильности белков, таких как антитела, а также улучшенных, стабильных антигенсвязывающих молекул, пригодных для масштабного производства. Существует также потребность в разработке усовершенствованных способов масштабируемого производства популяции стабильных антигенсвязывающих молекул, пригодных для применения в области фармацевтики. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится, по меньшей мере частично, к разработке улучшенных полипептидных композиций, например молекул с улучшенным связыванием, включающих или состоящих из молекул scFv с улучшенной стабильностью, а также к способам их приготовления. В соответствии с одним аспектом изобретение относится к популяции стабилизированных молекул scFv, в которой стабилизированные молекулы scFv включают: i) scFv-линкер, расположенный между доменами VH и VL, где домены VH и VL связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотой VH домена и аминокислотой VL домена, и где домены VH и VL молекул scFv характеризуются TM выше 55°С; или ii) scFv-линкер, расположенный между доменами VH и VL, где домены VH и VL связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотой VH домена и аминокислотой VL домена, и где молекулы scFv характеризуются Т50 выше 49°С. В соответствии с другим своим аспектом изобретение относится к стабилизированной молекуле scFv, которая включает: i) scFv-линкер с аминокислотной последовательностью (Gly4Ser)n, расположенный между доменами VH и VL, где домены VH и VL связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотой VH домена 44 и аминокислотой VL домена 100; ii) домены VH и VL, где молекула включает по меньшей мере одну замену, выбранную из нижеследующей группы: а) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 13 домена VH; б) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена VH; в) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена VL; г) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 49 домена VL; д) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 50 домена VL; е) замену аминокислотных остатков в положениях Кэбата 49 и 50 домена VL; ж) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 101 домена VH; з) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 20 домена VH; и) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 48 домена VH; к) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 3 домена VL; л) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 домена VH; м) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 67 домена VH; н) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 6 домена VH; о) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 32 домена VH; п) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 49 домена VH; р) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 43 домена VH; с) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 72 домена VH; т) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 79 домена VH; у) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 50 домена VL; ф) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 75 домена VL; х) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 80 домена VL; ц) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 83 домена VL; или iii) VH домен и VL домен со стабилизированной областью контакта между VH и VL молекулы scFv, где полученная молекула включает по меньшей мере одну замену в аминокислотной последовательности непосредственно в области контакта и/или аминокислотной последовательности, обеспечивающей взаимодействие между VH и VL, где по меньшей мере одно положение аминокислотного остатка выбрано из группы, включающей 47Н, 37Н, 45Н, 46Н, 51Н, 59Н, 109Н, 14Н, 26Н, 27Н, 40Н, 69Н, 103Н, 29Н, 38Н, 44Н, 49Н, 55Н, 63Н, 54Н, 68Н, 72Н, 74Н, 79Н, 82bH, 8Н, 32Н, 39Н, 41Н, 62Н, 85Н, 91Н, 24Н, 60Н, 37L, 36L, 44L, 59L, 57L, 64L, 46L, 48L, 63L, 67L, 68L, 39L, 45L, 47L, 54L, 56L, 79L, 85L, 98L, 58L, 74L, 77L, 83L, 89L и 104L в соответствии с нумерацией Кэбата, и где Т50 стабилизированной молекулы scFv боль-2- 015992 ше, чем у молекулы scFv без такой замены. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к стабилизированной молекуле scFv, включающей scFv-линкер (Gly4Ser)4, расположенный между VH доменом и VL доменом, где домены VH и VL связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотным остатком домена VH и аминокислотным остатком домена VL. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к стабилизированной молекуле scFv, включающей домены VH и VL и по меньшей мере одну замену, выбранную из следующей группы: a) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена VH, например, на глутамат или глютамин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена VL, например, на лизин; b) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена VH, например, на глутамат или глютамин, замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена VL, например, на лизин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 домена VH, например, на глицин; а также c) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена VH, например, на глутамат или глютамин, замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена VL, например, на лизин, замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 домена VH, например, на глицин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 101 домена VH, например, на аспарагиновую кислоту. В соответствии с другим аспектом стабилизированная молекула scFv характеризуется эквивалентом стабильности, соответствующим обычному фрагменту Fab, в условиях термической проверки. В соответствии с одним аспектом стабильность определяют, измеряя способность связываться с молекулой-мишенью. В соответствии с одним аспектом молекула scFv включает аминокислотную последовательность, закодированную нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID NO: 9, 14, 16 и 18. В соответствии с одним аспектом молекула scFv включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 10, 15, 17 и 19. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к химерному белку, включающему стабилизированную молекулу scFv. В соответствии с одним аспектом химерный белок включает по меньшей мере два сайта связывания антигена. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к популяции стабилизированных многовалентных антигенсвязывающих молекул, где стабилизированные связывающие молекулы включают по меньшей мере одну стабилизированную молекулу scFv, содержащую scFv-линкер, расположенный между доменами VH и VL, где домены VH и VL связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотой в домене VH и аминокислотой в домене VL, и где популяция стабилизированных связывающих молекул включает мономерные растворимые белки, из которых в агрегированной форме находится не более 10%. В соответствии с одним аспектом стабилизированные многовалентные антигенсвязывающие молекулы экспрессируются в клетках СНО или NSO. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к популяции стабилизированных многовалентных антигенсвязывающих молекул, где каждая многовалентная антигенсвязывающая молекула включает: i) по меньшей мере одну молекулу scFv, содержащую scFv-линкер, расположенный между доменами VH и VL, где домены VH и VL связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотой в домене VH и аминокислотой в домене VL, и где TM доменов VH и VL по меньшей мере одной молекулы scFv превышает 55°С; либо ii) по меньшей мере одну молекулу scFv, содержащую scFv-линкер, расположенный между доменами VH и VL, где домены VH и VL связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотой в домене VH и аминокислотой в домене VL, и Т50 по меньшей мере одной молекулы scFv многовалентной антигенсвязывающей молекулы превышает 49°С. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к стабилизированной многовалентной антигенсвязывающей молекуле, включающей: i) по меньшей мере одну стабилизированную молекулу scFv, где стабилизированная молекула scFv содержит (Gly4Ser)n scFv-линкер, расположенный между доменами VH и VL, и где домены VH и VL связаны дисульфидным мостиком; ii) по меньшей мере одну стабилизированную молекулу scFv, содержащую (Gly4Ser)n scFv-линкер, расположенный между доменами VH и VL, где домены VH и VL связаны дисульфидным мостиком, образованным между аминокислотным остатком 44 домена VH и аминокислотным остатком 100 домена VL; iii) по меньшей мере одну стабилизированную молекулу scFv, где стабилизированная молекула scFv включает по меньшей мере одну замену, выбранную из нижеследующей группы: а) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 13 домена VH; б) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена VH; в) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена VL; -3- 015992 г) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 49 домена VL; д) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 50 домена VL; е) замену аминокислотных остатков в положениях Кэбата 49 и 50 домена VL; ж) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 101 домена VH; з) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 20 домена VH; и) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 48 домена VH; к) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 3 домена VL; л) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 домена VH; м) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 67 домена VH; н) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 6 домена VH; о) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 32 домена VH; п) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 49 домена VH; р) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 43 домена VH; с) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 72 домена VH; т) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 79 домена VH; и) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 50 домена VL; ф) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 75 домена VL; х) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 80 домена VH; ц) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 83 домена VH, а также iv) VH домен и VL домен со стабилизированным областью контакта между VH и VL молекулы scFv, где полученная молекула включает по меньшей мере одну замену в аминокислотной последовательности непосредственно в области контакта и/или аминокислотной последовательности, обеспечивающей взаимодействие между VH и VL, где по меньшей мере одно положение аминокислотного остатка выбрано из группы, включающей 47Н, 37Н, 45Н, 46Н, 51Н, 59Н, 109Н, 14Н, 26Н, 27Н, 40Н, 69Н, 103Н, 29Н, 38Н, 44Н, 49Н, 55Н, 63Н, 54Н, 68Н, 72Н, 74Н, 79Н, 82bH, 8Н, 32Н, 39Н, 41Н, 62Н, 85Н, 91Н, 24Н, 60Н, 37L, 36L, 44L, 59L, 57L, 64L, 46L, 48L, 63L, 67L, 68L, 39L, 45L, 47L, 54L, 56L, 79L, 85L, 98L, 58L, 74L, 77L, 83L, 89L и 104L в соответствии с нумерацией Кэбата. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к стабилизированной многовалентной антигенсвязывающей молекуле, включающей: i) по меньшей мере одну стабилизированную молекулу scFv, включающую линкер (Gly4Ser)4 scFv между VH доменом и VL доменом, где домены VH и VL связаны дисульфидным мостиком между аминокислотным остатком домена VH и аминокислотным остатком домена VL; ii) по меньшей мере одну стабилизированную молекулу scFv, включающую линкер scFv с аминокислотной последовательностью (Gly4Ser)n, расположенной между VH доменом и VL доменом, где домены VH и VL связаны дисульфидным мостиком между аминокислотным остатком 44 домена VH и аминокислотным остатком 100 домена VL; а также iii) по меньшей мере одну стабилизированную молекулу scFv, где стабилизированная молекула scFv включает по меньшей мере одну серию замен, выбранную из следующей группы: а) замену аминокислотного остатка (например, глутамина) в положении Кэбата 3 домена VL, например, на аланин, серин, валин, аспарагиновую кислоту или глицин; б) замену аминокислотного остатка (например, серина) в положении Кэбата 46 домена VL, например, на лейцин; в) замену аминокислотного остатка (например, серина) в положении Кэбата 49 домена VL, например, на тирозин или серин; г) замену аминокислотного остатка (например, серина или валина) в положении Кэбата 50 домена VL, например, на серин, треонин, аргинин, аспарагиновую кислоту, глицин или лизин; д) замену аминокислотного остатка (например, серина) в положении Кэбата 49 и (например, серина) в положении Кэбата 50 домена VL соответственно на тирозин и серин; на тирозин и треонин; на тирозин и аргинин; тирозин и глицин; серин и аргинин; или серин и лизин; е) замену аминокислотного остатка (например, валина) в положении Кэбата 75 домена VL, например, на изолейцин; ж) замену аминокислотного остатка (например, пролина) в положении Кэбата 80 домена VL, например, на серин или глицин; з) замену аминокислотного остатка (например, фенилаланина) в положении Кэбата 83 домена VL, например, на серин, аланин, глицин или треонин; и) замену аминокислотного остатка (например, глутаминовой кислоты) в положении Кэбата 6 домена VH, например, на глутамин; к) замену аминокислотного остатка (например, лизина) в положении Кэбата 13 домена VH, например, на глутамат; л) замену аминокислотного остатка (например, серина) в положении Кэбата 16 домена VH, например, на глутамат или глутамин; м) замену аминокислотного остатка (например, валина) в положении Кэбата 20 домена VH, напри-4- 015992 мер, на изолейцин; н) замену аминокислотного остатка (например, аспарагина) в положении Кэбата 32 домена VH, например, на серин; о) замену аминокислотного остатка (например, глутамина) в положении Кэбата 43 домена VH, например, на лизин или аргинин; п) замену аминокислотного остатка (например, метионина) в положении Кэбата 48 домена VH, например, на изолейцин или глицин; р) замену аминокислотного остатка (например, серина) в положении Кэбата 49 домена VH, например, на глицин или аланин; с) замену аминокислотного остатка (например, валина) в положении Кэбата 55 домена VH, например, на глицин; т) замену аминокислотного остатка (например, валина) в положении Кэбата 67 домена VH, например, на изолейцин или лейцин; у) замену аминокислотного остатка (например, глутаминовой кислоты) в положении Кэбата 72 домена VH, например, на аспартат или аспарагин; ф) замену аминокислотного остатка (например, фенилаланина) в положении Кэбата 79 домена VH, например, на серин, валин или тирозин; а также х) замену аминокислотного остатка (например, пролина) в положении Кэбата 101 домена VH, например, на аспарагиновую кислоту. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к многовалентной антигенсвязывающей молекуле, включающей по меньшей мере одну стабилизированную молекулу scFv, которая включает по меньшей мере одну серию замен, выбранную из нижеследующей группы: а) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена VH, например, на глутамат или глутамин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена VL, например, на лизин; б) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена VH, например, на глутамат или глутамин, замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена VL, например, на лизин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 домена VH, например, на глицин; а также в) замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 домена VH, например, на глутамат или глутамин, замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 домена VL, например, на лизин; замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 домена VH, например, на глицин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 101 домена VH, например, на аспарагиновую кислоту. В соответствии с одним вариантом осуществления по меньшей мере одна стабилизированная молекула scFv генетически гибридизована с антителом. В соответствии с другим вариантом осуществления две стабилизированные молекулы scFv генетически гибридизованы с антителом. В соответствии с одним вариантом осуществления по меньшей мере одна стабилизированная молекула scFv генетически гибридизована с карбоксиконцом легкой или тяжелой цепи антитела. В соответствии с одним вариантом осуществления по меньшей мере одна стабилизированная молекула scFv генетически гибридизована с N-концом легкой или тяжелой цепи антитела. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один сайт связывания, который связывается с молекулой, предпочтительно экспрессируемой в раковых клетках. В соответствии с одним вариантом осуществления домен VH молекулы scFv изобретения получают из антитела ВНА10. В соответствии с одним вариантом осуществления домен VL молекулы scFv по изобретению получают из антитела ВНА10. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один сайт связывания, специфичный для молекулы, выбранной из группы, включающей HER1, HER3, CD80, CD86, PD-1, CTLA4, В7-Н4, RON, CD200, CD4, BAF R, EGFR, IGFR, VEGFR, членов семейства рецепторов TNF, рецептора Tie, MET, IGF1, IGF2, TNF, лиганда TNF, IL-6, TWEAK, Fn14, CD20, CD23, CRIPTO, HGF, альфа4бета1 интегрина, альфа5бета1 интегрина, альфа6бета4 интегрина и альфа5бета6 интегрина. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один сайт связывания, который связывается с молекулой, принимающей участие в модулировании иммунных ответов. В соответствии с одним вариантом осуществления молекула представляет собой рецептор Fc. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретения включает по меньшей мере один сайт связывания, который связывается с молекулой, принимающей участие в модулировании ангиогенеза. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению связывается с VEGF или ангиопоэтином. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один сайт связывания, который связывается с неврологической мишенью. -5- 015992 В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению полиспецифична. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению биспецифична. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению связывается с двумя членами семейства рецепторов TNF. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению связывается с LTβR и Trail R2. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает молекулу ВНА10 scFv, генетически гибридизованную с антителом 14А2. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает тяжелую цепь, последовательность которой выбрана из группы, включающей SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 55. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает нуклеотидную последовательность, которая кодирует полипептид молекулы по любому из пунктов формулы изобретения 4-8, 11, 12 и 18-22. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, которая кодирует стабилизированную молекулу scFv, или к связывающей молекуле, включающей стабилизированную молекулу scFv по изобретению. В соответствии с одним вариантом осуществления молекула нуклеиновой кислоты представлена в векторе. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение относится к клетке-хозяину, включающей такой вектор. В соответствии с одним вариантом осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку млекопитающего, например клетку СНО или NSO. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретение относится к популяции связывающих молекул, включающих молекулы scFv, причем эта популяция включает по меньшей мере на 10% меньше агрегатов по сравнению с клетками-хозяевами, экспрессирующими популяцию связывающих молекул, которые содержат обычные молекулы scFv. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретение относится к способу получения стабилизированной связывающей молекулы, в котором выращивание клетки-хозяина осуществляют в условиях, необходимых для продуцирования связывающих молекул. В соответствии с одним вариантом осуществления на каждый литр культуральной среды, включающей клетки-хозяева, продуцируется по меньшей мере 10 мг стабилизированных связывающих молекул, при этом в такой среде не более 10% связывающих молекул присутствует в агрегированной форме. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретение относится к способу лечения субъекта, для которого лечение связывающей молекулой по изобретению может оказаться эффективным, в котором указанному субъекту вводят связывающую молекулу. В соответствии с одним вариантом осуществления субъект страдает от заболевания или расстройства, выбранного из группы, включающей рак, аутоиммунное заболевание или расстройство и неврологическое заболевание или расстройство. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретение относится к способу стабилизации молекулы scFv, включающему генетическую гибридизацию VH домена и VL домена с использованием линкера (Gly4Ser)n scFv и конструирование домена VH так, чтобы он включал остаток цистеина в положении 44 аминокислотной последовательности, а также конструирование домена VL так, чтобы он включал остаток цистеина в положении 100 аминокислотной последовательности с получением стабилизированной молекулы scFv. В соответствии с одним аспектом изобретение относится к способу продуцирования стабилизированного поливалентного антитела со стабилизированной молекулой scFv, в котором осуществляют генетическую гибридизацию стабилизированной молекулы scFv с N-концом или С-концом легкой или тяжелой цепи молекулы антитела. В соответствии с одним аспектом изобретение относится к относится к способу продуцирования стабилизированной молекулы scFv, в котором осуществляют замещение по меньшей мере одного аминокислотного остатка области контакта VH/VL молекулы scFv и/или по меньшей мере одного аминокислотного остатка каркаса VH/VL молекулы scFv, улучшающего термическую стабильность доменов VH и VL молекулы scFv по сравнению с обычной молекулой scFv. В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу продуцирования стабилизированной молекулы scFv, в котором осуществляют замещение по меньшей мере одного аминокислотного остатка VH домена или VL домена, который коварьируется с двумя или более аминокислотными остатками области контакта между доменами VH и VL. В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу продуцирования стабилизированного химерного белка, включающего молекулу scFv; в котором осуществляют замещение по меньшей мере одного аминокислотного остатка в области контакта VH/VL молекулы scFv и/или по меньшей мере одного аминокислотного остатка каркаса VH/VL молекулы scFv, а также генетическую гибри-6- 015992 дизацию молекулы scFv с полипептидом с получением стабилизированного химерного белка. В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу повышения стабильности поливалентной молекулы, с по меньшей мере одной молекулой scFv, в котором по меньшей мере в одной молекуле scFv проводят по меньшей мере одну стабилизирующую мутацию, что и приводит к повышению стабильности многовалентной молекулы. В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу повышения стабильности молекулы scFv, в котором проводят по меньшей мере одну стабилизирующую мутацию в молекулу scFv, что и приводит к повышению стабильности молекулы scFv. В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу крупномасштабного продуцирования стабилизированных химерных белков, включающему: (а) проведение исследования термической стабильности молекулы scFv с целью определить ее термическую стабильность; (б) сравнение термической стабильности предполагаемой молекулы scFv с подходящим контролем с целью идентифицировать стабилизированную молекулу scFv, термическая стабильность которой повышена, по сравнению с контролем; (в) отбор стабилизированных молекул scFv, обнаруженных на этапе (b); (г) генетическую гибридизацию по меньшей мере одной стабилизированной молекулы scFv с белком с получением стабилизированного химерного белка; (д) трансфицирование клетки-хозяина от млекопитающего молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей стабилизированный химерный белок; (е) культивирование клетки-хозяина, полученной на этапе (f), в условиях, при которых экспрессируется стабилизированный химерный белок, где стабилизированный химерный белок экспрессируется не более чем с 10% агрегацией при выращивании в 10 л или более культуральной среды. В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу определения термической стабильности укладки (фолдинг) белка из полипептидного надсемейства иммуноглобулинов (Ig), включающего предполагаемые кандидаты аминокислотных последовательностей, который включает следующие этапы: (а) выравнивание соответствующего референсного набора последовательностей, соответствующих укладке Ig полипептида; (б) расчет ковариации между аминокислотными остатками последовательностей выравнивания с данными ковариации; (в) определение счета ковариации, специфического для положения в последовательностикандидате, на основании данных ковариации; а также (г) сохранение или вывод специфического для положения аминокислоты счета ковариации последовательности как степени стабильности полипептида. В соответствии с одним вариантом осуществления способ включает повторное проведение по меньшей мере этапов с) и d) для множества полипептидов надсемейства иммуноглобулинов (Ig). В соответствии с еще одним аспектом способ дополнительно включает этап выбора из множества представителей полипептидов надсемейства иммуноглобулинов (Ig) полипептида для получения, на основании специфического для положения в последовательности счета ковариации последовательности-кандидата. В соответствии с другим вариантом осуществления способ дополнительно включает этап получения отобранного полипептида надсемейства Ig и его продуцирования для терапевтического использования. В соответствии с другим вариантом осуществления полипептид надсемейства Ig получают из белка, выбранного из группы, включающей иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент, рецептор иммуноглобулина, белок клеточной адгезии, интегрин, аллерген, рецептор Т-клеток, а также главный комплекс гистосовместимости (МНС). В соответствии с одним вариантом осуществления полипептид надсемейства Ig выбран из группы, включающей вариабельную область тяжелой цепи (VH), вариабельную область легкой цепи (VL), а также одноцепочечное антитело (scFv). В соответствии с другим вариантом осуществления укладка Ig выбрана из группы, включающей укладки V-класса, укладки 1-класса, укладки C1-класса и укладки С2-класса. В соответствии с одним вариантом осуществления разнообразие исследуемого набора сравнения или выравнивания составляет не менее 50%. В соответствии с одним вариантом осуществления каждая последовательность в выравнивании характеризуется менее чем 90% идентичностью с каждой другой последовательностью в выравнивании. В соответствии с другим вариантом осуществления по меньшей мере одна последовательность берется из представителей млекопитающих и по меньшей мере одна последовательность берется не из представителей млекопитающих. В соответствии с одним вариантом осуществления остаткам в последовательности-кандидате назначается положительный специфический для последовательности счет ковариации для удовлетворения положительным ковариациям, включающимся в соответствующих положениях в выравнивании. -7- 015992 В соответствии с одним вариантом осуществления остаткам в последовательности-кандидате назначается отрицательный специфический для последовательности счет ковариации для удовлетворения отрицательным ковариациям, включающимся в соответствующих положениях в выравнивании. В соответствии с одним вариантом осуществления положительная ковариация характеризуется коэффициентом ассоциации фи (φ) приблизительно от +0,25 до +1,0. В соответствии с одним вариантом осуществления отрицательная ковариация характеризуется коэффициентом ассоциации фи (φ) приблизительно от -0,25 до -1,0. В соответствии с одним вариантом осуществления выравнивание выбрано из группы, включающей основанное на структуре выравнивание последовательности, основанное на последовательности выравнивание последовательности, а также основанное на структуре структурное выравнивание. В соответствии с одним вариантом осуществления специфический для положения счет ковариации определяют для всех возможных пар остатков для каждого положения остатка в выравнивании. В соответствии с одним вариантом осуществления выравнивание получают путем (i) генерации модели Hidden Markov Model (HMM) из начального выравнивания; (ii) запроса дополнительных последовательностей с НММ и (iii) выравнивания дополнительных последовательностей с начальным выравниванием. В соответствии с одним аспектом изобретение относится к компьютерной программе или компьютерному программному продукту, а также к предназначенному для чтения на компьютере носителю, включающим набор выполняемых процессором команд, следуя которым компьютер и осуществляет реализацию способа по изобретению. В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к компьютерной программе или компьютерному программному продукту, а также к предназначенному для чтения на компьютере носителю, пригодным для использования в электронных устройствах, включающих данные, требуемые для выравнивания по способу изобретения. В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к компьютерной программе или компьютерному программному продукту, а также к предназначенному для чтения на компьютере носителю, который пригоден для использования в электронных устройствах, включающих данные ковариации, способа изобретения. В соответствии с одним аспектом изобретение относится к устройству, предназначенному для реализации способа изобретения. В соответствии с одним аспектом изобретение относится к системе в компьютерном устройстве, включающей: (i) начальный этап накопления последовательности; (ii) место хранения, пригодное для хранения информации о последовательностях из выравнивания, в соответствии с пунктами формулы; (iii) средство анализа, которое программно анализируют ковариацию между парами остатков в выравнивании с целью получения данных ковариации; (iv) устройство вывода, связанное с указанным электронным устройством, на которое будут выводиться вышеупомянутые данные ковариации. В соответствии с одним аспектом изобретение относится к носителю в компьютерном устройстве, хранящему исполняемые команды, требуемые для выполнения любого этапа способа изобретения. В соответствии с еще одним вариантом осуществления данные по частоте использования остатков составляют матрицу, включающую (i) непрерывные фрагменты из аминокислотных остатков, соответствующих полипептидной последовательности; и (ii) частоты использования остатков для остатков каждого типа и каждого их положения. В соответствии с еще одним вариантом осуществления частоту использования остатков отображают символически. В соответствии с одним вариантом осуществления представлены все 20 аминокислот, пробелы и неясные остатки. В соответствии с одним вариантом осуществления частота использования остатков коррелирует с размером символа. В соответствии с одним вариантом осуществления частота использования остатков положительно коррелирует с размером символа. В соответствии с одним вариантом осуществления (i) положения остатков отображаются в столбцах; a (ii) частоты использования остатков располагаются в строках. В соответствии с другим вариантом осуществления ковариацию между ковариантными остатками отображают в виде сетки наложений. В соответствии с одним аспектом изобретение относится к графическому пользовательскому интерфейсу, с помощью которого графически отображается (i) графическая сетка, включающая набор данных о частоте использования остатков для набора последовательностей полипептидов сравнения; и (ii) наложение ковариаций. В соответствии с одним вариантом осуществления область контакта также включает (iii) отображе-8- 015992 ние интересующей последовательности. В соответствии с одним аспектом изобретение относится к способу продуцирования полипептида надсемейства иммуноглобулинов (Ig) с улучшенным биофизическим свойством, который включает следующие этапы: (a) осуществление выравнивания набора последовательностей сравнения, соответствующих Igукладке полипептида; (b) расчет ковариации между остатками последовательностей выравнивания с целью идентифицировать коварьирующие остатки; (с) замещение остатков полипептида, которые не удовлетворяют ковариации коварьирующим остатком из соответствующего положения выравнивания. В соответствии с другим вариантом осуществления биофизическое свойство выбрано из группы, включающей термическую стабильность, профиль развертывания под действием рН, стабильное устранение гликозилирования, растворимость, биохимическую функцию и их комбинации. В соответствии с одним вариантом осуществления биохимическая функция выбрана из группы, включающей распознавание белковой мишени или химического объекта, где химический объект выбран из группы, включающей фосфат, метил, ацетил, липид, детергент, ион металла, галоген, РНК, ДНК, олигонуклеотид и олигонуклеозид. В соответствии с одним вариантом осуществления полипептид надсемейства Ig получают из белка, выбранного из группы, включающей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, иммуноглобулиновый рецептор, белок клеточной адгезии, интегрин, аллерген, рецептор Т-клеток и молекулу главного комплекса гистосовместимости (МНС). В соответствии с одним вариантом осуществления полипептид надсемейства Ig выбирают из группы, включающей вариабельную область тяжелой цепи (VH), вариабельную область легкой цепи (VL), а также одноцепочечное антитело (scFv). В соответствии с одним вариантом осуществления укладка Ig выбрана из группы, включающей укладки V-класса, укладки 1-класса, укладки С1-класса и укладки С2-класса. В соответствии с другим вариантом осуществления полипептид надсемейства Ig представляет собой модифицированное антитело, выбранное из группы, включающей доменное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, нечеловеческое моноклональное антитело, химерное антитело, биспецифичное антитело, scFv-содержащее антитело и антитело с удаленным доменом. В соответствии с одним вариантом осуществления коварьирующие остатки входят в состав структурного элемента, выбранного из группы, включающей дисульфидный мостик, солевой мостик, фрагмент лигандсвязывающего кармана или поверхности, а также сеть Ван-Дер-Ваальса, водородный мостик и/или взаимодействия заряд-заряд. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение относится к способу получения антитела или модифицированного антитела с улучшенной стабильностью, в котором осуществляют следующие этапы: (а) создание структурной модели образца антитела высокого разрешения, стабильность которого подтверждена экспериментально; (б) использование структурной модели для идентификации области контакта VH/VL и/или каркасных остатков области контакта в образце антитела; (в) использование гомологичной модели для идентификации соответствующих остатков области контакта VH/VL антитела или модифицированного антитела, которые важны для стабилизации указанной области контакта, а также (г) замещение соответствующих остатков области контакта VH/VL антитела или модифицированного антитела на остатки области контакта белка образца. В соответствии с одним вариантом осуществления остаток области контакта белка образца накрывает собой по меньшей мере 10 Å2 площади поверхности в области контакта. В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированное антитело выбрано из группы, включающей доменное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, нечеловеческое моноклональное антитело, химерное антитело, биспецифичное антитело, scFv-содержащее антитело, химерное антитело, а также антитело с удаленным доменом. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к полипептидам, полученным способом по изобретению. В соответствии с одним вариантом осуществления полипептид обладает улучшенным биофизическим свойством, выбранным из группы, включающей термическую стабильность, профиль развертывания под действием рН, стабильное устранение гликозилирования, растворимость, биохимическую функцию и их комбинации. В соответствии с одним вариантом осуществления биохимическая функция представляет собой сродство к лиганду или специфичность. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение относится к способу создания библиотеки, включающей стабилизированную молекулу scFv, который включает: -9- 015992 (а) создание набора последовательностей сравнения, соответствующих последовательности вариабельного домена молекулы scFv; (b) идентификацию аминокислоты внутри вариабельного домена, отсутствующей в наборе сравнения или встречающейся там с низкой частотой; а также (c) комбинирование этой информации с данными ковариации, предполагая, что модификация аминокислоты, идентифицированной в наборе сравнения с низкой частотой, может удовлетворить существующим ограничениям ковариации внутри вариабельного домена; а также (d) замещение аминокислоты этапа (b) стабилизированной аминокислотой-кандидатом с целью создания библиотеки, включающей стабилизированную молекулу scFvs. В соответствии с одним вариантом осуществления аминокислота этапа (b) характеризуется консенсусным счетом менее 0,5. В соответствии с другим вариантом осуществления аминокислота этапа (b) присутствует в менее чем 10% последовательностей набора сравнения. В соответствии с другим вариантом осуществления аминокислота этапа (b) представляет собой неконсенсусный остаток. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная аминокислота-кандидат находится в соответствующем положении в наборе сравнения. В соответствии с еще одним вариантом осуществления стабилизированная аминокислота-кандидат представляет собой консенсусную аминокислоту. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированную аминокислоту-кандидата можно обнаружить путем анализа 3-D структуры вариабельной области последовательности. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированную аминокислоту-кандидата идентифицируют расчетом упаковки боковых цепей. В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу продуцирования стабилизированной молекулы scFv, который включает: (a) создание библиотеки scFv, спроектированной в соответствии со способом; (b) скрининг библиотеки scFv анализа в жестких температурных условиях с целью идентифицировать молекулы-кандидаты scFv; (c) сравнение термической стабильности молекул-кандидатов scFv из библиотеки scFv с подходящим контролем, в котором повышение термической стабильности молекулы-кандидата scFv относительно контроля характеризует молекулу-кандидата scFv как стабилизированную молекулу scFv. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к стабилизированной молекуле scFv, идентифицированной с помощью способа по изобретению, или к химерному белку, включающему стабилизированную молекулу scFv по изобретению. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу прогнозирования стабильности белка-кандидата, включающего аминокислотную последовательность, в состав которой входят последовательности доменов-кандидатов, при этом указанный способ включает: (a) создание набора сравнения аминокислотных последовательностей, соответствующих последовательности домена-кандидата белка-кандидата; (b) определение частот встречаемости остатков в индивидуальных положениях аминокислот исследуемой последовательности домена с целью получения консенсусного счета; а также (c) использование консенсусного счета для прогнозирования стабильности белка-кандидата, где консенсусный счет коррелирует со стабильностью белка-кандидата. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу прогнозирования стабильности белка-кандидата, который включает: (a) создание набора последовательностей сравнения, соответствующих исследуемой последовательности домена белка-кандидата; (b) определение частот встречаемости остатков в индивидуальных положениях аминокислот в исследуемой последовательности домена с получением консенсусного счета и (c) использование консенсусного счета для прогнозирования стабильности белка-кандидата, где консенсусный счет коррелирует со стабильностью белка-кандидата. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу прогнозирования стабильности белка-кандидата, в котором осуществляют следующие этапы: (а) создание набора последовательностей сравнения, соответствующих исследуемой последовательности домена белка-кандидата; (b) определение частот встречаемости остатков в положениях аминокислот в исследуемой последовательности домена с получением консенсусного счета; (c) определение частот встречаемости остатков в соответствующих положениях аминокислот в последовательности набора сравнения с получением среднего консенсусного счета; (d) сравнение консенсусного счета со средним консенсусным счетом с получением счета последовательности и (e) использование консенсусного счета для прогнозирования стабильности белка-кандидата, где консенсусный счет непосредственно коррелирует со стабильностью белка-кандидата. В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу прогнозирования стабиль- 10 - 015992 ности антитела-кандидата или модифицированного антитела-кандидата, в котором осуществляют следующие этапы: (a) создание набора сравнения последовательностей VH домена, соответствующих исследуемой последовательности VH домена антитела-кандидата или модифицированного антитела; (b) определение частот встречаемости аминокислотных остатков в положениях исследуемой последовательности VH домена с получением консенсусного счета; (c) определение частот встречаемости остатков в соответствующих положениях аминокислот в последовательности набора сравнения с получением среднего консенсусного счета; (d) сравнение консенсусного счета со средним консенсусным счетом с получением счета последовательности; а также (e) использование консенсусного счета для прогнозирования стабильности антитела-кандидата или модифицированного антитела, где консенсусный счет непосредственно коррелирует со стабильностью антитела-кандидата или модифицированного антитела. В соответствии с одним вариантом осуществления набор сравнения включает последовательности белков с таким же типом укладки, что и у белка-кандидата. В соответствии с другим вариантом осуществления набор сравнения включает ортологичные последовательности. В соответствии с одним вариантом осуществления набор сравнения включает последовательности человека, например последовательность VH человека того же класса Кэбата. В соответствии с одним вариантом осуществления набор сравнения включает зародышевые последовательности VH человека. В соответствии с одним вариантом осуществления исследуемая последовательность домена представляет собой фрагмент последовательности домена белка-кандидата. В соответствии с одним вариантом осуществления консенсусный счет определяют для каждого положения в исследуемой последовательности и на основании этих данных получают общий консенсусный счет, причем общий консенсусный счет коррелирует со стабильностью белка. В соответствии с другим вариантом осуществления общий консенсусный счет рассчитывают по следующей формуле: где score - счет ci(r) соответствует частоте встречаемости консенсусных аминокислотных остатков в положении консенсусной последовательности; hi(r) равняется частоте исследуемых аминокислотных остатков в положении исследуемой последовательности; i соответствует количеству аминокислотных положений в пределах исследуемой последовательности. В соответствии с одним вариантом осуществления стабильность белка определяют, сравнивая консенсусный счет белка-кандидата с консенсусным счетом подходящего контроля. В соответствии с другим вариантом осуществления стабильность белка определяют, сравнивая консенсусный счет белка-кандидата с идеальным консенсусным счетом белка-кандидата. В соответствии с еще одним вариантом осуществления стабильность белка определяют, сравнивая консенсусный счет белка-кандидата с подходящим контролем. В соответствии с еще одним вариантом осуществления стабильность белка определяют, сравнивая счет последовательности антитела-кандидата или модифицированного антитела с подходящим контролем. В соответствии с одним вариантом осуществления белок представляет собой полидоменный белок, причем последовательность домена-мишени получают из наименее стабильного домена полидоменного белка. В соответствии с другим вариантом осуществления белок представляет собой модифицированное антитело, выбранное из группы, включающей антитело верблюда, гуманизированное антитело, человеческое антитело, нечеловеческое моноклональное антитело, химерное антитело, биспецифичное антитело, scFv-содержащее антитело и антитело с удаленным доменом. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение относится к способу отбора белков-кандидатов для экспрессии, включающему определение стабильности белка-кандитата способом по изобретению, где белок-кандитат отбирается для экспрессии, если его консенсусный счет или счет последовательности прогнозирует высокую стабильность. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу отбора белков-кандидатов для экспрессии, включающему определение стабильности белка-кандитата способом по изобретению, в котором белок-кандитат отбирается для экспрессии, если его специфический для положения в последовательности счет ковариации прогнозирует высокую стабильность. В соответствии с другим аспектом изобретение относится к способу отбора исследуемой последо- 11 - 015992 вательности вариабельной области акцепторного иммуноглобулина для использования при гуманизации антитела донора, причем этот способ включает определение стабильности последовательностикандидата способом по изобретению, где последовательность-кандидат отбирают, если ее счет последовательности прогнозирует высокую стабильность. В соответствии с еще одним аспектом изобретение относится к способу отбора исследуемой последовательности вариабельной области акцепторного иммуноглобулина для использования при гуманизации антитела донора, причем этот способ включает определение стабильности последовательностикандидата способом по изобретению, где последовательность-кандидат отбирают, если ее специфический для положения в последовательности счет ковариации прогнозирует высокую стабильность. В соответствии с другим вариантом осуществления исследуемая последовательность представляет собой зародышевую последовательность человека. Перечень фигур, чертежей и иных материалов На фиг. 1 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 3), кодирующая обычный конструкт ВНА10 scFv, который включает линкер (Gly4Ser)3 (выделен полужирным шрифтом). На фиг. 2 показана последовательность (SEQ ID NO: 4), кодирующая обычный конструкт ВНА10 scFv. На фиг. 3, 4 отражены результаты измерения способом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) очищенных обычных фрагментов Fab или scFv последовательности ВНА10. На фиг. 3 показаны результаты ДСК-анализа, в котором сравнивали развертывание обычных фрагментов Fab или scFv последовательности ВНА10. На фиг. 4 показаны результаты ДСК-анализа очищенного ВНА10 scFv при скорости сканирования 1 и 2°С/мин. На фиг. 5 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 9), кодирующая стабилизированный дисульфидом между VH44/VL100 BHA10 scFv конструкт, включающий линкер (Gly4Ser)3 (показан полужирным шрифтом). На фиг. 6 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 10) стабилизированного дисульфидом между VH44/VL100 BHA10 scFv конструкта. Цистеиновые остатки, формирующие VH44/VL100 дисульфидный мостик, выделены полужирным шрифтом и курсивом. На фиг. 7 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 14), кодирующая стабилизированный ВНА10 scFv конструкт, включающий линкер (Gly4Ser)4 (показан полужирным шрифтом). На фиг. 8 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 15) (Gly4Ser)4 BHA10 scFv конструкта. Пояснение такое же, как и для фиг. 7. На фиг. 9 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 16), кодирующая ВНА10 scFv конструкт, включающий линкер (Gly4Ser)5 (показан полужирным шрифтом). На фиг. 10 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 17) (Gly4Ser)5 BHA10 scFv конструкта. Аннотация такая же, что и для фиг. 9. На фиг. 11 отражены результаты анализа Вестерн Блот (вестерн-блоттинг), в котором сравнивались уровни экспрессии обычного ВНА10 scFv (полоса 1) и стабилизированной ВНА10 молекулы scFvs изобретения (полосы 2-4). Каждый образец подвергался электрофорезу как в восстанавливающих (левая панель), так и в невосстанавливающих (правая панель) условиях. На фиг. 12 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 18), кодирующая стабилизированный дисульфидом между VH44/VL100 BHA10 scFv конструкт, включающий линкер (Gly4Ser)4 (показан полужирным шрифтом). На фиг. 13 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 19) стабилизированного дисульфидом между VH44/VL100 и (Gly4Ser)4 ВНА10 scFv конструкта. Цистеиновые остатки, формирующие VH44/VL100 дисульфидный мостик, выделены полужирным шрифтом и курсивом. Пояснение такое же, как и для фиг. 12. На фиг. 14 отражены результаты анализа термической проверки, в ходе которого термическую стабильность стабилизированной ВНА10 молекулы scFvs изобретения сравнили с традиционной ВНА10 молекулой scFv. В подписях к фигуре указана температура, при которой 50% молекул scFv сохраняют свою связывающую активность (Т50). На фиг. 15 отражены результаты анализа способом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), выполненного с обычными ВНА10 scFv и ВНА10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv. На фиг. 16 показаны результаты связывания гидрофобного флуоресцентного красителя 1-анилино8-нафталинсульфоната (ANS) с обычным ВНА10 scFv, ВНА10 (Gly4Ser)4 scFv и ВНА10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv. На фиг. 17, 18 отражены результаты анализа частоты остатков доменов ВНА10 VH и VL. На фиг. 17 перечислены положения ВНА10 VH из библиотеки для скрининга на основании анализа частоты остатков последовательностей вариабельного домена IgG. На фиг. 18 перечислены положения ВНА10 VL из библиотеки для скрининга на основании анализа частоты остатков последовательностей вариабельного домена IgG. На фиг. 19 отражены результаты анализа термической проверки, в ходе исследовали влияние стабилизирующих мутаций ВНА10 scFv на термическую стабильность и аддитивность стабилизирующих - 12 - 015992 мутаций (GS3 означает (G4S)3 и GS4 означает (G4S)4; SS означает сульфидную связь). На фиг. 20 показан пример стабилизированного LTβR/TRAIL-R2 биспецифичного антитела (антитела "Геркулес") изобретения. Антитела Геркулес образуют гибридизацией стабилизированной молекулы ВНА10 scFv изобретения с антителом 14А2 IgG. Молекулу scFv можно гибридизовать с С- или Nконцом тяжелой цепи (С-Геркулес или МН-Геркулес) или с N-концом легкой цепи (NL-Геркулес). На фиг. 21, 22 схематически отображены последовательные ПЦР-реакции, используемые для гибридизации обычных и сконструированных ВНА10 scFv с аминоконцом (фиг. 21) или карбоксиконцом (фиг. 22) тяжелой цепи 14А2. На фиг. 23 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 28) химерной легкой цепи 14А2, включающей сигнальный пептид (подчеркнуто). На фиг. 24 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 29) химерной легкой цепи 14А2. На фиг. 25 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 30) тяжелой цепи обычного ВНА10 scFv NH-Геркулес. На фиг. 26 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 31) тяжелой цепи обычного ВНА10 scFv NH-Геркулес. На фиг. 27 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 32) тяжелой цепи ВНА10 scFv (Gly4Ser)4 NH-Геркулес. На фиг. 28 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 33) тяжелой цепи ВНА10 scFv (Gly4Ser)4 NH-Геркулес. На фиг. 29 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 34) тяжелой цепи ВНА10 scFv VH44:VL100 N-Геркулес. На фиг. 30 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 35) тяжелой цепи ВНА10 scFv VH44:VL100 NH-Геркулес. На фиг. 31 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 36) тяжелой цепи ВНА10 scFv VH44;VL100/(Gly4Ser)4 NH-Геркулес. На фиг. 32 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 37) тяжелой цепи ВНА10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 NH-Геркулес. На фиг. 33 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 44) тяжелой цепи обычной ВНА10 scFv С-Геркулес. На фиг. 34 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 45) тяжелой цепи обычной ВНА10 scFv С-Геркулес. На фиг. 35 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 46) тяжелой цепи ВНА10 scFv (Gly4Ser)4 С- Геркулес. На фиг. 36 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 47) тяжелой цепи ВНА10 scFv (Gly4Ser)4 С-Геркулес. На фиг. 37 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 48) тяжелой цепи ВНА10 scFv VH44:VL100 С-Геркулес. На фиг. 38 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 49) тяжелой цепи ВНА10 scFv VH44:VL100 С-Геркулес. На фиг. 39 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 50) тяжелой цепи ВНА10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 С-Геркулес. На фиг. 40 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 51) тяжелой цепи ВНА10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 С-Геркулес. На фиг. 41 показаны результаты анализа Вестерн Блот кратковременно экспрессируемых С- и NHГеркулес биспецифичных антител в клетках СНО. Левая панель содержит анализ в невосстанавливающих условиях, а правая - в восстанавливающих условиях. На фиг. 42, 43 показаны результаты анализа ELISA, оценивающего активность связывания стабилизированных антител Геркулес настоящего изобретения с рецепторами LTβR. На фиг. 42 отражены результаты со стабилизированными антителами С-Геркулес. На фиг. 43 показаны результаты со стабилизированными антителами N-Геркулес. Сокращение "wt" означает обычное антитело NH Геркулес. "GS4" означает стабилизированное антитело NH Геркулес, включающее стабилизированную (Gly4Ser)4 scFv. "ds" соответствует стабилизированному антителу NH Геркулес, включающему стабилизированную scFv с VH44/VL100 дисульфидным линкером. На фиг. 44, 45 показаны результаты анализа ELISA, оценивающего активность связывания стабилизированных антител Геркулес настоящего изобретения с рецепторами TRAIL R2. На фиг. 44 отражены результаты со стабилизированными антителами С-Геркулес. На фиг. 45 показаны результаты со стабилизированными антителами NH-Геркулес. Сокращение "wt" означает обычное антитело NH Геркулес. "GS4" означает стабилизированное антитело NH Геркулес, включающее стабилизированную (Gly4Ser)4scFv. "ds" соответствует стабилизированному антителу NH Геркулес, включающему стабилизированную scFv с VH44/VL100 дисульфидным линкером. - 13 - 015992 На фиг. 46 показаны результаты SEC анализа стабилизированных биспецифичных антител СГеркулес после хроматографии белка А. На фиг. 47, 48 показаны результаты SDS-PAGE анализа очищенных стабилизированных биспецифичных антител Геркулес. На фиг. 47 отображены результаты для биспецифичных антител NH-Геркулес. На фиг. 48 отображены результаты для биспецифичных антител С-Геркулес. В каждую полосу загружали по 5 мкг образца. На фиг. 49 показаны результаты аналитического SEC анализа очищенных стабилизированных биспецифичных антител N-Геркулес. Панель А отображает профиль N-Геркулес с VH44:VL100 BHA10 scFv после хроматографии Белка А, а панель В - после препаративного SEC. Панель С отображает профиль NГеркулес с VH44:VL100/(G4S)4 BHA10 scFv после хроматографии Белка А, а панель D - после препаративного SEC. На фиг. 50 показаны результаты аналитического SEC анализа очищенных стабилизированных биспецифичных антител С-Геркулес. Панель А отображает профиль С-Геркулес с VH44:VL100 ВНА10 scFv после хроматографии белка А, а панель В - после препаративного SEC. Панель С отображает профиль СГеркулес с VH44:VL100/(G4S)4 ВНА10 scFv после хроматографии белка А, а панель D - после препаративного SEC. На фиг. 51 показаны результаты анализа способом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), выполненного для С-Геркулес с VH44:VL100/(G4S)4 ВНА10 scFv и С-Геркулес обычным ВНА10 scFv. На фиг. 52 показаны результаты анализа ELISA, оценивающего активность биспецифичного связывания стабилизированных антител Геркулес настоящего изобретения с рецепторами TRAIL-R2 и LTβR Ig. "N-''Геркулес" Cys и C-''Геркулес"Cys представляют собой антитела Геркулес, включающие NH- или С-концевые scFv с дисульфидной связью VH44/VL100. "N-''Геркулес"Cys и N-''Геркулес" DM" представляют собой антитела Геркулес, включающие NH- или С-концевые scFv с дисульфидной связью VH44/VL100 и линкером (Gly4Ser)4. Пентамер СВЕ11 представляет собой контрольное антитело с неспецифичной LTβR-связывающей активностью. На фиг. 53-56 отображены эффекты стабилизированных N- и С-Геркулес биспецифичных антител на рост клеток опухолей. На фиг. 53-56 показаны эффекты на рост опухолевых клеток WiDr, опухолевых клеток Me 180, MDA231 и HUVEC соответственно. Фиг. 57 представляет собой схематическую диаграмму стабилизированных двухцепочечных димерных мини-тел, включающих стабилизированные scFv. Пример мини-тела включает первый цепочечный фрагмент, включающий стабилизированный scFv со специфичностью связывания к антигену TRAIL R2, и второй цепочечный фрагмент, включающий стабилизированный scFv со специфичностью связывания к антигену LTβR. Ориентация доменов VH и VL в scFv может меняться, и соответствующие специфичности связывания также могут быть изменены. Фиг. 58 представляет собой схематическую диаграмму стабилизированного биспецифичного двухцепочечного димерного тетравалентного мини-тела (стабилизированного биспецифичного N-scFv тетравалентного мини-тела), включающего стабилизированные фрагменты scFv изобретения, соединенные с аминоконцом. Пример стабилизированного димерного тетравалентного мини-тела включает первый цепочечный фрагмент, включающий два стабилизированных scFvs со специфичностью связывания к антигену TRAIL R2, и второй цепочечный фрагмент, включающий два стабилизированных scFvs со специфичностью связывания к антигену LTβR. Возможны также и другие конфигурации, например, можно так сконструировать биспецифичное тетравалентное мини-тело, что каждый такой фрагмент будет содержать два стабилизированных фрагмента scFv с различными специфичностями. В соответствии с другим аспектом ориентацию доменов VH и VL в scFv можно изменить. В соответствии с другим вариантом осуществления scFv стабилизировано меньше всех. Фиг. 59 представляет собой схематическую диаграмму примера стабилизированного биспецифичного двухцепочечного димерного тетравалентного мини-тела (стабилизированного биспецифичного CscFv тетравалентного мини-тела), включающего стабилизированные фрагменты scFv изобретения, соединенные с обоими карбоксильными концами бивалентного мини-тела. Пример стабилизированного димерного тетравалентного мини-тела включает первый цепочечный фрагмент, включающий два стабилизированных scFvs со специфичностью связывания к антигену TRAIL R2, и второй цепочечный фрагмент, включающий два стабилизированных scFvs со специфичностью связывания к антигену LTβR. Возможны также и другие конфигурации, например, можно так сконструировать биспецифичное двухцепочечное димерное тетравалентное мини-тело, что каждая такая цепочка будет содержать два стабилизированных фрагмента scFv с различными специфичностями. В соответствии с другим вариантом осуществления ориентацию доменов VH и VL в scFv можно изменить. В соответствии с другим вариантом осуществления scFv стабилизировано меньше всех. Фиг. 60 представляет собой схематическую диаграмму стабилизированного биспецифичного четырехцепочечного димерного диатела, включающего стабилизированные scFv изобретения. Возможны также и другие конфигурации, например, можно так сконструировать стабилизированное биспецифич- 14 - 015992 ное двухцепочечное димерное тетравалентное мини-тело, что каждое такое плечо будет содержать стабилизированные фрагменты scFv с различными специфичностями. Ориентацию доменов VH и VL можно изменить. В соответствии с другим вариантом осуществления scFv стабилизировано меньше всех. Фиг. 61 представляет собой схематическую диаграмму стабилизированного биспецифичного четырехцепочечного димерного тетравалентного scFv антитела (стабилизированного C-scFv тетравалентного антитела), включающего стабилизированные scFv, соединенные с карбоксильным концом CH3 и пептидом, присоединенным к шарниру. Ориентацию доменов VH и VL в стабилизированном scFv можно изменить. Альтернативно, стабилизированные scFv фрагменты можно присоединять к аминоконцу либо тяжелой, либо легкой цепи с образованием NH-scFv тетравалентных антител или NL-scFv тетравалентных антител соответственно. Фиг. 62 представляет собой схематическую диаграмму стабилизированного четырехцепочечного тетравалентного биспецифичного антитела scFv без домена CH3 (стабилизированного C-scFv тетравалентного биспецифичного антитела с удаленным доменом CH3), включающего стабилизированное антитело scFv, присоединенное к карбоксильному концу CH3 и пептидом, присоединенным к шарниру. Каждый участок тяжелой цепочки биспецифичного антитела включает область Fv со специфичностью связывания к антигену TRAIL R2 и стабилизированную область scFv со специфичностью связывания к антигену LTβR. Ориентацию VH и VL доменов в стабилизированном scFv можно изменять и менять соответствующие антигенсвязывающие специфичности. В соответствии с другим вариантом осуществления scFv стабилизировано меньше всех. Фиг. 63 представляет собой схематическую диаграмму стабилизированного четырехцепочечного тетравалентного биспецифичного антитела scFv с удаленным доменом CH3 (стабилизированного NH-scFv тетравалентного биспецифичного антитела с удаленным доменом CH3), включающего стабилизированное антитело scFv, присоединенное к аминоконцу VH и включающее пептид, присоединенный к шарниру. Каждый участок тяжелой цепи биспецифичного антитела включает область Fv со специфичностью связывания к антигену TRAIL R2 и стабилизированную область scFv со специфичностью связывания к антигену LTβR. Ориентацию VH и VL доменов в стабилизированном scFv можно изменять и менять соответствующие антигенсвязывающие специфичности. В соответствии с другим вариантом осуществления scFv стабилизировано меньше всех. Фиг. 64 представляет собой схематическую диаграмму стабилизированного четырехцепочечного тетравалентного биспецифичного антитела scFv с удаленным доменом CH3 (стабилизированного NL-scFv тетравалентного биспецифичного антитела с удаленным доменом CH3), включающего стабилизированное антитело scFv, присоединенное к аминоконцу VL и включающее пептид, присоединенный к шарниру. Каждый участок тяжелой цепи биспецифичного антитела включает область Fv со специфичностью связывания к антигену TRAIL R2 и стабилизированную область scFv со специфичностью связывания к антигену LTβR. Ориентацию VH и VL доменов в стабилизированном scFv можно изменять и менять соответствующие антигенсвязывающие специфичности. В соответствии с другим вариантом осуществления scFv стабилизировано меньше всех. На фиг. 65 изображены кривые Т50 ВНА10 scFv дикого типа (закрашенные кружки) по сравнению со стабилизирующими мутациями ВНА10 scFV, включающими VL-S46L (фиг. 65А, пустые кружки), VHV55G (фиг. 65В, пустые кружки) и VH P101D (фиг. 65C, пустые кружки). На фиг. 66, 67 изображены кривые ДСК VH-(GS)4-VL-6His BHA10 scFv дикого типа (серая линия) по сравнению с ВН10 scFv, включающими стабилизирующие мутации VL S46L (черная линия) (фиг. 66) и VH V55G (черная линия) (фиг. 67). На фиг. 68 изображены кривые ДСК VH-(GS)4-VL-6His BHA10 scFv дикого типа (серая линия) по сравнению с ВН10 scFv, включающими стабилизирующую мутацию VH-P101D (черная линия). На фиг. 69 изображен анализ SDS-PAGE scFv дикого типа ("WT (G4S)X3") и стабилизированного мутантного scFv. Все мутантные scFv содержат связывающий пептид типа Gly-Ser и формулы (Gly4Ser)4 между N-концом VH и С-концом VL ("(G4S)X4"). Показана идентичность scFv в каждой полосе. Полосы 12-14 содержат ВНА10 scFv с дисульфидным мостиком между VH44 и VL100. (G4S)Х4/дисульфид стабилизирующие scFv обозначены как "DM", что означает "double mutant" (двойной мутант). Две последние полосы включают заданные мутации, которые также стабилизировали связанные через дисульфиды scFv. На фиг. 70, 71 изображены кривые ДСК ВНА10 scFv дикого типа scFv ("VH-(GS)4-VL-6His") (пунктирная линия), VH S16E мутантное scFv (тонкая серая линия), VL S46L мутантное scFv (тонкая черная линия), VH V55G мутантное scFv (толстая серая линия), а также VH P101D мутантное scFv (толстая черная линия). На фиг. 71 показана зависящая от температуры флуоресценция 10 мМ ANS в PBS (пустые кружки) или в присутствии ВНА10 scFv дикого типа ("VH-(GS)4-VL-6His") (закрашенные серые кружки), VH S16E мутантных scFv (ромбики), VL S46L мутантных scFv (квадратики), VH V55G мутантных scFv (обратные треугольники), а также VH P101D мутантных scFv (треугольники). Проведенные через кривые линии построены на основании модели развертывания с двумя состояниями. На фиг. 72, 73 показана флуоресценция ANS при 15°С в присутствии scFvs дикого типа и мутантных. Индуцированная каждым scFv флуоресценция ANS нанесена на график против ТМ домена VH того - 15 - 015992 же scFv, как определено способом ДСК (фиг. 72) и температурозависимым увеличением флуоресценции ANS, вызванным развертыванием каждой scFv (фиг. 73). На фиг. 74-76 представлены данные гель-хроматографии (SEC) высоких концентраций стабилизированного N-Геркулес (XWU028; ВНА10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4N-Геркулес; фиг. 74), стабилизированного С-Геркулес (XWU036; ВНА10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 С-Геркулес; фиг. 75), а также антител ВНА10 дикого типа (фиг. 76) в шести временных точках (Т=0, Т=1 неделя, Т=2 недели, Т=1 месяц, Т=2 месяца и Т=3 месяца) и низких температурах (2-8°С). По оси X отложено время (минуты), по оси у mAU (единицы поглощения) при 280 нм. За время эксперимента значительных изменений в профиле элюирования отмечено не было. На фиг. 77 представлены данные анализа SDS-PAGE для XWU028 и XWU036 до хранения и через 3 месяца после их передачи на хранение при 2-8°С. Панель А. Ранее восстановленные образцы были окислены до первоначального состояния (обозначены как "NR"). Предполагаемая молекулярная масса, MW, ~200 кДа, наблюдалась для биспецифических образцов. ВНА10 показал свою ожидаемую MW ~150 кДа. Полосы 1-4 соответствуют образцам XWU028. Полосы 5-8 соответствуют образцам XWU036. Полосы 9-10 соответствуют образцам ВНА10 IgG. Панель В. Образцы восстановили DTT (обозначены как "Red", восстановленные). Предполагаемая молекулярная масса для тяжелой цепи составляет ~75 кДа, а для легкой цепи ~25 кДа, они наблюдались для биспецифичных образцов в восстановительных условиях. Тяжелые и легкие цепи ВНА10 показали свои ожидаемые MW 50 и 25 кДа соответственно в восстановительных условиях. Панели 1, 2, 6 и 7 соответствуют образцам XWU028. Панели 3, 4, 8 и 9 соответствуют образцам XWU036. Панели 5 и 10 соответствуют образцам ВНА10 IgG. На фиг. 78, 79 показаны данные интактного масс-анализа для XWU028 (панель А) и XWU036 (панель В) при Т=0, Т=1 месяц и Т=3 месяца. Для каждого белка наблюдалось несколько пиков из-за высокого уровня сиалилирования N-связанных углеводов в CH3. Распределение углеводов биспецифичных антител типично для стандартных белков IgG1. На фиг. 80, 81 отображены результаты сэндвич-анализа ELISA, в котором измерялось биспецифичное связывание образцов сыворотки, включающей N-концевой Геркулес (XWU028; фиг. 74) или Сконцевой Геркулес (XWU036; фиг. 75), с рецепторами TRAIL-R2 и LTβR. Фиг. 82 отражает результаты эксперимента по оценке относительной активности in vivo стабилизированных биспецифичных антител (XWU028 (ромбики) и XWU036 (пустые квадратики)), моноспецифичных антител, вводившихся по отдельности (hCBE11 (закрашенные треугольники) и hBHA10 (обращенные треугольники) и ch14А2 (ромбики)) и совместно (пустые треугольники) против мышиной модели ксенотрансплантата. Введения начались на день 13. hCBE11 v. VC: P<0,001; hBHA10 v. VC: P<0,001; ch14A2 v. VC: P<0,01; Геркулес-II XWU028 v. VC.: P<0,001; Геркулес-II XWU028 v.hBHA10: P<0,05; Геркулес-IIXWU028v.ch14A2: P<0,005; Геркулес-IIXWU036 v. VC: P<0,001; Геркулес-II XWU036 v. hBHA10: P<0,01; Геркулес-II XWU036 v. Ch14А2: Р<0,05; комбо v. V.C. : Р<0,001. На фиг. 83 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 52) тяжелой цепи С-Геркулес ВНА10 scFv VH S16E+VL S46L биспецифичного антитела. На фиг. 84 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 53) тяжелой цепи СГеркулес ВНА10 scFv VH S16E+VL S46L биспецифичного антитела. На фиг. 85 показана последовательность ДНК (SEQ ID NO: 54) тяжелой цепи С-Геркулес ВНА10 scFv VH44-VL100/VH S16E+VL S46L биспецифичного антитела. На фиг. 86 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 55) тяжелой цепи СГеркулес ВНА10 scFv VH44-VL100/VH S16E+VL S46L биспецифичного антитела. На фиг. 87 показаны результаты аналитической гель-хроматографии (SEC) элюатов белка А из супернатантов, включающих С-Геркулес со стабилизированным VH S16E+VL S46L ВНА10 scFv (XWU054) и С-Геркулес с обычным ("WT") BHA10 scFv. На фиг. 88, 89 показаны гели SDS-PAGE очищенного С-концевого Геркулес с VH S16E+VL S46L ВНА10 scFv (фиг. 88) и очищенного С-концевого Геркулес с VH44:VL100/VH S16Е+VL S46L BHA10 scFv (фиг. 89). На фиг. 90, 91 показаны профили элюирования аналитической SEC для С-концевого Геркулес с VH S16E+VL S46L ВНА10 scFv (фиг. 90) и С-концевого Геркулес с VH44:VL100/VH S16E+VL S46L ВНА10 scFv (фиг. 91) после первоначального этапа очистки белка. На фиг. 92, 93 показаны результаты in vitro анализов пролиферации опухолевых клеток, демонстрирующих активность С-концевого Геркулес с VH S16E+VL S46L ВНА10 scFv (XWU054) и С-концевого Геркулес с VH44:VL100/VH S16E+VL S46L ВНА10 scFv (XWU055). Клеткам MDA231 (фиг. 92) и WiDr (фиг. 93) вводили антитела. Активность для антител Геркулес сравнивали со стабилизированными XWU036 биспецифичными антителами и соответствующими моноспецифичными антителами (hBHA10 и ch14A2), вводившимися по отдельности или совместно. На фиг. 94 отображена кривая развертывания ДСК для BIIB7 IgG1, сделанная в условиях, идентичных тем, что использовались для остальных человеческих (гуманизированных) антител 18 BIIB (сплошная линия). Индивидуальные Fab, CH3 и CH3 переходы, хорошо заметные на кривой ДСК, помечены и представлены пунктирными линиями. - 16 - 015992 На фиг. 95 показана кривая развертывания ДСК антител BIIB7 в форматах IgG1 и IgG4. На фиг. 96 показаны кривые термического развертывания четырех человеческих (гуманизированных) антител IgG1: BIIB16, BIIB6, BIIB4 и BIIB1. Переходы при развертывании между CH3 и CH3 доменами для всех четырех конструктов IgG1 идентичны, но переходы при развертывании Fab высоковариабельны. На фиг. 97 представлены результаты консенсусного счета для 182 вариабельных последовательностей доменов человеческих антител человеческих антител и консенсусных последовательностей индивидуальных подклассов. А. Счеты последовательностей подкласса VH, полученные способом анализа частоты остатков в базе данных VH млекопитающих. В. Распределение счетов последовательности сравнения VH из NCBI. Счеты последовательностей VH кластеризованы в соответствии с подклассом С. Счеты последовательностей подкласса VK, полученные способом анализа частоты остатков в базе данных млекопитающих VK. D. Распределение счетов из последовательности VK сравнения из NCBI. Счеты последовательностей VK кластеризованы в соответствии с подклассом. На фиг. 98, 99 представлены двумерные графики, на которых сравниваются счеты последовательностей для антител 18 BIIB с соответствующими температурами Fab ТМ, измеренными способом ДСК. Фиг. 98 отражает счеты BIIB1-18 VH против Fab TM. Идентичность каждой точки включается в табл. 20. Значения VH BIIB15 и BIIB16 содержат необычные включения/делеции в своих областях CDR. Результаты для BIIB15 и BIIB16 показаны в виде квадратиков. TM для BIIB18 искусственно помечен как 57,2°С (чтобы привести в соответствие с минимальным измеренным ТМ из BIIB17), так как его собственную ТМ измерить не удалось в виду отсутствия экспрессии. Вероятно, ТМ для BIIB18 будет значительно меньше, так как его счет последовательности чрезвычайно мал, и он не может экспрессироваться. Данные Fab для BIIB18 представлены в виде треугольников. Результаты для VH оставшихся антител BIIB представлены в виде кружков. На фиг. 99 показаны счеты BIIB1-18 VK против Fab TM. Символы соответствуют графику (А), если не считать счетов для VK. На фиг. 100 показаны репрезентативные структуры V-класса, С-класса и I-класса укладки Ig. На фиг. 101 отображена гистограмма длин последовательностей V-, I-, С1- и С2-классов укладок Ig, полученных из SCOP. На фиг. 102 показан вывод NAPMAP Visual Tool, включающий фрагмент платформы выравнивания, на котором накладываются данные ковариационного анализа. Платформа отображает колонки (столбцы), включающие все аминокислотные остатки, включая пропуски (тип остатка), для каждого положения в вариабельной области (№ положения остатка). На фиг. 103 показано наложение статистик ковариации укладки Ig на шаблон NAPMAP. Интересующая последовательность представлена в виде изогнутой линии, проходящей через соответствующие аминокислоты. Ковариации показаны в виде прямых полосок между соответствующими коварьирующими аминокислотными остатками. На фиг. 104 показаны детали ковариационного анализа ВНА10 VL с выделением ковариации между Tyr в положении Кэбата 36 (положение остатка № 48) и мутации SerLeu в положении Кэбата 46 (положение остатка № 67), как описано в примере 7. На фиг. 105 показаны детали ковариационного анализа ВНА10 VH с выделением конфликтующей ковариации между Val в положении Кэбата 67 (положение остатка № 100), Thr в положении Кэбата 70 (положение остатка № 104) и мутации MetLeu в положении Кэбата 80 (положение остатка № 116). На фиг. 106 показана последовательность одноцепочечной ДНК (SEQ ID NO: 63) тяжелой цепи Сконцевого тетравалентного антитела PRIMATIZED® р5Е8, включающего обычный scFv. На фиг. 107 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 64) тяжелой цепи Сконцевого тетравалентного антитела PRIMATIZED® р5Е8, включающего обычный scFv. На фиг. 108 показана последовательность одноцепочечной ДНК (SEQ ID NO: 65) легкой цепи PRIMATIZED® p5E8. Последовательность сигнального пептида выделена. На фиг. 109 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 66) легкой цепи PRIMATIZED® p5E8. На фиг. 110 показана последовательность одноцепочечной ДНК (SEQ ID NO: 67) обычной PRIMATIZED® p5E8 (VL/VH) scFv. Последовательность сигнального пептида выделена. На фиг. 111 показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 68) обычной PRIMATIZED® p5E8 (VL/VH) scFv. На фиг. 112 показана последовательность одноцепочечной ДНК (SEQ ID NO: 69) обычной PRIMATIZED® p5E8 (VH/VL) scFv. На фиг. 113 (SEQ ID NO: 70) показана аминокислотная последовательность обычной PRIMATIZED® p5E8 (VH/VL) scFv. На фиг. 114 показаны кривые Т50 обычной р5Е8 (VH/VL) scFv (закрашенные кружки) по сравнению с обычной р5Е8 (VL/VH) scFv (пустые кружки). На фиг. 115 показаны результаты исследования по оценке относительной стабильности in vivo стабилизированных биспецифичных антител "Геркулес-II" (XWU036 (закрашенные кружки)) и моноспеци- 17 - 015992 фичных антител, вводившихся по отдельности (hBHA10 (обращенные закрашенные треугольники) и ch14А2 (закрашенные ромбы)) и совместно (пустые обращенные треугольники) на мышиной модели опухолевых ксенотрансплантантов рака молочной железы человека (MDA-MB-231). На фиг. 116, 117 показаны остатки VH, участвующие в ковариационной сети, которые важны для поддержания области контакта (фиг. 116), и остатки области контакта, участвующие в создании прямых контактов с областью контакта VH/VL и которые непосредственно отображаются на поверхность домена VH (фиг. 117). Стрелки указывают на положение остатков вне фактической области контакта, которые по данным ковариационного анализа важны для стабилизации взаимодействия VH/VL и для стабильности VH/VL. Локализация гипервариабельных остатков CDR3, осуществляющих непосредственные контакты в области контакта между VH и VL, выделена рамкой. На фиг. 118, 119 показаны остатки VL, участвующие в ковариационной сети, которые важны для поддержки области контакта (фиг. 118), и остатки области контакта, участвующие в создании прямых контактов с областью контата VH/VL и которые непосредственно отображаются на поверхность VL (фиг. 119). Стрелки указывают на положение остатков вне фактической области контакта, которые по данным ковариационного анализа важны для стабилизации взаимодействия VH/VL и для стабильности VH/VL. Локализация гипервариабельных остатков CDR3, осуществляющих непосредственные контакты в области контакта между VH и VL, выделена рамкой. На фиг. 120 показан пример окружающих условий, подходящих для практического осуществления аспекта изобретения. Фиг. 121 представляет собой блок-схему последовательности действий, которых надо придерживаться в соответствии с аспектом изобретения, чтобы определить счет ковариации последовательности, который можно затем использовать как меру стабильности полипептида. Фиг. 122 представляет собой блок-схему последовательности действий, которых надо придерживаться в соответствии с аспектом изобретения, чтобы определить консенсусный счет и затем использовать его для прогнозирования стабильности белка-кандидата. Фиг. 123 представляет собой блок-схему последовательности действий, которых надо придерживаться в соответствии с аспектом изобретения, чтобы определить средний консенсусный счет и затем использовать его для прогнозирования стабильности белка-кандидата. Фиг. 124 представляет собой блок-схему последовательности действий, которых надо придерживаться в соответствии с аспектом изобретения, чтобы с помощью остатка замещения полипептида определить для него улучшенную последовательность. Фиг. 125(А-В) показывают аминокислотные последовательности стабилизированных ВНА10 scFV, включающих S46L(VL) стабилизирующую мутацию (SEQ ID NO: 137) и V55G(VH) стабилизирующую мутацию (SEQ ID NO: 138). Стабилизирующая мутация заключена в рамку. Ведущая последовательность, gly/ser-соединяющий пептид и домен CH1 выделены нижним подчеркиванием, полужирным шрифтом и курсивом соответственно. На фиг. 126 отображена гистограмма коэффициентов корреляции f-значений, вычисленных для каждого остатка внутри группы данных для С-класса. Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Изобретение основано, по крайней мере частично, на разработке стабилизированных связывающих мишень молекул, включающих стабилизированные молекулы scFv и способы приготовления таких стабилизированных связывающих молекул. Кроме того, настоящее изобретение относится также к способам конструирования стабильных белков, таких как молекулы антител. Стабилизированные молекулы scFv настоящего изобретения особенно эффективны при создании стабильных полиспецифичных, например биспецифичных, молекул. Стабилизированные связывающие молекулы изобретения, например полиспецифичные связывающие молекулы, могут быть стабильно экспрессированы в культуре, подходят для крупномасштабного изготовления и стабильны in vivo. Изобретение основано, по крайней мере частично, на разработке стабилизированных связывающих молекул, состоящих из или включающих стабилизированную молекулу scFv, и на способах получения таких связывающих молекул. Кроме того, настоящее изобретение относится также к способам конструирования стабильных белков и прогнозирования стабильности белков, таких как молекулы антител. Перед тем как приступить к более детальному описанию изобретения, далее для удобства приводится значение некоторых терминов. I. Определения. Термин "молекула scFv" здесь включает связывающие молекулы, состоящие из одного вариабельного домена легкой цепи (VL) или его фрагмента и одного вариабельного домена тяжелой цепи (VH) или его фрагмента, где каждый вариабельный домен или его фрагмент получают из одних и тех же или различных антител. Молекула scFv предпочтительно включает линкер scFv, расположенный между VH доменом и VL доменом. Молекула scFv известна в уровне техники и описана, например, в патенте США № 5892019 (Но et al.), 1989. Gene 77:51; Bird et al. 1988 Science 242:423; Pantoliano et al. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic et al. 1991. Cancer Research 51:6363; Takkinen et al. 1991. Protein Engineering 4:837. Термин "линкер scFv" здесь означает объект, расположенный между доменами VL и VH молекулы - 18 - 015992 scFv. Предпочтительно линкеры scFv поддерживают молекулу scFv в антигенсвязывающей конформации. В соответствии с одним вариантом осуществления линкер scFv включает или состоит из пептидного линкера scFv. В соответствии с некоторыми аспектами пептидный линкер scFv включает или состоит из связывающего пептида Gly-Ser. В соответствии с другими аспектами линкер scFv включает дисульфидную связь. Термин "связывающий пептид Gly-Ser" означает пептид, состоящий из остатков глицина и серина. Пример связывающего пептида Gly-Ser включает аминокислотную последовательность (Gly4Ser)n. В соответствии с одним вариантом осуществления n=1. В соответствии с одним вариантом осуществления n=2. В соответствии с другим вариантом осуществления n=3. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления n=4, т.е. (Gly4Ser)4. В соответствии с другим вариантом осуществления n=5. В соответствии с еще одним вариантом осуществления n=6. Еще один пример связывающего пептида Gly-Ser включает аминокислотную последовательность Ser(Gly4Ser)n. В соответствии с одним вариантом осуществления n=1. В соответствии с одним вариантом осуществления n=2. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления n=3. В соответствии с другим вариантом осуществления n=4. В соответствии с другим вариантом осуществления n=5. В соответствии с еще одним вариантом осуществления n=6. Термин "дисульфидный мостик" в настоящем изобретении означает ковалентную связь, образованную двумя атомами серы. Аминокислота цистеин включает тиоловую группу, которая может сформировать дисульфидную связь или мостик со второй тиольной группой. Термин "обычная молекула scFv" здесь означает молекулу scFv, которая не является стабилизированной молекулой scFv. Например, в типичной обычной молекуле отсутствуют стабилизирующие мутации, и включается домен VH и VL, связанные линкером (G4S)3. "Стабилизированная молекула scFv" изобретения - молекула scFv, включающая по меньшей мере одно изменение по сравнению с обычной молекулой scFv, которое приводит к стабилизации молекулы scFv. Здесь термин "стабилизирующая мутация" включает мутацию, придающую улучшенную белковую стабильность (например, термическую стабильность) молекуле scFv и/или более крупному белку, включающему указанную молекулу scFv. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизирующая мутация включает замещение дестабилизирующей аминокислоты другой аминокислотой, которая сообщает белку улучшенную стабильность (здесь "стабилизирующая аминокислота"). В соответствии с одним вариантом осуществления длина линкера scFv в стабилизирующей мутации оптимизирована. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная молекула scFv изобретения включает одну или более аминокислотных замен. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления стабилизирующая мутация включает замену по меньшей мере одного аминокислотного остатка, приводящую к повышению стабильности области контакта VH и VL молекулы scFv. В соответствии с одним вариантом осуществления аминокислота находится внутри области контакта В соответствии с другим вариантом осуществления аминокислота поддерживает взаимодействие между VH и VL. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизирующая мутация включает замену по меньшей мере одного аминокислотного остатка в домене VH или домене VL, коварьирующими с двумя или более аминокислотами области контакта между доменами VH и VL. В соответствии с другим вариантом осуществления при стабилизирующей мутации вводится по меньшей мере один остаток цистеина (т.е. он встраивается в один или более домен VH или VL), так что домены VH и VL связаны по меньшей мере одним дисульфидным мостиком между аминокислотами домена VH и аминокислотами домена VL. В соответствии с некоторыми предпочтительными аспектами стабилизированная молекула scFv изобретения характеризуется оптимизированной длиной линкера scFv, а также у нее замещен по меньшей мере один аминокислотный остаток и/или домены VH и VL связаны дисульфидным мостиком между аминокислотой домена VH и аминокислотой домена VL. В соответствии с одним вариантом осуществления в молекуле scFv можно сделать более одной описанной здесь стабилизирующей мутации. В соответствии с одним вариантом осуществления одна или более стабилизирующая мутация, сделанная в молекуле scFv, одновременно повышает термическую стабильность доменов VH и VL молекулы scFv по сравнению с обычной молекулой scFv. Предпочтительно, если популяция одной или более стабилизированных молекул scFv изобретения экспрессируется как популяция мономерных, стабильных белков. В соответствии с одним вариантом осуществления в агрегированной форме присутствует не более 10% молекул. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная молекула scFv популяции может содержать ту же стабилизирующую мутацию или комбинацию стабилизирующих мутаций. В соответствии с другими аспектами индивидуальные стабилизированные молекулы scFv популяции содержат различные стабилизирующие мутации. Стабилизированная молекула scFv может быть использована одна для связывания целевых молекул, а может быть связана с другим полипептидом с образованием стабилизирующей связывающей молекулы, включающей стабилизированную молекулу scFv. Например, связывающая молекула по изобретению может содержать молекулу scFv, связанную с второй молекулой scFv или не с молекулой scFv, например с молекулой, которая нарушает специфичность связывания, такой как антитело. - 19 - 015992 Термин "стабильность белка" в настоящем изобретении означает признанную в уровне техники характеристику сохранения одного или более физических свойств белка при изменении условий окружающей среды (например, на повышение или снижение температуры). В соответствии с одним вариантом осуществления физическое свойство представляет собой поддержание ковалентной структуры белка (например, отсутствие протеолитического расщепления, нежелательного окисления или деаминирования). В соответствии с другим вариантом осуществления физическое свойство представляет собой нахождение белка в правильно уложенном состоянии (например, отсутствии растворимых или нерастворимых агрегатов или преципитатов). В соответствии с одним вариантом осуществления стабильность белка измеряют, анализируя биофизическое свойство белка, например термическую стабильность, профиль развертывания как функцию от рН, стабильное удаление гликозилирования, растворимость, биохимическую функцию (например, способность связываться с белком (например, лигандом, рецептором, антигеном и т.д.) или химической группой и т.д.) и/или их комбинации. В соответствии с другим вариантом осуществления биохимическая функция определяется по сродству связывания при взаимодействии. В соответствии с одним вариантом осуществления характеристикой стабильности белка является его термическая стабильность, т.е. сопротивляемость температурным изменениям. Стабильность можно измерять способами, известными в уровне техники и/или описанными там. Домены VL и VH молекулы scFv получают из одной или более молекул антитела. Специалист понимает также, что вариабельные области молекул scFv изобретения можно модифицировать так, что их аминокислотная последовательность будет отличаться от молекулы антитела, из которой они были взяты. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления, можно произвести нуклеотидные или аминокислотные замены, ведущие к консервативным замещениям или изменениям в аминокислотных остатках (например, в аминокислотных остатках CDR и/или каркаса). Альтернативно или в дополнение, в аминокислотных остатках CDR можно произвести мутации с целью оптимизации связывания антигенов, используя при этом известные технологии. Связывающие молекулы изобретения сохраняют способность связываться с антигеном. Термин "производный от" ("полученный из") указанного белка означает происхождение полипептида. В соответствии с одним вариантом осуществления полипептидная или аминокислотная последовательность, производная от конкретного исходного полипептида, представляет собой последовательность вариабельной области (например, VH или VL) или родственную им последовательность (например, каркасный область или CDR). В соответствии с одним вариантом осуществления аминокислотная последовательность, производная от конкретного исходного полипептида, не является сплошной. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления, из исходного антитела можно получить одну, две, три, четыре, пять или шесть областей CDR. В соответствии с одним вариантом осуществления полипептидная или аминокислотная последовательность, производная от конкретного исходного полипептида или аминокислотной последовательности, включает аминокислотную последовательность, практически идентичную исходной последовательности или ее фрагменту, где фрагмент включает по меньшей мере 3-5 аминокислот, 5-10 аминокислот, по меньшей мере 10-20 аминокислот, по меньшей мере 20-30 аминокислот или по меньшей мере 30-50 аминокислот, или которую специалист может иным способом идентифицировать как происходящую от исходной последовательности. Выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую стабилизированную молекулу scFv или ее фрагмент, можно создать, вводя одну или несколько нуклеотидных замен, вставок или делеций в нуклеотидную последовательность обычной молекулы scFv или иммуноглобулина, из которого она была получена, так что в кодируемом белке образуется одна или более замен, вставок или делеций. Мутации можно вводить стандартными технологиями, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦРопосредованный мутагенез. В соответствии с одним вариантом осуществления консервативные аминокислотные замены производят в одном или более остатках несущественных аминокислот. "Консервативной аминокислотной заменой" называется такая замена, при которой аминокислотный остаток заменяется на другой аминокислотный остаток с такой же боковой цепью. В уровне техники определены семейства аминокислотных остатков с одинаковыми боковыми цепями, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-ветвящиеся боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, аминокислотный остаток в полипептиде иммуноглобулина можно заменить другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. В соответствии с другим вариантом осуществления строку аминокислот можно заменить структурно похожей строкой, отличающейся только порядком и/или композицией членов семейства боковых цепей. В соответствии с другим вариантом осуществления мутацию вводят для того, чтобы ввести по меньшей мере одну молекулу цистеина в домены VH и VL и, таким образом, ввести дисульфидную связь в молекулу scFv. В соответствии с другим вариантом осуществления аминокислоту из обычной молекулы scFv можно заместить на аминокислоту с такими же физическими (например, пространственными) или функциональными свойствами. Предпочтительно, - 20 - 015992 чтобы аминокислотные замены в обычной молекуле scFv были бы совместимы с целостностью области контакта VL/VH, конформациями CDR и упаковкой VH и/или VL. Альтернативно, в соответствии с другим вариантом осуществления мутации можно вводить случайным образом по всей или части кодирующей последовательности иммуноглобулина. Стабилизированная молекула scFv изобретения или полипептиды, включающие стабилизированную молекулу scFv, представляют собой связывающие молекулы, т.е. они связываются с целевой интересующей молекулой, например с антигеном. Когда стабилизированная молекула scFv изобретения сплавляется с другой молекулой, вторая молекула может также вносить дополнительную специфичность связывания в химерный белок. Связывающие молекулы изобретения состоят из молекулы scFv (например, доменов VH и VL, соединенных линкером scFv) или содержат стабилизированную молекулу scFv изобретения. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения моновалентны, т.е. содержат один целевой сайт связывания (например, это имеет место в случае молекулы scFv). В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения поливалентны, т.е. содержат более одного целевого сайта связывания. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы содержат по меньшей мере два сайта связывания. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы содержат два сайта связывания. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы содержат три сайта связывания. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы содержат четыре сайта связывания. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы содержат более четырех сайтов связывания. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения представляют собой мономеры. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения представляют собой полимеры. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения представляют собой димеры. В соответствии с одним вариантом осуществления димеры изобретения представляют собой гомодимеры, включающие две идентичные мономерные субъединицы. В соответствии с другим вариантом осуществления димеры изобретения представляют собой гетеродимеры, включающие две не идентичные мономерные субъединицы. Субъединицы димера могут содержать одну или более полипептидных цепей. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления димеры содержат по меньшей мере две полипептидные цепи. В соответствии с одним вариантом осуществления димеры содержат две полипептидные цепочки. В соответствии с другим вариантом осуществления димеры содержат четыре полипептидные цепи (например, как в случае молекул антител). Термин "валентность" здесь означает количество потенциальных мишеньсвязывающих сайтов в полипептиде. Каждый такой сайт специфически связывает одну молекулу мишени или специфический сайт на молекуле мишени. Если полипептид включает более одного сайта связывания мишени, то каждый такой сайт может специфично связываться с одной и той же или с различными молекулами (например, может связываться с различными молекулами, например, различными антигенами или различными эпитопами одной молекулы). Термин "специфичность" означает способность специфично связываться (например, иммунореагировать) с данной мишенью. Полипептид может быть моноспецифичным и содержать один или более сайтов связывания, которые специфично связываются с мишенью, или полипептид может быть полиспецифичным (например, биспецифичным или триспецифичным) и содержать два или более сайтов связывания, которые специфично связываются с одной или различными мишенями. Специфическое связывание может быть привнесено стабизированной молекулой scFv изобретения и/или группой не-scFv, с которой соединена молекула scFv изобретения. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению полиспецифична. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления полиспецифичная связывающая молекула по изобретению представляет собой биспецифичную молекулу (например, антитело, минитело, антитело с удаленным доменом или химерный белок, однодоменное антитело (например, верблюда, акулы, человека), включающее по меньшей мере одну стабилизированную молекулу scFv), обладающую специфичностью связывания по меньшей мере с двумя мишенями, например более чем с одной молекулой мишени или более чем с одним эпитопом одной молекулы мишени. В соответствии с одним вариантом осуществления полиспецифичная молекула включает по меньшей мере один сайт связывания, специфичный для молекулы с функцией восстановления или элиминирования или для молекулы-мишени в клетке. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичная молекула включает по меньшей мере один сайт связывания, специфичный для молекулы с функцией восстановления или элиминирования, и по меньшей мере один сайт связывания, специфичный для лекарства. В соответствии с еще одним вариантом осуществления полиспецифичная молекула включает по меньшей мере один сайт связывания, специфичный для молекулы с функцией восстановления или элиминирования, и по меньшей мере один сайт связывания, специфичный для пролекарства. В соответствии с одним вариантом осуществления полиспецифичная молекула включает одну спе- 21 - 015992 цифичность для растворимых молекул и одну специфичность для молекул клеточной поверхности. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичная молекула включает две специфичности связывания для двух мишеней в одной или более растворимых молекулах. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичная молекула включает две специфичности связывания для двух мишеней в одной или более молекулах клеточной поверхности (которые могут присутствовать в одной или более клетках). В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы содержат по меньшей мере один сайт связывания мишени, специфичный для молекулы, опосредующей биологические эффекты (например, модулирующей активацию клеток (например, путем связывания с рецептором клеточной поверхности, что приводит к передаче или ингибированию активирующего или ингибирующего сигнала), что приводит к смерти клетки (например, в результате индуцированного клеточного сигнала, комплементарной фиксации или экспозиции дополнительной функции на связывающейся молекуле), или модулирует заболевание или расстройство у субъекта (например, опосредуя или стимулируя уничтожение клеток, стимулируя лизис фибриновых тромбов или их образование, либо модулируя количество биодоступного вещества (например, усиливая или уменьшая количество у субъекта такого лиганда, как TNFα)). В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения связываются по меньшей мере с одной мишенью, трансдуцирующей сигнал в клетку, например, путем связывания с рецептором клеточной поверхности, таким как рецептор семейства TNF. Выражение "трансдуцирует сигнал" означает, что, связываясь с клеткой, связывающая молекула преобразует внеклеточное влияние на рецептор клеточной поверхности в клеточный ответ, например, модулируя путь трансдукции сигнала. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы связываются по меньшей мере с одной мишенью, специфичной для молекулы с функцией восстановления или элиминирования, например с антигеном клеточной поверхности или с растворимым антигеном. В соответствии с одним вариантом осуществления связывание связывающей молекулы с мишенью приводит к восстановлению или элиминированию мишени, например, из ткани или из кровотока. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы содержат по меньшей мере один сайт связывания, специфичный для молекулы, которая может быть использована для детекции целевой молекулы (например, для детекции примеси или диагностики состояния или расстройства). В соответствии с еще одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один сайт связывания, который нацеливает связанную молекулу в специфичную область организма субъекта (например, в опухолевую клетку или тромб). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления полиспецифичная молекула представляет собой тетравалентное антитело с четырьмя сайтами связывания. Тетравалентная молекула может быть биспецифичной и бивалентной по каждой специфичности. Далее приводится более подробное описание примеров биспецифичных молекул. Предпочтительные связывающие молекулы изобретения содержат аминокислотные последовательности каркаса и константной области, производные от аминокислотных последовательностей человека. Однако связывающиеся полипептиды могут содержать последовательности каркаса и/или константной области производные от других видов млекопитающих. Например, в некоторых применениях могут использоваться связывающие молекулы, включающие последовательности мыши. В соответствии с одним вариантом осуществления в состав молекулы связывания может входить выделенная у приматов (например, не человека) каркасная область, фрагмент тяжелой цепи и/или концевой участок. В соответствии с одним вариантом осуществления в каркасной области связывающегося полипептида может присутствовать одна или несколько мышиных аминокислот, например, каркасная аминокислотная последовательность человека или человекообразной обезьяны может содержать одну или более аминокислотных обратный мутаций, в которых присутствуют соответствующие остатки мышиных аминокислот, и/или содержать одну или более мутаций в различных аминокислотных остатках, не обнаруживаемых в исходных мышиных антителах. Предпочтительные связывающиеся молекулы изобретения менее иммуногенны, чем мышиные антитела. "Слитый" белок, или химерный белок, включает первую аминокислотную последовательность, связанную со второй аминокислотной последовательностью, причем эти последовательности в природе друг с другом не связаны. Они, обычно, могут существовать в составе различных белков, которые затем можно соединить в составе химерного белка, или они могут существовать в составе одного белка, но в химерном белке их взаимное расположение будет другим. Химерный белок можно приготовить, например, в ходе химического синтеза или путем создания и трансляции полинуклеотида, кодирующего требуемые пептидные участки,расположенные требуемым образом. Термин "гетерологичный" применяется к полинуклеотиду или полипептиду, он означает, что полинуклеотид или полипептид является производным от объекта, отличающегося по генотипу от объекта, с которым производится сравнение. Например, гетерологичный полинуклеотид или антиген можно получить из различных видов животных, различных клеточных типов индивидуума или из клеток одного или - 22 - 015992 различных типов различных индивидуумов. Термин "лигандсвязывающий домен" или "лигандсвязывающий фрагмент" здесь означает любой нативный рецептор (например, рецептор клеточной поверхности) или любую область или производное рецептора, сохраняющие, по меньшей мере, качественную способность к связыванию лиганда и предпочтительно биологическую активность соответствующего нативного рецептора. Термин "рецепторсвязывающий домен" или "рецепторсвязывающий фрагмент" здесь означает любой нативный лиганд или любую область или производное лиганда, сохраняющие, по меньшей мере, качественную способность к связыванию с рецептором и предпочтительно биологическую активность соответствующего нативного лиганда. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения представляют собой молекулы стабилизированных антител или иммуноглобулинов, например, природные молекулы антител или иммуноглобулинов (или их антигенсвязывающих фрагментов) или генетически сконструированные молекул антител, связывающие антиген тем же способом, что и молекулы антител, и включающих молекулу scFv изобретения. Термин "иммуноглобулин" в настоящем изобретении включает полипептид с комбинацией двух тяжелых и двух легких цепей, независимо от того, обладает ли он какой-либо специфичной иммунореактивностью. "Антитела" - такие сборки, которые проявляют значимую специфичную иммунореактивность по отношению к интересующему антигену (например, к антигену, связанному с опухолями). Антитела и иммуноглобулины содержат легкие и тяжелые цепи с или без ковалентных связей между ними. Основные структуры иммуноглобулинов в системах позвоночных сравнительно хорошо изучены. Как более подробно будет рассматриваться ниже, общий термин "иммуноглобулин" включает пять различных классов, которые можно различить биохимически. Все пять классов антител входят в область действия настоящего изобретения, но следующее ниже обсуждение в основном относится к классу IgG иммуноглобулинов. Молекула IgG иммуноглобулина содержат две идентичные легкие полипептидные цепи с молекулярным весом приблизительно 23000 Да и две идентичные тяжелые цепи весом 5300070000. Четыре цепи соединяются дисульфидными мостиками в "Y" конфигурации, причем легкие цепи обхватывают тяжелые цепи, начиная от "рта" буквы "Y" и продолжаясь в вариабельную область. Легкие и тяжелые цепи содержат области структурной и функциональной гомологии. Термины "константный" и "вариабельный" используются функционально. В этом отношении необходимо понимать, что вариабельный домен как легких (VL), так и тяжелых (VH) фрагментов цепи определяет узнавание и специфичность антигена. Наоборот, константные домены легкой (CL) и тяжелой цепи (CH1, CH3 или CH3) несут в себе важные биологические свойства, такие как секреция, трансплацентарная подвижность, связывание рецептора Fc, комплементарное связывание и подобные им. Согласно действующему соглашению номера константных областей доменов возрастают по мере их удаления от антигенсвязывающего сайта или N-конца антитела. N-конец представляет собой вариабельную область, а С-конец константную область, домены CH3 и CL, фактически, содержат карбоксиконцы тяжелой и легкой цепи соответственно. Стабилизирующие мутации в молекуле scFv могут быть в составе как аминокислот CDR, так и каркасных областей вариабельных тяжелых и/или легких цепей scFv. Термин "аминокислотные остатки вариабельной области CDR" включает аминокислоты в CDR (области, определяющие комплементарность), обнаруженные способами, основанными на структуре или последовательности. Термин "CDR" или "область, определяющая комплементарность" здесь означает несплошные узнающие антиген сайты из вариабельной области полипептидов тяжелых и легких цепей. Эти конкретные области были описаны в работах Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) и Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991), и by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) и by MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), причем определения включают наложения или подмножества аминокислотных остатков, наблюдаемые при их сравнении друг с другом. Для сравнения далее приводятся окружающие CDR аминокислотные остатки, определенные в каждой из приведенных выше ссылок. Предпочтительно определять термин CDR по способу Кэбата (Kabat), основанному на сравнении последовательностей. - 23 - 015992 1 Нумерация остатков соответствует номенклатуре Kabat et al., supra. Нумерация остатков соответствует номенклатуре Chothia et al., supra. 3 Нумерация остатков соответствует номенклатуре MacCallum et al., supra. Термин "аминокислотные остатки каркаса (framework, FM) вариабельной области" означает аминокислотные остатки каркасной области цепи Ig. Термин "каркасная область" или "область FR" здесь включает аминокислотные остатки, входящие в состав вариабельной области, но не являющиеся частью CDR (например, в соответствии с определением CDR по Кэбату). Таким образом, каркас вариабельной области включает от 100 до 200 аминокислотных остатков, но включает только аминокислоты, не входящие в состав CDR. В качестве конкретного примера вариабельной области тяжелой цепи и CDR в соответствии с определением по Кэбату можно сказать, что каркасная область 1 соответствует домену вариабельной области, охватывающему аминокислотные остатки 1-30; каркасная область 2 соответствует домену вариабельной области, охватывающему аминокислотные остатки 36-49; каркасная область 3 соответствует домену вариабельной области, охватывающему аминокислотные остатки 66-94, и каркасная область 4 соответствует домену вариабельной области, охватывающему аминокислотные остатки от 103 до конца вариабельной области. Каркасные области легкой цепи распределены по CDR вариабельных областей легкой цепи аналогичным образом. Точно так же на основании определений CDR, сделанных в работах Chothia et al. или McCallum et al., можно распределить границы каркасных областей по соответствующим концам CDR, как описано выше. В соответствии с предпочтительными аспектами области CDR определяются по Кэбату. В природных антителах шесть областей CDR в каждом мономерном антителе представляют собой короткие несмежные последовательности аминокислот, специфично так расположенные, чтобы сформировать антигенсвязывающий сайт в трехмерной конфигурации антитела в водной среде. Оставшаяся часть тяжелых и легких цепей вариабельных доменов демонстрирует меньше межмолекулярной вариабельности в своей аминокислотной последовательности и потому называется каркасными областями. В основном каркасные области находятся в конфигурации β-листа, a CDR образует петли, которые соединяют, а в некоторых случаях формируют часть этой структуры. Таким образом, эти каркасные области формируют структуру (каркас, scaffold), обеспечивающую правильную ориентацию шести областей CDR путем межцепочечных нековалентных взаимодействий. Антигенсвязывающий сайт, сформированный правильно расположенными CDR, определяет поверхностную комплементарность эпитопу иммунореактивного антигена. Эта комплементарная поверхность стимулирует нековалентное связывание антитела с иммунореактивным эпитопом антигена. Специалист легко может идентифицировать положения областей CDR. Как уже упоминалось, структура субъединиц и трехмерная конфигурация константных областей различных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Здесь термин "VH домен" включает аминоконцевой вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина. Термин "VL домен" включает аминоконцевой вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина. Термин "фрагмент" означает часть или фрагмент полипептида (например, антитела или его цепи), включающую меньше аминокислотных остатков, чем интактный или полный полипептид. Термин "антигенсвязывающий фрагмент" означает полипептидный фрагмент иммуноглобулина или антитела, которое связывает антиген или конкурирует с интактным антителом (т.е. с интактным антителом, из которого они были получены) за связывание антигена (т.е. специфичное связывание). Здесь термин "фрагмент" молекулы антитела включает антигенсвязывающие фрагменты антител, например легкую цепь антитела (VL), тяжелую цепь антитела (VH), одноцепочечное антитело (scFv), фрагмент F(ab')2, фрагмент Fab, фрагмент Fd, фрагмент Fv, однодоменный фрагмент антитела (DAb). Фрагменты можно получить, например, химической или ферментативной обработкой интактного или полного антитела или его цепи, а также рекомбинантными способами. 2 - 24 - 015992 Термин "сайт связывания" здесь означает область полипептида, ответственную за селективное связывание с интересующей молекулой мишени (например, с антигеном, лигандом, рецептором, субстратом или ингибитором). Домены связывания содержат по меньшей мере один сайт связывания мишени. Примеры доменов связывания включают вариабельный домен антитела, рецепторсвязывающий домен лиганда, лигандсвязывающий домен рецептора или ферментативный домен. Связывающие молекулы изобретения могут быть изготовлены способами, известными в уровне техники. В соответствии с одним вариантом осуществления полипептиды изобретения "производят рекомбинантно", т.е. с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Примеры технологий получения таких молекул подробнее рассматриваются ниже. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению представляет собой природное антитело, с которым сплавляется стабилизированная молекула scFv. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению представляет собой модифицированное антитело, с которым сплавляется стабилизированная молекула scFv. Термин "модифицированное антитело" включает здесь синтетические формы антител, измененные таким способом, которого нет в природе. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению представляет собой химерный белок, включающий по меньшей мере одну молекулу scFv. В соответствии с предпочтительными аспектами полипептид изобретения не индуцирует вредных иммунных ответов у людей. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает константную область, например константную область тяжелой цепи. В соответствии с одним вариантом осуществления такая константная область модифицирована по сравнению с константной областью дикого типа. Это означает, что описанные здесь полипептиды изобретения могут содержать изменения или модификации в одной или более из трех тяжелых цепей константных областей доменов (CH1, CH3 или CH3) и/или в легких цепях константных областей доменов (CL). Примеры модификаций включают замены, делеции или вставки одной или более аминокислот в одном или более доменах. Такие изменения можно включать для оптимизации эффекторной функции, времени полужизни и т.д. Термин "злокачественность" означает здесь недоброкачественную опухоль или рак. Термин "рак" включает злокачественность, характеризующуюся нарушением регуляции или неконтролируемым клеточным ростом. Примеры рака включают карциномы, саркомы, лейкемии и лимфомы. Термин "рак" включает первичные злокачественные опухоли (например, в которых клетки еще не успели мигрировать от первоначальной опухоли к другим местам организма) и вторичные злокачественные опухоли (например, возникшие из метастаз, в результате миграции опухолевых клеток от первоначальной опухоли к другим участкам организма). Термин "сконструированный" означает результат манипулирования нуклеотидными или полипептидными молекулами синтетическими средствами (например, рекомбинантными технологиями, синтезом пептидов in vitro, ферментативным или химических сопряжением пептидов или комбинацией описанных способов). Предпочтительно, если связывающие молекулы изобретения приготовлены с помощью таких способов. Термины "связанный", "слитый" или "сплавленный" используются здесь попеременно, заменяя друг друга. Они означают соединение двух элементов или компонентов любыми средствами, включая химическое конъюгирование или рекомбинантные средства. Предпочтительно, если полипептиды гибридизованы генетически, т.е. с использованием рекомбинантных технологий ДНК. "Гибридизация в рамке" означает объединение двух или более открытых рамок считывания (OPC, open reading frames (ORF)) с образованием сплошной более длинной ОРС способом, сохраняющим корректную рамку считывания первоначального ОРС. Так, полученный химерный белок представляет собой один белок, включающий два или более сегментов, соответствующих полипептидам, кодируемым первоначальной ОРС (эти сегменты, обычно, таким способом в природе не соединяются). Хотя рамка считывания при этом будет сплошной на протяжении гибридизованных сегментов, сами сегменты могут быть физически или пространственно разделены, например, линкерной последовательностью scFv в рамке. В контексте полипептидов "линейная последовательность" или "последовательность" представляют собой порядок аминокислот в полипептиде в направлении к амино- или С-концу, причем соседние остатки в этой последовательности в первичной структуре белка следуют подряд друг за другом. Фраза "субъект, для которого лечение связывающей молекулой по изобретению может оказаться эффективным" включает субъекты, например млекопитающих, которые получают пользу от введения связывающей молекулы, используемой, например, для детекции антигена, распознаваемого связывающей молекулой (например, в диагностической процедуре), и/или от лечения связывающей молекулой для уменьшения или уничтожения мишени, распознаваемой связывающей молекулой. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления субъект может получить пользу от уменьшения количества или элиминирования растворимых или нерастворимых молекул из крови или сыворотки (например, выведение оттуда токсина или патогена) или от уменьшения количества или элиминирования популяции клеток, экспрессирующих мишень (например, опухолевых клеток). Как более подробно описано ниже, связывающая молекула может использоваться в неконъюгированной форме или быть конъюгированной, - 25 - 015992 например, с детектируемой группой, лекарством, пролекарством или изотопом. Термин "TNF-рецептор" или "член семейства TNF-рецепторов" относится к любому рецептору, принадлежащему надсемейству рецепторов фактора некроза опухолей (Tumor Necrosis Factor ("TNF")). Члены надсемейства TNF-рецепторов (Members of the TNF Receptor Superfamily ("TNFRSF")) характеризуются внеклеточным участком, включающим два или более обогащенных цистеином домена (длиной около 40 аминокислот каждый), собранных в виде цистеиновых клубков (см. Dempsey et al., Cytokine Growth Factor Rev. (2003). 14(3-4): 193-209). После связывания с родственными TNF-лигандами, рецепторы TNF трансдуцируют сигналы, прямо или косвенно взаимодействуя с цитоплазматическими адапторными белками, называемыми TRAF (TNF receptor associate factors, факторы, ассоциированные с рецепторами TNF). TRAF могут индуцировать активацию нескольких киназных каскадов, которые окончательно ведут к активации путей трансдукции сигнала, таких как NF-KappaB, JNK, ERK, р38 и PI3K, которые, в свою очередь, регулируют клеточные процессы, от иммунной функции и дифференциации тканей до апоптоза. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности нескольких членов семейства рецепторов TNF известны в уровне техники и содержат по меньшей мере 29 генов человека: TNFRSF1A (TNFR1, известный также как DR1, CD120a, TNF-R-I p55, TNF-R, TNFRI, TNFAR, TNF-R55, p55TNFR, p55R или TNFR60, GenBank Gl № 4507575; см. также US 5395760), TNFRSF1B (CD120b, известный также как р75, TNF-R, TNF-R-II, TNFR80, TNFR2, TNF-R75, TNFBR или p75TNFR; GenBank GI № 4507577), TNFRSF3 (Lymphotoxin Бета Receptor (LTβR), известные также как TNFR2-RP, CD18, TNFR-RP, TNFCR, а также TNF-R-III; GI № 4505038 и 20072212), TNFRSF4 (OX40, известный также как АСТ35, TXGP1L, или CD134 антиген; GI № 4507579 и 8926702), TNFRSF5 (CD40, известный также как р50 или Вр50; GI № 4507581 и 23312371), TNFRSF6 (FAS, известный также как FAS-R, DcR-2, DR2, CD95, АРО-1 или АРТ1; GenBank GI № 4507583, 23510421, 23510423, 23510425, 23510427, 23510429, 23510431 и 23510434), TNFRSF6B (DcR3, DR3; GenBank GI № 4507569, 23200021, 23200023, 23200025, 23200027, 23200029, 23200031, 23200033, 23200035, 23200037 и 23200039), TNFRSF7 (CD27, известный также как Тр55 или S152; GenBank GI № 4507587), TNFRSF8 (CD30, известный также как Ki-1, или D1S166E; GenBank GI № 4507589 и 23510437), TNFRSF9 (4-1-ВВ, известный также как CD137 или ILA; GI № 5730095 и 728738), TNFRSF10A (TRAIL-R1, известный также как DR4 или Аро2; GenBank GI № 21361086), TNFRSF10B (TRAIL-R2, известный также как DR5, KILLER, TRICK2A или TRICKB; GenBank GI № 22547116 и 22547119), TNFRSF10C (TRAIL-R3, известный также как DcR1, LIT или TRID; GenBank GI № 22547121), TNFRSF10D (TRAIL-R4, известный также как DcR2 или TRUNDD), TNFRSF11А (RANK; GenBank GI № 4507565; см. патенты США № 6562948; 6537763; 6528482; 6479635; 6271349; 6017729), TNFRSF11B (остеопротегерин (OPG), известный также как OCIF или TR1; GI № 38530116, 22547122 и 33878056), TNFRSF12 (Translocating chain-Association Membrane Protein (TRAMP), известный также как DR3, WSL-1, LARD, WSL-LR, DDR3, TR3, APO-3, Fn14, or TWEAKR; GenBank GI № 7706186; US Patent Application Publication № 2004/0033225A1), TNFRSF12L (DR3L), TNFRSF13B (TACI; Gl № 6912694), TNFRSF13C (BAFFR; GI № 16445027), TNFRSF14 (медиатор вируса герпеса, Herpes Virus Entry Mediator (HVEM), известный также как ATAR, TR2, LIGHTR или HVEA; GenBank GI № 23200041, 12803895 и 3878821), TNFRSF16 (Low-Affinity Nerve Growth Factor Receptor (LNGFR), рецептор фактора роста нервов низкого сродства, известный также как Neurotrophin Receptor или p75(NTR); GenBank GI № 128156 и 4505393), TNFRSF17 (ВСМ, известный также как ВСМА; GI № 23238192), TNFRSF18 (AITR, известный также как GITR; GenBank GI № 4759246, 23238194 и 23238197), TNFRSF19 (Troy/Trade, известный также как TAJ; GenBank GI № 23238202 и 23238204), TNFRSF20 (RELT, известный также как FLJ14993; GI № 21361873 и 23238200), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (SOBa, известный также как Tnfrh2 или 2810028K06Rik), а также TNFRSF23 (mSOB, известный также как Tnfrh1). Другие члены семейства TNF-рецепторов включают EDAR1 (рецептор эктодисплазина А, известный также как Downless (DL), ED3, ED5, ED1R, EDA3, EDA1R, EDA-A1R; GenBank GI № 11641231; патент США № 6355782), XEDAR (известный также как EDA-A2R; GenBank GI № 11140823) и CD39 (GI № 2135580 и 765256). Термин "TNF-лиганд" или "член семейства TNF-лигандов" означает лиганд, принадлежащий к надсемейству фактора некроза опухолей (TNF). TNF-лиганды связываются с отдельными рецепторами надсемейства TNF-рецепторов и обладают 15-25% гомологией друг с другом (Gaur et al., Biochem. Pharmacol. (2003), 66(8): 1403-8). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности некоторых лигандов надсемейства TNF-рецепторов ("TNFSF") хорошо известны в уровне техники и включают по меньшей мере 16 человеческих генов: TNFSF1 (также известный как лимфотоксин-α (LTA), TNFβ или LT, GI № 34444 и 6806893), TNFSF2 (также известный как TNF, TNFα или DIF; GI № 25952111), TNFSF3 (также известный как лимфотоксин-β (LTB), TNFC или р33), TNFSF4 (также известный как OX-40L, gp34, CD134L, или такс-транскрипционно активируемый гликобелок 1,34 kD (TXGP1); GI № 4507603), TNFSF5 (также известный как CD40LG, IMD3, HIGM1, CD40L, hCD40L, TRAP, CD154 или gp39; GI № 4557433), TNFSF6 (также известный как FasL или APT1LG1; GenBank GI № 4557329), TNFSF7 (также известный как CD70, CD27L или CD27LG; GI № 4507605), TNFSF8 (также известный как CD30LG, CD30L или CD153; GI № 4507607), TNFSF9 (также известный как 4-1BB-L или ILA лиганд; GI - 26 - 015992 № 4507609), TNFSF10 (также известный как TRAIL, Apo-2L или TL2; GI № 4507593), TNFSF11 (также известный как TRANCE, RANKL, OPGL или ODF; GI № 4507595 и 14790152), TNFSF12 (также известный как Fn14L, TWEAK, DR3LG или APO3L; GI № 4507597 и 23510441), TNFSF13 (также известный как APRIL), TNFSF14 (также известный как LIGHT, LTg или HVEM-L; Gl № 25952144 и 25952147), TNFSF15 (также известный как TL1 или VEGI) или TNFSF16 (также известный как AITRL, TL6, hGITRL или GITRL; GI № 4827034). Другие члены семейства TNF-лигандов включают EDAR1 и XEDAR лиганд (ED1; GI № 4503449; Monreal et al. (1998), Am J. Hum Genet. 63:380), Troy/Trade лиганд, BAFF (также известный как TALL1; GI № 5730097) и NGF-лиганды (например, NGF-β (GI № 4505391), NGF-2/NTF3; GI № 4505469), NTF5 (GI № 5453808), BDNF (GI № 25306267, 25306235, 25306253, 25306257, 25306261, 25306264; IFRD1 (GI № 4504607)). Термин "ТМ", называемый также "температура перехода", обозначает температуру, при которой 50% макромолекулы, например связывающей молекулы, становится денатурированной, и считается стандартным параметром при описании термической стабильности белка. Термин "поддерживающий остаток" ("каркасный остаток") означает аминокислотные остатки или их положения, не входящие в состав области контакта (например, области контакта VH/VL), но важные в его обеспечении. Эти аминокислотные остатки не взаимодействуют с остатками области контакта соответствующего домена физически и не присутствуют на поверхности области контакта, но тем не менее они важны для создания правильного структурного контекста остатков области контакта. Например, такие аминокислотные остатки поддерживают взаимодействие между VH и VL. Если два или более аминокислотных положения в последовательности полипептида-кандидата обычно появляются совместно, то говорят, что они коварьируют ("коварьирующие положения остатков" или "ковариантные положения остатков"). Ковариация между двумя или более положениями аминокислотных остатков наблюдается, когда тип аминокислоты в первом положении зависит от типа аминокислоты, расположенной во втором положении. Это означает, что, если одна указанная аминокислота располагается в первом положении последовательности, во втором положении обычно будет располагаться вторая конкретная аминокислота. Термин "укладка Ig" включает домен белка, принадлежащего к иммуноглобулиновому надсемейству. Как хорошо известно, укладка Ig является отличительным признаком этого надсемейства (см., например, Bork, P., Holm, L & Sander, С. 1994. The Immunoglobulin Fold. J. Mol. Biol. 242, 309-320). Соответствующие структуры для каждого класса укладки Ig приведены на фиг. 100. II. Стабилизированные молекулы scFvs. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению представляет собой стабилизированную молекулу scFv. Стабилизированная молекула scFvs изобретения может содержать scFv линкер между доменами VH и VL, где домены VH и VL связаны дисульфидной связью между аминокислотой домена VH и аминокислотой домена VL. В соответствии с другими аспектами стабилизированная молекула scFvs изобретения включает scFv линкер оптимизированной длины и состава. В соответствии с еще одними аспектами стабилизированная молекула scFvs изобретения включает VH или VL домен, включающие по меньшей мере одну стабилизирующую аминокислотную замену (замены). В соответствии с еще одним вариантом осуществления стабилизированная молекула scFv изобретения включает по меньшей мере две указанные стабилизирующие характеристики. Стабилизированные молекулы scFv изобретения обладают улучшеной стабильностью. В соответствии с одним вариантом осуществления популяции стабилизированных молекул scFv изобретения или включающих их полипептидов экспрессируются как мономерные, растворимые белки, не более 10% которых находится в димерной, тетрамерной или агрегированной другим способом форме. В соответствии с другим вариантом осуществления популяции стабилизированных молекул scFv изобретения содержат VH и VL домены с ТМ более 55°С. В соответствии с другим вариантом осуществления популяции стабилизированных молекул scFv изобретения характеризуются Т50 больше 49°С. В соответствии с другим вариантом осуществления популяции стабилизированных молекул scFv изобретения характеризуются Т50 больше 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 или 48°С. В соответствии с еще одним вариантом осуществления популяции стабилизированных молекул scFv изобретения характеризуются Т50 больше 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 или 49°С. Молекула scFvs изобретения связывается с интересующей мишенью. Домены VH и VL, из которых получают scFv, могут быть производными от одних и тех же или различных антител. В соответствии с другим вариантом осуществления VH или VL для использования в стабилизированных scFv изобретения могут содержать одну или более областей CDR, связывающихся с интересующей мишенью, а другие домены VH или VL могут быть производными от других антител или быть синтетическими. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один CDR антитела, о котором известно, что оно связывается с интересующей мишенью. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере два CDR данного антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере три CDR данного антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по мень- 27 - 015992 шей мере четыре CDR данного антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере пять CDR данного антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере шесть CDR данного антитела. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один VH домен антитела, о котором известно, что оно связывается с интересующей мишенью. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один VL домен данного антитела. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один VH домен и один VL домен антитела, о котором известно, что оно связывается с интересующей мишенью. Молекулу scFv можно сконструировать в ориентации VH-линкер-VL или VL-линкер-VH. Стабильность молекул scFv изобретения или включающих их химерных белков можно оценить с точки зрения биофизических свойств (например, термической стабильности) обычной (нестабилизированной) молекулы scFv или связывающей молекулы, включающей обычную молекулу scFv. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула изобретения характеризуется термической стабильностью, большей приблизительно на 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10°С, чем контрольная связывающая молекула (например, обычная молекула scFv). Стабилизированная молекула scFvs изобретения включает и такие молекулы, которые были идентифицированы с помощью способа изобретения и описаны здесь в разделе III. В соответствии с другими аспектами стабилизированная молекула scFv изобретения включает scFv линкер с оптимизированной длиной и/или аминокислотным составом. Предпочтительные scFv линкеры изобретения улучшают термическую стабильность связывающей молекулы изобретения по меньшей мере приблизительно на 2 или 3° по сравнению с обычной связывающей молекулой. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению характеризуется улучшенной на 1°С термической стабильностью по сравнению с обычной связывающей молекулой. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению характеризуется улучшенной на 2°С термической стабильностью по сравнению с обычной связывающей молекулой. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению характеризуется улучшенной на 4, 5, 6°С термической стабильностью по сравнению с обычной связывающей молекулой. Сравнения можно проводить, например, между молекулой scFv изобретения и молекулами scFv, приготовленными с помощью описанных здесь способов из уровня техники, а также между фрагментами молекул scFvs и fab антитела, из которого были получены scFv VH и VL. Термическую стабильность можно измерить известными в уровне техники способами. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления можно измерить ТМ. Способы измерения ТМ и другие способы определения стабильности белков подробнее будут описаны ниже. В соответствии с одним вариантом осуществления scFv линкер состоит из аминокислотной последовательности (Gly4Ser)4 или включает эту последовательность. Другие примеры линкеров включают или состоят из последовательностей (Gly4Ser)3 и (Gly4Ser)5. Длина scFv линкеров изобретения может быть различной. В соответствии с одним вариантом осуществления длина scFv линкера изобретения составляет приблизительно от 5 до 50 аминокислот. В соответствии с другим вариантом осуществления длина scFv линкера изобретения составляет приблизительно от 10 до 40 аминокислот. В соответствии с другим вариантом осуществления длина scFv линкера изобретения составляет приблизительно от 15 до 30 аминокислот. В соответствии с другим вариантом осуществления длина scFv линкера изобретения составляет приблизительно от 17 до 28 аминокислот. В соответствии с другим вариантом осуществления длина scFv линкера изобретения составляет приблизительно от 19 до 26 аминокислот. В соответствии с другим вариантом осуществления длина scFv линкера изобретения составляет приблизительно от 21 до 24 аминокислот. scFv линкеры можно включать в полипептидные последовательности известными способами. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления можно использовать ПЦР мутагенез. Сделанные модификации подтвержают анализом последовательности ДНК. Плазмидная ДНК может использоваться для трансформации клеток-хозяев, обеспечивающей стабильную продукцию получаемых полипептидов. В соответствии с некоторыми аспектами стабилизированные молекулы scFv изобретения содержат по меньшей мере одну дисульфидную связь (мостик), соединяющую аминокислоту домена VL и аминокислоту домена VH. Для обеспечения дисульфидной связи необходимо наличие остатков цистеина. Дисульфидные связи могут быть включены в молекулу scFv изобретения, например, чтобы соединить FR4 из VL и FR2 из VH или FR2 из VL и FR4 из VH. Примеры положений для дисульфидной связи включают 43, 44, 45, 46, 47, 103, 104, 105 и 106 из VH и 42, 43, 44, 45, 46, 98, 99, 100 и 101 из VL в соответствии с нумерацией Кэбата. Примеры комбинаций аминокислотных положений, мутировавших на цистеиновые остатки, включают VH44-VL100, VH105-VL43, VH105-VL42, VH44-VL101, VH106-VL43, VH104-VL43, VH44VL99, VH45-VL98, VH46-VL98, VH103-VL43, VH103-VL44 и VH103-VL45. В соответствии с одним вариантом осуществления дисульфидная связь соединяет VH аминокислоту - 28 - 015992 44 и VL аминокислоту 100. Модификации в генах, которые кодируют домены VH и VL, можно сделать, используя технологии, известные в уровне техники, например сайт-направленный мутагенез. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная молекула scFv изобретения включает scFv линкер с аминокислотной последовательностью (Gly4Ser)4 между доменами VH и VL, где эти домены связаны дисульфидным мостиком между аминокислотой в положении 44 VH и аминокислотой в положении 100 VL. В соответствии с другими аспектами стабилизированные молекулы scFv изобретения содержат одну или более стабилизирующих мутаций в вариабельном домене (VH или VL) scFv. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизирующая мутация выбрана из следующей группы: а) замена аминокислоты (например, глутамина) в положении Кэбата 3 VL, например, на аланин, серин, валин, аспарагиновую кислоту или глицин; б) замена аминокислоты (например, серина) в положении Кэбата 46 VL, например, на лейцин; в) замена аминокислоты (например, серина) в положении Кэбата 49 VL, например, на тирозин или серин; г) замена аминокислоты (например, серина или валина) в положении Кэбата 50 VL, например, на серин, треонин, аргинин, аспарагиновую кислоту или лизин; д) замена аминокислоты (например, серина) в положении Кэбата 49 и (например, серина) в положении Кэбата 50 VL соответственно на тирозин и серин, тирозин и треонин, тирозин и аргинин, тирозин и глицин, серин и аргинин или серин и лизин; е) замена аминокислоты (например, валина) в положении Кэбата 75 VL, например, на изолейцин; ж) замена аминокислоты (например, пролина) в положении Кэбата 80 VL, например, на серин или глицин; з) замена аминокислоты (например, фенилаланина) в положении Кэбата 83 VL, например, на серин, аланин, глицин или треонин; и) замена аминокислоты (например, глутаминовой кислоты) в положении Кэбата 6 VH, например, на глутамин; к) замена аминокислоты (например, лизина) в положении Кэбата 13 VH, например, на глутамат; л) замена аминокислоты (например, серина) в положении Кэбата 16VH, например, на глутамат или глутамин; м) замена аминокислоты (например, валина) в положении Кэбата 20 VH, например, на изолейцин; н) замена аминокислоты (например, аспарагина) в положении Кэбата 32 VH, например, на серин; о) замена аминокислоты (например, глутамина) в положении Кэбата 43 VH, например, на лизин или аргинин; п) замена аминокислоты (например, метионина) в положении Кэбата 48 VH, например, на изолейцин или глицин; р) замена аминокислоты (например, серина) в положении Кэбата 49 VH, например, на глицин или аланин; с) замена аминокислоты (например, валина) в положении Кэбата 55 VH, например, на глицин; т) замена аминокислоты (например, валина) в положении Кэбата 67 VH, например, на изолейцин или лейцин; и) замена аминокислоты (например, глутаминовой кислоты) в положении Кэбата 72 VH, например, на аспартат или аспарагин; ф) замена аминокислоты (например, фенилаланина) в положении Кэбата 79 VH, например, на серин, валин или тирозин; а также х) замена аминокислоты (например, пролина) в положении Кэбата 101 VH, например, на аспарагиновую кислоту. В соответствии с одним из аспектов стабилизированная молекула scFv изобретения включает две или более стабилизирующих мутаций, описанных в пунктах а)-х) выше. В соответствии с одним из аспектов стабилизированная молекула scFv изобретения включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 49 VL, например, на тирозин или серин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 50 VL, например, на треонин, аргинин, аспарагиновую кислоту или лизин. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированная молекула scFv изобретения включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 VH, например, на глутамат и глутамин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 VL, например, на лизин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 VH, например, на глутамат или глутамин; замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 VL, например, на лизин и замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 VH, например, на глицин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 VH, например, на глутамат или глутамин; замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 46 VL, например, на лизин; замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 VH, например, на глицин и замену аминокислотного - 29 - 015992 остатка в положении Кэбата 101 VH, например, на аспарагиновую кислоту. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 6 VH, например, на глутамин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 13 VH, например, на глутамат. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 16 VH, например, на глутамат или глутамин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 20 VH, например, на изолейцин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 32 VH, например, на серин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 43 VH, например, на лизин или аргинин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 48 VH, например, на изолейцин или глицин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 49 VH, например, на глицин или аланин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 55 VH, например, на глицин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 67 VH, например, на изолейцин или лейцин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 72 VH, например, на аспартат или аспарагин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 79 VH, например, на серин, валин или тирозин. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает замену аминокислотного остатка в положении Кэбата 101 VH, например, на аспарагиновую кислоту. В соответствии с другим примером реализации изобретения стабилизированная молекула scFv изобретения включает одну или более описанных здесь замен стабилизирующих аминокислот и линкер scFv оптимизированной длины и состава (например, (Gly4Ser)4). В соответствии с другим примером реализации стабилизированная молекула scFv изобретения включает одну или более описанных здесь замен стабилизирующих аминокислот и дисульфидную связь, соединяющую аминокислоту из домена VL и аминокислоту из домена VH (например, VH44-VL100). В соответствии с другим примером реализации стабилизированная молекула scFv изобретения включает одну или более описанных здесь замен стабилизирующих аминокислот, линкер scFv оптимизированной длины и состава (например, (Gly4Ser)4), а также дисульфидную связь, соединяющую аминокислоту из домена VL и аминокислоту из домена VH (например, VH44-VL100). Стабилизированные молекулы scFv можно экспрессировать с помощью известных в уровне техники способов. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления такие молекулы можно экспрессировать с использованием вектора экспрессии, пригодного для экспрессии в клеточной системе экспрессии, например в системе экспрессии бактерий или млекопитающих. В соответствии с одним вариантом осуществления молекулу scFv можно экспрессировать в Е.coli, например, с использованием вектора, подходящего для периплазмической экспрессии. Для оптимизации экспрессии можно включить дополнительные последовательности, например сигнальную последовательность и/или метку (тэг), облегчающую очистку и/или детекцию scFv. В соответствии с одним вариантом осуществления для облегчения секреции из периплазмы в среду в систему можно вводить добавки, такие как 1-2% тритон (например, Тритон х-100) или 1-2% глицин и их комбинации (например, 1% глицин и 1% тритон). III. Способы прогнозирования/определения стабильности белков. В соответствии с определенными аспектами изобретение относится к способам прогнозирования a priori, потенциальных биофизических проблем с белками, выбранными для крупномасштабной экспрессии, например терапевтическими белками и промышленными ферментами. В соответствии с некоторыми примерами аспектов способы изобретения позволяют специалисту избежать экспрессии последовательностей белков, характеризующихся согласно прогнозу низкой стабильностью при рекомбинантной экспрессии, например, в клетках млекопитающих. В соответствии с альтернативными аспектами способы изобретения можно использовать для идентификации варианта последовательности, обладающего согласно прогнозу улучшенными биофизическими свойствами, включая, но не ограничиваясь, улучшенную стабильность, в том числе, и при изменении рН, а также улучшенной биохимической функцией. В соответствии с некоторыми аспектами изобретение относится к вычислительным способам прогнозирования биофизического свойства (например, термической стабильности) белка-кандидата или варианта последовательности или его гомолога на основании полипептидной последовательности (например, аминокислотной последовательности) белка-кандидата. В соответствии с другими аспектами спосо- 30 - 015992 бы изобретения используют способы структурного моделирования для прогнозирования стабильности белка-кандидата или для идентификации его гомологов или вариантов с известной, например, стабильностью, которые могут использоваться для улучшения стабильности белка-кандидата, например молекулы scFv. а. Анализ ковариаций. В соответствии с некоторыми иллюстративными аспектами изобретение относится к улучшенному вычислительному способу, называемому "анализом ковариаций" ("ковариационным анализом") прогнозирования биофизического свойства (например, стабильности белка). Термин "анализ ковариаций" здесь означает вычислительный способ идентификации двух или более позиций аминокислотных остатков в последовательности белка-кандидата, которые обычно присутствуют совместно и коварьируют у гомологов кандидата (здесь "коварьирующие положения остатков" или "ковариантные положения остатков"). Ковариация между двумя или более аминокислотными положениями наблюдается, если тип аминокислоты в первом положении зависит от типа аминокислоты во втором положении. Это означает, что, когда одна конкретная аминокислота находится в первом положении последовательности, вторая конкретная аминокислота обычно присутствует во втором ее положении. Так как такие коварьирующие остатки, скорее всего, эволюционировали совместно, наличие ковариации показывает, что совместимость аминокислотных остатков в коварьирующих положениях, вероятно, важна по функциональным или структурным причинам. Соответственно ковариационный способ изобретения можно использовать для идентификации одного или более коварьирующих остатков или групп остатков (например, коварьирующих пар остатков) в полипептидной последовательности (например, последовательности белка-кандидата). Здесь термин "коварьирующий остаток" (называемый также связанным остатком) означает аминокислоту, статистически превалирующую в положении коварьирующего остатка в полипептидной последовательности. В соответствии с некоторыми аспектами ковариационные способы изобретения можно использовать для идентификации функциональных остатков последовательности-кандидата. Более того, поскольку количество коварьирующих остатков в полипептиде-кандидате позволяет спрогнозировать его стабильность, ковариационный способ изобретения можно использовать для прогнозирования стабильности белка-кандидата. В соответствии с другими аспектами ковариационные способы изобретения можно использовать для руководства успешным дизайном белков. В соответствии с одним демонстративным вариантом осуществления ковариационный способ изобретения позволяет идентифицировать коварьирующие аминокислоты в последовательности-кандидате. В настоящее время коварьирующие остатки предпочтительно сохраняют в ходе последующего конструирования последовательности белка. В соответствии с другим демонстративным вариантом осуществления ковариационные способы изобретения можно использовать для идентификации аминокислотных позиций нековарьирующих остатков в последовательности белкакандидата, где соответствующие аминокислоты у других белков (например, белков, соответствующих последовательностям набора сравнения) обычно представляют собой коварьирующие аминокислоты. После их обнаружения нековарьирующие остатки можно заменить (например, способами рекомбинантной ДНК) на соответствующие коварьирующие остатки, чтобы усилить функцию или улучшить биофизические свойства (например, стабильность) последовательности белка-кандидата. Положения коварьирующих остатков можно идентифицировать статистическим анализом (например, корреляционным анализом) положений остатков в базе данных родственных полипептидных последовательностей (например, выровненного набора сравнения или результата выравнивания нескольких последовательностей). В соответствии с предпочтительными аспектами ковариационный анализ вовлекает статистическое сравнение полипептидных последовательностей-кандидатов с базой данных различных полипептидных последовательностей (с различной структурой), обладающих одной структурной укладкой (например, укладкой Ig). В соответствии с новым описанным здесь способом ковариационного анализа для прогнозирования стабильности полипептида-кандидата необходимо предпринять следующие действия. 1. Получить набор гомологичных последовательностей (здесь "набор сравнения"), соответствующих последовательности полипептида-кандитата или домена полипептида или фрагмента домена (здесь исследуемая последовательность домена). 2. Выровнять последовательности набора сравнения с генерацией выровненного набора гомологичных последовательностей (здесь выровненный набор). 3. Определить ковариацию между двумя или более положениями остатков (например, по меньшей мере между одной парой аминокислотных остатков) с набором сравнения для генерации данных ковариации или набора данных ковариации ("база данных ковариации"). 4. Воспользоваться данными ковариации для прогнозирования стабильности белка-кандидата. Этап 1. Получение набора сравнения. В способах ковариации изобретения используется набор последовательностей ("набор сравнения"), гомологичных (т.е. родственных) интересующей последовательности, или "исследуемой последователь- 31 - 015992 ности". Набор сравнения может содержать набор гомологичных последовательностей с умеренной или высокой степенью сходства с исследуемой последовательностью. В соответствии с некоторыми аспектами гомологичные последовательности набора сравнения характеризуются умеренной или высокой степенью сходства аминокислотных последовательностей (последовательное сходство). В соответствии с более предпочтительными аспектами гомологичные последовательности набора сравнения характеризуются умеренной или высокой степенью структурного сходства. В соответствии с еще более предпочтительными аспектами гомологичные последовательности набора сравнения характеризуются высокой степенью структурного сходства (например, в них присутствует одинаковый домен или укладка белка). Не требуется, чтобы набор гомологичных последовательностей был большим, главное, чтобы можно было получить разумно беспристрастный выбор. В примерах реализации изобретения ковариационный способ изобретения использует исправленный набор сравнения. Термин "исправленный набор сравнения" здесь означает набор сравнения, в котором были удалены последовательности некоторых компонентов или добавлены новые последовательности в соответствии с определенными критериями выбора. Соответственно, если неисправленный набор последовательностей был сгенерирован на основании беспристрастного, объективного выбора компонентов, исправленный набор получают пристрастным выбором. Например, можно провести "выбраковку" в наборе сравнения гомологичных последовательностей, чтобы устранить некоторые из них, например гомологичные последовательности. Альтернативно, исправленный набор можно расширить, например, включив подходящее количество не избыточных или не идентичных последовательностей. В соответствии с определенными аспектами исправленная база данных включает по меньшей мере сотню последовательностей (например, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750 или больше последовательностей). В соответствии с одним вариантом осуществления исправленная база данных включает по меньшей мере тысячу последовательностей (например, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 или больше последовательностей). В соответствии с другим вариантом осуществления исправленная база данных включает по меньшей мере десять тысяч последовательностей (например, 10000, 20000, 50000, 100000, 250000, 500000, 750000 или больше последовательностей). В соответствии с одним вариантом осуществления исправленная база данных включает по меньшей мере один миллион индивидуальных последовательностей (например, 1 млн, 2 млн, 5 млн, 10 млн или больше последовательностей). В соответствии с предпочтительными аспектами в ковариационном способе изобретения используется исправленный набор, включающий по меньшей мере 50% разнообразие (например, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или еще большее разнообразие), с целью минимизации количества искусственных или неинформативных ковариаций. Здесь термин "% разнообразия" означает процент последовательностей в наборе сравнения, которые не избыточны или не идентичны. Термин "не избыточный" означает здесь последовательность с менее чем 100% последовательной идентичностью с каждой другой последовательностью набора сравнения, т.е. последовательность, которая отличается по меньшей мере на одно аминокислотное положение от каждой другой последовательности набора сравнения. В соответствии с некоторыми аспектами последовательность из набора сравнения обладает менее чем 99%, менее чем 95%, менее чем 90% или менее чем 85% последовательной идентичностью с каждой другой последовательностью набора сравнения. В соответствии с предпочтительными аспектами последовательность из набора сравнения обладает менее чем 80% последовательной идентичностью с каждой другой последовательностью набора сравнения (например, менее чем 75%, менее чем 70%, менее чем 65%, менее чем 60% или менее чем 50% последовательной идентичностью). В соответствии с особо предпочтительными аспектами каждая последовательность из набора сравнения обладает менее чем 80% последовательной идентичностью с каждой другой последовательностью набора сравнения. В соответствии с примерами реализации изобретения последовательности набора сравнения исправляют для достижения предпочтительного разнообразия с помощью инструментов фильтрования, которые отбраковывают последовательности более общих типов (например, инструмент сортировки Хеникова (Henikoff)). Если длина двух последовательностей одинакова, сортировка по весам Хеникова гарантирует сохранность последовательностей с остатками редких типов и выбраковку последовательностей с более распространенными типами остатков (Henikoff et al., J. Mol. Biol., 243: 574-578 (1994)). В соответствии с предпочтительными аспектами набор сравнения включает последовательности, кодируемые генами, не являющимися эволюционно близкими генам, кодирующим другие последовательности в базе данных. Например, для повышения разнообразия набор сравнения может содержать одну или более ортологичных последовательностей, т.е. последовательностей из других видов (например, из других видов млекопитающих), обладающих такой же или похожей биохимической функцией. В соответствии с одним примером реализации набор сравнения может содержать одну человеческую последовательность и по меньшей мере одну нечеловеческую последовательность (например, нечеловеческую последовательность млекопитающего). В соответствии с другим примером реализации набор срав- 32 - 015992 нения может содержать одну последовательность млекопитающего (например, человека, шимпанзе, собаки, коровы, свиньи, кошки, крысы или мыши) и по меньшей мере одну последовательность не млекопитающего (например, последовательность немлекопитающих позвоночных животных (например, последовательность рыб или птиц), последовательности непозвоночных (например, насекомых (например, дрозофил)) или нематод (например, последовательность С. elegans) или последовательность грибков, растений, бактерий или вирусов). В соответствии с другими аспектами набор сравнения может содержать одну или больше паралогичных последовательностей, т.е. последовательностей из тех же видов, что и первая последовательность, и обладающих такой же или похожей биохимической функцией. В соответствии с другими аспектами длина последовательностей набора сравнения превышает определенное пороговое значение. Предпочтительно, чтобы последовательности набора сравнения были длиной по меньшей мере 20 остатков (например, 25, 30 или 40 остатков). Более предпочтительно, чтобы последовательности набора сравнения были длиной по меньшей мере 50 остатков (например, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 95 остатков). Еще более предпочтительно, чтобы последовательности набора сравнения были длиной по меньшей мере 100 остатков (например, 110,120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 или больше остатков). В соответствии с примерами реализации последовательности набора сравнения исправляют для достижения предпочтительной длины, фильтруя их с использованием инструмента фильтрования (например, счет остатков без пробелов). Ранжирование в сторону уменьшения такого счета гарантирует, что более короткие последовательности (например, с пробелами) будут отфильтрованы быстрее, чем более длинные. Последовательности получают в результате основанного на последовательностях поиска по гомологии в любой из известных баз данных последовательностей, таких как базы данных NCBI или TIGR. В соответствии с примером реализации можно выполнить стандартный поиск BLAST для исследуемой последовательности с параметрами по умолчанию; это поможет получить гомологичные интересующие последовательности. Для включения в набор сравнения можно выбрать последовательности с минимальным процентом идентичности (например, больше 25, 30, 35, 40, 45 или 50% последовательной идентичности, предпочтительно более 30% идентичности) по сравнению с исследуемой последовательностью. В соответствии с предпочтительными аспектами набор сравнения исправляют, включая в него последовательности белков с укладкой того же типа (например, белки с укладкой SH3, TPR, GPCR, типа сериновых протеаз, аспарагиновых протеаз, глобина, иммуноглобулинов и других типов). Такие белки и структуры можно обнаружить и собрать способами биоинформатики, известными в уровне техники (например, в результате структурного поиска в базе данных консервативных доменов (CDD) Национального института здравоохранения (National Institutes of Health) или в базе данных ASTRAL или базе данных белков RCSB (protein database (PDB)) с использованием желаемой классификации SCOP). Предпочтительно выделять последовательности из белков, трехмерная структура которых была разрешена с высоким разрешением, например способами рентгеновской кристаллографии. В соответствии с предпочтительными аспектами последовательности, соответствующие выбранным структурам, выделяются известными в уровне техники способами, чтобы удалить ошибочно категоризированные, неполные, избыточные структуры и структуры с заменой доменов. В соответствии с одним вариантом осуществления структуры проверяют визуально (например, с использованием программы SwissPDB Viewer) на предмет поиска разрывов в соответствующих последовательностях из-за неразрешенных плотностей и замены доменов. Файлы PDB с неверными структурами вручную удаляют из соответствующего набора структур. В соответствии с другим вариантом осуществления последовательности (например, последовательности FASTA), соответствующие собранным структурам, фильтруют, чтобы удалить все последовательности, идентичные на 100%, а также правильно соотнести подстроки оставшихся последовательностей. В соответствии с другими аспектами структуры PDB с ошибочно длинными или короткими аминокислотными последовательностями (признак ошибочной структурной категоризации) выбраковывают из базы данных структур. Критерий отсева по длине можно определить, например, изучив гистограмму всех длин последовательностей набора сравнения. В соответствии с другими аспектами структуры инспектируются визуально (например, с использованием программы SwissPDB Viewer) на предмет поиска неправильной укладки. Структуры, не соответствующие стандартной топологии укладки белка, предпочтительно удаляются. В соответствии с примерами реализации изобретения исправленный набор сравнения включает последовательности, соответствующие укладке типа иммуноглобулина ("укладка Ig"), и описывающие белки, принадлежащие иммуноглобулиновому надсемейству белков. Как хорошо известно в уровне техники, укладка Ig является отличительной чертой иммуноглобулинового надсемейства (см., например, Bork, P., Holm, L. & Sander, С. 1994. The Immunoglobulin Fold. J. Mol. Biol. 242, 309-320). Укладка Ig часто представлена у белков млекопитающих и служит платформой для различных функций - в особенности, взаимодействия белок-белок. Например, все иммуноглобулины и большая часть иммуноглобулиновых рецепторов состоят из нескольких доменов с укладкой Ig. Эту укладку можно подразделить на несколько подсемейств, включая С1, С2, I и V. Хотя члены всех подсемейств характеризуются топологией типа "греческий ключ" (greek-key), включающей два β-листа, они различаются по количеству β-нитей в каждом листе и по способу соединения листов (см., например, A.F. Williams, Immunology Today, 8 (1987)). - 33 - 015992 Репрезентативные структуры каждого класса Ig-укладки отображены на фиг. 100. В соответствии с одним вариантом осуществления набор сравнения включает последовательность с Ig-укладкой белков недсемейства иммуноглобулинов, выбранных из группы, включающей белок клеточной адгезии, интегрин, аллерген, рецептор Т-клеток, белковый комплекс большой гистосовместимости (например, белок МНС Class I или МНС Class II), иммуноглобулиновый рецептор (например, Fc гамма рецептор (например, FcγRI, FcγRIIa)), а также иммуноглобулин (например, IgG, IgM, IgA или IgE). В соответствии с определенными предпочтительными направлениями реализации изобретения все последовательности набора сравнения соответствуют укладке Ig или ее фрагменту. В соответствии с одним вариантом осуществления укладка Ig представляет собой укладку С1. В соответствии с другим вариантом осуществления укладка Ig представляет собой укладку С2. В соответствии с другим вариантом осуществления укладка Ig представляет собой V-укладку. В соответствии с еще одним вариантом осуществления укладка Ig представляет собой I-укладку. В соответствии с другим вариантом осуществления все последовательности набора сравнения соответствуют укладке С1. В соответствии с другим вариантом осуществления все последовательности набора сравнения соответствуют укладке С2. В соответствии с другим вариантом осуществления все последовательности набора сравнения соответствуют I-укладке. В соответствии с некоторыми предпочтительными аспектами длина последовательностей укладки Ig набора сравнения составляет от 75 до 150 остатков. Этап 2. Выравнивание набора сравнения. На втором этапе последовательности набора сравнения точно выравнивают, чтобы сгенерировать выровненный набор последовательностей (или выравнивание). В соответствии с одним вариантом осуществления последовательности набора сравнения выравнивают с помощью алгоритмов выравнивания последовательностей (например, LALIGN или BLAST и другие известные в уровне техники способы выравнивания, описанные в этой работе) и создают в результате выровненный набор последовательностей (здесь этот способ называют выравниванием, основанным на последовательности). В соответствии с другим вариантом осуществления структуры, соответствующие последовательностям набора сравнения, выравнивают с использованием алгоритма структурного выравнивания (например, алгоритм вторичного структурного выравнивания (Secondary Structure Matching (SSM)) используется в программном пакете Schrodinger structalign фирмы Шредингер) и создают в результате выровненный набор структур (здесь этот способ называют выравниванием, основанным на структурах, или структурным выравниванием). Предпочтительно, чтобы алгоритм структурного выравнивания гарантировал выравнивание центральных областей (например, цепей β-листа) каждой структуры, а не промежуточных петель. В соответствии с еще одним вариантом осуществления последовательности набора сравнения выравнивают структурными способами (например, приводя аминокислоты из одной наложенной структуры аминокислотам другой структуры на основании кратчайшего расстояния между α-углеродными атомами полипептидных каркасных цепей, например, с помощью пакета компании Шредингер). В соответствии с другим вариантом осуществления последовательности набора сравнения выравнивают с использованием алгоритмов, как основанных на последовательности, так и на структуре. Предпочтительно, чтобы соответствующие последовательностям набора сравнения структуры выравнивали сначала с использованием алгоритма структурного выравнивания или другого основанного на структуре инструмента выравнивания, а затем выравнивали соответствующие последовательности алгоритмом, основанным на последовательностях. Более предпочтительно сначала выравнивать структуры, соответствующие последовательностям набора сравнения, а затем выравнивать последовательности с использованием структурных алгоритмов выравнивания. В соответствии с некоторыми дополнительными аспектами выровненный набор последовательностей затем дополнительно исправляется. Например, его можно расширить (например, сортировкой без пробелов или по Хеникову), что повысит его разнообразие (например, позволит получить очень большие наборы гомологичных последовательностей с такой же укладкой). В соответствии с другими аспектами выровненный набор последовательностей можно подвергнуть затем нескольким циклам исправления и, необязательно, дополнительного выравнивания (например, структурного). В соответствии с некоторыми предпочтительными аспектами изобретение относится к способам исправления выровненного набора, включающего относительно малое количество последовательностей, чтобы усилить его разнообразие. С повышением количества последовательностей в выравнивании возрастает мощность ковариационного анализа. В соответствии с одним вариантом осуществления способы могут использовать эвристическую модель или профиль для поиска дополнительных гомологичных последовательностей из большой, общественно доступной базы данных последовательностей (например, базы данных NR, обслуживаемой NCBI). Эвристические модели можно получить с помощью одного или более алгоритмов регрессии, выбранных из числа, например, следующих: регрессия по способу частичных наименьших квадратов, множественная линейная регрессия, регрессия по способу обратных наименьших квадратов, регрессия по способу главных компонентов, переменной важности для проекции и подобные им. В соответствии с другими аспектами эвристическая модель получается с использованием одного или более алгоритмов, основанных на паттерне, выбранных, например, из числа следующих: - 34 - 015992 скрытая модель Маркова (Hidden Markov model), алгоритм Смита-Ватермана, нейронные сети, дерево классификации и регрессии, сплайновая кривая многомерной адаптивной регрессии и подобные им. В соответствии с демонстративным вариантом осуществления алгоритм распознавания паттерна представляет собой скрытую модель Маркова. НММ - статистическая модель, где моделируемая система включает скрытые параметры, которые можно определить с помощью наблюдаемых параметров и использовать для анализа распознавания паттернов. Например, в признанных НММ могут использоваться предсказанные вторичные структуры, позволяющие найти антитела такой же укладки, что и данное антитело, а не просто антитела с чисто последовательным сходством (см., например, Proteins 36(1), 68-76). Примерами основанных на НММ инструментов распознавания паттерном являются MetaFam (Silverstein et al. Nucleic Acids Res 29(1), 49-51 (2001)), Interpro (Apweiler, et al., Nucleic Acids Res, 29(1), 37-40 (2001)) и HMMER (Bateman et al., Nucleic Acids Res 27(1), 260-2 (1999)). В соответствии с некоторыми дополнительными аспектами последовательности, извлеченные с помощью алгоритма НММ, можно валидировать (проверить их допустимость), проверив их правильное выравнивание в структурном классе, использовав при этом признанное программное обеспечение по биоинформатике. Примером инструмента валидации является средство классификации PFAM, разработанное Wellcome Trust Sanger Institute и публично доступное в сети Интернет. Например, инструмент PFAM под названием ''pfamverify'' можно применить к каждой извлеченной последовательности и подтвердить ее корректную классификацию класс-специфическим НММ, созданным на основании структурного выравнивания, основанного на структуре (Finn et al., Nucleic Acids Res, 24 (Database issue), D24751 (2006)). Профили НММ, соответствующие клану PFAM (или родственному семейству белков, например укладке клана Ig), можно выгрузить с web-сайта PFAM, что позволит облегчить определение ранга (scoring) извлеченных последовательностей. Последовательности, чей ранг (счет) не укладывается в рекомендованные границы, предпочтительно удалять из набора сравнения. В соответствии с другими аспектами последовательности, полученные по алгоритму НММ, можно выровнять также с помощью алгоритма НММС. Так как эти алгоритмы НММ основаны на тщательном структурном выравнивании, этот процесс гарантирует структурное выравнивание дополнительных проэкстрагированных последовательностей. Например, с помощью модуля HMMER можно генерировать выравнивание типа ''mapali'' в формате вывода FASTA. В соответствии с предпочтительными аспектами способ изобретения относится к новому алгоритму НММ, который не только позволяет найти последовательности, похожие на выровненный набор, но также и выравнивает новые последовательности, гарантируя правильное выравнивание области ядра. Например, новый алгоритм НММ изобретения позволяет искать отдельные домены (например, укладку Ig доменов) внутри отдельного белка (например, представителя надсемейства иммуноглобулинов), отдельно экстрагировать каждый домен и добавлять его к выровненному набору последовательностей. Алгоритмы и профили НММ можно создавать на основании структурного выравнивания последовательностей (например, с использованием программного модуля HMMER, который публично доступен в сети Интернет, например, на сайте www.psc.edu). Для каждого структурно-специфичного поиска НММ, предпочтительно, последовательности, превышающие пороговое значение выбора, сохраняются в качестве кандидатов в структурный класс, для которого и использовался НММ. В случае отбора участков выбранной последовательности можно экстрагировать точную подпоследовательность, соответствующую критериям отбора. В соответствии с другими примерами аспектов изобретение относится к способам исправления выровненного набора последовательностей, чтобы снизить его избыточность. Например, хотя большое количество последовательностей в структурно выровненном наборе (например, выровненный набор укладок Ig) представляет богатый источник таких последовательностей, некоторые подсемейства (например, некоторые подклассы укладок Ig) могут быть представлены избыточно, а другие в недостаточной степени. Такие пере- или недопредставления приводят к существенному смещению из-за близкого сходства предков и ограничивают общую полезность ковариационного анализа. Соответственно в соответствии с предпочтительными аспектами выравнивание следует подвергнуть дополнительному фильтрованию, чтобы снизить его избыточность. В соответствии с предпочтительными аспектами по меньшей мере одну последовательность с более чем 90% идентичностью с другой последовательностью (например, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 99% или большей идентичностью) удаляют из выравнивания. В соответствии с особенно предпочтительными аспектами из выравнивания удаляют по меньшей мере одну последовательность с более чем 80% идентичностью с другой последовательностью (например, 81, 82, 83, 84, 87, 88, 89 или 90% идентичностью). В соответствии с примером реализации изобретение относится к новому способу снижения избыточности выравнивания. Такие способы включают использование эвристического алгоритма для поиска и ранжирования с требуемым порогом идентичности. При этом используется один или более следующих последовательных действий: (1) расчет процента идентичности всех пар последовательностей в выравнивании; (2) группирование значений идентичности в одну или более групп идентичности; (3) ранжирование последовательностей из каждой группы путем снижения счета беспробельных остатков и/или путем взвешивания последовательностей по Хеникову; и (4) удаление избыточных последовательностей в - 35 - 015992 соответствии с критерием отсечения (например, уровень отсечения по проценту идентичности). Удаление избыточных последовательностей можно осуществить различными способами. В соответствии с одним вариантом осуществления ранжированные последовательностей группируют в несколько групп (бинов) идентичности (например, 99% бин, 98% бин, 97% бин и т.