Метаболизм Пуриновых и Пиримидиновых нуклеотидов

Метаболизм пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов
Гидролиз полинуклеотидов
Как известно, большая часть нуклеиновых кислот в клетке связана с белком в форме нуклеопротеинов. Поступающие с пищей нуклеопротеины разрушается панкреатическими ферментами, а нуклеопротеины ткани - лизосомальными ферментами. Вначале
происходит диссоциация компонентов нуклеопротеинов на белки и нуклеиновые кислоты. Этому способствует кислая среда желудка. Белки затем включаются в обмен вместе с
другими белками пищи, а нуклеиновые кислоты гидролизуются нуклеазами сока железы
(РНКазами и ДНКазами), с образованием смеси полинуклеотидов (рис 8.8). Далее в процесс включаются полинуклеотидазы и фосфодиэстеразы (эндонуклеазы) кишечника Они
довершают гидролиз нуклеиновых кислот до мононуклеотидов. В кишечнике, как правило, образуются 3'-фосфат нуклеотиды, а под влиянием лизосомальных полинуклеотидаз
образуются биологически важные 5'- фосфат нуклеотиды.
Нуклеотиды гидролизуются нуклеотидазами, с образованием нуклеозидов и Фн.
Нуклеозиды, которые обычно рассматриваются как конечный продукт переваривания
нуклеиновых кислот в кишечнике, всасываются. В клетках некоторых тканей, в том числе
Рис 8.8. Схема катаболизма нуклеиновых кислот и нуклеотидов.
и клетках кишечника, нуклеозиды подвергаются фосфоролизу нуклеозид фосфорилазами, с образованием оснований и рибозы 1-Ф (или дезоксирибозы 1-P). Рибоза 1-Ф и рибоза 5-Ф в цитозоле находятся в равновесии и могут быть вновь использованы для синтеза нуклеотидов или вступают в неокислительную часть пенозофосфатного пути.
Пуриновые и пиримидиновые основания также или распадаются далее до конечных продуктов или используются повторно для синтеза нуклеотидов. В клетке существует
интенсивно обмениваемый пул рибонуклеотидов и РНК. Молекулы ДНК и пул дезоксирибонуклеотидов обменивается значительно медленнее.
Тканевые пурины и пиримидины, которые не попадают в пути повторного использования, обычно распадаются и продукты их распада выделяются. Используется лишь
очень небольшое количество пищевых пуринов, а основная масса поступивших с пищей
пуринов распадается. Катаболизм пуринов и пиримидинов не сопровождается значительным высвобождением энергии в сравнении с обменом аминокислот, однако некоторые
продукты распада выполняют определенные физиологические функции, например, конечный продукт катаболизма пуринов у человека мочевая кислота, может служить антиоксидантом, продукт катаболизма пиримидина, β– аланин используется в синтезе активных
пептидов мозга и мышц. Парэнтеральное введение нуклеотидов и нуклеозидов нашло
применение в исследовательской практике. Меченый 3Н –тимидин включается в синтезируемую ДНК без изменений и используется для введения метки в ДНК различных биологических оъектов.
Катаболизм пуриновых нуклеотидов
Конечный продукт катаболизма пурина у человека - мочевая кислота. У других
Рис. 8-9. Реакции распада мочевой кислоты
млекопитающих имеется фермент уратоксидаза которая превращает мочевую кислоту в
более растворимый аллантоин. У человека нет такого фермента, и мочевая кислота, кото-
рая образуется преимущественно в печени, выделяется почками как конечный продукт
обмена пуриновых нуклеотидов. Превращение мочевой кислоты в аллантоин может протекать неферментативно. Эта реакция рассматривается как один из механизмов антиоксидантной защиты клетки у организмов, утративших способность синтезировать аскорбиновую кислоту, а мочевая кислота как важный антиоксидант, заменивший аскорбиновую
кислоту. У некоторых животных аллантоин может распадаться далее до мочевины или аммиака.
От нуклеотидов к основаниям.
Гуаниновые нуклеотиды гидролизуются с образованием гуанозина, который подвергается фосфоролизу до гуанина и рибоза 1-Ф. Гуанин дезаминируется гуанин дезаминазой с образованием ксантина. Аденозин также можно получить по такому пути, однако
внутриклеточные нуклеотидазы у человека не очень активны по отношению к AMФ.
АМФ чаще дезаминируется ферментом аденилат (AMФ) дезаминазой с образованием
ИМФ. Последний далее гидролизуется нуклеотидазой с образованием инозина и после
фосфоролиза превращается в гипоксантин.
Некоторое количество аденозина образуется из S -аденозилметионина в процессах переметилирования. Аденозин дезаминируется до инозина аденозин дезаминазой.
Недостаточность аденозин дезаминазы или пуриновой нуклеозид фосфорилазы ведет к
двум различным болезням иммунодефицита механизмами, которые до конца не раскрыты.
Рис 8-10. Основные пути катаболизма нуклеотидов
При недостаточности аденозин дезаминазы, страдают T и B-лимфоциты, а при
недостаточности фосфорилазы нарушается функция T клеток, а B клетки остаются нормальными. В сентябре 1990 г была успешно применена генинженерная технология для
лечения 4-летней девочки с недостаточностью аденозин дезаминазы.
Катаболизм метилированных (минорных) пуринов зависит от расположения метильной группы. Если метильная группа связана с группой -NH2, она удаляется вместе с
-NH2, и оставшаяся часть обменивается в дальнейшем обычным способом. Если метил
связан с атомом азота гетероцикла, соединение выделяется в неизменном виде с мочой.
От оснований к мочевой кислоте
И адениновые и гуаниловые нуклеотиды превращаются в одно общее промежуточное соединение ксантин. Гипоксантин, возникающий из аденина, окисляется в ксантин
ксантиноксидазой . Гуанин дезаминируется с образованием аммиака и ксантина. Образующийся аммиак переносится к печени в составе глутамина, где используется для синтеза мочевины.
Ксантин, подобно гипоксантину, окисляется кислородом и ксантиноксидазой в
мочевую кислоту с образованием перекиси водорода. У человека, мочевая кислота выделяется, а перекись водорода разрушается каталазой. Высокая активность ксантиноксидазы обнаруживается только в клетках печени и кишечника.
Рис 8.11 Основные пути катаболизма пиримидиновых азотистых оснований
Катаболизм пиримидиновых нуклеотидов
В отличие от пуринов, кольцевая структура пиримидинов разрушается с образованием обычных конечных продуктов катаболизма - β-аминокислот, аммиака и двуокиси
углерода. В катаболизме пиримидиновых нуклеотидов принимают участие нуклеотидазы
и пиримидиновые нуклеотид фосфорилазы, которые превращают мононуклеотиды в свобоные основания. Аминогруппы цитозина и 5-метилцитозина отделяется в форме аммиака..
Дециклизация. Свободные пиримидиновые основания восстанавливаются
НАДФН+Н+. Атомы N2 и C3 пиримидинового кольца выделяются в форме аммиака и
двуокиси углерода соответственно. Оставшаяся часть кольца представляет собой β-аминокислоту . β -аминоизомасляная кислота образуется из тимина или 5-метилцитозина и в
основном затем выделяется почками. Незначительная часть ее после переаминирования
может превращаться в сукцинил-КоА и использоваться в цикле трикарбоновых кислот. Из
цитозина и урацила образуется β-аланин, который может быть использован для синтеза
биологически активных дипептидов карнозина (гис-β-ала) или ансерина (метил гис-βала) в мозге и мышцах.