д.). Последовательности затем систематически удаляют на основании их ранга (например, сначала удаляют с наибольшим рангом). Этапы расчета идентичности, группировки и/или ранжирования (этапы (1)-(3)) можно повторить после каждого этапа удаления, пока не будет удален последний бин, соответствующий критериям отсечения. В соответствии с другим вариантом осуществления по критерию отсечения создают один бин ранжированных последовательностей, и последовательности систематически удаляют из этого бина, в соответствии с их рангом. Расчет идентичности и/или этапы ранжирования (этапы (1)-(3)) можно повторить после каждого этапа удаления. В соответствии с предпочтительными аспектами критерий отсечения - это 90% или выше (например, 91, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 99% или больше). В соответствии с особо предпочтительными аспектами критерий отсечения - это 80% или выше (например, 81, 82, 83, 84, 87, 88, 89 или 90% идентичности). В соответствии с другим дополнительным этапом длины последовательностей в выровненном наборе можно уменьшить. В соответствии с одним вариантом осуществления можно удалить пробельные области в выравнивании, чтобы избежать вычислений в этих менее информативных областях. Например, можно удалить столбцы, не соответствующие состояниям профиля НММ. В соответствии с другим вариантом осуществления сокращают последовательности в выравнивании, накладывающиеся в области консенсусной длины выравнивания, при этом удаляют выступающие участки последовательностей. В соответствии с другим вариантом осуществления накладывающиеся последовательности удаляют из выравнивания. Этап 3. Ковариационный анализ выровненного набора. После компиляции набора сравнения к одной или более пар аминокислотных остатков выровненного набора применяют ковариационный анализ. Последний приводит к генерации нового набора данных (здесь "ковариационный набор данных"), описывающего статистическую значимость коррелирующих остатков выравнивания. В соответствии с некоторыми аспектами ковариационный набор данных включает корреляции между всеми возможными парами остатков в выравнивании. В соответствии с предпочтительными аспектами расчет ковариаций представляет собой процесс, реализуемый на компьютере (например, в среде Java). Расчет ковариации может привести к получению нескольких признаваемых в уровне техники статистических параметров. В соответствии с одним вариантом осуществления статистическая значимость (например, значение χ2) ковариации рассчитывается анализом Хи-квадрат. В соответствии с другим вариантом осуществления определяется статистическая длина (например, значение φ) ковариации. Например, отрицательное значение φ может прогнозировать негативную корреляцию. Это означает, что наличие одного аминокислотного остатка в первом положении выравнивания благоприятствует отсутствию другого конкретного аминокислотного остатка во втором положении. Напротив, положительное значение φ может прогнозировать положительную корреляцию, показывая, что аминокислотный остаток в первом положении выравнивания благоприятствует наличию другого конкретного аминокислотного остатка во втором положении. В соответствии с одним вариантом осуществления значение φ рассчитывают по формуле (I) где aibj означает, сколько раз остатки типов а или b присутствуют в одной и той же последовательности в положениях i и j соответственно; означает, сколько раз остатки обоих типов отсутствуют в одной последовательности; означает, сколько раз остаток а присутствует, a b отсутствует; означает, сколько раз остаток а отсутствует, a b присутствует. В соответствии с одним вариантом осуществления значение φ рассчитывают по формуле (II) где параметры с-j представлены в матрице: - 36 - 015992 В соответствии с некоторыми вариантами осуществления значение χ2 можно рассчитать по формуле, основанной на "частоте возникновения". В соответствии с другими аспектами значение χ2 рассчитывается по формуле, основанной на событиях (т.е. количестве случаев). Пример формулы, основанной на событиях, приведен ниже (формула (III)) где p(i) и p(j) - частоты остатков любых двух интересующих типов остатков в положениях i и j соответственно, выровненного набора последовательностей; c(i, j) означает, сколько раз p(i) и p(j) присутствуют в одной последовательности; c(t) - общее число последовательностей в выравнивании; и где частоты остатков определены как количество раз, которое остаток данного типа наблюдался в конкретном положении выравнивания, деленное на общее количество последовательностей в выравнивании. В соответствии с определенными аспектами только остатки аминокислот природного типа считаются при подсчете типа остатков для задач вычисления ковариаций. В соответствии с предпочтительными аспектами, однако, тип остатка может также включать пробел как отдельный тип, так как пробелы (особенно, в положениях в петле) часто позволяют отличить один мотив от другого. В соответствии с определенными аспектами расчет ковариации может включать функцию взвешивания разнообразия (например, по схеме взвешивания Хеникова). В соответствии с другими аспектами для фильтрования коварьирующих пар можно использовать средние идентичности последовательностей (Sequence Average Identities (SAI)). Например, SAI позволяют отделить ковариации от пар с более чем средней идентичностью последовательностей, чтобы устранить потенциальные ковариации-артефакты, возникающие среди близкородственных последовательностей. В аспектах, где выравнивание подвергалось исправлению с высоким порогом идентичности (например, 80% идентичность в качестве критерия отсечения), предпочтительно обходиться без расчета SAI. В соответствии с определенными аспектами сведения о коварьирующих парах не выводятся, если только они не наблюдались минимальное количество раз (здесь "порог события"). В соответствии с одним вариантом осуществления порогом является 10 или более событий. В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления порог события составляет 2 или более, но меньше 10 (например, 9, 8, 7, 6 или 5 событий). Этап 4. Использование данных ковариации для прогнозирования стабильности белка. В соответствии с определенными аспектами статистически значимые ковариации из набора ковариации используются для поиска соответствующих ковариацией в последовательности-кандидате и исследуемой последовательности. В частности, консервация одного или более ковариантных аминокислотных остатков набора сравнения в соответствующих положениях последовательности-кандидата и исследуемой последовательности показывает, что эти остатки функционально важны и прогнозируют благоприятную стабильность белка. Соответственно для прогнозирования стабильности последовательности можно использовать количество ковариантных аминокислотных остатков, консервативных для последовательности-кандидата и исследуемой последовательности. В соответствии с примерами некоторых аспектов для визуализации важных ковариаций можно использовать графическую пользовательскую область контакта (GUI) изобретения (например, инструмент NAPMAP, описанный в разделе V ниже), это облегчает анализ данных ковариаций. Из-за того, что интерпретация данных набора ковариаций может быть утомительной, графическая пользовательская область контакта позволяет облегчить анализ данных, а также дизайн и функциональный анализ белков. В соответствии с демонстративными направлениями реализации наличие или отсутствие коварьирующих остатков в наборе сравнения или выравнивании, которые присутствуют или отсутствуют в последовательности-кандидате, позволяют установить счет, коррелирующий со стабильностью белка. Например, если ковариантная пара остатков (например, позитивно ковариантная) существует и в последовательности-кандидате, то ей можно назначить первый балл счета (например, положительный). Напротив, если ковариантная пара остатков (например, позитивно ковариантная) отсутствует в последователь- 37 - 015992 ности-кандидате, то ей можно назначить второй балл со знаком, противоположным первому (например, отрицательный). В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления при отсутствии отрицательно ковариантных пар остатков в исследуемой последовательности ей назначают положительный балл, а наличие таких остатков приводит к отрицательному баллу. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления при наличии положительно ковариантных пар остатков в исследуемой последовательности ей назначают положительный балл, а отсутствие таких остатков приводит к отрицательному баллу. В соответствии с определенными аспектами счет ковариации генерируют только для таких ковариаций, которые удовлетворяют пороговому уровню статистической значимости. В соответствии с одним вариантом осуществления счеты ковариаций генерируют только для ковариаций выше (или ниже) определенного значения χ2 или φ. Например, порогом для назначения отрицательного балла может быть ковариация с коэффициентом ассоциации фи (φ) менее чем +0,2 (приблизительно от +0,2 до -1,0), а более предпочтительно менее -0,2. В соответствии с другим примером реализации ковариации назначают положительный балл, если ее коэффициент ассоциации фи больше -0,2, предпочтительно больше чем +0,2. В соответствии с предпочтительными аспектами отрицательный балл ковариации назначают ковариациям с коэффициентом ассоциации фи менее чем -0,5 (например, -0,5, -0,6, -0,7, -0,8, -0,9 или -1,0), а положительный балл ковариации назначают ковариациям с коэффициентом ассоциации фи более чем +0,5 (например, +0,5, +0,6, +0,7, +0,8, +0,9 или +1,0), а все остальные ковариации маскируют, назначая нейтральный балл (например, ноль). В соответствии с определенными аспектами отрицательный или положительный счет ковариации можно взвесить, чтобы отразить статистическую значимость и силу соответствующей ковариации. В соответствии с демонстративным примером реализации положительной ковариации можно назначить высокоположительный балл, если ее коэффициент ассоциации фи также высок, или небольшой положительный балл, если ее φ мал. Например, в случае последовательности-кандидата, у которой первая и вторая ковариации характеризуются соответственно значениями φ +0,5 и +1,0, можно назначить небольшой положительный балл (например, +1) для первой ковариации и более высокий положительный балл (например, +2) для второй ковариации. В соответствии с другими аспектами счет ковариации назначают только таким ковариациям, которые валидированы другими средствами, а не просто расчетной статистической значимостью. Для валидации можно использовать несколько нестатистических критериев, позволяющих показать, что рассчитанные ковариации значимы и несут в себе биологический смысл. В соответствии с одним вариантом осуществления ковариацию валидируют, определяя, существует ли корреляция или тренд между остатками, коварьирующими друг с другом, и их близостью друг с другом в структурной модели соответствующего белка. Если указанные остатки располагаются близко друг к другу (например, на 30 А или меньше, предпочтительно 10 А или меньше) в этой структуре, предсказанная ковариация валидируется как истинная ковариация. В соответствии с другим вариантом осуществления ковариацию валидируют, определяя, образуют ли коварьирующие аминокислоты связь, о которой известно, что она существует в подмножестве белков, соответствующих последовательности набора сравнения (например, известные дисульфидные связи). Например, остатки 6-10 с N-конца человеческой или мышиной укладки вариабельной тяжелой цепи IgG образуют очень специфичную конформацию, основанную на консервации коварьирующих пар аминокислот (Ewert et al., Methods, 34: 184-199 (2004)). В соответствии с другими аспектами счет ковариации аминокислоты в последовательностикандидате можно взвесить, чтобы отразить тем самым количество ковариаций в наборе сравнения или выравнивании, которое было бы удовлетворительным (или нет). В соответствии с одним вариантом осуществления последовательности-кандидату назначают положительный балл ковариации за каждую ковариацию в наборе или выравнивании сравнения, которая присутствует в последовательности-кандидате, и отрицательный балл за каждую ковариацию, которая там отсутствует. В соответствии с предпочтительными аспектами счет ковариации для конкретной аминокислоты из исследуемой последовательности представляет собой сумму положительных баллов ковариации за вычетом суммы отрицательных баллов. Например, если для аминокислотного положения из набора сравнения наблюдалось две отрицательные и девять положительных ковариаций при сравнении с аминокислотой из последовательности-кандидата, то общий счет ковариации аминокислоты из последовательности кандидата составляет 7. В соответствии с определенными аспектами общие баллы ковариации суммируются для всех аминокислот последовательности кандидата (или их фрагментов) с получением "счета ковариации последовательности" ("балла ковариации последовательности"). Этот счет можно использовать для прогнозирования стабильности последовательности. В целом, отрицательный счет ковариации позволяет спрогнозировать низкую стабильность белка, а положительный счет говорит о высокой стабильности. b. Подсчет консенсуса. В соответствии с другими аспектами в вычислительных способах изобретения используется новая технология подсчета, называемая "подсчет, основанный на консенсусе", "консенсусный подсчет", в которой полипептидные последовательности-кандидаты сравниваются с базой данных родственных полипеп- 38 - 015992 тидных последовательностей с целью идентификации белков, обладающих потенциально низкой стабильностью. Термин "консенсусный подсчет" означает здесь расчет количества неконсенсусных аминокислот в белке (например, в исследуемом белке), на основании информации, доступной из последовательностей родственных белков. Этот расчет позволяет получить "консенсусный счет" белка. Как показано в примерах ниже, консенсусный счет белка хорошо коррелирует с эмпирически определенной стабильностью белка. Соответственно задачей изобретения является использование консенсусного подсчета для прогнозирования стабильности белка. Чем сильнее отклонение исследуемой последовательности белка от консенсусной последовательности, тем выше консенсусный счет, и тем более вероятно, что исследуемый белок включает аминокислоты, ухудшающие его стабильность. В соответствии с предлагаемым здесь новым консенсусным подходом для прогнозирования стабильности белка-кандидата или исследуемого белка необходимо предпринять следующие основные действия. 1. Получение набора гомологичных последовательностей (например, "набора сравнения"), соответствующего последовательности домена (или его части) белка-кандидата (здесь "исследуемой последовательности домена"). 2. Определение частоты остатков для каждого положения остатков в исследуемой последовательности домена (или его части) с получением консенсусного счета. 3. Прогнозирование на основании консенсусного счета стабильности белка-кандидата или исследуемого белка. В соответствии с демонстративными направлениями реализации для повышения прогнозирующей силы консенсусного счета можно выполнить следующие необязательные действия. 1. Определение частоты остатков в каждом соответствующем положении в каждой последовательности набора сравнения (или его подмножества) с получением среднего счета. 2. Сравнение консенсусного счета со средним консенсусным счетом для определения счета последовательности. 3. Использование счета последовательности для прогнозирования стабильности белка-кандидата или исследуемого белка. Этап 1. Получение набора сравнения. Основанные на консенсусном подсчете способы изобретения используют набор последовательностей ("набор сравнения"), которые гомологичны (т.е. родственны) интересующей последовательности, или "исследуемой последовательности". Набор сравнения может содержать группу гомологичных последовательностей, демонстрирующих от среднего до высокого сходства с исследуемой последовательностью. Специалист может определить набор гомологичных последовательностей и включить в него достаточное количество не избыточных последовательностей. Набор гомологичных последовательностей не должен быть большим, главное получить разумно несмещенную выборку. Важно не число последовательностей, но отношение частот. Такие последовательности можно получить гомологичным поиском в любой базе данных последовательностей, известных в уровне техники (например, базы данных NCBI, TIGR). В примере реализации можно выполнить стандартный поиск BLAST с параметрами по умолчанию и с исследуемой последовательностью, чтобы найти гомологичные интересующие последовательности. Для включения в набор сравнения можно выбрать последовательности с минимальным процентом идентичности (например, больше 25, 30, 35, 40, 45 или 50% идентичности, предпочтительно больше 30% идентичности). В соответствии с определенными аспектами последовательности с высокой степенью идентичности (например, больше 85, 90, 95 или 98%, предпочтительно больше 95%) исключают из набора сравнения, чтобы не допустить смещения. В соответствии с определенными аспектами набор сравнения можно исправить, включив туда только последовательности, удовлетворяющие одному или больше критериев включения в набор. Например, в соответствии с определенными аспектами набор сравнения может содержать ортологичные последовательности (например, последовательности из различных видов (например, различных видов млекопитающих), но обладающие одной биохимической функцией). В соответствии с другими аспектами набор сравнения включает человеческие последовательности. В соответствии с примером реализации набор сравнения включает только зародышевые последовательности млекопитающих. В соответствии с предпочтительными аспектами набор сравнения включает последовательности белков того же класса укладки (например, из того же домена белков), что и исследуемый белок (например, белки с укладкой иммуноглобулинового типа). Такие белки можно идентифицировать способами биоинформатики, известными в уровне техники (например, выполнив поиск в базе данных консервативных доменов (Conserved Домен Database (CDD) Национального института здравоохранения США). Этап 2. Определение консенсусного счета исследуемой последовательности. После того как последовательности набора сравнения скомпилированы, определяют консенсусную последовательность набора сравнения, это делается, чтобы облегчить консенсусный подсчет изобретения. Термин "консенсусная последовательность" означает последовательность, остатки в которой (на- 39 - 015992 пример, аминокислотные остатки) в каждом положении соответствуют наболее распространенным остаткам в этом положении в выровненном наборе родственных последовательностей (т.е. в наборе сравнения). Чтобы определить консенсусную последовательность, последовательности из набора сравнения необходимо сначала выровнять, воспользовавшись алгоритмами выравнивания последовательностей, известными в уровне техники. Предпочтительным неограничивающим примером алгоритма локального выравнивания, применяемым для сравнения последовательностей, является алгоритм Karlin и Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, модифицированный, как описано в работе Karlin и Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5858-77. Такой алгоритм встроен в программу BLAST (версию 2,0) авторов Altschul, et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10. В соответствии с другим вариантом осуществления выравнивание оптимизируют, включив соответствующие пробелы, и процент идентичности определяют по длине выровненных последовательностей (т.е. выравнивание с пробелами). Чтобы получить выравнивание с пробелами для целей сравнения, можно воспользоваться Gapped BLAST, как описано в работе Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. В соответствии с другим вариантом осуществления выравнивание оптимизируют, включив соответствующие пробелы, и процент идентичности определяют по всей длине выровненных последовательностей (т.е. глобальное выравнивание). Предпочтительным, неограничивающим примером математического алгоритма, используемого для глобального сравнения последовательностей, является алгоритм Myers и Miller, CABIOS (1989). Такой алгоритм входит в состав программы ALIGN (версия 2,0), входящей в состав программного пакета выравнивания последовательностей GCG. При использовании программы ALIGN для сравнения последовательностей можно применять таблицу весовых остатков РАМ 120, значение параметра gap length penalty 12 и gap penalty (штраф за пропуск в последовательности) 4. Чтобы определить консенсусную последовательность выровненного набора последовательностей, определяют наиболее часто встречающиеся остатки в каждом положении выровненного набора последовательностей. Консенсусную последовательность можно определить визуально, а можно анализом на компьютере с использованием публично доступной программы по биоинформатике (например, инструмент EMBOSS CONS, доступный из Helix Systems Национального института здравоохранения). Консенсусную последовательность используют в способах изобретения для определения консенсусного счета. В соответствии с определенными аспектами консенсусный счет представляет собой численное значение, соотносящее частоту остатков или вхождение в набор сравнения консенсусного остатка в каждом аминокислотном положении консенсусной последовательности (т.е. "частоту консенсусных остатков") и частоту остатков или вхождение в набор сравнения консенсусного остатка в каждом аминокислотном положении исследуемой последовательности (т.е. "частоту исследуемых остатков"). Частоты остатков в положении исследуемой или консенсусной последовательности рассчитывают, суммируя количество раз, которое аминокислота в этом положении присутствует в соответствующем положении выровненного набора сравнения, и разделив полученное значение на общее количество последовательностей в наборе сравнения. В соответствии с примером реализации консенсусный счет (балл) по каждому аминокислотному положению определяют, разделив частоту остатков в исследуемой последовательности на частоту остатков в консенсусной последовательности и получив ненулевое значение больше 0, но не больше 1. Например, остатку, идентичному консенсусной аминокислоте в этом положении, назначают идеальный балл 1, но чем реже аминокислота встречается в этом положении, тем ближе балл к нулю. В соответствии с предпочтительными аспектами консенсусный счет можно просуммировать по всем положениям исследуемой последовательности (или ее фрагмента) с получением общего консенсусного счета. Например, идеальным общим консенсусным счетом является количество аминокислотных остатков в исследуемой последовательности, показывая, что исследуемая последовательность идентична соответствующей консенсусной последовательности. Пример формулы для расчета общего консенсусного счета белка представлен ниже где ci(r) соответствует частоте консенсусных остатков в аминокислотном положении консенсусной последовательности; hi(r) соответствует исследуемой частоте аминокислотного положения исследуемой последовательности; i соответствует количеству аминокислот в исследуемой последовательности. Этап 3. Использование консенсусного счета для прогнозирования стабильности белка. Консенсусный счет можно затем использовать для прогнозирования стабильности исследуемого белка. В целом, чем больше значение консенсусного счета, тем выше вероятность, что стабильность исследуемого белка будет адекватная его предполагаемому использованию. В соответствии с определенными аспектами консенсусный счет исследуемого белка можно сравнить с консенсусным счетом контрольной последовательности. В соответствии с одним примером реализации контрольная последовательность соответствует белку, о котором известно, что он обладает плохими или нежелательными свой- 40 - 015992 ствами стабильности (здесь "отрицательный контроль"). Соответственно для исследуемого белка можно спрогнозировать улучшенную стабильность, если его консенсусный счет выше, чем у отрицательного контроля. В соответствии с одним примером реализации контрольная последовательность соответствует белку, о котором известно, что он обладает желательными свойствами стабильности (здесь "положительный контроль"). Соответственно для исследуемого белка можно спрогнозировать улучшенную стабильность, если его консенсусный счет в значительной степени одинаков или даже выше, чем у положительного контроля. В соответствии с другими аспектами консенсусный счет исследуемой последовательности можно сравнить с ее гипотетическим идеальным консенсусным счетом, т.е. значением, соответствующим общему числу аминокислотных остатков в исследуемой последовательности. Этап 4. Определение среднего консенсусного счета набора сравнения. В соответствии с определенными аспектами средние консенсусные счеты по некоторым или всем аминокислотным положениям последовательностей набора сравнения определяют для сравнения с консенсусным счетом по соответствующим положениям в исследуемой последовательности. В соответствии с предпочтительными аспектами средний общий консенсусный счет набора сравнения определяют для сравнения с общим консенсусным счетом исследуемой последовательности. Средний общий консенсусный счет набора сравнения представляет собой сумму частот остатков по всем аминокислотным положениям последовательности набора сравнения, деленную на общее количество последовательностей в этом наборе сравнения. Этап 5. Определение счета последовательности. В соответствии с определенными аспектами счет последовательности определяют, сравнивая средний консенсусный счет набора сравнения с консенсусным счетом исследуемой последовательности. Разница этих значений представляет собой "счет последовательности" исследуемой последовательности (также называемый "Δ счетом"). Счет последовательности можно определить, вычитая консенсусный счет из среднего консенсусного счета. Этап 6. Использование счета последовательности для прогнозирования стабильности белка. Счет последовательности является мерой отклонения консенсусного счета исследуемой последовательности от среднего консенсусного счета набора сравнения. Приводимые ниже примеры демонстрируют, что счет последовательности белка хорошо коррелирует с его стабильностью (например, термической стабильностью). Соответственно в соответствии с определенными аспектами счет последовательности также можно использовать для прогнозирования стабильности белка. Если Δ счет белка отрицателен (т.е. консенсусный счет ниже среднего консенсусного счета), то можно предположить, что интересующий белок будет обладать меньшей стабильностью, чем большая часть белков набора сравнения. В соответствии с определенными аспектами используемые в способах изобретения исследуемые последовательности представляют собой однодоменные белки. Здесь термин "однодоменный белок" означает белок, состоящий из одного или более доменов, где все домены одного типа (например, вариабельные тяжелые домены - VH). В соответствии с другими аспектами используемые в способах изобретения исследуемые последовательности представляют собой полидоменные белки. Здесь термин "полидоменный белок" означает белок, состоящей из двух или более доменов, где по меньшей мере два домена относятся к разным типам. Например, антитела - белки, как правило, состоящие из шести доменов (т.е. VH, VL, CL, CH1, CH3 и CH3). В соответствии с предпочтительными аспектами стабильность наименее стабильного домена полидоменного белка можно спрогнозировать способами изобретения. Приводимые ниже примеры показывают, что способы изобретения особенно эффективны для прогнозирования термической стабильности, если в исследуемой последовательности используется наименее стабильный домен (или его фрагмент) полидоменного белка (например, домен VH антитела). Если наименее стабильный домен a priori неизвестен, его можно определить экспериментальными способами, известными в уровне техники (например, с использованием любого из описанных ниже способов, таких как дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК), температурно-зависимые круговой дихроизм (КД) или флуоресценция). Такие способы позволяют определить несколько переходов при термическом развертывании, где наименее стабильный домен либо развертывается первым (см. фиг. 94), либо ограничивает общий порог стабильности полидоменной единицы, которая развертывается кооперативно (т.е. у полидоменного белка, демонстрирующего единый переход развертывания). Наименее стабильный белок можно определить множеством дополнительных способов. Чтобы выяснить, какой домен ограничивает общую стабильность, можно использовать мутагенез. Кроме того, можно проверить сопротивляемость полидоменного белка действию протеаз в условиях, когда известно, что наименее стабильный домен, действительно, развертывается (это можно определить ДСК или другими спектроскопическими способами (Fontana, et al., Fold. Des., 2: R17-26, 1997). После того как наименее стабильный домен идентифицирован, кодирующую его (или его фрагмент) последовательность можно использовать как исследуемую последовательность в способах изобретения. В соответствии с демонстративными направлениями реализации полидоменные белки, оцениваемые способами изобретения, представляют собой антитела. Способы изобретения позволяют специали- 41 - 015992 сту исключить неправильные домены вариабельных областей из огромного разнообразия последовательностей вариабельных областей, создаваемых механизмами разнообразия иммунной системы. В соответствии с демонстративными направлениями реализации, например, молекула scFvs или молекулы антител, включающие домены вариабельных областей (Fv) с относительно высокой стабильностью, можно идентифицировать способами изобретения и затем выбрать. В соответствии с другими примерами реализации домены вариабельной области иммуноглобулина человека (Fv) с приемлемой стабильностью можно идентифицировать способами изобретения и затем выбрать в качестве цепей акцепторного иммуноглобулина при гуманизации антитела. В соответствии с другими примерами реализации способы изобретения можно использовать для просеивания вариабельных последовательностей сконструированных антител-кандидатов (например, гуманизированных последовательностей VL или VH) по их стабильности до перехода к синтезу связывающей молекулы, включающей последовательность-кандидата. Как известно в уровне техники, стабильность белков колеблется от одного антитела к другому и зависит от множества различных вариаций природных и сконструированных антител. Например, селективное давление иммунной системы по развитию разнообразия вариабельных доменов природных антител может негативно повлиять на их стабильность и свертываемость в рекомбинантных системах экспрессии (Knappik и Pluckthun, Protein Engng., 8: 81-89 (1995); Wall и Pluckthun, Protein Engng, 12: 605-11 (1999); Knappik et al., J. Mol. Biol., 296: 57-86 (2000); Ewert et al., J. Mol. Biol., 3325: 531-33 (2003)). Состоящие из одного изотипа и подкласса антитела (из которых чаще всего используют для терапии антителами человеческий IgG1) различаются друг от друга по стабильности, в зависимости от различий в их вариабельных доменах, так как остальная часть их последовательностей идентична. Термическое развертывание фрагментов антител Fab преимущественно происходит в виде одного заметного перехода. Чаще всего, общая термостабильность Fab ограничивается областями Fv антител, за исключением редких случаев, когда стабильность Fv (или одного только VH или VL) чрезвычайно мала или высока, и переход развертывания Fv происходит отдельно от области CH1/CL (Shimba, et al., 1995; Rothlisberger et al., 2005). В соответствии с определенными аспектами способы изобретения используют последовательность вариабельных областей антитела в качестве исследуемой. В соответствии с предпочтительными аспектами способы изобретения используют тяжелую цепь вариабельных доменов (VH) (или ее фрагмент) в качестве исследуемой последовательности. В примерах ниже показано, что VH домен хорошо позволяет прогнозировать стабильность антитела, включающего указанный домен. В соответствии с определенными аспектами исследуемая последовательность вариабельного домена сравнивается с набором сравнения, включающим или исключительно состоящим из последовательностей вариабельных доменов. Такие последовательности можно скомпилировать из базы данных Кэбата последовательностей иммуноглобулинов (Kabat et al., "Distribution Files of the Fifth Edition of Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1992). В соответствии с предпочтительными аспектами набор сравнения может содержать или состоять из последовательностей иммуноглобулинов человека. В соответствии с другими предпочтительными аспектами набор сравнения может содержать или состоять исключительно из человеческих зародышевых последовательностей. В соответствии с одним вариантом осуществления набор сравнения включает последовательности вариабельных доменов из того же подкласса Кэбата последовательностей антител. В соответствии с другими аспектами часть вариабельного домена (например, домена VH) используется в способах изобретения в качестве исследуемой последовательности. Примером части вариабельного домена является последовательность, включающая меньше чем все последовательности каркасных областей или CDR вариабельной области (например, последовательность VH, усеченную, чтобы удалить CDR3 и FR4). В соответствии с одним вариантом осуществления последовательности домена VH входят в подкласс зародышевых последовательностей VH1 по Кэбату. В соответствии с другим вариантом осуществления вариабельные последовательности домена входят в подкласс зародышевых последовательностей VH2 по Кэбату. В соответствии с другим вариантом осуществления вариабельные последовательности домена входят в подкласс зародышевых последовательностей VH3 по Кэбату. В соответствии с другим вариантом осуществления вариабельные последовательности домена входят в подкласс зародышевых последовательностей VH4 по Кэбату. В соответствии с другим вариантом осуществления вариабельные последовательности домена входят в подкласс зародышевых последовательностей VH5 по Кэбату. В соответствии с другим вариантом осуществления вариабельные последовательности домена входят в подкласс зародышевых последовательностей VH7 по Кэбату. Способы изобретения могут быть использованы совместно с белками, известными в уровне техники. В соответствии с одним вариантом осуществления белок представляет собой антитело или его фрагмент. В соответствии с определенными аспектами антитело - гуманизированное антитело. В соответствии с другими аспектами антитело - человеческое антитело. В соответствии с другими аспектами антитело - нечеловеческое антитело (например, мышиное моноклональное антитело). В соответствии с другими аспектами антитело - однодоменное антитело (например, верблюда, акулы, человека). В соответствии с дополнительными аспектами антитело является химерным. Другие примеры модифицированных антител для использования в способах изобретения включают антитела с удаленными доменами и биспецифич- 42 - 015992 ные связывающие молекулы. Дополнительные примеры антител включают scFv-включающие антитела и модифицированные антитела, описанные далее. В соответствии с предпочтительными аспектами стабильность упомянутых выше связывающих белков оценивается в способах изобретения по их вариабельной последовательности тяжелой цепи (или ее фрагментам) как исследуемая последовательность. В соответствии с одним аспектом изобретения данные, полученные для данного полипептида, сохраняются и выводятся как характеристика стабильности полипептида. В соответствии с одним вариантом осуществления описанные здесь способы можно повторить для большого числа полипептидов. В соответствии с одним вариантом осуществления выбор полипептида может быть основан на полученных данных. В соответствии с другим вариантом осуществления отобранный полипептид можно сформулировать для терапевтического применения. IV. Способы конструирования/изготовления белков с улучшенными биофизическими свойствами (например, стабильностью белка). (а) Ковариационный дизайн. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение включает способы конструирования вариантов белков с биофизическими свойствами, улучшенными по сравнению с родительской молекулой, от которых они получены, с использованием результатов ковариационного анализа. Известно множество способов конструирования белков, которые можно облегчить данными ковариационного анализа, включая, но не ограничиваясь, конструирование белков с улучшенной стабильностью, модификацию рН-профилей развертывания, стабильное устранение гликозилирования и изменение биохимической функции. В соответствии с определенными аспектами изобретение относится к способам конструирования белков с улучшенной стабильностью, основанным на идентификации счетов ковариации (или самих ковариаций), которые позволяют спрогнозировать улучшенную или ухудшенную стабильность белков, в соответствии со способами из раздела III выше. Например, если в последовательности, принадлежащей интересующему белку, отсутствует или нарушены несколько ключевых ковариаций, это можно исправить способами конструирования белков. Можно включать также модификации, улучшающие рассчитанное количество сильных ковариаций, наблюдаемых в отдельной последовательности. Для стабилизации доменов ВНА10 scFv VH и VL разработано большое количество видов дизайна. В частности, результаты первоначального скрининга библиотеки двух доменов scFv ВНА10 позволяют оценить возможности инструмента ковариационного анализа по дизайну стабильности белка. Первый пример включает успешное прогнозирование стабилизирующей мутации (S46L) домена ВНА10 VL, которая существенно улучшает термическую стабильность (ΔТ50=+10°С), определенную способом анализа термической проверки. Мутация от Ser к Leu в положении 46 по системе нумерации Кэбата ведет к положительному соединению с существующим Tyr в положении 36, который по данным инструмента сильно коварьирует с Leu 46 (фиг. 104). Вторым примером применения инструмента ковариационного анализа является аналитическое решение проблемы негативных эффектов мутации ВНА10 VH Q6E. Анализ частоты одиночных остатков показал, что мутация в этом положении на значительно более часто встречающийся Glu приведет к повышению стабильности белка. Однако по данным инструмента ковариационного анализа одиночная мутация на Glu нарушает несколько существующих ковариаций последовательности ВНА10 VH. Для улучшения стабильности следует заменить несколько аминокислот, предпочтительно стабилизирующих Glu в этом положении. Другой пример прогнозирующей значимости инструмента ковариационного анализа показан на фиг. 105. Как часть процесса конструирования библиотеки по одному остатку, Met 80 мутировали в Leu. Полагали, что эта мутация окажется высокостабилизирующей, так как Leu представляет собой аминокислоту, чаще всего наблюдающуюся в этом положении в базе данных последовательностей. Однако ковариационный анализ показал, что для гармоничной ковариаций необходимо мутировать две другие аминокислоты (V67F и T70S). (b) Дизайн области контакта. В соответствии с другими аспектами изобретение представляет способы усиления биофизического свойства (например, стабильности белка) у второго белка или белка-кандидата (например, антитела), используя при этом первый белок как белок-образец для рационального дизайна. Термин "белок-образец" здесь означает белок с требуемым биофизическим свойством (например, высокой термической стабильностью), который используется для моделирования того же самого свойства у второго белка, для которого улучшение этого биофизического свойства также желательно. В соответствии с предпочтительными аспектами белок-образец относится к тому же структурному классу, что и второй белок (например, если второй белок является антителом, то белком-образцом также будет антитело). В соответствии с определенными аспектами белок-образец можно определить как обладающий биофизическим свойством (например, растворимостью), желательным в соответствии со способом изобретения. В соответствии с одним примером реализации белок-образец с желательными свойствами стабильности можно выделить в группе белков (такой как BIIB1-4 из табл. 20, ниже) экспериментальными способами, такими как описаны в примере 15. Этот белок-образец будет затем использоваться как плат- 43 - 015992 форма последовательности для дизайна. В соответствии с одним примером реализации описанный здесь способ ковариационного анализа позволяет спрогнозировать в белке-образце улучшенное биофизическое свойство (например, стабильность белка). В соответствии с другими примерами реализации описанный здесь способ консенсусного счета позволяет показать, что белок-образец является желательным белком (например, стабилизированным белком). В соответствии с еще одним примером реализации белокобразец идентифицируется способами скрининга изобретения. В соответствии с другими аспектами белок-образец конструируют в соответствии со способом изобретения. В соответствии с примером реализации белок-образец конструируют так, чтобы он отличался улучшенным биофизическим свойством (например, улучшенной стабильностью), делая это с помощью ковариационного способа изобретения. В соответствии с еще одним примером реализации белок-образец конструируют так, чтобы он отличался улучшенным биофизическим свойством, делая это с помощью способа подсчета консенсуса. Способы настоящего изобретения включают следующие этапы: (1) получение структурных моделей белка-образца и белка-кандидата; (2) идентификация остатков в белке-образце, важных для стабильности; и (3) замена остатков в белке-кандидате, которые соответствуют существенным остаткам в белкеобразце. В соответствии с одним вариантом осуществления структурная модель образца белка представляет собой кристаллическую структуру (например, полученную с помощью рентгеновского излучения), и белок-кандидат моделируется способом гомологичного моделирования с использованием структурной модели образца белка. В соответствии с другим вариантом осуществления важным остатком является остаток области контакта VH/VL. Здесь термин "остаток области контакта" означает остаток, участвующий в домен-доменном взаимодействии внутри белка или между белками. Предпочтительно остатки области контакта располагаются на границе, т.е. в "области контакта" между двумя доменами белков и вносят вклад в поверхность по меньшей мере одного домена (предпочтительно обоих). Остатки, на которых расходуется значительно больше площади поверхности области контакта, чем на другие, т.е. такие остатки, которые не предъявляют значительную часть своей поверхности свернутой части белка, считаются более важными для стабильности белка. Площадь поверхности, которую каждый остаток занимает на области контакта, можно определить признаваемыми в уровне техники способами (например, анализом с помощью программного обеспечения MOLMOL). В соответствии с определенными аспектами остатки области контакта занимают по меньшей мере 10 А2 площади поверхности (например, 10 А2, 15 А2, 20 А2, 25 А2 или больше). Остатки белка-кандидата, локализованные в аминокислотных положениях, соответствующих положениям важных остатков (например, остатки на области контакта) белка-образца, предпочтительно замещаются, если они не идентичного типа. В соответствии с определенными аспектами делаются только неконсервативные замены. В соответствии с другими аспектами делаются только консервативные замены. В соответствии с демонстративными направлениями реализации образец и белок-кандидат представляют собой связывающие молекулы (например, антитела или их варианты (например, молекула scFv)). В соответствии с одним вариантом осуществления изучаемая область контакта расположена между доменом Fc (например, петля, CH3 и CH3) и другим доменом Fc. В соответствии с другим вариантом осуществления область контакта располагается между VH доменом и VL доменом. В соответствии с предпочтительными аспектами конструирование сосредоточено на области контакта между доменами VH и VL антитела. Биофизические данные (см. данные ДСК - пример 15) позволяют предположить, что сродство доменов VH и VL друг к другу маргинально для формата scFv (т.е. в отсутствие доменов Fab CH1 и CL). В особенности, взаимодействия VH и VL не всегда достаточно сильны (т.е. у них недостаточно сродства, чтобы привести к образованию совместно свернутого единого объекта). Это означает, что улучшение стабильности области контакта VH/VL (т.е. возрастание сродства между доменами VH и VL) может быть предпочтительным маршрутом усиления стабильности антитело/scFv. Стабилизируя область контакта, можно превратить переходы свертывания антитела в единое событие, повысить сродство доменов друг к другу и допустить менее динамичные флуктуации, которые могут привести к экспонированию площади гидрофобной поверхности (как наблюдалось в экспериментах по связыванию ANS). В соответствии с другими аспектами результаты конструирования можно валидировать с помощью способа дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), который дает специалисту возможность неколичественно наблюдать реальное возрастание сродства между VH и VL. (с) Объединение ковариаций и конструирования области контакта. В соответствии с другими аспектами изобретения два или больше описанных здесь инструментов дизайна, основанного на последовательностях, можно использовать для конструирования оптимизированных вариантов белков. В соответствии с одним демонстративным направлением реализации изобретения способ конструирования области контакта используется совместно с ковариационным анализом для определения остатков и их положений, важных для структуры и функции белков, включая, напри- 44 - 015992 мер, стабильность. В соответствии с одним примером реализации ковариационный анализ позволяет определить остатки или их положения вне области контакта (например, называемые "поддерживающие остатки"), которые не взаимодействуют физически с остатками области контакта противоположного домена и не вносят вклад в область области контакта, но тем не менее важны для создания правильного структурного контекста остатков области контакта. Например, можно провести ковариационный анализ остатков, локализованных на поверхности, чтобы найти поддерживающие остатки, коварьирующие с остатками области контакта. Предпочтительно для ковариационного анализа отбирать остатки области контакта, занимающие значительную часть площади поверхности (например, остатки, занимающие по меньшей мере 40 А2 площади). Поддерживающие остатки, коварьирующие с отобранными остатками области контакта, можно затем определить ковариационными способами изобретения. Предпочтительно отбирать поддерживающие остатки, коварьирующие сильно (например, значение фи не меньше 0,25). В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления поддерживающие остатки отбирают, если они коварьируют по меньшей мере с двумя остатками области контакта (например, с 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше остатков). Чем больше количество ковариаций, тем больший ковариационный счет можно назначить поддерживающему остатку, так как число ковариаций позволяет спрогнозировать вклад, вносимый поддерживающим остатком для стабилизации области контакта VH/VL. Способы этого аспекта изобретения включают следующие этапы: (1) получение структурной модели белка-образца и белка-кандидата; (2) идентификация остатков области контакта (например, VH/VL) белка-образца, важных для стабильности; (3) идентификация поддерживающих остатков, коварьирующих с остатками области контакта этапа (2), например, с использованием описанного здесь инструмента ковариационного анализа; (4) замещение одного или более остатков области контакта или поддерживающих остатков белкакандидата на соответствующие остатки или поддерживающие остатки, идентифицированные на этапах (2) и (3). Остатки белка-кандидата, локализованные в аминокислотных положениях, соответствующих положениям наиболее важных остатков (например, остатков области контакта или поддерживающих) образца белка, предпочтительно замещаются, если только они не идентичного типа. В соответствии с определенными аспектами делаются только неконсервативные замены. В соответствии с другими аспектами делаются только консервативные замены. В соответствии с одним аспектом изобретения улучшенную последовательность данного белка сохраняют или выводят на внешнее устройство. В соответствии с другим вариантом осуществления отобранный полипептид можно сформулировать для терапевтического применения. V. Системы, области контакта и компьютерные способы. Один аспект изобретения относится к способам (например, реализованным на компьютере), устройствам и программному обеспечению для реализации способов изобретения, связанных с отбором или дизайном. В соответствии с демонстративными направлениями реализации изобретение относится к компьютерному способу и устройству для идентификации аминокислотных остатков (например, коварьирующих аминокислотных остатков) в последовательности-кандидате. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение относится к компьютерным способам и устройству для ранжирования одной или более исследуемых последовательностей или последовательностей-кандидатов на основании их счета (например, консенсусного счета или ковариационного счета), который позволяет спрогнозировать биофизическое свойство (например, стабильность белка, его каталитическую активность, терапевтическую активность, сопротивляемость патогенам или токсинам, токсичность и т.д.). Аспекты компьютерных способов можно описать следующей последовательностью операций: (а) получение данных (например, данных последовательности или структурных), характеризующих набор последовательностей и исследуемую последовательность; (b) вычисление счета на основании этих данных (например, счета ковариации или консенсусного счета); (с) ранжирование счета с целью идентификации одной или больше интересующих последовательностей или аминокислотных остатков. В соответствии с некоторыми аспектами счета ранжируют, чтобы определить один или больше аминокислотных остатков, которые надо зафиксировать и сохранить в исследуемой последовательности или последовательности-кандидате. В соответствии с другими аспектами счеты ранжируют, чтобы определить один или больше аминокислотных остатков, которые будут кандидатами на замену. В соответствии с примером реализации компьютерные способы ранжируют положения остатков (или конкретных остатков в определенных положениях) в порядке счета ковариации. В соответствии с другим примером реализации компьютерные способы ранжируют последовательности-кандидаты в порядке их консенсусного счета. Еще один аспект изобретения относится к устройствам и носителям информации с программными командами и/или данными для реализации описанных здесь способов. Часто программные команды представляют собой код для выполнения операций определенных способов. Данные, если они нужны для реализации свойств настоящего изобретения, могут быть предоставлены в виде структур данных, таблиц - 45 - 015992 базы данных, объектов данных и других соответствующих форм объединения указанной информации. Любой способ и систему изобретения можно представить, полностью или частично, в виде таких программируемых инструкций и/или данных на носителе, предназначенном для чтения на компьютере. Компьютерные способы изобретения могут включать устройство вывода, отображающее информацию пользователю (например, дисплей CRT, LCD, принтер, коммуникационное устройство, такое как модем, аудиовыход и т.д.). Кроме того, инструкции (например, алгоритмы) по выполнению расчетов, частично или полностью, можно сохранять, частично или полностью, на носителе, пригодном для использования в электронном устройстве для выполнения инструкций. Так, способы изобретения применимы как к программному обеспечению, реализующему высокопроизводительный подход (например, к инструкциям, читаемым компьютером), так и к соответствующему оборудованию (например, компьютеры, роботы и чипы). Реализуемый на компьютере процесс не ограничивается конкретной компьютерной платформой, конкретным процессором или конкретным языком программирования высокого уровня. В соответствии с определенными аспектами расчеты, используемые в способах изобретения, выполняются компьютерным алгоритмом, подходящим для использования с языком программирования на компьютере (например, PERL). В соответствии с демонстративными направлениями реализации компьютерный алгоритм предназначен для распознавания (i) выравнивания последовательностей набора сравнения и/или (ii) одной или больше исследуемых последовательностей, поступаемых на вход алгоритма. (i) Компьютерная реализация консенсусного подсчета. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретение относится к способам, реализованным на компьютере, к устройствам и программному обеспечению для выполнения описанного выше компьютерного подсчета консенсуса с использованием компьютерного алгоритма. В соответствии с демонстративными направлениями реализации алгоритм предназначен для выполнения одного или больше следующих действий: (1) представление каждого положения остатка в выравнивании в виде столбца и подсчет консенсусной частоты остатков в этом положении; (2) расчет частоты исследуемых остатков для каждого положения остатка в исследуемой последовательности (последовательностях) и (3) деление частоты остатков в исследуемой последовательности на консенсусную частоту остатков с получением консенсусного счета; и/или (4) суммирование консенсусного счета в каждом положении с получением общего консенсусного счета. В соответствии с другими аспектами алгоритм можно спроектировать на выполнение одного или больше следующих действий: (5) расчет среднего консенсусного счета набора сравнения и/или (6) счета последовательности для исследуемой последовательности. Эти аспекты изобретения реализованы также в системе для осуществления способа консенсусного подсчета изобретения. Система включает (а) компьютер, который включает базу данных, способную вместить в себя по меньшей мере одну популяцию наборов сравнения, и (b) системное программное обеспечение. Последнее включает одну или более логических команд по осуществлению любого из этапов (1)-(6) компьютерного способа подсчета консенсуса. Изобретение относится также к компьютерному программному продукту для выполнения способа консенсусного подсчета изобретения. Этот продукт включает читаемый на компьютере носитель информации, включающий одну или более логическую команду для выполнения этапов (1)-(6). (ii) Компьютерная реализация ковариационного анализа. Еще один аспект изобретения относится к компьютерной реализации способов проведения описанного ковариационного анализа изобретения с использованием компьютерного алгоритма. В соответствии с демонстративными направлениями реализации алгоритм предназначен для выполнения одного или более следующих действий: (1) представление каждого положения остатка в выравнивании в виде столбца; (2) объединение столбцов в матрицу; (3) расчет корреляции между различными столбцами матрицы с получением фактора корреляции (correlative term); (4) прибавление факторов корреляции к линейным факторам, которые соответствуют аминокислотным остаткам с целью генерации расширенной матрицы прогнозирования; (5) генерация эвристической модели (например, скрытой модели Маркова) из расширенной матрицы прогнозирования с целью идентификации важных корреляций. Эти аспекты изобретения реализуются также в системе для выполнения способа ковариационного анализа изобретения. Система включает (а) компьютер, который включает базу данных, способную вместить в себя по меньшей мере одну популяцию библиотек символьных строк, и (b) системное программное обеспечение. Последнее включает одну или более логических инструкций по проведению любого из этапов (1)-(5) компьютерного способа подсчета ковариаций. Изобретение относится также к компьютерному программному продукту для проведения ковариационного анализа изобретения. Этот продукт включает читаемый на компьютере носитель информации, включающий одну или более логическую инструкцию для выполнения этапов (1)-(5). (iii) Графический интерфейс пользователя для ковариационного анализа. В соответствии с некоторыми примерами аспектов изобретение относится к новому графическому интерфейсу пользователя (GUI), используемому совместно с ковариационными способами изобретения. Этот инструмент ковариационного анализа, называемый NAPMAP, помогает пользователю визуализировать ковариации в контексте выровненного набора последовательностей. Новый графический интерфейс пользователя реализован на компьютере на языке программирования, признанном в уровне техники (на- 46 - 015992 пример, на Java 1.4.2 с библиотекой обработки из файла proCessing.org). (а) Структура сетки. В соответствии с одним вариантом осуществления графический пользовательский интерфейс изобретения включает графическую картину выравнивания (например, выравнивания последовательностей, созданного в соответствии с описанными здесь способами изобретения) и соответствующие ему данные. Простой формой такого интерфейса является сетчатая структура. Термин "сетчатая структура" (также известный как платформа выравнивания) обозначает здесь матрицу, в которой представлены свойства выравнивания. В соответствии с одним вариантом осуществления сетчатая структура графически представляет положения остатков последовательностей в выравнивании. В соответствии с другим вариантом осуществления она графически представляет типы остатков последовательностей в выравнивании. В соответствии с другим вариантом осуществления она графически представляет частоты типов остатков (или "частоты использования остатков") в выравнивании. В соответствии с другими аспектами она представляет одно или больше свойств остатков в выравнивании (например, гидрофобность, заряд, размер, pKa и т.д.). В соответствии с демонстративными направлениями реализации сетчатая структура включает репрезентативный вывод на экран: (i) непрерывных положений остатков, соответствующих последовательности выравнивания; и (ii) частоты использования остатков для типов остатков в каждом положении остатков в последовательности выравнивания. В соответствии с одним вариантом осуществления частоты использования остатков изображают символически (например, кружками или квадратиками). В соответствии с другими аспектами представлены все 20 природных аминокислот, пробелы и избыточные остатки. В соответствии с определенными аспектами положения остатков выводятся в строках, а частоты их использования в столбцах. В соответствии с определенными аспектами положения остатков положения остатков выводятся в столбцах, а частоты их использования в строках. В соответствии с одним вариантом осуществления частота использования остатка коррелирует (например, положительно или отрицательно) с размером символа (например, размером кружка), так что более консервативные остатки можно визуально отделить от наблюдаемых реже. Например, частоты остатков можно представить в виде кружков различных размеров, причем площади кружков пропорциональны частоте использования соответствующих остатков. Радиус каждого кружка ® для рисования узла с можно определить по следующей формуле (IV): где А - требуемая площадь поверхности всех узлов; N - число последовательностей, использующих этот остаток; М - среднее количество последовательностей, использующих каждый остаток. В соответствии с примером реализации структура сетки составляет матрицу непрерывных столбцов и строк, где (i) сплошные столбцы графически представляют соответствующие сплошные положения остатков в выравнивании; (ii) каждая сплошная строка графически представляет специфичный тип аминокислот и (iii) частота использования остатков в каждом положении графически представлена в ячейках матрицы. Предпочтительно, если все типы остатков (например, все 20 аминокислот и/или возможные пробелы) представлены отдельной строкой в структуре сетки. Более предпочтительно, если частоты использования остатков в каждом положении выравнивания графически представлены в ячейках матрицы символом (например, кружком), размер которого коррелирует (например, положительно коррелирует) с частотой использования остатков. Пример сетчатой структуры представлен на фиг. 102. (b) Наложение ковариаций. В соответствии с другими аспектами графический пользовательский интерфейс изобретения включает графическое изображение одной или более ковариаций (например, ковариаций, идентифицированных в соответствии с описанными здесь способами изобретения) и соответствующих им данных. В соответствии с определенными аспектами графический интерфейс пользователя настоящего изобретения включает графическое изображение как (i) структуры сетки, так и (ii) одной или более ковариаций. В соответствии с этими аспектами структура сетки может служить платформой выравнивания для отображения данных ковариации. Данные ковариации можно показать, например, накладывая их на сетчатую структуру. Организованные таким образом данные ковариации называются "ковариационным наложением". Например, ковариации можно показывать в наложении в виде линий или сетки линий, соединяющих две или больше коварьирующие аминокислоты, которые графически отображаются в структуре сетки. Линии наложения ковариаций могут быть различной толщины (например, тонкие линии и столбики) или непрерывности (например, пунктирная или твердая, сплошная или рваная), главное, чтобы соединение между двумя или более коварьирующими аминокислотами было бы очевидно пользователю (см., например, фиг. 103, где ковариации изображены в виде полупрозрачных столбиков, соединяющих - 47 - 015992 две коварьирующие аминокислоты). В соответствии с демонстративными направлениями реализации графическое представление ковариаций может также представлять ее статистическую значимость (например, значения φ или χ2). В соответствии с одним примером реализации толщина линии в ковариационном наложении может быть пропорциональна статистической значимости ковариации. Например, толщина линии ковариационного наложения может быть нарисована в такой пропорции к значению φ, которую можно рассчитать по формуле (V) где W - толщина линии; Ф - фи (коэффициент корреляции); N - увеличивающий множитель; М - максимальная толщина линии. В соответствии с другим примером реализации положительные и отрицательные ковариации можно графически отделить друг от друга (например, различным цветом линий или различной толщиной). В соответствии с другими примерами реализации пользователю показывают только ковариации выше определенного порогового уровня статистической значимости. Например, в соответствии с определенными аспектами, для просмотра ковариации только желательной силы можно использовать критерии отсечения по значению φ. (с) Следы последовательностей. В соответствии с другими дополнительными аспектами графический пользовательский интерфейс включает графическое изображение интересующей последовательности в помощь возможным усилиям по дизайну белков. Интересующая последовательность может быть исследуемой последовательностью или последовательностью-кандидатом (т.е. последовательностью ввода), или она может быть последовательностью, в которой интегрированы желательные ковариации (т.е. последовательностью вывода). Интересующая последовательность может быть графически представлена в виде линии. В соответствии с одним вариантом осуществления графический интерфейс включает как (i) отображение интересующей последовательности; так и (ii) структуру сетки (например, интересующую последовательность, наложенную на структуру сетки). В соответствии с другим вариантом осуществления графический интерфейс включает как (i) отображение интересующей последовательности; так и (ii) наложение ковариаций (например, интересующую последовательность, наложенную на структуру ковариаций). В соответствии с другими аспектами графический интерфейс включает (i) отображение интересующей последовательности; (ii) наложение ковариаций и (iii) структуру сетки (например, интересующую последовательность, наложенную (например, трассированную) на структуру ковариаций, которая, в свою очередь, наложена на структуру сетки). Интересующая последовательность может быть показана в виде структуры сетки, например в виде кривой, соединяющей соседние аминокислоты, которые графически показаны в структуре сетки. Показанная таким способом интересующая последовательность называется "следом последовательности". В соответствии с предпочтительными аспектами след последовательности может проходить только через одну ячейку (или графическую репрезентацию типа аминокислоты) для конкретной строки или столбца структуры сетки, которые представляют положение конкретного остатка. Более предпочтительно, если след последовательности проходит через ячейку, графически представляющую тип остатка в конкретном положении интересующей последовательности. След последовательности может проходить через каждую ячейку структуры сетки, которые представляют остаток в интересующей последовательности, и может проходить только через ячейки, представляющие часть интересующей последовательности. Пример следа интересующей последовательности показан на фиг. 103. Отображенные там следы последовательностей (сплайновые кривые типа catmull-rom splines) нарисованы с помощью функции Безье. Если даны два узла и надо нарисовать кривую Безье перехода последовательности, то предыдущий и следующий узлы пары используются как якорные точки, а сами два узла используются как первая и вторая контрольные точки. Для узлов в первом столбце (представляющих первые остатки аминокислотной последовательности) первая контрольная точка удваивается, чтобы играть также роль якорной точки; для узлов в последнем столбце вторая контрольная точка удваивается, чтобы играть также роль якорной точки. В соответствии с предпочтительными аспектами график следа последовательности делают интерактивным и открытым для манипуляций со стороны пользователей. Например, структуру сетки можно сделать интерактивной. В соответствии с одним вариантом осуществления избранным ячейкам можно назначать конкретное состояние выбора (например, положительное, нейтральное или отрицательное состояния). В соответствии с одним примером реализации ячейку, представляющую конкретный остаток, можно положительно выбрать, так чтобы провести след последовательности через нее. Например, если ячейка положительно отобрана пользователем, для всех интересующих последовательностей (например, для всех последовательностей внутри набора сравнения или выравнивания) можно сгенерировать несколько следов, использующих остаток, представленный положительно выбранной ячейкой. В соответствии с альтернативным направлением реализации ячейку, представляющую конкретный остаток, можно - 48 - 015992 выбрать отрицательно, так чтобы след последовательности не проходил через нее. Соответственно для всех интересующих последовательностей (например, для всех последовательностей внутри набора сравнения или выравнивания) можно сгенерировать несколько следов, которые исключают остаток, представленный отрицательно выбранной ячейкой. Можно графически отобразить несколько интересующих последовательностей, если только их сможет различить пользователь (например, используя различную толщину линий или их тип). Например, чтобы сравнить различные выравнивания последовательностей, следы последовательностей, представляющие несколько интересующих последовательностей из двух или более выравниваний, можно наложить на структуру ячейки (например, изобразив их различными цветами, предпочтительно противоположными цветами), визуализировав различное использование остатков в глобальном масштабе. (d) Режимы вывода на экран. Графический интерфейс пользователя может облегчить любую признанную в уровне техники функциональность. Например, в соответствии с определенными аспектами графический интерфейс пользователя обеспечивает прокрутку и зум различных фрагментов структуры сетки. Например, можно изменить размер окна просмотра структуры ячейки в зависимости от разрешения экрана компьютера пользователя, можно увеличивать или уменьшать масштаб изображения и прокручивать изображение выравнивания, которое первоначально не укладывается в окно просмотра. В соответствии с предпочтительными аспектами используется маскировка данных, например, чтобы подчеркнуть наиболее важные ковариационные пары и/или сети из нескольких пар. Графический интерфейс пользователя изобретения может использовать один или несколько режимов просмотра ковариаций (например, статистически значимых ковариаций). Предпочтительно указанные режимы просмотра доступны в интерактивном графике при просмотре следа интересующей последовательности. В качестве примеров можно привести следующие режимы просмотра: Режим № 1: показаны только ковариации между остатками, которые также присутствуют в интересующей последовательности. Можно рассматривать эти ковариации в контексте гипотетического взаимодействия между остатками (например, обнаруживаемых в результате статистического анализа частоты пар остатков), которое удерживает соответствующую молекулу белка вместе и может быть важно для ее функционирования. Режим № 2: показаны только ковариации между парами остатков, у которых только один остаток из пары присутствует в интересующей последовательности. Эти ковариации отражают взаимодейстие между остатками, которое консервативно, но отсутствует в интересующей последовательности, и отсутствие которой может ухудшить стабильность белка. Этот режим особенно предпочтителен, когда для конструирования белка используется инструмент анализа ковариации (см. раздел IV выше). Режим № 3: показаны только ковариации между парами остатков, у которых ни одна аминокислота из пары не присутствует в интересующей последовательности. В соответствии с определенными аспектами все режимы просмотра могут быть показаны пользователю, но каждый в уникальном формате просмотра. В соответствии с другим вариантом осуществления все режимы просмотра выводятся по отдельности (например, в отдельных окнах просмотра). На фиг. 120 показан пример среды, подходящей для практической реализации аспекта изобретения. Компьютеризированное устройство 8900 поддерживает первоначальный процесс сбора последовательности 8902 и средства анализа 8904. В качестве компьютеризированного устройства 8900 может использоваться рабочая станция, сервер, настольный компьютер, мэйнфрейм, PDA или другое вычислительное устройство с одним или несколькими процессорами, поддерживающее первоначальный процесс сбора последовательности 8902 и средства анализа 8904. Компьютеризированное устройство 8900 может представлять собой один процессор или несколько процессоров, а каждый процессор может содержать одно или несколько ядер. Средства анализа 8904 реализованы программно, они анализируют ковариации между парами остатков выравнивания с целью получения данных ковариации. Компьютеризированное устройство 8900 взаимодействует и выводит данные на дисплей вывода 8910. Дисплей вывода 8910 отображает графическую область контакта пользователя (GUI) 8912, генерируемую средствами анализа 8904. GUI 8912 может содержать структуру сетки 8914 и наложение ковариаций 8916. Компьютеризированное устройство 8900 может также взаимодействовать с сетью 8920, включающей одно или больше мест хранения 8930 и 8940, которые соответственно содержат данные о последовательностях 8932 и 8942. Первоначальный процесс сбора последовательности 8902 программно отбирает последовательности-кандидаты из данных о последовательностях 8932 и 8942 на основании введенных пользователем и/или определенных заранее параметров. Извлеченные данные анализируются средствами анализа 8904. Специалист понимает, что, хотя первоначальный процесс сбора последовательности 8902 и средства анализа 8904 показаны на фиг. 120 по отдельности, их можно реализовать как части интегрированного приложения, процесса или подключаемой программы. Аналогично, необходимо понимать, что первоначальный процесс сбора последовательности 8902 и средства анализа 8904 могут и по отдельности представлять собой задачу, поток, процесс, приложение или подключаемую программу. Компьютеризированное устройство 8900 может взимодействовать по сети 8920 с местами хранения 8930 и 8940 с помощью различных сред и конфигураций. Например, сеть 8920 можно организовать в виде локальной сети (LAN), глобальной - 49 - 015992 сети (WAN), сети интранет, Интернет и/или беспроводной сети, телефонной линии или сети другого типа, позволяющей компьютеризированному устройству 8900 взаимодействовать с местами хранения 8930 и 8940. Места хранения 8930 и 8940 могут представлять собой базы данных или структуры данных хранения другого типа, устанавливаемые на компьютеризированных устройствах и доступные по сети 8920. Следует отметить, что, хотя компоненты настоящего изобретения отображены на фиг. 120 в виде отдельной конфигурации, в области настоящего изобретения возможны и другие конфигурации. Например, первоначальный процесс сбора последовательности 8902 и средства анализа 8904 могут располагаться на различных компьютеризированных устройствах, и/или данные последовательностей 8932 и 8942 могут храниться в одной или более баз данных на компьютеризированном устройстве 8900. Фиг. 121 представляет собой пример блок-схемы серии этапов, которые могут сопровождаться аспектом изобретения с целью определения счета ковариации последовательности, используемого как характеристика стабильности белка. Серия начинается с того, что первоначальный процесс сбора последовательности 8902 создает выравнивание исправленного набора последовательностей, соответствующих укладке Ig полипептида (этап 9000). Затем средства анализа 8904 рассчитывают ковариацию между остатками последовательностей выравнивания, как описано здесь, и генерируют данные ковариации (этап 9002). Средства анализа 8904 используют данные ковариации для определения счета ковариации последовательностей применительно к последовательности-кандидату из ковариации данных ковариации (этап 9004). Полученный счет ковариации последовательностей представляет собой индикатор для измерения стабильности полипептида и может сохраняться и/или выводиться пользователю посредством GUI 8912 или другим способом (этап 9006). Как уже упоминалось выше, средства анализа 8904 могут использоваться для определения консенсусного счета. Фиг. 122 представляет собой пример блок-схемы серии этапов, которые могут использоваться аспектом изобретения с целью определения и использования консенсусного счета для прогнозирования стабильности белка-кандидата. Серия начинается с того, что первоначальный процесс сбора последовательности 8902 создает набор сравнения последовательностей, соответствующих последовательности исследуемого домена белка-кандидата (этап 9100). Затем средства анализа 8904 определяют частоты остатков в аминокислотных положениях последовательности исследуемого домена с целью получения консенсусного счета (этап 9102). Полученный консенсусный счет можно затем сохранить и/или вывести пользователю с целью прогнозирования стабильности белка-кандидата (этап 9104). Средства анализа 8904 могут использоваться для определения среднего консенсусного счета. Фиг. 123 представляет собой пример блок-схемы серии этапов, которые могут использоваться аспектом изобретения с целью определения и использования среднего консенсусного счета, используемого как характеристика стабильности белка. Серия начинается с того, что первоначальный процесс сбора последовательности 8902 создает набор сравнения последовательностей, соответствующих последовательности исследуемого домена белка-кандидата (этап 9200). Затем средства анализа 8904 определяют частоты остатков в аминокислотных положениях последовательности исследуемого домена с целью получения консенсусного счета (этап 9202). Кроме того, средства анализа 8904 определяют частоты остатков в последовательности набора сравнения с целью получения среднего консенсусного счета (этап 9204). Консенсусный счет сравнивается со средним консенсусным счетом для определения счета последовательности (этап 9206), а затем полученный счет последовательности можно сохранить и/или вывести пользователю с целью прогнозирования стабильности белка-кандидата (этап 9206). Фиг. 124 представляет собой пример блок-схемы серии этапов, которые могут использоваться аспектом изобретения с целью идентификации и замены аминокислотных остатков, не удовлетворяющих ковариации с коварьирующими остатками в соответствующих положениях выравнивания с целью определения улучшенной аминокислотной последовательности полипептида. Серия начинается с того, что первоначальный процесс сбора последовательности 8902 создает выравнивание исправленного набора сравнения последовательностей, соответствующих укладке Ig полипептида (этап 9300). Затем средства анализа 8904 рассчитывают ковариацию между остатками последовательности выравнивания с целью идентификации коварьирующих остатков (этап 9302). Средства анализа 8904 могут обнаружить конкретный остаток полипептида, который не может удовлетворить ковариации и может замещать коварьирующий остаток в соответствующем положении выравнивания (этап 9304) с целью улучшения последовательности полипептида. Улучшенную последовательность можно сохранить или вывести пользователю (этап 9306). Настоящее изобретение может быть реализовано в виде одной или более читаемых на компьютере программ, сохраняемых на одном или больше носителей. Носители могут представлять собой дискету, жесткий диск, компакт-диск, цифровой двусторонний диск, карту памяти, PROM, MRAM, RAM, ROM или магнитную ленту. В целом компьютерные программы могут быть реализованы на любом языке программирования. Некоторые примеры возможных языков включают FORTRAN, С, C++, С#, Python или Java. Программы можно сохранять на или в одном или нескольких носителей в виде объектного кода. Можно использовать устройствное ускорение, а также весь код или его части могут работать на FPGA, ASIP или ASIC. Код может выполняться также в виртуальном окружении, например на виртуальной ма- 50 - 015992 шине. На одном процессоре может находиться несколько виртуальных машин с выполняющимся кодом. VI. Способы оценки стабильности белков. Свойства стабильности композиций изобретения можно анализировать с использованием способов, известных в уровне техники. Можно использовать характеристики стабильности, принятые в уровне техники. Примеры параметров подробно описаны ниже. В соответствии с демонстративными направлениями реализации оценивают термическую стабильность. В соответствии с предпочтительными аспектами оценивают уровни экспрессии белков (например, выраженные как % выхода) композиций изобретения. В соответствии с другими предпочтительными аспектами оценивают уровни агрегации композиций изобретения. В соответствии с определенными аспектами свойства стабильности композиций изобретения сравнивают с подходящим контролем. Пример контролей включает обычную молекулу scFv. Особо предпочтительным контролем является (Gly4Ser)3 молекула scFv. В соответствии с одним вариантом осуществления измеряют один или больше описанных ниже параметров. В соответствии с одним вариантом осуществления измеряют один или больше этих параметров после экспрессии в клетках млекопитающих. В соответствии с одним вариантом осуществления один или более описанных ниже параметров измеряют в условиях крупномасштабного изготовления (например, экспрессию scFv или включающих scFv молекул в биореакторе). а) Термическая стабильность. Термическую стабильность композиций изобретения можно проанализировать с использованием большого количества (без ограничений) биофизических или биохимических способов, известных в уровне техники. В соответствии с определенными аспектами термическую стабильность оценивают способом аналитической спектроскопии. Примером способа аналитической спектроскопии является дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК). В этом способе используется калориметр, чувствительный к поглощению тепла, сопровождающему развертывание большинства белков и доменов белков (см., например, Sanchez-Ruiz, et al., Biochemistry, 27: 1648-52, 1988). Для того чтобы определить термическую стабильность белка, образец белка помещают в калориметр и поднимают температуру до развертывания Fab или scFv. Температура, при которой развертывается белок, позволяет сделать вывод о его общей стабильности. Еще одним способом аналитической спектроскопии является круговой дихроизм (КД). КДспектрометрия измеряет оптическую активность композиции в зависимости от возрастающей температуры. При этом определяется разница в поглощении левополяризованного и правополяризованного света, обусловленная структурной асимметрией. Спектр КД неупорядоченной и развернутой структуры сильно отличается от спектра упорядоченной и свернутой структуры. Спектр КД отражает чувствительность белка к денатурирующему действию возрастающей температуры и, таким образом, показывает термическую стабильность белка (см. van Mierlo и Steemsma, J. Biotechnol., 79(3):281-98, 2000). Еще одним примером способа аналитической спектроскопии, применяемого для измерения термической стабильности белка, является флуоресцентная эмиссионная спектроскопия (см. van Mierlo и Steemsma, supra). Еще одним примером способа аналитической спектроскопии, применяемого для измерения термической стабильности белка, является спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (см., например, van Mierlo и Steemsma, supra). В соответствии с другими аспектами термическую стабильность композиции изобретения измеряют биохимически. Пример такого способа определения термической стабильности - анализ температурной проверки. В ходе "анализа термической проверки" (thermal challenge assay) композицию изобретения помещают в условия повышенной температуры на заданное время. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления, исследуемые молекулы scFv или молекулы, включающие молекулы scFv, подвергают действию повышенной температуры, например, в течение 1-1,5 ч. Затем активность белка анализируют подходящим биохимическим способом. Например, если белок представляет собой белок связывания (например, scFv или scFv-включающий полипептид изобретения), то активность связывания такого белка можно определить функциональным или количественным ELISA. В соответствии с одним вариантом осуществления такой анализ можно поставить в формате высокопроизводительного скрининга. В соответствии с другим вариантом осуществления библиотеку вариантов scFv можно создать способами, известными в уровне техники. Можно индуцировать экспрессию scFv и подвергнуть эти молекулы термической проверке. После "проверки" образцы анализируют на связывание и стабильные scFv можно масштабировать и охарактеризовать дополнительно. В соответствии с определенными аспектами термическую стабильность оценивают, измеряя температуру плавления ™ композиции изобретения с использованием одной из приведенных выше методик (например, способы аналитической спектроскопии). Температура плавления - температура средней точки на кривой температурного перехода, где 50% молекул композиции находится в свернутом состоянии. В соответствии с другими аспектами термическую стабильность оценивают, измеряя специфичное тепло или теплоемкость (Ср) композиции изобретения с использованием аналитического калориметрического способа (например, ДСК). Специфическое тепло композиции - энергия (например, выраженная в - 51 - 015992 ккал/моль), требуемая для того, чтобы повысить на 1°С температуру 1 моль воды. Большое Ср является признаком денатурировавшей или неактивной белковой композиции. В соответствии с определенными аспектами изменение теплоемкости (ΔСр) композиции измеряют, определяя специфичное тепло композиции до и после термического перехода. В соответствии с другими аспектами термическую стабильность можно оценить, измеряя и определяя другие параметры термодинамической стабильности, включая свободную энергию Гиббса развертывания (ΔG), энтальпию развертывания (ΔН) или энтропию развертывания (ΔS). В соответствии с другими аспектами один или более описанных выше биохимических анализов (например, анализ температурной проверки) применяются для определения температуры (т.е. значения ТС), при которой 50% композиции сохраняет свою активность (например, активность связывания). b) % Агрегации. В соответствии с определенными аспектами стабильность композиции изобретения измеряют, определяя ее склонность к агрегации. Агрегацию можно измерить множеством биохимических и биофизических способов без ограничения. Например, агрегацию композиции изобретения можно оценить с использованием хроматографии, такой как гель-хроматография (Size-Exclusion Chromatograpy (SEC)). SEC разделяет молекулы по их размеру. Колонку наполняют полутвердыми шариками полимерного геля, который пропускает через себя ионы и маленькие молекулы, но задерживает большие. Когда белковую композицию наносят на вершину колонки, компактно свернутые белки (например, неагрегированные белки) оказываются распределены в большем объеме растворителя, чем доступен для больших агрегатов. Соответственно большие агрегаты быстрее проходят через колонку, и таким способом удается разделить смесь, фракционировав ее на компоненты. Каждую фракцию можно оценить количественно (например, по рассеянию света) по мере ее выхода с геля. Соответственно % агрегации состава изобретения можно определить, сравнивая концентрацию фракции с общим содержанием белка, нанесенного на гель. Стабильные композиции элюируют с колонки, фактически, в виде одной фракции и в профиле элюирования или хроматограмме выглядят в виде одного пика. В соответствии с предпочтительными аспектами SEC используется совместно со способом определения светорассеяния (например, классическим или динамическим светорассеянием) для определения процента агрегации композиции. В соответствии с предпочтительными аспектами статическое светорассеяние используется для измерения массы каждой фракции или пика, независимо от формы пика или положения элюирования. В соответствии с другими предпочтительными аспектами динамическое светорассеяние используется для измерения гидродинамического размера композиции. Другие примеры способов оценки стабильности белков включают высокоскоростную SEC (High-Speed SEC (см., например, Corbett et al., Biochemistry. 23(8): 1888-94, 1984)). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления % агрегации определяется путем измерения доли агрегатов белка в его образце. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления % агрегации белка определяется путем измерения доли свернутого белка в его образце. c) % Выхода. В соответствии с другими аспектами стабильность композиции изобретения оценивают путем измерения количества белка, восстановленного (здесь "% выхода") после его экспрессии (например, рекомбинантной экспрессии). Например, % выхода можно измерить, определяя количество миллиграмм белка, восстановленного на каждый мл среды культуры клеток-хозяев (т.е. мг/мл белка). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления % выхода определяют после экспрессии в хозяйских клетках млекопитающих (например, в клетке СНО). d) % Потери. В соответствии с другими аспектами стабильность композиции изобретения оценивают путем мониторинга потери белка в диапазоне температур (например, от -80 до 25°С) после хранения в течение определенного времени. Количество и концентрацию восстановленного белка можно определить любым известным способом количественного анализа белков и сравнить с начальной концентрацией белка. Примеры способов количественного анализа белков включают анализ SDS-PAGE и способ анализа Брэдфорда (Bradford, et al., Anal. Biochem. 72, 248 (1976)). Предпочтительный способ оценки потери белка использует любой из описанных здесь аналитических способов SEC. Необходимо понимать, что измерения % потери можно выполнить для любых требуемых состояний хранения или составов хранения, включая, например, лиофилизированный белок. е) % Протеолиза. В соответствии с другими аспектами стабильность композиции изобретения оценивают путем определения количества белка, протеолизируемого после хранения в стандартных условиях. В соответствии с примером реализации протеолиз определяют способом SDS-PAGE образца белка, при котором количество интактного белка сравнивают с количеством фрагментов белка низкого молекулярного веса, представленного в геле SDS-PAGE. В соответствии с другим примером реализации протеолиз определяют способом масс-спектрометрии (MS), в соответствии с которым количество белка ожидаемого молекулярного веса сравнивают с количеством белковых фрагментов низкого молекулярного веса в образце. - 52 - 015992 f) Сродство связывания. В соответствии с дополнительными аспектами стабильность композиции изобретения можно оценить путем определения его сродства связывания с мишенью. Известно большое количество способов определения сродства связывания. В качестве примера такого способа можно привести поверхностный плазмонный резонанс. Поверхностный плазмонный резонанс представляет собой оптическое явление, позволяющее анализировать биоспецифичные взаимодействия в режиме реального времени путем детекции изменения концентрации белков в биосенсорной матрице, например, с помощью системы BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden и Piscataway, NJ). Дополнительную информацию см. в работах Jonsson, U., et al. (1993), Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991), Biotechniques 11:620627; Johnsson, В., et al. (1995), J. Mol. Recognit. 8:125-131; и Johnnson, В., et al. (1991), Anal. Biochem. 198:268-277. g) Другие исследования стабильности. В соответствии с другими аспектами стабильность композиции изобретения можно определить, количественно измеряя связывание меченого соединения с денатурированным и развернутым фрагментом связывающей молекулы. Такие молекулы предпочтительно гидрофобны, так как они предпочтительно связываются и взаимодействуют с большими гидрофобными группами аминокислот, обычно находящимися в глубине нативного белка, но экспонируемые денатурированной или развернутой связывающей молекуле. Примером меченого соединения является гидрофобный флуоресцентный краситель, 1анилино-8-нафталин сульфонат (ANS). VII. Способы выбора стабильных белков. Описанные здесь способы прогнозирования стабильности белков могут использоваться также для выбора белка-кандидата (например, антител) для дальнейшего использования. В соответствии с определенными аспектами способы изобретения используются для выбора белка для экспрессии. В соответствии с другими аспектами способы изобретения используются для выбора белка-кандидата для модификации. В соответствии с демонстративными направлениями реализации способы прогнозирования изобретения могут использоваться в процессе гуманизации нечеловеческих донорных антител (например, чтобы выбрать иммуноглобулин-акцептор). Белок-кандидат можно выбрать на основании его общего консенсусного счета или счета последовательности, определенных способами изобретения. В соответствии с определенными аспектами белок-кандидат выбирают, если его консенсусный счет больше, чем подходящий отрицательный контроль (например, больше 5%, предпочтительно больше 10%, более предпочтительно больше 20%). В соответствии с другими аспектами белок-кандидат выбирают, если его консенсусный счет фактически такой же (например, укладывается в 20, 10 или 5%) или больше (например, больше 5%, предпочтительно больше 10%, более предпочтительно больше 20%) подходящего положительного контроля. В соответствии с другими аспектами белок-кандидат выбирают, если его консенсусный счет в значительной степени такой же, что и идеальный или правильный консенсусный счет (например, укладывается в 30%, предпочтительно в 20%, более предпочтительно в 10%). В соответствии с другими аспектами белок-кандидат выбирают, если его счет последовательности больше нуля. В соответствии с одним вариантом осуществления белок-кандидат выбирают, если его счет последовательности больше 0,5. В соответствии с другим вариантом осуществления белок-кандидат выбирают, если его счет последовательности больше 1. В соответствии с другим вариантом осуществления белок-кандидат выбирают, если его счет последовательности больше 2. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления белок-кандидат выбирают, если его счет последовательности больше 3. В соответствии с другими аспектами белок-кандидат выбирают, если его Δ-счет не меньше -3, не меньше -2 или не меньше -1, предпочтительно не меньше 0, более предпочтительно не меньше 1. а. Выбор акцепторного иммуноглобулина для гуманизации антител. Гуманизированные антитела можно получить рекомбинантными способами ДНК, см., например, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989), 86:10029-10033; Jones et al., Nature (1986), 321:522-25; Riechmann et al., Nature (1988), 332:323-27; Verhoeyen et al., Science (1988), 239:1534-36; Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989), 86:3833-37; патенты США № 5225539, 5530101, 5585089, 5693761, 5693762, 6180370. Если для гуманизации выбрано предпочтительное нечеловеческое донорное антитело, то соответствующее человеческое акцепторное антитело можно получить, например, из генов баз данных последовательностей экспрессируемых человеческих антител, из зародышевых последовательностей Ig или из консенсусных последовательностей нескольких человеческих антител. Скорее всего, введение нечеловеческих участков CDR в каркас человеческого вариабельного домена приведет к сохранению их корректной пространственной ориентации, если каркас человеческого вариабельного домена примет такую же или похожую конформацию, что и у нечеловеческого вариабельного каркаса, из которого взят CDR. Это достигается выделением человеческих вариабельных доменов из человеческих акцепторных антител, каркасные последовательности которых демонстрируют высокую степень идентичности последовательностей с нечеловеческими вариабельными доменами, из которых эти CDR были получены. Каркасные вариабельные области тяжелых и легких цепей можно получить из одних и тех же или разных последовательностей антител человека. Предпочтительно, чтобы человеческое акцепторное антитело - 53 - 015992 сохраняло канонические и остатки области контакта донорного антитела. Кроме того, предпочтительно, чтобы человеческое акцепторное антитело проявляло значительное сходство по длине петель CDR. См. Kettleborough et al., Protein Engineering 4:758 (1991); Kolbinger et al., Protein Engineering 6:971 (1993) и Carter et al., WO 92/22653. Идентифицировав области CDR донорного антитела и соответствующее человеческое акцепторное антитело, надо определить, какие (если есть) остатки этих компонентов следует заменить, чтобы оптимизировать свойства полученного гуманизированного антитела. Как правило, некоторые или все аминокислоты легкой или тяжелой цепи нечеловеческого, донорного иммуноглобулина, необходимые для связывания антигена (например, один или больше CDR), замещают соответствующие аминокислоты легкой или тяжелой цепи человеческого акцепторного антитела. Человеческое акцепторное антитело сохраняет некоторые или все аминокислоты, не требуемые для связывания антигена. При необходимости один или больше остатков человеческих каркасных областей можно заменить на остатки из соответствующих положений мышиных антител, чтобы сохранить сродство связывания гуманизированного антитела к антигену. Это изменение иногда называют обратной мутацией. Некоторые аминокислоты человеческих вариабельных каркасных областей выбирают для обратной мутации на основании их возможного влияния на конформацию CDR и/или связывание с антигеном. Иногда, однако, процесс гуманизации приводит к неестественным изменениям в вариабельном домене, вносящим в гуманизированное антитело нежелательную нестабильность. Например, акцепторный иммуноглобулин может содержать редкие вариации в последовательности, которые придают ей низкую стабильность. Это особенно верно для некоторых зародышевых последовательностей, которые могут не использоваться часто иммунной системой. Способы изобретения включают усовершенствованные способы гуманизации. В частности, способы изобретения позволяют опытному специалисту спрогнозировать, какая исследуемая последовательность (например, зародышевая исследуемая последовательность) с набором сравнения акцепторных последовательностей кандидатов (например, зародышевых последовательностей) будет приемлемо стабильна для использования при гуманизации акцепторной последовательности. Исследуемые акцепторные последовательности (например, зародышевые последовательности), обладающие счетом, который позволяет спрогнозировать приемлемую стабильность (например, с высоким консенсусным счетом по сравнению со средним консенсусным счетом набора сравнения), можно выбрать как акцепторный иммуноглобулин. VIII. Основанные на библиотеках способы идентификации стабилизированных молекул scFv. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способам идентификации молекул scFv с повышенной стабильностью белка, например с повышенной термической стабильностью. Способы изобретения включают следующие: (i) получение библиотеки, включающей молекулы-кандидаты scFv; и (ii) скрининг библиотеки для идентификации молекул-кандидатов, стабильность которых повышена по сравнению с подходящим контролем (например, контрольной молекулой scFv). Здесь термин "молекула-кандидат scFv" означает молекулу scFv, полученную путем введения одной или более стабилизирующих мутаций в молекулу scFv, где эффект стабилизирующей мутации на стабильность молекулы scFv заранее неизвестен, т.е. молекулу scFv, в которую была введена мутация и которую необходимо проанализировать, чтобы определить, привела ли мутация к повышению стабильности. В соответствии с одним вариантом осуществления молекула-кандидат scFv формируется путем введения одной или больше стабилизирующих мутаций в обычную (т.е. нестабилизированную) молекулу scFv. В соответствии с другим вариантом осуществления молекула-кандидат scFv формируется путем введения одной или больше стабилизирующих мутаций в стабилизированную молекулу scFv, описанную в разделе II. "Библиотека молекул-кандидатов scFv" здесь означает по меньшей мере две не избыточные молекулы-кандидаты scFv, предпочтительно по меньшей мере 10, особо предпочтительно по меньшей мере 100 и чрезвычайно предпочтительно по меньшей мере 1000 (например, по меньшей мере около 104, 105, 106, 107 или 108 молекул scFv). В соответствии с одним вариантом осуществления библиотека рандомизируется, при этом неспецифичные мутации генерируются случайным образом по всей молекуле. В соответствии с другим вариантом осуществления библиотека рандомизируется частично или конструируется. Это означает, что конкретные аминокислотные остатки или их класс вводятся случайным образом в любой позиции scFv или для мутагенеза неспецифицированными аминокислотными остатками, остатками конкретного класса или конкретными остатками выбираются конкретные положения аминокислот. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления библиотеку scFv конструируют, замещая указанный остаток молекулы scFv аминокислотой заданного класса, например гидрофобной аминокислотой, основной аминокислотой, гидрофильной аминокислотой, заряженной аминокислотой, аминокислотой с объемными группами (большими или маленькими) или цистеином, способным образовывать дисульфидные мостики. В соответствии с определенными аспектами библиотека scFv включает молекулы-кандидаты scFv со стабилизирующими мутациями, которые включены в вариабельную область (VL и/или VH) молекулы scFv. В соответствии с другими аспектами библиотека scFv включает молекулы-кандидаты scFv со ста- 54 - 015992 билизирующими мутациями, которые включены в линкер scFv молекулы scFv. В соответствии с другими аспектами библиотека scFv включает молекулы-кандидаты scFv со стабилизирующими мутациями, которые включены в линкер scFv молекулы scFv, и стабилизирующими мутациями, которые включены в вариабельный область (VL и/или VH) молекулы scFv. а. Дизайн библиотек scFv. В помощь способам конструирования библиотек scFv можно использовать молекулярное или компьютерное моделирование. В соответствии с определенными аспектами дизайн библиотеки можно проводить in silico. В соответствии с определенными аспектами библиотеку scFv можно сконструировать с использованием следующего двухстадийного подхода: 1) идентификация аминокислотных остатков мишени scFv, которые при внесении в них мутаций (например, путем замены аминокислотных остатков) согласно прогнозу повышают стабильность scFv (здесь "кандидатуры дестабилизирующих остатков"); и 2) замена аминокислотных остатков мишеней кандидатурами стабилизирующих остатков. Этап 1. Идентификация кандидатур дестабилизирующих остатков. В соответствии с определенными аспектами кандидатуры дестабилизирующих аминокислотных остатков можно идентифицировать анализом, основанным на последовательности. Например, кандидатуры дестабилизирующих аминокислотных остатков можно определить, сравнивая последовательности вариабельных областей scFv с набором сравнения последовательностей вариабельных областей, например последовательностей вариабельных областей природных человеческих антител, и выбирая такие аминокислотные остатки scFv, наличие которых в соответствующих аминокислотных положениях набора сравнения необычно, или они встречаются там редко. В соответствии с предпочтительными аспектами анализируют только каркасные области последовательностей вариабельных областей scFv, а области, определяющие комплементарность (CDR) вариабельных областей, консервируют, чтобы не испортить связывающую активность молекул scFv. В соответствии с определенными аспектами кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка отсутствует в соответствующем положении набора сравнения гомологичных последовательностей вариабельной области или присутствует там редко. Способы компилирования набора сравнения описаны в разделах III-V настоящего изобретения. В соответствии с предпочтительными аспектами кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка присутствует в соответствующих положениях менее чем 10% последовательностей набора сравнения. В соответствии с более предпочтительными аспектами кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка присутствует в соответствующих положениях менее чем 5% последовательностей набора сравнения. В соответствии с особенно предпочтительными аспектами кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка присутствует в соответствующих положениях менее чем 2% последовательностей (например, 0,5, 0,75 или 1%) набора сравнения. В соответствии с другим вариантом осуществления кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка отличается от аминокислоты в соответствующем положении консенсусной последовательности набора сравнения последовательностей вариабельной области (т.е. консенсусного аминокислотного остатка). Способы определения консенсусной последовательности набора сравнения описаны в разделах III-V настоящего изобретения. В соответствии с другим вариантом осуществления кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка характеризуется низким консенсусным счетом. Способы определения консенсусного счета аминокислотного остатка описаны в разделах III-V настоящего изобретения. В соответствии с одним вариантом осуществления кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка характеризуется консенсусным счетом менее 0,5 (например, менее 0,4, менее 0,3, менее 0,2 или менее 0,1). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления кандидатура дестабилизирующего аминокислотного остатка характеризуется консенсусным счетом менее 0,3. Этап 2. Выбор кандидатур стабилизирующих мутаций. Определив одну или более кандидатур дестабилизирующих аминокислотных остатков, далее надо для каждого дестабилизирующего аминокислотного остатка выбрать одну или более кандидатур стабилизирующих мутаций. Библиотеку scFv можно затем так сконструировать, чтобы она включала репрезентативные кандидатуры молекул scFv для каждой выбранной кандидатуры стабилизирующих мутаций. В соответствии с определенными аспектами каждый природный аминокислотный вариант конкретной дестабилизирующей аминокислоты выбирают в качестве кандидатуры стабилизирующей мутации (т.е. 19 кандидатур стабилизирующей мутации для каждой дестабилизирующей аминокислоты). В соответствии с более предпочтительными аспектами в качестве кандидатуры стабилизирующей мутации выбирают подмножество природных аминокислотных вариантов конкретной дестабилизирующей аминокислоты (т.е. 1-18 кандидатур стабилизирующих аминокислот для каждой дестабилизирующей аминокислоты). В соответствии с одним вариантом осуществления подмножество кандидатур стабилизирующих мутаций включает замены аминокислот определенного класса, например гидрофобных аминокислот, основных аминокислот, гидрофильных аминокислот, заряженных аминокислот и стерически объемных аминокислот (маленьких либо больших). - 55 - 015992 В соответствии с одним вариантом осуществления подмножество кандидатур стабилизирующих мутаций включает замены аминокислот, присутствующих с высокой частотой в положениях дестабилизирующих аминокислот в наборе сравнения гомологичных последовательностей вариабельных областей. В соответствии с предпочтительными аспектами кандидатура стабилизирующей мутации включает замены аминокислотами, представленными в базе данных с частотой более 10%. В соответствии с более предпочтительными аспектами аминокислоты представлены в базе данных с частотой более 15%. В соответствии с еще более предпочтительными аспектами аминокислоты представлены в базе данных с частотой более 20%. В соответствии с еще более предпочтительными аспектами аминокислоты представлены в базе данных с частотой более 25%. В соответствии с другим вариантом осуществления кандидатура стабилизирующей мутации представляет собой замену консенсусной аминокислотой (т.е. наиболее частым остатком), включающейся в наборе сравнения в положении дестабилизирующей аминокислоты. В соответствии с другим вариантом осуществления подмножество кандидатур стабилизирующих мутаций включает замены каждой аминокислотой из набора сравнения гомологичных последовательностей вариабельных областей, присутствующих в положении дестабилизирующей аминокислоты. Соответственно библиотеку scFv можно так спроектировать, чтобы она включала репрезентативную кандидатуру молекулы scFv для каждой кандидатуры стабилизирующей мутации из набора сравнения. В соответствии с другими аспектами подмножество кандидатур стабилизирующих мутаций можно идентифицировать и расставить приоритеты для скрининга путем анализа (например, визуального или на компьютере) трехмерной структуры или модели вариабельной области молекулы scFv. Трехмерная структура полипептида влияет на его биологическую активность и стабильность, и эту структуру можно определить и спрогнозировать различными способами. Четвертичную структуру можно спрогнозировать, строя модель трехмерных структур одного или более гомологичных белков (или белковых комплексов) с известными трехмерными структурами. Возможно, лучшим способом определения структуры белков является рентгеновская кристаллография (соответственно, термин "кристаллическая структура" можно использовать вместо термина "структура"), но можно сделать определенные оценки на основании данных кругового дихроизма, рассеяния света или измеряя поглощение и эмиссию лучистой энергии. Другие полезные методики включают дифракцию нейтронов, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и моделирование гомологии. Все эти способы хорошо известны специалистам и описаны в типовых учебниках (см., например, Physical Chemistry, 4th Ed., W.J. Moore, Prentiss-Hall, N.J., 1972 или Physical Biochemistry, K.E. Van Holde, Prentiss-Hall, N.J., 1971)) и многочисленных публикациях. Все эти способы позволяют определить структуру молекулы, включающей вариабельную область молекулы scFv (например, антитела, Fab или самой молекулы scFv). Структуру вариабельной области можно моделировать in silico. Например, совместимость кандидатуры стабилизирующей мутации с трехмерной структурой можно проанализировать, моделируя на компьютере замену дестабилизирующей мутации на кандидатуру стабилизирующей мутации. Кандидатура стабилизирующей мутации может быть выбрана для включения в библиотеку scFv, если она совместима с общей структурой молекулы scFv. В соответствии с одним вариантом осуществления кандидатура стабилизирующей мутации может быть отобрана, если она не мешает естественному свертыванию или конформации вариабельной области молекулы scFv или одному или нескольким областям, определяющим комплементарность (CDR). В соответствии с другим вариантом осуществления кандидатура стабилизирующей мутации может быть отобрана, если она не мешает способности вариабельной области формировать нативную область контакта VL/VH. В соответствии с определенными аспектами кандидатура стабилизирующей мутации может быть отобрана путем применения технологии повторной упаковки боковых цепей к структуре (например, кристаллической структуре или модели) вариабельной области. В ходе расчетов повторной упаковки боковых цепей кандидатуры стабилизирующих остатков можно модифицировать на компьютере, и стабильность полученных мутантов также оценивают на компьютере. Расчеты повторной упаковки боковых цепей генерируют ранжированный список мутаций, изменяющих стабильность (т.е. изменяющих внутримолекулярную энергию). Число белковых мутантов, оцениваемых вычислительными способами, может быть очень большим, так как каждое вариабельное аминокислотное положение можно мутировать во все 20 стандартных аминокислот. Примеры компьютерных алгоритмов, используемых для ранжирования результатов компьютерного анализа, включают алгоритмы устранения тупиков и поисков по дереву (см., например, Lasters et al. (Protein Eng. 8:815-822, 1995), Looger и Hellinga (J. Mol. Biol. 307:429-445, 2001), и Dahiyat и Mayo (Protein Sci. 5:895-903, 1996)). Соответственно библиотеку scFv можно сконструировать так, чтобы она включала репрезентативные кандидаты молекул scFv для каждой кандидатуры стабилизирующей мутации с максимальным рангом из ранжированного списка мутаций, генерированного расчетом по способу повторной упаковки боковых цепей. В соответствии с определенными аспектами выбирают, по меньшей мере, мутацию с максимальным рангом (например, одну мутацию с максимальным рангом, две мутации с максимальным рангом, три мутации с максимальным рангом, четыре мутации с максимальным рангом и пять мутаций с максимальным рангом). - 56 - 015992 b. Конструирование библиотек scFv. Определив кандидатуры стабилизирующих мутаций для включения в библиотеку scFv, получить кандидатуры молекул scFv, включающих мутации, можно любым из множества доступных способов. Такие полипептиды можно, например, производить рекомбинантными способами. Более того, из-за дегенерации генетического кода для кодирования каждой желаемой scFv можно использовать множество последовательностей нуклеиновых кислот. Примеры признаваемых способов получения молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей кандидатуру молекулы scFv, включают, но не ограничиваются, сайт-направленный (или опосредованный нуклеотидами) мутагенез, ПЦР мутагенез и кассетный мутагенез ранее приготовленных ДНК, кодирующих кандидата scFv. Сайт-направленный мутагенез представляет собой предпочтительный способ приготовления вариантов замены. Эта технология хорошо известна в уровне техники (см., например, Carter et al. Nucleic Acids Res. 13:4431-4443 (1985) и Kunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1987)). Кратко, при выполнении сайт-направленного мутагенеза ДНК родительская молекула ДНК изменяется сначала путем гибридизации олигонуклеотида, кодирующего желательную мутацию, в одной цепочке такой родительской ДНК. После гибридизации ДНК-полимераза используется для синтеза целой второй цепочки, при этом гибридизованный олигонуклеотид выступает в роли праймера, а одна цепь родительской ДНК - в роли образца. Таким способом кодирующий желательную мутацию олигонуклеотид встраивается в полученную двухцепочечную ДНК, которая затем может быть лигирована в плазмиду или другой подходящий вектор. Для получения молекул-кандидатов scFv подходит также ПЦР-мутагенез. См. Higuchi, in PCR Protocols, p. 177-183 (Academic Press, 1990); и Vallette et al., Nuc. Acids Res. 17:723-583 (1989). Кратко, когда небольшие количества образца ДНК используются в качестве исходного материала в ПЦР, праймеры, последовательность которых слегка отличается от последовательности соответствующей области образца ДНК, можно использовать для генерации относительно больших количеств специфичного фрагмента ДНК, отличающегося от последовательности образца только в тех положениях, в которых праймеры отличаются от образца. Праймеры ПЦР могут также быть сконструированы так, чтобы включать сайты рестрикции, так что продукт ДНК ПЦР-реакции можно было затем непосредственно лигировать в плазмиду или другой подходящий вектор. Другой способ приготовления вариантов, кассетный мутагенез, основан на технике, описанной в работе Wells et al., Gene 34:315-323 (1985). Исходный материал - это плазмида (или другой вектор), включающий исходную полипептидную ДНК, которую предстоит мутировать. Идентифицируются кодоны родительской ДНК, которые предстоит мутировать. На каждой стороне идентифицированных сайтов мутации должны быть уникальные сайты эндонуклеазы рестрикции. Если таких сайтов нет, их необходимо сгенерировать с помощью описанного выше способа олигонуклеотид-опосредованного мутагенеза и ввести в соответствующие положения исходной полипептидной ДНК. Для линеаризации ДНК плазмиды разрезается по этим сайтам. Двухцепочечный олигонуклеотид, кодирующий последовательность ДНК между сайтами рестрикции, но включающий желаемые мутации, синтезируют с помощью стандартных процедур, причем две цепочки нуклеотида синтезируют по отдельности, а затем гибридизуют стандартными способами. Такой двухцепочечный олигонуклеотид называется кассетой. 5' и 3' концы кассеты должны быть совместимы с концами линеаризованной плазмиды, так что она может быть непосредственно лигирована туда. Вышеприведенными способами можно сгенерировать репрезентативные аминокислоты для каждой кандидатуры молекулы scFv. Затем нуклеиновые кислоты можно клонировать в векторы экспрессии с формированием библиотеки векторов экспрессии. Затем хозяйские клетки трансформируют полученной библиотекой векторов и выращивают в соответствующих условиях, чтобы экспрессировать кандидатуры молекул scFv. с. Способы скрининга. Библиотеку scFv изобретения можно скринировать в анализе (например, в высокопроизводительном способе анализа), чтобы идентифицировать кандидатуры молекул scFv с желательной стабильностью. Такой анализ может использовать любой из способов для оценки стабильности белка, описанные в разделе VI выше. Особо предпочтительным способом является анализ термической стабильности. Такие способы анализа в целом вовлекают сравнение термической стабильности кандидатуры молекулы scFv с подходящим контролем и выбор кандидатуры молекулы scFv, если ее термическая стабильность больше, чем у контроля. Примеры подходящих контролей включают обычные молекулы scFv, например молекулу (Gly4Ser)3scFv. Кандидатуры молекул scFv могут быть отобраны, если их термическая стабильность больше контроля приблизительно на 0,1, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10°С. В примере реализации кандидатуры молекулы scFv отбирают, если их термическая стабильность больше контроля приблизительно на 3°С. Библиотеки scFv можно представить в различных форматах анализа. Например, молекулы scFv можно представить в растворе (например, Houghten (1992), Biotechniques 13:412-421), на шариках (Lam (1991), Nature 354:82-84), чипах (Fodor (1993), Nature 364:555-556), в бак- 57 - 015992 териях (Ladner USP 5223409), спорах (Ladner USP '409) или на фаге (Scott и Smith (1990), Science 249:386390); (Devlin (1990), Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991), J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner supra.). В соответствии с демонстративными направлениями реализации кандидатуры молекул scFv анализируют в виде раствора. В соответствии с одним вариантом осуществления каждый образец включает аликвоту раствора с кандидатурами молекул scFv, обладающими одной и той же кандидатурой стабилизирующей мутации или мутаций. Такой раствор можно сгенерировать, выделяя колонии индивидуальных клеток-хозяев из библиотеки хозяйских клеток, трансформированных библиотекой плазмид экспрессии, и выращивая эти колонии в соответствующем сосуде в условиях, облегчающих экспрессию молекул scFv. В соответствии с одним вариантом осуществления кандидатуры молекул scFv можно выделить из клеток-хозяев и заново растворить в соответствующем растворе для анализа. В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления кандидатуры молекулы scFv сплавляют с отщепляемой последовательностью сигнального пептида, так что молекула scFv секретируется хозяйской клеткой в клеточную среду. В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления хозяйские клетки можно выращивать в условиях, когда кандидатуры молекулы scFv выделяются в среду совместно с белками хозяйской клетки. Иногда может быть желательно автоматизировать любой из описанных выше форматов анализа. Например, можно использовать роботизированные установки для выделения каждого члена семейства scFv (например, в виде индивидуальной колонии хозяйских клеток), позволяющих это делать быстро, так что их можно анализировать в различных сосудах. Примеры таких сосудов включают планшеты для микротитрования (например, 96-луночные планшеты), пробирки (обычные и микроцентрифужные). d. Дополнительная оптимизация стабилизированных молекул scFv. Стабильную молекулу scFv, идентифицированную описанными выше способами скрининга, можно ремоделировать и дополнительно оптимизировать, чтобы улучшить стабильность белка. Так, описанные выше этапы можно повторить со стабильной молекулой scFv, обнаруженной на начальном этапе оптимизации. Альтернативно, стабилизирующие мутации из двух или более стабилизированных молекул scFv можно объединить в одной молекуле scFv, чтобы еще больше повысить стабильность белка. В соответствии с определенными аспектами стабильную молекулу scFv, идентифицированную способами изобретения, можно дополнительно оптимизировать. Например, в нее можно внести одно или больше следующих дополнительных изменений. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная молекула scFv может быть стабилизирована еще больше путем ввода дисульфидной связи, связывающей аминокислоту из домена VL и аминокислоту из домена VH. Примеры дисульфидных связей включают любые связи, описанные в разделе II выше. Особо предпочтительной дисульфидной связью является связь VH44-VL100. В соответствии с другими аспектами идентифицированная способами изобретения стабильная молекула scFv может быть далее оптимизирована путем ввода scFv линкера с оптимальной длиной или композицией. Примеры scFv-линкеров описаны в разделе II выше. Особо предпочтительным scFv линкером является (Gly4Ser)4. В соответствии с другим вариантом осуществления стабильная молекула scFv, идентифицированная способами изобретения, может быть оптимизирована еще больше путем ввода стабилизирующей мутации по меньшей мере в один из доменов VH или VL. IX. Способы стабилизации связывающих молекул. В соответствии с другими аспектами изобретение относится к способам повышения свойств стабильности связывающих молекул. В общем случае, эти способы включают включение или добавление стабилизированной молекулы scFv изобретения к связывающей молекуле. К удивлению, было обнаружено, что, как показано в приведенных ниже рабочих примерах, молекулы scFv изобретения не только стабильны сами по себе, но также и улучшают стабильность связывающих молекул, в которые они были включены. Соответственно способы изобретения предоставляют удобные и надежные средства улучшения стабильности коммерчески значимых связывающих молекул, крупномасштабное производство которых часто бывает ограничено плохой стабильностью (например, полиспецифичных антител (например, биспецифичных антител) и других модифицированных антител). Стабилизированные молекулы scFv можно встроить в связывающие молекулы способами конъюгации белков, хорошо известными в уровне техники. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная scFv сплавляется непосредственно с N- или С-концами полипептида, например, молекулы антитела. В соответствии с другим вариантом осуществления, чтобы связать стабилизированную scFv с N- или С-концами полипептида, используется непептидный линкер. В соответствии с еще одним вариантом осуществления для связи стабилизированной scFv с полипептидом используется связывающий пептид. В соответствии с примером реализации связывающим пептидом является короткий пептид, обогащенный парами gly/ser. Примеры таких пептидов приведены в табл. 1 ниже. Другие примеры связывающих пептидов хорошо известны в уровне техники (см., например, International PCT Application Nos. WO 2005/000898 и WO 2005/000899). В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированную scFv изобретения связывают с С-терминальным концом связывающей молекулы, например - 58 - 015992 молекулы антитела, линкером S(G4S)3. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированную scFv изобретения связывают с N-терминальным концом связывающей молекулы, например молекулы антитела, линкером (G4S)5. Таблица 1 Связывающие пептиды В соответствии с одним вариантом осуществления по меньшей мере одну стабилизированную молекулу scFv присоединяют к молекуле антитела с получением биспецифичной молекулы. В соответствии с другим вариантом осуществления две стабилизированные молекулы scFv присоединяют к молекуле антитела с получением биспецифичной молекулы. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления стабилизирование связывающих молекулы изобретения приводит к повышению выхода по сравнению с обычными молекулами scFv или связывающими молекулами, включающими обычные молекулы scFv. Способы оценки выхода описаны в разделе VI. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула, полученная способами изобретения, улучшает выход по меньшей мере на 1% по сравнению с нестабилизированной связывающей молекулой. В соответствии с другими аспектами стабилизированная связывающая молекула, полученная способами изобретения, улучшает выход по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75% или по меньшей мере на 100% по сравнению с нестабилизированной связывающей молекулой. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления связывающие молекулы изобретения снижают агрегацию по сравнению с обычными молекулами scFv или связывающими молекулами, включающими обычные молекулы scFv. Способы оценки агрегации описаны в разделе VI. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула, полученная способами изобретения, уменьшает агрегацию по меньшей мере на 1% по сравнению с нестабилизированной связывающей молекулой. В соответствии с другими аспектами стабилизированная связывающая молекула уменьшает агрегацию по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75% или по меньшей мере на 100% по сравнению с нестабилизированной связывающей молекулой. В соответствии с другими аспектами связывающие молекулы изобретения увеличивают срок хранения или долгосрочную стабильность по сравнению с обычными молекулами scFv или связывающими молекулами, включающими обычные молекулы scFv. Способы оценки полужизни включают % потери или % протеолиза, описанные в разделе VI. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула, полученная способами изобретения, повышает срок хранения по меньшей мере на один день по сравнению с нестабилизированной связывающей молекулой. Это означает, что препарат из связывающих молекул включает, фактически, такое же количество связывающих молекул, как было накануне. В соответствии с другими аспектами стабилизированная связывающая молекула повышает срок хранения по меньшей мере на два дня, по меньшей мере на пять дней, по меньшей мере на неделю, по меньшей мере на две недели, по меньшей мере на один месяц, по меньшей мере на два месяца, по меньшей мере на шесть месяцев или по меньшей мере на один год по сравнению с нестабилизированной связывающей молекулой. В соответствии с другими аспектами связывающие молекулы изобретения улучшают стабильность, например при экспрессии в клетках-хозяевах конкретных типов по сравнению с обычными молекулами scFv или связывающими молекулами, включающими обычные молекулы scFv. В соответствии с демонстративными направлениями реализации способы изобретения приводят к получению связывающих молекул, характеризующихся повышенной стабильностью (например, улучшенным выходом), при экспрессии в клетках-хозяевах, например, бактерий или эукариотов (например, грибков или млекопитающих). Примеры клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичек китайского хомячка (Chinese Hamster Ovary (CHO)), клетки HELA (human cervical carcinoma, карцинома шейки матки человека), клетки CVI (monkey kidney line, линия почек мартышек), клетки COS (производные CVI с антигеном SV40 Т), клетки R1610 (Chinese hamster fibroblast, фибробласты китайского хомячка), клетки BALBC/3T3 (фибробласты мыши), клетки HAK (hamster kidney line, линия почек хомячка), клетки SP2/O (миелома мыши), клетки BFA-1c1BPT (бычьи эндотелиальные клетки), RAJI (человеческие лимфоциты) - 59 - 015992 и клетки 293 (почка человека). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления две стабилизированные молекулы scFv присоединяются к молекуле антитела с созданием стабилизированной биспецифичной молекулы для секреции в клетках СНО. В соответствии с другими аспектами клетки-хозяева, способные экспрессировать стабилизированные связывающие молекулы, можно проскринировать, чтобы выбрать изоляты отдельных клеток, способные экспрессировать высокие уровни солюбилизированных и правильно свернутых стабилизированных связывающих молекул (например, связывающих молекул, демонстрирующих менее чем 10% агрегацию). В таких способах может использоваться сортировка флуоресцентно активируемых клеток (технология FACS) (см., например, Brezinky et al., J. Immunol Meth (2003). 277:141-155). В соответствии с одним вариантом осуществления изоляты отдельных клеток адаптируются к бессывороточной среде, чтобы получить стабильную линию клеток-производителей. Такую линию можно затем выращивать, чтобы облегчить крупномасштабное производство стабилизированной связывающей молекулы изобретения. В соответствии с другими аспектами способы изобретения используются для повышения стабильности связывающей молекулы, экспрессируемой клетками-хозяевами в большой объем культуральной среды. В соответствии с демонстративными направлениями реализации способы изобретения приводят к повышению стабильности (например, к увеличению выхода), если связывающая молекула экспрессируется по меньшей мере в 1 л культуральной среды. В соответствии с другими аспектами способы изобретения используются для получения стабилизированной связывающей молекулы с увеличенной стабильностью (например, выходом) при экспрессии из клеток-хозяев по меньшей мере в 2 л, по меньшей мере в 10 л, по меньшей мере в 20 л, по меньшей мере в 50 л, по меньшей мере в 75 л, по меньшей мере в 100 л, по меньшей мере в 200 л или по меньшей мере в 500 л культуральной среды. В соответствии с примером реализации способы изобретения используются для получения по меньшей мере 10 мг стабилизированной связывающей молекулы на каждый литр культуральной среды. X. Стабилизированные связывающие молекулы, включающие стабилизированные молекулы scFv. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению представляет собой химерный белок. Например, стабилизированную молекулу scFv изобретения можно связать со второй молекулой scFv или молекулой не scFv. В соответствии с одним вариантом осуществления молекула не scFv, с которой может быть связана стабилизированная молекула scFv изобретения, включает по меньшей мере один дополнительный сайт связывания. Например, сайты связывания, которые возможно ввести в связывающую молекулу изобретения, включают рецепторсвязывающий участок лиганда, лигандсвязывающий участок рецептора, субстратсвязывающий фрагмент фермента, ферментсвязывающий фрагмент субстрата или один или более антигенсвязывающих участков антитела. Молекулы scFv можно связать, например, с молекулами антител с формированием модифицированных молекул антител или с другими пептидами с формированием химерных белков. Ниже описано несколько примеров этих процессов. А. Модифицированные молекулы антител. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная молекула scFv изобретения связывается с антителом или его фрагментом с формированием стабилизированного белка связывания, которые представляет собой модифицированное антитело. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированная scFv изобретения связывается с модифицированным антителом, т.е. не встречающейся в природе молекулой антитела, с формированием стабилизированного белка связывания. Ниже подробнее описаны предпочтительные конструкты из модифицированных антител. Термин "модифицированное антитело" здесь включает синтетические формы антител, измененных таким образом, чтобы они не встречались в природе, например антитела, включающие по меньшей мере два фрагмента тяжелой цепи, но не две полные тяжелые цепи (например, антитела без доменов или мини-тела); полиспецифичные формы антител (например, биспецифичные, триспецифичные и т.д.), измененные так, чтобы связывать два или больше различных антигенов или два разных эпитопа на одном антигене. Кроме того, термин "модифицированное антитело" включает поливалентные формы антител (например, трехвалентные, четырехвалентные и т.д. антитела, связывающиеся с тремя или больше копиями одного антигена). Необходимо понимать, что при описании связывающих молекул изобретения описываемые здесь особенности связывания можно реализовать, введя стабилизированную молекулу scFv изобретения, связывающую молекулу, включающую молекулу scFv изобретения или и то, и другое. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированные связывающие белки изобретения могут быть иммунореактивны с одним или более опухолевыми антигенами или антигенами, ассоциированными с иммунными расстройствами. Например, для неопластических расстройств сайт связывания (т.е. вариабельная область, иммунореактивный фрагмент или их рекомбинант) рассматриваемой связывающей молекулы связывается с выбранным ассоциированным с опухолью антигеном в месте злокачественного новообразования. Аналогично, в соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула может связываться по меньшей мере с одним избранным маркером, присутствующим в иммунных клетках. С учетом числа известных антигенов, ассоциированных с неоплазиями и иммунными расстройствами, и числа связанных с ними антител, специалист поймет, что раскрываемые в настоящем - 60 - 015992 изобретении молекулы могут быть получены из любого из множества антител. Обобщая, можно сказать, что используемые в настоящем изобретении полипептиды могут быть получены из любого антитела (включая описанные ранее в литературе), которые реагируют с молекулой или маркером, ассоциированным с выбранным состоянием. Далее, родительские антитела, антитела-предшественники и их фрагменты, используемые для генерации стабилизированных связывающих молекул изобретения, могут быть мышиными, человеческими, химерными, гуманизированными, из нечеловеческих приматов и приматизированными. Термин "антигены, ассоциированные с опухолями" здесь включает антигены, которые в целом ассоциированы с опухолевыми клетками, например экспрессируются в опухолевых клетках. Обобщая, можно сказать, что антигены, ассоциированные с опухолями, включают антигены, предусмотренные для локализации иммунореактивных антител в неопластических клетках, независимо от их экспрессии в незлокачественных клетках. Такие антигены могут быть относительно специфичны для опухоли, например их экспрессия может быть ограничена поверхностью злокачественных клеток. Альтернативно, такие антигены могут содержаться как в злокачественных, так и в незлокачественных клетках. Например, CD20 предсталяет собой антиген пан-В, включающийся на поверхности как злокачественных, так и незлокачественных В-клеток, который оказался чрезвычайно эффективной мишенью для иммунотерапевтических антител при лечении лимфоны не-Ходжкинса. В этом отношении пан-Т-клеточные антигены, такие как CD2, CD3, CD5, CD6 и CD7, также содержат антигены, ассоциированные с опухолями, попадающие в область настоящего изобретения. Другие примеры ассоциированных с опухолями антигенов включают, но не ограничиваются, MAGE-1, MAGE-3, MUC-1, HPV 16, HPV E6 и Е7, TAG-72, СЕА, L6-антиген, CD19, CD22, CD37, CD52, HLA-DR, EGF-рецептор и HER2-рецептор. Об иммунореактивных антителах для каждого из этих антигенов часто сообщалось в публикациях. Специалисты понимают, что каждое из этих антител может служить предшественником антител изобретения в соответствии с настоящим изобретением. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированные связывающие молекулы изобретения предпочтительно ассоциированы и связываются с описанными выше антигенами, ассоциированными с опухолями и иммунитетом. Соответственно как более подробно рассматривается далее, стабилизированные связывающие молекулы настоящего изобретения можно выделить, сгенерировать или изготовить из любого из множества антител, реагирующих с антигенами, ассоциированными с опухолями. В соответствии с определенными аспектами стабилизированные связывающие молекулы изобретения представляют собой антитела без доменов, которые получают обычными способами генетической инженерии, причем по меньшей мере один или более доменов константных областей удалены или заменены, так чтобы получить желательные биохимические характеристики, такие как сниженный период полужизни в сыворотке. Более конкретно, специалист легко может выделить генетическую последовательность, соответствующую вариабельным и/или константным областям стабилизированной связывающей молекулы, и изменить или удалить соответствующие нуклеотиды с получением полипептидов изобретения для использования в виде мономерных субъединиц в соответствии с настоящим изобретением. Известные антитела, реагирующие с ассоциированными с опухолями антигенами, могут быть стабилизированы, как описано здесь, с получением стабилизированных связывающих молекул настоящего изобретения. Примеры антител, которы могут использоваться для получения антигенсвязывающих областей с целью генерации или выделения описанных здесь стабилизированных связывающих молекул, включают, но не ограничиваются, 2В8 и С2В8 (Зевалин® и Ритуксан®, IDEC Pharmaceuticals Corp., San Diego), Lym 1 и Lym 2 (Techniclone), LL2 (Immunomedics Corp., New Jersey), HER2 (Герцептин®, Genentech Inc., South San Francisco), B1 (Бексар®, Coulter Pharm., San Francisco), Кампат® (Millennium Pharmaceuticals, Cambridge), абаговомаб (Menarini, Italy), CEA-Scan™ (Immunomedics, Morris Plains, NJ), капромаб (Prostascint®, Cytogen Corp.), едреколомаб (Panorex®, Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ), иговомаб (CIS Bio Intl., France), митумотмаб (ВЕС2, Imclone Systems, Somerville, NJ), нофетумомаб (Verluma®, Boehringer Ingleheim, Ridgefield, CT), ОваРекс (Altarex Corp., Waltham, MA), сатумомаб (Onoscint®, Cytogen Corp.), цеткусимаб (Erbitux®, Imclone Systems, New York, NY), бевацизумаб (AVASTIN®, Genentech Inc., S. San Francisco, CA), аполизумаб (REMITOGEN™, Protein Design Labs, Fremont, CA), лабетузомаб (CEACIDE™, Immunomedics Inc., Morris Plains, NJ), пертузумаб (OMNITARG™, Genentech Inc., S. San Francisco, CA), MB1, ВН3, В4, B72,3 (Cytogen Corp.), CC49 (National Cancer Institute) и 5Е10 (University of Iowa). Другие сайты связывания, которые можно включить в связывающие мишень молекулы, выбирают в следующем списке: Ортоклон ОКТ3 (CD3), РеоПро (Gpllb/glla), Зепанах (С25), Ремикад (TNF-α), Симулект (CD25), Синагис (RSV), Милотарг (CD33) и Кампат (CD52). В соответствии с предпочтительными аспектами стабилизированные связывающие молекулы настоящего изобретения связываются с такими же ассоциированными с опухолями антигенами, как и перечисленные выше антитела. В соответствии с особенно предпочтительными аспектами стабилизированные связывающие молекулы получены из (и связаны с) одними и теми же антигенами, такими как 2B8, С2В8, СС49 и С5Е10, и даже более предпочтительно в них полностью или частично отсутствует домен CH2. - 61 - 015992 В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению может содержать один или более сайтов связывания, полученных из одного или более следующих антител: тоситумомаб (Бекксар®), муромонаб (ОРТОКЛОН®) и ибритумомаб (ЗЕВАЛИН®), цетуксимаб (ЕРБИТУБ™), ритуксимаб (МАБТЕРА®/РИТУКСАН®), инфликсимаб (РЕМИКАД®), абциксимаб (РЕОПРО®) и базиликсимаб (СИМУЛЕКТ®), ефализумаб (РАПТИВА®), бевацизумаб (АВАСТИН®), алемтузумаб (КАМПАТ®), трастузумаб (ГЕРЦЕПТИН®), гемтузумаб (МИЛОТАРГ®), паливизумаб (СИНАГИС®), омализумаб (КСОЛАИР®), даклизумаб (ЗЕНАПАКС®), натализумаб (ТИЗАБРИ®) и ранибизумаб (ЛУВЕНТИС®), адалимумаб (ХУМИРА®) и панитумумаб (ВЕКТИБИКС®). В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению связывается с CD23 (US патент 6011138). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению связывается с тем же эпитопом, что и антитело 5Е8. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один CDR (например, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 CDR) из анти-CD23 антитела, например антитела 5Е8. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению связывается с TNF-рецептором. В соответствии с одним примером реализации стабилизированная связывающая молекула по изобретению связывается с LTβR. В соответствии с другим примером реализации стабилизированная связывающая молекула по изобретению связывается с TRAILрецептором. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению включает по крайней мере один CDR (например, по крайней мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 CDR) из анти-TRAIL-R2 антитела (например, мышиного или химерного 14А2). В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению включает по крайней мере один CDR из анти-LTβR антитела. Примеры анти-LTβR антител включают BKA11, CDH10, BCG6, AGH1, BDA8, СВЕ11 и ВНА10. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению связывается с CRIPTO-I антигеном (WO 02/088170 A2 или WO 03/083041 A2). В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению связывается с тем же эпитопом, что и B3F6 антитело. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению включает по крайней мере один CDR из анти-CRIPTO-I антитела, например B3F6 антитела. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула связывается с тем же ассоциированным с опухолью антигеном, что и Ритуксан®. Ритуксан® (также известный как ритуксимаб, IDEC-C2B8 и С2В8) был первым одобренным FDA моноклональным антителом для лечения человеческой лимфомы В-клеток (см. патенты США № 5843439; 5776456 и 5736137, каждый из которых включен сюда по ссылке). Y2B8 (90Y меченый 2В8; Зевалин®; ибритумонаба тиуксетан) представляет собой мышиного предка С2В8. Ритуксан® - это химерное, анти-CD20 моноклональное антитело, которое ингибирует рост и согласно имеющейся информации сенситизирует определенные клетки лимфомы к апоптозу под действием химиотерапевтических агентов in vitro. Антитело эффективно связывается с человеческим комплементом, проявляет сильное связывание FcR и может эффективно убивать человеческие лимфоциты in vitro посредством как комплемент-зависимого (CDC), так и антителозависимого (ADCC) механизмов (Reff et al., Blood 83: 435-445 (1994)). Специалисты понимают, что димерные варианты (гомодимеры или гетеродимеры) С2В8 или 2В8, модифицированные в соответствии с настоящим изобретением, могут использоваться в конъюгированной или неконъюгированной формах для эффективного лечения пациентов с опосредованными CD20+ злокачественными новообразованиями. Обобщая, необходимо понимать, что рассматриваемая здесь стабилизированная связывающая молекула может использоваться как в "голом", или неконъюгированном состоянии, так и быть конъюгирована с цитотоксическим агентом для эффективного лечения любого из расстройств. В соответствии с другими предпочтительными аспектами настоящего изобретения стабилизированная связывающая молекула по изобретению получается из или связывается с тем же ассоциированным с опухолью антигеном, что и СС49. СС49 связывается с человеческим ассоциированным с опухолью антигеном TAG-72, который ассоциирован с поверхностью некоторых опухолевых клеток человеческого происхождения, конкретно, линии клеток LS174T. LS174T [American Type Culture Collection (herein ATCC) № CL 188] представляет собой вариант линии клеток аденокарциномы толстого кишечника LS180 (ATCC № CL 187). Следует также понимать, что было разработано множество мышиных моноклональных антител со специфичностью связывания с TAG-72. Одно из этих моноклональных антител, а именно В72.3, представляет собой мышиный IgGI, полученный из гибридомы В72.3 (ATCC № HB-8108). B72.3 представляет собой моноклональное антитело первого поколения, разработанное с использованием экстракта карциномы молочной железы человека как иммуноген (см. Colcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78:31993203 (1981); патенты США № 4522918 и 4612282, все эти работы влючены сюда по ссылке). Другие моноклональные антитела, направленные против TAG-72, помечены как "СС" (для рака толстого кишечни- 62 - 015992 ка). Как описано в работе Schlom et al. (патент США № 5512443, которая влючена сюда по ссылке), моноклональные СС антитела представляют собой семейство мышиных моноклональных антител второго поколения, полученных с использованием TAG-72, очищенных с помощью В72,3. Из-за своего относительно хорошего сродства связывания с TAG-72 следующие СС антитела были включены в АТСС, и к ним открыт ограниченный доступ: СС49 (ATCC № НВ 9459); СС83 (ATCC № НВ 9453); СС46 (ATCC № HB 9458); СС92 (АТТСС № НВ 9454); СС30 (ATCC № НВ 9457); СС11 (ATCC № 9455); СС15 (ATCC № НВ 9460). Патент U.S.P.N. 5512443 также показывает, что рассматриваемые там антитела можно превратить в их химерные формы, замещая, например, домены человеческих константных областей (Fc) на мышиные константные области рекомбинантными способами ДНК, известными в уровне техники. Помимо описанных мышиных и химерных анти-TAG-72 антител, Schlorn et al. получили также варианты гуманизированного СС49 антитела, как описано в работе PCT/US99/25552, и одноцепочечные конструкты, как описано в патенте США № 5892019, каждая из которых включена сюда по ссылке. Специалисты понимают, что каждое из описанных антител, конструктов и рекомбинантов, а также их вариаций можно модифицировать и использовать для получения полипептидов в соответствии с настоящим изобретением. Помимо описанных выше анти-TAG-72 антител, разнообразные группы исследователей сообщали о конструкциях и частично характеризовали бездоменные СС49 и 1372,3 антитела (например, Calvo et al. Cancer Biotherapy, 8(1):95-109 (1993), Slavin-Chiorini et al. Int. J. Cancer 53:97-103 (1993) и Slavin-Chiorini et al. Cancer. Res. 55:5957-5967 (1995)). Остальные предпочтительные аспекты настоящего изобретения содержат сайты связывания, производные от и связывающиеся с теми же опухоль-ассоциированными антигенами, что и С5Е10. Как отмечено в совместно поданной заявке 09/104717, С5Е10 представляет собой антитело, распознающее гликобелковую детерминанту весом приблизительно 115 кДа, специфичную для клеточных линий рака простаты (например, DU145, РС3 или ND1). Так, в соответствии с настоящим изобретением, стабилизированные связывающие молекулы (например, антител без CH3 доменов), которые специфично связываются с таким же ассоциированным с опухолью антигеном, распознаваемым С5Е10 антителами, можно получить и использовать в конъюгированной или неконъюгированной форме для лечения неопластических расстройств. В соответствии с особо предпочтительными аспектами стабилизированная связывающая молекула является производной (или включает весь или часть антигенсвязывающей области от С5Е10 антитела, выделяемого из клеточной линии гибридомы с АТСС № PTA-865). Полученная стабилизированная связывающая молекула может затем быть конъюгирована с радионуклидом, как описано ниже, и введена пациенту, больному раком простаты, в соответствии с описанными здесь способами. В соответствии с вариантами осуществления стабилизированная связывающая молекула изобретения включает по крайней мере одну описанную здесь специфичность связывания, например описанную в секции С. В соответствии с другим вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению может связываться с молекулой интересующей мишени, например, описанной здесь, например, в секциях В или С. Ранее известные антитела, реагирующие с антигенами, которые ассоциированы с расстройствами иммунных клеток (например, расстройствами В-клеток), могут быть стабилизированы, как описано здесь, образуя стабилизированные связывающие молекулы настоящего изобретения. Примеры антител, которые могут использоваться для получения антигенсвязывающих областей с последующей генерацией и извлечением описываемых здесь стабилизированных связывающих молекул, включают, но не ограничиваются, анти-TNFα антитело (например, инфликсимаб (Ремикад®, Центокор, Хоршам, PA); MAK195F (Abbott Labs., Abbott Park, IL); адалимумаб (Хумира®, Abbott Labs, Abbott Park, IL)); анти-CD3 антитело (например, Ортоклон (OKT3®, OrthoBiotech, Bridgewater, NJ); MEDI-500 (Medimmune, Gaithersburg, MD); визилизумаб (NUVION®, Protein Design Labs (Fremont, CA, USA)); анти-IgE антитело (например, омализумаб, XOLAIR®, Genentech, South San Francisco, CA); анти-VLA-4 антитело (например, ТИСАБРИ, Biogenldec, Cambridge, MA); анти-CD147 антитело (например, ABX-CBL (Abgenix, Fremont, CA)); анти-CD25 антитело (например, базиликсимаб, Simulect® (East Hanover, NJ); инолиномаб (OPI, France)); анти-CD18 антитело (например, одулимомаб, Антилфа®, Pateur Meriuex, France); анти-1МСА90 (например, сулесомаб, Лейкоскан®, Immunomedics, Morris Plains, NJ); анти-Gpllb/glla антитело (например, абциксимаб, РеоПро®, Центокор, Хоршам, РА); анти-С25 антитело (например, Зенапакс); анти-СР33 антитело (например, Милотарг) и анти-CD25 антитело (например, алемтузумаб, Кампат® (Milleneum Pharmaceuticals, Cambridge, MA)). В соответствии с предпочтительными аспектами стабилизированная связывающая молекула настоящего изобретения связывается с теми же ассоциированными с иммунными клетками антигенами, что и антитела, перечисленные в этом абзаце. В соответствии с одним вариантом осуществления термин "модифицированное антитело" в соответствии с настоящим изобретением включает иммуноглобулины, антитела или их иммунореактивные фрагменты или рекомбинанты, в которых по крайней мере часть одного или более константных областей доменов была удалена или изменена другим способом, так чтобы получить требуемые биохимические характеристики, такие как способность к нековалентной димеризации, улучшенная способность локали- 63 - 015992 зации в сайте опухоли или сниженный период полужизни в сыворотке по сравнению с целым, неизмененным антителом, приблизительно такой же иммуногенности. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления полипептиды настоящего изобретения представляют собой бездоменные антитела, включающие полипептидную цепочку, подобную тяжелой цепи иммуноглобулина, но в которых отсутствует по меньшей мере часть одного или нескольких доменов тяжелой цепи. В соответствии с одним вариантом осуществления один целый домен константной области стабилизированного белка связывания будет удален. В соответствии с другим вариантом осуществления удаляются все или часть CH3 домена. В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированные белки связывания изобретения представляют собой мини-тела. Мини-тела представляют собой димерные молекулы, состоящие из двух полипептидных цепочек, каждая из которых включает стабилизированную молекулу scFv (один полипептид включает один или более антигенсвязывающих сайтов, например, VL домен связан гибким линкером с VH доменом, гибридизованным с CH3 доменом с помощью связывающего пептида). Мини-тела можно получать, конструируя компонент scFv и связывающий пептид-CH3 компонент, используя описанные в уровне техники способы (см., например, патент США № 5837821 или WO 94/09817А1). Эти компоненты можно выделить из различных плазмид как фрагменты рестрикции и затем лигировать и реклонировать в соответствующий вектор. Верифицировать правильную сборку можно рестрикционным поглощением и анализом последовательности ДНК. В соответствии с другим вариантом осуществления можно сконструировать четырехвалентное мини-тело. Четырехвалентные мини-тела конструируют таким же способом, что и мини-тела, но только две молекула scFv связывают гибким линкером, например, включающим аминокислотную последовательность (G4S)4G3AS. В соответствии с одним вариантом осуществления четырехвалентные антитела можно получить, комбинируя кодирующие антитело последовательности ДНК с молекулой scFv. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления эти последовательности объединяют так, что молекула scFv оказывается связанной со стороны своего N-конца с CH3 доменом антитела через гибкий линкер (например, gly/ser линкер, такой как (Gly4Ser)3). В соответствии с еще одним вариантом осуществления четырехвалентное антитело можно изготовить гибридизацией стабилизированных молекул scFv со связывающим пептидом, который гибридизован с CH1 доменом с получением стабилизированной scFv-Fab четырехвалентной молекулы (Coloma и Morrison, 1997, Nature Biotechnology. 15:159; WO 95/09917). В соответствии с одним вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению включает четырехвалентное или биспецифичное четырехвалентное антитело с scFv со стороны N-конца легкой цепи. В соответствии с другим направлением реализации изобретения связывающая молекула включает четырехвалентное или биспецифичное четырехвалентное антитело без домена CH2 с scFv со стороны N-конца тяжелой цепи. В соответствии с одним вариантом осуществления прикрепление scFv к N-концу приводит к снижению агрегации молекул по сравнению с молекулами, у которых scFv прикреплен к карбоксиконцу. Антитела или их фрагменты, используемые в стабилизированных связывающих молекулах изобретения, могут быть получены с помощью известных протоколов. Например, сначала антитела выращивают в организме млекопитающих, делая им множественные подкожные или внутрибрюшинные инъекции соответствующего антигена (например, очищенных ассоциированных с опухолями антигенов или включающих такие антигены клетки или клеточные экстракты) и адъюванта. Эта иммунизация, обычно, вызывает иммунный ответ, включающий производство антиген-реактивных антител активированными спленоцитами или лимфоцитами. Хотя образующиеся антитела можно собрать в сыворотке животного и получить поликлональный препарат, часто бывает желательно изолировать индивидуальные лимфоциты из селезенки, лимфотических узлов или периферической крови, получив гомогенные препараты моноклональных антител (Mab). Предпочтительно выделять лимфоциты из селезенки. В соответствии с этим хорошо известным способом (Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)) относительно короткоживущие и смертные лимфоциты млекопитающих, которым были сделаны инъекции антигена, сплавляют с бессмертной опухолевой клеточной линией (например, линией миеломы), получая тем самым гибридные клетки или гибридомы, одновременно бессмертные и способные генерировать генетически закодированное антитело В-клеток. Полученные гибриды сегрегируют в отдельные клеточные штаммы, отбирая, разбавляя и заново выращивая каждый индивидуальный штамм, включающий специфичные гены для образования отдельного антитела. Они производят антитела, гомогенные относительно желательного антигена и по сравнению с их чистым генетическим предком называемые "моноклональными". Приготовленные таким способом клетки гибридомы высевают и выращивают в подходящей культуральной среде, предпочтительно включающей одно или более веществ, ингибирующих рост или выживание негибридизованных родительских клеток миеломы. Специалисты понимают, что реагенты, клеточные линии и среды для образования, селекции и роста гибридом коммерчески доступны из большого количества источников, а также установлены стандартизированные протоколы. В общем случае культу- 64 - 015992 ральная среда, в которой растут клетки гибридомы, анализируется на производство моноклональных антител против желательного антигена. Предпочтительно, если специфичность связывания моноклональных антител из клеток гибридомы определяют иммуноосаждением или анализами in vitro, такими как радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА или enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA)). После идентификации клеток гибридомы, производящих антитела желательной специфичности, сродства и/или активности, клоны можно субклонировать, ограничивая процедуры разбавления и роста стандартными способами (Goding, Monoclonal Антител: Principles и Practice, pp 59-103 (Academic Press, 1986)). Необходимо понимать также, что моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно отделить от культуральной среды, удалить жидкость и сыворотку стандартными процедурами очистки, такими как, например, белок-А, гидроксилапатит хроматография, гельэлектрофорез, диализ или аффинная хроматография. В соответствии с другим вариантом осуществления ДНК, кодирующие желательные моноклональные антитела, можно легко выделить и секвенировать обычными способами (например, с помощью олигонуклеотидных зондов, способных специфично связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). Выделенные и субклонированные клетки гибридомы служат предпочтительным источником ДНК. После выделения ДНК можно поместить в векторы экспрессии, затем трансфицируемые в прокариотические и эукариотические клетки-хозяева, такие как Е.coli, обезьяньи клетки COS, клетки яичников китайского хомячка (СНО) и клетки миеломы, которые в другом случае не производят иммуноглобулины. Более конкретно выделенную ДНК (которую можно и синтезировать описанными здесь способами) можно использовать для клонирования последовательностей константных и вариабельных областей для изготовления антител, как описано в работе Newman et al., US Pat. № 5658570, подана 25, 1995, включенной сюда по ссылке. Фактически, процесс включает в себя экстракцию РНК из выбранных клеток, преобразование ее в кДНК и амплификацию ее способом ПЦР с использованием Igспецифичных праймеров. Подходящие для этой цели праймеры описаны в US Pat. № 5658570. Как подробно обсуждается ниже, экспрессирующие желаемые антитела трансформированные клетки можно вырастить в относительно больших количествах, получив клинические и коммерческие источники иммуноглобулина. Специалисты должны понимать, что ДНК, кодирующие антитела или их фрагменты (например, антигенсвязывающие сайты), можно также получить из библиотек фагов антител, например, по технологии pd phage или Fd phagemid. Примеры способов описаны, например, в ЕР 368684 В1; патент US 5969108, Hoogenboom, H.R. и Chames. 2000. Immunol. Today 21:371; Nagy et al. 2002. Nat. Med. 8:801; Huie et al. 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:2682; Lui et al. 2002. J. Mol. Biol. 315:1063, каждый из которых включен сюда по ссылке. Некоторые публикации (например, Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992)) описали производство человеческих антител высокого сродства способом тасования цепей, а также комбинаторной инфекцией и in vivo рекомбинацией как стратегии конструирования больших библиотек фагов. В соответствии с другим вариантом осуществления для замены бактериофага можно использовать рибосомальный дисплей в качестве платформы дисплея (см., например, Hanes et al. 2000. Nat. Biotechnol. 18:1287; Wilson et al. 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:3750; или Irving et al. 2001 J. Immunol. Methods 248:31). В соответствии с еще одним вариантом осуществления библиотеки клеточной поверхности можно скринировать на наличие антител (Boder et al. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:10701; Daugherty et al. 2000, J. Immunol. Methods 243:211). Такие процедуры представляют собой альтернативу традиционным гибридомных технологиям выделения и последующего клонирования моноклональных антител. В соответствии с другим направлением реализации настоящего изобретения сайт связывания связывающей молекулы изобретения можно получить из человеческого или в значительной степени человеческого антитела. Последние можно изготовить в трансгенных животных (например, мыши), неспособных к эндогенному производству иммуноглобулина (см., например, US Pat. № 6075181, 5939598, 5591669 и 5589369, каждый из которых включен сюда по ссылке). Например, показано, что гомозиготное удаление областей, объединяющих тяжелые цепи антител в химерных и зародышевых линиях мутантных мышей, приводит к полному ингибированию эндогенной выработки антител. Перенос гена человеческого иммуноглобулина в такой зародышевый мутант приводит к продукции человеческого антитела после действия антигена. Другие предпочтительные способы генерации человеческих антител с помощью мыши SCID описаны в US Pat. № 5811524, который включен сюда по ссылке. Необходимо понимать, что связанный с этими человеческими антителами генетический материал можно также выделить и манипулировать с ним, как описано в настоящем изобретении. Еще одно высокоэффективное средство генерации рекомбинантных антител описано в работе Newman, Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992). Конкретно, этот способ приводит к генерации приматизированных антител, включающих вариабельные домены мартышки и константные последовательности человека. Эта работа включена сюда по ссылке во всей своей полноте. Более того, указанная техника описана также в US Pat. № 5658570, 5693780 и 5756096, каждый из которых включен сюда по ссылке. В соответствии с другим вариантом осуществления лимфоциты можно выбрать путем микроманипулирования и изоляции вариабельных генов. Например, моноядерные клетки периферической крови можно - 65 - 015992 выделить из иммунизированного млекопитающего и выращивать in vitro около 7 дней. Культуры затем скринируют на наличие специфичных IgG, соответствующих критериям скрининга. Можно выделять клетки из ячеек с положительным ответом. Индивидуальные Ig-продуцирующие В-клетки выделяют способом FACS или идентифицируя их путем анализа способом комплемент-опосредуемых гемолитических плашек, Ig-продуцирующими В-клетками можно манипулировать в пробирке, амплифицируя гены VH и VL, например, способом RT-PCR. Гены VH и VL можно клонировать в вектор экспрессии антитела и трансфицировать в клетки (например, эукариотические или прокариотические) для экспрессии. Более того, генетические последовательности, пригодные для продукции связывающих молекул настоящего изобретения, можно получить из большого количества разнообразных источников. Например, как широко рассматривалось выше, большое количество генов человеческих антител доступно в публичных хранилищах. Опубликовано множество последовательностей антител и антител-кодирующих генов, и подходящие гены антител можно химически синтезировать из этих последовательностей известными способами, методики синтеза олигонуклеотидов, совместимые с этим аспектом изобретения, хорошо известны специалистам, и их можно выполнить в любом из нескольких коммерчески доступных автоматизированных синтезаторов. Кроме того, последовательности ДНК, кодирующие описанные здесь тяжелые и легкие цепи различных типов, можно получить у коммерческих производителей. Полученный любыми из описанных выше способов генетический материал можно затем изменять с получением полипептидов настоящего изобретения. Альтернативно, продуцирующие антитела клеточные линии можно выбрать и выращивать способами, хорошо известными квалифицированным специалистам. Такие технологии описаны в большом количестве лабораторных руководств и первичных публикаций. В этом отношении описанные далее подходящие для использования в настоящем изобретении способы приведены в работе Current Protocols in Immunology, Coligan et al., Eds., Green Publishing Associates и Wiley-lnterscience, John Wiley и Sons, New York (1991), которая включена сюда по ссылке во всей своей полноте, включая приложения. Понятно также, что область настоящего изобретения охватывает стабилизированные связывающие молекулы, включающие аллели, варианты и мутации известных антигенсвязывающих последовательностей ДНК и стабилизированных молекул scFv изобретения. Как хорошо известно, РНК могут быть выделены из первоначальных клеток гибридомы или из других трасформированных клеток стандартными способами, такими как экстракция и осаждение гуанидин изотиоцианатом с последующим центрифугированием или хроматографией. При желании, из общей РНК можно выделить мРНК стандартными способами, такими как хроматография на олиго дТ целлюлозе. Соответствующие технологии известны в уровне техники. В соответствии с одним вариантом осуществления кДНК, кодирующая легкую и тяжелую цепи антитела, можно сделать, одновременно или по отдельности, с использованием обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы в соответствии с хорошо известными способами. ПЦР можно инициировать праймерами консенсусного константной области или более специфичными праймерами, основанными на опубликованных данных о ДНК и аминокислотных последовательностях тяжелых и легких цепей. Как уже рассматривалось выше, ПЦР можно также использовать для выделения клонов ДНК, кодирующих легкие и тяжелые цепи антител. В этом случае библиотеки можно скринировать консенсусными праймерами или более крупными гомологичными зондами, такими как зонды мышиных константных областей. ДНК, обычно плазмидную ДНК, можно выделить из клеток известными способами, рестрикционно картировать и секвенировать в соответствии со стандартными, хорошо известными методиками, подробно описанными, например, в следующих далее ссылках. Конечно, ДНК можно синтезировать в соответствии с настоящим изобретением в любой момент процесса выделения или последующего анализа. Примеры антител или их фрагментов для использования в связывающих молекулах изобретения включают антитела, распознающие описанные далее мишени. В соответствии с определенными аспектами антигенсвязывающие фрагменты антител можно продуцировать с помощью хорошо известных технологий. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению может содержать молекулу антитела и стабилизированную молекулу scFv. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению может содержать фрагмент молекулы антитела и стабилизированную молекулу scFv. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает фрагмент антитела и стабилизированную молекулу scFv. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению может содержать антитело без домена и стабилизированную молекулу scFv. Антитело без домена представляет собой молекулу антитела, в котором один или больше доменов частично или полностью удалены. В соответствии с особо предпочтительными аспектами совместимые стабилизированные связывающие молекулы содержат конструкты без доменов или их варианты, у которых удален весь домен CH2 (CH3 конструкты). В соответствии с другими предпочтительными аспектами короткий связывающий пептид можно заместить удаленным доменом, чтобы обеспечить гибкость и свободу перемещения вариабельной области. Специалисты понимают, что такие конструкты особо предпочтительны в связи с регулирующими свойствами CH3 домена на скорость ката- 66 - 015992 болизма антитела. Конструкты с удаленными доменами можно получить с помощью вектора (например, от IDEC Pharmaceuticals, San Diego), кодирующего IgG1 человеческий константный домен (см., например, WO 02/060955A2 и WO 02/096948A2). Следует отметить, что эти примеры конструктов были сконструированы, чтобы сплавить CH3 домен непосредственно с окраинной областью соответствующих полипептидов изобретения. В случае других конструктов может быть желательно ввести пептидный спэйсер между окраинными областями и синтетическими доменами CH3 и/или CH3. Например, совместимые конструкты можно экспрессировать, если был удален домен CH3, а оставшийся CH3 домен (синтетический или несинтетический) объединен с окраинными областями 5-20 аминокислотным спэйсером. Такой спэйсер можно добавить, например, чтобы гарантировать, что регуляторные элементы константного домена остаются свободными и доступными, или что окраинный область остается гибким. Например, можно использовать конструкт без домена B3F6 с коротким аминокислотным спэйсером, замещенным доменом CH3, и нижними окраинными областями (B3F6.(CH3 [gly/ser])). Известны и другие примеры связывающих пептидов (см., например, International PCT Application Nos. WO 2005/000898 и WO 2005/000899). Эти пептиды можно использовать совместно со связывающими молекулами изобретения. Предпочтительно, если связывающий пептид используется с полипептидом, в котором отсутствует домен тяжелой цепи СН2. Предпочтительно, чтобы любой связывающий пептид, совместимый с настоящим изобретением, был относительно не-иммуногенным и не ингибировал нековалентную ассоциацию полипептидов изобретения. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает тяжелую цепь иммуноглобулина с делециями или заменами нескольких или даже одного аминокислотного остатка, если только она разрешает желательную ковалентную или нековалентную ассоциацию между мономерными субъединицами. Например, мутации одного аминокислотного остатка в выбранных областях CH3 домена может оказаться достаточно, чтобы существенно снизить Fc связывание и, тем самым, увеличить локализацию опухоли. Аналогично, может быть желательно просто удалить ту часть одного или нескольких доменов константных областей, которые контролируют модулируемую эффекторную функцию (например, связывание комплемента). Такие пространственные делеции константных областей могут улучшить избранные характеристики антитела (период полужизни в сыворотке), оставив интактными другие желательные функции, ассоциированные с доменом константной области. Более того, как показано выше, константные области описываемых антител могут быть синтетическими в связи с мутацией или заменой одной или нескольких аминокислот, которые усиливают профиль полученного конструкта. В этом отношении можно разрушить активность, вносимую консервативным сайтом связывания (например, Fc-связывания), сохраняя конфигурацию и иммуногенный профиль стабилизированной связывающей молекулы. Дополнительные предпочтительные аспекты могут включать добавление одной или нескольких аминокислот к константной области, чтобы усилить желательные характеристики, такие как эффекторную функцию, и получить больше цитотоксинов и углеводов в среде. В соответствии с такими аспектами может быть желательно включить или реплицировать специфичные последовательности, взятые из выбранных доменов константной области. Известно в уровне техники, что константная область опосредует несколько эффекторных функций. Например, связывание с антителами компонента C1 комплемента активирует комплементарную систему. Активизация комплемента важна для опсонизации и лизиса клеточных патогенов. Активизация комплемента также стимулирует воспалительный ответ и может быть вовлечена в аутоиммунную гиперчувствительность. Более того, антитела связываются с клетками через область Fc, причем Fc-рецепторный сайт области связывается с Fc рецептором (FcR) клетки. Существует множество рецепторов Fc, специфичных для различных классов антител, включая IgG (гамма рецепторы), IgE (эпсилон рецепторы), IgA (альфа рецепторы) и IgM (мю рецепторы). Связывание антитела с Fc рецепторами на клеточной поверхности запускает множество важных и разнообразных биологических ответов, включая поглощение и разрушение покрытых антителами частиц, очистку иммунных комплексов, лизис покрытых антителами клеток мишеней клетками-киллерами (называемый антителзависимой опосредуемой клетками цитотоксичностью или ADCC), высвобождение медиаторов воспаления, проход через плацентарный барьер и контроль над продукцией иммуноглобулинов. В соответствии с одним вариантом осуществления эффекторные функции могут быть уничтожены или уменьшены с помощью константной области IgG4 антитела, которое, как полагают, не может удалить клетки-мишени, или с помощью изготовления Fc вариантов, где остатки в области Fc, критичные для функций эффекторов, мутируются известными технологиями, например, S. Pat. № 5585097. Например, делеция или инактивация (посредством точечных мутаций или других средств) домена константной области может уменьшить связывание Fc рецептора циркулирующей стабилизированной связывающей молекулы, увеличивая локализацию опухоли. В других случаях может получиться, что модификации константной области, согласованные с настоящим изобретением, модерируют связывание комплемента и, тем самым, снижают время полужизни в сыворотке и неспецифичную ассоциацию конъюгированного цитотоксина. Другие модификации константной области могут использоваться для модификации ди- 67 - 015992 сульфидных связей или молекул олигосахаридов, которые обеспечивают усиленную локализацию благодаря повышенной специфичности к антигену или гибкости антитела. Обобщая, специалисты понимают, что модифицированные описанным здесь способом антитела могут проявлять множество тонких эффектов, которые могут быть или не быть легко заметны. Однако получаемый физиологический профиль, биодоступность и другие биохимические последствия сделанных модификаций, такие как локализация опухоли, биодистрибуция и полужизнь в сыворотке, можно легко измерить и оценить количественно хорошо известными иммунологическими способами без излишнего экспериментирования. В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированные формы антител можно приготовить из целого предшественника или родительского антитела с помощью известных в уровне техники способов. Далее более подробно рассматриваются примеры таких способов. В. Модифицированные химерные белки. В соответствии с определенными аспектами стабилизированная связывающая молекула по изобретению представляет собой модифицированный химерный белок. В соответствии с одним примером реализации связывающая молекула по изобретению представляет собой модифицированный химерный белок, включающий стабилизированную молекулу scFv, связанную с лигандсвязывающим участком рецептора, молекулой адгезии, лигандом или ферментом. В соответствии с другим примером реализации связывающая молекула по изобретению представляет собой химерный белок, включающий стабилизированную молекулу scFv, связанную с рецепторсвязывающим участком лиганда. Например, связывающая молекула по изобретению представляет собой химерный белок, включающий стабилизированную молекулу scFv с одной или более следующих молекул. Цитокины и рецепторы цитокинов. Цитокины оказывают плейротропные эффекты на пролиферацию, дифференциацию и функциональную активацию лимфоцитов. Различные цитокины и их рецепторсвязывающие участки могут использоваться в химерных белках изобретения. Примеры цитокинов включают интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13 и IL-18), колониестимулирующие факторы (CSF) (например, гранулоцитарные CSF(G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальные CSF(GMCSF) и моноцитарно макрофагальные CSF (M-CSF)), фактор некроза опухолей (TNF) альфа и бета, а также интерфероны, такие как интерферон-α, β или γ (патенты США № 4925793 и 4929554). Рецепторы цитокинов, как правило, состоят из лиганд-специфичной альфа-цепи и общей бета-цепи. Примеры рецепторов цитокинов включают рецепторы GM-CSF, IL-3 (патент США № 5639605), IL-4 (патент США № 5599905), IL-5 (патент США № 5453491), IFNγ (EP0240975) и TNF-семейство рецепторов (например, TNFα, например, TNFR-1 (ЕР 417563), TNFR-2 (ЕР 417014) бета рецептор лимфотоксина). В соответствии с другим вариантом осуществления молекула scFv изобретения может связываться с цитокином или цитокиновым рецептором. Белки адгезии. Молекулы адгезии представляют собой мембранно-связанные белки, которые позволяют клеткам взаимодействовать друг с другом. В связывающие молекулы изобретения можно включать различные белки адгезии, включая рецепторы лейкоцитов и молекулы клеточной адгезии, или их рецепторсвязывающие комплексы. Рецепторы лейкоцитов экспрессируются на клеточной поверхности лейкоцитов при воспалении и включают α-1 интегрины (например, VLA-1, 2, 3, 4, 5 и 6), опосредующие связывание с экстраклеточными компонентами матрицы, и β2-интегрины (например, LFA-1, LPAM-1, CR3 и CR4), связывающиеся с молекулами клеточной адгезии (САМ) на эндотелии сосудов. Примеры САМ включают ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 и MAdCAM-1. Другие САМ включают представителей семейства селектинов, в том числе Е-селектин, L-селектин и Р-селектин. В соответствии с другим вариантом осуществления молекула scFv изобретения может связываться с белком адгезии или рецептором белка адгезии. Хемокины. Хемокины, хемотактические белки, которые стимулируют миграцию лейкоцитов к сайту инфекции или к их фрагментам, связанным с хемокиновыми рецепторами, также можно включать в связывающие молекулы изобретения. Примеры хемокинов включают макрофагальные воспалительные белки (MIP-1-α и MIP-1-β), хемотактический фактор нейтрофилов и RANTES (regulated on activation normally T-cell expressed и secreted). В соответствии с другим вариантом осуществления молекула scFv изобретения может связываться с хемокинами или их рецепторами. Факторы роста и рецепторы факторов роста. Факторы рости или их рецеторы (или их рецепторсвязывающие или лигандсвязывающие фрагменты) или молекулы, с которыми они связываются, также можно включать в связывающие молекулы изобретения. Примеры факторов роста включают ангиобелок, фактор роста сосудов эндотелия (Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)) и его изоформы (US Pat. № 5194596); факторы роста эпидермиса (Epidermal Growth Factors (EGFs)); факторы роста фибробластов (Fibroblastic Growth Factors (FGF)), включая aFGF и bFGF; предсердный натрийуретический фактор (ANF); факторы роста печени (HGFs; - 68 - 015992 патенты США № 5227158 и 6099841); нейротропные факторы, такие как костные нейротропные факторы (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6) или фактор роста нервов, такие как NGF-β тромбоцитарный фактор роста (PDGF) (US Pat. № 4889919, 4845075, 5910574 и 5877016); трансформирующие рост факторы (TGF), такие как TGF-альфа и TGF-бета (WO 90/14359), остеоиндуктивные факторы, включая костный морфогенетический белок (BMP); инсулин-подобные факторы роста-I и -II (IGF-I и IGF-II; патенты США № 6403764 и 6506874); эритропоэтин (ЕРО); фактор стволовых клеток (SCF), тромбопоэтин (с-MpI лиганд) и полипептиды Wnt (патент США № 6159462). Примеры рецепторов факторов роста, которые могут использоваться, включают рецепторы EGF (EGFR); рецепторы VEGF (например, Plt 1 или Flk1/KDR), рецепторы PDGF (WO 90/14425); рецепторы HGF (патенты США № 5648273 и 5686292); рецепторы IGF (например, IGFR1 и IGFR2) и нейротропные рецепторы, включая рецепторы низкого сродства (LNGFR), также называемые p75NTR или р75, которые связывают NGF, BDNF и NT-3, а также рецепторы высокого сродства, входящие в состав trk-семейства рецепторных тирозиновых киназ (например, trkA, trkB (ЕР 455460), trkC (EP 522530)). В соответствии с другим вариантом осуществления IGFR1 и VEGF являются мишенями. В соответствии с еще одним вариантом осуществления VLA4 и VEGF являются мишенями. В соответствии с другим вариантом осуществления LFA1 и VLA4 являются мишенями. Другие рецепторы клеточной поверхности и/или их лиганды также могут быть мишенями (например, рецепторы семейства TNF или их лиганды (как здесь описано в больших подробностях)). В соответствии с другим вариантом осуществления молекула scFv изобретения может связываться с фактором роста или рецептором фактора роста. Гормоны. Примеры гормонов роста или связываемых с ними молекул, которые могут использоваться как агенты мишеней в связывающих молекулах изобретения, включают ренин, гормон роста человека (HGH; патент США № 5834598), N-метионил гормона роста человека; бычий гормон роста; фактор высвобождения гормона роста; паратироидный гормон (РТН); тироидстимулирующий гормон (TSH); тироксин; проинсулин и инсулин (патенты США № 5157021 и 6576608); фолликулстимулирующий гормон (FSH), кальцитонин, лютеинизирующий гормон (LH), лептин, глюкагоны; бомбезин; соматропин; муллерианингибирующее вещество; релаксин и прорелаксин; гонадотропин-ассоциированный пептид; пролактин; плацентальный лактоген; белок ОВ; или муллериан-ингибирующее вещество. В соответствии с другим вариантом осуществления молекула scFv изобретения может связываться с гормоном или рецептором гормонов. Факторы свертывания. Примеры факторов коагулирования крови для использования в качестве агентов мишеней в связывающих молекулах изобретения включают факторы свертывания (например, факторы V, VII, VIII, X, IX, XI, XII и XIII, фактор Фон Виллебрандта); тканевой фактор (US Pat. № 5346991, 5349991, 5726147 и 659684); тромбин и протромбин; фибрин и фибриноген; плазмин и плазминоген; активаторы плазминогена, такие как урокиназа или человеческая моча, или активатор плазминогена тканевого типа (tissue-type plasminogen activator (t-PA)). В соответствии с другим вариантом осуществления молекула scFv изобретения может связывать фактор свертывания. В соответствии с другими аспектами стабилизированный связывающий белок изобретения представляет собой модифицированный иммуноадгезин. Как хорошо известно в уровне техники, иммуноадгезин представляет собой химерный белок, который комбинирует мишеньсвязывающую область рецептора, молекулу адгезии, лиганд или фермент с Fc-участком антитела. Примеры иммуноадгезинов описаны, например, в патентах США № 5116964; 5428130; 5714147 и 6406697, каждый из которых включен сюда по ссылке. В соответствии с одним вариантом осуществления модифицированный иммуноадгезин изобретения формируется путем связывания стабилизированной молекулы scFv с иммуноадгезином. Иммуноадгезины, о которых сообщалось ранее, могут быть стабилизированы, как здесь описано, с получением модифицированных иммуноадгезинов настоящего изобретения. Примеры иммуноадгезинов, которые могут использоваться для генерации или получения рассматриваемых модифицированных иммуноадгезинов, включают, но не ограничиваются, абатацепт (Оренсия®, Bristol-Meyers Squibb, Princeton, NJ), алефасепт (Amevive®, Biogenldec, Cambridge, MA), етанерцепт (Enbrel®, Amgen, Thousand Oaks, CA), SMART™ анти-гамма Интерфрон (Protein Design Labs, Fremont, CA), SMART™ анти-L-Селектин (Protein Design Labs. Fremont, CA), рилонацепт (Regeneron Pharmaceuticals Inc., Tarrytown, NY), регавирумаб (TI-23, Teijin America, New York, NY), R24 (National Cancer Institute (Bethesda, MD), Опрелвекин (NEUMEGA®, Genetics Institute, Cambridge, MA), ОНКОЛИЗИН В, ОНКОЛИЗИН CD6, ОНКОЛИЗИН М и ОНКОЛИЗИН S (все от ImmunoGen Inc., Cambridge, MA, USA), ОНКОЛИМ™ 131 (Techniclone Corp., Tustin, CA), ImmuRAIT-LL2 (Immunomedics Inc., Morris Plains, NJ), IL-4 RA (BAY 16-9996; Bayer Corp., Berkeley, CA), IC14 (ICOS Corporation, Bothell, WA), CYT-356-Y-90 (ONCORAD®PR, Cytogen Corp., Princeton, NJ), KOTAPA™ (Techniclone Corp., Tustin, CA), CMB-401 (Wyeth Pharmaceuticals, Madison, NJ), - 69 - 015992 АВИЦИДИН® конъюгат (NeoRx Corp., Seattle, WA) и анти-CD18 иммуноадгезин (Genentech Inc., S. San Francisco, CA). Другим примером молекул, которые можно включать в состав связывающей молекулы изобретения, является член номер 9 надсемейства иммуноглобулинов (IGSF9; Genomics. 2002. 79:663-70). С. Специфичность связывания. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению связывается с молекулой мишени, представленной на поверхности клетки, или растворимой. В соответствии с одним вариантом осуществления по крайней мере одна специфичность связывания связывающей молекулы изобретения является каталитической. Ее можно создать известными способами (см., например, US Pat. № 6590080 и 5658753). Каталитическая специфичность связывания функционирует по различным базовым механизмам, подобным тем, которые реализуются у ферментов для стабилизации переходного состояния, что снижает свободную энергию активации. Например, общие кислотные или основные остатки можно оптимально расположить в каталитическом активном сайте для участия в катализе; можно сформировать ковалентные фермент-субстратные интермедиа™; каталитические антитела также можно разместить в правильной ориентации для реакции и повысить эффективную концентрацию реагентов по крайней мере на семь порядков величины (Fersht, A.R., et al., Am. Chem. Soc. 90 (1968):5833), что позволяет сильно снизить энтропию химической реакции. Наконец, каталитические антитела могут конвертировать энергию, полученную в результате связывания субстрата, чтобы направить реакцию в направлении структуры, напоминающей переходное состояние. В соответствии с одним вариантом осуществления в сайт связывания можно включить кислотные или основные остатки, используя комплементарно заряженные молекулы в качестве иммуногена. Такая технология доказала свой успех в индукции антител с гаптеном, включающих положительно заряженный ион аммония (Shokat, et al., Chem. Int. Ed. Engl. 27 (1988):269-271). В соответствии с другим подходом антитела можно превратить в стабильные соединения, напоминающие по размеру, форме и заряду переходное состояние требуемой реакции (т.е. аналоги переходного состояния). См. US Pat. № 4792446 и 4963355, которые описывают использование аналогов переходного состояния для иммунизации животных и продукции каталитических антител. Оба эти патента включены сюда по ссылке. В соответствии с одним вариантом осуществления такие молекулы можно вводить как часть иммуноконъюгата, например, совместно с иммуногенной молекулой-носителем, такой как KLH. Например, каталитическая специфичность связывания может обладать, например, эстеразной активностью (вовлекающее заряженное переходное состояние, электростатические характеристики и характеристики формы которых можно имитировать фосфонатной структурой; Jacobs, et al., J. Am. Chem. Soc. 109 (1987):2174-2176; Durfor, et al., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988):8713-8714; Tramontano, et al., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988):2282; Pollack, et al., J. Am. Chem. Soc. 111 (1989):5961-5962); пептидазной или амидазной активностью (Janda, et al., Science 241 (1988): 1188-1191; Iverson, et al., Science 243 (1989):11841188; Paul, et al., Science 244 (1989): 1158-1162); Claisen rearrangement (Jackson, et al., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988):4841-4842; Hilvert, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988):4953-4955; Hilvert, et al., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988):5593-5594); катализировать восстановительные реакции (Shokat, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27 (1989):269-271); фотохимическое расщепление тимидинового димера (Cochran, et al., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988):7888-7890); стереоспецифичные перегруппировки трансэтерификации (Napper, et al., Science 237 (1987):1041-1043); а также синтез бимолекулярных амидов (Benkovic, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988):5355-5358; Janda, et al., Science 241 (1988):1188-1191). В соответствии с другим подходом общую специфичность связывания можно мутировать, чтобы сделать ее каталитической. Способы скрининга активности каталитического антитела хорошо известны в уровне техники (например, Reymond, J.L. 2002. Journal of Immunological Methods 269:125; Mouratou et al. 2002. J. of Immunological Methods. 269:147). В соответствии с еще одним вариантом осуществления каталитические Вклетки можно выбрать, например, как описано в патенте US patent 6590080, где используется молекула, конструируемая для облегчения селекции каталитических В-клеток. В соответствии с другим вариантом осуществления каталитическая специфичность связывания может быть создана в двухстадийном процессе. Каталитические антитела выбираются, только если продемонстрированы следующие характеристики связывания: связывание как субстрата, так и реактивной группы таким способом, чтобы две группы находились в реактивном положении друг относительно друга. Во-вторых, отобранные антитела можно сконструировать химически, ковалентно связав реактивную группу с карманом связывания антитела. J. Immunol Methods. 2002. 269:81-98. В соответствии с одним вариантом осуществления каталитическая специфичность связывания специфична для пролекарства. Такая специфичность связывания может использоваться для катализа превращения в лекарство, эффективное in vivo. Предпочтительно, если катализируемая реакция не может протекать под действием природных ферментов in vivo. Примеры активации пролекарств антителами хорошо известны в уровне техники (см., например, Miyashita et al. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5337). - 70 - 015992 В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению включает по крайней мере одну специфичность связывания для клетки мишени и по крайней мере одну специфичность связывания для пролекарства. Например, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления стабилизированная связывающая молекула по изобретению включает по крайней мере одну специфичность связывания для опухолевой клетки и по крайней мере одну специфичность связывания для пролекарства, которое может быть преобразовано в цитотоксическое лекарство. В соответствии с одним примером стабилизированная связывающая молекула по изобретению включает специфичность связывания для пролекарства карбамата 4-[N,N-бис(2-хлороэтил)]аминофенил-N-[(1S-(1,3дикарбокси)пропил]карбамата и генерирует соответствующий цитотоксический азотвключающий препарат (Wentworth et al. 1996. Proc Natl. Acad. Sci. USA. 93:799). В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула вводится до введения пролекарственной формы, чтобы накопиться в сайте клетки-мишени. Примеры пролекарственных форм хорошо известны в уровне техники. Пролекарственные формы можно также синтезировать, включив в них фрагмент, который должен высвобождаться под действием катализатора, в качестве примера можно привести последовательную реакцию ретро-альдол/ретро-Михаэля, катализируемую антителом с альдолазной активностью (Shabat et al. 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:7428). Такие маскирующие лекарства фрагменты можно получить, например, модификацией гидроксильной и тиоловой группы лекарства. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению полиспецифична, т.е. включает по крайней мере один сайт связывания, который связывается с первой молекулой мишени или эпитопом молекулы мишени, и по крайней мере еще один сайт связывания, который связывается со второй молекулой мишени, отличающейся от первой, или с вторым, отличающимся от первого, эпитопом первой молекулы мишени. В соответствии с определенными аспектами полиспецифичные связывающие молекулы изобретения (например, биспецифичные связывающие молекулы) содержат по крайней мере один сайт связывания из любого из антител, описанных здесь, например, в разделе А. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению биспецифична. Биспецифичные молекулы могут связываться с двумя различными сайтами связывания, например, на одной и той же молекуле мишени или на различных молекулах мишени. Например, в случае антител, биспецифичные молекулы могут связываться с двумя различными эпитопами, например, на одном и том же антигене или на двух различных антигенах. Биспецифичные молекулы могут использоваться, например, в диагностических и терапевтических применениях. Например, с их помощью можно иммобилизировать ферменты в иммуноанализах. Их можно применять также в диагностике и лечении рака, например, если они связываются с молекулой, ассоциированной с опухолью, и с регистрируемым маркером (например, хелатором, тесно связывающимся с радионуклидом). Биспецифичные молекулы могут использоваться также для лечения людей, например, направляя цитотоксичность на конкретную мишень (например, связываясь с патогеном или опухолевой клеткой и с молекулой, запускающей цитотоксическое действие, такой как рецептор Т-клеток или рецептор Fcγ). Биспецифичные антитела можно использовать, например, в качестве фибринолитических агентов или адъювантов вакцин. В соответствии с одним вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения включают по крайней мере одно плечо (т.е. сайт связывания), направленное против молекулы клеточной поверхности, и по крайней мере одно плечо, направленное против растворимой молекулы. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичное антитело изобретения включает два сайта связывания растворимых молекул. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичное антитело изобретения включает два сайта связывания молекул клеточной поверхности. Полиспецифичные связывающие молекулы изобретения могут быть одновалентными для каждой специфичности или поливалентными (многовалентными) для каждой специфичности. В соответствии с одним вариантом осуществления биспецифичная связывающая молекула по изобретению может содержать один сайт связывания, который реагирует с первой молекулой мишени, и один сайт связывания, который реагирует со второй молекулой мишени (например, биспецифичная молекула антитела, химерный белок или мини-тело). В соответствии с другим вариантом осуществления биспецифичная связывающая молекула по изобретению может содержать два сайта связывания, которые реагируют с первой молекулой мишени, и два сайта связывания, которые реагируют со второй молекулой мишени (например, биспецифичное четырехвалентное антитело scFv2, четырехвалентное мини-тело или диатело). В соответствии с определенными аспектами по крайней мере один сайт связывания полиспецифичной связывающей молекулы по изобретению представляет собой антигенсвязывающую область антитела или его антигенсвязывающий фрагмент. В соответствии с одним вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения представляют собой двухвалентные антитела или их варианты, у которых одно плечо включает по крайней мере одну стабилизированную scFv, направленную на первую молекулу мишени, а второе плечо включает по крайней мере одну стабилизированную scFv, направленную на вторую молекулу мишени. - 71 - 015992 В соответствии с одним вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения содержат по крайней мере одну стабилизированную scFv (например, 2, 3 или 4 scFv), связанную с С-концом тяжелой цепи, где молекулы scFv обладают той же или другой специфичностью связывания. Пример связывающей молекулы этого типа (антитело "С-Геркулес") показан на фиг. 20. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения содержат по крайней мере одну стабилизированную scFv (например, 2, 3 или 4 scFv), связанную с Nконцом тяжелой цепи, где молекулы scFv обладают той же или другой специфичностью связывания. Пример связывающей молекулы этого типа (антитело "NH-Геркулес") показан на фиг. 20. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения содержат по крайней мере одну стабилизированную scFv (например, 2, 3 или 4 scFv), связанную с N-концом легкой цепи, где молекулы scFv обладают той же или другой специфичностью связывания. Пример связывающей молекулы этого типа (антитело "NL-Геркулес") показан на фиг. 20. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения содержат по крайней мере одну стабилизированную scFv (например, 2, 3 или 4 scFv), связанную с N-концом тяжелой или легкой цепи, и по крайней мере одну стабилизированную scFv (например, 2, 3 или 4 scFv), связанную с Сконцом тяжелой цепи, где молекулы scFv обладают той же или другой специфичностью связывания. В соответствии с одним вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения представляют собой двухвалентные мини-тела, одно плечо которых включает по крайней мере один scFv фрагмент, направленный на первую молекулу мишени, а второе плечо включает по крайней мере один scFv фрагмент, направленный на вторую молекулу мишени, где по крайней мере одна из молекул scFv стабилизирована. Пример конструкта биспецифичного двухвалентного мини-тела показан на фиг. 57. CH3 домен фигуры гибридизован со стороны своего N-конца со связывающим пептидом, который со стороны своего N-конца гибридизован с VH доменом, который со стороны своего N-конца гибридизован с (Gly4Ser)n гибким линкером, который со стороны своего N-конца гибридизован с VL доменом. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения представляют собой scFv четырехвалентные мини-тела, в которых каждый фрагмент тяжелой цепи включает первый и второй фрагменты scFv, где по крайней мере одна молекула scFv стабилизирована. Второй названный фрагмент scFv может быть связан с N-концом первого фрагмента scFv (например, биспецифичного NH scFv четырехвалентного мини-тела или биспецифичного NL scFv четырехвалентного мини-тела). Пример биспецифичного N scFv четырехвалентного мини-тела показан на фиг. 58. Альтернативно, второй фрагмент scFv может быть связан с С-концом указанного фрагмента тяжелой цепи, включающего первый указанный scFv фрагмент (например, биспецифичные C-scFv четырехвалентные мини-тела). Пример биспецифичного C-scFv четырехвалентного мини-тела показан на фиг. 59. В соответствии с одним вариантом осуществления первый и второй фрагменты scFv могут связываться с молекулами одной или различных мишеней. Если первый и второй фрагменты scFv участка тяжелой цепи биспецифичного четырехвалентного мини-тела связываются с молекулой одной мишени, то по крайней мере один из двух фрагментов scFv второго участка тяжелой цепи биспецифичного четырехвалентного мини-тела связывается с другой молекулой мишени. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения представляют собой биспецифичные диатела, каждое плечо которых включает тандем фрагментов scFv, по крайней мере один из которых стабилизирован. В соответствии с одним вариантом осуществления биспецифичное диатело может содержать первое плечо с первой специфичностью связывания и второе плечо со второй специфичностью связывания (см., например, фиг. 60). В соответствии с другим вариантом осуществления каждое плечо диатела может содержать первый scFv фрагмент с первой специфичностью связывания и второй scFv фрагмент со второй специфичностью связывания. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения представляют собой scFv2 четырехвалентные антитела, у которых каждый фрагмент тяжелой цепи включает молекулу scFv, где по крайней мере одна из молекула scFv стабилизирована. scFv фрагменты могут быть связаны с N-концом вариабельной области частей тяжелой цепи (например, биспецифичные NH scFv2 четырехвалентного антитела или биспецифичных NL scFv2 четырехвалентные антитела). Альтернативно, scFv фрагменты могут быть связаны с С-концом фрагментов тяжелой цепи четырехвалентного антитела (например, биспецифичных C-scFv2 четырехвалентного антитела, см., например, фиг. 61). Каждый фрагмент тяжелой цепи scFv2 четырехвалентного антитела может содержать вариабельные области и scFv фрагменты, связывающиеся с той же или другой молекулой мишени. Если scFv фрагмент и вариабельная область первого участка тяжелой цепи биспецифичного scFv2 четырехвалентного антитела связываются с одной и той же молекулой мишени, по крайней мере один из первого или второго фрагментов второго участка тяжелой цепи биспецифичного четырехвалентного антитела связывается с другой молекулой мишени. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичные связывающие молекулы изобретения представляют собой scFv2 четырехвалентные бездоменные антитела, у которых каждый фрагмент тяжелой цепи включает фрагмент scFv, по крайней мере один из которых стабилизирован. scFv фрагменты могут быть связаны с N-концом вариабельной области частей тяжелой цепи (например, бис- 72 - 015992 пецифичные NH scFv2 четырехвалентного антитела (см. фиг. 63) или биспецифичные NL scFv2 четырехвалентные антитела (см. фиг. 64)). Альтернативно, scFv фрагменты могут быть связаны с С-концом фрагментов тяжелой цепи scFv2 четырехвалентного бездоменного антитела (например, биспецифичные C-scFv2 четырехвалентные бездоменные антитела, см., например, фиг. 62). Примеры молекул клеточной поверхности, к которым может присоединяться связывающая молекула по изобретению, включают антигены рецепторов и опухолевых клеток, которые сверхэкспрессируются на поверхности опухолевых или неопластических клеток, а также любой из описанных здесь цитокиновых рецепторов, молекул адгезии или рецепторов факторов роста, например, описанных в разделе В настоящего изобретения. Примеры растворимых молекул включают антиопухолевые агенты (например, токсины, химиотерапевтические препараты и их пролекарства), растворимые ферменты (например, ферменты, конвертирующие пролекарства), цитокины, хемокины, гормоны, факторы роста или факторы тромбообразования, например, описанные здесь в разделе А. Биспецифичные молекулы, связывающиеся как с антигенами опухолевых клеток, так и с противоопухолевыми агентами или растворимыми ферментами, могут локализовать противоопухолевый агент на клетке опухоли, экспрессирующей указанный антиген, что максимально позволяет увеличить токсические эффекты противораковых лекарств на опухолевую клетку и предельно уменьшить токсический эффект противораковых лекарств на нормальные клетки. Примеры биспецифичных связывающих молекул по крайней мере с одним сайтом связывания опухолевого антигена и по крайней мере одним сайтом связывания токсина включают анти-сапорин/анти-Id1, анти-CD22/анти-сапорин, анти-CD7/анти-сапорин, анти-CD38/анти-сапорин, анти-СЕА/анти-рицин А цепи, анти-интерферон-.альфа.(IFN-.альфа.)/анти-гибридомы идиотип, анти-СЕА/анти-винки алкалоид. Примеры биспецифичных связывающих молекул по крайней мере с одним сайтом связывания молекулы клеточной поверхности и по крайней мере одним сайтом связывания фермента, конвертирующего пролекарство, включают, например, анти-CD30/анти-щелочную фосфатазу (которая катализирует превращение пролекарства митомицинфосфата в химиотерапевтический митомициновый спирт). В соответствии с другими аспектами биспецифичные связывающие молекулы связываются с антигенами опухолевых клеток и диагностическими агентами, тем самым локализуя указанный диагностический агент на опухолевой клетке, экспрессирующей указанный антиген, и облегчая детекцию опухоли in vitro или in vivo. Примеры биспецифичных связывающих молекул включают анти-СЕА/анти-EOTUBE, анти-СЕА/анти-DPTA, анти-СЕА/анти-бета-галактозидазу и анти-р185HER2/анти-гаптен. В соответствии с другими аспектами биспецифичные связывающие молекулы связываются с растворимыми молекулами (например, растворимыми антигенами) и молекулами клеточной поверхности неопухолевых клеток (например, иммунных клеток). Например, они могут использоваться, чтобы нацелить растворимые иммунные комплексы на рецепторы клеточной поверхности иммунных клеток, что облегчает их вывод из организма по опосредуемым клетками иммунным механизмам. Примеры биспецифичных молекул такого типа включают анти-липобелки низкой плотности (LDL)/анти-Fc рецептор (например, Fc.гамма.RI, Fc.гамма.RII или Fc.гамма.RIII)) и биспецифичные связывающие молекулы, применяемые в терапии инфекционных заболеваний (такие как анти-CD3/анти-герпеса симплексный вирус (HSV), анти-Т-клеточный рецептор:CD3 комплекс/анти-грипп, анти-Fc.гамма.R/антиВИЧ)). В соответствии с другими аспектами биспецифичные связывающие молекулы изобретения могут связываться как с рецепторами клеточной поверхности, так и с растворимыми лигандами. В соответствии с одним вариантом осуществления лиганд представляет собой родственный лиганд рецептора TNF семейства. Примерами рецепторов клеточной поверхности, с которыми могут связываться биспецифичные связывающие молекулы, являются антигены опухолевых клеток и рецепторы иммунных клеток. Примеры рецепторов клеточной поверхности включают также рецепторы цитокинов, молекулы адгезии или рецепторы факторов роста, например, как описано здесь, например, в разделе В. Примеры растворимых лигандов включают цитокины, хемокины, гормоны, факторы роста или факторы тромбообразования, например, как описано здесь в разделе В. Примеры биспецифичных связывающих молекул включают анти-VLA4/анти-Мас-1, антиVLA4/анти-VEGF, анти-VLA4/анти-ангиопоэтин, анти-VLA4/анти-TNFα, анти-IGFRI/анти-VEGF, антиIGFR1/анти-ангиопоэтин, анти-IGFR1/анти-EGFR, анти-HGF-SF/анти-VEGF, анти-HGF-SF/антиангиопоэтин и HGF-SF/любой второй антиген (см., например, Cao et al. Proc. Natl. Acad. Sci 2001. 98:7443; Lu et al. 2004. J. Biol. Chem. 279:2856). В соответствии с другими аспектами биспецифичные связывающие молекулы изобретения включают по крайней мере одно плечо (т.е. сайт связывания), направленное против первой растворимой молекулы (например, растворимого л иганда), и по крайней мере одно плечо, направленное против второй растворимой молекулы (например, растворимого лиганда). Такие биспецифичные связывающие молекулы могут использоваться как средство диагностики (например, анти-кролик IgG/анти-ферритин, антипероксидаза из хрена (HRP)/анти-гормон, анти-соматостатин/анти-вещество Р, анти-HRP/анти-FITC (см. Nolan et al., supra)) или фибринолитические агенты (например, анти-фибрин/анти-активатор тканевого плазминогена (tPA), анти-фибрин/анти-активатор плазминогена урокиназного типа (uPA)). - 73 - 015992 В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления растворимая молекула, с которой связывается биспецифичная связывающая молекула по изобретению, - это растворимый лиганд семейства TNF. Примеры таких лигандов включают, но не ограничиваются, LTA (который связывает TNFR1/TNFRSF1A), TNF (который связывает CD120b/TNFRSF1B), LTB (который связывает LTBR/TNFRSF3), OX40L (который связывает ОХ40/TNFRSF4), CD40L (который связывает CD40/TNFRSF5), (который связывает Fas/TNFRSF6 и DcR3/TNFRSF6B), CD27L (который связывает CD27/TNFRSF7), CD30L (который связывает CD30/TNFRSF8), 4-1-BB-L (который связывает 4-1BB/TNFRSF9), TRAIL (который связывает TRAIL-R1/TNFRSF10A, TRAIL-R2/TNFRSF10B, TRAILR3/TNFRSF10C и TRAIL-R4/TNFRSF10D), RANKL (который связывает RANK/TNFRSF11А и Остеопротегин/TNFRSFHB), APO-3L (который связывает АРО-3/TNFRSF12 и DR3L/TNFRSF12L), APRIL (который связывает TTACI/NFRSF13B), BAFF (который связывает BAFFR/TNFRSF13A), LIGHT (который связывает HVEM/NFRSF14), NGF-лиганды (которые связывают LNGFR, например, NGF-, NGF-2/NTF3, NTF5, BDNF, IFRD1), GITRL (который связывает GITR/TNFRSF18), EDAR1 и XEDAR лиганд, Fn14 лиганд, а также Troy/Trade лиганд. В соответствии с другими примерами реализации биспецифичные связывающие молекулы изобретения содержат по крайней мере один сайт связывания для первой молекулы клеточной поверхности и по крайней мере один сайт связывания для второй молекулы клеточной поверхности. В соответствии с одним вариантом осуществления первая и вторая молекулы клеточной поверхности расположены на различных клетках (например, различных типов). Например, биспецифичные молекулы могут содержать по крайней мере одно плечо, направленное против антигена опухолевых клеток, и одно плечо, направленное против рецептора клеточной поверхности на неопухолевой клетке (например, иммунной клетке). Примеры биспецифичных связывающих молекул этого типа включают включающие по крайней мере один сайт связывания для антигена опухолевых клеток и по крайней мере один сайт связывания, направленный против цитотоксической триггерной молекулы иммунной эффекторной клетки (такой как антиFc.гамма.RI/анти-CD15, анти-p185.sup.HER2/Fc.гамма.RIII (CD16), анти-p185.sup.HER2/анти-VEGF, анти-CD3/анти-злокачественная В-клетка (1D10), анти-CD3/анти-p185.sup.HER2, анти-CD3/анти-р97, антиCD3/анти-клетки карциномы почек, анти-CD3/анти-OVCAR-3, анти-CD3/L-D1 (анти-карцинома толстого кишечника), анти-CD3/анти-аналог меланоцитстимулирующего гормона, анти-EGF-рецептор/анти-CD3, анти-CD3/анти-САМА1, анти-CD3/анти-CD19, анти-CD3/MoV18, анти-молекула адгезии нервных клеток (NCAM)/анти-CD3, анти-фолат связывающий белок (FBP)/анти-CD3 и анти-панкарциномаассоциированный антиген (АМос-31)/анти-CD3)). Биспецифичные молекулы, связывающиеся с антигенами опухолевых клеток и с молекулой цитотоксического триггера, могут эффективно соединять опухолевые клетки с иммунными эффекторными клетками, тем самым активируя способность эффекторных клеток разрушать опухолевые клетки по опосредуемому клетками иммунному механизму. В соответствии с другим вариантом осуществления первая и вторая молекулы клеточной поверхности, с которой может связаться биспецифичная связывающая молекула, расположена на той же клетке или типе клеток. Образуя связь между первым и вторым рецепторами на одной и той же клетке, биспецифичные связывающие молекулы изобретения могут ингибировать или усиливать активность (например, активность по трансдукции сигнала), ассоциированную с одним из этих двух рецепторов или с ними обоими. В соответствии с одним направлением реализации первая и вторая молекулы клеточной поверхности относятся к одному типу (например, принадлежат одному семейству молекул). В соответствии с другим направлением реализации указанные первая и вторая молекулы клеточной поверхности относятся к разным типам (например, принадлежат различным семействам молекул). Примеры рецепторов клеточной поверхности, с которыми связываются биспецифичные связывающие молекулы, включают антигены опухолевых клеток или рецепторы иммунных клеток. Примеры рецепторов клеточной поверхности включают также любой из цитокиновых рецепторов, молекул адгезии или рецепторов факторов роста, описанных в разделе В. В соответствии с одним вариантом осуществления примеры молекул мишеней, с которыми связываются связывающие молекулы изобретения, включают один или более эпитопов, например сульфат гепарина, факторы роста и их рецепторы (например, фактор роста эпидермиса, рецептор инсулинподобного фактора роста, рецептор фактора роста гепатоцитов (HGF/SF) (см., например, Cao et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 2001. 98:7443; Lu et al. 2004. J. Biol. Chem. 279:2856). В соответствии с примером реализации по крайней мере одна молекула, с которой связывается биспецифичная связывающая молекула по изобретению, является членом семейства TNF-рецепторов (TNFR). В соответствии с другим примером реализации первая и вторая молекулы мишени, с которой связывается биспецифичная связывающая молекула по изобретению, представляют собой члены семейства TNFR. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению связывается с лигандом семейства TNFR. В соответствии с еще одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению связывается с лигандом семейства TNFR. В соответствии с еще одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению связывается с одним членом семейства TNFR и антигеном, экспрессируемым на поверхности опухолевой клетки, например, предпочтительно экспрессируемым на опухолевой клетке. Ограничивающим фактором при лечении опухолей моноспеци- 74 - 015992 фичными TNFR-связывающими молекулами является то, что чувствительно к подобной терапии только подмножество опухолей. Полиспецифичные TNFR связывающие молекулы могут специфично активировать TNFR и усиливать передачу сигнала рецептором, например, приведя TNFR в непосредственную близость. Изобретение относится к способам улучшения биспецифичных TNFR связывающих молекул, которые могут быть направлены на более чем один TNFR или тип TNFR и усиливать передачу сигнала, обеспечивая улучшенный способ лечения рака. В соответствии с одним вариантом осуществления биспецифичная TNFR связывающая молекула повышает силу сигнала, связываясь с двумя или более TNFR одного типа, что повышает количество TNFR, расположенных близко друг к другу. В соответствии с более предпочтительным вариантом осуществления биспецифичная TNFR связывающая молекула способна связываться с двумя различными рецепторами семейства TNF. В соответствии с одним вариантом осуществления по крайней мере один TNFR, с которым связывается биспецифичная TNFR связывающая молекула, включает домен смерти. Термин "домен смерти" означает цитоплазматическую область рецептора семейства TNF, который вовлечен в TNFопосредуемую клеточную смерть или апоптическую передачу сигнала и индукцию цитотоксичности клеток, опосредуемую этими рецепторами. Регион сопрягает рецептор с активацией каспазы посредством адаптерных белков, что приводит к активации внешнего пути умирания клетки. Примеры TNF-рецепторов, которые содержат домены смерти, включают, но не ограничиваются, TNFR1 (TNFRSF1A), Fas (TNFRSF6), DR-3 (TNFRSF6B), LNGFR (TNFRSF16), TRAIL-R1 (TNFRSF10А), TRAIL-R2 (TNFRSF10В) и DR6 (TNFRSF21). Передача апоптического сигнала от этих рецепторов модулируется связыванием родственного лиганда и образованием одной из следующих рецептор-лигандных пар: NFR1/TNFα, Fas/FasL, DR-3/DR-3LG, TRAIL-R1/TRAIL или TRAIL-R2/TRAIL. Биспецифичные TNFR связывающие молекулы, нацеленные на рецепторы семейства TNF, включающие домены смерти, полезны при лечении рака, так как TNFR этого типа часто сверхэкспрессируются в раковых клетках, и стимуляция рецептора может активировать апоптоз опухолевых клеток. В соответствии с предпочтительными аспектами домен смерти, включающий TNFR, с которым связывается биспецифичная TNFR связывающая молекула по изобретению, представляет собой TRAIL-R2. TRAILR2 предпочтителен при терапии опухоли у человека, так как его активация не запускает апоптоз гепатоцитов и, следовательно, такое лечение характеризуется пониженной токсичностью. Хотя активация некоторых включающих домен смерти рецепторов, например TNFR1 или Fas, оказалась токсичной в применении in vivo, вероятно, привязка этих рецепторов к другим TNF-рецепторам может уменьшить токсичность и, тем самым, сделать токсическое антитело менее токсичным. В соответствии с одним вариантом осуществления биспецифичная TNFR связывающая молекула по изобретению включает по меньшей мере один сайт связывания, направленный на TNFR, включающий домен смерти, и по крайней мере один сайт связывания, направленный на TNFR без домена смерти. В соответствии с демонстративными направлениями реализации изобретения TNFR без домена смерти включают TNFR, принимающие участие в дифференциации тканей. Примеры TNFR рецепторов, вовлеченных в процесс дифференциации тканей, включают LTβR, RANK, EDAR1, XEDAR, Fn14, Troy/Trade и NGFR. TNFR, вовлеченные в процесс дифференциации тканей, могут влиять на нее после связывания с родственным лигандом. TNFR связывающие молекулы, направленные на TNFR, вовлеченные в процесс дифференциации тканей, могут влиять на опухоли различными способами. Во-первых, они могут непосредственно замедлить рост опухоли, изменив клеточный цикл. Во-вторых, дифференциация тканей в контексте трансформации опухолевых клеток может привести к конфликту клеточного цикла и апоптозу. В-третьих, такой конфликт может сделать клетки более чувствительными к химиотерапии. В соответствии с предпочтительными аспектами TNFR, вовлеченные в процесс дифференциации тканей, представляют собой β-рецептор (LTβR). LTβR участвует в управлении статусом взросления различных специализированных стромальных клеток в иммунной системе и играет критическую роль в ходе развития стромальных элементов бластоциты лимфоузла. Предполагается, что активация программы развития эпителиальных и фибробластоидных клеток в контексте трансформированной клетки отрицательно влияет на ее выживание, и это может объяснить часть противоопухолевой активности активации LTβR. Эти рецепторы могут также инициировать воспалительные программы, вовлекающие высвобождение хемокинов и стимулирующих иммунологический противоопухолевый ответ. Такое высвобождение может повлиять на воспалительный статус опухоли и/или инициировать инфильтрацию лимфоидных элементов, стимулирующих иммунологическую реакцию в опухоли. Так, биспецифичные TNFR связывающие молекулы, которые связывают LTβR, по отдельности или совместно с TNF-рецепторами, включающими домены смерти (например, TRAIL-R2), входят в состав настоящего изобретения. В соответствии с иллюстративными вариантами осуществления TNFR без домена смерти включают TNFR, вовлеченные в иммунное регулирование. Такие рецепторы включают TNFR2, HVEM, CD27, CD30, CD40, 4-1BB, ОХ40, GITR, TACI, BAFF-R, ВСМА и RELT. Другие рецепторы семейства TNF, участвующие в иммунной регуляции, включают TRAIL-R3 и TRAIL-R4. Другие целевые рецепторы TNF семейства, участвующие в образовании опухоли, можно определить с использованием имеющихся баз - 75 - 015992 данных РНК экспрессии рецепторов в клетках различных типов, которые дают возможность определить рецепторы TNF семейства, присутствующие или идеально сверхэкспрессирующиеся в различных опухолях. Более того, существующие базы данных РНК предоставляют дополнительное преимущество в том, что пару рецепторов TNF семейства, с которыми связана биспецифичная TNFR связывающая молекула по изобретению, можно оптимизировать, идентифицировав пару рецепторов, наиболее уникально экспрессирующихся в типе опухолей или подмножестве опухолей, но не являющихся избыточными для нормальных тканей, особенно, печени и сосудистой системы. В таких случаях идентифицируются рецепторные пары (или больше), способные доставить сильный сигнал опухоли и редким нормальным тканям. Способы получения полиспецифичных молекул хорошо известны в уровне техники. Например, с использованием рекомбинантной технологии можно создать полиспецифичные молекулы, например, диатела, одноцепочечные диатела, тандемные scFv и другие. Примеры способов получения полиспецифичных молекул известны в уровне техники (например, Kontermann et al. Methods in Molecular Biology, vol. 248: Антитело Engineering: Methods and Protocols. P. 227-242, US 2003/0207346 A1 и процитированные там ссылки). В соответствии с одним вариантом осуществления полимерные полиспецифичные молекулы получают способами, такими как описанные, например, в US 2003/0207346 А1 или US patent 5821333 или US 2004/0058400. В соответствии с другим вариантом осуществления полиспецифичная связывающая молекула по изобретению представляет собой полиспецифичный химерный белок. Фраза "полиспецифичный химерный белок" означает химерные белки (описанные выше), включающие по крайней мере две специфичности связывания (т.е. комбинирующие домены связывания лиганда или рецептора). Полиспецифичный химерный белок можно собрать, например, в виде гетеродимеров, гетеротримеров или гетеротетрамеров, в особенности, как описано в WO 89/02922 (6 апреля 1989 г.), в EP 314317(3 мая 1989 г.) и в патенте США № 5116964, 2 мая, 1992. Предпочтительными полиспецифичными химерными белками являются биспецифичные белки. Примеры биспецифичных химерных белков включают CD4-scFv/TNF-рецепторIgG и CD4-scFv/L-селектин-IgG. Последний комбинирует функцию связывания с лимфоузлом рецептора лимфоцитов (LHR, L-селектин) и HIV-связывающую функцию CD4, и его потенциальное применение может заключаться в профилактике или лечении ВИЧ-инфекции, родственных состояний или в диагностике. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретение относится к полиспецифичным стабилизированным связывающим молекулам, например биспецифичным связывающим молекулам, например антителам, включающим по крайней мере один сайт связывания, который связывается с известной мишенью, и по крайней мере один сайт связывания, который распознает неизвестную мишень (например, в соответствии с одним вариантом осуществления биспецифичная молекула включает сайты связывания, выбранные из библиотеки дисплея фагов полусинтетических антител) и стабилизированную scFv изобретения. В соответствии с одним направлением реализации изобретения специалист может, начав с одноцепочечного антитела известной специфичности, построить библиотеку Fab известными в уровне техники способами, или, альтернативно, начав с фрагмента Fab известной специфичности, построить библиотеку стабилизированных одноцепочечных антител известными в уровне техники способами. Известно, что библиотеки из неиммунизированных источников и полученные синтетической рекомбинацией последовательностей гена V (предпочтительно комбинацией VH с последовательностями DH и JH, а также VL с JL) можно использовать для выделения антител любого антигена. Например, патентная заявка WO 92/01047 показывает, что фрагменты антител можно изобразить на поверхности бактериофага, и что они будут связывать антиген. Фрагменты антител (например, Fab, Fv, scFv и VH) можно непосредственно выбрать, используя эту особенность. Другие известные в уровне техники способы включают описанные, например, в патентах US 5698426; 6291159; 5658727; 5667988 и 5969108. В соответствии с другим вариантом осуществления scFv, распознающую известную мишень, можно димеризовать с помощью scFv, выделенной из библиотеки дисплея полусинтетических антител человеческого фага (см., например, Kruif и Logtenberg 1996. J. Biol. Chem. 271:7630). В соответствии с одним вариантом осуществления рассматриваемая полиспецифичная молекула экспрессируется в системе экспрессии, которая применяется для экспрессии молекул антител, например, клеток млекопитающих, грибков, бактерий, таких как такие как Picchia, E.coli, Bacculovirus и т.д. В соответствии с одним вариантом осуществления рассматриваемая полиспецифичная молекула экспрессируется в векторой системе NEOSPLA (см., например, патент US 6159730). Этот вектор включает промотер/усилитель цитомегаловируса, главный промотер мышиного бета глобина, источник репликации SV40, последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста, экзоны 1 и 2 неомицин фосфотрансферазы, ген дигидрофолат редуктазы и ведущую последовательность. В соответствии с одним вариантом осуществления рассматриваемая полиспецифичная молекула включает синтетический связывающий пептид. Такие полиспецифичные молекулы содержат один или больше сайтов связывания известной мишени и экспрессируют библиотеку по одному или больше сайтов связывания. Такие полиспецифичные молекулы можно использовать, например, для идентификации молекул в близком соседстве с или связан- 76 - 015992 ные с известной мишенью. Например, специалист может проанализировать рассматриваемые полиспецифичные молекулы с целью выбрать такие молекулы, которые индуцируют конкретный ответ, например, апоптоз или активацию клеток, используя хорошо известные способы скрининга. Затем можно идентифицировать биспецифическую молекулу, генерирующую искомый ответ, и определить ее специфичность. Используя указанные способы, можно идентифицировать молекулы в близкой ассоциации с конкретными интересующими мишенями, например, маркеры Т-клеток или другие сигнальные молекулы (такие как CRIPTO-I, молекулы домена смерти или молекулы, вовлеченные в апоптоз). Близость известной мишени и молекулы, недавно идентифицированной как "ближайший сосед", можно подтвердить способами иммунопреципитации или другими технологиями, известными специалистам. Указанные способы позволяют также идентифицировать молекулы как мишени для модулирования конкретного клеточного ответа. Специфичность связывания, включающая сайты распознавания или целые вариабельные области полиспецифической связывающей молекулы, в частности полиспецифических антител или вариантов антител изобретения, можно определить из анализа одного или нескольких родительских антител. Родительские антитела могут включать природные антитела или их фрагменты, антитела или их фрагменты, адаптированные из природных антител, антитела, сконструированные de novo с использованием последовательностей антител или их фрагментов, о которых известно, что они являются специфическими целевыми молекулами. Последовательности, которые могут быть получены из родительских антител, включают вариабельные области тяжелых и/или легких цепей и/или CDR, каркасные области или другие фрагменты. В соответствии с одним примером реализации изобретения родительские антитело, используемое для конструирования полиспецифической TNFR связывающей молекулы, представляет собой антиTRAIL-R2 антитело, например 14А2, и анти-LTβR антитело, например СВЕ11 или ВНА10. Многовалентные, полиспецифичные антитела могут содержать тяжелую цепь из двух или более вариабельных областей и/или легкую цепь из одного или более вариабельных областей, где по крайней мере две вариабельных области узнают различные эпитопы LTβR. Полиспецифичные, например, биспецифичные TNFR связывающие молекулы можно сконструировать различными способами с использованием множества разнообразных последовательностей, производных от родительских анти-LTβR антител, включая мышиные или гуманизированные ВНА10 (Browning et al., J. Immunol. 154:33 (1995); Browning et al. J. Exp. Med. 183:867 (1996)), мышиные или гуманизированные СВЕ11 (патент US 6312691 и WO 02/30986 соответственно), и/или родительские анти-TRAIL-R2 мышиные или химерные 14А2. Примеры анти-LTβR антител, которые могут использоваться для конструирования биспецифических TNFR связывающих молекул изобретения, включают состоящие из BKA11, CDH10, BCG6, AGH1, BDA8, CBE11 и ВНА10 или ВНА10. Следующие далее линии клеток гибридомы, продуцирующие моноклональные анти- LT-β-R антитела, можно использовать для продукции анти-LTβR антител, из которых получают последовательности конструктов антител. Эти линии хранятся в американской коллекции культур типов (American Type Culture Collection (ATCC)) в соответствии с поручением Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры под соответствующими номерами АТСС: Другие примеры антител против TNF-рецепторов, которые могут использоваться в полиспецифических TNFR связывающих молекулах изобретения, включают антитела, направленные против TNFрецепторов, включающих домен смерти. Множество антител было сгенерировано для TNF-рецепторов с доменами смерти, они хорошо известны в уровне техники. Такие антитела включают анти-TNF-R1 моноклональные антитела (R&D системы анти-TNF-R1; Tularik mAb № 985, патенты США № 6110690; - 77 - 015992 6437113), анти-Fas рецепторы mAb CH-11 (патент США № 6312691; WO 95/10540), анти-DR3 антитела (патент США № 5985547; Johnson, et al. (1984), ImmunoBiology of HLA, ed. Dupont, B.O., Springer, New York; патенты США № 6462176; 6469166) и анти-TRAIL-R антитела (патенты США № 5763223; 6072047; 6284236; 6521228; 6569642; 6642358 и 6417328). Большое количество антител было также продуцировано для TNF-рецепторов, участвующих в дифференциации тканей, они хорошо известны в уровне техники. Примеры антител к TNF-рецепторам, специфических для TNF-рецепторов, включают анти-RANK моноклональные антитела (Immunex - патенты США № 6562948, 6537763, 6528482, 6479635, 6271349, 6017729; Komed - WO 03/080671), антиEDAR поликлональные (античеловеческие) и моноклональные (антимышиные) антитела (R&D Systems MAB745, BAF157; Elomaa et al. (2001), Human Molecular Genetics. 10:953), анти-XEDAR моноклональные и поликлональные антитела (R&D Systems- MAB1093 и AF1093), анти-Fn14 моноклональные антитела (Nakayama et al. (2003), J. Immunology 170:341; ITEM-1, ITEM-2 и ITEM-4 клоны, доступные в eBioscience), анти-TROY антитело (Т3323 from Sigma-Aldrich) и анти-NGFR (антигрызуны) антитело (Chemicon USA). Большое количество антител было также выращено для TNF-рецепторов, участвующих в иммунорегуляции, они хорошо известны в уровне техники. Примеры антител к TNF-рецепторам, специфических для TNF-рецепторов, вовлеченных в иммунорегуляцию, включают анти-HVEM антитела (HGSI WO 03/086301), анти-CD40 антитела (Biogen - WO 97/20063; Chiron - патенты США № 5677165; 5874082; 6004552; 6056959; 6315998; патентная заявка США № 2002/0106371; патентные заявки США № 2003/0059427; 20030118588А1; 2003/0211100А1; 2002020142358А1; патенты США № 6312693; 6051228; Fanslow et al. - 5801227), анти-4-1ВВ (международная публикация WO 03/084999; ЕР 0948353; патент США № 6210669; Genecraft - WO 03/083069) и анти-BAFF-R антитела (кроличьи поликлональные ProSci catalog № 3097), а также большое количество других антител, выращенных для рецепторов, регулирующих иммунитет. Специалист может разработать большое количество других многовалентных конструктов антител, используя рутинные технологии рекомбинирования ДНК, например, описанные в следующих работах: РСТ International Application № PCT/US86/02269; European Patent Application № 184187; European Patent Application № 171496; European Patent Application № 173494; PCT International Publication № WO 86/01533; US Pat. № 4816567; European Patent Application № 125,023; Better et al. (1988), Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987), J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987), Cancer Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985), Nature 314:446-449; Shaw et al. (1988), J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison (1985), Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986), BioTechniques 4:214; US Pat. № 5225539; Jones et al. (1986), Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988), Science 239:1534; Beidler et al. (1988), J. Immunol. 141:4053-4060; Winter и Milstein, Nature, 349, p. 293-99 (1991). Предпочтительно, если нечеловеческие антитела "гуманизируют", связывая нечеловеческий антигенсвязывающий домен с человеческим константным доменом (например, Cabilly et al., US Pat. № 4816567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, p. 6851-55 (1984)). Другие способы, которые могут быть использованы для приготовления многовалентных конструктов антител, описаны в следующих публикациях: Ghetie, Maria-Ana et al. (2001), Blood 97:1392-1398; Wolff, Edith A. et al. (1993), Cancer Research 53:2560-2565; Ghetie, Maria-Ana et al. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. 94:7509-7514; Kim, J.C. et al. (2002), Int. J. Cancer 97(4):542-547; Todorovska, Aneta et al. (2001), Journal of Immunological Methods 248:47-66; Coloma M.J. et al. (1997), Nature Biotechnology 15:159-163; Zuo, Zhuang et al. (2000), Protein Engineering (Suppl.) 13(5):361-367; Santos A.D., et al. (1999), Clinical Cancer Research 5:3118s-3123s; Presta, Leonard G. (2002), Current Pharmaceutical Biotechnology 3:237-256; van Spriel, Annemiek et al. (2000), Review Immunology Today 21(8):391-397. XI. Экспрессия связывающих молекул. После работы с изолированным генетическим материалом для получения полипептидов изобретения, как описано выше, гены, как правило, встраивают в вектор экспрессии для индукции в клеткухозяина, которые, в свою очередь, позволяют получить требуемое количество полипептида, а последний приводит к заявленным связывающим молекулам. Термин "вектор" или "вектор экспрессии" в целях спецификации и формулы изобретения означает векторы, используемые в соответствии с настоящим изобретением в качестве носителя для внедрения в клетку и экспрессии там желаемого гена. Как хорошо известно специалистам, такие векторы можно легко выбрать из группы, состоящей из плазмид, фагов, вирусов и ретровирусов. В общем случае, совместимые с настоящим изобретением векторы содержат маркер выбора, соответствующие сайты рестрикции, облегчающие клонирование желательного гена, а также возможность встраиваться и/или реплицироваться в эукариотических или прокариотических клетках. В целях настоящего изобретения могут использоваться многочисленные системы экспрессии векторов. Например, один класс векторов использует элементы ДНК, производные от вирусов животных, такие как вирус папилломы быка, вирус полиомы, аденовирус, вирус коровьей оспы, бакуловирус, ретровирусы (RSV, MMTV или MOMLV) или SV40 вирус. Другие вовлекают использование полицистрон- 78 - 015992 ных систем с внутренними сайтами связывания рибосом. Кроме того, клетки, интегрировавшие ДНК в свои хромосомы, можно выбрать для введения одного или больше маркеров, обеспечивающих селекцию трансфицированных клеток-хозяев. Маркеры могут вносить прототропию ауксотропным хозяйским клеткам, резистентность к биоцидом (например, антибиотикам) или тяжелым металлам, таким как медь. Ген выбираемого маркера может либо быть напрямую связан с экспрессируемой последовательностью ДНК, либо вводиться в ту же клетку совместной трансформацией. Для оптимального синтеза мРНК могут потребоваться дополнительные элементы. Эти элементы могут включать сигнальные последовательности, сигналы сплайсинга, а также промотеры, усилители транскрипции и сигналы завершения. В соответствии с особенно предпочтительными направлениями реализации изобретения клонированные гены вариабельных областей вводят в вектор экспрессии совместно с генами (предпочтительно человеческими) константных областей тяжелых и легких цепей, синтезированными, как описано выше. Предпочтительно на это влияют с помощью коммерческого вектора экспрессии IDEC, Inc., называемого NEOSPLA (патент US 6159730). Этот вектор включает промотер/усилитель цитомегаловируса, главный промотер мышиного бета глобина, источник репликации SV40, последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста, экзоны 1 и 2 неомицинфосфотрансферазы, ген дигидрофолатредуктазы и ведущую последовательность. Как показано в приводимых ниже примерах, обнаружено, что данный вектор приводит к очень высокому уровню экспрессии антител при внедрении генов вариабельных и константных областей, трансфекции в клетках СНО, сопровождаемой селекцией в G418-включающей среде и амплификацией метотрексата. Векторные системы описаны также в патентах US № 5736137 и 5658570, каждый из которых включен сюда по ссылке в своей полноте. Эта система обеспечивает высокие уровни экспрессии, например >30 пг/клетку/день. Другие примеры векторных систем описаны, например, в патенте US 6413777. В соответствии с другими предпочтительными аспектами полипептиды настоящего изобретения можно экспрессировать с использованием полицистронных конструктов, таких как описаны в поданной совместно с данной заявкой американской предварительной патентной заявке № 60/331481, поданной 16 ноября 2001 г. и включенной сюда по ссылке во всей своей полноте. В этих новых системах экспрессии из одного полицистронного конструкта можно получить многочисленные интересующие генные продукты, такие как тяжелые и легкие цепи антител. Такие системы с выгодой используют внутренний сайт ввода рибосом (internal ribosome entry site (IRES)) с получением относительно высокого содержания полипептидов изобретения в эукариотических клетках-хозяевах. Совместимые последовательности IRES описаны в патенте US № 6193980, который также включен сюда по ссылке. Специалисты понимают, что такие системы экспрессии можно использовать для эффективного получения полного диапазона полипептидов, описанных в настоящем изобретении. Обобщая, можно сказать, что, как только вектор или последовательность ДНК, кодирующая мономерную субъединицу связывающей молекулы (например, модифицированное антитело), получен, вектор экспрессии можно ввести в соответствующую клетку-хозяина. Это означает, что клетки-хозяива могут быть трансформированы. Введение плазмиды в хозяйскую клетку может быть выполнено различными способами, хорошо известными специалистам. Эти способы включают, но не ограничиваются, трансфекцию (включая электропорез и электропорацию), гибридизацию протопласта, осаждение фосфатом кальция, гибридизацию клеток с помощью ДНК оболочки, микроинъекцию и инфекцию интактным вирусом. См., например, Ridgway, A.A.G. "Mammalian Expression Vectors", Chapter 24, 2, p. 470-472, Vectors, Rodriguez и Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988). Наиболее предпочтительно вводить плазмиду в хозяйскую клетку способом электропорации. Трансформированные клетки выращивают в условиях, соответствующих продукции легких и тяжелых цепей, и анализируют на белковый синтез тяжелых и легких цепей. Примеры способов анализа включают твердофазный иммуноферментный анализ (ТИФА или ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) или анализ сортировщиком флуоресцентно-активированных клеток (FACS), иммуногистохимию и т.д. Термин "трансформация" здесь используется в широком смысле, означая введение ДНК в хозяйскую клетку реципиента, которая изменяет генотип и соответственно приводит к изменению клетки реципиента. Термин "клетка-хозяин" или "хозяйская клетка" означает клетки, трансформированные векторами, сконструированными с использованием способов рекомбинантной ДНК и кодирующими по крайней мере один гетерологичный ген. При описании процессов выделения полипептидов из рекомбинантных хозяев термины "клетка" и "клеточная культура" используются, заменяя друг друга, чтобы обозначить исходное антитело, если только явным образом не указано по-другому. Иными словами, восстановление полипептида из "клетки" может означать либо откручивание целых клеток на центрифуге, либо даже всей клеточной культуры, включающей среду и суспендированные клетки. В соответствии с одним вариантом осуществления линия хозяйских клеток, используемая для экспрессии белка (например, многовалентной связывающей молекулы), взята из млекопитающих; специалисты могут определить конкретные линии хозяйских клеток, которые лучше всего приспособлены для экспрессии в них желательного генного продукта. Примеры хозяйских клеток включают, но не ограничиваются, DG44 и DUXB11 (линия клеток яичников китайского хомячка, без DHFR), HELA (карцинома шейки матки человека), CVI (линия почек мартышки), клетки COS (производные CVI с антигеном SV40 - 79 - 015992 Т), клетки R1610 (Chinese hamster fibroblast, фибробласты китайского хомячка), клетки BALBC/3T3 (фибробласты мыши), клетки HAK (hamster kidney line, линия почек хомячка), клетки SP2/O (миелома мыши), P3.times.63-Ag3653 (мышиная миелома), клетки BFA-1c1BPT (бычьи эндотелиальные клетки), RAJI (человеческие лимфоциты) и клетки 293 (почка человека). В соответствии с одним направлением реализации можно использовать клетки NSO. Клетки СНО особенно предпочтительны. Как правило, линии хозяйских клеток доступны из коммерческих источников, американской коллекции тканей культур или из опубликованной литературы. Продуцирование in vitro может быть масштабировано, чтобы получить большое количество требуемых полипептидов. Технологии культивации клеток млекопитающих в культурах тканей известны в уровне техники и включают гомогенизацию культуры суспензии, например, в эрлифтном реакторе или в реакторе с непрерывным перемешиванием, либо иммобилизацию или захват клеточной культуры, например, в полом волокне, микрокапсулах, на агарозных микрошариках или керамических картриджах. Если надо, то растворы полипептидов можно очистить обычными хроматографическими способами, такими как гель-фильтрация, ион-обменная хроматография, хроматография через DEAE-целлюлозу или (иммуно-)аффинная хроматография, например, после предпочтительного биосинтеза полипептидов синтетических окраинных областей или до и после хроматографии HIC, описанной в настоящем изобретении. Гены, кодирующие полипептид изобретения, можно также экспрессировать в клетках немлекопитающих, таких как клетки бактерий, дрожжей или растений. В этом отношении надо понимать, что различные одноклеточные микроорганизмы, такие как бактерии, также можно трансформировать, т.е. это касается микроорганизмов, способных к росту в культуре или ферментере. Бактерии, восприимчивые к трансформации, включают члены семейства enterobacteriaceae, такие как штаммы Escherichia coli или Salmonella; Bacillaceae, такие как Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenzae. Следует также понимать, что при экспрессии в бактериях полипептиды, как правило, становятся частью телец включения. Полипептиды необходимо выделить, очистить и затем собрать в функциональные молекулы. Если желательна четырехвалентная форма антител, субъединицы затем сами собираются в четырехвалентные антитела (WO 02/096948A2). Помимо прокариотов можно использовать и эукариотические микробы. Чаще всего среди эукариотических микроорганизмов используют Saccharomyces cerevisiae или обычные пекарские дрожжи, хотя доступно и множество других штаммов. Для экспрессии в Saccharomyces, обычно, используют плазмиду YRp7 (например, Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)). Эта плазмида уже включает ген TRP1, который является маркером селекции мутантного штамма дрожжей, не способных расти в триптофане, например, АТСС № 44076 или РЕР4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)). Наличие повреждений trpl как характеристики генома хозяйских клеток дрожжей предоставляет эффективное окружение для регистрации трансформации путем роста в отсутствие триптофана. XII. Мечение и конъюгирование связывающих молекул. Связывающие молекулы настоящего изобретения могут быть использованы в неконъюгированной форме или быть конъюгированы по крайней мере с одним из множества эффекторов, т.е. функциональных молекул, например, чтобы облегчить детекцию мишени, а также для визуализации или лечения пациента. Полипептиды изобретения можно пометить или конъюгировать как до, так и после очистки, если очистка выполняется. В частности, полипептиды настоящего изобретения можно конъюгировать с цитотоксинами (такими как радиоизотопы, цитотоксические препараты или токсины), цитостатическими агентами, биологическими токсинами, пролекарствами, пептидами, белками, ферментами, вирусами, липидами, модификаторами биологического ответа, фармацевтическими агентами, иммунологически активными лигандами (например, лимфокинами или другими антителами, где полученная молекула связывается с неопластической и эффекторной клеткой, такой как Т-клетка), PEG или или регистрируемыми молекулами, полезными при визуализации. В соответствии с другим вариантом осуществления полипептид изобретения можно конъюгировать с молекулой, которая снижает васкуляризацию опухолей. В соответствии с другими аспектами описываемая композиция может содержать полипептиды изобретения, сопряженные с лекарствами или пролекарствами. Дополнительные аспекты настоящего изобретения включают использование полипептидов изобретения, конъюгированных со специфическими биотоксинами или их цитотоксическими фрагментами, такими как рицин, гелонин, экзотоксин псевдомонас или токсин дифтерии. Выбор конъюгированных и неконъюгированных полипептидов для использования зависит от типа и стадии рака, применения дополнительной терапии (например, химиотерапии или внешнего облучения) и состояния пациента. Следует понимать, что специалист легко сможет сделать такой выбор в свете изложенной здесь информации. В проведенных ранее исследованиях противоопухолевые антитела, помеченные изотопами, успешно использовались для разрушения клеток солидных опухолей, а также лимфом/лейкемий на животных моделях и иногда на людях. Примеры радиоизотопов включают 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67 Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re и 188Re. Действие радионуклидов основано на ионизирующем излучении, которое вызывает многочисленные повреждения цепей ДНК, ведущие к гибели клеток. Используемые в терапевтических конъюгатах изотопы, как правило, дают высокоэнергетические α- или β-частицы с коротким - 80 - 015992 радиусом действия. Такие радионуклиды убивают клетки, находящиеся поблизости, например, неопластические клетки, к которым прикреплен конъюгат, или в которые он был введен. На расположенные вдалеке клетки изотопы оказывают очень небольшой эффект, или не оказывают его совсем. Как правило, радионуклиды неиммуногенны. Что касается использования радиоактивно меченых конъюгатов совместно с настоящим изобретением, то полипептиды изобретения можно пометить непосредственно (например, способом иодирования), а можно и косвенно действием хелатирующего агента. Фразы "косвенное мечение", "непрямое мечение" означают, что хелатор ковалентно прикрепляется к связывающей молекуле и с хелатором ассоциирован по крайней мере один радионуклид. Такие хелаторы, как правило, называют бифункциональными, поскольку они связываются с полипептидом и изотопом. Особо предпочтительные хелаторы включают производные 1-изотиоцикмато-бензил-3-метилдиотилен триаминопентауксусной кислоты ("MX-DTPA") и циклогексил диэтилентриамин пентауксусной кислоты ("CHX-DTPA"). Другие хелаторы включают производные P-DOTA и EDTA. Особо предпочтительные для непрямого мечения радионуклиды включают 111In и 90Y. Здесь фраза "прямое мечение" означает, что радионуклид ковалентно связан непосредственно с полипептидом (как правило, через аминокислотный остаток). Более конкретно, эти технологии связывания включают мечение случайным образом и сайт-направленное мечение. В последнем случае мечение направлено на специфичные сайты полипептида, такие как N-связанные остатки сахаров, присутствующие только на Fc-участках конъюгатов. Более того, с настоящим изобретением совместимы различные технологии и протоколы прямого мечения. Например, полипептид, меченный технецием-99m, можно приготовить процессом обмена лигандами, восстановлением пертехната (ТсО4-) в растворе двухвалентного олова, хелатированием восстановленного технеция на колонке Sephadex и нанесением на эту колонку полипептидов, а можно с использованием технологий пакетного мечения, например, инкубируя пертехнат, восстановитель, такой как SnCl2, буферный раствор, такой как раствор натрий-калий-фталата, и антитело. В любом случае предпочтительные для прямого мечения антител радионуклиды хорошо известны в уровне техники, а особенно предпочтительным радионуклидом является 131I, ковалентно связанный через остатки тирозина. Соответствующие настоящему изобретению полипептиды могут быть получены, например, с использованием радиоактивного иодида натрия и калия и химического окислителя, такого как гипохлорид натрия, хлорамин Т или подобные им, либо ферментативного окислителя, такого как лактопероксидаза, глюкозоксидаза и глюкоза. Однако для целей настоящего изобретения особо предпочтительным является непрямое мечение. Патенты, относящиеся к хелаторам и их конъюгатам, хорошо известны в уровне техники. Например, патент США № 4831175 автора Gansow направлен на полизамещенные комплексы диэтилентриаминпентауксусной кислоты и включающие их белковые конъюгаты, а также на способы их приготовления. Патенты США № 5099069, 5246692, 5286850, 5434287 и 5124471 от Gansow также относятся к полизамещенным комплексам DTPA. Эти патенты включены сюда по всей своей полноте. Другими примерами совместимых хелаторов металлов является этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДПТА), 1,4,8,11-тетраазатетрадекан, 1,4,8,11-тетраазатетрадекан1,4,8,11-тетраукусная кислота, 1-окса-4,7,12,15-тетраазагептадекан-4,7,12,15-тетрауксусная кислота или подобные вещества. Особо предпочтительны циклогексил-ДТПА и СГХ-ДТПА, далее они рассматриваются подробнее. Другие совместимые хелаторы, включая такие, которые еще только предстоит открыть, могут быть легко выбраны опытным специалистом и, очевидно, также входят в область настоящего изобретения. Совместимые хелаторы, включая специфичные бифункциональные хелаторы, используемые для облегчения хелатирования в поданных совместно с данной заявкой патентных заявках США № 08/475813, 08/475815 и 08/478967, предпочтительно выбираются, чтобы обеспечить высокое сродство с трехвалентными металлами, показывают увеличенный радиус опухоль-не-опухоль и уменьшенное поглощение костной тканью, а также большее удержание радионуклидов in vivo в целевых сайтах, т.е. в сайтах В-клеточной лимфомы. Однако другие бифункциональные хелаторы, которые могут обладать или не обладать всеми этими характеристиками, также известны в уровне техники и могут с выгодой использоваться в терапии опухолей. Следует также понимать, что в соответствии с приведенной здесь информацией полипептиды можно конъюгировать с различными радиоактивными метками с диагностическими и терапевтическими целями. В связи с этим упомянутые выше совместно поданные заявки, включенные сюда по ссылкам во всей своей полноте, раскрывают использование радиоактивно меченых терапевтических конъюгатов для диагностического "картирования" опухолей перед введением терапевтических антител. Конъюгат In2В8 включает мышиное моноклональное антитело, 2В8, специфичное для человеческих антигенов CD20, которые связаны с 111In посредством бифункционального хелатора, т.е. МХ-ДТПА (диэтилентриаминпентауксусной кислоты), который включает смесь 1:1 1-изотиоцианатобензил-3-метил-DTPA и 1-метил-3изотиоцианатобензил-DTPA. 111In особо предпочтителен в качестве диагностического радионуклида, потому что приблизительно от 1 до 10 mCi можно безопасно вводить, не вызывая заметной токсичности, а данные картирования в целом позволяют спрогнозировать последующее распределение Y-меченых - 81 - 015992 антител. Большинство исследований картирования использует 5 mCi 111In-меченое антитело, потому что эта доза безопасна и характеризуется повышенной эффективностью по сравнению с более низкими дозами, причем оптимальное картирование можно провести в момент времени от трех до шести дней после введения антитела. См., например, Murray, J. Nuc. Med. 26: 3328 (1985) и Carraguillo et al., J. Nuc. Med. 26: 67 (1985). Как уже упоминалось, к настоящему изобретению применимо множество радионуклидов, и специалист легко может определить, какой радионуклид наиболее пригоден в различных обстоятельствах. Например, 131I предсталяет собой хорошо известный радионуклид, используемый для направленной иммунотерапии. Однако клиническая пригодность 131I может быть ограничена несколькими факторами, включая: восьмидневный период полураспада; дегалогенирование иодированного антитела в крови и в сайтах опухолей, а также характеристики эмиссии (например, большой компонент гамма), которая может быть субоптимальна для локализованной депозиции дозы в опухоли. С появлением новых превосходных хелаторов возросли возможности связывания металлических хелатирующих групп с белками, а следовательно, появилась возможность использовать и другие радионуклиды, такие как 111In и 90Y. 90Y связан с несколькими преимуществами при использовании в радиоиммунотерапевтических приложениях: 64 период полураспада 90Y - это достаточно долго, чтобы обеспечить накопление антитела в опухоли, и, в отличие, например, от 131I, 90Y излучает только бета-лучи высокой энергии без сопровождающего распад гаммаизлучения, при этом оказывается затронутой ткань на расстоянии от 100 до 1000 клеточных диаметров. Более того, минимальное количество проникающей радиации позволяет вводить 90Y-меченые антитела амбулаторно. Кроме того, для уничтожения клеток не требется интернализация меченого антитела, и локальная эмиссия ионизирующего излучения должна быть летальной для прилегающих клеток опухолевых тканей без молекулы мишени. Специалисты должны понимать, что эти нерадиоактивные конъюгаты могут также быть собраны различными способами, в зависимости от выбранного для конъюгации агента. Например, конъюгаты с биотином готовят реакцией полипептидов с активированным эфиром биотина, таким как биотин Nгидроксисукцимида эфир. Аналогично, конъюгаты с флуоресцентными маркерами можно приготовить в присутствии агента присоединения, например, приведенного выше, или реакцией с изотиоцианатом, предпочтительно флуоресцин-изотиоцианатом. Конъюгаты полипептидов изобретения с цитостатическими/цитотоксичными веществами и хелаторами металлов готовят аналогично. У многих эффекторных молекул отсутствуют функциональные группы, с которыми может связаться антитело. В соответствии с одним вариантом осуществления эффекторная молекула, например, лекарство или пролекарство, связывается с антителом посредством связывающей молекулы. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула включает химическую связь, обеспечивающую активацию цитотоксичности в конкретном сайте. Подходящие химические связи хорошо известны в уровне техники и включают дисульфидную связь, кислотные лабильные связи, фотолабильные связи, пептидаз-лабильные связи, тиоэфирные связи, сформированные между сульфгидрильной и малеимидной группами, а также эстеразные лабильные связи. Наиболее предпочтительно связывающая молекула включает дисульфидную связь и тиоэфирную связь. В соответствии с изобретением связывающая молекула предпочтительно включает реактивную химическую группу. Особо предпочтительные реактивные химические группы - это N-сукцинимидильные эфиры и N-сульфосукцинимидильные эфиры. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления реактивная химическая группа может быть ковалентно связана с эффектором посредством дисульфидной связи между тиоловыми группами. В соответствии с одним направлением реализации молекула эффектора модифицируется так, чтобы содержать тиоловую группу. Специалист понимает, что тиоловая группа включает атом серы, связанный с атомом водорода, и, как правило, называется в уровне техники сульфгидрильной группой, обозначаемой как "-SH" или "RSH." В соответствии с одним вариантом осуществления соединяющая молекула может использоваться для объединения эффекторной молекулы и связывающей молекулы. Связывающая молекула изобретения может быть отщепляемой и неотщепляемой. В соответствии с одним вариантом осуществления отщепляемая связывающая молекула представляет собой редокс-отщепляемую связывающую молекулу, такую что связывающая молекула отщепляется в окружении с пониженным редокс-потенциалом, таком как цитоплазма и другие области с более высокой концентрацией молекул со свободными сульфгидрильными группами. Примеры соединяющих молекул, которые могут отщепляться при изменении редокспотенциала, включают молекулы, включающие сульфиды. Отщепляющий стимул можно применить при внутриклеточном захвате белка связывания изобретения, где более низкий редокс-потенциал цитоплазмы облегчает отщепление связывающей молекулы. В соответствии с другим вариантом осуществления снижение рН запускает выброс перенесенного груза в клетку-мишень. Снижение рН имеет место во многих физиологических и патологических процессах, таких как перемещения эндосом, рост опухоли, воспаление и миокардиальная ишемия. рН снижается с физиологического значения 7,4 до 5-6 в эндосомах и 4-5 в лизосомах. Примеры чувствительных к закислению соединяющих молекул, которые могут использоваться для действия на лизосомы и эндосомы раковых клеток, включают включающие разрушаемые при закислении связи, такие как бывают в ацеталях, кеталях, ортоэфирах, гидразонах, тритилах, цис- 82 - 015992 аконитилах и тиокарбамоилах (см., например, Willner et al. (1993), Bioconj. Chem., 4: 521-7; US Pat. № 4569789, 4631190, 5306809 и 5665358). Другие примеры чувствительных к закислению соединяющих молекул включают дипептидные последовательности Phe-Lys и Val-Lys (King et al. (2002), J. Med. Chem., 45: 4336-43). Стимул отщепления может применяться при движении внутри клетки и попадании там в эндосомальные отделы с низким рН (например, в лизосомы). Другие примеры расщепляемых при закислении эндосомальных молекул включают молекулы, включающие две или более разрушаемые при закислении связи, используемые для присоединения двух или более майтансиноидов (maytansinoids (King et al. (1999), Bioconj. Chem., 10: 279-88; WO 98/19705)). Расщепляемые связывающие молекулы могут быть чувствительны к действию биологических отщепляющих агентов, которые ассоциированы с конкретной клеткой-мишенью, например, лизосомальным или ассоциированным с опухолью ферментам. Примеры соединяющих молекул, которые могут отщепляться ферментативно, включают, но не ограничиваются, пептиды и сложные эфиры. Примеры ферментов, отщепляющих связывающие молекулы, включают те, которые чувствительны к действию опухоль-ассоциированных протеаз, таких как катепсин В или плазмин (Dubowchik et al. (1999), Pharm. Then, 83: 67-123; Dubowchik et al. (1998), Bioorg. Med. Chem. Lett., 8: 3341-52; de Groot et al. (2000), J. Med. Chem., 43: 3093-102; de Groot et al. (1999), 42: 5277-83). Расщепляемые катепсином В сайты включают дипептидные последовательности валин-цитруллин и фенилаланин-лизин (Doronina et al. (2003), Nat. Biotech., 21(7): 778-84); Dubowchik et al. (2002), Bioconjug. Chem., 13: 855-69). Другие примеры ферментативно-расщепляемых сайтов включают образуемые олигопептидными последовательностями из 4-16 аминокислотных остатков (например, Suc-β-Ala-Leu-Ala-Leu), которые распознаются протеазами типа trouse proteases, такими как олигопептидаза Тимета (Thimet Oliogopeptidase (ТОР)), фермент, предпочтительно выделяемый нейтрофилами, макрофагами и другими гранулоцитами. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула образуется при реакции связывающей молекулы по изобретению с соединяющей молекулой формулы X-Y-Z, где X - присоединяемая молекула; Y - связывающая молекула (спэйсер) и Z - эффекторная присоединяемая группа. Термин "присоединяемая молекула к связывающей молекуле" включает молекулы, дающие возможность ковалентного прикрепления соединяющего пептида к связывающей молекуле изобретения. Присоединяемая молекула может содержать, например, ковалентную цепь из 1-60 атомов углерода, кислорода, азота, серы, возможно, замещенных атомами водорода и другими заместителями, позволяющая связывающей молекуле выполнять свои функции. Присоединяемая молекула может содержать пептидные, сложноэфирные, алкильные, алкенильные, алкинильные, арильные, эфирные, тиоэфирные и т.д. функциональные группы. Предпочтительно прикрепляющую молекулу выбирают так, чтобы она была способна реагировать с реактивной функциональной группой полипептида, включающей по крайней мере один антигенсвязывающий сайт, с образованием связывающей молекулы изобретения. Примеры прикрепляющих молекул включают, например, амино, карбоксилат и тиолвключающие присоединяемые молекулы. Аминосодержащие присоединяемые молекулы включают молекулы, реагирующие с аминогруппами полипептида такими, что образуется связывающая молекула по изобретению. Аминосодержащие присоединяемые молекулы известны в уровне техники. Их примеры включают активированные карбамиды (например, которые могут реагировать с аминогруппой на связывающей молекуле с образованием линкерной молекулы, включающей группу мочевины), альдегиды (например, которые могут реагировать с аминогруппой на связывающей молекуле) и активированные изоцианаты (которые могут реагировать с аминогруппой на связывающей молекуле с образованием линкерной молекулы, включающей группу мочевины). Примеры аминосодержащих присоединяемых молекул включают, но не ограничиваются, молекулы N-сукцинимидила, N-сульфосукцинимидила, N-фталимидила, N-сульфофталимидила, 2нитрофенила, 4-нитрофенила, 2,4-динитрофенила, 3-сульфонил-4-нитрофенила или 3-карбокси-4нитрофенила. Карбоксилатсодержащие присоединяемые молекулы включают молекулы, реагирующие с карбоксилатными группами полипептида такими, что образуется связывающая молекула по изобретению. Карбоксилатсодержащие присоединяемые молекулы известны в уровне техники. Их примеры включают, но не ограничиваются, активированные сложноэфирные интермедиаты и активированные карбонильные интермедиаты, которые способны реагировать с группой СООН на связывающей молекуле с образованием линкерной молекулы, включающей сложноэфирную, тиоэфирную или амидную группы. Тиолсодержащие присоединяемые молекулы включают молекулы, реагирующие с тиоловыми группами полипептида, такими что образуется связывающая молекула по изобретению. Тиолсодержащие присоединяемые молекулы известны в уровне техники. Их примеры включают активированные ацильные группы (которые могут реагировать с сульфгидрилом связывающей молекулы с образованием линкерной молекулы, включающей тиоэфир), активированные алкильные группы (которые могут реагировать с сульфгидрилом связывающей молекулы с образованием линкерной молекулы, включающей тио- 83 - 015992 эфир), акцепторы Михаэля, такие как малеинимид или акриловые группы (которые могут реагировать с сульфгидрилом связывающей молекулы с образованием, например, линкерной молекулы, включающей молекулу дисульфида). Другие тиолсодержащие присоединяемые молекулы включают акриламиды, альфа-иодоацетамиды и циклопропан-1,1-дикарбонильные соединения. Кроме того, тиолсодержащие присоединяемые молекулы могут содержать молекулы, модифицирующие тиоловую группу связывающей молекулы с образованием другой реактивной группы, к которой может быть прикреплена линкерная молекула с образованием связывающей молекулы по изобретению. Спэйсер, молекула Y, представляет собой ковалентную связь или ковалентную цепочку атомов, которая может содержать один или более аминокислотных остатка. Она может содержать 0-60 атомов углерода, кислорода, серы или азота, необязательно замещенных водородом или другими заместителями, позволяющими образующейся связывающей молекуле выполнять свою функцию. В соответствии с одним вариантом осуществления Y включает алкин, алкенил, алкинил, сложный или простой эфир, карбонил или амид. В соответствии с другим вариантом осуществления тиоловая группа на связывающей молекуле конвертируется в реактивную группу, такую как реактивная карбонильная группа, например кетон или альдегид. Затем прикрепляющая молекула реагирует с кетоном или альдегидом с образованием желательных соединений изобретения. Примеры карбонильных реактивных групп включают, но не ограничиваются, гидразины, гидразиды, О-замещенные гидроксиламины, альфа-бета-ненасыщенные кетоны и H2C=CH-CO-NH-NH2. Другие примеры прикрепляющих молекул и способов идентификации тиоловых молекул, которые могут использоваться для формирования связывающих молекул изобретения, описаны в работах Pratt, М.L. et al. J. Am Chem Soc. 2003 May 21; 125(20):6149-59; и Saxon, E. Science. 