Продукты распада нуклеотидов могут повторно использоваться (реутилизацироваться)
Продукты катаболизма нуклеиновых кислот могут использоваться клетками в качестве субстратов для синтеза мононуклеотидов и служить дополнительным источником
пула нуклеотидов клеток. Нулеозиды и основания легко проникают через мембраны и могут, при участии системы кровообращения, переносится из клеток одних тканей другим
Повторное использование этих продуктов для синтеза нуклеиновых кислот энергетически
выгоднее для клеток, чем синтез их de novo. Большинство клеток обладает несколькими
путями для преобразования нуклеозидов и свободных оснований назад, до уровня нуклеотидов. Имеются доказательства того, что биосинтез пуринов в печени обеспечивает
предшественниками синтеза ДНК другие клетки, в частности, клетки костного мозга. В
реутилизации продуктов распада нуклеиновых кислот участвуют следующие ферменты:
Фосфорибозил трансферазы. Эти ферменты катализируют образование нуклеозидмонофосфатов из свободных оснований (аденина, гуанина, и гипоксантина) и ФРПФ;
Две ключевых трансферазы включается в утилизацию пуринов: аденозин фосфорибозил-трансфераза (AФРT), которая катализирует следующую реакцию:
аденин + ФРПФ <-----> AMФ+ ФФн
и гипоксантин гуанин фосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ), которая катализирует
следующую реакцию:
ФРПФ +гипоксантин <------> ИМФ + ФФн
2. Нуклеотидазы – катализируют реакции гидролиза мононуклеотидов с образованием нуклеозидов;
3. Нуклеозидкиназы – катализируют реакции фосфорилирования нуклеозидов с образованием нуклеозидмонофосфатов;
Тимидин киназа фермент который катализирует следующую реакцию:
(Дезокси)тимидин + АТФ <=> дТМФ +АДФ
Форма этого фермента, обнаруженная в цитозоле, действует только на дезокситимидин. Тимидин киназа митохондрий катализирует реакцию фосфорилирования дезокситимидина, дезоксицитидина и дезоксиуридина. Обладая довольно широкой специфичностью, митохондриальная тимидин киназа может влиять на фосфорилирование средства,
используемого при лечении СПИДа, 3'-азидо-2'3'- дидезокситимидина (AZT). AZT после
фосфорилирования в митохондриях, может ингибировать репликацию ДНК митохондрий,
что может объяснить кардиотоксический эффект этого средства
Дезоксицитидин киназа, фермент катализирующий фосфорилирование дезоксицитидина, а также дезоксиаденозина и дезоксигуанозина при высоких их концентрациях.
Фермент ингибируется дЦТФ. В отличие от тимидин киназы, активность которой колеблется в течение клеточного цикла, активность дезоксицитидин киназы относительно постоянна.
Дезоксигуанозин киназа I - митохондриальный фермент, катализирующий фосфорилирование дезоксигуанозина.
4. Фосфорилазы – катализируют реакцию фосфоролиза нуклеозидов, с образованием свободных оснований и рибоза-1-фосфата. Эти реакции обратимы и могут участвовать
в образовании нуклеозидов
5. Фосфодиэстеразы –катализируют превращение олигонуклеотидов в нуклеозидмонофосфаты;
6. Эндонуклеазы,- катализируют гидролиз нуклеиновых кислот до олигонуклеотидов
De novo синтез пуриновых и пиримидиновых рибонуклеотидов
Несмотря на возможность повторного использования продуктов распада нуклеиновых кислот для синтеза нуклеотидов, значительная доля потребности клеток в нуклеотидах удовлетворяется синтезом нуклеотидов de novo. Этот процесс использует достаточно
легко доступные компоненты.
ФРПФ. Необходимой предпосылкой для биосинтеза нуклеотидов является синтез
активной формы рибоза-5-фосфата. Рибоза 5-фосфат вступает в реакцию с ATФ, формируя 5-фосфо - α - D-рибозил-1-пирофосфат (ФРПФ).
Реакция катализируется синтетазой ФРПФ. Фермент обнаружен практически во
всех тканях, потому, что ФРПФ служит субстратом для процессов реутилизации нуклео
Рис 8.12. Основные субстраты, используемые в синтезе пуриновых нуклеотидов.
тидов, синтеза пиримидиновых нуклеотидов, и коферментов НАД+ и НАДФ+ (фермент
фосфорибозил трансфераза), синтеза пуриновых нуклеотидов (ФРПФ амидотрансфераза)
de novo.
ФРПФ синтетаза тщательно регулируется рядом соединений (нуклеозидди- и трифосфаты, 2,3-ДФГ), преимущественно обеспечивая соответствие синтеза ФРПФ потребности в
продуктах, в которых это соединение используется.
De Novo синтез пуриновых нуклеотидов.
Основные субстраты, использующиеся в синтезе пуриновых нуклеотидов показаны на рис 8.12. Нуклеотиды «собираются» на рибозе при участии нескольких амидотрансферазных и трансформилирующих реакции. Весь процесс можно разделить на 2
этапа:
•
а) образование ИМФ - исходного предшественника для синтеза главных пуриновых нуклеотидов
•
б) преобразование ИМФ в АМФ и ГМФ.
Для синтеза ИМФ необходимо пять молей ATФ, два моля глутамина (атомы 3,9), один
моль глицина (атомы 4,5,7) , один моль CO2 (атом 6), один моль аспартата(атом 1) и два
моля формиата (атомы 2,8). Формильный фрагмент переносится при участии тетрагидрофолиевой кислоты (ТГФ) в форме N5, N10-метенил-ТГФ и N10-формил-ТГФ (см рис 9-14).
Ключевая реакция. Биосинтез пуриновых нуклеотидов происходит активно в цитозоле печени, где присутствуют все необходимые ферменты в форме макромолекулярного агрегата. Первый шаг - замена пирофосфата ФРПФ амидной группой глутамина ка-
тализируется фосфорибозипирофосфат амидотрансферазой.
Продукт этой реакции - 5-фосфорибозиламин (ФРА). Аминогруппа глутамина,
перенесенная на С1 рибоза-1-фосфата становится атомом N 9 будущего кольца пурина.
Это - ключевая и ограничивающая скорость реакция пути синтеза пуриновых нуклеотидов.
Фермент находится под жестким аллостерическим контролем путем торможения
по типу обратной связи. И AMФ, и ГМФ, и ИМФ порознь ингибируют активность амидотрансферазы, так же как и пары AMФ + ГМФ или AMФ + ИМФ. Этим обеспечивается
тонкий постоянный контроль активности этого фермента. Нуклеотиды ингибируют фермент, способствуя агрегации небольших активных молекул в неактивные агрегаты молекул.
Концентрация ФРПФ также играет существенную роль в регуляции скорости
ключевой реакции. Нормальные внутриклеточные концентрации ФРПФ (которые могут и
колебаться) - ниже Км фермента для ФРПФ, что создает возможности для увеличения
скорости реакции, путем увеличения концентрации субстрата. Фермент мало чувствителен к изменениям концентрации глутамина, (кинетика гиперболическая, а концентрация глутамина соответсвует Км). Очень высокая концентрация ФРПФ может снимать
обычный ингибирующий эффект, вызываемый нуклеотидами, заставляя неактивные
агрегаты фермента диссоциировать с образованием активных молекул. Скорость синтеза
Рис 8.13. Реакции образования ИМФ- первого пуринового нуклеотида
ФРПФ зависит от наличия субстратов синтеза (рибоза-5-фосфата) и каталитической активности ФРПФ-синтазы, активность которой в свою очередь зависит от концентрации
мононуклеотидов , выступающих в роли аллостерических регуляторов.
Cинтез пуринов de novo - сложный, многоступенчатый, потребляющий большое
количество энергии и тщательно регулируемый путь После образования 5-фосфорибозиламина, остальная часть молекулы формируется серией реакций в форме присоединения
химических групп, образуя сначала пяти - а затем шестичленное кольца пурина. (рис. 916). Целая молекула глицина (реакция 1), за счет ATФ присоединяется к аминогруппе
ФРА, образуя глицинамид рибозидфосфат (ГАР). Эту реакцию катализирует глицинамидкиносинтетаза.. Углеродные атомы глицина становятся атомами С4 и С5, а Рис 8-14. Ре-
акции образования АМФ и ГМФ из ИМФ
атом азота - N7 кольца пурина. Этот атом азота формилируется при участии глицинамидрибозилфосфат –формилтрансферазы.(реакция 2). Донором формильной группы является
N5, N10 метенилтетрагидрофолат. Атом углерода этой группы займет положение С8 в
кольце пурина. Вторая молекула глутамина участвует в реакции 3. Амидирование происходит по атому С4 формилглицинамид - рибозилфосфата и катализируется формилглицинамид рибозилфосфатсинтетазой. Присоединяемый атом азота займет положение N3. Замыкание пятичленного (имидазольного) кольца происходит в реакции 4 под влиянием
аминоимидазолилрибозилфосфатсинтетазы. Аминоимидазолрибозилфосфат карбоксилируется (реакция 5) с образованием аминоимидазолкарбоксилат-рибозилфосфата.