2000 Mar 17; 287(5460):2007-10. Линкерная молекула может быть способна реагировать с молекулой-эффектором или ее производной с образованием связывающей молекулы изобретения. Например, эффекторная молекула может быть связана с оставшимся фрагментом (фрагментами) молекулы через дисульфидную связь. В таких случаях линкерная молекула выбирается так, чтобы она могла реагировать с соответствующим производным эффекторной группы, так чтобы эффекторная молекула была бы связана со связывающей молекулой изобретения. Как уже показано выше, линкерная молекула и/или связывающий пептид в целом могут быть выбраны так, чтобы связывающий пептид отщеплялся в соответствующем окружении. Особо предпочтительные связывающие пептиды включают, например, N-сукцинимидил 3-(2пиридилтио)пропионат (SPDP) (см., например, Carlsson et al., Biochem. J., 173, 723-737 (1978)), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилтио)бутаноат (SPDB) (см., например, патент US № 4563304), N-сукцинимидил 4-(2-пиридилтио)пентаноат (SPP) (см., например, CAS Registry number 341498-08-6), N-сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC) (см., например, Yoshitake et al., Eur. J. Biochem., 101, 395-399 (1979)) и N-сукцинимидил 4-метил-4-[2-(5нитропиридил)дитио]пентаноат (SMNP) (см., например, патент US № 4563304). Наиболее предпочтительные связывающие пептидные молекулы, используемые в составе композиций изобретения, - это SPP, SMCC и SPDB. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления SPDB используется для соединения эффекторной молекулы и связывающей молекулы изобретения. Предпочтительные цитотоксические эффекторные молекулы для использования в настоящем изобретении - это цитотоксические препараты, в особенности те, которые применяются при терапии рака. Здесь термин "цитотоксин или цитотоксический агент" означает любой агент, нарушающий процесс роста и пролиферации клеток и способный снизить, заингибировать или разрушить клетку или злокачественность. Примеры цитотоксинов включают, но не ограничиваются, радионуклиды, биотоксины, ферментативно активные токсины, цитостатики или цитотоксические терапевтические агенты, пролекарства, иммунологически активные лиганды и модификаторы биологического ответа, такие как цитокины. Любой цитотоксин, способный затормозить или замедлить рост иммунореактивных или злокачественных клеток, находится в области настоящего изобретения. Примеры цитотоксинов включают в целом цитостатические агенты, алкилирующие агенты, антиметаболиты, анти-пролиферативные агенты, тубулин-связывающие агенты, гормоны и антагонисты гормонов и т.д. Примеры цитостатиков, совместимых с настоящим изобретением, включают алкилирующие вещества, такие как мехлорэтамин, триэтиленфосфорамид, циклофосфамид, ифосфамид, хлорамбуцил, бусульфан, мелфалан или триазихинон, а также соединения нитрозомочевины, такие как кармустин, ломустин или семустин. Особо предпочтительные молекулы для конъюгирования - это майтансиноиды (maytansinoids). Мэйтансиноиды были первоначально выделены из кустарника в Восточной Африке, принадлежащего роду Maytenus, но затем обнаружено, что они являются метаболитами почвенных бактерий, таких как Actinosynnema pretiosum (см., например, патент US № 3896111). Известно, что майтансиноиды включают майтансил, майтансинол, С-3 сложные эфиры майтансинола и другие аналоги и производные майтансинола (см., например, патенты US № 5208020 и 6441163). С-3 сложные эфиры могут встречаться в природе, а могут производиться синтетическими способами. Более того, природные и синтетические С-3 майтансинольные эфиры можно классифицировать как С-3 сложные эфиры с простым остатком карбоновой - 84 - 015992 кислоты и С-3 сложные эфиры с производным N-метил-L-аланина, причем последний более цитотоксичен, чем первый. Синтетические аналоги майтансиноидов также известны в уровне техники и описаны, например, в работе Kupchan et al., J. Med. Chem., 21, 31-37 (1978). Способы генерации майтансинола и его аналогов или производных описаны, например, в патентной работе US № 4151042. Подходящие майтансиноиды для использования в составе конъюгатов антител можно выделить из природных источников, а также приготовить синтетически или полусинтетически известными способами. Более того, майтансиноиды можно модифицировать любым известным способом, главное, чтобы в готовой молекуле-конъюгате сохранялось достаточно цитотоксичности. Особо предпочтительные майтансиноиды, включающие соединяющие молекулы с реактивными химическими группами, - это С-3 сложные эфиры майтансинола и его аналогов, где соединяющая молекула включает дисульфидную связь, а прикрепляющая молекула - N-сукцинимидильный или N-сульфосукцинимидильный эфир. Много положений в майтансиноидах могут служить местами химического прикрепления соединяющей молекулы, например, через эффекторную прикрепляющую молекулу. Например, полезны бывают С-3 позиция с гидроксильной группой, С-14 позиция, модифицированная гидроксиметилом, С-15 позиция, модифицированная гидрокси, и С-20 позиция с гидроксигруппой. Наиболее предпочтительно, если соединяющая молекула связана с С-3 позицией майтансинола. Также предпочтительно, если майтансинол, применяемый совместно с композицией изобретения, представляет собой N.sup.2'-деацетил-N.sup.2'-(-3-меркапто-1-оксопропил)майтансин (DM1) или N.sup.2'-деацетилN.sup.2'-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)майтансин (DM4). Соединяющие молекулы с другими химическими связями также могут использоваться в контексте изобретения, равно как и другие майтансиноиды. Специфические примеры других химических связей, которые могут включаться в соединяющие молекулы, это такие описанные выше связи, как, например, кислотные лабильные связи, тиоэфирные связи, фотолабильные связи, пептидаза-лабильные связи и эстераза-лабильные связи. Способы получения майтансиноидов с соединяющими молекулами и/или эффекторными прикрепляющими молекулами описаны, например, в патентных работах US № 5208020, 5416064 и 6333410. Линкерная молекула (и/или эффекторная присоединяемая молекула) майтансиноида, как правило и предпочтительно, входит в состав более длинной связывающей пептидной молекулы, которая применяется для объединения антитела с майтансиноидом. В связи с настоящим изобретением может использоваться любая подходящая связывающая пептидная молекула, если только линкерная молекула обеспечивает снижение токсичности и свойств определения мишени для майтансиноида и антитела соответственно. Линкерная молекула объединяет майтансиноид с антителом посредством химических связей (как описано выше), так что майтансиноид химически сопрягается с антителом (например, связывается ковалентно). Желательно, чтобы линкерная молекула химически присоединялась к майтансиноиду антитела посредством дисульфидных и тиоэфирных связей. Наиболее предпочтительно, если антитело химически сопрягается с майтансиноидом через дисульфидные связи. Другие предпочтительные классы цитотоксических агентов включают, например, антрациклиновое семейство лекарств, лекарства из растения Vinca, митомицины, блеомицины, цитотоксические нуклеозиды, птеридиновое семейство лекарств, диинены и подофиллотоксины. Особо полезные члены этого класса включают, например, адриамицин, карминомицин, даунорубицин (дауномицин), доксорубицин, аминоптерин, метотрексат, метоптерин, митрамицин, стрептонигрин, дихлорометотрексат, митомицин С, актиномицин-Д, порфиромицин, 5-фтороурацил, флоксуридин, фторафур, 6-меркаптопурин, цитарабин, цитозин арабинозид, подофиллотоксин или его производные, такие как етопозид или етопозида фосфат, мелфалан, винбластин, винкристин, лейрозидин, виндезин, лейрозин и подобные им. Еще одна группа цитотоксинов, совместимая с настоящим изобретением, включает таксол, таксан, цитохалазин В, графицидин D, этидиум бромид, еметин, тенопозид, колхицин, дигидрокси антрацин дион, митоксантрон, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуропичин, а также их аналоги и гомологи. С настоящим изобретением совместимы также гормоны и их антагонисты, такие как кортикостероиды, например, преднизон, прогестины, например, гидроксипрогестерон или медропрогестерон, экстрогены, например, диэтилстибестрол, антиэстрогены, например, тамоксифен, андрогены, например, тестостерон, и ингибиторы ароматазы, например, аминоглутетимид. Как уже упоминалось ранее, специалисты легко смогут внести в желаемые соединения химические модификации, чтобы сделать реакции с участием этих соединений более подходящими для целей получения конъюгатов изобретения. Один пример особенно предпочтительных цитотоксинов включает участников или производные энедиинового семейства протиопухолевых антибиотиков, включая калихеамицин, эсперамицины или динемицины. Эти токсины чрезвычайно эффективны, они действуют, расщепляя ядерную ДНК, что ведет к смерти клеток. В отличие от белковых токсинов, которые могут быть расщеплены in vivo с получением множества неактивных, но иммуногенных фрагментов полипептида, токсины, такие как калихеамицин, эсперамицины и другие энедиины, являются маленькими молекулами, которые являются чрезвычайно неиммуногенными. Эти непептидные токсины химически связывают с димерами или тетрамеры с помощью способов, которые ранее использовались, чтобы маркировать моноклональные антитела и другие молекулы. Такие технологии связывания включают сайт-специфичную связь через N-связанные ос- 85 - 015992 татки сахаров, присутствующие только на фрагментов конструктов Fc. Такие сайт-направленные способы связывания обладают преимуществом уменьшения возможных эффектов связи на свойства связывания конструктов. Следует понимать, что помимо прочих цитотоксинов полипептиды могут также быть связаны с биотоксином, таким как подгруппа рицина А, абрин, токсин дифтерии, ботиллинум, циангинозины, сакситоксин, шигатоксин, столбнячный токсин, тетродотоксин, трихотецен, веррикуллоген или токсический фермент. Предпочтительно, такие конструкции будут сделаны с использованием способов генной инженерии, которые учитывают прямую экспрессию конструкта связывающая молекула-токсин. Другие модификаторы биологического ответа, которые могут быть связаны с полипептидами настоящего изобретения, включают цитокины, такие как лимфокины и интерфероны. В свете настоящего описания предполагается, что специалист сможет с легкостью сформировать такие конструкты, используя обычные способы. Еще один класс совместимых цитотоксинов, которые могут использоваться совместно с описываемыми полипептидами, представляет собой радиосенситизирующие препараты, которые могут быть эффективно направлены к опухоли или иммунореактивным клеткам. Такие препараты увеличивают чувствительность к ионизирующей радиации, тем самым увеличивая эффективность лучевой терапии. Интернализованный опухолевой клеткой конъюгат доставляет радиосенситизатор ближе ядра, где радиосенсибилизация будет максимальна. Полипептиды изобретения, не связанные с радиосенситизатором, быстро выводятся из крови, локализуя остающееся средство радиосенсибилизации в целевой опухоли и обеспечивая минимальное поглощение в нормальных тканях. После быстрого клиренса из крови дополнительная лучевая терапия применяется в одном из трех способов: 1) внешняя радиация, направленная специфично к опухоли, 2) радиоактивность, непосредственно введенная в опухоль, или 3) системная радиоиммунотерапия с той же связывающей молекулой. Потенциально привлекательная вариация этого подхода представляет собой применение терапевтического радиоизотопа к радиосенситизированному иммуноконъюгату, таким образом обеспечивая преимущество введения пациенту единственного лекарственного средства. В соответствии с одним вариантом осуществления молекула, которая увеличивает стабильность или эффективность полипептида, может быть конъюгирована. Например, в соответствии с одним вариантом осуществления, чтобы увеличить период полураспада полипептидов изобретения in vivo, с ними может быть конъюгирован PEG. Leong, S.R., et al. 2001. Cytokine 16:106; 2002; Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531; или Weir et al. 2002. Biochem. Soc. Transactions 30:512. Как ранее упоминалось, совместимые цитотоксины могут включать пролекарство. Здесь термин "пролекарство" относится к предшественнику или производной форме фармацевтически активного вещества, которое является менее цитотоксическим к опухолевым клеткам по сравнению с исходным лекарственным средством, и способен к ферментативной активации или превращению в более активную родительскую форму. Пролекарства, совместимые с изобретением, включают, но не ограничиваются, включающие фосфат пролекарства, тиофосфатвключающие пролекарства, сульфатвключающий пролекарства, пептидвключающие пролекарства, β-лактамвключающие пролекарства, возможно, замещенные феноксиацетамидвключающие пролекарства или, возможно, замещенные фенилацетамидвключающие пролекарства, 5-фтороцитозин и другие 5-фтороуридиновые пролекарства, которые могут быть преобразованы к более активному цитотоксическому свободному лекарственному средству. В соответствии с одним вариантом осуществления цитотоксический агент, такой как майтанзионид, вводится как пролекарство, которое высвобождается гидролизом дисульфидных мостиков. Дополнительные примеры цитотоксических препаратов, которые могут быть дериватизированы в форму пролекарства для использования в существующем изобретении, включают химиотерапевтические агенты, описанные выше. XIII. Введение связывающих молекул. Способы приготовления и введения связывающих молекул изобретения субъекту хорошо известны специалистам или легко могут быть определены им. Путь введения связывающих молекул изобретения может быть оральным, парентеральным, ингаляцией или топическим. Термин парентеральный здесь включает внутривенное, внутриартериальное, интраперитонеальное, внутримышечное, подкожное, ректальное или влагалищное введение. Внутривенные, внутриартериальные, подкожные и внутримышечные формы парентерального введения особо предпочтительны. В то время как все эти формы введения явным образом включены в область изобретения, особо предпочтительны внутривенные или внутриартериальные инъекции. Обычно, подходящий фармацевтический состав для инъекции может включить буфер (например, ацетатный, цитратный или фосфатный буфер), сурфактант (например, полисорбат), возможно, стабилизатор (например, человеческий альбумин) и т.д. Однако в других способах, совместимых с приводимой здесь информацией, полипептиды можно ввести непосредственно в сайт больных клеток, таким образом увеличивая экспозицию патологически измененной ткани терапевтическому агенту. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примеры неводных растворителей - пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и вводимые в виде инъекций органические эфиры, такие как - 86 - 015992 этил олеат. Водные носители включают воду, алкоголь/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и забуференную среду. В настоящем изобретении фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются, 0,01-0,1М и предпочтительно 0,05М фосфатный буфер или 0,8% физиологический раствор. Другие обычные парентеральные носители включают растворы фосфата натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактированный раствор Рингера или фиксированные масла. Внутривенные носители включают жидкие и питательное составы, электролиты, такие как основанные на декстрозе рингера, и подобные им. Консерванты и другие добавки могут также присутствовать, такие как, например, антибактериальные препараты, антиоксиданты, хелаторы, инертные газы и подобные им. Более конкретно, фармацевтические составы, подходящие для введения в виде инъекций, включают стерильные водные растворы (если растворимы в воде), дисперсии или стерильные порошки для немедленного введения стерильных вводимых растворов или дисперсии. В таких случаях состав должен быть стерильным и жидким до степени, обеспечивающей легкое введение. Состав должен быть стабильным в условиях изготовления и хранения и должен быть предпочтительно защищен от действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носитель может быть растворителем или средой диспергирования, включающей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропилен гликоль, жидкий полиэтилен гликоль и т.д.), а также подходящие смеси всего перечисленного. Надлежащая текучесть может быть обеспечена, например, при помощи покрытия, такого как лецитин, поддержанием необходимого размера частиц в случае дисперсии и при помощи сурфактантов. Профилактика действия микроорганизмов может быть достигнута различными антибактериальными и противогрибковыми агентами, например парабеном, хлоробутанолом, фенолом, аскорбиновой кислотой, тимерозалом и т.д. Во многих случаях предпочтительно включать изотонические вещества, например, сахар, полиспирты, такие как маннит, сорбитол, хлорид натрия или их композиции. Длительная абсорбция вводимых составов может быть вызвана включением в состав агента, который задерживает поглощение, например моностеарата алюминия и желатина. В любом случае, стерильные вводимые растворы могут быть подготовлены путем включения активного состава (например, полипептида отдельно или в комбинации с другими активными агентами) в необходимом количестве в соответствующем растворителе с одним или комбинацией компонентов, перечисленных здесь, как требуется, с последующей стерилизацией путем фильтрования. В общем случае, дисперсии делают, включая активный состав в стерильный носитель, который включает основную среду дисперсии и необходимые другие компоненты из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для подготовки стерильных вводимых растворов предпочтительными способами являются вакуумная и лиофильная сушка, которые приводят к получению порошка, состоящего из активного ингредиента и любого дополнительного желательного компонента из ранее стерильно отфильтрованного раствора. Препараты для инъекций обрабатывают, помещают в контейнеры, такие как ампулы, мешки, бутылки, шприцы или пузырьки и запечатывают при стерильных условиях согласно способам, известным в уровне техники. Далее, препараты могут быть упакованы и проданы в форме наборов, таких как описаны в совместно поданной заявке U.S.S.N. 09/259337 и U.S.S.N. 09/259338, каждая из которой включена сюда по ссылке. Для таких препаратов предпочтительно делать метки или указания о том, что ассоциированные с ними составы полезны для лечения субъета, страдающего от или предрасположенного к аутоиммунным или неопластическим расстройствам. Эффективные дозы стабилизированных связывающих молекул настоящего изобретения для лечения вышеупомянутых описанных состояний изменяются в зависимости от множества различных факторов, включая средства введения, целевого сайта, физиологического состояния пациента, является ли пациент человечеком или животным, других принимаемых лекарств и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно, пациент - человек, но можно также лечить нечеловеческие млекопитающие, включая трансгенные млекопитающие. Дозировки могут титроваться, используя обычные способы, известные специалистам, чтобы оптимизировать безопасность и эффективность. Для пассивной иммунизации связывающей молекулой изобретения дозировка может находиться в диапазоне, например, от приблизительно 0,0001 до 100 мг/кг, чаще от 0,01 до 5 мг/кг (например, 0,02, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2 мг/кг и т.д.) массы тела хозяина. Например, дозировки могут составлять на 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или в интервале 1-10 мг/кг, предпочтительно по крайней мере 1 мг/кг. Дозы в вышеупомянутых диапазонах также входят в область изобретения. Субъектам можно вводить такие дозы ежедневно, в альтернативные дни, еженедельно или согласно любому другому списку, определенному эмпирическим анализом. Пример лечения включает введение в многократных дозировках в течение длительного периода, например по крайней мере шесть месяцев. Дополнительные примеры режима лечения предполагают введение раз в каждые две недели или один раз в месяц или раз за каждые 3-6 месяцев. Примеры схем дозировки включают 1-10 мг/кг или 15 мг/кг в последовательные дни, 30 мг/кг через день или 60 мг/кг еженедельно. В некоторых способах два или больше моноклональных антител с различной специфичностью связывания вводят одновременно, в этом случае дозировка каждого вводимого антитела может находиться в пределах обозначенных диапазонов. Связывающие молекулы изобретения можно вводить многократно. Интервалы между отдельными - 87 - 015992 дозировками могут быть, например, ежедневно, еженедельно, ежемесячно или ежегодно. Интервалы могут также быть нерегулярными, на основании данных об уровне в крови пациента полипептида или целевой молекулы. В некоторых способах дозировка настраиваится так, чтобы достигнуть определенной концентрации в плазме связывающей молекулы или токсина, например, 1-1000 мкг/мл или 25-300 мкг/мл. Альтернативно, связывающие молекулы могут быть введены в составе задержанного высвобождения, когда требуется менее частое введение. Дозировка и частота изменяется в зависимости от времени полужизни антитела в пациенте. В целом, гуманизированные антитела демонстрируют самую длинную полужизнь, за ними следуют химерные антитела и нечеловеческие антитела. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения могут быть введены в неконъюгированной форме. В соответствии с другим вариантом осуществления полипептиды изобретения могут быть введены многократно в конъюгированной форме. В соответствии с еще одним вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения могут быть введены в неконъюгированной форме, а затем в конъюгированной форме или наоборот. Частота и дозировка введения может изменяться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. В профилактических применениях составы, включающие настоящее антитело или его коктейль, введены еще здоровому пациенту, чтобы увеличить сопротивляемость. Такое количество называется "профилактической эффективной дозой". В этом случае точное количество также зависит от состояния здоровья пациента и общего иммунитета, но в общем случае колеблется от 0,1 до 25 мг за дозу, особенно 0,5 к 2,5 мг за дозу. Относительно низкая дозировка вводится относительно редко в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают лечиться всю оставшуюся жизнь. Для терапевтического применения иногда требуется относительно высокая дозировка (например, приблизительно от 1-400 мг/кг связывающей молекулы, например, антитела за дозу, с дозировками от 5 до 25 мг, часто используемая для радиоиммуноконъюгатов, и более высокие дозы для конъюгированных молекул цитотоксин-лекарство) за относительно короткие интервалы, пока прогрессия болезни не понижена, или болезнь не прекратилась и предпочтительно пока пациент не показывает частичное или полное ослабление симптомов болезни. После этого пациент может быть переведен на режим профилактического введения препарата. В соответствии с одним вариантом осуществления субъекта можно лечить нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид изобретения (например, в векторе). Дозы для таких нуклеиновых кислот колеблются приблизительно от 10 нг до 1 г, 100 нг до 100 мг, 1 мкг до 10 мг или 30-300 мкг ДНК для пациента. Дозы для инфекционных вирусных векторов изменяются от 10-100 или больше вирионов на дозу. Терапевтические вещества могут быть введены парентеральными, топическими, внутривенными, пероральными, подкожными, внутриартериальными, внутричерепными, интраперитонеальными, внутриносовыми или внутримышечными способами для профилактики и/или терапевтического лечения. Внутримышечные инъекции или внутривенные инфузии предпочтительны для введения связывающей молекулы изобретения. В некоторых способах специфичные терапевтические связывающие молекулы вводятся непосредственно в череп. В некоторых способах связывающие молекулы вводятся как приспособление или устройство задержанного высвобождения, такие как устройство Medipad™. Агенты изобретения могут произвольно быть введены в комбинации с другими агентами, которые эффективны для лечения расстройства или состояния (например, профилактическое или терапевтическое средство). Предпочтительные дополнительные агенты - те, которые признаны в уровне техники и стандартно вводятся для лечения специфических расстройств. Эффективные однократные дозировки лечения (т.е. терапевтически эффективное количество) 90Y-меченых полипептидов изобретения располагаются приблизительно в диапазоне 5-75 мКи, более предпочтительно приблизительно 10-40 мКи. Эффективные аблативные дозировки при лечении некостного мозга 131I-мечеными антителами составляют приблизительно 5-70 мКи, более предпочтительно приблизительно 5-40 мКи. Эффективные однократные дозировки аблативного лечения (т.е. может потребовать аутогенной пересадки костного мозга) 131I-мечеными антителами колеблется в диапазоне, приблизительно 30-600 мКи, более предпочтительно, приблизительно 50-500 мКи. В соединении с химерными модифицированными антителами, вследствие более долгой полужизни мышиных антител, эффективные отдельные дозировки аблатива некостного мозга при лечении йода 131 мечеными химерными антителами располагаются приблизительно в диапазоне 5-40 мКи, более предпочтительно менее чем приблизительно 30 мКи. Критерии картирования для, например, меток 111 In, как правило, меньше чем приблизительно 5 мКи. В то время как большой клинический опыт был получен с 131I и 90Y, в уровне техники известны и другие метки, используемые в подобных целях. Дополнительные радиоизотопы используются и для картирования. Например, дополнительные радиоизотопы, которые совместимы с областью настоящего изобретения, включают, но не ограничены, 123I, 125I, 32Р, 57Co, 64Cu, 67Cu, 77Br, 81Rb, 81Kr, 87Sr, 113 In, 127Cs, 129 Cs, 132I, 197Hg, 203Pb, 206Bi, 177Lu, 186Re, 212Pb, 212Bi, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 225Ac, 211At и 213Bi. В этом отношении альфа, гамма и бета эмиттеры все совместимы с настоящим изобретением. Более того, каждый специалист легко может определить, какие радионуклиды совместимы с выбранным курсом лечения без неуместного экспериментирования. В связи с этим дополнительные радионуклиды, которые - 88 - 015992 уже использовались в клиническом диагнозе, включают 125I, 123I, 99Тс, 43K, 52Fe, 67Ga, 68Ga, а также и 111In. Антитела метились множеством радионуклидов также и для потенциального использования в направленной иммунотерапии (Peirersz et al. Immunol. Cell Biol. 65: 111-125 (1987)). Эти радионуклиды включают 188Re и 186Re, так же как 199Au и 67Cu в меньшей степени, патент США № 5460785 включает дополнительную информацию относительно таких радиоизотопов и включен сюда по ссылке. Независимо от того, используются ли или нет связывающая молекула изобретения в конъюгированной или неконъюгированной форме, главное преимущество настоящего изобретения - это способность использовать эти полипептиды у миелоподавленных пациентов, особенно тех, кто подвергается или подвергался дополнительным способам лечения, таким как лучевая терапия или химиотерапия. В соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления полипептиды (снова в конъюгированной или неконъюгированной форме) могут вводиться в объединенной терапевтической схеме с химиотерапевтическими агентами. Специалисты понимают, что такие терапевтические режимы могут включить последовательное, одновременное, параллельное введение описываемых антител и одного или более химиотерапевтических агентов, а также введение в течение одинакового времени. Особенно предпочтительные варианты осуществления изобретения будут включать введение токсин-конъюгированной связывающей молекулы, например, конъюгированной к майтансиноидам, таким как D4 майтансиноиды. В то время как связывающие молекулы могут быть введены, как описано выше, нужно подчеркнуть, что в соответствии с другими аспектами конъюгированные и неконъюгированные полипептиды могут быть введены в остальном здоровым пациентам как терапевтический агент первой линии. В таких вариантах осуществления полипептиды могут быть введены пациентам, имеющим нормальные средние запасы красного костного мозга, и/или пациентам, которые не имеют таковых после дополнительных способов лечения, таких как внешняя лучевая или химиотерапия. Однако как обсуждалось выше, некоторые варианты осуществления изобретения включают введение связывающих молекул пациентам с подавленой функцией костного мозга отдельно или в комбинации или совместно с одним или более дополнительными способами лечения, такие как лучевая терапия или химиотерапия (т.е. объединенная схема лечения). Здесь введение полипептидов в комбинации или совместно с одним или более дополнительными способами лечения означает последовательное, симультанное, параллельное, сопутствующее введение или одновременное введение, применение терапии и раскрытых здесь связывающих молекул. Квалифицированные специалисты понимают, что введение или применение различных компонентов объединенной схемы лечения может быть рассчитано, чтобы увеличить полную эффективность лечения. Например, химиотерапевтические вещества могли быть введены в стандартных, известных курсах лечения, сопровождаемого в течение нескольких недель радиоиммуноконъюгатами настоящего изобретения. Наоборот, цитотоксин-ассоциированные полипептиды могли быть введены внутривенно, сопровождаться внешним облучением опухоли. В соответствии с другими аспектами полипептид может быть введен одновременно с одним или более отобранными химиотерапевтическими агентами во время отдельного визита. Квалифицированный специалист (например, опытный онколог) легко может различить эффективные комбинированные терапевтические режимы без неуместного экспериментирования, на основании подобранной дополнительной терапии и описания настоящих методик. В этом отношении следует понимать, что комбинация связывающих молекул (любой конъюгированных или неконъюгированных) и химиотерапевтического вещества может быть назначена в любом порядке и в любой момент времени, который предоставляет терапевтическую пользу пациенту. Таким образом, химиотерапевтическое вещество и полипептид могут быть введены в любом порядке или одновременно. Связывающие молекулы и химиотерапевтические агенты могут быть введены отдельно, или могут быть введены в одном препарате. В отобранных аспектах полипептиды настоящего изобретения будут введены пациентам, которые ранее перенесли химиотерапию. В соответствии с другими аспектами полипептиды и химиотерапевтическое лечение будет проведено по существу одновременно. Например, пациенту можно дать связывающую молекулу во время курса химиотерапии. В соответствии с предпочтительными аспектами связывающая молекула будет введена в течение 1 года после любого химиотерапевтического агента. В соответствии с другими предпочтительными аспектами полипептид вводится в пределах 10, 8, 6, 4 или 2 месяцев после любого химиотерапевтического лечения. В соответствии с остальными предпочтительными аспектами полипептид вводится в пределах 4, 3, 2 или 1 недели после лечения или профилактики любым химиотерапевтическим агентом или лечения. В соответствии с другими аспектами полипептид вводится в пределах 5, 4, 3, 2 или 1 дня после лечения подобранным химиотерапевтическим агентом. Следует понимать, что эти два вещества могут быть введены пациенту в пределах нескольких часов или минуты (т.е. фактически одновременно). Кроме того, в соответствии с существующим изобретением пациент с подавленной функцией костного мозга означает любого пациента, имеющего пониженные количества форменных элементов крови в анализах. Специалисты понимают, что несколько параметров анализа крови, традиционно используемых как клинические индикаторы подавления функции костного мозга, могут легко измерить степень подавления функции костного мозга у пациента. Примером известного способа измерения подавления функции костного мозга являетя абсолютное количество нейтрофилов (ANC). Такое подавление функции ко- 89 - 015992 стного мозга может быть результатом различных биохимических расстройств или болезни или, более вероятно, являться результатом предшествующей лучевой терапии или химиотерапии. В этом отношении, квалифицированные специалисты понимают, что пациенты, которые перенесли традиционную химиотерапию, как правило, демонстрируют уменьшенное количество красного костного мозга. Как обсуждалось выше, таких субъектов часто не удается вылечить оптимальными уровнями цитотоксина (т.е. радионуклидами) из-за недопустимых побочных эффектов, таких как анемия или иммуносупрессия, которые заканчиваются увеличенной летальностью или осложненным течением. Более конкретно, конъюгированные или неконъюгированные полипептиды настоящего изобретения могут использоваться для эффективного лечения пациентов, имеющих ANC ниже чем 2000/мм3, или количество тромбоцитов ниже чем 150000/мм3. Более предпочтительно полипептиды настоящего изобретения могут использоваться для лечения пациентов, имеющих ANC менее чем 1500/мм3, менее чем 1000/мм3 или еще более предпочтительно менее чем 500/мм3. Аналогично, полипептиды настоящего изобретения могут использоваться для лечения пациентов с количеством тромбоцитов менее чем около 75000/мм3, менее чем 50000/мм3 или даже менее чем 10000/мм3. В более общем смысле, специалисты в данной области легко смогут определить, когда у пациента будет подавлена функция костного мозга, используя принятые правительством руководящие доументы и методики. Как указано выше, много пациентов с подавленной функцией костного мозга прошли курсы лечения, включая химиотерапию, имплантационную лучевую терапию или внешнюю лучевую терапию. В последнем случае внешний радиационный источник используют для местного облучения злокачественного новообразования. В случае способов имплантации лучевой терапии радиоактивные реактивы хирургически распологают в пределах злокачественного образования, тем самым селективно облучая центр заболевания. В любом случае, описанные полипептиды могут использоваться для лечения расстройства у больных с подавленной функцией костного мозга, независимо от причины. В этом отношении следует понимать, что полипептиды настоящего изобретения могут использоваться совместно или в комбинации с любым химиотерапевтическим агентом или агентами (например, чтобы обеспечить комбинированный терапевтический режим), которые устраняют, уменьшают или контролируют или ингибируют рост неопластических ячеек in vivo. Как показано, такие агенты часто приводят к сокращению резервов красного костного мозга. Это сокращение можно возместить, полностью или частично, уменьшая миелотоксичность составов настоящего изобретения, что очень хорошо при агрессивном лечении неоплазий у таких пациентов. В соответствии с другими предпочтительными вариантами осуществления меченный радиоактивным изотопом иммуноконъюгат, раскрытый здесь, может эффективно использоваться с радиосенсибилизаторами, которые увеличивают восприимчивость неопластических клеток к радионуклидам. Например, радиосенсибилизующий состав может быть введен после того, как меченая радиоактивным изотопом связывающая молекулы значительной степени удалена из кровотка, но все еще остается на терапевтически эффективных уровнях на сайте опухоли или в самой опухоли. Относительно этих аспектов изобретения демонстративные химиотерапевтические агенты, которые совместимы с настоящим изобретением, включают алкилирующие агенты, алкалоиды барвинка (например, винкристин и винбластин), прокарбазин, метотрексат и преднизон. Комбинация МОРР из четырех лекарственных средств (меклетамин (азотный иприт), винкристин (Онковин), прокарбазин и преднизон) очень эффективна в лечении различных типов лимфомы и является предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения. У МОРР-устойчивых пациентов, ABVD (например, адриамицин, блеомицин, винбластин и дакарбазин), ChlVPP (хлорамбуцил, винбластин, прокарбазин и преднизон), ТАКСИ (ломустин, доксорубицин, блеомицин и стрептозотоцин), МОРР плюс ABVD, МОРР плюс ABV (доксорубицин, блеомицин и винбластин) или BCVPP (кармустин, циклофосфамид, винбластин, прокарбазин и преднизон) могут использоваться совместно. Arnold S. Freedman и Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, in HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774-1788 (Kurt J. Isselbacher et al., eds., 13th ed. 1994) и V.Т. DeVita et al. (1997) и процитированные там ссылки для стандартной дозировки и схемы лечения. Эти способы лечения могут использоваться в соответствии с базовыми рекомендациями, или их можно изменить, как необходимо для конкретного пациента, применяя в комбинации с одним или более полипептидов изобретения, как описано здесь. Дополнительные режимы, которые пригодны в контексте настоящего изобретения, включают использование отдельных алкилирующих агентов, таких как циклофосфамид или хлорамбуцил, или их комбинаций, таких как ЦВД (циклофосфамид, винкристин и преднизон), CHOP (CVP и доксорубицин), С-МОРР (циклофосфамид, винкристин, преднизон и прокарбазин), БИБОП САР ВОР (СНОР плюс прокарбазин и блеомицин), м-BACOD (CHOP плюс метотрексат, блеомицин и лейковорин), ProMACEМОРР (преднизон, метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид и лейковорин плюс стандартный МОРР), ProMACE-CytaBOM (преднизон, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид, цитарабин, блеомицин, винкистин, метотрексат и лейковорин) и МАСОР-В (метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, фиксированные дозы преднизона, блеомицин и лейковорин). Специалисты легко могут определить стандартные дозировки и схему введения для каждого из этих режимов. CHOP была также объединена с блеомицином, метотрексатом, прокарбазином, горчицей азота, цитозиновым арабинозидом - 90 - 015992 и етопозидом. Другие совместимые химиотерапевтические агенты включают, но не ограничены, 2хлордезоксиаденозин (2-CDA),2'-дезоксикоформицин и флударабин. Для пациентов со средней и высокой степенью НХЛ, для которых не получается добиться ремиссии, используется ургентная терапия. Способы такой терапии используют препараты, такие как цитозиновый арабинозид, цисплатин, этопозид и ифосфамид отдельно или в комбинации. В случае рецидивов или агрессивных форм или в случае определенных неопластических расстройств часто используются следующие протоколы: IMVP-16 (ифосфамид, метотрексат и этопозид), MIME (метил-GAG, ифосфамид, метотрексат и этопозид), DHAP (дексаметазон, цитарабин в большой дозе и цисплатин), ESHAP (етопозид, метилпреднизолон, цитарабин HD, цисплатин), СЕРР (В) (циклофосфамид, этопозид, прокарбазин, преднизон и блезомцин), CAMP (ломустин, митоксантрон, цитарабин и преднизон) каждый с известными нормами и схемами дозирования. Количество химиотерапевтического агента, который будет использоваться в комбинации с полипептидами данного изобретения, может измениться в соответствии с уровнем техники, схема введения также может варьироваться. См., например, Bruce A Chabner et al., Antineoplastic Agents, in GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287 (Joel G. Hardman et al., eds., 9th ed. 1996). В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению может быть введена субъекту, который перенес, переносит или перенесет хирургическую операцию, например, по удалению первичной опухоли, метастаза или предзлокачественного роста ткани или в качестве профилактики. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению вводится совместно с биопрепаратом. Биопрепараты, пригодные для лечения рака, известны в уровне техники, связывающая молекула по изобретению может быть введена, например, в соединении с такими известными биопрепаратами. Например, FDA одобрил следующие биопрепараты для лечения рака молочной железы: Герцептин® (трастузумаб, Genentech Inc, Южный Сан-Франциско, Калифорния; гуманизированное моноклональное антитело, с антиопухолевой активностью в HER2-положительном раке молочной железы); Фаслодекс® (фулвестрант, Фармацевтические препараты AstraZeneca, LP, Уилмингтон, Делавэр; антагонист рецептора эстрогена для лечения рака молочной железы); Аримидекс® (анастрозол, Фармацевтические препараты AstraZeneca, LP; нестероидный ингибитор ароматазы, который блокируетароматазу, фермент, которые требуется для получения эстрогена); Аромастин® (эксеместан, Pfizer Inc, Нью-Йорк, Нью-Йорк; необратимый стероидный инактиватор ароматазы, используемый в лечении рака молочной железы); Фемара® (летрозол, Фармацевтические препараты Novartis, Восточный Ганновер, Нью-Джерси; нестероидный ингибитор ароматазы, одобренный FDA для лечения рака молочной железы); и Нолвадекс® (тамоксифен, Фармацевтические препараты AstraZeneca, LP; нестероидный антиэстроген, одобренный PDA для лечения рака молочной железы). Другие биопрепараты, с которыми могут совместно использоваться связывающие молекулы изобретения, включают: Авастин™ (бевацизумаб, Genentech Inc; первая FDA-одобренная терапия, разработанная, чтобы ингибировать ангиогенез); Зевалин® (ибритумомаба теуксетан, Biogen Idec, Кембридж, Массачусетс; меченое радиоактивным изотопом моноклональное антитело, в настоящее время одобренное для лечения В-лимфоцитарных лимфом). Кроме того, FDA одобрил следующие биопрепараты для лечения колоректального рака: Авастин™; Эрбитукс™ (цитексимаб, ImClone Systems Inc, Нью-Йорк, Нью-Йорк, Bristol-Myers Squibb, Нью-Йорк, NY; моноклональное антитело против рецептора эпидермального фактора роста (EGFR)); Гливек® (иматиниба метисилат; ингибитор белоккиназы); Эргамизол® (гидрохлорид левамизола, Janssen Pharmaceutica Products, LP, Titusville, NJ; Titusville, Нью-Джерси; иммуномодулятор, одобренный FDA в 1990 как полезное лечение в комбинации с с 5-фтороурацилами после хирургической резекции у больных рака толстой кишки в стадии Dukes' Stage С). Одобренные способы лечения лимфом не-Ходжкина в настоящее время включают: Бексар® (тозитумомаб и йод I-131 тозитумомаб, GlaxoSmithKline, Парк Triangle Park, NC; многошаговое лечение, вовлекающее моноклональное антитело мыши (тозитумомаб), связанное с радиоактивной молекулой (йод 1-131)); Интрон® (интерферон-альфа-2b, Schering Corporation, Kenilworth, NJ; тип интерферона, одобренный для лечения фолликулярной лимфомы не-Ходжкина в соединении с содержащей антрациклин химиотерапевтической комбинацией (например, циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, преднизон [CHOP])); Ритуксан® (ритуксимаб, Genentech Inc., South San Francisco, CA, и Biogen Idec, Cambridge, MA; моноклональное антитело для лечения лимфомы не-Ходжкина; Онтак® (денилейкина дифлитокс, Ligand Pharmaceuticals Inc, Сан-Диего, Калифорния; химерный белок, состоящий из фрагмента токсина дифтерии, генетически гибридизованного с интерлейкином 2); и Зевалин® (тиуксетана ибритумомаб, Biogen Idec; радиоактивно меченое моноклональное антитело, одобренное FDA для лечения лимфом неХоджкина В-клеток). Для лечения лейкемии могут использоваться следующие биопрепараты в комбинации со связывающими молекулами изобретения: Гливек®; Кампат®-1Н (алемтузумаб, Laboratories, Richmond, СА; тип моноклонального антитела, используемого в лечении хронического лимфоцитарного лейкоза). Кроме - 91 - 015992 того, Генасенс (облимерсен, Genta Corporation, Berkley Heights, NJ; антисенсорная терапия BCL-2 при развитии, может использоваться для лечения лейкоза (например, один или в комбинации с одним или более препаратов химиотерапии, такими как флударабин и циклофосфамид), вещества могут вводиться совместно с указанными связывающими молекулами. Для лечения рака легкого могут применяться Тарсева™ (ерлотиниб HCL, OSI Pharmaceuticals Inc, Melville, Нью-Йорк; маленькая молекула, направленная против человеческого рецептора эпидермального фактора роста 1 (HER1)). Для лечения множественной миеломы могут использоваться Велкад® (бортезомиб, Millennium Pharmaceuticals, Cambridge MA; ингибитор протеасом). Дополнительные биопрепараты включают Талидомид® (талидомид, Clegene Corporation, Warren, NJ; иммуномодулятор, видимо, обладающий и другими механизмами действия, включая способность ингибировать рост и выживание миеломных клеток и антиангиогенез). Другие примеры биопрепаратов включают МОАВ IMC-C225, разработанный ImClone Systems, Inc, New York, NY. Кроме того, заявленные связывающие молекулы могут быть введены совместно с вакцинами или другими агентами (например, цитокины), модулирующими иммунные ответы против рака. Например, Мелацин® (Corporation, Seattle, WA) является аллогенной вакциной опухоли, у которой, как сообщалось, проявились многообещающие результаты в лечении резецированной меланомы T3N0M0. GMK® (Progenies Pharmaceutical, Inc, Tarrytown, Нью-Йорк) является ганглиозным антигеном, введенным как вспомогательный для фазы III агент у больных с высоким риском рецидива меланомы. Анти-гастрин Терапевтическая вакцина® (Aphton Corporation, Miami, FL) нейтрализует гормоны G17, находится в третьей фазе клинических испытаний для лечения пациентов с колоректальным и панкреатическим раками и раком желудка. CeaVac® (Titan Pharmaceuticals, Inc, South San Francisco, CA) является антигенотипом вакцин антител, исследуемый применительно к колоректальному раку. Наконец, Терапот® (Biomira Inc. Edmonton, Alberta, Canada), терапевтическая вакцина с синтетическими углеводами, исследуемая на третьей фазе как агент у больных с метастатическим раком молочной железы (Pharmaceutical Research и Manufacturers of America, 2000). В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению может быть введена совместно с анти-ангиогенным агентом, например, Эндостатином (эндогенный, полученный из опухоли, эндотелий-специфичный ингибитор, который останавливает капиллярную эндотелиальную продукцию клетки); анти-VEGF антитело; талидомид; ингибиторы металлобелказы матрицы ингибируют синтез и деградацию и базовой мембраны кровеносных сосудов). Как упоминалось ранее, связывающие молекулы настоящего изобретения, иммунореактивные фрагменты или их рекомбинанты могут быть введены в фармацевтически эффективном количестве для in vivo лечения расстройств у млекопитающих. В этом отношении следует понимать, что описываемая связывающая молекула будет включена в такой состав, чтобы облегчить введение и повысить стабильность активного агента. Предпочтительно фармацевтические составы в соответствии с изобретением включают фармацевтически приемлемый нетоксичный стерильный носитель, такой как физиологический раствор, нетоксичные буферы, консерванты и подобное им. В контексте настоящего изобретения фармацевтически эффективное количество связывающей молекулы изобретения, конъюгированной или неконъюгированной с терапевтическим агентом, означает количество, достаточное для эффективного связывания, например, чтобы уменьшить симптомы болезни или расстройства или чтобы обнаружить вещество или клетку. В случае опухолевых клеток полипептид будет предпочтительно взаимодействовать с отобранными иммунореактивными антигенами на неопластических или иммунореактивных клетках и приводить к усилению гибели этих клеток. Конечно, фармацевтические составы настоящего изобретения могут быть введены однократно или в многократных дозах, достаточных для того, чтобы доставить в организм фармацевтически эффективное количество полипептида. В рамках объема настоящего изобретения полипептиды изобретения могут быть введены человеку или другому животному в соответствии с вышеупомянутыми способами лечения в количестве, достаточном для того, чтобы оказать терапевтическое или профилактическое действие. Полипептиды изобретения могут быть введены такому человеку или другому животному организму в обычной форме дозировки, приготовленной путем смешивания связывающей молекулы изобретения с обычным фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем согласно известным методикам. Специалисту будет понятно, что форма и особенности фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя определяют количество активного компонента, с которым они должны быть объединены, путь введения и другие известные переменные. Квалифицированные специалисты понимают также, что коктейль, включающий один или более разновидностей полипептидов согласно существующему изобретению, может оказаться особенно эффективным. - 92 - 015992 XIV. Способы применения. Молекулы изобретения могут использоваться при состояниях, когда желательно применить стабилизированную молекулу scFvs или составы, включающие такую молекулу scFvs, например, в диагностических или терапевтических целях. Предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения представляют соединения, составы, композиции и способы диагноза и/или лечения расстройств, при которых введение связывающей молекулы изобретения является эффективным, например, неопластические расстройства у млекопитающего субъекта, нуждающегося в таком лечении. Предпочтительно субъект представляет собой человека. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающие молекулы могут использоваться в пробе, чтобы обнаружить антиген опухоли in vitro, например, используя пробу ELISA. Образцовые пробы известны в уровне техники, см., например, заявку на патент США № 20040077025. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы могут использоваться для обнаружения клеток с антигеном опухоли, используя технологию формирования изображения. Для таких областей применения может быть желательно конъюгировать связывающую молекулу с поддающейся обнаружению молекулой, например, радиоактивномеченой, как описано ниже. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы могут использоваться для снижения концентрации или удаления клеток (например, апоптозом), несущих в себе эпитоп (например, эпитоп Cripto или эпитоп члена семейства рецептора TNF. TRAIL-R2 или LTβR), распознаваемый связывающей молекулой изобретения. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы могут использоваться для снижения концентрации или устранения растворимых целевых молекул из кровообращения. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению уменьшает размер опухоли, ингибирует рост опухоли и/или продлевает время жизни онкологически больного субъекта. Соответственно это изобретение также относится к способу лечения опухолей у человека или другого животного организма посредством введения такому человеку или животному организму эффективного, нетоксичного количества полипептида. Специалист сможет обычным экспериментированием определить эффективное, нетоксичное количество полипептида с целью лечения злокачественных образований. Например, терапевтически активное количество полипептида может измениться согласно таким факторам, как стадия болезни (например, стадия I против стадии IV), возраст, пол, медицинские осложнения (например, иммуносупрессивные состояния болезни), вес субъекта и способность связывающей молекулы выявить желательную реакцию у субъекта. Режим дозировки может быть отрегулирован, чтобы обеспечить оптимальную терапевтическую реакцию. Например, несколько разделенных доз могут быть введены ежедневно, или доза может быть пропорционально уменьшена в случае соответствующей терапевтической ситуации. В общем случае, однако, эффективная дозировка, вероятно, будет колебаться в диапазоне приблизительно 0,05-100 мг на 1 кг веса тела в день и более предпочтительно от приблизительно 0,5 до 10 мг на 1 кг веса тела в день. Термин "млекопитающее" означает любой животный организм, классифицированный как млекопитающее, включая людей, домашних животных фермы и зоопарка и спортивных животных, а также таких животных, как собаки, лошади, кошки, коровы и т.д. Предпочтительно млекопитающее является человеком. "Лечение" означает как терапевтическое лечение, так и профилактическое средство и/или профилактические меры. К нуждающемся в лечении относятся как субъекты уже с болезнью или расстройством, так и те, у кого болезнь или расстройство следует остановить. Следовательно, млекопитающее может быть диагностировано как имеющее болезнь или расстройство или как предрасположенное или восприимчивое к болезни. В общем, описываемые составы могут использоваться профилактически или терапевтически. Например, опухоль, включающая маркерный ген, нацеленный связывающей молекулой на раковые клетки, может быть обнаружена или ингибирована (например, уничтожена) с использованием связывающей молекулы изобретения. В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения используются, чтобы лечить солидные опухоли. Пример рака включает, но не ограничивается, рак простаты, желудочные раки, такие кактолстой кишки, рак кожи, молочной железы, яичников, легких и поджелудочной железы. В соответствии с другим вариантом осуществления антитела настоящего изобретения могут использоваться для лечения саркомы Капоши, неоплазии CNS (капиллярной гемангиобластомы, менингиомы и мозговых метастазов), меланомы, желудочно-кишечной почечной саркомы и рабдомиосаркомы, глиобластомы (предпочтительно многоформной глиобластомы), лейомиосаркомы, ретинобластомы, сосочковой цистаденокарциномы яичника, опухоли Вилма или мелкоклеточного рака легкого. Следует понимать, что в свете настоящего описания адекватные полипептиды могут быть получены для молекул опухоли, ассоциированных с каждой из указанных неоплазий без неуместного экспериментирования ввиду наличия настоящего описания. Примеры гематологических онкологий, которые поддаются лечению настоящим изобретением, включают лимфомы Ходжкинса и не-Ходжкинса, а также лейкозы, включая ALL-L3 (лейкоз типа Беркитта), хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL) и моноцитарные клеточные лейкозы. Следует понимать, что составы, способы настоящего изобретения особенно эффективны в лечении множества В- 93 - 015992 клеточных лимфом, включая лимфому не-Ходжкина (NHL) низкой степени/фолликулярную, клеточную лимфому (FCC), лимфому MCL, диффузную крупноклеточную лимфому (DLCL), мелкую лимфоцитарную (SL) NHL, умеренную/фолликулярную NHL, умеренную диффузную NHL, высокую диффузную NHL, высокую лимфобластную NHL, высокую мелко клеточную NHL нерасщепленных клеток, большую NHL и макроглобулинимею Валденстрома. Специалисту понятно, что у этих лимфом часто будут различные названия из-за изменяющихся систем классификации и что пациенты с лимфомами под другими названиями могут также получить положительный эффект от комбинированных терапевтических схем настоящего изобретения. В дополнение к вышеупомянутым неопластическим расстройствам следует понимать, что раскрытое изобретение может с успехом использоваться для лечения дополнительных злокачественных образований с молекулами из совместимых опухолей. В соответствии с одним вариантом осуществления связывающая молекула по изобретению способна к специфичному связыванию с антигеном опухолевой клетки и ингибированнию роста опухолевых клеток у пациента. В соответствии с определенными аспектами опухолевые клетки представляют собой опухолевые клетки мозга, головы, шеи, простаты, груди, тестикулярные, толстого кишечника, легкого, яичника, мочевого пузыря, утробные, цервикальные и панкреатические. В соответствии с другими аспектами связывающая молекула по изобретению специфично связывается с антигеном опухолевой клетки и ингибирует рост опухолевых клеток, которые усиленно продуцируют антиген. В соответствии с одним вариантом осуществления опухолевые клетки представляют собой клеточные линии, которые повышенно продуцируют антиген, такие как клеточные линии, полученные из мозга, груди, тестикулярные, толстого кишечника, легкого, яичника, мочевого пузыря, утробные, цервикальные, панкреатического рака и желудка. В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения связывающие молекулы изобретения могут использоваться для лечения иммунных расстройств, включающих, но не ограничивающихся следующими: аллергический бронхолегочный аспергиллез, аллергический ринит, аутоиммунную гемолитическую анемию, акантокератодермию, аллергический контактный дерматит, Аддисонову болезнь, атопический дерматит, очаговую алопецию, универсальную алопецию, амилоидную дистрофию, аллергическую пурпуру, анафилактоидную реакцию, апластическую анемию, наследственный ангионевротический отек, идиопатический ангионевротический отек, анкилозирующий спондилоартрит, краниальный артериит, гигантоклеточный артериит, артериит Такаясу, темпоральный артериит, астму, атаксиютелеангиэктазию, аутоиммунный оофорит, аутоиммунный орхит, аутоиммунный полиэндокринный синдром, болезнь Бехчета, болезнь Бергера, болезнь Бюргера, бронхит, буллезный пемфигоид, хронический кандидоз кожи и слизистых, синдром Каплана, посткардиотомный синдром, постперикардиотомный синдром, кардит, нетропическую энтеропатию, болезнь Чагаса, синдром Чедиак-Хигаси, болезнь Черджа-Стросса, синдром Когана, синдром холодовой агглютинации, синдром CREST, болезнь Крона, криоглобулинемию, эндогенный фиброзный альвеолит, герпетиформный дерматит, болезнь Вагнера (дерматомиозит), сахарный диабет, синдром Даймонда-Блекфена, синдром Ди Георге, дискоидная красную волчанку, атонический фасциит, эписклерит, Drythema elevatum diutinum, ревматоидную эритему, полиморфную эритему, узловатую эритему, семейную средиземноморскую лихорадку, синдром Фелти, фиброз легких, псевдоанафилактический гломерулонефрит, аутоиммунный гломерулонефрит, постстрептококковый гломерулонефрит, посттрансплантационный гломерулонефрит, мембранозную гломерулопатию, синдром Гудпасчера, иммунноопосредованную гранулоцитопению, анулярную гранулему, аллергическую гранулему, гранулематозный миозит, диффузный токсический зоб, аутоиммунный тиреоидит (тиреоидит Хашимото), гемолитическую болезнь новорожденных, идиопатический гемохроматоз, болезнь Шенлейн-Геноха, хронически активный и хронически прогрессивный гепатит, гистоцитоз X, гиперэозинофильный синдром, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, синдром Джоба, ювенильный дерматомиозит, ювенильный ревматоидный артрит (ювенильныйхронический артрит), синдром Кавасаки, кератит, сухой кератоконъюнктивит, синдром Ландри-Гийена-Барре-Строла, лепроматозную лепру, синдром Леффлера, волчанку, синдром Лайелла, вызванное спирохетой Borrelia burghdorferi заболевание домашних животных и человека, лимфоматозный гранулематоз, системный гепариноцитоз, смешанное заболевание соединительной ткани, множественный мононеврит, синдром Макла-Уэлса, слизисто-кожный лимфоузелковый синдром, многоцентровый ретикулогистиоцитоз, рассеянный склероз, миастению gravis, грибовидный микоз, системный некротический васкулит, нефротический синдром, синдром <перехлеста>, панникулит, холодовая пароксизмальную гемоглобинурию, ночную пароксизмальную гемоглобинурию, пемфигоид, пемфигус, эритематозный пемфигус, листовидную пузырчатку, обыкновенную пузырчатку, аллергоз голубеводов, гиперчувствительный пневмонит, узелковый полиартериит, ревматическую полимиалгию, болезнь Вагнера (полимиозит), идиопатический полирадикулоневрит, португальскую семейную полиневропатию, преэклампсию/эклампсию, билиарный первичный цирроз печени, генерализованную склеродермию (склеродермию), псориаз, псориатический артрит, легочно-альвеолярный протеиноз, пневмосклероз, феномен/синдром Рейно, тиреоидит Рейдела, болезнь Рейтера, рецидивирующую полихондрию, ревматический полиартрит, ревматоидный артрит, саркоидоз, склерит, склерозирующий холангит, сывороточную болезнь, ретикулярную эритродермию, синдром Шегрена, злокачественную экссудативную эритему, синдром Стилла, лейкоэнцефалит Ван-Богарта, метастатическую офтальмию, системную красную волчанку, отторжение трансплантата, неспецифический - 94 - 015992 язвенный колит, недифференцированную диффузную болезнь соединительной ткани, хроническую уртикарию, холодовую крапивницу, увеит, витилиго, болезнь Вебера-Кристиана, синдром Вегенера и синдром Вискотта-Олдрича. В соответствии с другим вариантом осуществления связывающие молекулы изобретения могут использоваться для предварительного применения. Например, те же самые преимущества будут очевидны в предварительном применении для химиотерапевтической доставки лекарства. Это изобретение ниже иллюстрировано следующими примерами, которые не должны быть рассмотрены как ограничивающие. Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, процитированных в тексте настоящего изобретения, включены в него по ссылке. Примеры В примерах использовались следующие материалы и способы, если не указано иначе. Общие материалы и способы. Как правило, при выполнении работ в настоящем изобретении использовались, если не указано иное, традиционные методы химии, биофизики, молекулярной биологии, технологии рекомбинантных ДНК, иммунологии (особенно, например, технологии работ с антителами) и стандартные способы электрофореза. В качестве примера можно посмотреть пособие следующих авторов: Sambrook, Fritsch и Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L Press, Pub. (1999) и Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley &Sons (1992). Конструкты экспрессии. Как правило, если не указано иное, конструкты экспрессии для scFvs в приведенных ниже примерах включают в себя N-концевой сигнальный пептид Gene III, а также С-концевой пептид очистки, включающий в себя маркерные последовательности Мус и His, а также участок гидролиза энтерокиназой (Enterokinase). Последовательность ДНК для каждого пептида приведена ниже. Последовательность ДНК для N-концевого сигнального пептида Gene III: Последовательность ДНК для N-концевого сигнального пептида Gene III: Последовательность ДНК для С-концевого пептида очистки: Последовательность ДНК для С-концевого пептида очистки: Антитела. Антитела BIIB, использованные в ряде примеров (BIIB1-BIIB18), представляют собой коллекцию антител с различной специфичностью. 17 из 18 антител были экспрессированы или в стабильном объеме, или в клонируемых клетках линии СНО, и один тип антител (BIIB13) был экспрессирован способом временной трансфекции в клетках HEK293Е. Все 18 типов антител содержат легкие каппа-цепи. Большинство антител являлись человеческими иммуноглобулинами типа IgG1; однако BIIB2, BIIB5 и BIIB11 являлись человеческими иммуноглобулинами типа IgG4. Семнадцать из 18 антител были человеческими или гуманизированными. BIIB15 были приматизированными® (Nakamura et al., 2000). Идентичность человеческих зародышевых линий для каждого из антител оценивалась выравниванием с помощью ClustalW (ClustalW WWW Service at the European Bioinformatics Institute, Thompson et al., 1994) последовательностей BIIB VH или VK против находящихся в свободном доступе человеческих зародышевых линий (Lefranc et al., 1999). 15 из 18 общих антител принадлежали к подклассу IgG1, оставшиеся 3 - к подклассу IgG4 (BIIB2, BIIB5 и BIIB11). Последовательности СН1 иммуноглобулинов IgG1 и IgG4 имеют 10 аминокислотных различий (6 являются консервативными) и дополнительный дисульфидный мостик с легкой цепью. Конструкт IgG1 и IgG4 с удвоенной Fv областью для исследования эффекта подкласса IgG на стабильность Fab был коммерчески доступен. Также были созданы два конструкта, включающие VH область BIIB7, встроенный в тяжелую цепь константной области или IgG1, или IgG4. Пример 1. Получение обычных белков ВНА10 scFv и Fab. ВНА10 scFv субклонировали из плазмиды pXWU034 способом полимеразной цепной реакции (Polymerase Chain Reaction (PCR)), используя олигонуклеотидные праймеры, приведенные в табл. 2. Прямой праймер BHA10-01F включает уникальный сайт рестриктазы Sph I (подчеркнутая последовательность), за которой следует 18 оснований из последовательности, комплементарной N-концевому вариабельному домену тяжелой цепи гена ВНА10. Обратный праймер, BHA10-01R, 24 основания из последовательности, комплементарной С-концевому вариабельному домену легкой цепи гена ВНА10, 15 оснований по- 95 - 015992 следовательности, комплементарной участку энтерокиназы (Enterokinase) и прилегающие участки Hind III и Xba I рестриктаз (участки рестрикционных эндонуклеаз подчеркнуты). После амплификации способом ПЦР ПЦР-продукт ожидаемого размера отделяли способом элетрофореза в агарозном геле, вырезали и очищали с помощью набора реагентов для экстракции Millipore Ultrafree-DA, пользуясь приложенной к набору методикой (Millipore; Bedford, MA). Очищенный ПЦР-продукт гидролизовали рестриктазой Sph I, получили "тупой" конец с помощью ДНК-полимеразы I в присутствии dNTPs и гидролизовали рестриктазой Hind III. Полученный ПЦР-продукт лигировали в pKJS216, предварительно гидролизованную с помощью Sca I/Hind III. pKJS216 является вектором Е.coli, который обеспечивает экспрессию рекомбинантного белка под контролем индуцибельного ara С промоутера. Частью легирующей смеси обычно трансформировали линию Е.coli XL1-Blue. Затем скринировали резистентные к ампициллину колонии, и правильность сиквенса конечного конструкта pIEH003 подтверждалась с помощью анализа ДНК. Сиквенс ДНК и аминокислотный сиквенс ВНА10 scFv показаны соответственно на фиг. 1 и 2 Таблица 2 Олигонуклеотиды для амплификации способом ПЦР обычного ВНА10 scFv Для экспрессии ВНА10 scFv свежевыделенные колонии Е.coli линии W3110 (АТСС, Manassas, Va. Cat. № 27325), трансформированные плазмидой pIEH003, выращивали в среде SB 4 × 250 мл (Teknova, Half Moon Bay, Ca. Cat. № S0140), включающей 50 мкг/мл карбенициллина в конических колбах объемом 1 л до OD600≅0,8, индуцировали добавлением к 0,02% арабинозе и культивировали в течение ночи. Бактерии отделяли центрифугированием. Осадки сольюбилизировали и лизировали в 40 мл B-PER реагента для экстракции белков (Cat № 78243, Pierce). Солюбилизированные scFv наносили на колонку Ni-NTA-Superflow объемом 5 мл (Cat № 30410, Qiagen). Связавшийся scFv промывали 60 мМ имидазолом, рН 8,0 и элюировали 300 мМ имидазолом, рН 8,0. Элюированный scFv наносили на колонку Protein L agarose объемом 6 мл (Cat № 20510, Pierce). Связавшийся белок промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS) и элюировали 0,1 М глицином, рН 3,0. Очищенные scFvs диализовали PBS и хранили при -20°С. Концентрацию белка определяли по ε280nm=2,1 мл⋅мг-1⋅см-1. Для ферментативного получения ВНА10 Fab, BHA10 IgG смешивали с 4 мкл концентрированного сток-раствора папаина (0,3 мг/мл, 30 Units/мг - Cat № 108014, Roche) в 8,3 мл раствора, включающего 2,4 мг/мл ВНА10 IgG1, 100 мМ Tris-HCl, 20 мМ EDTA при рН 7,0. Реакцию проводили при 25°С в течение 90 мин. Полученный раствор разбавили в соотношении 1:5 20 мМ ацетатом, рН 5,0 и нанесли на колонку SP-Sepharose FF объемом 6 мл, предварительно уравновесив колонку тем же буфером для разбавления. Колонку промывали двумя объемами (по размеру колонки) буфера для разбавления. "Сырые" фрагменты Fab элюировали линейным градиентом NaCl (0-200 мМ), 30 объемами колонки. Широкий пик, выходящий при концентрации 140 мМ NaCl (общий объем ~24 мл), содержал основную массу гидролизованного IgG. Собранный элюат концентрировали до объема 2 мл и наносили на препаративную колонку G300 SW Tosohaas SEC (109 мл), уравновешенную PBS. Fab элюировался с колонки в 0,8 объема и собирался в объеме около 15 мл. Очищенный Fab концентрировали до 2-11 мг/мл. Концентрации Fab определяли, используя ε280nm=1,5 мл⋅мг-1⋅см-1. Пример 2. Термостабильность обычной молекулы ВНА10 scFvs. Для сравнения стабильности очищенного ВНА10 scFv и его аналога Fab использовался способ дифференциальной сканирующей калоримметрии. Сканирование выполняли на автоматизированном капиллярном дифференциальном сканирующем калориметре (capDSC, Microcal, LLC). Растворы белков и растворы сравнения автоматически отбирались из 96-луночных планшетов. Перед каждым сканированием белка в ячейке для пробы выполнялось 2 сканирования буфера, и полученная величина в дальнейшем использовалась для вычитания фонового поглощения. После каждого сканирования белков проводилось однократное очищающее сканирование с использованием 5% Liquinox. После каждого сканирования прибор автоматичеки промывался деионизированной дистиллированной водой (2мл), включающей 0,01% азид натрия, при этом ячейка для образца и ячейка для раствора сравнения промывались трижды. Сканирования выполнялись со скоростью 1°С/мин, с использованием режима medium feedback mode для улучшения разрешения прибора. Сканирование проводилось винтервале температур 20-95°С. Все 96луночные планшеты, включающие белок, хранились внутри прибора при температуре 6°С. На фиг. 3, 4 показаны результаты сканирования способом дифференциальной сканирующей калоримметрии очищенных фрагментов антител ВНА10 Fab и scFv. Температура внутри калоримметра увеличивалась до тех пор, пока не происходило развертывание Fab или scFv. Температура, при которой происходило развертывание белка (а именно величина ТМ), может служить показателем общей стабильности белка. Все четыре домена ВНА10 Fab (VH, VL, CH1 и CL) развертываются одновременно при температуре - 96 - 015992 78°С (фиг. 3). scFv домен. scFv домен теряет домены СН1 и CL. Без этого взаимодействия домены scFv развертываются при гораздо более низкой температуре, чем Fab, при этом наблюдается существенное снижение калориметрической энтальпии доменов, указывающее на потерю стабилизирующих взаимодействий. VL домен развертывается при температуре ТМ=68°С, в то время как VH домен развертывается при температуре 58°С, что на 20°С ниже, чем температура перехода в денатурированное состояние (unfolding transition) для ВНА10 Fab (фиг. 4). Кроме этого, величина ТМ зависит от скорости сканирования, из этого следует, что агрегация белка происходит и во время фазы нагрева. Для scFv показано, что при снижении скорости нагрева ТМ снижается (Sanchez-Ruiz et al., Biochemistry, 27: 1648-1652, 1988). Выявленная низкая стабильность и склонность к агрегации может быть детерминирующим фактором, из-за которого клетки СНО не способны производить существенные количества стабильного, неагрегирующего материала, включающего scFvs, такого как обычные молекулы биспецифических антител Геркулес. Пример 3. Конструкция молекулы ВНА10 scFvs с улучшенной термостабильностью. На основе того, что домен ВНА10 scFv, как показано в примере 2, в своей основе нестабилен, было выдвинуто предположение, что модификация scFv способами генной инженерии с использованием технологии рекомбинантной ДНК, позволит получить модифицированные scFv, которые будут термодинамически или функционально эквивалентны Fab в условиях изменения температуры, что приведет к созданию scFv домена, который может быть использован для создания биспецифических антител. Также было выдвинуто предположение, что модификация scFv домена сама по себе придаст какие-нибудь положительные биофизические свойства, которые проявятся, когда он будет частью полностью сформированной биспецифической молекулы. В итоге была начата работа по улучшению биофизической стабильности ВНА10 scFv домена с использованим экспрессионной системы Е.coli. Стабильность оценивали по измерению связывания термически резистентных scFv доменов с лигандом и по результатам термического анализа. Для стабилизации scFv домена были использованы два способа: 1) введение дисульфидной связи между VH и VL доменами ВНА10 scFv и 2) оптимизация длины (Gly4Ser)n линкера, который связывает VH и VL домены BHA10 scFv. А. Создание ВНА10 scFvs, стабилизированного дисульфидной связью. В качестве родительского вектора для экспрессии ВНА10 scFv был использован вектор pIEH003. Набор реактивов QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene; La Jolla, CA) использовали согласно прилагаемой к набору инструкции. С его помощью в цепи VH и VL ввели два цистеиновых остатка (по одному в каждую цепь), которые могли использоваться для образования стабилизирующей дисульфидной связи. Чтобы вызвать мутацию остатка Gly (GGA) на Cys (TGC) в позиции 44 (по Кэбату) вариабельного домена тяжелой цепи ВНА10, использовали пары праймеров VH44-F и VH44-R (табл. 3). Продукт мутагенеза гидролизовали с помощью чувствительного к метилированию фермента Dpn I в соответствии с методикой, приложенной к набору реактивов для Dpn I, и тансформировали в Е.coli линии XL10GOLD® (Stratagene; La Jolla, CA). Для отбора колоний, включающих заданную мутацию, трансформированные колонии Е.coli, нечувствительные к ампициллину, скринировали путем секвенирования ДНК. Полученная плазмида pIEH004 была использована в дальнейшем для создания мутации остатка Gln (CAG) в позиции 100 (по Кэбату) на Cys (TGC) в вариабельном домене легкой цепи ВНА10. Для этого использовались пары праймеров VL100-F и VL100-R (табл. 3). Прямой (VH44-F) и обратный (VH44-R) праймеры заменяют Gly (GGA) на Cys (TGC) в позиции 44 VH (TGC указано подчеркиванием). Прямой (VL100-F) и обратный (VL100-R) праймеры вызывают мутацию Gln (CAG) на Cys (TGC) в позиции 100 VL (TGC указано подчеркиванием). Для отбора колоний, включающих заданную мутацию, трансформированные колонии XL10GOLD® Е.coli, нечувствительные к ампициллину, скринировали путем секвенирования ДНК. Полученная плазмида pIEH006 несла двойную цистеиновую мутацию в позициях VH44 и VL100. Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность для VH44/VL100 в стабилизированном дисульфидной связью ВНА10 scFv показаны соответственно на фиг. 5 и 6. - 97 - 015992 Таблица 3 Олигонуклеотиды для конструкции BHA10scFv, стабилизированного дисульфидной связью между VH44/VL100 В. Конструкция ВНА10 scFv с альтернативными линкерами (Gly4Ser)n. Плазмида pIEH003, кодирующая huBHA10 scFv с обычным линкером (Gly4Ser)3, была модифицирована способом ПЦР-амплификации с целью получения линкеров (Gly4Ser)4 или (Gly4Ser)5. Использованные праймеры приведены в табл. 4. Для получения ВНА10 scFv (Gly4Ser)4 был использован прямой праймер 5'PCR, обозначенный как pXWU002-F1, и обратный праймер 3'PCR, обозначенный как XWU002-R. Праймер 5' VH PCR XW002-F1 включает в себя сайт рестрикционной эндонуклеазы Btg I (подчеркнутая последовательность), локализованный на С-конце ВНА10 VH, за которым следует последовательность линкера (Gly4Ser)4. Праймер 3' VL PCR XW002-R включает в себя сайт Xba I и неполный сайт энтерокиназы (Enterokinase site). Неполный ВНА10 VH+линкер (Gly4Ser)4+участки ВНА10 VL амплифицировали способом ПЦР, используя набор праймеров XW002-F1/XW002-R PCR из плазмиды DNA pIEH003 (описана в примере 1). Соответствующий ожидаемому размеру фрагмент гена для неполного ВНА10 scFv-линкера (Gly4Ser)4 отделяли электрофорезом на агарозном геле, вырезали из геля и очищали с помощью набора реактивов для экстракции Millipore Ultrafree-DA в соответствии с приложенными к набору инструкциями (Millipore; Bedford, MA). Очищенный ПЦР-продукт гидролизовали и клонировали в гидролизованном Btg I/Xba I векторе pIEH003, получив плазмиду pXWU002, кодирующую ВНА10 scFv, включающий линкер (Gly4Ser)4. BHA10 scFv, включающий линкер (Gly4Ser)5, был получен аналогичным способом, с использованием ПЦР-праймеров XW003-F и XW002-R для получения плазмиды pXWU003. Прямой праймер 5' PCR (XWU003-F) содержал участок для Btg I (подчеркнутая последовательность), за которым следовала последовательность, кодирующая несколько аминокислот С-конца ВНА10 VH, и последовательность, кодирующую неполный линкер (Gly4Ser)5. Правильные последовательности были отобраны путем анализа последовательности ДНК. Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность для ВНА10 scFv, включающего линкер (Gly4Ser)4, показаны на фиг. 7 и 8 соответственно. Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность для ВНА10 scFv, включающего линкер (Gly4Ser)5, показаны на фиг. 9 и 10 соответственно. Таблица 4 Олигонуклеотиды для конструкции ВНА10 scFv с линкерами (Gly4Ser)4 или (Gly4Ser)5 Пример 4. Характеристика ВНА10 молекулы scFvs с улучшенной термостабильностью. А. Экспрессия и Вестерн блот анализ сконструированного ВНА10 scFvs. Для экспрессии сконструированного ВНА10 scFvs, E.coli линии W3110 (АТСС, Manassas, Va. Cat. № 27325) трансформировали с помощью плазмид pIEH003, pXWU002, pXWU003 и pIEH006, отбирали резистентные к ампициллину колонии и выращивали их в 10 мл среды SB (Teknova, Half Moon Bay, Ca. Cat. № S0140), включающей 50 мкс/г/мл карбенициллина в конической пробирке для центрифугирования объемом 50 мл до OD600≅0,8, индуцировали добавлением к 0,02% арабинозе и культивировали в течение ночи. Бактерии отделяли центрифугированием. Осадки ресуспендировали в 1/20 объема ледяного изоосмотического раствора, включающего 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1 мМ EDTA и 20% сахарозы (вес/объем) и охлаждали на льду. К бактериальной суспензии добавили равный объем 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1 мМ EDTA и 20% sucrose (вес/объем), включающий 2 мг/мл Lysozyme (Sigma), и инкубировали на льду, ино- 98 - 015992 гда встряхивая, в течение 10 мин. Затем бактериальную суспензию центрифугировали в течение 10 мин при 8000×g, 4°С и сохраняли периплазматическую фракцию. Образцы смешивали с нативным буфером для образцов или буфером, включающим восстанавливающий реагент дитиотреитол, и нагревали при 90°С в течение 3 мин. Восстановленные и невостановленные образцы разделяли способом SDS-PAGE электрофореза на Tris-глицин полиакриламидном геле и переносили электрофоретически на нитрозеллюлозную мембрану (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA). Мембрану блокировали PBS, включающим 5% (вес/объем) обезжиренное молоко и 0,1% Тритон Х100 и инкубировали с античеловеческими антителами каппа (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Мембрану отмывали и инкубировали с антикроличьими антителами HRP (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Образовавшиеся иммунные комплексы идентифицировали способом ECL (ECL Western Blotting Analysis System) согласно приложенной к набору инструкции (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Было показано, что одна из трех протестированных дисульфидных пар, а именно VH44:VL100, продуцирует значительные количества белка при экспрессии в Е.coli (фиг. 11, линия 2) (протестированные дисульфиды VH 44:VL 105 и VH 106:VL43 не продуцируют такого большого количества интактного scFv). Аналогичным образом, при увеличении длины линкера (Gly4Ser)n до n=4 (линия 3) или n=5 (не показано) также происходило увеличение продуцирования белка в Е.coli. Объединение обеих модификаций VH44:VL100 и ликера (Gly4Ser)4 в ВНА10 scFv c помощью способов, описанных в примере 3, также давало высокий уровень экспрессии белка (фиг. 11, линия 4). Последовательность ДНК и аминокислотная последовательность для ВНА10 scFv, включающего обе модификации (VH44:VL100 и линкер (Gly4Ser)4) показаны на фиг. 12 и 13 соответственно. В обоих случаях, когда ВНА10 scFv включает мутации VH44:VL10, scFvs имеет повышенную подвижность в денатурирующем не-восстанавливающем полиакриламидном геле, мигрируя аналогично ВНА10 scFv в денатурирующих, восстанавливающих условиях (фиг. 11, линии 2 и 4). Этот анализ позволяет предположить, что в тех случаях, когда ВНА10 scFv включает VH44;VL100, формируются интактные дисульфидные связи и образуется более компактная структура. В. Измерение термической денатурации. Активности обычного и сконструированного ВНА10 scFvs сравнивались способом температурного теста (thermal challenge assay), определяющего температуру, при которой 50% молекул scFvs сохраняет способность связываться с антигеном после выдерживания в условиях повышенной температуры (thermal challenge event). Величина этой температуры обозначалась как "Т50", измерялась в°С. В этом исследовании измерения для scFvs проводились в диапазоне температур, охватывающем температуру перехода для обычного ВНА10 scFv. Е.coli линии W3110 (АТСС, Manassas, Va. Cat. № 27325) трансформировали с помощью плазмид, кодирующих сконструированный и обычный ВНА10 scFvs под контролем индуцибельного промотера ara С промотор. Трансформированные клетки выращивали в течение ночи в среде для экспрессии SB (Teknova, Half Moon Bay, Ca. Cat. № S0140), включающей 1% глицин, 1% Тритон Х100, 0,02% арабинозу и 50 мкг/мл карбенициллина или при 37°С или при 32°С. Бактерии осаждали центрифугированием, полученный супернатант оставляли для дальнейшей обработки. Включение глицина и Тритона Х-100 в среду позволяет высвободить содержимое периплазмы (нативный белок Е.coli и scFv) в среду (Yang et al. Applied и Enviromental Microbiology (1998), 64:2869-2874). Присутствие в супернатанте белков Е.coli является существенным для выполнения этого измерения, т.к. термоинактивированные белки действуют как "раковина", захватывая случайно развернутые молекулы scFvs в необратимо инактивированные агрегаты. Каждую библиотеку скринировали на термическую стабильнось дважды. Первый супернатант подвергали воздействию в условиях эксперимента, а второй супернатант оставляли и использовали для сравнения. Измерение термоинактивации для получения данных о термостабильности может быть выполнено при одной температуре или в выбранном диапазоне температур. Для обработки образцов (супернатантов) использовался термоциклер, способный создавать стабильные температурные градиенты (iCycler, Bio-Rad, Gaithersburg, Md). Температурное воздействие варьировалось в зависимости от свойств взятого ВНА10 scFv и обычно было на 2-3 градуса выше, чем экспериментально определенная величина Т50. Замороженные платы Master размораживали и высевали в лунки на титрационном микропланшете, включающие 250 мкл на лунку среды для экспрессии, и культивировали в течение ночи при 32°С. В качестве контроля использовались культуры, включающие родительскую плазмиду. Их выращивали в тех же условиях и использовали одновременно с библиотекой. Бактерии осаждали и аликвоты объемом 50-100 мкл исследуемого супернатанта помещали или в пробирки для ПЦР (strip tubes) (Applied Biosystems, Foster City, Ca, Cat. № N801535), или в 96-луночные платы (Applied Biosystems, Foster City, Ca, Cat. № N801-560). Образцы нагревали в течение 60-90 мин. Образцы переносили в 96-луночные платы с V-образным дном (Corning, Corning, NY, Cat. № 3357) и центрифугировали в охлаждаемой клинической центрифуге (IEC model 8R, Thermo Electron, Waltham, Ma) в течение 30 мин. Затем 100 мкл супернатанта переносили в стандартный титрационный микропланшет (Corning, Corning, NY, Cat. № 3357). Аликвоту супернатанта оставляли для - 99 - 015992 DELFIA. Для большинства библиотек платы, включающие остатки супернатанта, запечатывали (Nalge Nunc, Rochester, NY, Cat. № 235205) и помещали в инкубатор с соответствующей термической проверкой (Echo Therm, Torrey Pines Scientific, San Marcos, Ca) на 90 мин. Для скрининга, требующего измерений при нескольких температурах проверки (или при температуре выше 75°С) супернатанты помещали в 96луночную плату для ПЦР (Applied Biosystems, Foster City, Ca, Cat. № N801-560) и инкубировали в течение 90 мин при требуемой температуре. После температурной стимуляции образцы центрифугировали при 2000 RPM для удаления с агрегировавшего материала. Растворимые ВНА10 scFv, оставшиеся после обработки в прозрачном супернатанте, отделяли и измеряли связывание с родственным (cognate) антигеном LTβR Ig способом DELFIA. 