α-Аминогруппа аспарагиновой кислоты в следующей реакции (реакция 6) становится донором азота кольца в положении N1.Сукцинильный фрагмент аспарагиновой
кислоты удаляется в форме фумаровой кислоты. В результате возникает аминоимидазолкарбоксиламид – рибозилфосфат, который формилируется (реакция 7) N10-формилтетрагидрофолатом под влиянием формилтрансферазы. Вновь присоединенный атом углерода
займет в молекуле пурина положение 2. ИМФ-циклогидролаза (реакция 8) завершает
формирование пуринового нуклеотида, катализируя замыкание 6-членного кольца пурина.
В результате образуется первый пуриновый нуклеотид – инозиновая кислота, (инозинмонофосфат ИМФ). На образование ИМФ расходуется 4 моля АТФ.
Образование AMФ и ГМФ (рис.9-19). ИМФ может затем превратится или в
AMФ или в ГМФ. Образование ГМФ протекает в 2 стадии. Вначале ИМФ окисляется
Рис.8.15.Основные принципы регуляции синтеза пуриновых нуклеотидов.
при участии НАД зависимой ИМФ дегидрогеназы с образованием ксантинмонофосфата
(КсMP). Последний во второй стадии аминируется при участии амидогруппы глутамина,
используя молекулу АТФ. При этом АТФ гидролизуется до АМФ и ФФн . Атом кислорода в позиции 2 замещается амидной группой глутамина.
Образование АМФ также протекает в 2 стадии. ИМФ вначале аминируется с участием аспарагиновой кислоты. Механизм аминирования подобен реакции биосинтеза пуринового нуклеотида, в которой альфа аминогруппа аспарагиновой кислоты формирует
атом N1 пуринового кольца. Аминирование ИМФ сопровождается образованием промежуточного соединения аденилосукцината. На втором этапе аденилосукцинат теряет атомы
углерода аспарагиновой кислоты в составе фумарата, аминогруппа аспарагиновой кислоты становится 6-аминогруппой кольца аденина.
Регуляция синтеза пуриновых нуклеотидов de novo
В регуляции синтеза пуриновых нуклеотидов можно выделить несколько уровней.
Управление синтезом в целом происходит на этапе фосфорибозиламидотрансферазы Как
видно из рис. 9-18, основную роль в регуляции на этом уровне играет ингибирующее
влияние мононуклеотидов по механизму обратной связи и -или концентрация ФРПФ (см
выше) . . Мононуклеотиды (АМФ и ГМФ). Второй уровень регуляции связан с контролем
за поддержанием соответствующего равновесия между ATФ и ГТФ. АТФ, являясь источником энергии для синтеза ГМФ, стимулирует образование ГМФ. В свою очередь ГТФ,
как источник энергии для синтеза АМФ, стимулирует образование АМФ
Кроме того, каждый их нуклеотидов тормозит свое образование по принципу
обратной связи, действуя на ферменты своего синтеза. ГМФ тормозит преобразование
ИМФ в КсMФ, а AMФ тормозит преобразование ИМФ в аденилсукцинат.
Такое многоуровневое и согласованное действие регуляторов позволяет поддерживать соотношение мононуклеотидов на уровне, обеспечивающем потребности в них в
клетке
Рис 8.16. Основные субстраты синтеза пиримидиновых нуклеотидов
Cинтез пиримидиновых нуклеотидов de novo
Структура пиримидинового кольца проще, и путь биосинтеза пиримидинов короче, чем у пуринов. Амидный азот глутамина и диоксид углерода обеспечивает атомы 2 и 3
кольца пиримидина после преобразования их в карбамоилфосфат (рис 8.16). Другие
четыре атома кольца происходят из аспартата. Так же как и в случае с пуриновыми нуклеотидами, углеводная часть поставляется ФРПФ.
Карбамоилфосфат. Образование пиримидиновых нуклеотидов начинается с синтеза карбамоил фосфата, который протекает в цитозоле тканей, способных к образованию
пиримидинов (наиболее высокая активность синтеза в селезенке, тимусе, ЖКТ и яичках).
Карбамоил фосфат, как упоминалось в главе об обмене аминокислот, используется также
в синтезе мочевины.
Его образование в клетках катализируется двумя разными карбамоилфосфат синтетазами - I и II.Основные различия между ними приведены в таблице 8.3.
Таблица 8.3. Сравнительная характеристика карбомоилфосфат синтетаз I и II
Карбамоил фосфат
Карбамоил фосфат
синтетаза I
синтетаза II
Распределение в тканях
Преимущественно
Во всех тканях
печень
Клеточная локализация
Митохондрия
Цитозоль
Метаболический путь
Синтез мочевины
Биосинтез пиримидинов
Источник азота
Ионы аммония
Аминогруппа глутамина
Карбамоилфосфат синтетаза II (КФС II) предпочитает амид глутамина свободному
аммиаку и не требует N-ацетилглутамата в качестве косубстрата. У человекаn КФСII, аспартат-транскарбамоилазная, и дигидрооротазная активности - это части одного мультифункционального белка.
Образование оротовой кислоты. Ключевая реакция. Первая уникальная для
биосинтеза пиримидинов реакция – это реакция конденсации карбамоилфосфата и аспартата с образованием карбамоиласпартата, катализируемая аспартаттранскарбамоилазой
(реакция
2). Затем дигидрооротаза катализирует отщепление Н2О с образованием кольцевой структуры (реакция -3). Дегидрогеназа дигидрооротата, используя НАД+ в качестве
кофермента, формирует оротовую кислоту - основного предшественника пиримидиновых
Рис. 8.17. Реакции синтеза пиримидиновых нуклеотидов
оснований (реакция 4).
Образование нуклеотидов. Образование мононуклеотида происходит в реакции 5
путем присоединения к оротовой кислоте остатка рибоза-5-фосфата. Донором моносахарида служит ФРПФ. Первый пиримидиновый мононуклеотид - оротидинмонофосфат
(ОМР). Эта реакция катализируется оротат-фосфорибозилтрансферазой — ферментом,
аналогичным гипоксантин-гуанин— фосфорибозилрансферазе и аденин-фосфорибозил
трансферазе, которые участвуют в фосфорибозилировании пуриновых колец при их реутилизации.
Первый главный пиримидиновый рибонуклеотид - уридиловая кислота (уридинмонофосфат, УМФ) образуется путем декарбоксилирования оротидилата (реакция б). Дигидрооротатдегидрогеназа — митохондриальный фермент. Все остальные ферменты,
участвующие в синтезе пиримидинов de novo, локализуются в цитозоле. УМФ подвергает-
ся двукратному фосфорилированию и образующийся УТФ аминируется с участием глутамина и АТФ и образованием ЦТФ (реакция 9).
Регуляция синтеза пиримидиновых нуклеотидов Ключевым ферментом синтеза пиримидиновых нуклеотидов у человека является цитоплазматическая КФС II. УТФ
тормозит активность этого фермента, конкурируя с ATФ. ФРПФ является активатором
этого фермента. Имеются и другие участки регуляции (например, OMФ декарбоксилаза
ингибируется УМФ и ЦМФ). Однако при нормальных условиях эти участки имеют ограниченное значение. У бактерий ключевым регуляторным ферментом является аспартат
транскарбомоилаза. У них имеется только одна карбомоилфосфат синтетаза, так как они
не имеют митохондрий. Карбомоилфосфат, таким образом, находится на развилке метаболических путей, которая ведет или к образованию пиримидиновых нуклеотидов или к
синтезу аргинина.
Суммарная сравнительная характеристика путей синтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов приводится в следующей таблице.
Таблица 8.4. Сравнительная характеристика путей синтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов
Путь синтеза пуринов
Путь синтеза пиримидинов
Последовательность 1.Образование N-гликозидной
1.Сборка кольцевой структуры
синтеза
связи
2.Образование N-гликозидной
2.Сборка кольцевой структуры
связи
Ключевая реакция
Образование фосфорибозилами Образование карбамоилфос
на(фосфорибозиамидотрансфер фата (Аспартат транскарба
аза)
моилаза)
Локализация в
Цитозоль
Митохондрии и цитозоль
клетке
Ферментгная
Отдельные ферменты и
Отдельные ферменты и
орнганизация
полифункциональные (3)
полифункциональные (2)
Регуляция
Торможение ИМФ,АМФ и
Торможение УТФ
ГМФ вна нескольких уровнях
карбамоилфосфатсинтетазы II
Рибонуклеотидредуктаза и биосинтез дезоксирибонуклеотидов
Большинство атомов углерода, проходящих через пути синтеза нуклеотидов попадает в рибонуклеозидтрифосфаты (рНТФ) - ATФ, ЦТФ, ГТФ, и УТФ. Относительно небольшая доля атомов углерода включается в синтез дезоксирибонуклеозидтрифосфатов
(дНТФ). Преобладание синитеза рНТФ над синтезом дНТФ связано с тем, что
большинство клеток содержит в 5-10 раз больше РНК, чем ДНК, а также ещё и потому,
что рНТФ выполняют ряд специфических функций в клетке, в то время как дНТФ используются только для синтеза ДНК. Как показано на рис рНДФ ("Д" означает ди-) превращаются в соответствующие дезоксирибонуклеозиддифосфаты при участии фермента рибонуклеозиддифосфат релуктазы (также называемая рибонуклеотид редуктаза, рНДФ
редуктаза или РНР). Относительно простыми являются пути синтеза дАТФ, дГТФ и
дЦТФ в отличие от механизма образования дТТФ, предшественником которого служит
дУДФ
Рибонуклеотид редуктаза, фермент, катализирующий синтез дНДФ из рНДФ
восстанавливает гидроксил при С2 рибозы по свободно радикальному механизму.
Восстановление рибонуклеотидов требует электронов. Они в конечном счете доставляются из НАДФН+Н+ при участии тиоредоксина или глутаредоксина, как это показано на рис 8.18. Тиоредоксин широко распространен в животном и растительном мире.
У животных он контролирует уровень инсулина, способствуя его восстановлению, участвует в образовании меланина (люди с высоким уровнем тиоредоксина легко загорают),
способствует формированию пространственной структуры белков.
Рис.8.18.Схема реакций, катализируемых с участием рНДФ редуктазы
Биосинтез тимидиловых дезоксирибонуклеотидов
Синтез дезокситимидиловых нуклеотидов происходит иначе чем других дНТФ, которые образуются непосредственно из рибонуклеотидов под влиянием редуктазы катализирующей преобразование рибонуклеозиддифосфатов в дезоксирибонуклеозиддифосфаты (см рис.9-22).Термины тимидин и дезокситимидин (или дTTФ и ТТФ) относятся к дезоксирибонуклеотиду, потому что тимидиловый рибонуклеотид не встречается среди
нормальных метаболитов. В редких случаях, где имеется тимидиловый рибонуклеотид
его обычно обозначают как 'рТТФ'
Синтез тимидиловых нуклеотидов de novo начинается или с УДФ или ЦДФ и приводит к образованию дТТФ . Что касается возможной реутилизации , то образование тимидиловых нуклеотидов начинается с дезоксицитина, дезоксиуридина или дезокситими-
дина, которые превращаются в соответсвующие нуклеозидмонофосфаты на первом этапе
при помощи соответсвующих киназ (см раздел о реутилизации нуклеотидов) Имеются
несколько уровней регуляции синтеза. Например, дЦТФ ингибирует реакции реутилизации, катализируемую дезоксицитидин киназой и активизирует реакцию, катализируемую
дЦМФ дезаминазой. С другой стороны, дTTФ ингибирует реакцию дезаминирования
дЦМФ, а также фермент тимидин киназу.
.
Рис.8-19.Механизм образования дезокситимидилового нуклеотида (дТМФ)
Превращение дУМФ в дТМФ сопровождается переносом одноуглеродного фрагмента от 5,10-метилентетрагидрофолата в реакции, катализируемой тимидилат синтазой.
Реакция, катализируемая тимидилатсинтазой - единственная, известная в клетке, в
которой ТГФ не регенерирует. Дигидрофолатредуктаза, таким образом, играет существенную роль в окончательной регенерации 5,10 метилен-ТГФ. Этот фермент явялется мишенью при антиопухолевой химиотерапии, так как он ингибируется лекарственным средством метотрексатом.
Обмен дезоксиуридиловых нуклеотидов
Дезоксиуридиловые нуклеотиды являются промежуточными продуктами синтеза тимидиловых нуклеотидов.дУТФ легко узнается ДНК полимеразами и может быть ис-
пользован для синтеза ДНК вместо дТТФ. При репликации урацила в структуре ДНК образует комплементарную пару с аденином, так что при этом не теряется информация, записанная на ДНК. Однако дУМФ может возникать в структуре ДНК путем спонтанного
дезаминирования дЦМФ. В этом случае при репликации возникает мутация, поскольку
комплементарное основание цитозина гуанин, а не аденин.
Для предупреждения встраивания уридиновых нуклеотидов в ДНК в клетках действует простой механизм. Фермент дУТФаза, превращает дУТФ (субстрат ДНК полимеразы) в дУМФ (не является субстратом ДНК полимеразы), который используется для синтеза тимидиловых нуклеотидов , поскольку дУМФ превращается вначале дТМФ, а затем и
дТТФ.
Наиболее частые проявления нарушений обмена пуринов - гиперурикемия и подагра
Конечный продукт распада пуриновых нуклеотидов мочевая кислота характеризуется низкой растворимостью в воде, ее натриевая соль отличается более высокой растворимостью. Форма, в которой мочевая кислота находится в биологических жидкостях
(кровь, моча, спиномозговая жидкость), зависит от рН этой жидкости. Величина рК для
протона N9 составляет 5,75, а для протона N-l—10,3. Это означает, что в физиологических
условиях, т е. при нормальном рН физиологических жидкостей, можно обнаружить как
саму мочевую кислоту, так и ее мононатриевую соль (урат натрия). В жидкостях с рН
ниже 5,75 основной молекулярной формой является мочевая кислота. При рН 5,75 кислота
и ее соль присутствуют в эквимолярных количествах. При рН выше 5,75 доминирующая
форма - натриевая соль мочевой кислоты.
Нарушения пуринового обмена включают гиперурикемию, гипоурикемию и болезни иммунодефицита.
Очень высокая концентрация мочевой кислоты в крови ведет к довольно распространенной группе болезней, называемых подагрой. Частота подагры зависит от страны
и составляет около 3/1000. Подагра - группа патологических состояний, связанных с заметно повышенными уровнями урата в крови (в норме 3-7 мг/100 мл). Гиперурикемия не
всегда проявляется какими-либо симптомами но, у некоторых людей, способствует осаждению кристаллов урата натрия в суставах и тканях. В дополнение к выраженной боли
сопровождающей обострение, повторные приступы приводят к деструкции тканей и тяжелых артритоподобных нарушений. Термин подагра должен быть ограничен гиперурикемией с присутствием таких подагрических отложений.
Ниже приводится таблица, указывающая на возможные причины нарушения обмена пуриновых нуклеотидов
Таблица 8.5.Нарушения обмена пуриновых нуклеотидов.
Болезнь
Дефект
Природа дефекта
коментарий
Подагра
ФРПФ синтетаза
Увеличение активности
фермента из-за повышенный Vmax
Повышенное образование Гиперурикемия
Подагра
ФРПФ синтетаза
Фермент устойчив к торможению продуктами
Гиперурикемия
Подагра
ФРПФ синтетаза
Фермент имеет высокое
сродство к рибоза-5-фосфату (снижение Km)
Гиперурикемия
Подагра
ФРПФ синтетаза
Потеря способности к торможению по типу обратной
связи
Гиперурикемия
Подагра
ГГФРТa
Частично дефектный фермент
Гиперурикемия
Синдром ЛешаНихана
ГГФРТ
Отсутствие фермента
См. выше
ТКИД
АДАb
Отсутствие фермента
См. выше
Иммунодефицит
ПНФc
Отсутствие фермента
См. выше
Почечно каменная болезнь
АФРТd
Отсутствие фермента
2,8-дигидроксиадениловый
почечный литиаз
Ксантинурия
Ксантиноксидаза
Отсутствие фермента
Гипоурикемия и ксантиновый почечный литиаз
Боллезнь
Гирке
Глюкозо-6фосфатаза
Отсутствие фермента
См. выше
а
Гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза; bаденозин дезаминаза;
пуриновая нуклеотидфосфорилаза; daденозин фосфорибозил трансфераза
ТКИД- тяжелый комбинированный иммунодефицит
c
Причинами повышения могут быть нарушения функции трех основных ферментов
обмена пуринов (рис. 8.20).