96-луночные платы (MaxiSorp, Nalge Nunc, Rochester, NY, Cat. № 437111) покрывали гибридным белком, состоящим из эктодомена рецептора LTβ (LTβR), связанного с Fc областью человека (концентрация раствора 1 мкг/мл в 0,1М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5). Платы инкубировали в течение ночи при 4°С и блокировали с помощью буфера для измерения DELFIA (DAB, 10 мМ Tris HCl, 150 мМ NaCl, 20 мкМ EDTA, 0,5% BSA, 0,02% Tween 20, 0,01% NaN3, pH 7,4), инкубируя с ним в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре. Платы отмывали 3 раза DAB, не включающим BSA (отмывочный буфер), затем добавляли к платам исследуемые образцы, растворенные в DAB в конечном объеме 100 мкл. Платы инкубировали в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре и трижды отмывали отмывочным буфером для удаления несвязавшихся или функционально неактивных молекул scFvs. Связанный ВНА10 scFv определяли добавлением в каждую ячейку 100 мкл DAB, включающего 40 нг/мл меченых Eu антиHis6 антител (Perkin Elmer, Boston, MA, Cat. № AD0109), и инкубировали на шейкере при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем платы трижды отмывали отмывочным буфером и добавляли в каждую ячейку 100 мкл усиливающего раствора DELFIA (Perkin Elmer, Boston, MA, Cat. № 4001-0010). После инкубации в течение 15 мин платы детектировали, определяя Европий на приборе Victor 2 (Perkin Elmer, Boston, MA). Данные измерений обрабатывали с помощью программного обеспечения Spotfire DecisionSite (Spotfire, Somerville, Ma.) и выражали в виде отношения количества импульсов при температуре проверки к количеству импульсов при исходной температуре для каждого клона. Клоны, воспроизводимо дающие значение этого отношения в два или более раз выше, чем для родительской плазмиды, считались хитами. Плазмидная ДНК для этих клонов была выделена с помощью набора mini-prep (Wizard Plus, Promega, Madison, WI) и ретрансфомирована в Е.coli W3110 для вторичного измерения температурной проверки. Данные, полученные при градиенте температуры, анализировались с помощью программного обеспечения Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, Ca), с использованием в качестве модели сигмоидальной дозовой зависимости с варьируемой крутизной (варьируемым наклоном). За величину Т50 принимались значения, полученные в средней точке кривой термической денатурации, при этом принималось, что они не эквивалентны биофизически определенной величине ТМ. Результаты, полученные при анализе температурной проверки, показаны на фиг. 14. Как видно из фиг. 14, все стабилизированные молекулы scFvs изобретения демонстрируют улучшенную связывающую активность (Т50 >49°С) по сравнению с обычными scFv. В частности, величины Т50 для ВНА10 позиции библиотеки VL46 scFv(S46L), позиции библиотеки VH16 scFv (S16E и S16Q) и позиции библиотеки VL49:VL50 scFv демонстрировали увеличение термической стабильности в диапазоне от 3 до 12°С по сравнению с обычным ВНА10 scFv. Кроме этого, величины Т50 для ВНА10 позиция библиотеки VL3 scFv (Q3A, Q3G, Q3S, Q3V и Q3D), позиция библиотеки VH67 scFv (V67I и V67L), позиция библиотеки VH48 scFv (M48I и M48G), позиция библиотеки VH20 scFv(V20i) и позиция библиотеки VH101 scFv (Р101D) демонстрировали увеличение термической стабильности в диапазоне от 4 до 18°С по сравнению с обычным ВНА10 scFv. Одна из стабилизирующих мутаций (VL K13E) возникла благодаря ошибке ПЦР. Оказалось, что включение этой стабилизирующей мутации в pIEH009 дает дополнительное увеличение термической стабильности и даже превышает те, что получены для ВНА10 Fab в этих условиях. Важно, что нековалентная мутация VL46, VH101 и мутации VH55, определенные в ходе одного (или более) из подходов (моделирование гомологии области контакта VL/VH, согласованные вычисления, компьютерное моделирование и ковариационный анализ), приводят к увеличению термической стабильности scFv приблизительно в той же степени, что наблюдается для дисульфидных мутаций, и обосновывают полезность и новизну этих подходов. В частности, Т50 для конструкта pIEH006, BHA10 VH44:VL100 scFv (59°C) отличалась от ВНА10 Fab (62°C) только на 3°С, в то время как конструкт pIEH009, ВНА10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер, как оказалось, был функционально эквивалентен ВНА10 Fab при этих условиях. Эти результаты демонстрируют, что стабилизированные scFvs изобретения имеют улучшенную активность после температурной проверки. С. Измерение сродства. Для измерения сродства sLTβR к ВНА10 Fab, полученного фементативным гидролизом молекулы ВНА10 IgG1, был использован способ изотермического калориметрического титрования (ITC.) sLTβR получали по методике, описанной Eldredge et al., Biochemistry (2006). Fab и sLTβR концентрировали соответственно до 6,0 и 2,0 мг/мл. Концентрирование проводили способом ультрацентрифугирования, ис- 100 - 015992 пользуя оборудование и фильтры Amicon (MWCO 10,000). Перед калориметрическим титрованием (ITC) концентрированные сток-растворы одновременно диализовали против PBS. Калориметрическое титрование ITC проводили на приборе VP-ITC (Microcal LLC, Northampton, MA) при 30°С. Примерно 500 мкл 7 мкМ раствора sLTβR поместили в ячейку для образца и добавили в ячейку сравнения диализат PBS. Затем в ячейку для образца порциями добавляли 70 мкМ BHA10 Fab (инъекции 7×10 мкл, 12×7 мкл и затем 8×10 мкл, общее количество добавленного ВНА10 Fab составило 234 мкл). Стехиометрия реакции 1:1. Кривые ITC анализировались с помощью пограмммного обеспечения, поставляемого вместе с прибором. Измерение KD обычного ВНА10 scFv, а также препаратов ВНА10 (Gly4Ser)4 scFv и ВНА10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv, описанных в примере 3 и экспрессированных и очищенных способами, приведенными в примере 1, выполняли способом поверхностного плазменного резонанса (SPR) на приборе Biacore 3000 (Biacore Inc., Piscataway, NJ). Все измерения проводили в буфере HBS-EP, рН 7,4. Биотинилированные антитела PENTA-His (20 мкг/мл, Cat № 34440, Qiagen) были иммобилизованы на покрытом стрептавидином чипе СМ5 при скорости потока 10 мкл/мин в течение примерно 1 мин. 0,1 мкМ растворы исследуемых scFvs впрыскивали над чипом при скорости потока 5 мкл/мин в течение 10 мин, при этом scFvs связывались с поверхностью с помощью иммобилизованных антител PENTA-His. Для определения связывания между sLTβR и связавшимися scFv была измерена концентрационная зависимость при концентрациях sLTβR (1, 2, 5, 10, 25, 50, 100 и 200 нМ). sLTβR дважды впрыскивали на поверхность со связанными scFv при скорости потока 30 мкл/мин. Для вычитания фона из величины, полученной при инъекции образца, вычиталась величина, полученная в тот момент, когда проточная кювета содержала только буфер, и величина, полученная для поверхности с PENTA-His, когда вслед за инъекцией scFv вместо sLTβR впрыскивали буфер. Полученные кривые анализировали с помощью программного обеспечения BiaEval 3,0. Значение KD определяли по кривым ассоциации и диссоциации, используя модель Ленгмюра при связывании в соотношении 1:1. Поверхность чипа регенерировали двумя последовательными инъекциями 0,1 М глицина, рН 3,0. Табл. 5 показывает результаты измерения сродства способом поверхностного плазменного резонанса. Сродство рекомбинантного ВНА10 scFv практически такое же, как у ВНА10 Fab, полученного способом, описанным в примере 1. Кроме этого, введение линкера (G4S)4 одного или стабилизирующей дисульфидной связи или их комбинации не приводит к существенной потере сродства к антигену. Таблица 5 Измерения сродства к LTβR способом поверхностного плазмонного резонанса * Измерено способом изотермического калориметрического титрования. D. Исследования способом дифференциальной сканирующей калориметрии. Способ дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) применялся для анализа ВНА10 scFv, BHA10 (Gly4Ser)4 scFv и ВНА10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv. Эксперименты проводились, как описано выше, для первоначального сравнения обычного scFv и полученного ферментативным путем Fab, за исключением того, что сканирование выполнялось со скоростью 4°С/мин. Термостабильность ВНА10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv была выше, чем термостабильность scFv дикого типа. В частности, менее стабильный из двух доменов, домен VH BHA10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv, денатурировал при температуре примерно на 5°С выше, чем обычный ВНА10 scFv (фиг. 15). Повышение "температуры плавления" или ТМ могло быть вызвано двумя различными факторами: (i) увеличением термостабильности равновесной складчатой структуры или (ii) снижением тенденции к аггрегации. Различие в Δ 5°С между обычным ВНА10 scFv и ВНА10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv практичеки не зависело от скорости сканирования (в интервале между 0,2 и 4,0°С/мин), это позволяет предположить, что наблюдаемые изменения ТМ происходят благодаря стабилизации равновесной складчатой структуры. Е. Изучение связывания ANS. Способность связывать гидрофобный флюоресцентный краситель 1-анилино-8-нафталин сульфонат (ANS) можно считать показателем взаимодействия между значительными по размеру гидрофобными участками белка в нативном состоянии или в частично раскрывшейся структуре, которая образуется при повышении температуры. В растворителе собственная флюоресценция красителя гаснет, но она значительно повышается при взаимодействии с большой гидрофобной поверхностью белка. Обычный ВНА10 - 101 - 015992 scFv в действительности связывает ANS в значительно большей степени, чем ВНА10 (Gly4Ser)4 scFv, или ВНА10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv, что указывает на наличие на scFv доступных гидрофобных областей, существующих благодаря линкеру неадекватного (неподходящего) размера. Введение более длинного линкера, а именно (Gly4Ser)4, как оказалось опосредует это эффект. Видимая открытость гидрофобной поверхности обычного ВНА10 scFv может приводить к повышенному уровню аггрегации в присутствии других белков или молекул, и даже в чистом растворе самого белка. Нагревание ВНА10 scFv выше его ТМ вызывает связывание ANS и с обычным, и с конструированным ВНА10 scFvs. Интересно, что обычный ВНА10 scFv показывал значительное увеличение связывания ANS как функцию от повышающейся температуры, это позволяет предположить, что при температурах ниже ТМ повышается доступность гидрофобных участков, в частности, это может происходить при температурах, используемых при культивировании бактериальных клеток и клеток млекопитающих (т.е. 37°С) (фиг. 16). В противоположность этому, как ВНА10 (Gly4Ser)4, так и ВНА10 VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFvs не проявляли такого свойства, это позволяет предположить, что стабилизирующие мутации, описанные в данном изобретении, снижают тенденцию к образованию полу-ассоциатов или ассоциатов с другими белковыми компонентами в культуре благодаря меньшей доступности гидрофобных участков на поверхности белка. Пример 5. Идентификация стабилизирующих мутаций, обеспечивающих улучшенную внутреннюю стабильность белка. (i) Идентификация стабилизирующих мутаций. Для идентификации стабилизирующих мутаций, обеспечивающих повышенную стабильность представляющим интерес белковым молекулам, были использованы разнообразные способы, основанные на анализе последовательностей (например, подсчет консенсуса, ковариационный анализ, моделирование гомологии области контакта VH/VL). Эти стабилизирующие мутации были использованы при создании библиотек экспрессии вариабельного участка антитела. А. Ковариационный анализ. Много проектов было разработано для того, чтобы стабилизировать ВНА10 scFv VH и VL домены, на основании сильной ковариации, демонстрируемой двумя или более остатками в пределах отдельной последовательности. Анализ ковариаций был выполнен на ВНА10 scFv VH и VL доменах с использованием способов, подобных описанным в примере 17, чтобы идентифицировать отсутствующие или разрушающие ковариации таким образом, что стабилизирующие мутации могли быть спрогнозированы и включены в библиотеку экспрессии вариабельных областей антител для экспериментального скрининга. В первом примере, мутации от Ser к Leu в положении 46 (S46L; система нумерация Кэбата) в пределах ВНА10 VL показали положительную связь с существующим Tyr в остатке 36, который по данным Инструмента Анализа Ковариации сильно коварьирует с 46 леями (см. фиг. 104). Анализ частот остатков также показал, что мутация должны быть стабилизирующей. В дополнение к S46L вторая мутация, стабилизирующая по данным ковариации, была мутацией V55G в пределах VH BHA10 домена. В то время как частота остатка указала, что Val нечасто наблюдается в этом положении, это положение включено в CDR2 и является вариабельным. Поэтому, без дополнительной информации, не предпринималось попыток вносить изменения в этом положении. После анализа ковариации, однако, данные ковариации предположили, что это положение сильно коррелировано по крайней мере с 10 другими аминокислотами, которые уже существуют в пределах VH BHA10 домен. Мутация к Gly в положении 55 удовлетворила все 10 ковариаций. Другим примером эффективно Инструмента Анализа Ковариации было прогнозирование отрицательного эффекта VH BHA10 мутации Q6E. Частотный анализ одного остатка предположил, что мутация к намного чаще наблюдаемому Glu в этом положении приведет к увеличению стабильности. Однако Инструмент Анализа Ковариации указал, что отдельная мутация K Glu нарушает несколько существующих настоящих ковариаций в пределах последовательности VH BHA10. Чтобы получить улучшение стабильности, нужно заменить несколько аминокислот, которые избирательно стабилизируют Glu в этом положении. Еще один пример прогностической ценности Инструмента Анализа Ковариации показан на фиг. 105. Met 80 был мутирован к Leu как часть отдельного проекта библиотеки остатка. Считалось, что эта отдельная мутация будет очень стабилизирующей, поскольку Leu - самая частая аминокислота, наблюдаемая в этом положении в базе данных последовательности. Однако исследования ковариации указывают, что две других аминокислоты должны быть мутированы (V67F и T70S), чтобы достигнуть гармонии ковариации. В. Подсчет консенсуса. Оценка консенсуса использовалась как способ идентификации аминокислотных остатков scFv VH и VL области для мутагенеза, чтобы улучшить стабильность scFv. Оценка показывает относительное отклонение от консенсуса VH и VK последовательностей из-за гиперсоматических мутаций и эволюционных зародышевых изменений. Информация, полученная из этого анализа, использовалась, чтобы проектировать библиотеку для скрининга scFv вариантов с улучшенной стабильностью. Набор сравнения VH и VK каппа последовательностей млекопитающих использовался для получения консенсусной последовательности для подсчета, и индивидуальные частоты аминокислот в каждом - 102 - 015992 положении остатков были собраны, отсортированы и отобраны, как описано ранее (Demarest, et al., J. Mol. Biol. 335, 41-48 (2004); Demarest, et al., Protein Eng. Des. Sel. In Press (2006). Наборы сравнения млекопитающих были наивно сконструированы, чтобы включать V-гены от различных млекопитающих для достижения разнообразия через эволюционное отклонение между разновидностями. Набор сравнения VH млекопитающих включает 61 последовательность VH, прежде всего от NCBI и TIGR, представляя в общей сложности 17 различных видов млекопитающих. Набор сравнения VK млекопитающих включает 53 VK последовательностей от 13 различных видов млекопитающих. Статистический анализ VH BHA10 и VL был выполнен с использованием пользовательских баз данных IgG и модифицированного набора символов PERL (Demarest и др., 2004; Demarest и др., 2006). Частота аминокислот каждого остатка в пределах VH BHA10 и VL была вычислена из пользовательской базы данных. Частота остатка каждой аминокислоты в пределах VH BHA10 и VL, Si®, для каждого положения "i'' в индивидуальной последовательности была вычислена столько раз, что специфичный тип остатка (r=А, С, D,... V, W, Y) наблюдается в пределах набора данных, разделенного на общее количество последовательностей. Фиг. 17, 18 показывают VH BHA10 и VL частоты остатков, деленное на частоту консенсусных остатков базы данных. Разделив на консенсусную частоту остатка, получен строгий порог для создания библиотек в положениях остатка, где аминокислота ВНА10 нечасто наблюдается среди общего VH или VL последовательности. Положения библиотеки были определены теми остатками, частота которых, разделенная на наибольшую частоту остатка (Si(r)/MFRi(r)), составляла <0,3. Остатки, перечисленные справа от вычислений частоты остатка, обычно находятся в человеческих последовательностях как показано в работе (Chothia, и др., J. Молекулярная масса. Biol. 278, 457-479 (1998)), и могут быть специфично перенаправлены в формат библиотеки, чтобы показать на экране для самой стабилизирующей аминокислоты. CDR VH и VL BHA10 не рассматривали для оптимизации стабильности из-за потенциального прерывания взаимодействия с LTβR, но могли рассматривать для дизайнов второго поколения. С. Моделирование гомологии области контакта VH/VL. Как описано в примере 15, анализ дифференциальной сканирующей калориметрии был выполнен на 17 человеческих антителах. Главные кандидаты, BIIB1-4 все имели прекрасные (т.е. очень высокие и желательные) свойства стабильности. Эти очень устойчивые антитела могут использоваться как платформа для того, чтобы улучшить стабильность scFv или доменов антител с низкой собственной стабильностью. В частности, особое внимание уделялось внутренней поверхности между VH и VL, чтобы обеспечить потенциально больший уровень свойств стабильности. Конверсия ВНА10 Fab в scFv формат приводила к изменению в термограмме ДСК, говорящей о полностью кооперативном событии разворачивания, что видно из одного перехода развертывания при более высокой температуре (Fab), по существу, к некооперативному событию развертывания, что видно из двух индивидуальных низкотемпературных переходов развертывания (scFv). Другими словами, в Fab формате, междоменные контакты были достаточно сильны, чтобы захватить все домены в один высокотемпературный переход развертывания. После удаления доменов CH1 и CL, VH и VL домены scFv больше не могли вести переход развертывания в кооперативном событии. Постулируется, что стабилизация области контакта может не только стабилизировать оба VH и VL домена одновременно, но также и вызвать прилипание VH/VL области контакта и не допустить агрегации. Четыре самых устойчивых BIIB антитела (BIIB1-4) использовались, чтобы спроектировать стабилизирующие мутации в ВНА10 scFv через двухступенчатую процедуру. Во-первых, кристаллическая структура гуманизированного Fab BHA10 использовалась для структурного анализа. Конкретно, кристаллическая структура использовалась, чтобы идентифицировать все остатки в области контакта между VH и VL, так же как площадь поверхности, которую каждый остаток покрывает в области контакта (использующий программное обеспечение MOLMOL). Остатки, которые в области контакта занимают значительно больше площади поверхности, чем другие, как полагают, являются более критическими для области контакта. В качестве произвольно взятого предела приоритизации, те остатки, которые занимают от 30 и 40 Å2, считаются важными. Те, которые занимают > 40 Å2, считают критическими. Этим двум категориям уделили самое высокое значение в терминах моделирования гомологии и мутагенеза. Площадь поверхности, которую каждый остаток вводит в толщу тканей в области контакта, представлена в табл. 6. Вовторых, типы аминокислоты в области контакта между VH и VL сравнили с аминокислотами, которые присутствуют в тех же самых положениях в BIIB1-4 (т.е. чрезвычайно устойчивого антитела). Этот способ позволил идентифицировать многие выдающиеся мутации для того, чтобы стабилизировать ВНА10 scFv. Две мутации, S46L в VL и P101D в VH, были экспериментально валидированы, как описано в примере 8. Фактически, эти две мутации были отдельными наиболее стабилизирующими мутациями, проверенными в анализе термической проверки (например, см. фиг. 65(А)). Обе мутации стабилизируют VH и VL домены одновременно, предполагая, что они помогают построить кооперативность среди доменов. - 103 - 015992 Таблица 6 Анализ площади поверхности ВНА10 VHVL - 104 - 015992 (Положения остатков, помеченные *, показывают хорошие возможности дизайна стабильности посредством мутаций на остатки BIIB1, 2, 3 или 4). D. Компьютерный анализ. Вычислительные способы использовались, чтобы проанализировать ВНА10 для того, чтобы делать рекомендации по положениям, аминокислотные замены в которых могли бы улучшить стабильность. Эти способы состояли из двух этапов: основанный на последовательности анализ (этап 1) и основанный на структуре анализ (этап 2). Во время первого этапа использовалась база данных последовательностей вариабельных доменов антител. Аминокислоты, представленные в низких частотах в их соответствую- 105 - 015992 щих положениях (меньше чем в 10% последовательностей базы данных) или те, которые не соответствовали соответствующим консенсусным аминокислотам, были отобраны для замен на высокочастотные или консенсусные аминокислоты (мутации кандидатуры). На втором этапе использовалась трехмерная структура или модель фрагмента Fab антитела. Мутации кандидата были оценены в их структурном контексте и расположены по приоритетам для экспериментального исследования, основанного на структурных свойствах, совместимости с конформациями областей, определяющих комплементарность, роль в упаковке области контакта VL/VH и сворачивание тяжелых и легких цепей. ВНА10 необычен из-за наличия серина в положении 46 легкой цепи. В базе данных приблизительно 1% VL (каппа подтип) последовательности обладают S46, тогда как приблизительно у 79% VL (каппа подтип) последовательности есть L46. Кроме того, у человеческого консенсуса KV1 есть L46. После идентификации как кандидатуры мутации замена S46L была оценена в контексте трехмерной модели Fab BHA10. Положение 46 было найдено, так как находилось в области контакта VL/VH в контакте с Y101 и W103 VH и Y36 и Y55 VL. Структурный анализ показал, что замена S46L была совместима с целостностью области контакта VL/VH, конформациям CDR и VL сворачиванием. Серин - нечастая аминокислота в положении 16 тяжелой цепи. В базе данных приблизительно 5% последовательностей VH содержат S16, у 25% есть А16, у 21% есть G16, у 11% есть Е16 и приблизительно 10% - Q16. Также А16 есть у человеческого консенсуса HV1. После идентификации как мутации кандидата, S16A, Г, Е и Q замены были оценены в контексте трехмерной модели Fab ВНА10. Нашли, что положение 16 находится в петле, ближайшей к области контакта VH/CH1 и в контакте с K13 и S16 VH. Структурный анализ показал, что S16A, Г, Е и Q замены были совместимы с целостностью области контакта VL/VH, конформаций CDR и сворачиванием VH. Также заключили, что предпочтительны длинные гидрофильные боковые цепи Е16 и Q16. Соответственно положения VL46 и VH16 были представлены в проекте библиотеки. Комплементарный подход к вычислительному анализу использовал структурные способы белковой инженерии, такие как описаны в работе Rosetta (Kuhlman В. и др., PNAS 200198 (19): 10687-91) и DEEK (Hanf K.J., Ph.D. Thesis, MIT, 2002). Учитывая трехмерную структуру белковой области контакта, эти способы позволяют определить мутации в последовательности аминокислоты, которые приводят к улучшенному ΔΔГ для VH и VL связывания (различие между связанным и несвязанным состояниями), и/или ΔΔГ для VH и VL свертывания (различие между свернутым и несвернутым состояниями). Использование этих способов показало, что S46L - мутация, которая улучшает связывание VH и VL, тогда как S16E - мутация, которая улучшает сворачивание VH. Е. Комбинированные подходы дизайна области контакта и ковариаций. Анализ ковариаций использовался, чтобы определить сети остатков, важные для обеспечения и поддержки области контакта между VH и VL и для обеспечения сильного сродства между VH/VL, что приводит к увеличению scFv стабильности. Остатки, непосредственно вовлеченные в область контакта между VH и VL BHA10 scFv, были идентифицированы, как описано в примере 5С, и перечислены в табл. 6. Остатки, которые сильно коварьируют с наиболее используемыми остатками, перечисленными в табл. 6, были вычислены, используя способологию ковариации, описанную в секции (а) выше. НММ, используемый для анализа ковариации, не позволяет исследовать остатки в CDR2 и CDR3 обоих VH и VL доменов, которые заняты в области контакта. Однако предполагается, что никакие сильные ковариации не явились бы результатом этих положений остатка, поскольку они являются очень вариабельными из-за интенсивного селективного давления, которое существует для антител, чтобы они распознавали антигены с высоким сродством. Поэтому остатки, которые использовались для того, чтобы определить, существует ли сеть ковариации, поддерживающая область контакта между обоими VH и VL, были: Остатки, вид которых в выравнивании последовательности V-класса коррелировал с упомянутыми выше остатками области контакта, были определены с использованием порога значения фи> 0,25. Остаток не рассмотрели как важный элемент для поддержания сильного взаимодействия между VH и VL, если он не коррелировал по крайней мере с двумя из остатков области контакта, перечисленных непосредственно выше. Табл. 7 и 8 перечисляют такие остатки VH и VL доменов соответственно, которые демонст- 106 - 015992 рируют две или более корреляций с остатками области контакта. Чем больше количество связей, тем больше воздействие и каждое из этих положений аминокислоты стабилизирует область контакта между V H и V L. Таблица 7 Остатки с VH с множественными сильными корреляциями к структурным остаткам, наблюдаемым в области контакта кристаллической структуры ВНА10, полученной в результате рентгеновского анализа Выделенные полужирным шрифтом остатки занимают место на области контакта. Выделенные курсивом остатки непосредственно прилегают к первичной последовательности остатков, расположенных в области контакта. * Свойство, позволяющее различать подклассы. ** Коварьирует с большим количеством таких же остатков, что и первичный остаток, но с меньшим уровнем корреляции из-за меньшей частоты остатков. - 107 - 015992 Таблица 8 Остатки с VL с множественными сильными корреляциями к структурным остаткам, наблюдаемым в области контакта кристаллической структуры ВНА10, полученной в результате рентгеновского анализа Выделенные полужирным шрифтом остатки занимают место в области контакта. Выделенные курсивом остатки непосредственно прилегают к первичной последовательности остатков, расположенных в области контакта. *Q50,A89,Y135 консервативны в тяжелой и легкой цепях и ковариации, вероятно, не коррелируют с положением в легкой цепи. Остатки из табл. 7 и 8 были представлены на поверхности VH BHA10 и VL соответственно и сопоставлены с фактическими остатками, которые устанавливают прямой контакт в области контакта между двумя доменами (см. фиг. 116-119). Из этого анализа сделано два вывода. Во-первых, ковариации не предоставляют информацию (на данном этапе) о сетях, вовлекающих CDR2 и CDR3 остатки в области контакта. Во-вторых, ковариации предполагают, что не только остатки, которые устанавливают прямые контакты в пределах области контакта, важны для его обеспечения, но что много других остатков вне прямых остатков с областью контакта важны для его поддержки и поддерживают положения остатков области контакта. Этот вывод проиллюстрирован теми остатками, которые есть на поверхности сети ковариаций, но отсутствуют на поверхности, полученной просто с помощью структур, чтобы вычислить те остатки, которые непосредственно занимают поверхность в области контакта. Нарушения нескольких из этих сетей ковариации области контакта были обнаружены в ВНА10 или р5Е8 (описанный ниже в примере 21) scFv: VH или VL последовательности. Мутация нативная/неидеальная аминокислоты в этих положениях к идеально поддерживающим кислотным остаткам области контакта, описанным в табл. 7 и 8, оказалась очень стабилизирующей для ВНА10 или р5Е8 scFvs: (а) ВНА10 VL S46L и (b) Idec152 VH S49G (Кэбат и рентген №) E72D (73 для рентгена). Один из этих остатков (S46LVL) был непосредственно в области контакта, один (S49GVH) был непосредственно связан с областью контакта, и каждый был дистальным для области контакта (E72DVH). Однако все три были спрогнозированы на основании Анализа Ковариаций, чтобы стабилизировать область контакта. Стабилизация области контакта может наблюдаться способом ДСК как увеличение теплоустойчивости V H и V L. ii) Конструирование и скрининг ВНА10 scFv библиотек с улучшенной температурной стабильностью. А) Конструирование библиотек scFv. Библиотеки проектировали, чтобы они содержали желательные замены аминокислот в обычном ВНА10 scFv (pXWU002), способами, описанными в примерах 4-6. Их создали, используя QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit, следуя инструкциям изготовителя (Stratagene, La Jolla, Ca) с помощью олигонуклеотидов, перечисленных в табл. 9. Последовательность ДНК обычного scFv изображена в фиг. 1, 2. - 108 - 015992 Идеальные трансформированные колонии выбраны в глубокие 96-луночные блюда (Corning, Corning, NY, Cat. № 3960), включающие 400 мкл/лунку LB плюс 50 мкг/мл карбенициллина и выращенные в течение ночи при 37°С. Главные планшеты были созданы добавлением равного объема LB, включающего 20%-ный глицерин, к каждому источнику глубоких 96-луночных планшет и передачей 50 мкл аликвот бактерийной взвеси к стерильным пластинам микротитратора (Corning, Corning, NY, Cat. № 3359) и заморозке для хранения при -80°С. Таблица 9 Олигонуклеотиды для конструирования стабильности BHA10 scFv Положения для мутагенеза выделены подчеркиванием. Избыточные основания сокращены следующим образом: W=А или Т, V=А или С или G, Y=С или Т, S=С или G, М=А или С, N=А или С или G или Т, R=А или G, K=G или Т, В=С или G или Т (J Biol Chem. 261(1):13-7 (1986)). В. Анализ температурной стабильности. Активности обычного и сконструированного ВНА10 scFv затем сравнили в анализе термической проверки, который может использоваться, чтобы определить температуру, когда 50% молекул scFvs сохраняют антигенсвязывающую активность. Числовая величина, соответствующая этой температуре, называется значение Т50 и измеряется в °С. В этом анализе scFvs были подвергнуты диапазону температур, которые охватывают тепловую температуру перехода обычного ВНА10 scFv. Е.coli линии W3110 (АТСС, Manassas, Va. Cat. № 27325) трансформировали с помощью плазмид, кодирующих сконструированный и обычный ВНА10 scFvs под контролем индуцибельного промотера ага С promoter. Трансформированные клетки выращивали в течение ночи в среде для экспрессии SB (Teknova, Half Moon Bay, Ca. Cat. № S0140), включающей 1% глицин, 1% Тритон Х100, 0,02% арабинозу и 50 мкг/мл карбенициллина или при 37°С, или при 32°С. Бактерии осаждали центрифугированием, полученный супернатант оставляли для дальнейшей обработки. Включение глицина и Тритона Х-100 в среду позволяет высвободить содержимое периплазмы (нативный белок Е.coli и scFv) в среду (Yang et al. Applied и Enviromental Microbiology (1998), 64:2869-2874). Присутствие в супернатанте белков Е.coli является существенным для выполнения этого измерения, т.к. термоинактивированные белки действуют как "раковина", захватывая случайно развернутые молекулы scFvs в необратимо инактивированные агрегаты. Каждую библиотеку скринировали на термическую стабильность дважды. Первый супернатант подвергали воздействию в условиях эксперимента, а второй супернатант оставляли и использовали для сравнения. Измерение термоинактивации для получения данных о термостабильности может быть выполнено при одной температуре или в выбранном диапазоне температур. Для обработки образцов (супернатантов) использовался термоциклер, способный создавать стабильные температурные градиенты - 109 - 015992 (iCycler, Bio-Rad, Gaithersburg, Md). Температурное воздействие варьировалось в зависимости от свойств взятого ВНА10 scFv и обычно было на 2-3° выше, чем экспериментально определенная величина Т50. Замороженные платы Master размораживали и высевали в лунки на титрационном микропланшете, включающие 250 мкл на лунку среды для экспрессии, и культивировали в течение ночи при 32°С. В качестве контроля использовались культуры, включающие родительскую плазмиду. Их выращивали в тех же условиях и использовали одновременно с библиотекой. Бактерии осаждали в глубоко-луночные планшеты хорошо центрифугированием 2000 об/мин (модель IEC 8R, Thermo Electron, Waltham, Ma) в течение 30 мин и 100 мкл супернатанта переносили на стандартные пластины для микротитрования (Corning, Corning, NY, Cat. № 3357). Аликвоту супернатанта оставляли for the reference DELFIA. Для большинства библиотек платы, включающие остатки супернатанта, запечатывали (Nalge Nunc, Rochester, NY, Cat. № 235205) и помещали в инкубатор с соответствующей термической проверкой (Echo Therm, Torrey Pines Scientific, San Marcos, Ca) на 90 мин. Для скрининга, требующего измерений при нескольких challenge температурах (или при температуре выше 75°С), супернатанты помещали в 96-луночную плату для ПЦР (Applied Biosystems, Foster City, Ca, Cat. № N801-560) и инкубировали в течение 90 мин при требуемой температуре. После температурной стимуляции агрегировавший материал удаляли центрифугированием и растворимые ВНА10 scFv, оставшиеся после обработки в прозрачном супернатанте, отделяли и измеряли связывание с родственным (cognate) антигеном LTβR Ig способом DELFIA. 96-луночные платы (MaxiSorp, Nalge Nunc, Rochester, NY, Cat. № 437111) покрывали гибридным белком, состоящим из эктодомена рецептора LTβ (LTβR), связанного с Fc областью человека (концентрация раствора 1 мкг/мл в 0,1 M натрий-карбонатном буфере, рН 9,5). Платы инкубировали в течение ночи при 4°С и блокировали с помощью буфера для измерения DELFIA (DAB, 10 мМ Tris HCl, 150 мМ NaCl, 20 мкМ EDTA, 0,5% BSA, 0,02% Tween 20, 0,01% NaN3, pH 7,4), инкубируя с ним в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре. Платы отмывали 3 раза DAB, не включающим BSA (отмывочный буфер), затем добавляли к платам исследуемые образцы, ратворенные в DAB в конечном объеме 100 мкл. Платы инкубировали в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре и трижды отмывали отмывочным буфером для удаления несвязавшихся или функционально неактивных молекул scFvs. Связанный ВНА10 scFv определяли добавлением в каждую ячейку 100 мкл DAB включающего 40 нг/мл меченых Eu анти-His6 антител (Perkin Elmer, Boston, MA, Cat. № AD0109) и инкубировали на шейкере при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем платы трижды отмывали отмывочным буфером и добавляли в каждую ячейку 100 мкл усиливающего раствора DELFIA (Perkin Elmer, Boston, MA, Cat. № 4001-0010). После инкубации в течение 15 мин платы детектировали, определяя Европий на приборе Victor 2 (Perkin Elmer, Boston, MA). Данные измерений обрабатывали с помощью программного обеспечения Spotfire DecisionSite (Spotfire, Somerville, Ma.) и выражали в виде отношения количества импульсов при термической проверке к количеству импульсов при reference temperature для каждого клона. Клоны, воспроизводимо дающие значение этого отношения в два или более раз выше, чем для родительской плазмиды, считались хитами. Плазмидная ДНК для этих клонов была выделена с помощью набора mini-prep (Wizard Plus, Promega, Madison, WI) и ретрансфомирована в Е.coli W3110 для вторичного анализа термической проверки. Данные, полученные при градиенте температуры, анализировались с помощью программного обеспечения Prism 4 (GraphPad Software, San Diego, Ca), с использованием в качестве модели сигмоидальной дозовой зависимости с варьируемой крутизной (варьируемым наклоном). За величину Т50 принимались значения, полученные в средней точке кривой термической денатурации, при этом принималось, что они не эквивалентны биофизически определенной величине ТМ. Первичные и подтверждающие результаты, полученные при анализе термической проверки, показаны в табл. 10. Некоторые стабилизированные молекулы scFvs изобретения демонстрируют улучшенную связывающую активность (Т50 >49°С) по сравнению с обычными scFv. В частности, величины Т50 для ВНА10 позиции библиотеки VL46 scFv(S46L), позиции библиотеки VH16 scFv (S16E и S16Q) и позиции библиотеки VL49: VL50 scFv демонстрировали увеличение термической стабильности в диапазоне от 3 до 12°С по сравнению с обычным ВНА10 scFv. Кроме этого, величины Т50 для ВНА10 позиция библиотеки VL3 scFv (Q3A, Q3G, Q3S, Q3V, и Q3D), позиция библиотеки VH67 scFv (V67I и V67L), позиция библиотеки VH48 scFv (M48I и M48G), позиция библиотеки VH20 scFv (V20I) и позиция библиотеки VH101 scFv (P101D) демонстрировали увеличение термической стабильности в диапазоне от 4 до 18°С по сравнению с обычным ВНА10 scFv. Одна из стабилизирующих мутаций (VL K13E) возникла благодара ошибке ПЦР. Оказалось, что включение этой стабилизирующей мутации в pIEH009 дает дополнительное увеличение термической стабильности и даже превышает те, что получены для ВНА10 Fab в этих условиях (фиг. 19). Важно, что нековалентная мутация VL46 и VH55, полученная в ходе одного или более из четырех способов дизайна (моделирование гомологии области контакта VL/VH, расчет консенсуса, вычислительное моделирование, анализ ковариации), заканчивалась улучшением термической стабильности scFv, почти приближающейся к имеющей место для дисульфидных мутаций и валидирующая пригодность и новизну этих средств проектирования. - 110 - 015992 Фиг. 2 показывает аминокислотные последовательности обычного ВНА10 scFv (SEQ ID NO: 4), и фиг. 125(А и В) показывают аминокислотные последовательности стабилизированной ВНА10 scFV, включающей S46L (VL), стабилизирующую мутацию (SEQ ID NO: 137), и V55G(VH), стабилизированную мутацию (SEQ ID NO: 138) соответственно. Последовательность ДНК дикого типа ВНА10 scFv (SEQ ID NO: 3) изображена на фиг. 1. Стабилизирующая мутация заключена в рамку. Ведущая последовательность, gly/ser связывающий пептид и CH1 домен выделены подчеркиванием, полужирным шрифтом и курсивом соответственно. Таблица 10 ВНА10 VH и VL библиотечные положения, библиотечный состав и результаты скрининга na=не применимо. Табл. 11 показывает результаты всестороннего анализа термоустойчивости различных индивидуальных и комбинированных стабилизирующих мутаций, введенных в обычный scFv. Эти результаты демонстрируют, что улучшение активности аддитивно, и что способы, описанные в этом изобретении, приводят к улучшению свойств теплоустойчивости scFv даже превосходя нативные Fab. Даже в отсутствие ковалентного дисульфидного мостика в положениях VH44-VL100 стабилизирующие мутации показали увеличение теплоустойчивости в пределах от 19 до 33°С относительно обычного ВНА10 scFv. - 111 - 015992 Таблица 11 Характеристики конструктов ВНА10, используемые для изготовления модифицированных белков и значений Т50 по результатам анализа термической проверки na=не применимо. аа=аминокислотных остатков. Резюме. Три стабилизирующих мутации (VL_S46L, VH_V55G и VH_P101D) экспериментально валидировались анализом термической проверки (Т50). Было спрогнозировано, что обе мутации VL_S46L и VH_V55G стабилизируют индивидуальные VH и VL домены; это сделано на основании данных ковариации, описанных в примере 3 выше. Как показано на фиг. 65(А и В), обе эти мутации привели к значительным увеличениям Т50 ВНА10 scFv. В частности, мутация VL_S46L стабилизирует scFv на ~7-8°С, в то время как VH_V55G мутация стабилизирует scFv на ~12°С. Обе эти мутации также значительно сокращают промежуток ТМ между VH и VL, как определено ДСК (см. фиг. 66-67). Данные ДСК показывают, что обе мутации приводят к значительным увеличениям обоих ТМ (середина температурных переходов развертывания) как для VH и VL доменов, так и в калориметрической энтальпии (т.е. область под кривой) для scFv. Увеличение этих значений обеспечивает экспериментальную валидацию, что эти спрогнозированные стабилизирующие мутации фактически стабилизируют scFv. Кроме того, так как эти две мутации стабилизируют оба VH и VL домена одновременно, они, вероятно, важны в построении кооперативности между VH и VL доменами. Соответственно ожидается, что укрепление области контакта между VH и VL может не только способствовать увеличению стабильности, но и уменьшить тенденцию формирования агрегатов. Было также спрогнозировано, что VL_S46L, стабилизирующая мутация и третья стабилизирующая мутация (VH_P101D) являются стабилизирующими; это сделано на основании моделирования гомологии области контакта VH/VL, описанного в примере 4 выше. VH_P101D стабилизирующая мутация стабилизировала scFv ~15°С по данным анализа термической проверки (фиг. 65(С)). Кроме того, ДСК (см. фиг. 68) показывает, что эта стабилизирующая мутация приводит к значительным увеличениям ТМ VH и VL - 112 - 015992 доменов и в калориметрическом теплосодержании, указывая, что эта мутация - также, вероятно, кооперативно стабилизируют scFv в целом через VH/VL область контакта. Пример 6. Биофизическая характеристика ВНА10 scFvs, включающего стабилизирующие мутации. Последовательности для V-участка гена различных плазмид показаны в табл. 11. Они были субклонированы в модифицированный вектор экспрессии Е.coli, чтобы обеспесить экспрессию рекомбинантного белка под контролем индуцибельного ara С промотора. Разновидности ВНА10 scFvs были экспрессированы и очищены описанными выше способами. Очевидный сайт рестрикции на N-конце VL домена приводил к снижению уровня VL в большинстве препаратов scFv, как это видно из результатов SDSэлектрофореза (фиг. 69). Гидродинамические свойства каждого из scFv исследовались способом эксклюзионной хроматографии HPLC (Agilent Technologies) со статистическим светорассеянием и рефрактометрическими детекторами (MiniDAWN/ReX, Wyatt Technology). Оказалось, что scFv в основном были мономерными, однако несколько scFvs, включая scFv дикого типа (нестабилизированный), содержали небольшое количество димерного материала (табл. 12). Ни один из очищенных scFvs не содержал заметного (определяемого) уровня олигомеров, больших, чем димер. Таблица 12 Результаты SEC/светорассеяния scFvs а Белки без стандартной ошибки были экспрессированы 1 раз. n.d., не определяется. с Эти величины определялись после того, как был выполнен препаративный SEC для уменьшения количества агрегатов. Конечной целью экспериментов было определить, приведут ли созданные мутации к увеличению стабильности и снижению способности к агрегации. Термостабильность каждого из scFv оценивалась двумя различными способами. Во первых, развертывание scFvs под действием температуры анализировалось способом DSC (фиг. 70). Во-вторых, термостабильность каждого scFv определялась при нагревании с флуоресцентрым гидрофобным красителем 1-анилино-8-сульфонатом (ANS, фиг. 71). ANS, как правило, связывается с частично развернутыми белками или белками в компактном неразвернутом состоянии, но денатурировавшими при нагревании. При связывании с гидрофобной поверхностью флюоресценция красителя ANS возрастает, предположительно из-за того, что снижается гашение флюоресценции растворителем. Кривые температурной зависимости для флюоресценции были представлены в виде графиков двухэтапного развертывания белка, как описано ниже. В качестве буфера использовался PBS и концентрация scFv в каждом эксперименте составляла 750 нМ. Измерение флюоресценции выполняли на спектрополяриметре с измерением циркулярного дихроизма JASCO модели 812, оснащенного термоэлектрическим элементом Пелтье и наружной водяной баней. Флюоресфенцию определяли, используя фотоумножитель, расположенный перпендикулярно световому потоку, и монохроматор, установленный на длину волны 480 нм. Чувствительность была установлена на величине 600 V. Нагревание выполнялось с постоянной скоростью 120°С/мин. Длина волны возбуждения составляла 370 нм. Развертывание третичной структуры scFv в данном исследовании приводило к увеличению флюоресценции ANS. Средняя точка термического развертывания (т.е. ТМ) для каждого белкового домена b - 113 - 015992 scFv определялась способом DSC путем подгонки каждого пика развертавания белка к уравнению Гиббса-Геймгольца. Для этого использовалось программное обеспечение Origin 7,0 (Microcal, Inc). Значения ТМ определялись по флюоресценции ANS путем включения уравнения Гиббса-Геймгольца в нелинейную кривую в KaleighdaGraphTM: где ΔGUo(T) - зависимое от температуры изменение свободной энергии Гиббса при развертывании белка; ΔHUo(Т) - изменение энтальпии, связанное с развертыванием; ΔSUo(T) - энтропия, связанная с развертыванием. Уравнение может быть переписано следующим образом: где ТМ - средняя точка кривой развертывания белка и ΔCp° - разность теплоемкостей между свернутым и развернутым состоянием белка. Это уравнение может быть использовано для вывода температурной зависимости интенсивности флюоресценции ANS, если использовать приближение, что интенсивность флюоресценции - это сумма внутренней флюоресценции ANS в присутствии свернутого и развернутого scFv где iT(T) - зависимая от температуры величина флюоресценции; iF и iU - интенсивности флюоресценции в свернутом и развернутом состоянии соответственно; fF и fU - доли свернутого и развернутого scFv соответственно при данной температуре. Доля свернутого белка связана с равновесной константой развертывания и свободной энергией развертывания: Включая KU(Т) и ΔGU°(T) в уравнение (3) и предполагая, что интенсивность флюоресценции ANS в присутствии свернутого и развернутого scFv линейно зависит от температуры (т.е. iF=i1+i2T и iU=i3+i4T), получим следующее уравнение: Чтобы получить конечное уравнение, пригодное для подстановки данных, подставляем уравнение (2) для AGUo(T) в уравнение (5), предполагая, что ΔCp° не зависит от температуры и пропорциональна разнице доступной для растворителя площади поверхности в свертутом и развернутом состояниях (Haynie & Friere, Proteins: Struct. Funct. Genet. 16: 115-140 (1993); Myers et al., Protein Sci. 4: 2138-2148 (1995)). Измерения термостабильности, полученные разными способами (способом DSC и способом измерения флюоресценции ANS), для всех scFv дают сравнимые результаты. Развертывание каждого scFv необратимо, следовательно, агрегация влияет на абсолютное значение ТМ, полученное способом DSC или связывания ANS. Так как нагревание образца в обоих экспериментах происходит по-разному и с разными скоростями, значения ТМ, полученные в разных экспериментах, не могут быть полностью идентичны (Sanchez-Ruiz et al., Biochemistry, 27:1648-1652 (1988)). Однако тенденция, наблюдаемая для каждой экспериментальной техники, была идентична (см. табл. 13). ДСКэксперименты легко разделили переходы развертывания VH и VL. Эксперименты по ANS-связыванию не могли точно дискриминировать 2 перехода (т.е. VH против VL - развертывания); таким образом, только кажуцийся ТМ был предоставлен для экспериментов по ANS-связыванию. Очевидный ТМ, наблюдаемый в ANS-связывании, казалось, коррелировал хорошо с ТМ развертывания последнего домена либо VH, либо VL, в зависимости от мутации, как определено ДСК. Из-за агрегации развернутого материала в обоих форматах анализа Тм использовалась как руководство по оценке порядка повышения стабильности, предоставленной каждой мутацией без дополнительной интерпретации scFv свободных энергий разворачивания и т.д. - 114 - 015992 Таблица 13 Измерения термостабильности каждого scFv a Эти конкретные мутации вели к однократному, кооперативному событию развертывания VH/VL, Все последующие scFv были сконструированы с (G4S)*4 20 аминокислотным линкером. c Анализ осложнен множественными переходами. d Невозможно дискриминировать VH по сравнению с VL. Резюме. Все разработанные отдельные мутации выбрали из библиотечных экранов: VH S16E, S16Q, V55G, P101D и VLS46L значительно стабилизировали VH домен и в некоторых случаях также VL домен (фиг. 69). Объяснение, почему на предмет повышения стабильности исследовали эти положения, часто возникали на основании различных форм анализа. Консенсусные способы спрогнозировали, что все мутации VH S16E, S16Q, V55G, P101D и VL S46L стабилизируют ВНА10 scFv (пример 3). Однако VH V55G и P101D (случайно оказались две наиболее стабилизирующих мутации) помещены в CDR2 и CDR3 VH, и соответственно, ранее их не рассматривали для мутагенеза, пока не были получены другие прогностические критерии, позволившие предположить, что мутация в этих двух положениях могла привести к стабилизирующим событиям. Ковариационный анализ также спрогнозировал стабилизирующий характер VH V55G и VL S46L. Наконец, стабилизация VH P101D и VL S46L была спрогнозирована на основании состава области контакта очень устойчивого человеческого антитела (пример 3). Отдельные мутации в VH/VL области контакта увеличили стабильность обоих доменов, в то время b - 115 - 015992 как мутации VH вне области контакта стабилизировали только непосредственно VH домен. VH S16E, S16Q и V55G были вне области контакта и увеличили очевидный ТМ VH BHA10 на 3, 2 и 11°С соответственно. Стабильность VL была относительно не затронута этими мутациями. VH мутация V55G, казалось, увеличила стабильность VH, в соответствии с VL доменом, не приводя к заметному увеличению стабильности VL. Обе мутации в области контакта VH P101D и VL S46L значительно увеличили стабильность обоих доменов. Мутация P101D в особенности привела к полностью совместному разворачиванию VH и VL доменов, предполагая, что область контакта и кооперативность сворачивания между VH и VL была значительно усилена. Таким образом, мутации в VH/VL области контакта могут обеспечить самые эффективные средства формирования стабилизированной Fv области, которая и объясняет то, что оно расположило по приоритетам проекты стабильности к VH/VL области контакта scFvs по дизайнам, направленным на остатки вне области контакта Fv. Объединение мутаций VH в конечном счете привело к разъединению между кооперативностью VH/VL разветывания (табл. 13). Поскольку ТМ VH поднялась выше 75°С (результат комбинаций мутаций VH), TM VL начал двигаться к более низким температурам. Это позволяет предположить, что гиперстабилизация VH домена без построения компенсационных мутаций в VL домене может привести к уменьшенной кооперативности свертывания и ослаблению взаимодействия между двумя доменами. В то время как TM VH и VL доменов (включая ТМ дикого типа ВНА10 scFv) были часто весьма различны, свидетельство, что мутации в области контакта между двумя доменами могли стабилизировать оба домена, одновременно позволяет предположить, что два домена взаимодействуют на некотором уровне друг с другом - хотя кажущееся сродство между изолированными доменами, как ожидают, не будет чрезвычайно высоко, кроме, возможно, VH P101D стабилизированного варианта (Brandts & Lin, Биохимия, 29:6927-6940 (1990)). Увеличение стабильности scFv привело к уменьшению связывания гидрофобного флуоресцентного красителя ANS при температуре среды (15°С, фиг. 72, 73). Дикий тип scFv слабо связывается с ANS, предполагая, что белок может постоянно или временно подвергать гидрофобную площадь поверхности воздействию растворителя. Стабилизированная scFv, казалось, полностью потеряла способность связывать ANS в условиях окружающей среды - флюоресценция ANS в присутствии большинства стабилизированных scFv была не больше чем у одного только ANS в растворителе. Графики VH_ТМ (измеренный ДСК или температурно-зависимым экспериментом по ANS связыванию) против ANS - флюоресценции в присутствии свернутого белка при 15°С демонстрирует, что scFv-зависимая флюоресценция ANS уменьшается при увеличении стабильности scFv (фиг. 72, 73). Снижение ANS-связывания под действием scFv стабилизации может указать, что менее гидрофобная площадь поверхности подвергается воздействию растворителя и что у стабилизированной scFvs может быть более низкая склонность к агрегации. Измерения KD различных индивидуальных и объединенных стабилизирующих ВНА10 scFv мутаций были выполнены с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на устройстве Biacore 3000. Табл. 13 показывает результаты анализа сродства на Biacore. Обязательное сродство варианта ВНА10 scFvs колебалось от 1Х-2,5Х родительского ВНА10 scFv. Пример 7. Продуцирование стабилизированных биоспецифических антител "Геркулес". Как обычная ВНА10 scFv, так и стабилизированная ВНА10 scFv изобретения использовались, чтобы построить группу биспецифических антител, называемых "Геркулес". Геркулес биспецифичные антитела включают слияние химерных 14А2 IgG антител, которые связываются с TRAIL R2 рецептором и с ВНА10 scFv, который связывается с LTβR. Геркулес антитела были построены оба как N- и С-концевые ВНА10 scFv химеры (см. фиг. 20). N-концевые scFv химеры могут быть спроектированы как легкая цепь и/или гибридизация тяжелой цепи ("NL-Геркулес" или "NH-Геркулес" соответственно). Решение, какую из аминотерминальных V областей (тяжелой или легкой) отобрать для того, чтобы присоединить к scFv, прежде всего, определяется тем, какая цепь может распознать первый антиген мишени, не влияя заметно на связывание Fab домена к второму антигену мишени. Можно также с использованием способов изобретения, описанных в этом изобретении, спроектировать четырехвалентное или биспецифичное антитело, состоящее исключительно из стабилизированных scFv, гибридизованных непосредственно с окраинными областями антител или с СН2 или СН3 доменами, как показано, например, в фиг. 57-64. Указанное антитело может включать области Fc полной длины (см., например, фиг. 61), или СН2-бездоменные области Fc (см., например, фиг. 57). В других примерах осуществления два или более стабилизированных scFv домена могут быть гибридизованы к тому же самому окончанию тяжелой или легкой цепи (см., например, фиг. 58). А. Конструирование "NH-Геркулес" с ВНА10 обычной (G4S)4, VH44:VL100 и VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFvs. Дизайны четырех анти-LTβR (ВНА10) × анти-TRAIL R2(chi14A2) биспецифических антител были основаны на добавлении обычного варианта и ВНА10 scFvs к окончанию аминоконца анти-TRAIL R2 тяжелой цепи антитела. ВНА10 scFvs ДНК, описанные в примере 3, использовались, чтобы построить группу NH-Геркулес биспецифических антител ПЦР амплификацией, используя инициаторы олигонуклеотида, описанные в табл. 14. (Gly4Ser)5 линкер использовался, чтобы соединить ВНА10 scFvs со зре- 116 - 015992 лым окончанием аминоконца chi14A2 тяжелой цепи. Первые 5' праймеры ПЦР VH (scFvBHA10-F1) включают Mlu I сайт эндонуклеазы рестрикции (подчеркнутая последовательность) для клонирования, сопровождаемого кодированием последовательности, последние три аминокислоты тяжелой цепи сигнализируют пептид и аминоконец VH ВНА10. Два обратных 3' инициатора ПЦР использовались, чтобы произвести продукты ПЦР с внутренним обратным инициатором, кодирующим XWU005-R карбоксиловый конец ВНА10 VL, сопровождаемый (Gly4Ser)5 линкером, и обратный праймер scFvBHA10-R1, кодирующий частичную анти-TRAIL R2 область VH и сайт Bgl II (подчеркнутая последовательность) для клонирования. Таблица 14 Олигонуклеотиды для ПЦР-амплификации N-Геркулес с обычными (Gly4Ser)4, VH44:VL100 и VH44:VL100/(Gly4Ser)4 ВНА10 scFvs BHA10 scFv+(Gly4Ser)5 линкер+частичные анти-TRAIL R2 генные последовательности VH были амплифицированы в двух последовательных реакциях ПЦР через общее кодирование последовательностей перекрывания, кодирующих (Gly4Ser)5 линкер, как представлено в фиг. 21, чтобы приготовить обычный ВНА10 scFv от ДНК плазмиды pXWU034, ВНА10 scFv (Gly4Ser)4 от плазмиды pXWU002, BHA10 scFv VH44:VL100 от плазмиды pIEH006 и BHA10 scFvVH44:VL100/(Gly4Ser)4 от плазмиды pIEH009. Продукты ПЦР из группы усиленного ВНА10 scFvs были очищены электрофорезом агарозного геля, используя Millipore Ультрасвободный-DA котенок извлечения согласно инструкциям изготовителя (Millipore; Бедфорд, Массачусетс). Очищенные продукты ПЦР были усвоены с Mlu I/Bgl эндонуклеазами рестрикции и лигированы в Mlu I/Bgl усвоенный pN5KG1 вектор, включающий chi14A2 IgG1, ранее измененный, чтобы удалить внутренний сайт Bgl II из chi14A2 IgG1 кодирующей последовательности. Вектор экспрессии млекопитающих pN5KG1 включает ухудшенный по трансляции, модифицированный (включающий интрон) ген неомицин фосфотрансферазы, чтобы выбрать для транскрипционно активных событий интеграции, и мышиный ген редуктазы дигидрофолата, чтобы разрешить амплификацию с метотрексатом (Barnett, et al., Антитело Expression и Engineering. (Imanaka, H.Y.W. а. Т., ed), p. 27-40, Oxford University Press, New York, NY (1995)). Полученная группа конструктов формирует химерные белки варианта ВНА10 scFvs к аминоконцу анти-TRAIL R2 антитела VH домена через 25 аминокислотный (Gly4Ser)5 линкер. Гибридизация обычной ВНА10 scFv генной последовательности с аминоконцом анти-TRAIL R2 антитело генной последовательности тяжелой цепи произвело плазмиду pXWU005. Гибридизация ВНА10 scFv(Gly4Ser)4 генных последовательности к аминоконцу анти-TRAIL R2 антитело генная последовательность тяжелой цепи произвело плазмиду pXWU026. Гибридизация ВНА10 scFv VH44:VL100 генной последовательности к аминоконцу анти-TRAIL R2 антитело генная последовательность тяжелой цепи произвело плазмиду pXWU027. Гибридизация ВНА10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 генных последовательностей к аминоконцу антиTRAIL R2 антитело генная последовательность тяжелой цепи произвело плазмиду pXWU028. Смеси лигирования использовались, чтобы преобразовать штамм Е.coli, TOP 10 компетентных ячеек (корпорация Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Е.coli колонии, преобразованные к лекарственной устойчивости к ампициллину, были скринированы на наличие вставок. Секвенирование ДНК подтвердило правильную последовательность заключительных конструкций. Химерная 14А2 используемая легкая цепь распространена среди всех N- и С-Геркулес биспецифических антител, и ДНК (SEQ ID NO: 28), и аминокислотные последовательности (SEQ ID NO: 29) показаны на фиг. 23 и 24. Химерная 14А2 легкая цепь экспрессируется с пептидом сигнала в N-конец следующей ДНК последовательности аминокислоты: (SEQ ID NO: 59); (SEQ ID NO: 60). ДНК тяжелой цепи (SEQ ID NO: 30) и аминокислотные последовательности (SEQ ID NO: 31) для обычного ВНА10 scFv NH-Геркулес показаны на фиг. 25 и 26 соответственно. ДНК тяжелой цепи (SEQ ID NO: 32) и аминокислотные последовательности (SEQ ID NO: 33) для ВНА10 scFv (Gly4Ser)4 NHГеркулес показаны на фиг. 27 и 28 соответственно. ДНК тяжелой цепи (SEQ ID NO: 34) и аминокислотные последовательности (SEQ ID NO: 35) для ВНА10 scFv VH44:VL100 N-Геркулес показаны на фиг. 29 и 30 соответственно. ДНК тяжелой цепи (SEQ ID NO: 36) и аминокислотные последовательности (SEQ ID - 117 - 015992 NO: 37) для ВНА10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 N-Геркулес показаны на фиг. 31 и 32 соответственно. Каждая из тяжелых цепей экспрессировалась с пептидом сигнала в N-конец, включающий следующие ДНК и аминокислотные последовательности: (SEQ ID NO: 61); scFv. (SEQ ID NO: 62). В. Конструкция C-scFv "Геркулес" с обычной ВНА10 (G4S)4, VH44:VL100 и VH44:VL100/(Gly4Ser)4 Четыре дизайна анти-LTβR (ВНА10) × анти-TRAIL R2 (chi14A2) биспецифических антител были основаны на добавлении обычного ВНА10 scFv и его варианта к карбоксиловому концу анти-TRAIL R2 антитело тяжелая цепь. ВНА10 scFvs ДНК, описанные в примере 3, использовались, чтобы построить группу С-Геркулес биспецифических антител амплификацией ПЦР, используя праймеры олигонуклеотида, описанные в табл. 15. Ser (Gly4Ser)3 линкер использовался, чтобы соединить ВНА10 scFvs с карбоксиловым концом chi14A2 тяжелой цепи. Прямой 5' праймер ПЦР VH (XWU006-F1) включают BamHI сайт эндонуклеазы рестрикции (подчеркнутая последовательность) для клонирования, сопровождаемой последовательности, кодирующей фрагмент Ser (Gly4Ser)3 линкерного пептида и аминоконец VH BHA10. Обратный 3' праймер ПЦР VL (XWU006-R1) начинает ВНА10 scFv легкую цепь и включает терминирующий кодон, сопровождаемый BamHI сайтом (подчеркнутая последовательность) для клонирования. Прямой 5' внутренний перекрываемый праймер ПЦР (XWU006-F2) включает кодирование последовательности (Gly4Ser)3 линкер и включает молчащую мутацию, указанную жирным шрифтом. Обратный 3' внутренний праймер ПЦР перекрывания (XWU006-R2) включает кодирование последовательности (Gly4Ser)3 линкера и включает молчащую мутацию, указанную жирном шрифтом, чтобы удалить сайт BamHI, расположенный в ВНА10 scFv (Gly4Ser)3 области линкера. Таблица 15 Олигонуклеотиды для ПЦР-амплификации С-Геркулес с обычными ВНА10 conventional (G4S)4, VH44:VL100 и VH44:VL100/(Gly4Ser)4 scFv Как показано на фиг. 22, ВНА10 scFv генные последовательности VH были амплифицированы в двух последовательных реакциях ПЦР с использованием 5' VHXWU006-F1+3' VLXWU006-R1 PCR набора праймеров и набора внутренних перекрывающихся ПЦР праймеров (XWU006-F2 и XWU006-R2), разработанных, чтобы устранить BamHI сайт в ВНА10 scFv (Gly4Ser)3 линкерной области. Эти состояния ПЦР использовались, чтобы приготовить обычный ВНА10 scFv из плазмиды pXWU034, ВНА10 scFv (Gly4Ser)4 из плазмиды pXWU002, BHA10 scFv VH44:VL100 из плазмиды pIEH006 и ВНА10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 из плазмиды pIEH009. Продукты ПЦР панели амплифицированного ВНА10 scFv были очищены электрофорезом на агарозном геле, используя Millipore Ultrafree-DA набор экстракции согласно инструкциям изготовителя (Millipore; Бедфорд, Массачусетс). Очищенные продукты ПЦР были усвоены с BamH I эндонуклеазами рестрикции, и лигированный в BamHI сайт pN5KG1 вектора, ранее спроектированный, чтобы содержать несколько модификаций. Кратко, вектор pN5KG1, включающий chi14A2 IgG1, был изменен, чтобы удалить терминирующий кодон в 3' концах гена тяжелой цепи, и ввести нуклеотиды для кодирования последовательности аминокислоты Ser-Gly-Gly-Gly сопровождаемый BamHI сайтом эндонуклеазы рестрикции (кодирующего Gly-Ser) для клонирования. Наконец, внутренний нежелательный BamHI сайт эндонуклеазы рестрикции в chi14A2 VL область был также устранен. Полученная группа конструктов формирует химерные белки варианта ВНА10 scFvs к карбоксиконцу анти-TRAIL R2 антитела тяжелой цепи через 16 аминокислотный Ser(Gly4Ser)3 линкер. Гибридизация обычной ВНА10 scFv генной последовательности с генной последовательностью карбоксиконца антиTRAIL R2 антитела тяжелой цепи привела к плазмиде pXWU006. Гибридизация ВНА10 scFv (Gly4Ser)4 генной последовательности с генной последовательностью карбоксиконца анти-TRAIL R2 антитела тяжелой цепи привела к плазмиде pXWU034. Гибридизация ВНА10 scFv VH44:VL100 генной последовательности с генной последовательностью карбоксиконца анти-TRAIL R2 антитела тяжелой цепи привела к плазмиде pXWU035. Гибридизация ВНА10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 генной последовательности с генной последовательностью карбоксиконца анти-TRAIL R2 антитела тяжелой цепи привела к плазмиде pXWU036. Смеси лигирования использовались, чтобы преобразовать штамм Е.coli, TOP 10 компетентных яче- 118 - 015992 ек (Корпорация Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). E.coli колонии, преобразованные к лекарственной устойчивости к ампициллину, были скринированы на наличие вставок. Секвенирование ДНК подтвердило правильную последовательность заключительных конструкций. Химерная 14А2 используемая легкая цепь распространена среди всех N- и С-Геркулес биспецифических антител, и ДНК (SEQ ID NO: 28), и аминокислотные последовательности (SEQ ID NO: 29) показаны на фиг. 23 и 24. ДНК тяжелой цепи и аминокислотные последовательности ВНА10 scFv С-Геркулес показаны на фиг. 33 и 34 соответственно. ДНК тяжелой цепи и аминокислотные последовательности ВНА10 scFv (Gly4Ser)4 С-Геркулес показаны на фиг. 35 и 36 соответственно. ДНК тяжелой цепи и аминокислотные последовательности ВНА10 scFv VH44:VL100 С-Геркулес показаны на фиг. 37 и 38 соответственно. ДНК тяжелой цепи и аминокислотные последовательности ВНА10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 C-Геркулес показаны на фиг. 39 и 40 соответственно. Резюме по С-терминальным, биспецифическим конструктам Геркулес включается в табл. 16. Таблица 16 Интермедиаты и плазмиды экспрессии, кодирующие "Геркулес" С. Временная экспрессия биспецифических антител в клетках СНО. ДНК плазмиды pXWU005, pXWU026, pXWU027, pXWU028 и pXWU006, pXWU034, pXWU035 и pXWU036 (табл. 16) использовались, чтобы преобразовать клетки CHO DG44 для переходной продукции белка антитела. Каждые 20 мкг ДНК плазмиды был объединены с 4×106 клеток в объеме 0,4 мл 1XPBS. Смесь была добавлена к кювете на 0,4 см (BioRad) и помещена в лед на 15 мин. Затем клетки электропорировали в 600 uF и 350 Вт с электропоратором Gene Pulser (BioRad). Клетки были помещены в CHOSSFM среду, включающую 100 мкМ гипоксантина и 16 мкМ тимидина, в колбу Т-25 и культивировали при 37° в течение 4 дней. Супернатанты, включающие белки Геркулес, произведенные этой временной системой экспрессии СНО, были собраны и оценены Вестерн-блоттингом. Фиг. 41 показывает, что Геркулес антитела, включающие VH44:VL100 (ds=дисульфид) или VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер-стабилизированную ВНА10 scFvs, резко улучшали выходы экспрессии, независимо от того, был ли scFv гибридизован K NH- или Сконец (плоскости 3, 4, 7, 8). Удивительно, никакой секретированный белок не был обнаружен с диким типом ВНА10 scFv, как и (Gly4Ser)4 линкер ВНА10 scFv химеры N-конца, обозначающего преимущество scFv стабилизации при экспрессии (плоскости 6 и 7). Кроме того, обычный ВНА10 scFv и (Gly4Ser)4 линкер ВНА10 scFv химеры С-конца показал значительное количество ~55-60 побочных продуктов молекулярной массы, которых было существенно меньше в стабилизированных конструкциях, что позволяет предположить, что scFv стабилизация может улучшить качество продукта. D. Анализ ELISA биспецифического связывания. Супернатанты были проверены на индивидуальную активность связывания с рекомбинантными TRAIL R2 и LT°R рецепторами в анализах ELISA. В обоих анализах рецептор был иммобилизирован на пластины и исследуемые образцы инкубировали, чтобы они могли связаться с рецептором. Связанные образцы были обнаружены маркированным антителом. 96-луночные планшеты для микротитрования Immulon II (Fisher, Cat № 14245-61) были покрыты 100 мкл/лунку 2 мкг/мл LTβR-Ig в Na2CO3/NaHCO3 буфере с рН 9,5, при 4°С одну ночь и заблокирован- 119 - 015992 ны 200-мкл буфером разбавления (0,5% обезжиренное сухое молоко в PBS плюс на 0,01% тимерозала) 1 час при 37°С. На следующем этапе 100 мкл индивидуального супернатанта "Геркулес" или очищенного белка в буфере разбавления были добавлены в лунки в двух повторах и инкубировались 1 ч при 37°С. После промывки водой из-под крана 100 мкл 100 нг/мл TRAIL-R2 Fc 6X-His теговый химерный белок (R&D Systems, Minneapolis, MN) был добавлен к колодцам и инкубировался 1 ч при 37°С. После отмывки 100 мкл разбавленного 1/2000 конъюгата Penta-His HRP Conjugate (QIAGEN, Cat№ 34460) было добавлено к каждой лунке и инкубировалось в течение 1 ч при 37°С. После отмывки 100 мкл/лунку Субстрата HRPO совместно с Субстратом Пероксидазы ТМВ/Раствором Пероксидазы В (Kirdgaard и Perry Labs, Cat. 50-76-00) было добавлено в систему. Реакция была остановлена 100 мкл 2М H2SO4 через 5-10 мин., OD измерили при 450 нм и 540 нм с помощью планшетного ридера Molecular Devices, и кривые связывания были получены. Фиг. 42-45 показывают, что N-концевые (фиг. 42 и 44) и С-концевые (фиг. 43 и 45) антитела Геркулес, включающие VH44:VL100 (ds=дисульфид) или VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер-стабилизированную ВНА10 scFv, улучшают связывание с LTβR (фиг. 42, 43) и TRAIL R2 (фиг. 44-45) соответственно по сравнению с Геркулес, включающим обычный BHA10 scFv (по весу). Е. Стабильная экспрессия биоспецифических антител в клетках СНО, очистка и характеризация антител. ДНК плазмиды pXWU027, pXWU028 и pXWU006, pXWU035 и pXWU036 (табл. 16) использовались, чтобы преобразовать DHFR-дефицитные клетки СНО DG44 для устойчивой продукции белка антитела. Инфицированные вирусом клетки были выращены в альфа минус питательной среде MEM, включающей 2 мМ глутамина, с 10% диализованной эмбриональной бычьей сывороткой (Invitrogen Corporation) с флуоресцентно-мечеными антителами, с использованием способа реитеративной сортировки флуоресцентно меченых клеток (FACS) (Brezinsky, et al. J. Immunol Methods. 277(1-2):141-55 (2003)). FACS также использовался, чтобы произвести индивидуальные линии клетки. Линии и пулы клеток были приспособлены к бессывороточным состояниям и масштабированы для продукции антител. Супернатанты от трансфицированных клеточных пулов или линий СНО, экспрессирующие 1) Стерминальный Геркулес с VH44:VL100 стабилизированной ВНА10 scFv и 2) С-терминальный Геркулес с VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер стабилизированной ВНА10 scFv, так же как клональные линии клетки СНО, экспрессирующие 3) N-концевой Геркулес с VH44:VL100 стабилизированной ВНА10 scFv и 4) Nконцевой Геркулес с VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер стабилизированной ВНА10 scFv, были собраны и очищены на колонке Protein A Sepharose FF (6 мл), используя буфер PBS с 10-мМ EDTA. Белки Геркулес были элюированы, используя глицин 0,1 М., рН 3,0 и немедленно нейтрализованны к рН 7,5-8,5 с помощью основания Трис. Кроме того, С-Геркулес, включающий обычный BHA10 scFv, экспрессировался и, после очистки Белком А, его хроматографировали для сравнения. Элюаты Белка А от С-Геркулес, включающие обычный ВНА10 scFv, С-концевой Геркулес с VH44:VL100 ВНА10 scFv, С-концевой Геркулес с VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv, был исследован на наличие агрегатов аналитической гельхроматографией (фиг. 46). Профиль хроматограммы С-Геркулес, включающей обычный ВНА10 scFv, показал ~40%-ные агрегаты. Напротив, С-концевой Геркулес с VH44:VL100 BHA10 scFv уменьшил уровень агрегатов до 20%-ого, дальнейшая стабилизация была достигнута через С-концевой Геркулес с VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv, уровень агрегатов снизился до 10%. Уровень агрегации, вероятно, зависит от свойств scFv, а не от того, была ли молекула прикреплена к NH- или С-концу 14А2 IgG (данные не показаны). Элюаты Геркулес были далее очищены диализом в ацетат 0,1 М, рН5,0 и очищены MonoS (GE Healthcare) хроматографией катионного обмена, используя идентичный рабочий буфер как диализат. Белки Геркулес были элюированы, используя поэтапный градиент 0,1 М ацетата рН5,0, 0,5 М NaCl. MonoS элюаты были собраны и пропущены через препаративную колонку SEC (TosoHaas), чтобы удалить агрегаты. Фиг. 47 и 48 показывают гели SDS-PAGE очищенного Т-концевого Геркулес с VH44:VL100 стабилизированной ВНА10 scFv и NH-концевого Геркулес с VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер-стабилизированной ВНА10 scFv и С-концевого Геркулес с VH44:VL100 стабилизированная ВНА10 scFv и С-концевого Геркулес с VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер-стабилизированной ВНА10 scFv соответственно. Понижающиеся линии показывают ожидаемые размеры белков тяжелой и легкой цепи. Важно, что нет никакого значительного количества деградировавших или нежелательных побочных продуктов малой молекулярной массы, что часто наблюдался с Геркулес, включающим дикий тип scFv доменов. Фиг. 49 (панели А и С) показывает аналитические профили элюирования SEC NH-концевого Геркулес с VH44:VL100 стабилизированной ВНА10 scFv и NH-концевого Геркулес с VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер-стабилизированной ВНА10 scFv соответственно после первоначального этапа очистки белком А. Фиг. 49 (группы В и D) также показывает аналитические профили элюции элюирования SEC NHконцевого Геркулес с VH44:VL100 стабилизированной ВНА10 scFv и NH-концевого Геркулес с VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер-стабилизированная ВНА10 scFv соответственно после удаления на препаративной SEC остаточных немономерных белковых примесей. Аналогично, фиг. 50 (панели А и С) показывает аналитические профили элюирования SEC С-концевого Геркулес с VH44:VL100 стабилизированной ВНА10 scFv и С-концевого Геркулес с VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер-стабилизированной ВНА10 scFv соответственно после первоначального этапа очистки белком А. Фиг. 50 (группы В и D) также пока- 120 - 015992 зывает аналитические профили элюции элюирования SEC С-концевого Геркулес с VH44:VL100 стабилизированной ВНА10 scFv и С-концевого Геркулес с VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер-стабилизированная ВНА10 scFv соответственно после удаления на препаративной SEC остаточных немономерных белковых примесей. Эти исследования демонстрируют, что стабилизация ВНА10 scFv дополнением либо VH44:VL100 дисульфида, либо VH44:VL100 (Gly4Ser)4 линкера приводит к препаративным количествами> 98%-ный чистого, мономерного биспецифичного антитела Геркулес, который фактически свободен от разновидностей молекулярной массы более высокого порядка. ДСК исследования, выполненные при идентичных состояниях, демонстрируют, что С-Геркулес VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv является более термостойким, чем С-Геркулес, включающий обычный ВНА10 scFv (фиг. 51). Профиль денатурации для С-Геркулес, включающего обычный ВНА10 scFv, начинается с ~5°С более низкой температуры, чем профиль, наблюдаемый для С-Геркулес VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv. Эти результаты предполагают, что scFv может ограничить общую термостойкость молекул Геркулес. Это коррелирует с наблюдаемым увеличением 5°С ТМ для VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv по сравнению с обычными ВНА10 scFv. Очищенные версии стабилизированных конструктов Геркулес были проверены на биспецифическую активность связывания к рекомбинантно полученным TRAIL-R2 и LTβR рецепторам в анализе ELISA. В этом анализе LTβR Ig рецептор был иммобилизирован на пластины, на которых были затем инкубированы исследуемые образцы, чтобы обеспечить связывание с рецептором. Несвязанные образцы были удалены отмывкой с последующим вторым этапом инкубации с TRAIL R2-(His) 6. После этапа отмывки дву-связанные комплексы были детектированы с маркированным анти-(His) 6 антителом. Результаты этого исследования и эффективная концентрация (ЕС50, в мкг/мл) для каждого конструкта изображены на фиг. 52. Фиг. 52 показывает, что оба N-терминал и С-терминал Геркулес антитела с VH44:VL100 (ds=дисульфид) или VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер-стабилизированной ВНА10 scFv демонстрируют четкое биспецифичное связывание с обоими LTβR и TRAIL R2. Многовалентная (пентамерная) версия LTβR-связанных антител (СВЕ11) использовалась как контроль, чтобы продемонстрировать, что одиночное распознавание только LTβR не вызывает сигнал в анализе связывания. Пример 8. Масштабированное производство стабилизированного биспецифичного "Геркулес" антитела в клетках СНО. DHFR-дефицитные линии клеток СНО, устойчиво трансфицированные ДНК плазмиды pXWU028 и pXWU036 (табл. 16) скринировались, чтобы выбрать отдельные клеточные изоляты, которые способны к экспрессии высоких уровней солюбилизированных и свернутых должным образом молекул Геркулес, которые были стабилизированы, используя способы изобретения. В способах клеточного скрининга использовались активизированные флюоресценцией клетки, сортирующие (FACS) анализ Brezinky и др. (Brezinky et al., J. Immunol Meth (2003), 277:141-155). Кратко, флуоресцентные теговые анти-Геркулес антитела использовались, чтобы маркировать клетки СНО, показывающие переходную экспрессию Геркулес антител на их поверхности. Клетки, показывающие интенсивную сигнатуру флюоресценции, затем отбирались, так как сортировочный аппарат был настроен на эти подписи. Отдельные клетки, показывающие высокие уровни производительности, были таким образом отобраны и адаптированы к бессывороточным состояниям, чтобы установить устойчивые линии клетки производителя. Линии клетки производителя были впоследствии масштабированы для продукции и очистки биспецифических антителбелковых комплексов. 80 л N-концевого Геркулес, включающего VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv (XWU028) супернатант после 11-дневной обработки в биореакторе, были собраны и предочищены ультрафильтрацией. Биспецифичное антитело было захвачено хроматографией с белком А и элюировано в объеме 1218 мл. Белковая фракция была далее очищена в двух отдельных партиях способом анион-обменной хроматографии, сопровождаемой предварительной гель-хроматографией. Первая партия выдавала 825,5 мг при концентрации 4,85 мг/мл в PBS с чистотой 98,9% и нагрузкой эндотоксина 0,13 ЕС/мг. Вторая партия выдавала 318 мг при концентрации 10,3 мг/мл с чистотой 99,1% и нагрузкой эндотоксина 2,37 ЕС/мг. В общей сложности, удалось получить 1143,5 мг высокоочищенного, мономерного N-концевого Геркулес, включающего VH44:VL100/(Gly4Ser)4 ВНА10 scFv. 24 л С-концевого Геркулес, включающего VH44:VL100/(Gly4Ser)4 BHA10 scFv (XWU036) супернатант после 11-дневной обработки в биореакторе, были собраны и предочищены ультрафильтрацией. Биспецифичное антитело было очищено в два приема, как описано выше при работе с белком А. Хроматография захваченного неочищенного продукта сопровождалась анион-обменной хроматографией и предварительной гель-хроматографией. Первая партия выдавала 985,5 мг при концентрации 13 мг/мл с чистотой 98,5% и нагрузкой эндотоксина 0,01 EU/мг. Вторая партия выдавала 570 мг при концентрации 11,42 мг/мл с чистотой 99% и нагрузкой эндотоксина 1,91 EU/мг. В общей сложности, удалось получить 1555,5 мг высокоочищенного, мономерного С-концевого Геркулес, включающего VH44:VL100/(Gly4Ser)4 ВНА10 scFv. Линия клетки СНО, производящая XWU054 биспецифичное антитело, была изолирована и, как оказалась, она производила 21,5 мг/л. Это укладывается в ожидаемый диапазон для исследования неампли- 121 - 015992 фицированных линий клетки СНО, и авторы изобретения ожидали бы намного более высокую производительность в случае получения линии клеток. Эти исследования масштабирования изготовления проводились с неамплифицируемыми линиями клетки СНО, и все же заканчивались выработкой более чем 1 г биофизически устойчивых биспецифических антител высокого качества. По-видимому, стратегия амплификации линии клетки очень увеличила бы клеточную производительность трансфицированных линий клетки СНО, позволяя совершенствовать процессы, подходящие для коммерческого применения. Эти исследования иллюстрируют эффективность способов, описанных в этом изобретении для того, чтобы производить масштабируемую продукцию устойчивых биспецифических антител в линии клеток (например, СНО), подходящую для изготовления. Пример 9. Биологическая активность биоспецифических антител "Геркулес". Линии опухолевой клетки WiDr (ATCC CCL-218) человеческая линия клетки рака толстой кишки, Ме180 (АТСС НТВ 33) человеческая цервикальная эпителиальная линия клетки рака и MDA231 (д-р Dajun Yang, Университет Мичигана) человеческая линия клетки рака молочной железы культивировались в MEM-EARLES с 10%-ым FCS, 2-миллиметровым L-Глутамин, 1Х несущественные аминокислоты, 0,5миллиметровый пируватнатрия, Пенициллин/стрептомицином. Линии опухолевой клетки были промыты один раз с PBS, после чего на них подействовали трипсином. Клетки были собраны центрифугированием, ресуспендированы в полных средах, посчитаны и высеяны в 96-луночные культуральные планшеты в концентрации 5000 клеток/лунку для WiDr и Me 180 и клетка/лунку 1500 для MDA231. Человеческий IFN γ (Biogen Idec, Corp) добавлен к суспензиям клетки, заключительная концентрация цитокина 80 ед./мл для WiDr и MDA231 и 50 ед./мл для Ме180. 50 мкл суспензии опухолевые клетки/IFNγ были смешаны с 50 мкл 2Х, сконцентрированы 3-кратными серийными разведениями исследуемых антител, приготовленных в полных средах. Конечные концентрации исследуемых антител типично колебались от 5000 рМ до 0,07 рМ. Клетки выращивали в течение 4 дней (WiDr & Ме180) или 3 дня (MDA231) при 37°С в 5%-ной СО2-увлажненной камере. Клетки убивали добавлением 20 мкл/лунку Promega CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay реагент Promega Corporation, Madison, WI). Пластины были прочитаны в спектрофотометре для чтения планшетов в 490 нм (Spectromax Plus, Molecular Devices, Sunnyvale CA). Данные были представлены в виде графика, используя Microsoft Excel (Microsoft Inc, WA). Результаты этих исследований показаны на фиг. 53-56. Фиг. 53 показывает, что у 14А2 IgG антител была скромная активность по ингибированию роста опухолевых клеток WiDr и в комбинации с IgG ВНА10 было небольшое увеличение активности анти-опухолевой-клетки по сравнению с одним только IgG ВНА10. Напротив, оба биспецифических Геркулес антитела показали увеличенную способность к уничтожению опухолевых клеток WiDr. Фиг. 54 показывает, что оба 14А2 IgG и ВНА10 IgG антитела имели скромную, если не сказать незначительную, активность в ингибировании роста опухолевых клеток Me180 как отдельные агенты или в комбинации. Напротив, оба биспецифических Геркулес антител показали способность уничтожать опухолевые клетки Me180. Фиг. 55 показывает, что у 14А2 IgG и ВНА10 IgG антител была незначительная активность в отношении ингибирования роста опухолевых клеток MDA231 при применении по отдельности и, возможно, некоторая активность в комбинации. Напротив, биспецифичные Геркулес антитела XWU036 (конец С-Геркулес с VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер стабилизированная ВНА10 scFv) показал уничтожение опухолевых клеток MDA231. Фиг. 56 показывает, что ни одно из антител не демонстрирует какой-либо активности по отношению к контролю (эндотелиальные клетки человеческой пупочной вены (HUVEC)), т.