ФРПФ -синтетазы - Дефекты в структуре этого фермента могут приводить к потере его чувствительности к торможению по типу обратной связи пуриновыми нуклеотидами. Тем самым, увеличивается образование пуриновых нуклеотидов и как следствие чрезмерный синтез мочевой кислоты..
Рис.8.20.Основные ферменты метаболизма пуринов, нарушение функции которых ведет к
повышению уровня мочевой кислоты.
ФРПФ амидотрансферазы - Дефекты в структуре ФРПФ амидотрансферазы могут
приводить к потере чувствительности к торможению по типу обратной связи пуриновыми
нуклеотидами, что приводит к повышенному синтезу пуриновых нуклеотидов, мочевой
кислоты, и развитию подагры.
Гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ). ГГФРТ обеспечивает
повторное использование пуринов (для аденинa –аденин фосфорибозилтрансфераза
АФРТ). Отношения между дефектом этого фермента и подагрой неясны. Это может быть
связано с тем, что субстратом ГГФРТ является ФРПФ. Активность фермента у больных
подагрой значительно снижена. Полное отсутствие активности фермента обнаруживается
у больных синдромом Леша-Найхана.
Подагра может также быть вызвана нарушениями выделения мочевой кислоты
(связанными с неспособностью почечных канальцев выделить мочевую кислоту).
У больных со злокачественными опухолями подагра может возникнуть в результате химиотерапии, при которой происходит гибель клеток, что приводит к повышению образования пуринов за счет нуклеиновых кислот гибнущих клеток
О величине растворимого уратного пула можно судить по содержанию урата натрия в сыворотке крови. Когда этот показатель превышает растворимость урата натрия в
сыворотке (гиперурикемия), образуются кристаллы. Содержание урата натрия в сыворотке крови при 37°С составляет 2—6 мг%. Кристаллы могут отлагаться в мягких тканях,
особенно в суставах или вокруг них. Эти отложения уратов называются «узлами». Накопление кристаллов урата натрия в тканях, их фагоцитоз полиморфно-ядерными лейкоцитами в суставной щели могут вызывать резкую воспалительную реакцию—острый подагрический артрит. Хронический подагрический артрит приводит к деформации сустава.
В водных растворах мочевая кислота (протонированная форма урата) в семнадцать
раз менее растворима, чем ее натриевая соль. Моча при рН 5 становится насыщенной
уратами при концентрации 15 мг%. Поскольку рН мочи здоровых людей в норме ниже рК
мочевой кислоты (5,75), ураты в моче представлены в основном мочевой кислотой. Если
рН мочи достигает 7, то в ней может раствориться 150—200 мг уратов на 100 мл.
Мочевая кислота становится основной формой уратов при рН мочи ниже рН 5,75.
Такое значение рН характерно для дистальных канальцев и собирательных трубочек почек. Если кристаллы этого конечного продукта катаболизма пуринов образуются в системе выведения мочи, т.e. в зоне, проксимальной от области закисления мочи, это будут
кристаллы урата натрия; в самой же области закисления окажутся кристаллы мочевой кислоты. Поэтому большинство камней, образующихся в мочевыводящих путях, состоят из
мочевой кислоты. Интенсивность образования камней мочевой кислоты можно в значительной мере уменьшить, смещая рН мочи в щелочном направлении (при этом будет
доминировать более растворимая форма—урат натрия).
Синдром Леша—Найхана (полное отсутствие ГГФРТ) наследуется как сцепленный с X-хромосомой рецессивный признак. Болезнь характеризуется корковым параличом, сопровождающимся хореоатетозом, судоргами, стремлением к нанесению себе повреждений и тяжелой гиперурикемией. В моче наблюдается образование камней мочевой
кислоты. Матери больных детей гетерозиготны и мозаичны в отношении ГГФРТазной
недостаточности, у них часто обнаруживается гиперурикемия, но без неврологических
симптомов. Частичная недостаточность ГГФРТазы, вызванная мутациями соответствующего гена, встречается и у мужчин. Для таких больных характерна тяжелая гиперурикемия, не сопровождающаяся существенными неврологическимими нарушениями
Избыточное образование пуринов у пациентов с недостаточностью ГГФРТ связано
с увеличенной внутриклеточной концентрацией ФРПФ, что, по-видимому, является результатом уменьшения потребления ФРПФ на. пути регенерации пуриновых нуклеотидов.
Биохимическая основа некрологических отклонений при синдроме Леша—Найхана неизвестна.
Гипоурикемия обусловлена либо усилением экскреции либо снижением скорости
образования уратов. У человека она связана чаще всего с нарушением реабсорбции мочевой кислоты из клубочкового фильтрата, что может приводить к выделению уратов и мочевой кислоты в количествах, которые является неадекватно большим отношению к содержанию уратов в плазме.
Недостаточность ксантиноксидазы, вызванная либо генетнческим дефектом, либо
тяжелым поражением печени, приводит к гипоурикемии и увеличение экскреции оксипуринов — гипоксантина и ксантина. При тяжелой недостаточности ксантиноксидазы у пациентов часто развивается ксантннурия и образование ксантиновых камней.
В последние годы описаны два иммунодефицитных заболевания, связанные с недостаточностью ферментов катаболизма пуринов. С недостаточностью аденозиндезаминазы связано тяжелое иммунодефицитное заболевание, npи котором снижается количество и нарушается функция как тимусных лимфоцитов (Т-клеток), так и лимфоцитов костного мозга (В-клеток). С недостаточностью пурнннуклеозид-фосфорилазы связана более легкая форма иммунодефицита. при которой
функции В-лимфоцитов остаются нормальными, но сильно нарушены функции Т-лимфоцитов. Оба заболевания наследуются по аутосомно-рецессивному типу. Метаболические
нарушения при рассмотренных иммунных дисфункциях связаны с накоплением дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дГТФ и дАТФ). которые аллостерически ингибируют рибонуклеотидредуктазу, что, в свою очередь, приводит к снижению содержания в Т-лимфоцитах пула предшественников синтеза ДНК, главным образом dЦТФ. Пуринодефицитные
состояния у человека встречаются редко. Часто они бывают связаны с недостатком фолиевой кислоты, вероятно, витамина В12, что приводит к снижению синтеза производных фолата.
У больных со злокачественными опухолями подагра может возникнуть как осложнение химиотерапии, вызывающей гибель клеток и, как следствие, повышение образования пуринов за счет нуклеиновых кислот гибнущих клеток.
В лечении подагры нашел широкое применение аллопуринол, химическое соединение структурно подобное гипоксантину. Это хороший ингибитор ксантиноксидазы.
Его применение приводит к накоплению гипоксантина и ксантина, которые лучше растворимы в воде и легче выделяются, чем мочевая кислота.
Нарушение обмена пиримидиновых нуклеотидов также приводит к болезням.
Таблица 8-6. Заболевания, связанные с нарушением обмена пиримидиновых нуклео-
тидов
Болезнь
Дефектный фермент
Коментарий
Оротовая ацидурия, Тип I
оротатфосфорибозилтрансфераза
и OMФ декарбоксилаза
Кристаллы оротовой кислоты в
моче, отставание в развитии, Мегалобластическая анемия.
Оротовая ацидурия, Тип
II
ОМФ декарбоксилаза
Оротовая ацидурия, (умеренная , без гематологических осложнений )
β-аминоизобутират ацидурия
Лекарственная оротат
ацидурия
ъ\=
Мегалобластическая анемия
Недостаточность орнитин транскарбомоилазы из цикла образования мочевины
Повышенное образование карбамоилфосфата в митохондриях
увеличивает биосинтез пиримидинов; печеночная энцефалопатия
Трансаминаза, затрагивает цикл
мочевинообразования
Мягкое течение, распространено
на востоке
ОМФ декарбоксилаза
Лечение аллопуринолом и 6-азауридином вызывают оротат ацидурию без гематологического
компонента; их продукты их распада тормозят OMФ декарбоксилазу
Конечными продуктами метаболизма пиримидинов являются хорошо растворимые
в воде соединения, такие, как СО2, аммиак, β-аланин и β-изо-пропионат. Поэтому клинические симптомы при их усиленном образовании проявляются слабо. В случаях гиперурикемии, обусловленной избыточной продукцией ФРПФ, наблюдаются повышенный синтез
пиримидиновых нуклеотидов и соответственно увеличивается выделение конечных продуктов метаболизма, в частности β-аланина. Поскольку для синтеза тимидилата необходим N5, N'°-метилентетрагидрофолат, нарушения метаболизма фолата и витамина В12;
приводят к дефициту ТМР (влияние недостатка витамин В12 реализуется опосредованно).
Экскреция с мочой β-аминоизобутирата—аутосомный рецессивный признак. Он
распространен главным образом среди жителей Востока
Описаны два типа первичной наследственной оротовой ацидурии. Более распространенная форма (хотя и встречающаяся весьма редко) связана с утратой двух ферментов
—оротат-фосфорибозилтрансферазы и оротидилат(ОМР)-декарбоксилазы. В детском возрасте для больных характерны отставание в развитии, мегалобластическая анемия и
«оранжевая кристаллоурия» (оротовая кислота). При отсутствии лечения пиримидиновыми нуклеозидами пациенты подвержены инфекциям. Второй тип наследуемой оротовой
ацидурии (тип 11) связан с недостатком только ОМР-декарбоксилазы .
У пациентов, страдающих оротовой ацидурией первого типа, основным продуктом
экскреции является оротовая кислота. У больных aцидурией второго типа с мочой выделяется главным образом оротидин и только небольшое количество оротовой кислоты. В
эритроцитах пациентов с оротовой ацидурией типа I были значительно повышены удельные активности аспартаттранскарбамоилазы и дегидрооротазы, однако, прием уридина
восстанавливал нарушения. Эти наблюдения свидетельствуют о том, что конечные продукты пути биосинтеза пиримидинов регулируют активность рассматриваемых ферментов. В условиях недостатка конечных продуктов происходит дерепрессия, вероятно координированного характера, по кранней мере этих двух ферментов.
У больных с недостаточностью орнитинтранскарбамоилазы — митохондриального
фермента клеток печени, ответственного за раннюю стадию синтеза мочевины и аргинина,
наблюдается увеличение экcкpeции оротовой кислоты, урацила и уридина. По-видимому,
в митохондриях этих пациентов В результате снижения активности орнитинтранскарбамоилазы накапливается карбамоилфосфат, который выходит в цитозоль. где используется
как cyбстрат для синтеза пиримидиновых нуклеотидов de novo. При избыточном образовании оротовой кислоты диагностируется оротовая ацилурия. Обычно она проявляется в
легкой форме и не сопровождается образованием кристаллов. Синтез и экскреция оротовой кислоты у таких больных усиливаются при употреблении в пищу мясных продуктов
таких, как мясо.
Оротовую ацидурию может вызвать применение некоторых лекарственных препаратов. Упоминаемый выше аллопуринол, используемый для лечения некоторых форм подагры фосфорибозилируется оротат-фосфорибозилтрансферазой, конкурентно ингибируя фосфорибозилирование оротовой кислоты. Более того, образующийся при этом
необычный нуклеотид подавляет оротидилатдекарбоксилазу. вызывая тем самым оротовую ацидурию и оротидинурию. Однако путь биосинтеза пиримидинов у человека, постепенно «приспосабливается» к такому ингибированию и симптомы оротовой ацидурии
проявляются только на ранних стадиях лечения препаратом
6-азауридин после превращения в 6-азауридилат функционирует как конкурентный ингибитор ОМР- декарбоксилазы., что приводит к увеличению экскреции оротовой
ксилоты и оротидина.
При специфическом поражении митохондрий клеток печени (синдром Рейе) имеет
место вторичная оротовая ацидурия. Дело в том, что пораженные митохондрии
оказываются неспособными утилизировать карбамоилфосфат, который как и в случае
наследуемой недостаточности орнитинтранскарбамоилазы, вызывает избыточное
образование оротовой кислоты
Введение в строение генома человека
Проекты жизни преобладающего большинства живущих на Земле сохраняются в
последовательности нуклеотидов молекул ДНК, организованных в хромосомы. Этот
проект вмещается на одной или нескольких молекулах ДН К, объединяемых в понятие геном клетки или организма. Проект жизни переходит от поколения к поколению. Это наследование требует точного копирования ДНК клетки. При этом каждый сегмент ДНК
должен быть скопирован только один раз. Копируемая ДНК распределяется между двумя
дочерними клетками так, чтобы каждая получила одну точную копию всей информации.
Геномы находятся в постоянном движении. Существует много причин, вызывающих изменения генома. Мутации возникают при воздействии факторов окружающей среды. Происходит постоянный обмен участками гомологичных последовательностей молекул ДНК (рекомбинация). ДНК одного организма может вторгаться в геном другого. Короткие или длинные последовательности нуклеотидов в ДНК могут быть при определенных условиях многократно размножены. Эти перемены в геноме могут способствовать
развитию организмов и эволюционному совершенствованию, могут быть нейтральными и
не оказывать существенного влияния на организм или могут приводить к нарушению процессов жизнедеятельности и даже гибели клетки или организма. Внимание врача в значительной степени привлекают последние. Они могут быть непосредственной причиной болезни или накладывать отпечаток индивидуальности на течение болезни. Знание этих
особенностей одно из условий успеха врачебного вмешательства.
От предположений до проекта «Геном человека»
Основные положения о законах передачи генетической информации были открыты
с использованием методов экспериментальной биологии. Молекулярные основы этого
процесса были изучены значительно позже и связаны с исследованиями по трансформации бактерий.
В мае 1953 года Д. Уотсон, Ф.Крик и М. Уилкинс предложили модель структуры
молекул ДНК, из которой вытекал принцип синтеза молекул и следовательно принцип
передачи наследственной информации. В статье, посвященной структуре они отметили: "
не обошло нашего внимания то, что специфическое спаривание, постулированное нами,
непосредственно предлагает возможный механизм копирования генетического материала".
Комплементарный характер взаимодействия между цепями полинуклеотидов в
молекуле ДНК предполагал полуконсервативный синтез дочерних ДНК, при котором
синтезируемая дочерняя молекула ДНК должна была состоять из одной материнской и
Рис.8.21. Размер геномов у разных видов живых организмов
другой синтезированной заново цепи полинуклеотидов. Это предсказание было блестяще
подтверждено работами Мэтью Мезелсона и Фрэнка Сталя в конце 1958.
В 1956 г. Артур Корнберг из 100 кг биомассы E. coli выделил 0.5 г фермента,
участвующего в синтезе ДНК - ДНК-полимеразу. Этот фермент, как потом оказалось, не
был основным в механизмах репликации, однако исследование его свойств позволили понять общие принципы синтеза ДНК. Все ДНК полимеразы используют в качестве субстратов дезоксирибонуклеотид трифосфаты (дАТФ, ТТФ, дГТФ, дЦТФ), требуют для начала
работы затравочного количества РНК и не катализируют реакцию без матричной ДНК.
Одновременно с изучением синтеза ДНК ведутся исследования распада этих молекул. Выделены многочисленные нуклеазы, катализирующие гидролиз фосфодиэфирных
связей в молекуле ДНК. Среди них особое внимание уделяется нуклеазам, обладающим
высокой специфичностью действия. Такие нуклеазы выделены у бактерий, где эти ферменты выполняют важную роль в защите от чужеродных ДНК. Они получили название
рестрикционных нуклеаз или рестриктаз. И ДНК- полимеразы и рестриктазы стали хорошим инструментов в руках молекулярного биолога для изучения структуры и функции нуклеиновых кислот. Цепная полимеразная реакция позволяет размножать небольшие отрезки ДНК, рестриктазы – своеобразный хирургический инструмент при работе с ДНК- стали
неотъемлемой частью методов генной инженерии. Электрофорез нуклеотидов в высоко
пористых гелях позволил разделять нуклеотиды, отличающиеся между собой на один мо-
нонуклеотид. Все это стало предпосылкой для подхода к расшифровке генома человека.