е. цитотоксическая активность биспецифических антител не является повсеместной. HUVEC показывает положительное окрашивание для LTβR и TRAIL-R2 анализом FACS (данные, не показанные) указание наличия рецепторов и что активность биспецифических антител может зависеть от триггера и определенных уникальных компонентов в опухолевых клетках. Пример 10. Исследования стабильности биспецифических антител "Геркулес". Проводились исследования стабильности в реальном времени образцов N- и С-концевых биспецифичных антител XWU028 (ВНА10 scFv VH44:VL100/(Gly4Ser)4 N-Геркулес) и XWU036 (ВНА10 scFv VH44:VL100 /(Gly4Ser)4 С-Геркулес) хранящихся при 2-8°С в течение трех месяцев. Качество белка оценили для следующих случаев: (1) агрегация, (2) осаждение, (3) распад полипептида или протеолиз и (4) посттрансляционные модификации, такие как деамидирование или окисление. Высокая и низкая концентрации N- и С-концевых биспецифических антител в образцах, используемых для исследований, были XWU028 1,8 мг/мл (низко) и 10,3 мг/мл (высоко) и XWU036 в 5,0 мг/мл (низко) и 11,4 мг/мл (высоко). Антитела были приготовлены в PBS. Для исследования стабильности проанализировали начальный (Т=0), промежуточный (Т=1 неделя, 2 недели, 1 месяц, 2 месяца) и финальный (Т=3 месяца) моменты времени. Кроме того, начальные (Т=0) образцы были заморожены и сохранялись при -70°С до использования во вторичных исследованиях 3-месячного периода. IgG BHA10 (8,7 мг/мл) использовался как контроль и был так же обработан. - 122 - 015992 А. Анализ агрегации и преципитации белка. Агрегацию или осаждение белков определяли, используя аналитическую гель-хроматографию (SEC), связанную со встроенными датчиками светорассеяния и показателя преломления (Wyatt Technologies, MiniDawn и rEX, соответственно). Анализ SEC/СВЕТОРАССЕЯНИЯ не позволил получить доказательства агрегации или потери материала, которые могли бы происходить при осаждении. Профили элюирования SEC в начальный, Т=0, и финальный, Т=3 месяца, моменты времени для XWU028, XWU036 и ВНА10 антител были почти идентичны (фиг. 74, 75 и 76 соответственно). XWU028 и XWU036 образцы оба накопили ~1% агрегированного материала при завершении исследования; однако детекция этих агрегатов была около низкого предела детекции, определенного для этого способа (табл. 17). Формирование агрегатов происходило независимо от концентрации белка. На основании установленных значений молекулярных масс, используя способы детекции светорассеяния, удалось показать, что низкие уровни агрегации в исследуемых образцах вероятно представляют собой продукт преобразования мономеров в димеры. Ни один из образцов биспецифических антител, XWU028 или XWU036, не накопил поддающиеся обнаружению уровни агрегатов более высокого порядка, даже при том, что этот тип агрегата должен легко наблюдаться указанными способами. ВНА10 антитело не продемонстрировало увеличения агрегатов в течение 3-месячного курса исследования (табл. 17). Таблица 17 Процент мономеров, определенный способом хроматографии SEC В. Исследование протеолиза и посттрансляционных модификаций. Протеолиз исследуют, используя жидкостную хроматографию SDS-PAGE и жидкостную хроматографию/массовую спектроскопию (LC/MS) интактного анализа по массе (Agilent LC/MSD TOF связанный с 1100 Agilent 1100 LC через область контакта электрораспыления). Для анализа СТРАНИЦЫ SDSPAGE 5 мкг белка были загружены в полосу. Сниженные образцы были препарированы в 1Х буфере образца Трис-глицин, включающем 5% β-меркаптоэтанол. XWU028 и XWU036 не смогли получить доказательства расщепления белка за 3-месячный период хранения при 2-8°С, как определено невосстанавливающим и восстанавливающим анализом SDS-PAGE (фиг. 77(А и В)). Точно так же XWU028 и XWU036 не позволил получить доказательства более низкой молекулярной массы протеолитических продуктов за 3-месячный период хранения в 2-8°С, как определено анализом LC/MS (фиг. 78-79). Посттрансляционные модификации были исследованы с использованием LC/MS. Т=0, Т=1 мес и Т=3 мес образцы были проанализированы в невосстановленной и восстановленной форме. Восстановленные образцы были приготовлены обработкой в 50 мм DTT/4M гуанидин гидрохлорида в течение 1 ч при 37°С. Буфер HPLC А состоит из TFA 0,03% в воде и HPLC, буфер В включает TFA 0,025% в ацетонитриле. Скорость потока сохранялась постоянной в 100 мкл/мин. 7,5 мкг каждого образца (восстановленного и невосстановленного) было нанесено на 2,1 × 50-миллиметровые колонки С4 и проанализированы Agilent ESI-TOF. Способ связывать-и-элюировать использовался для невосстановленных образцов, в то время как способ градиента использовался для сниженных образцов. Спектры были получены, используя Аналитика и пакеты программ MaxEnt1, включенных в комплект поставки. Деконволюированные спектры массы XWU028 и XWU036 (высокие концентрации) в Т=0, Т=1 mo и Т=3 mo показаны на фиг. 78-79. Ни XWU028, ни XWU036 не продемонстрировали каких-либо поддающихся обнаружению изменений в их масс-спектрах, обозначая отсутствие посттрансляционной модификации, которая могла потенциально неблагоприятно повредить функциям или стабильности биспецифичного антитела. Вместе указанные данные позволяют предположить, что N- и С-концевые биспецифичные антитела, включающие стабилизированные scFv домены, устойчивы при расширенных состояниях хранения, - 123 - 015992 такие как требуемые для биологических лекарственных продуктов. Эти результаты особенно приятны, потому что исследования стабильности проводились с N- и С-концевыми биспецифичными антителами в простом буфере (PBS), и не с растворами, препарированными с оптимальными формулировками. Пример 11. In vivo фармакокинетическая активность и сывороточная стабильность биспецифичных "Геркулес" антител. Однократная инъекция 10 мг/кг (1 мг/мл) N-концевого Геркулес (XWU028) или С-концевого Геркулес (XWU036), разбавленного в забуференном фосфатом PBS, было введено интраперитонеально самцам мышей CB17-scid. Мышей умерщвляли в 0, 0,5, 2, 6, 24, 48, 72, 96, 168, 240 и 336 ч после инъекции, в каждый момент времени для каждого биспецифичного антитела использовалось по три мыши. Образцы сыворотки были подготовлены к анализу методом ELISA, чтобы определить количественно уровни биспецифичных антител. Чашки ELISA были покрыты козьим-античеловеческим IgG, заблокированным с PBS/1%BSA; сыворотка, включающая биспецифичные антитела, была последовательно разбавлена в PBS/1%BSA и добавлена к чашкам для инкубации. Захваченные антитела были обнаружены с козьимиантичеловеческими каппа HRP-связанными антителами. Результаты фармакокинетического исследования показаны в табл. 18. У конца N-Геркулес (XWU028) есть период полураспада элимирирования (t1/2) 10,3 дней с пиковой серологической концентрацией 85,67 мкг/мл. У конца С-Геркулес (XWU036) более длинный период полураспада элиминирования (t1/2) 15,1 дней с пиковой серологической концентрацией 105,67 мкг/мл. У обеих молекул есть подобные объемы распределения (Vd), хотя эти значения не были отрегулированы для биопригодности. Таблица 18 Фармакокинетические параметры Образцы сыворотки были также проанализированы в биспецифичном ELISA связывании, описанном в примере 7. В этом анализе серологические образцы, включающие конец N-Геркулес (XWU028) или С-конец Геркулес (XWU036), описанные выше, были исследованы на биспецифичную обязательную активность к рекомбинантно полученным TRAIL-R2 и LTβR рецепторам в анализе ELISA. Фиг. 80 и 81 показывают, что серологические образцы от мышей, получавших N- и С-концевой Геркулес, содержат антитела, которые биспецифично связываются с обоими TRAIL-R2 и LTβR и близко соответствуют профилям элиминирования, наблюдаемым в исследовании PK, указывающем, что биспецифичные антитела остаются интактными при физиологических состояниях для расширенных промежутков времени. Пример 12. In vivo биологическая активность биспецифичных антител "Геркулес". (A) In vivo биологическая активность биспецифичных антител "Геркулес" на модели рака толстой кишки. Клетки рака толстой кишки человека WiDr (2×10Е6 клеток на мышь) были внедрены подкожно в 125 атимических голых мышей. Опухоли выращивались до тех пор, пока они не достигли приблизительно 100 мг, в этот момент в общей сложности 70 мышей были отобраны для исследования, разделенного на 7 групп по 10 мышей. IP лечение было введено, начиная с 13 дня постимплантаций, следующим образом: Группа 1=апирогенный PBS; Группа 2=СВЕ11, 2 мг/кг, 1×/неделя; Группа 3=hBHA10, 2 мг/кг, 2×/неделя; Группа 4=ch14А2, 2 мг/кг, 2×/неделя; Группа 5=Геркулес-XWU028, 2 мг/кг, 1×/неделя; Группа 6=Геркулес-XWU036, 2 мг/кг, 1×/неделя; Группа 7=hBHA10+ch14A2, 1 мг/кг каждый, 2×/неделя. Весы тела, размеры опухоли регистрировались каждые две недели. Исследование было закончено, когда средний размер опухоли группы носителя достиг приблизительно 2000 мг. Объем опухоли был вычислен с использованием формулы: (L×W2/2). Временные исследования мышей относились с XWU028 и XWU036, показал значительную активность анти-опухоли (р<0,001) для обоих биспецифичных антител по сравнению с носителем-контролем PBS (фиг. 82). В случае XWU028 значительные анти-канцерогенные-эффекты (р <0,05) наблюдались по сравнению с ответами на лечение только hBHA10 или ch14A2 mAb. Для XWU036 значительный антиканцерогенный эффект (р <0,05) наблюдался по сравнению с ответом на действие ch14A2 mAb и, в осо- 124 - 015992 бенности, наибольший значимый ответ (р <0,01) по сравнению с hBHA10 mAb. Важно, что биспецифичное антитело показало превосходную in vivo активность против опухоли, хотя вводилось оно только один раз в неделю. В связи с этим предполагается, что повышение стабильности, описанное в настоящем изобретении, приводит к улучшению свойств антитела и физической стабильности при физиологических состояниях. (В) In vivo биологическая активность биспецифичных антител "Геркулес" на опухолевой модели рака молочной железы. Клетки карциномы молочной железы человека MDA-MB-231 были введены подкожно в 135 атимических голых мышей (2×10Е6 клетки на мышь). Опухоли были выращены до дня 13, после чего 75 мышам с опухолями среднего размера, приблизительно, 168 мг было назначено лекарство (группа лечения, N=10) и носитель в качестве контроля (N=15). Мыши получали антитела и носитель, начиная с дня 13. Группы показаны следующим образом: Группа 1=апирогенный PBS; 1×/неделя; Группа 2=hBHA10, 2 мг/кг, 2×/неделя; Группа 3=ch14A2, 2 мг/кг, 2×/неделя; Группа 4=Геркулес-XWU036, 2 мг/кг, 1×/неделя; Группа 5=hBHA10+ch14A2, 1 мг/кг каждый, 2×/неделя. Массы тела и размеры опухолей регистрировались каждые две недели. Исследование было закончено, когда средний размер опухоли группы носителя достиг приблизительно 2800 мг. Объем опухоли был вычислен по формуле (L×W2/2). XWU036 продемонстрировал статистически значимую (р<0,001) активность против опухоли по сравнению с любым отдельным hBHA10 или ch14A2 mAbs или со смесью двух антител. Важно, что биспецифичное антитело XWU036 продемонстрировало хорошую противоопухолевую активность in vivo при введении раз в неделю, схема дозирования предполагала, что усиление стабильности, описанное в этом изобретении, приводило к улучшению свойств антитела и физической стабильности при физиологических состояниях (см. фиг. 115). Пример 13. Получение стабилизированного биспецифичного антитела "Геркулес", включающего нековалентные стабилизирующие мутации scFv. ВНА10 scFvs изобретения, включающие одни только нековалентные стабилизирующие мутации, а также совместно с дисульфидным мостиком VH44-VL100, использовались, чтобы построить стабилизированные биспецифичные С-Геркулес антитела, включающие гибриды химерных 14А2 IgG антител, которые связывают TRAIL R2 рецептор с LTβR. Биспецифичные антитела были построены как С-концевые ВНА10 scFv химеры, используя способы, как описано в примере 7. А. Конструирование С-Геркулес биспецифичных антител с ВНА10 VH S16E+VLS46L и VH44VL100/VH S16E+VL S46L scFvs. ПЦР использовалась, чтобы амплифицировать вариант ВНА10 scFv фрагмента гена из ДНК плазмиды pIEH-050 (родительская плазмида у плазмиды высокой экспрессии pIEH076) и pIEH-052 (родительская плазмида у плазмиды высокой экспрессии pIEH080), включающей ВНА10 S16Е+VL S46L и VH44-VL100/VH S16E+VL S46L scFvs соответственно, используя праймеры олигонуклеотида, описанные в табл. 19. Вариант ВНА10 scFv генных фрагментов был изолирован на геле. Из-за сайта BamHI в области линкера плазмиды pIEH-050 и pIEH-052 генные фрагменты были усвоены с pPuM I и Kpn I эндонуклеазы ограничения и лигированы к модифицированной плазмиде pN5KG1, усвоенной с теми же самыми эндонуклеазами ограничения, заканчивающимися продуктом гибридизации стабилизированной анти-LTBR (ВНА10) scFvs к карбоксильному концу анти-TRAILR2 (14А2) СН3 домена антитела через 16 аминокислотный (Gly4Ser)3 линкер. Правильные последовательности были подтверждены секвенированием ДНК. Таблица 19 Олигонуклеотиды для амплификации ПЦР ВНА10 VH S16E+VLS46L и VH44-VL100/VH S16E+VLS46L scFvs Гибридизация ВНА10 scFv VH S16E+VL S46L генной последовательности с карбоксильным концом анти-TRAIL R2 генной последовательности тяжелой цепи антитела позволила получить плазмиду PXWU054. Гибридизация ВНА10 scFv VH44-VL100/VH S16E+VL S46L генной последовательности с карбоксильным концом анти-TRAIL R2 генной последовательности тяжелой цепи антитела позволила получить плазмиду PXWU055. Смеси лигирования использовались для трансфицирования 10 самых компетентных клеток штамма Е.coli (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Колонии Е.coli, трансформированные в устойчивые к ампициллину, скринировались на наличие вставок. Секвенирование ДНК подтвердило правильную последовательность заключительных конструкций. Химерные 14А2 ДНК легкой цепи (SEQ ID NO: 28 SEQ) последовательности аминокислоты и (SEQ ID NO: 29 SEQ) показаны на фиг. 23 и 24. ДНК тяжелой цепи (SEQ ID NO: 52 SEQ) последовательности аминокислоты и (SEQ ID NO: 53 SEQ) для С-Геркулес ВНА10 scFv VH S16E+VL S46L биспецифичных антител показаны на фиг. 83 и 84 соответственно. ДНК тяжелой - 125 - 015992 цепи (SEQ ID SEQ NO: 54), аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 55 SEQ) для С-Геркулес ВНА10 scFv VH44-VL100/VH S16E+VL S46L биспецифичного антитела показана на фиг. 85 и 86 соответственно. С тяжелыми цепями использовался тот же сигнальный пептид, что и раньше. В. Стабильная экспрессия биспецифичного антитела в клетках СНО, очистка и характеризация антитела. DHFR-дефицитные линии клетки СНО, устойчиво трансфицированные с ДНКплазмиды pXWU054 и pXWU055 и приспособленные к бессывороточным условиям, были исследованы на предмет продукции биспецифичного антитела и очищены, как описано в примере 8. Белковые элюаты супернатантов, включающие С-Геркулес с VH стабилизированная S16E+VL S46L ВНА10 scFv и С-биспецифичным антителом со стабилизированной VH44-VL100/VH S16E+VL S46L ВНА10 scFv, были исследованы на наличие агрегатов способом аналитической гель-хроматографии (фиг. 87). Профиль хроматограммы С-Геркулес, включающей обычный ВНА10 scFv, показал ~40%-ные агрегаты. Напротив, С-концевой Геркулес с VH стабилизированным S16Е+VL S46L ВНА10 scFv значительно восстанавливал количество агрегатов до уровней, сопоставимых с наблюдаемыми для стандартных IgG. Фиг. 88 и 89 показывают гели SDS-PAGE очищенного С-концевого Геркулес с VH S16E+VL S46L ВНА10 scFv и С-концевого Геркулес с VH44:VL100/VH S16E+VL S46L ВНА10 scFv соответственно. Уменьшенные полоски показывают ожидаемые размеры белков тяжелой и легкой цепей. Важно, что нет никакого значительного содержания нежелательных или деградировавших побочных продуктов меньшей молекулярной массы, которые часто наблюдались с Геркулес, включающей дикий тип scFv доменов. Фиг. 90 и 91 показывают аналитические профили элюирования SEC С-концевого Геркулес с VH S16E+VLS46L BHA10 scFv и С-концевого Геркулес с VH44:VL100/VH S16E+VL S46L ВНА10 scFv, соответственно, следующих за начальным белком этапа очистки белков. Эти исследования демонстрируют, что стабилизация ВНА10 scFv введением только VH S16E+VL S46L мутаций и в комбинации с дисульфидными результатами VH44:VL100 привела к получению в препаративных количествах > 98%-ого чистого, мономерного Геркулес биспецифичного антитела, которое свободно от молекул большего молекулярного веса. Пример 14. Биологическая активность биспецифичного антитела "Геркулес", включающего нековалентные стабилизирующие мутации scFv. In vitro биологическая активность С-концевого Геркулес с VH S16E+VL S46L ВНА10 scFv (XWU054) и С-концевого Геркулес с VH44:VL100/VH S16Е+VL S46L BHA10 scFv (XWU055) была исследована в анализе пролиферации опухолевой клетки, как описано в примере 7. Результаты этих исследований представлены на фиг. 92, 93. Фиг. 93 показывает, что у 14А2 IgG антитела была умеренная активность ингибирования роста опухолевых клеток WiDr, и в комбинации с IgG BHA10 оно показало небольшое увеличение противоопухолевой активности по сравнению с одним только IgG BHA10. Напротив, оба биспецифичных антитела Геркулес (XWU054 и XWU055) показали усиленную способность к уничтожению опухолевых клеток WiDr, сопоставимую той, что наблюдается для молекулы XWU036 (С-концевой Геркулес с VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер стабилизированная ВНА10 scFv), описанной в примере 10. Фигура 92 показывает, что у 14А2 IgG и ВНА10 IgG антител была незначительная активность в отношении ингибирования роста опухолевых клеток MDA231 в случае использования по отдельности и совместно. Напротив, биспецифичные Геркулес антитела (XWU054 и XWU055) показали усиленное уничтожение опухолевых клеток MDA231, сопоставимое наблюдаемому с молекулой XWU036 (С-концевой Геркулес с VH44:VL100/(Gly4Ser)4 линкер-стабилизированной ВНА10 scFv), как описано в примере 10. Пример 15. Использование способа дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) для измерения термической стабильности человеческих или гуманизированных последовательностей антител. Чтобы оценить диапазон стабильности антител, дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) была выполнена на наборе из 17 BIIB человеческих или гуманизированных антител. BIIB антитела были диализированы против 20 мМ цитрата натрия, 150 мМ буфера хлорида натрия при рН 6,0. Диализаты использовались в ячейке сравнения калориметра, чтобы определить базовую линию каждого сканирования антитела. После диализа концентрации BIIB1-17 были измерены по поглощению при 280 нм (Расе et al., Protein Sci. 4, 2411-2423, 1995). Растворы антитела, используемые для ДСК, были универсально приготовлены в 1 мг/мл, путем разбавления сконцентрированных стоков с их диализатами. Сканирования выполняли, используя автоматизированный капиллярный сканирующий калориметр (сарДСК, Microcal, LLC). Белковые растворы и растворы сравнения были проанализированы автоматически в 96-луночных планшетах с помощью автоматизированного приспособления. До начала сканирования белков было выполнено 2 с буфером в клетке образца, они использовались для вычитания фона. Отдельное очищающее сканирование было выполнено после каждого белкового просмотра, используя 5%ный Liquinox. После каждого просмотра инструмент автоматически промывался клетками сравнения и образца с 3Х-2 мл дистиллированной деионизированной Н2О, включающей азид натрия 0,01%. Сканирование выполнялось со скоростью 1°С/мин в режиме обратной связи для улучшения разрешения пиков. - 126 - 015992 Диапазон сканирования был 20-95°С. Все 96-луночные платы с белком хранились на инструменте при температуре 6°С. Данные сканирования анализировали программным обеспечением Origin, поставляемым производителем. После фоновой экстракции ненулевые базовые линии были скорректированы с использованием полином третьего порядка. Переходы развертывания для каждого домена IgG1 были обращены заполнением кривых с несколькими пиками в 3 различных переходах. Рекомбинантные домены IgG1 и IgG4 Fcγ были использованы для идентификации СН2 и СН3 пиков в каждом переходе. Предполагалось, что оставшиеся переходы соответствуют развертыванию фрагмента Fab антитела. Большая часть фрагментов Fab 17 антител развертывалась в процессе кажущихся простых переходов со средними точками термического развертывания (ТМ) в диапазоне 57-82°С, в зависимости от уникальных свойств каждого индивидуального Fv. Только три антитела, BIIB15, BIIB16 и BIIB17 продемонстрировали 4 перехода. Типичный ДСК след IgG1 показан на фиг. 94. CPmax (т.е. высота ДСК пика) Fab фрагментов, в целом, значительно выше, чем у доменов СН2 или СН3. Это разумно, с учетом того, что масса белка Fab антитела в 4 раза больше, чем у доменов СН2 или СН3, и Fab-участок антитела также включает заполненную площадь поверхности между четырьмя доменами, в отличие от СН2 и СН3 доменов, где каждый переход вовлекает разрушение только одной гомодимерной области контакта. В целом, переходы, наблюдаемые для СН2 и СН3 доменов каждого антитела IgG1, накладывались друг на друга. То же верно и для СН2 и СН3 доменов 3 IgG4. По этим причинам переходы Fab для каждой молекулы IgG1 или IgG4 были легко идентифицированы. Одно антитело (BIIB18) способом ДСК не изучалось. BIIB18 экспрессировал плохо и никогда не приводил к растворимому/неагрегированному веществу. Это антитело было включено в анализ последовательности, описанный в примере 16. Одно из антител, BIIB7, было проанализировано для IgG1 и IgG4 человека. Очевидные значения Fab термостабильности BIIB7 в IgG1 и IgG4 формате, как измерено по средним точкам их тепловых переходов разворачивания (ТМ), были очень похожи (см. фиг. 95). Вариации в константном подклассе домена не влияло на Fab TM или Fab калориметрическую энтальпию развертывания. Наложившиеся переходы, соответствующие СН2 и СН3 доменам IgG4 Fc, встречаются при значительно более низких температурах, чем таковые у IgG1, и искусственно делают Fab переходы на ~1-2°С ниже для IgG4. После полной деконволюции переходов IgG, Fab TM становятся намного ближе, чем в следах ДСК (ΔТМ <1°С). Факт, что Fab кривые ДСК BIIB7 в IgG1 и IgG4 форматах были очень подобны, предполагает, что термостабильность IgG 1 Fabs и IgG4 Fabs можно сравнивать непосредственно. ДСК измерения с 17 гуманизированными BIIB антителами показывают, что области Fv сильно влияют на очевидную стабильность их соответствующих Fab. Например, фиг. 96 демонстрирует совсем другие кривые ДСК, полученные для BIIB1, BIIB4, BIIB6 и BIIB16. Все четыре антитела - IgG1 и единственные различия их последовательностей связаны с областью Fv. Величины и положения СН2 и СН3 ДСК переходов всех 17 антител независимы от Fab, к которому они присоединены (см. фиг. 96). Диапазон Fab TM для лучших 17 антител в табл. 20 был между 57,2 и 81,6°С (+24,4°С), с BIIB1, показывающим самую высокую очевидную Fab стабильность и для BIIB17 самую низкую. Три антитела с самыми низкими измеряемыми значениями ТМ Fab, BIIB15, BIIB16 и BIIB17, демонстрируют разъединение между доменом, разворачивающим переходы в пределах Fab (см. фиг. 96 для BIIB16's ДСК кривая). Ожидаемый пик Fab был расколот на два отдельных перехода. Более низкие переходы ТМ перечислены в табл. 20, но второй переход, который может представлять разворачивание структурной единицы CH1/CL, встречался с ТМ 74, 72 и 70°С для BIIB15, BIIB16 и BIIB17 соответственно. BIIB18 был включен в исследование как пример антитела, которое не будет экспрессироваться и последовательность VH которого значительно отклонялась от консенсуса (см. пример 16). Исследования ДСК ясно показали, что уникальные свойства индивидуальных Fv-областей могут сильно ослабить очевидные ТМ всей части Fab антитела. В крайних случаях BIIB15, BIIB16 и BIIB17, очевидные Fv стабильности были достаточно низки, так что разворачивающиеся переходы доменов в пределах части Fab отделились друг от друга. Чтобы поддержать очевидный отдельный переход для разворачивания всех четырех домен s Fab, должен существовать минимальный общий предел ТМ (>70°С для IgG1 при состояниях просмотра, описанных здесь), иначе многократные появляются переходы. Было бы удобно назначить низкую температуру, разворачивающую переходы BIIB15, BIIB16 и BIIB17 к Fv и другие, более высокотемпературные переходы, к CH1/CL домену. Однако Ewert и сотрудники показали, что разворачивание VH/VL домена не всегда сопрягается и может зависеть от подкласса, VH/VL стабильности и VH/VL взаимозависимости (Ewert et al., J. Mol. Biol. 325: 531-553, 2003). Фактически, очень немногие из VH/VL scFv конструкций с полученными из консенсуса каркасами показали совместное разворачивание. Поэтому, вероятно, что, как в случае расщепления переходов, сценарий развертывания может быть более осложненным, чем простой раскол в два перехода, представляющий Fv-область и CH1/CL-области. Очевидные стабильности, по данным ДСК для BIIB7 IgG1 и IgG4 Fab, были очень подобны даже при том, что есть существенные врожденные различия в последовательности CH1 и дисульфидном сцеплении между этими двумя подклассами. Есть много возможных объяснений этого, такие как (1), биофизические свойства Fv устанавливают потолок термостабильности Fab BIIB7 независимо от того, является - 127 - 015992 ли CH1 IgG1 или IgG4, (2), очевидная стабильность области CH1/CL идентична для IgG1 и IgG4 или (3), структурная единица CH1/CL не разворачивается в пределах периода эксперимента ДСК. Факт, что Fab BIIB7, развернутый в отдельном ТМ и с подобным калориметрическим теплосодержанием в обоих форматах IgG1 и IgG4, предлагает потенциальную зависимость стабильности от Fv, а не константных областей. Таблица 20 BIIB IgG Fab ТМ-значения, VH и VK счета и зародышевые последовательности. a Lefranc et al., 1999. Необычные включения/делеции в CDR1 или CDR2. c Не экспрессировали 1. Пример 16. Использование консенсусного подсчета для идентификации вариабельных областей антител с субоптимальной стабильностью. Консенсусный подсчет использовался как способ идентификации, какое из BIIB антител содержало значительно большие количества неоптимальных аминокислот в пределах их областей Fv. Подсчет оценивает относительное отклонение на основании консенсуса VH и VK последовательностей из-за гиперсоматических мутаций и эволюционных зародышевых изменений. Измерения ДСК для 17 антител использовались, чтобы квалифицировать способность консенсусного подсчета спрогнозировать слабую стабильность антитела. Набор сравнения каппа последовательностей VH и VK млекопитающих использовался для определения последовательности консенсуса для подсчета, и индивидуальные частоты аминокислот в каждом положении остатка были собраны, сортированы и отобраны, как описано ранее (Demarest et al., J. Mol. Biol. 335: 41-48, 2004). Наборы сравнения млекопитающих были наивно построены, чтобы включать Vгены от различных млекопитающих, чтобы получить разнообразие через эволюционное отклонение между разновидностями. VH наборов сравнения млекопитающих включает 61 последовательность VH прежде всего от NCBI и TIGR, представляя в общей сложности 17 различных разновидностей. VK наборов сравнения млекопитающих содержат 53 VK последовательностей от 13 различных видов. Человеческие VH и VK последовательности для построения набора сравнения (или для использования как исследуемые последовательности) были собраны из базы данных NCBI, используя критерий поиска "антитело вариабельной тяжелой цепи человека разумного" и "антитело каппа вариабельной легкой цепи человека разумного" соответственно. В общей сложности 182 последовательности V-гена человека, 114 VH и 68 VK, были полурандомизированно отобраны из базы данных NCBI для сравнения с VH и VK базами данных млекопитающих. Распределение подклассов человеческих VH и VK последовательностей, полученных полуслучайным выбором из базы данных NCBI, выдавало ожидаемое представление подкласса, основанное на естественном зародышевом VH или VK (Guigou и др., 1990), предлагающий небольшой уклон в пути последовательности, выбранных из NCBI. Затем последовательности категоризировали в их индивидуальные вариабельные подклассы доменов (VH1-VH7 и VK1-VK4) выравниванием ClustalW против консенсусных последовательностей подкласса, полученных из Aho's Amazing Atlas of Антитело Anatomy website. Подклассы были дополнительно b - 128 - 015992 подтверждены выравниванием против общественно доступных человеческих зародышевых последовательностей (Lefranc и др., Нуклеиновые кислоты Res. 27, 209-212, 1999). Не более чем 5 человеческих последовательностей от любого полипоследовательного элемента NCBI были включены в наборы сравнения, чтобы восстановить потенциальный уклон, созданный более важными наборами или основанный на антигенном использовании V-гена. Сбор последовательности был выполнен наивно; поэтому после группировки подкласса наблюдалось естественное изобилие VH3 и VK1 последовательностей. Средний счет и стандартное отклонение (описанное ниже и в табл. 20) был вычислен для каждого подкласса, используя 25 VH1, 3 VH2, 44 VH3, 34 VH4, 5 VH5, 3 VH7, 29 VK1, 4 VK2, 19 VK3 и 16 человеческих последовательностей VK4. Только 2 из 18 антител (BIIB5 и BIIB14) содержали VH домены с минимальными группами последовательностей подгруппы (т.е. VH2, VH5 или VH7). Четыре из 18 антител (BIIB3, BIIB4, BIIB17 и BIIB18) содержали вариабельные домены подкласса VK2, подкласс которого был недостаточно представлен в пространстве последовательностей и точность подсчета которого была плохо определена. Никакие естественные последовательности VH6 не были найдены в пределах человеческого набора сравнения последовательности VH. Это не вызывало беспокойства, поскольку ни один из BIIB антител конструкции не содержал VH6 домен. Вариабельные последовательности доменом 18 BIIB антител и 182 человеческих VH и VK последовательностей, полученных из NCBI, были подсчитаны против набора сравнения млекопитающих последовательностей антител. Все VH и VK последовательности был сокращены до CDR3 (два остатка после консенсусных остатков YYC), чтобы снизить непредсказуемость, вызванную гипервариабельной природой V-(D-) J-C объединяющих областей. Частоты остатка (пи®) в каждом положении базы данных млекопитающих были вычислены, суммируя, сколько раз каждая аминокислота (А, С, D, ... V, W, Y,-) встречается в каждом положении остатка в пределах базы данных, разделенной на общее количество последовательностей. Подсчеты были произведены для каждой человеческой VH и V исследуемой последовательности, используя следующую формулу: где ci(r) равняется частоте консенсусных остатков в каждом положении вариабельных баз данных доменов млекопитающих; hi(r) равняется испытательной частоте остатка каждой аминокислоты человеческой вариабельной исследуемой последовательности домена. Идеальное консенсусное множество для последовательностей консенсуса млекопитающих баз данных было 104 для VH и 100 для VK. А. Случайный подсчет VH и VK последовательностей с использованием базы данных млекопитающих V-Gene. VH и VK консенсусные последовательности подкласса были подсчитаны против консенсуса базы данных млекопитающих, это показано на фиг. 97(А и С) соответственно. Консенсусный счет VH3подкласса только на 1 пункт ниже, чем гипотетический "идеальный" счет консенсуса базы данных млекопитающих, и отличался от него, в общей сложности, тремя остатками. Таким образом, очевидно, что база данных млекопитающих склоняется к VH3-подобным последовательностям. Все другие человеческие последовательности консенсуса подкласса VH подсчитаны также и получили значительно меньший счет. Уклон к последовательностям VK4 наблюдался для баз данных млекопитающих VK (фиг. 97(С)). Человеческие или гуманизированные последовательности BIIB были проанализированы на основании работы человеческих последовательностей NCBI сопоставимого подкласса. Распределения индивидуального множества последовательностей VH показано на фиг. 97(В) и распределения счетов индивидуальных последовательностей VK показано на фиг. 97(D). В. Результаты подсчета для BIIB1-BIIB18. VH и VK счета для всех 18 BIIB антител были вычислены по сравнению с относительными количествами, полученными из набора сравнения последовательности человека V-gene NCBI (табл. 20). Также в табл. 20 включены различия между счетами V-gene BIIB и средним счетом подкласса. Это различие между этими счетами использовалось для того, чтобы исследовать потенциальные тенденции стабильности. BIIB1-18 были маркированы в порядке убывания их взвешенной стабильности Fab. Подкласс V-gene и ближайшая индивидуальная человеческая зародышевая последовательность для VH BIIB и VK генов был определен анализом ClustalW. Консенсусные счеты были получены для 18 BIIB антител и сопоставлены с экспериментально определенными Fab температурными профилями разворачивания. BIIB антител с самым большим различием между V-gene BIIB счетом и их средний счетом подкласса (т.е. самым низким счетом последовательностей) были коррелированы с низкими ТМ Fab, измеренными в примере 15 (табл. 20, фиг. 98). Не было никакой очевидной тенденции, коррелирующей VK множества с ТМ, измеренными ДСК (фиг. 99). Фактически, самый низкий счет VK последовательностей принадлежал BIIB2, у которого была вторая самая высокая очевидная стабильность Fab. Необычные делеции и вставки аминокислот CDR были найдены в BIIB15 и BIIB16, так же как в - 129 - 015992 BIIB18, у которого был худший счет VH всего BIIB антител, и никогда не экспрессировался в значительной степени. Счет VH не предполагал потенциальные проблемы стабильности для BIIB15 и BIIB16; однако их TM Fab были двумя из самых низких проверенных (фиг. 98). BIIB15 содержал необычно длинный CDR1 (13 аминокислот в длине и 2 дольше, чем любой VH3-подобный домен в нашей млекопитающей базе данных млекопитающих, или VH3 домен в наборе человеческих последовательностей авторов изобретения) и BIIB16 содержал необычно короткий CDR2 (15 аминокислот длиной на 1 аминокислота короче большинства других VH3 CDR2s в обеих базах данных VH млекопитающих и набора сравнения человеческого VH авторов изобретения). С. Использование небольших баз данных последовательностей млекопитающих для анализа частоты остатков и прогнозирования стабильности BIIB Fab. Расчет VH BIIB доменов против базы данных последовательностей VH млекопитающих, оказалось, был полезным инструментом для того, чтобы определить избыточность неоптимальных аминокислот каждого VH домена, который может, в свою очередь, ограничить полную стабильность Fab. Счеты были полезны для выбора Fab с низкой стабильностью и потенциала для снижения in vitro долговечности, и увеличения скорости агрегации. На основании уклонов подкласса, наблюдаемых для V-гена баз данных млекопитающих, можно было бы усомниться, не будет ли лучше всего использовать строго базы данных человека V-гена для того, чтобы выполнить консенсусный подсчет, а не на базе данных млекопитающих, используемой здесь. Однако на основании большого количества переменных, определяющих стабильность, которые не отражает счет, такие как точные положения остатка аминокислот неконсенсуса, прочность VH/VL взаимодействия, природа V-(D-) J-C присоединения и уровень гиперсоматических вставок и делеций, трудно предположить, что только человеческая база данных VH обеспечила бы значительное улучшение. Строго человеческая база данных, используемая для подсчета, может также потребовать, чтобы значительно большее количество последовательностей соответствовало эволюционному разнообразию, наивно включенному в пределах млекопитающей базы данных. Часть данных, которые указывают, что подход "млекопитающих" работает хорошо, заключается в том, что человеческий консенсус подкласса последовательности VH отранжирован в порядке возрастания их геномной избыточности и очевидного применения подкласса (Guigou et al., 1990; Teale и Medina, 1992; Tomlinson et al., 1992). База данных VH млекопитающих, кажется, правильно взвешивает общие вклады человеческих подклассов VH. Тот факт, что каждый VH и VK подкласс консенсусных последовательностей подкласса, в общем случае посчитанных, выше, чем огромное большинство индивидуальных уникальных человеческих последовательностей, и выбранных из NCBI, предполагает, что база данных млекопитающих захватила консенсусную информацию для всех подклассов, даже при том, что уклон существует к VH3. Поэтому из-за существования других влияющих на стабильность факторов, которые не включает счет, тенденция, наблюдаемая на фиг. 98, вряд ли улучшится, при тонкой настройке базы данных последовательности VH, используемой для подсчета. Необычные вставки и делеции в VH доменах, кажется, оказывают значительное влияние на стабильность, не отраженную скорингом консенсуса. Необычно длинный (13 аминокислот) CDR1 BIIB15 и необычно короткий (15 аминокислот) CDR2 BIIB16 - вероятные переносы гуманизации от оригинальной последовательности мыши. Фактически, последовательность VH BIIB16 выравнивается очень близко к двум мышиным последовательностям VH в базе данных млекопитающих у авторов изобретения, которая также содержала 15 аминокислотный CDR2. Создание необычно маленького CDR для человеческого каркаса, возможно, неблагоприятно повлияет на стабильность этого антитела. BIIB18 не только показал самый низкий счет VH всех последовательностей BIIB, но также и содержал необычно длинный CDR2 (22 остатка по сравнению с обычными 19 аминокислот). Таким образом, при рассмотрении многократных возможных проблем, связанных с последовательностями BIIB18, не приходится удивляться, что они никогда не достигнут уровней экспрессии, допускающих что-нибудь другое, кроме чрезвычайно сырых биологических проб с неочищенными супернатантами. Результаты для BIIB15, BIIB16 и BIIB18 предполагают, что необычные вставки VH или делеции могут иметь больший эффект на термостабильность антитела, чем большинство отдельных точечных мутаций. Исключительно слабое поведение BIIB18 не было спрогнозировано с первого взгляда на его последовательность, поскольку его Fv содержал все "существенные" аминокислоты, строго сохраненные в пределах V-гена складок. Возможность отбраковки проблемных антител является реальным полезным следствием подхода подсчета. Никакие тенденции не были очевидны, если сравнивать измеренные Fab стабильности с VK счетами. Объединение VK счетов со счетами VH просто снижало тренд, наблюдаемый для одних только счетов VH. В отличие от результатов подсчета VH человеческий VK консенсусный счет не соответствовал естественной избыточности VK зародышевых линий и использованию генов (Guigou et al., 1990; Meindl et al., 1990; Cox et al., 1994); даже при том, что консенсусные счеты работают лучше, чем их индивидуальные человеческие последовательности подкласса каппа (фиг. 99). Есть предположение, что эти отклонения от ожидаемого порядка консенсусных счетов VK могут удержать способность баз данных млекопитающих точно спрогнозировать низкую стабильность VK доменов. Кроме того, последовательностей VK2 было недостаточно для того, чтобы определить счет среднего числа подкласса VK2. После того как распределения подкласса были определены для VK последовательностей 68 человек, только 4 оказались последо- 130 - 015992 вательностями VK2 (что вполне прилично отражает использование VK2). Даже с этими недостатками VK все еще предполагают, что большее разнообразие последовательности генов VH может, чаще чем не может, делать VH домены определяющими стабильность компонентов Fab (Demarest и др., 2006); хотя в литературе доступны примеры противоположного (Rothlisberger и др., 2006). D. Зависимость стабильности от VH или VL зародышевых линий и пар VH/VL. Многие из 18 антител содержали перекрывающиеся зародышевые V-гены, чьи CDR и гиперсоматические мутации варьируются, и чьи VH или VK были одинаковыми или различными. Это позволяло сравнить стабильности Fab антител против индивидуальных зародышевых линий, из которых они были получены. У двух самых устойчивых Fab, BIIB1 и BIIB2, есть те же самые VH1 и VK1 зародышевые комбинации. VH и VK соединения, кажется, не имеют ясных свойственных им уклонов, на основании исследовании Winter с сотрудниками, но, как полагают, являются "рецептор-управляемым" (de Wildt и др., 1999b). BIIB1 и BIIB2 связывают относительно несхожие антигены, CCL2 и VLA4; поэтому комбинация либо встречалась случайным образом, или была результатом гуманизации. Наблюдалось ясное изобилие неоптимальных аминокислот в пределах VH доменов наименее устойчивых Fab, BIIB17 и BII18 (т.е. низкие счеты последовательности и BIIB18 содержали необычную вставку). Оба этих антитела также содержали те же самые зародышевые VK2, потенциально предлагающие проблемы стабильности белка легкой цепи как основу проблем VH, определенных подсчетом. Будущее исследование должно определить, был ли этот специфичный VK2 компонентом слабого биофизического поведения этих двух антител. Подкласс VK2 в общем не был связан с плохой стабильностью Fab, поскольку BIIB3 и BIIB4 также содержат ген подкласса VK2. Зародышевое AB019438VH1 (Lefranc и др., 1999) неожиданно возникало четыре раза. Значения TM для этих Fab (BIIB12, BIIB11, BIIB7 и BIIB3) колебались от 71,2 до 78,2. Интересно, их счеты последовательности VH коррелировали с их кажущимися стабильностями Fab (BIIB12<BIIB11 <BIIB7≈BIIB3). Положительная корреляция подсчета VH была также обнаружена в BIIB1 и BIIB2 антителах, описанных выше, с той же самой зародышевой VH1. Очевидная неточность подсчета VH, однако, была подчеркнута отрицательной корреляцией стабильности, наблюдаемой для BIIB4 и BIIB6, оба из которых содержали зародышевое M99649VH3. В то время как использование VH зародышевых семейств у взрослых кажется довольно случайным, семейство VH3 включает большинство представителей у людей. VH3 или VH3-подобные гены стохастически чаще появлялись в человеческом наборе сравнения и базе данных млекопитающих. Ewert и Pluckthun's получили результаты, которые продемонстрировали, что полученная из консенсуса человеческая последовательность VH3 была самой устойчивой из полученных из консенсуса VH доменов (Ewert и Pluckthun, 2003). Этот результат, возможно, не был полностью неожиданным, так как у подкласса VH3 есть больше зародышевых последовательностей, чтобы поспособствовать созданию оптимального консенсуса по сравнению с другими подклассами. Полученные данные стабильности показывают, что IgG, включающие VH3 зародышевые линии, в целом, не демонстрируют более высоких значений TM Fab. VH3 и VH1 Гены подкласса VH3 и VH1 существуют в верхней и нижней частях списка стабильности. В то время как много других факторов способствуют полной стабильности Fab, особенно свойства VK копий в пределах Fv, можно было бы ожидать тенденцию к более высоким стабильностям Fab, которые содержат подкласс VH3 зародышевых линий, если бы VH3 домены в общем были более устойчивыми, чем другие подклассы. Это, кажется, не является верным, на основании ограниченного количества представленных здесь исследований стабильности. Пример 17. Анализ ковариаций укладки Ig полипептидов. А. Сбор и фильтрация структур Ig-укладки. Структуры белков Ig-укладки или доменов Ig-укладки из полидоменных белков были собраны из базы данных ASTRAL, которая включает структуры доменов, соответствующие иерархии SCOP. Иммуноглобулин специфичные Ig-домены были найдены согласно следующим классификациям в пределах иерархии SCOP: "Все белки бета"→"Подобный иммуноглобулину бета-сэндвич"→"Иммуноглобулин". Под иммуноглобулином были доступны четыре набора структур: "V набор", "набор С1", "набор С2" и "набор I." Четырьмя таможенными подлинниками загрузки отдельно управляли, чтобы получить pdb файлы классов "V-класс", "С1-класс", "1-класс" и "С2-класс", было запущено четыре пользовательских скрипта загрузки. Как только файлы структуры для каждого подсемейства были загружены, было выполнено некоторое фильтрование, чтобы удалить ошибочно категоризированные, неполные, избыточные или доменобменные структуры (Liu Y, et al., Protein Sci. (2002), 1285-1299). Было 4 главных этапа фильтрования, они описаны ниже. Этап 1. Удаление последовательностей с разрывами. Структуры от каждого подкласса были визуально осмотрены, используя просмотровую программу SwissPDB, на предмет разрывов в последовательности (любые неразрешенные удельные веса или отсутствующие секции из-за обмена между доменами). Файлы PDB дефектных структур были вручную удалены из наборов данных структуры V-, С1-, С2-, I-класса. - 131 - 015992 Этап 2. Удаление 100% идентичных последовательностей. Структуры формата PDB были преобразованы в аминокислотные последовательности формата FASTA и отфильтрованы, чтобы удалить любые последовательности, которые были на 100% идентичны оставшимся подпоследовательностям. Этап 3. Удаление последовательностей неправильной длины. Структуры PDB с ошибочно длинными или короткими последовательностями аминокислот были удалены из наборов данных структуры. Критерии сокращения длины были определены на основании гистограммы всех длин последовательности (фиг. 101). Гистограммы предствалялись соответствующими нормальному распределению. Последовательности за пределами двух допустимых отклонений от среднего были удалены из каждого набора данных подсемейства. Полное среднее количество остатков для суперсемейства иммуноглобулина было 106,10 и допустимое отклонение было 12,19. Следовательно, общие используемые сокращения были ≤81 и ≥131 остаток. Распад средних длин допустимых отклонений показан в табл. 21. Таблица 21 Критерии длин последовательностей наборов структурных данных Этап 4. Удаление неверно свернутых последовательностей. Структуры были визуально осмотрены, используя SwissPDB, на предмет поиска неверного свертывания. Отказались от любых структур, которые не соответствовали двум бета-листовым топологиям бутерброда. Только начиная с пяти С2-классов, домены были получены из SCOP, и после этого Ig-сгибы С2-подкласса более не преследовались. После этого C1-классы стали называться С-классом. B. Получение выравнивания последовательностей на основании структурного выравнивания. Для каждого отдельного класса структуры Ig-укладки были наложены друг на друга, используя принцип соответствия вторичных структур (SSM) в пределах Schrodinger structalign пакета (см. главную документацию программы Schrodinger для инструкций относительно создания суперпозиций). Суперпозиции были выполнены на "все ко всем" или "все к одному" основанию. Каждый алгоритм привел к подобным качественным выравниваниям, таким образом "все к одному" были выбраны для суперположений. Некоторые суперналожения были исправлены, чтобы гарантировать, что основные области каждой структуры были добавлены вместо петель. Суперналожения тогда использовались, чтобы произвести основанные на структуре выравнивания последовательности всего V-класса, I-класса, последовательностей С-класса и в пределах каждого структурного выравнивания. Выравнивание каждой последовательности на другой было выполнено с использованием пакета Schrodinger, соответствуя аминокислотам от одной последовательности до той из второй последовательности, основанной на самом коротком расстоянии между α-углеродом полипептидной цепи. C. Конструирование исправленной базы данных последовательностей Ig-укладки. Некоторые этапы были созданы, чтобы получить исправленную базу данных укладок Ig для того, чтобы вычислить правильную статистику ковариации: Этап 1. Конструирование профилей НММ. Три профиля Скрытой Модели Маркова (НММ) были построены, каждый на основании структуры выравнивания последовательности для одного из трех классов Ig-укладки. Профили были созданы пакетом программ HMMER (версия 1,8), используя команды "hmmbuild" и "hmmcalibrate" со стандартными выборами. Эти НММ тогда использовались, чтобы обнаружить и выравнять дополнительные последовательности Ig-Fold в НОМЕРЕ базы данных, поддержанной в NCBI. Этап 2. Поиск NR с помощью новых V-, I- и C-класса НММ профилей. Три специфичных для класса НММ использовались, чтобы искать подобные последовательности в местном NR базы данных. NR базы данных является большим файлом, включающим ~3 миллиона безызбыточных белковых последовательностей. Для каждого из V-, "I", С-классов НММ, HMMER команда "hmmsearch" использовалась, чтобы искать NR. Каждый выход оценил NR последовательностей их счетами относительно NR используемый и предоставил информацию о количестве областей, пораженных NR и положения областей хита в пределах каждого NR последовательности. Для каждой Ig-укладки специфичной для класса НММ ищут NR последовательностей выше рекомендуемого порога счета критерия - 132 - 015992 как кандидаты в члены класса Ig-укладки, чей НММ использовался. Для тех областей хита, которые были подпоследовательностями NR последовательности, точный NR хита подпоследовательности был извлечен из полного NR последовательности, используя пользовательскую программу. Этап 3. Валидация Ig-укладки с помощью PFAM. PFAM - белковое семейство и домен инструмента классификации, созданный и поддержанный Wellcome Trust Sanger Institute (Fin, et al., Nuc. Acids. Res. (2006), 34: D247-D251), который может быть применен к индивидуальным белковым последовательностям. Инструмент Pfam "pfamverify" был применен к каждой последовательности кандидата Ig-Fold, полученной на этапе 2 выше, чтобы подтвердить, что оно было правильно классифицировано специфичной для класса Ig-укладки НММ, созданным на основании структуры выравниваний последовательности, Ig-клан PFAM ХМ представляет V-, "I", C1-, С2- и менее специфичный Ig HMMs, были загружены от веб-сайта PFAM. Каждая последовательность из NR была выиграна Ig-кланом НММ, показывая, какхорошо каждая последовательность соответствует каждому PFAM ХМ. Последовательности, счеты которых лежат ниже рекомендуемых сокращений (ТС1 - определенный в веб-сайте PFAM) для V-, -I- или С-классы или были удалены из соответствующих наборов последовательности. Таким образом, кандидатный класс специфичных последовательностей Igукладок, найденный на этапе 2, был сохранен, только если его счета PFAM подтверждали свои установки для класса Ig-укладки. Этап 4. Выравнивание новых последовательностей Ig-укладок. Последовательности Ig-укладки, которые перешли от этапа NR к НММ поискам и которые прошли приведенный выше этап 3, затем были выровнены относительно пользовательского НММ назначенного класса. Так как эти НММ были основаны на тщательных структурных выравниваниях, этот процесс застраховал управляемое структурой выравнивание новых последовательностей. Пакет HMMER использовался, чтобы произвести "mapali" выравнивания в fasta формате выхода, использовавшемся в Инструменте Ковариации Последовательности, описанном ниже. Выравнивания были также выведены в "Стокгольмском" формате выхода и осмотрены для неверных и невыровненных последовательностей или которые были упущены. Заканчивающиеся выравнивания, состоящие из оригинальных структурно выровненных последовательностей с добавленными НММ-выровненными последовательности из NR, содержали следующие количества последовательностей: ~50 000 V-классов; ~10 000 С-классов; ~10 000 Iклассов. Этап 5. Удаление избыточных и похожих последовательностей. Ожидалось, что эти выравнивания будут смещаться к часто наблюдаемым последовательностям, со снижением частоты появления редких последовательностей и последовательным снижением разнообразия последовательности. Например, ожидался большой уклон в V-классе выравнивания последовательности Ig-укладки к мышиной человеческой переменной иммуноглобулина и доменов. Так как сверхпредставление специфичных типов последовательности ограничивает полноценность исследований ковариации, был создан инструмент фильтрования, он снижал избыточность выравнивания. Инструмент использовал новый эвристический алгоритм, чтобы найти последовательности с >80%-ной идентичностью к друг другу, и удалял их из выравниваний, т.е. проценты тождественности были вычислены для всех пар последовательности. Значения идентичности были тогда сгруппированы в группы процента идентичности (т.е. 99%-й бин, 98%-й бин, 97%-й бин и т.д.). Во время сокращения каждого бина последовательности каждого мусорного ведра оценивались, уменьшая счет остатка непромежутка, и тогда их весом последовательности Henikoff (Henikoff S и Henikoff JG, J. Молекулярная масса. Biol. (1994), 243: 184-199). После этого этапа остающееся количество последовательностей в каждом выравнивании было: 2 786 Vклассов; 1 587 I-классов; и 518 С-классов. Этап 6. Удаление пробелов и создание окончательного выравнивания. В окончательных выравниваниях столбцы, которые не соответствовали состояниям НММ профиля, были удалены. Поэтому в то время как многие из последовательностей содержали больше аминокислот, чем заключительная длина выравнивания, длины были сокращены, чтобы избежать вычислений на менее информативных областях промежутка выравнивания. Заключительные количества остатков (включая промежутки) в пределах выравниваний были 144 для V-класса, 60 для I-класса и 111 для С-класса. D. Общее описание заключительного выравнивания. а) V-Класс. После того как был наложен заключительный 80%-ный фильтр, 2786 последовательностей V-класса могли быть разделены на три категории: (1) вариабельный генный класс мммуноглобулина, 49%, которые включают оба VH и VL домена разнообразных иммуноглобулинов; (2) Т-лимфоцитарные гены Vкласса Рецептора, 16%, которые содержали гипервариабельный домен; и (3) Другие гены V-класса, 35%. Гены V-класса иммуноглобулина берутся из огромного разнообразия разновидностей в пределах от хрящевой рыбы к приматам. Был уклон к человеческим последовательностям V-класса (537 из 1272 последовательностей). Однако другие позвоночные разновидности были только минимально представлены: мышь (33), корова (5), верблюд (23), лама (31), макака (17), цыпленок (6) и т.д. Т-лимфоцитарный набор рецептора последовательностей был почти как разнообразный в пределах от рыбы примату и не содержал уклон к человеческим последовательностям. "Другая" категория включала большое количество раз- 133 - 015992 нообразных последовательностей без реальных подкатегорий, включающих более чем 1-2% остающихся последовательностей. "Другая" категория содержала еще более широкое множество разновидностей, включая хордовых животных (прежде всего), хрящевую рыбу, цефалоидов и насекомых. b) С-Класс. После того как был наложен заключительный 80%-ный фильтр, 2786 последовательностей V-класса могли быть разделены на три категории: (1) вариабельный генный класс иммуноглобулина, 49%, которые включают оба VH и VL домена разнообразных иммуноглобулинов; (2) Т-лимфоцитарные гены Vкласса рецептора, 16%, которые содержали гипервариабельные домены; и (3) Другие гены V-класса, 35%. Гены V-класса иммуноглобулина берутся из огромного разнообразия разновидностей в пределах от хрящевой рыбы к приматам. На подкатегорию иммуноглобулина С-класса не оказал влияние примат или даже млекопитающие последовательности (только 3 человеческих последовательности оставались нефильтрованными: IgE-CH4, CL каппы и CL лямбды). Подкатегория MHC также колебалась от хрящевой рыбы приматам, и также показал, что немного склоняет к одной эволюционной группе. "Другая" категория С-класса содержала много неизвестных белков, очень маленькую подкатегорию различного бета-2microglobulins, и много других белков, которые не наблюдались с частотой, заслуженной подкатегории. с) I-Класс. У I-класса не было никаких ясных подкатегорий. Титан или подобные титану молекулы обычно неожиданно возникали также, как и адгезия клеток или молекул. Е. Расчет статистики ковариаций. Сила корреляции (в терминах φ-значение) и значение (в терминах χ2-значения) ковариаций между всеми возможными парами аминокислот в выравниваниях было вычислено на основании признанных в уровне техники способов, но включало следующие изменения: 1) промежутки были включены как различный тип остатка; (2) взвешивание схемы по Хеникову не было выполнено; (3) тождества среднего числа последовательности (SAI) не использовались, чтобы отфильтровать коварьирующие пары; (4) χ2 значения были вычислены, используя основанный на событиях счет (количество возникновений), а не частоты; и (5) о коварьирующих парах не сообщали в соответствии с программой, если они не наблюдались минимальное количество раз. Две группы статистики были созданы, первое (меньший набор) с сокращением случаев до 10 и второй (намного больший набор) с сокращением числа случаев до 6 событий. Способность вычислить эти параметры на любом данном выравнивании последовательности была закодирована в на Java и проверена на Java Runtime Engine (JRE) version 1.4.2. На основании количества положений в пределах выравнивания и в общей сложности 23 возможных остатка в каждом положении (включая промежутки, В и Z неоднозначные остатки), было 2,4 млн корреляций, вычисленных для С-класса, 700 тыс., вычисленных для I-класса, и 4,1 млн вычислены для Vкласса. Фиг. 126 показывает значения φ для V-класса с высокими χ2 значениями, φ оценивает диапазон от -1 до+1. Поскольку положительные значения χ перемещаются от 0 (т.е. k+1), прочность корреляции (т.е. ковариация) между двумя аминокислотами в определенных положениях в пределах увеличений выравниваний. Отрицательные корреляции (т.е. наличие одной аминокислоты на одном сайте в выравнивании, вызывающем отсутствие другой специфичной аминокислоты на втором сайте) увеличиваются по мере перемещения φ в сторону -1. Сокращения для того, что является реальной ковариацией, несколько произвольны, но ковариации со значением χ> 0,5 сильно коррелированы друг с другом. Таким образом, согласно фиг. 126, только 370 из возможных 2,4 миллионов корреляций в пределах С-класса сильны. Однако сообщалось, что корреляции выше 0,3 также важны и увеличивают число положительных корреляций, наблюдаемых для всех трех классов, приблизительно в 10 раз. Эти корреляции представляют очень маленькую, но важную часть набора данных, который используется для дальнейших исследований, генерации белковых проектов или прогнозирования функциональных положений остатка. F. Валидация статистики ковариаций. Для валидации сильных ковариаций используется несколько критериев, которые были получены из базы данных Ig-Fold, они значительны и значимы, даже если не считать статистической силы, основанной на вычислениях. Первый критерий должен проанализировать, был ли тренд между остатками, которые коварьировали друг с другом и их близостью в Ig-укладках известной структуры. Предыдущие исследования продемонстрировали, что корреляция между коварьированием остатков и их близостью к друг другу действительно существует - хотя они очень слабы - в согласии с нашими результатами. Второй критерий - генерировали ли вычисления ковариации Ig-укладки известные связи между положениями аминокислот, которые, как уже сообщали, существовали в пределах известных субпопуляций Igукладки. Один четкий пример связан с N-концом человеческих/мышиных укладок вариабельной тяжелой цепи IgG (часть V-класса). Остатки 6-10, как известно, принимают очень специфичные конформации, основанные на сохранении коварьирования пар аминокислот (Ewert S. и др., Methods (2004), 24: 184-199). Две из трех пар, о которых сообщают, что коварьирования аминокислот были найдены, характеризуются φ выше 0,3 - много больше очевидного фона набора данных. - 134 - 015992 Пример 18. Получение PRIMATIZED® р5Е8 четырехвалентного антитела, включающего обычный р5Е8 scFv. PRIMATIZED® p5E8G1 является химерным макака/человек (PRIMATIZED®) моноклональным антителом, включающим тяжелые и легкие вариабельные области макаки, гибридизованные с человеческой гамма 1 и константной областью каппы соответственно. PRIMATIZED® p5E8G1 связывается с человеческим CD23, рецептором низкого сродства для IgE(FcεRII) (Mavromatis и Cheson. 2003. J. Clin. Oncol. 21:1874; US Patent Application 20030059424). Четырехвалентное PRIMATIZED® р5Е8 антитело было построено с использованием подобной стратегии, как это описало в примерах 1-8. PRIMATIZED® p5E8 scFv, используемый для того, чтобы строить четырехвалентное антитело, состоит из р5Е8 VL и последовательности области VH, привязанных коротким линкером к VL→(Gly4Ser)3 линкер→ориентация VH, и описан подробно в примере 19. Правильные последовательности были подтверждены секвенированием ДНК. ДНК плазмиды использовалась, чтобы преобразовать клетки СНО DG44 для устойчивой продукции белка антитело. Фиг. 106 показывает последовательность ДНК С-конца тяжелой цепи четырехвалентного PRIMATIZED® p5E8 антитела с включением обычного scFv. Фиг. 107 показывает последовательность аминокислоты С-конца тяжелой цепи четырехвалентного PRIMATIZED® p5E8 антитела с включением обычного scFv. Фиг. 108 показывает последовательность ДНК PRIMATIZED® p5E8 легкой цепи. Фиг. 109 показывает последовательность аминокислот PRIMATIZED® p5E8 легкая цепь. Пример 19. Получение примитизированных белков р5Е8 scFv и Fab. PRIMATIZED® p5E8 scFvs в обеих ориентациях (VL линкер (Gly4Ser)3 R VH (VL/VH) и VH линкер (Gly4Ser)3 VL (VH/VL)) были субклонированы способом ПЦР-амплификации с использованием плазмид, описанных в US патентной заявке 20050163782. Олигонуклеотиды, использованные в конструкции, показаны в табл. 22. Приматизированные р5Е8 scFv (VL/VH) были получены способом ПЦР с использованием прямого праймера P5E8-VL01F, включающего 29 оснований, кодирующих часть лидерной последовательности gpIII, за которой следуют 15 оснований последовательности, комплементарной гену N-конца легкого вариабельного домена р5Е8, и обратный праймер, P5E8-VH01R, который включает 15 оснований последовательности, комплементарной гену р5Е8 С-конца вариабельного домена тяжелой цепи, за которым следует уникальный смежный сайт рестрикции эндонуклеазы Sal I (сайт рестрикции эндонуклеазы подчеркнут). Точно так же PRIMATIZED p5E8 scFvs (VH/VL) был построен способом ПЦР, используя прямой праймер P5E8-VH01F, который включает 29 оснований, кодирующих часть gpIII ведущей последовательности, сопровождаемый 18 основаниями последовательности, комплементарной гену р5Е8 вариабельного N-концевого тяжелого домена, и обратный праймер, P5E8-VL01R, который включает 12 оснований последовательности, дополнительной к р5Е8 вариабльному С-концевому легкому домену, сопровождаемой уникальным смежным Sal I сайтом эндонуклеазы (сайт эндонуклеазы подчеркнут). Таблица 22 Олигонуклеотиды для ПЦР амплификации обычного PRIMATIZED® p5E8 scFv После амплификации ПЦР праймер P5E8-Leader01 был добавлен к обеим реакциям для второй реакции ПЦР. Праймер P5E8-Leader01 включает уникальный Nde сайт эндонуклеазы, сопровождаемый 25 основаниями, кодирующими часть N-конца gpIII последовательности лидера, сопровождаемой 22 основаниями, комплементарными 5' концам P5E8-VL01F и P5E8-VH01F и ПЦР амплифицировали опять. Продукты ПЦР, соответствующие ожидаемым размерам, были растворены электрофорезом агарозного геля, иссечены и очищены с использованием Millipore Ultrafree-DA extraction kit согласно инструкциям изготовителя (Millipore; Бедфорд, Массачусетс). Очищенные продукты ПЦР были впоследствии усвоены с Nde I и Sal I и клонированы в Nde I/Sal I сайты модифицированного Е.coli вектора экспрессии, разработанного, чтобы делать рекомбинантную белковую экспрессию под контролем индуцибельного ara С промотора. - 135 - 015992 Вектор экспрессии содержал модификацию, кодирующую уникальный Nde I, перекрывающую стартовый кодон ВНА10 scFv. Индивидуальные реакции лигирования были выполнены с каждым из очищенных продуктов ПЦР геля и усвоенным вектором экспрессии, и часть каждой из смесей лигирования использовалась, чтобы преобразовать Е.coli XL1-синее напряжение. Устойчивые к ампициллину колонии скринировались, и анализ сиквенса ДНК подтвердил правильную последовательность конца р5Е8 (VH/VL) кодирование pIEH-162 и р5Е8 (VL/VH) кодирование pIEH-163 конструкции. ДНК последовательности аминокислоты и р5Е8 (VL/VH) scFv показаны на фиг. 110 и 111 соответственно. ДНК последовательности аминокислоты и р5Е8 (VH/VL) scFv показаны на фиг. 112 и 113 соответственно. Для экспрессии обычного р5Е8 scFv, недавно изолированные колонии штамма Е.coli W3110 (АТСС, Manassas, Va. Cat. № 27325), трансформированного плазмидами pIEH-162 и pIEH-163, были выращены и любые супернатанты культуры или экстракты периплазмы были препарированы, как описано в примере 4. PRIMATIZED® p5E8 Fab был приготовлен ферментативным усвоением PRIMATIZED® p5E8 IgG после применения способов, описанных в примере 1. Очищенный Fab был сконцентрирован к диапазону 2-11 мг/мл. Концентрации Fab были определены, используя ε280 нм=мг на 1,5 мл-1⋅см-1. Пример 20. Термическая стабильность обычных антител р5Е8 scFv. Поскольку была получена очень хорошая корреляция между значениями Т50, полученными способом термической проверки, описанным в примерах 4 и 5, и значениями Т50, расчитанными способом DSC (r2=0,93). Для определения относительной термической стабильности р5Е8 (VL/VH) и р5Е8 (VH/VL) scFv был использован способ термической проверки. Способ термической проверки применялся, как описано в примерах 4 и 5, за искличением того, что для покрытия плат был использован растворимый антиген CD23 в концентрации 1 мкг/мл, и концентрация меченых европием антител (Eu-labelled anti-6 His antibody (Perkin Elmer, Boston, MA, Cat. № AD0109)) была увеличена до 250 нг/мл. Согласно полученным результатам величина Т50 для р5Е8 (VL/VH) составляет 38°С, а для р5Е8 (VH/VL) немного ниже и составляет 34°С (фиг. 114). Поскольку оба scFv имели заметно низкие величины Т50, а р5Е8 (VL/VH) был немного более термостабилен, именно он был выбран для дальнейшей модификации. Пример 21. Конструкция молекул р5Е8 scFv с улучшенной термической стабильностью. Индивидуальные варианты и библиотеки, включающие требуемые аминокислотные замены в обычном р5Е8 (VL/VH) scFv по методикам, приведенным в примерах 3 и 5, были созданы, как это было ранее описано, с помощью олигонуклеотидов, приведенных в табл. 23. В табл. 23 вместе с каждым названием олигонуклеотиндов дана ссылка на соответствующую замену аминокислоты в VH или VL с номером позиции согласно системе нумерации Кэбата. В графе "Обоснование" дана ссылка на использованный способ. Упомянутые способы детально описаны в примере 5 supra. Мутагенные остатки обозначены заглавными буквами. Пары олигонуклеотидов для создания дисульфидной связи VH/VL помещены в рамку. Использованы следующие сокращения: "СОМР" - компьютерный анализ, "COVAR'' - ковариационный анализ, "CONS" - консенсусный счет, "INTER-VH/VL" - дизайн Интерфейса, "SS" - VH/VL дисульфидная связь и "TBD" - следует определить. - 136 - 015992 Таблица 23 Олигонуклеотиды и обоснования для конструкции разновидностей р5Е8 (VL/VH) sCFv - 137 - 015992 Позиции, являющиеся мишенями для мутагенеза, указаны подчеркиванием. Неопределенные строго основания обозначены следующим образом: W=А или Т; V=A, или С, или G; Y=С или Т; S=С или G; М=А или С; N=А, или С, или G, или Т; R=А или G; K=G или Т; В=С, или G, или Т (J. Biol Chem. 261(1):13-7 (1986)). Трансформированные индивидуальные колонии были отобраны в 96-луночные платы и после культивирования проскринированы согласно способам, детально описанным в примере 5. Трансформированные культуры выращивали в течение ночи в среде для экспрессии, на основе SB (Teknova, Half Moon Bay, Ca. Cat. № S0140), включающей 0,6% глицин, 0,6% Тритон X100, 0,02% арабинозу и 50 мкг/мл карбенициллина при 37 или 32°С. После термической проверки агрегировавший материал удаляли центрифугированием и измеряли в растворимом CD23 DELFIA, как описано в примере 3. Данные измерений были обработаны с помощью программного обеспечения Spotfire DecisionSite software (Spotfire, Somerville, Ma) и выражены в виде отношения значений DELFIA, наблюдаемых при термической проверке к начальной температуре для каждого клона. Клоны, воспроизводимо дающие отношение, не менее чем в 2 раза большее, чем наблюдаемое для родительской плазмиды, считались хитами. Плазмидная ДНК этих позитивных клонов была выделена способом mini-prep (Wizard Plus, Promega, Madison, WI) и снова ретрансформирована в Е.coli W3110 для повторного измерения способом термической проверки, а также для определения последовательности ДНК. Результаты первоначальных и повторных измерений приведены в табл. 24. Некоторые из стабилизированных молекул scFv изобретения имели улучшенную связывающую активность (Т50>38°С) по сравнению с обычным р5Е8 scFv. В частности, значения Т50 для р5Е8 с позицией в библиотеке VH6 (E6Q), с позицией в библиотеке VH49 (S49G и S49A), с позицией в библиотеке VH43 (Q43K), с позициями в библиотеке VH72 (E72D и E72N) и с позицией в библиотеке VH79 (F79S) демонстрируют увеличение термической стабильности на величину от 4 до 5°C относительно обычного р5Е8 scFv. Значения Т50 для р5Е8 с позицией в библиотеке VL50 (V50D и V50S), с позицией в библиотеке VL75 (V75I), с позицией в библиотеке VL80 (P80S) и с позициями в библиотеке VL83 (F83A, F83G, F83S и F83T) демонстрируют увеличение термической стабильности на величину от 3 до 7°С по сравнению с обычным р5Е8 scFv. Кроме этого, значения Т50 для р5Е8 с позицией в библиотеке VH32 (N32S) и позицией в библиотеке VH79 (F79Y) демонстрируют увеличение термической стабильности на величину +2°С по сравнению с обычным р5Е8 scFv. Стабилизирующие мутации были идентифицированы с помощью ряда способов, описанных в примере 5 - мутации VH6 (E6Q), VL75 (V75I), VL80 (P80S) и VL83 (F83A, F83G, F83S и F83T) были выведены способом компьютерного анализа, мутация VH32 (N32S) была выведена способом консенсусного счета, четыре мутации VH49 (S49G и S49A), VH43 (Q43K), VH72 (E72D и E72N), VH79 (F79S и F79Y) были выведены способом ковариационного анализа, мутации VL50 (V50D и V50S) были выведены способом VH/VL анализом области контакта, что обосновывает полезность и новизну этих способов. Комбинация мутаций VH43Q и VH32S со стабилизирующими мутациями VH49G, VH72D, или VH49A повышала термостабильность (Т50) для р5Е8 до 53°С, что на 15°С больше, чем эта же величина для обычного р5Е8 scFv. - 138 - 015992 Таблица 24 р5Е8 VH и VL позиции библиотеки, состав библиотеки и результаты скрининга Табл. 25 показывает результаты всестороннего анализа термической стабильности различных индивидуальных стабилизирующих мутаций и их комбинаций, введенных в обычный scFv. Для стабилизирующих мутаций было показано, что в комбинации они дают увеличение термической стабильности в диапазоне от 10 до 15°С по сравнению с обычным р5Е8 scFv. Эти результаты, аналогично приведенным в примере 5, показывают, что улучшения в активности являются аддитивными и способы, описанные в этом изобретении, могут улучшать термическую стабильность второго исследуемого scFv, что демонстрирует общую пригодность этих способов. Таблица 25 Характеристики конструктов р5Е8, использованных для получения различных вариантов белка, и значения Т50, полученные способом термической проверки na=неприменимы; аа=аминокислота; TBD=следует определить. - 139 - 015992 Пример 22. Продукция стабилизированных четырехвалентных антител р5Е8. Стабилизированные р5Е8 scFv изобретения использованы для создания тетравалентных антител, гибридизованных на N-конце и С-конце и имеющих конфигурацию, аналогичную показанной на фиг. 20. А. Конструкция тетравалентных антител NH-p5E8. Для конструкции тетравалентных антител NH-p5E8, аналогичных тем, что описаны в примере 7 supra, использованы ДНК р5Е8 scFv, описанные в примере 21. Чтобы связать р5Е8 scFv с N-концом сформированной тяжелой цепи приматизированного® р5Е8 IgG, использован линкер (Gly4Ser)5. Конструкция молекулы следующая: р5Е8 scFv - линкер (Gly4Ser)5 - тяжелая цепь приматизированного® р5Е8 IgG. Эта молекула соединяется с легкой цепью и образует тетравалентное антитело. Правильность последовательности ДНК может быть подтверждена путем ее анализа. Конструкт мог быть использован для трансфекции клеток СНО, как это описано в примере 8 для продукции больших количеств тетравалентных антител NH- p5E8. Трансфицированные клетки СНО могут быть проскринированы на связывание с иммобильзованным антигеном CD23 способом DELFIA. 96-луночные платы, например (MaxiSorp, Nalge Nunc, Rochester, NY, Cat. № 437111) можно покрыть растворимым антигеном CD23 в концентрации 1 мкг/мл, растворенным в 0,1 M натрий-карбонатном буфере, рН 9,5. Платы покрывают в течение ночи при 4°С и блокируют в течение 1 ч при комнатной температуре буфером для измерения DELFIA (DAB, 10 мМ Tris HCl, 150 мМ NaCl, 20 мМ EDTA, 0,5% BSA, 0,02% Tween 20, 0,01% NaN3, рН 7,4). Платы отмывают 3 раза DAB, не включающим BSA (отмывочный буфер), затем добавляют в платы исследуемые образцы, растворенные в DAB, в конечном объеме 100 мкл. Платы инкубируют в течение 1 ч на шейкере при комнатной температуре и затем отмывают 3 раза отмывочным буфером, чтобы удалить несвязавшийся материал. Связавшиеся антитела определяют, добавляя в ячейку 100 мкл DAB, включающего 250 нг/мл меченых Eu античеловеческих антител (Perkin Elmer, Boston, MA, Cat. № 1244-330), и инкубируют при комнатной температуре на шейкере в течение 1 ч. Платы трижды отмывают отмывочным буфером и добавляют в каждую ячейку 100 мкл усиливающего раствора DELFIA (Perkin Elmer, Boston, MA, Cat. № 4001-0010). Затем инкубируют в течение 15 мин и определяют Eu по методике на приборе для считывания плат Victor 2 plate reader (Perkin Elmer, Boston, MA). В. Конструирование С-р5Е8 четырехвалентного антитела. Молекулы р5Е8 scFv ДНК, описанные в примере 21 выше, используются, чтобы построить С-р5Е8 четырехвалентное антитело, как описано в примере 7 выше. Сер (Gly4Ser)3 пептидный линкер используется, чтобы соединить р5Е8 scFv с карбоксильной конечной группой PRIMATIZED® р5Е8 IgG тяжелой цепи. Структура молекулы - PRIMATIZED® p5E8 IgG тяжелая цепь - Сер (Gly4Ser)3 линкер-р5Е8 scFv. Эта молекула объединяется с легкой цепью, чтобы сформировать четырехвалентное антитело. Правильная последовательность была бы подтверждена анализом последовательности ДНК. Конструкция могла использоваться для трансфицирования ячеек СНО, как описано в примере 8, для увеличенного производства С-р5Е8 четырехвалентного антитела. Ячейки Transacted CHO могут быть показаны на экране, как описано выше. Эквиваленты. Специалисты понимают или смогут путем рутинного экспериментирования установить множество эквивалентов приведенным выше вариантам осуществления настоящего изобретения. Такие эквиваленты также охватываются объемом нижеприведенной формулы изобретения. - 140 - 015992 Перечень последовательностей - 141 - 015992 - 142 - 015992 - 143 - 015992 - 144 - 015992 - 145 - 015992 - 146 - 015992 - 147 - 015992 - 148 - 015992 - 149 - 015992 - 150 - 015992 - 151 - 015992 - 152 - 015992 - 153 - 015992 - 154 - 015992 - 155 - 015992 - 156 - 015992 - 157 - 015992 - 158 - 015992 - 159 - 015992 - 160 - 015992 - 161 - 015992 - 162 - 015992 - 163 - 015992 - 164 - 015992 - 165 - 015992 - 166 - 015992 - 167 - 015992 - 168 - 015992 - 169 - 015992 - 170 - 015992 - 171 - 015992 - 172 - 015992 - 173 - 015992 - 174 - 015992 - 175 - 015992 - 176 - 015992 - 177 - 015992 - 178 - 015992 - 179 - 015992 - 180 - 015992 - 181 - 015992 - 182 - 015992 - 183 - 015992 - 184 - 015992 - 185 - 015992 - 186 - 015992 - 187 - 015992 - 188 - 015992 - 189 - 015992 - 190 - 015992 - 191 - 015992 - 192 - 015992 - 193 - 015992 - 194 - 015992 - 195 - 015992 - 196 - 015992 - 197 - 015992 - 198 - 015992 - 199 - 015992 - 200 - 015992 - 201 - 015992 - 202 - 015992 - 203 - 015992 - 204 - 015992 - 205 - 015992 - 206 - 015992 - 207 - 015992 - 208 - 015992 - 209 - 015992 - 210 - 015992 - 211 - 015992 - 212 - 015992 - 213 - 015992 - 214 - 015992 - 215 - 015992 - 216 - 015992 - 217 - 015992 - 218 - 015992 - 219 - 015992 - 220 - 015992 - 221 - 015992 - 222 - 015992 - 223 - 015992 - 224 - 015992 - 225 - 015992 - 226 - 015992 - 227 - 015992 - 228 - 015992 - 229 - 015992 - 230 - 015992 - 231 - 015992 - 232 - 015992 - 233 - 015992 - 234 - 015992 - 235 - 015992 - 236 - 015992 - 237 - 015992 - 238 - 015992 - 239 - 015992 - 240 - 015992 - 241 - 015992 - 242 - 015992 - 243 - 015992 - 244 - 015992 - 245 - 015992 - 246 - 015992 - 247 - 015992 - 248 - 015992 - 249 - 015992 - 250 - 015992 - 251 - 015992 - 252 - 015992 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения стабилизированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с улучшенными биофизическими свойствами, которые содержат стабилизированный VH домен и стабилизированный VL домен, полученные из VH и VL доменов антитела-кандидата, в котором выравнивают исправленный исходный набор аминокислотных последовательностей, которые относятся к надсемейству иммуноглобулинов (Ig), с получением набора выравнивания, затем определяют ковариацию между по меньшей мере двумя позициями аминокислотных остатков с получением набора ковариаций, идентифицируют нековарьирующие аминокислотные остатки в VH или VL доменах антителакандидата, причем нековарьирующими аминокислотными остатками являются те, которые не соответствуют ни одной ковариации в наборе ковариаций, после этого заменяют по меньшей мере один нековарьирующий аминокислотный остаток в VH или VL доменах антитела-кандидата аминокислотным остатком в соответствующем положении набора выравнивания, который соответствует по меньшей мере одной ковариации в наборе ковариаций, с получением стабилизированного антитела или его фрагмента. 2. Способ по п.1, в котором биофизическое свойство выбрано из группы, включающей термическую стабильность, профиль рН развертывания, стабильное удаление гликозилирования, растворимость, биохимическую функцию и их комбинации. 3. Способ по п.1, в котором стабилизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из группы, включающей доменное антитело, гуманизированное антитело, человеческое антитело, нечеловеческое моноклональное антитело, химерное антитело, биспецифичное антитело, scFv антитело, scFv-содержащее антитело, антитело с удаленным доменом и комбинации любых фрагментов указанных антител. 4. Способ по п.1, в котором аминокислотные остатки в наборе ковариаций представляют собой часть структурного признака, выбранного из группы, включающей дисульфидный мостик, солевой мостик, фрагмент лигандсвязывающего кармана или поверхности, Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия, водородные связи и/или заряд-зарядное взаимодействие. 5. Способ по п.1, в котором аминокислотные последовательности в наборе выравнивания обладают менее чем 95% идентичностью по отношению друг к другу. 6. Способ по п.1, в котором получение исправленного исходного набора включает создание набора трехмерных структур Ig-укладки, причем указанные структуры Ig-укладки выбраны из группы, включающей укладку V-класса, I-класса, С1-класса и С2-класса и комбинации указанных классов Ig-укладки, фильтрование указанного набора структур Ig-укладки исключением структур Ig-укладки, которые содержат последовательности с разрывами, 100% идентичностью, аберрантной длиной или показывающие неправильную укладку, проведение структурного выравнивания между структурами Ig-укладки внутри отфильтрованного набора структур, проведение выравниваний последовательностей из структурных выравниваний, при котором аминокислоты из последовательности одной структуры выравнивают с аминокислотами из последовательности второй структуры на основе кратчайшего расстояния между α-углеродами полипептидных каркасов, построение скрытых марковских моделей (НММ), основанных на структурных выравниваниях последовательностей для одного из классов Ig-укладки, проведение поиска в базе данных белковых последовательностей с использованием по меньшей мере одной НММ, специфичной для класса Ig-укладки, при котором извлекаются записи о хранящихся в базе данных белковых последовательностях, совпадающих по НММ, и валидацию отнесения класса Ig-укладки белковых последовательностей, записи о которых извлечены в результате проведения поиска с использованием по меньшей мере одной НММ, при помощи аннотированной базы данных белковых доменов, где указанные извлеченные записи о последовательностяхкандидатах Ig-укладки белка сохраняются только в том случае, если их отнесение к классу Ig-укладки в аннотированной базе данных белковых доменов является статистически значимым. 7. Способ по п.1, в котором выравнивание дополнительно включает удаление лишних или имеющих высокую степень сходства аминокислотных последовательностей из набора выравнивания и удаление столбцов в выравнивании, которые не совпадают в НММ-профиле. 8. Способ по п.1, в котором определение ковариации включает по меньшей мере одну стадию, выбранную из группы, включающей идентификацию разрывов как признаков аминокислот различного типа, определение веса аминокислот, причем указанное определение отлично от определения веса уникальности по Хеникову, фильтрацию коварьирующих пар, в которой не используются средние идентичности последовательностей (SAI), отсечение по событию, при котором коварьирующие пары не регист- 253 - 015992 рируются, если только они не наблюдались некоторое минимальное количество раз, и при котором отсечение по событию происходит по меньшей мере примерно 2 раза, и комбинацию двух или более указанных стадий. 9. Способ по п.1, в котором определение ковариации включает определение статистической значимости вариации с использованием χ2-анализа. 10. Способ по п.9, в котором значения χ2 определяют при помощи формулы, основанной на событиях. 11. Способ по п.10, в котором указанная формула имеет следующий вид: где p(i) и p(j) представляют собой частоты встречаемости аминокислотных остатков любых двух интересующих типов в положениях i и j соответственно в выровненном наборе последовательностей; c(i, j) представляет собой количество случаев присутствия p(i) и p(j) в одной и той же последовательности; c(t) представляет собой общее количество последовательностей в выровненном наборе последовательностей, при этом частоты встречаемости аминокислотных остатков представляют собой количество случаев присутствия аминокислотного остатка определенного типа в определенном положении в выровненном наборе последовательностей, разделенное на общее количество последовательностей в выровненном наборе. 12. Способ по п.1, в котором определение ковариации включает определение коэффициента корреляции (φ) по формуле где aibj - количество случаев присутствия аминокислотных остатков типа а или b в одной и той же последовательности в положениях i и j соответственно; - количество случаев отсутствия аминокислотных остатков обоих типов в одной и той же последовательности; j - количество случаев присутствия аминокислотного остатка типа а при отсутствии аминокислотного остатка типа b; - количество случаев отсутствия аминокислотного остатка типа а при наличии аминокислотного остатка типа b, при этом коэффициент корреляции (φ) определяет статистическую достоверность ковариации. 13. Способ по п.1, в котором определение ковариации включает в себя определение ковариационных счетов только для тех ковариаций, которые удовлетворяют пороговому значению статистической достоверности. 14. Способ по п.13, в котором ковариационные счета определяют только для тех ковариаций, которые обладают значением выше или ниже порогового значения χ2 или значения φ. 15. Способ по п.14, в котором положениям аминокислотных остатков последовательностикандидата присваивают положительные специфические ковариационные счета для положительных ковариаций, коэффициент корреляции φ которых составляет от примерно +0,25 до примерно +1,0. 16. Способ по п.14, в котором положениям аминокислотных остатков последовательностикандидата присваивают отрицательные специфические ковариационные счета для отрицательных ковариаций, коэффициент корреляции φ которых составляет от примерно -0,25 до примерно -1,0. 17. Способ по п.1, который дополнительно включает получение структурных моделей доменов VH или VL образца антител и доменов VH или VL антитела-кандидата, идентификацию аминокислотных остатков области белок-белкового взаимодействия в домене VH или VL образца антитела, которые важны для стабилизации указанной области, идентификацию каркасных аминокислотных остатков, которые коварьируют с идентифицированными аминокислотными остатками области контакта, и замещение по меньшей мере одного соответствующего остатка области контакта или каркасной области домена VH или VL антитела-кандидата на соответствующие идентифицированные аминокислотные остатки указанных областей. 18. Способ по п.17, в котором VH домен или VL домен образца антитела обладает укладкой надсемейства Ig. 19. Способ по п.17, в котором аминокислотные остатки области контакта расположены в области контакта VH/VL доменов VH домена или VL домена антитела-кандидата. 20. Способ по п.1, который дополнительно включает определение консенсусного счета по меньшей мере для одного положения аминокислотного остатка доменов VH или VL антитела-кандидата, комбинирование консенсусных счетов с данными набора ковариации и выбор замен аминокислотных остатков, - 254 - 015992 предсказанных для стабилизации VH домена или VL домена антитела-кандидата, причем выбор основан на комбинации консенсусных счетов с данными ковариации. 21. Способ по п.20, в котором определение консенсусного счета включает получение исправленного исходного набора полипептидных последовательностей, принадлежащих к надсемейству Ig, выравнивание последовательностей исходного набора с получением набора выравнивания и определение частоты встречаемости исследуемого аминокислотного остатка для каждого положения внутри VH домена или VL домена антитела-кандидата, при котором частота определяется путем суммирования количества случаев наличия указанного аминокислотного остатка в соответствующем положении среди последовательностей выровненного набора и деления полученного значения на общее количество последовательностей в исходном наборе. 22. Способ по п.21, который включает определение консенсусной последовательности, в которой аминокислотный остаток в каждом положении последовательности соответствует наиболее распространенному аминокислотному остатку для данного положения в выровненном наборе, определение частоты встречаемости консенсусной аминокислоты для каждого аминокислотного положения внутри консенсусной полипептидной последовательности, при котором частота определяется путем суммирования количества случаев наличия указанного аминокислотного остатка в соответствующем положении среди последовательностей выровненного набора и деления полученного значения на общее количество последовательностей в исходном наборе, и деление частоты исследуемого аминокислотного остатка на частоту консенсусного аминокислотного остатка с получением консенсусного счета. 23. Стабилизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные способом по любому из пп.1-22, которые включают стабилизированные домены VH и VL и по меньшей мере одну замену нековарьирующего аминокислотного остатка коварьирующим в соответствующем положении. 24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.23, термическая стабильность которых, измеренная как T50, по меньшей мере на 10°С выше, чем термическая стабильность соответствующего антитела-кандидата. 25. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.23, термическая стабильность которых, измеренная как Т50, превышает 67°С по результатам анализа термической проверки. 26. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.23, которые имеют домены VH и VL со стабилизированной областью контакта между ними и по меньшей мере одну стабилизирующую замену по сравнению с антителом-кандидатом в аминокислотном положении непосредственно в области контакта. 27. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.23, которые являются молекулами scFv, включающими линкер, соединяющий между собой домены VH и VL. 28. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.27, в которых линкер содержит SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 20. 29. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.23-28, термическая стабильность которых измеряется методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), спектроскопии кругового дихроизма (КД), флуоресцентной эмиссионной спектроскопии, спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или посредством анализа термической проверки. 30. Многовалентная антигенсвязывающая молекула, которая включает стабилизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.23-29, которые генетически гибридизованы со вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом. 31. Полинуклеотид, кодирующий стабилизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.23-29 или молекулу по п.30. 32. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.31. 33. Изолированная клетка-хозяин, которая содержит вектор по п.32. 34. Способ продуцирования стабилизированной связывающей молекулы, в котором выращивают клетку-хозяин по п.33 в культуральной среде и очищают стабилизированную связывающую молекулу. 35. Способ продуцирования стабилизированной молекулы в условиях крупномасштабного производственного процесса, в котором выращивают клетку-хозяин по п.34 в условиях, пригодных для крупномасштабного производства и сбора популяции стабилизированных молекул. 36. Применение стабилизированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.23-29 или многовалентной антигенсвязывающей молекулы по п.30 в качестве средства при лечении субъекта, при котором лечение с помощью указанных стабилизированных молекул способно облегчить состояние субъекта. 37. Применение по п.36, в котором указанный субъект страдает от заболевания или расстройства, выбранного из группы, включающей рак, аутоиммунное расстройство или заболевание и неврологическое расстройство или заболевание. - 255 - 015992 Фиг. 1 Фиг. 2 Фиг. 3 Фиг. 4 - 256 - 015992 Фиг. 5 Фиг. 6 Фиг. 7 Фиг. 8 Фиг. 9 - 257 - 015992 Фиг. 10 Фиг. 11 Фиг. 12 Фиг. 13 - 258 - 015992 Фиг. 14 Фиг. 15 Фиг. 16 - 259 - 015992 Фиг. 17 Фиг. 18 Фиг. 19 - 260 - 015992 Фиг. 20 Фиг. 21 Фиг. 22 - 261 - 015992 Фиг. 23 Фиг. 24 Фиг. 25 - 262 - 015992 Фиг. 26 Фиг. 27 - 263 - 015992 Фиг. 28 Фиг. 29 - 264 - 015992 Фиг. 30 Фиг. 31 - 265 - 015992 Фиг. 32 Фиг. 33 - 266 - 015992 Фиг. 34 Фиг. 35 - 267 - 015992 Фиг. 36 Фиг. 37 - 268 - 015992 Фиг. 38 Фиг. 39 - 269 - 015992 Фиг. 40 Фиг. 41 Фиг. 42 - 270 - 015992 Фиг. 43 Фиг. 44 Фиг. 45 - 271 - 015992 Фиг. 46 Фиг. 47 Фиг. 48 - 272 - 015992 Фиг. 49 Фиг. 50 Фиг. 51 - 273 - 015992 Фиг. 52 Фиг. 53 Фиг. 54 - 274 - 015992 Фиг. 55 Фиг. 56 Фиг. 57 - 275 - 015992 Фиг. 58 Фиг. 59 Фиг. 60 - 276 - 015992 Фиг. 61 Фиг. 62 - 277 - 015992 Фиг. 63 Фиг. 64 - 278 - 015992 Фиг. 65 Фиг. 66 Фиг. 67 - 279 - 015992 Фиг. 68 Фиг. 69 Фиг. 70 - 280 - 015992 Фиг. 71 Фиг. 72 Фиг. 73 - 281 - 015992 Фиг. 74 Фиг. 75 - 282 - 015992 Фиг. 76 Фиг. 77 Фиг. 78 - 283 - 015992 Фиг. 79 Фиг. 80 Фиг. 81 - 284 - 015992 Фиг. 82 Фиг. 83 - 285 - 015992 Фиг. 84 Фиг. 85 - 286 - 015992 Фиг. 86 Фиг. 87 Фиг. 88 Фиг. 89 Фиг. 90 - 287 - 015992 Фиг. 91 Фиг. 92 Фиг. 93 - 288 - 015992 Фиг. 94 Фиг. 95 Фиг. 96 - 289 - 015992 Фиг. 97 Фиг. 98 - 290 - 015992 Фиг. 99 Фиг. 100 Фиг. 101 - 291 - 015992 Фиг. 102 Фиг. 103 - 292 - 015992 Фиг. 104 Фиг. 105 - 293 - 015992 Фиг. 106 Фиг. 107 Фиг. 108 Фиг. 109 - 294 - 015992 Фиг. 110 Фиг. 111 Фиг. 112 Фиг. 113 Фиг. 114 - 295 - 015992 Фиг. 115 Фиг. 116 Фиг. 117 Фиг. 118 - 296 - 015992 Фиг. 119 Фиг. 120 Фиг. 121 - 297 - 015992 Фиг. 122 Фиг. 123 - 298 - 015992 Фиг. 124 Фиг. 125 Фиг. 126 Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2 - 299 -