Начало третьего тысячелетия ознаменовалось сообщением о последовательности нуклеотидов во всех ДНК клетки человека. За неполные 100 лет человечество прошло путь от догадки о значении ДНК до установления последовательности всего генома человека.
Уже многое известно о строении генома человека
По-видимому, можно считать, что все началось с работ американского биохимика
Э. Чаргаффа по исследованию особенностей нуклеотидного состава ДНК. Его правила
были положены в основу модели пространственной структуры ДНК. Одновременно проводились исследования общего количества нуклеотидов в геномах разных видов живущих
на Земле. Оказалось, что не существует выраженной прямой зависимости между сложностью строения организмов и количеством нуклеотидов в геноме.(см рис 9-24). Несомненно, у млекопитающих общее содержание ДНК намного больше, чем у прокариот, однако
меньше, чем у растений. Более того, простые расчеты показали, что общая сумма ДНК эукариотических клеток намного превышает объем информации , требуемый для кодирования всех белков этих клеток.
Количество ДНК казалось избыточным. Это стимулировало исследования каче
Рис8.22.Схема строения генома человека
ственных особенностей последовательностей нуклеотидов в геномах, что позволило выявить ряд особенностей, проливающих свет на избыточность ДНК. Важную роль в исследованиях качественной особенности нуклеотидных последовательностей сыграл метод
кинетики ренатурации денатурированных фрагментов ДНК.
Исследование кинетики ренатурации позволило выявить несколько фракций последовательностей, различающихся по скорости ренатурации:
•
Уникальные последовательности (1 копия на геном)
•
Умеренно повторяющиеся последовательности (102 - 105 копий)
•
Высоко повторяющиеся последовательности (>105 копий).
Такое распределение последовательностей затем было подтверждено уже непо-
средственным исследованием последовательности нуклеотидов всего генома человека.
Уникальность человека не связана прямо с числом уникальных последовательностей.
Общие представления о геноме человека представлены на рис.8.22. Из 3.2 млрд пар
оснований генома человека на долю уникальных последовательностей приходится менее
50% генома. Среди них область, кодирующая белки (сумма последовательностей всех экзонов) составляет менее 2%. Интроны вносят в эту кодирующую область дополнительно
около 20%. Предполагаемое ранее число генов, кодирующих белки в 50-100000, после
расшифровки геномной последовательности сократилось до 30000. Белки, кодируемые
этими генами, могут быть сгруппированы в семейства на основе их подобия по структуре
и функциям. В геноме человека кодируется большинство таких же белковых семейств, как
и у других видов живых организмов, однако число белков в отдельных семействах у людей может быть значительно больше. Это увеличение особенно очевидно для генов, кодирующих белки, которые регулируют развитие или сигналы общения между клетками, а
также белки иммунной системы: люди имеют 765 генов, кодирующих субъединицы иммуноглобулинов, в то время как у мух их 140, червей 64, а в растениях и дрожжах нет ни одного вообще. Лишь 7% идентифицированных белковых семейств специфичны только для
позвоночных. Результаты исследования генома человека показали, что сложность строения человека не является результатом увеличения числа генов. Трудно выделить одно
доминирующее свойство, объясняющее эту сложность. Скорее всего, это может быть
несколько причин, среди которых можно назвать особенности сплайсинга РНК, образование большого числа белков, которые являются переключателями генов, пострибосомальная модификация белковых структур. Все это указывает на существование тонкой многоуровневой системы управления генами и белками, начиная с развития оплодотворенного
яйца до взрослого состояния и поддержания и восстановления клеток независимо от
сложности условий ежедневной жизни
Число повторяющихся элементов в геноме человека беспрецедентно для любого
другого известного генома
На долю повторяющихся последовательностей приходится более половины генома.
Высокоповторяющиеся последовательности ДНК чаще всего состоят из участков длиной
5-500 пар, расположенных один за другим (тандемно). Эти последовательности обычно не
транскрибируются и часто располагаются в центромерах хромосом. Функция таких последовательностей, возможно, состоит в распознавании и юстировке хромосом во время
мейоза и митоза.
Нуклеотидный состав таких высокоповторяющихся последовательностей значительно отличается от суммарного состава оснований хромосомной ДНК и при ультрацентрифугировании в градиенте плотности CsCl такие последовательности выделяются в
форме фракций разной плотности и обозначаются как спутниковая или сателитная ДНК
Умеренно повторяющиеся последовательности способны перемещаться по геному
Умеренно повторяющиеся последовательности не образуют кластеров, а диспергированы
по геному. Среди них можно выделить длинные и короткие диспергированные повторы.
Рис.8.22. Распределение различных видов повторяющихся последовательностей в геноме
человека
(long (LINE)and short (SINE) interspersed elements). Длинные повторы содержат до 6-7 тысяч пар оснований, а короткие до 300 пар оснований. Среди последних характерными
только для генома человека являются так называемые Alu последовательности.
Почти 106 копий таких последовательностей обнаружено в геноме человека. Их называют
так потому, что они содержит участок, на который действует рестриктаза AluI.Эти последовательности располагаются как правило в нетранскрибируемых областях.
Примеры различных видов повторяющихся последовательностей и их распределение, обнаруженных в геноме человека показаны на рис.8.22
Среди этих повторяющихся последовательностей можно выделить небольшие элементы ДНК подобные ретровирусным последовательностям. Они относятся к так называемым подвижным (мобильным) элементам, которые способны перемещаться по ДНК, оказывая существенное влияние на процессы эволюции генома. Эти элементы размножаются
путем копирования и переноса новой своей копии в другое место в геноме. Примерами
подвижных элементов могут служить и так называемые процессированные гены. В них
отсутствует последовательность промотора и они часто фланкированы короткими прямыми повторами. Они рассматриваются как обратные транскрипты соответствующих иРНК,
содержащих нетранскрибируемый 5’ участок гена, кодирующую область без интронов и
полиА последовательность на 3’конце. Процессированные гены относятся к группе псевдогенов, т.е генов, которые содержат мутации и не экспрессируются.
Мобильные элементы оказывают существенное влияние на функции генома
Внедрение мобильных элементов внутрь гена может приводить к выключению
гена или нарушению его регуляции, провоцировать экспрессию генов, которые не должны
в данный момент времени работать. Присутствие мобильных элементов может быть фактором, способствующим так называемой незаконной рекомбинации, при которой перетасовываются гены, не имеющие отношения друг к другу. Наконец, мобильные элементы
способствуют образованию делеций, инверсий, дупликаций отдельных участков хромосом. Все это - хромосомные мутации.
Среди повторяющихся последовательностей обнаружены семейства генов
Еще один источник повторной ДНК - семейства генов. К умеренным повторам относят как транскрибируемые и транслируемые, так и только транскрибируемые, но не
транслируемые последовательности ДНК и регуляторные участки.(см табл)
Таблица 8.7.Примеры участков генома с умеренно повторяющимися последовательностями.
Умеренные повторы
Гены
регуляторные участки
транскрибируемые
транскрибируемые
энхансерные модули, ori ретранслируемые
пликации, промоторы и терГены белков рибосом, гисто- не транслируемые
минаторы транскрипции
новые гены, гены мембранных белков, цитоскелетных
гены рРНК, sРНК, тРНК
белков, гены иммуноглобулинов
Гены тРНК в среднем повторяются в геноме 5 тыс. раз. Гены sРНК - сотни тысяч
раз.
Многие уникальные гены фактически выделились в семейства очень подобных генов.
Например, гены гемоглобина человека развились из одиночного предкового гена. Обнаружены теперь два подсемейства таких генов, гены α− глобина и гены β- глобина. Каждое подсемейство состоит из кластера из нескольких генов, расположенных на двух различных хромосомах. Индивидуальные гены экспрессируются в разное время в течение
развития. В дополнение к функциональным генам гемоглобина, кластеры генов также содержат несколько псевдогенов.
Клетка эукариот обладает способностью умножать некоторые последовательности под
влиянием внешней среды. Например, при длительном лечении метотрексатом, ингибитором дигидрофолат редуктазы, часто возникают клетки, устойчивые к этому лекарственному средству. Исследование генома таких клеток обнаружило появление сотен тандемных
дупликаций гена, кодирующего дигидрофолат редуктазу. (Повторяющаяся единица был
значительно большей, чем длина гена, которая могла ожидаться если бы дублирование
было следствием рекомбинации.) Это позволило клетке резко повысить продукцию фермента и таким образом компенсировать ингибирующий эффект метотрексата. Такие амплификации гена, вероятно, происходят часто, но не всегда замечаются.
Однонуклеотидный полиморфизм- основа индивидуальности человека.
Исследование последовательности нуклеотидов генома человека выявило около 3
млн участков, которые были заняты разными парами оснований (0,1% всего генома) у
разных людей. Примерно на каждую 1000 пар нуклеотидов встречается одна замена нуклеотида. Введение понятия однонуклеотидный полиморфизм (ОНП) позволяет индивидуализировать геномы каждого человека и значительно изменяет развитие практической
медицины в будущем. Составленные карты ОНП позволят при высоко автоматизированной технике анализа последовательности быстро обнаруживать такие ОНП и связывать
их с индивидуальными особенностями больного человека.
Биосинтез ДНК – один из важнейших процессов передачи генетической информации последующим поколениям
и ее хранения.
Известно несколько разных по биологическому назначению процессов биосинтеза
ДНК. Некоторые их этих процессов проходят во всех типах клеток (репликация и репарация ДНК, синтез ДНК митохондрий), другие же - только в специализированных (например, осуществляющих синтез антител, транспозонов) или инфицированных вирусами
клетках (репликация бактериофагов и вирусов). Все эти процессы катализируются разны-
ми ДНК- полимеразами, различающимися по числу субъединиц, молекулярной массе,
ассоциацией с разными вспомогательными белками, ускоряющими процессы биосинтеза
ДНК, и по многим другим структурным свойствам и функциональному назначению. В целом общие принципы синтеза ДНК схожи, однако, несомненно, существуют и различия,
обусловленные видовыми и клеточными особенностями.
Как уже упоминалось выше синтез ДНК в подавляющем большинстве случаев проходит по полуконсервативному механизму, то есть дочерняя цепь ДНК синтезируется на
материнской цепи, называемой обычно матрицей. Матрицами могут быть односпиральные ДНК или РНК. Ферменты, катализирующие синтез ДНК - полимеразы различаются
по многим показателям. Одни из них синтезируют дочерние цепи ДНК процессивно, то
есть, диссоциируя из комплекса с матричной цепью ( М-дДНК ) после удлинения дДНК на
десятки нуклеотидных остатков (вплоть до полного окончания процесса), другие же функционируют дистрибютивно, диссоциируя из комплекса с матрицей практически после
каждого шага удлинения. Процессивность полимераз усиливается специальными дополнительными беловыми факторами. Все ДНК-полимеразы нуждаются для начала своей работы в предварительно синтезированных олигонуклеотидах – затравках, 3’-ОН группа которых используется для удлинения цепи. (Эти короткие отрезки, обычно, рибонуклеотидов синтезируются специальными РНК-полимеразами. По названию затравки – праймер
эти полимеразы получили название праймаз). Все ДНК-полимеразы формируют дочерние
цепи в одном направлении 5’  3’, перемещаясь по матричной ДНК в направлении 3’ 
5’. На ДНК-полимеразы возложена ответственность за точность репликации, поэтому
многие из них обладают экзонуклеазной корректирующей активностью, действующей в
направлении 3’ 5’. Субстратами ДНК полимераз являются дезоксирибонуклеозидтрифосфаты.
Основные принципы синтеза ДНК были изучены в исследованиях с прокариотами.
Процесс репликации ДНК на уровне отдельных молекул удалось впервые показать
при помощи ауторадиографии Джону Каирнсу. Он метил бактерии радиоактивным 3 H-тимидином и через короткий промежуток времени осторожно лизировал клетки, а выделенную ДНК помещал на нитроцеллюлозный фильтр. Контуры радиоактивно меченых молекул ДНК становились видимыми после заливки фильтров фотоэмульсией. Бактериальная
ДНК имела структуру, напоминающую греческую букву θ с двумя точками ветвления.
Такая структура впоследствии была названа репликативным «пузырем» или «глазом».
Инициация репликации ДНК начинается в специальных участках со специфической нуклеотидной последовательностью (Эти участки получили название ori от origin начало) и продолжается в двух направлениях до тех пор, пока репликативные вилки не
встречаются на противоположной стороне кольцевой хромосомы бактерии. После завершения процесса две связанные кольцевые дочерние молекулы разделяются при участии
специальной ферментной системы..
Скорость репликации (перемещения вилки) у бактерий составляет приблизительно
50,000-100000 пар нуклеотидов в минуту при 37 0 C. Родительская двойная спираль ДНК
при такой скорости перемещения должна раскручиваться со скоростью 5,000-10000
об\мин (один виток молекулы образуется 10 парами азотистых оснований). Такой простой
расчет указывает на определенные чисто механические проблемы, возникающие в процессе репликации. Основные участники процесса репликации и их основные функции у прокариот перечисляются в следующей таблице.
заIII
Таблица 8-8. Основные ферменты и белки, участвующие в процессе репликации
Белок
Функция
Главный белок праймосомы раскручивает ДНК в сайте
DnaB белок
ori
DnaC белок
Образует комплекс с dnaB
Белок Rep
Хеликаза (раскручивает ДНК в репликационной вилке)
Праймаза (dnaG)
Синтезирует РНК-затравку
ДНК-полимераПолимераза, катализирующая репликацию
Связывается с одноцепочечной ДНК в репликативной
вилке для предотвращения образования двойной спирали
ДНК-полимеразаI
Удаляет РНК-затравку, заполняя пробел
Катализирует образование 3 ’, 5 -фосфодиэфирной свяДНК лигаза
зи, соединяя фрагменты Оказаки
Топоизомераза I
Ослабляет суперспирализацию ДНК
Топоизомераза II
Разделяет ДНК после репликации
SSB
Последовательность событий в механизме репликации у
Е Coli следует строго определенному сценарию.
oric - инициирующая последовательность E.Coli длиной в 245 пар. Отдельные
участки этой последовательности характеризуются высоким содержанием АТ пар и таким образом денатурируются относительно легко. К этому участку присоединяется белок
- продукт гена DnaA.и специфические основные белки (HU и IHF) которые облегчают
изгиб ДНК, образование которого - важный шаг в инициации репликации:
Рис.8-23.Структура oric и механизм инициации репликации у Е.coli
1.
Комплекс из 10-20 молекул белка DnaA и ATФ связываются с oric . Молеку-
ла ДНК при этом образует изгиб и в зоне изгиба происходит плавление молекулы ДНК и
раскрытие цепей. Активность молекул DnaA поддерживается специальным липидом –
кардиолипином..
2.
Комплекс из белков DnaC и DnaB связывается к обеим освободившимся
цепям открытой петли и DnaB, обладающий активностью хеликазы, раскручивает молекулу ДНК открывая большее количество нуклеотидов. Белки SSB связываются с открытыми цепями, предотвращая их обратное скручивание.
3.
Белок DnaG (праймаза) присоединяется к открытым цепям ДНК и катали-
зирует синтез РНК- затравки. Некоторые праймеры могут быть синтезированы РНК-полимеразой. Ключом к открытию рибонуклеотидной природы праймеров послужило наблюдение, что репликация ДНК некоторых фагов тормозилась рифампицином (антибиотиком), который ингибировал РНК полимеразу. Длина праймеров составляет 10-12 нуклеотидов. Праймеры синтезируются на обеих цепях. Комплекс белков DnaB (хеликаза),
DnaC и DnaG (праймаза) получил название праймосома
4.
Затем в дело вступает ДНК-полимераза III. Как оказалось, выше упомяну-
тая ДНК полимераза открытая А.Корнбергом и теперь называемая ДНК-полимеразаI (Pol
I) - не основной фермент репликации, хотя и играет существенную роль в процессе репликации (см. позже). У E. coli выделены две дополнительных ДНК-полимеразы, полимераза II (Pol II) и полимераза III (Pol III). Точная функция полимеразы II в клетке пока не известна. Основным ферментом, катализирующим репликацию, является полимераза III.
Помимо полимеразной активности все бакте
Рис.8.24. Механизм репликации у прокариот
риальные ДНК-полимеразыобладают 3 '-5 ' экзонуклеазной активностью.
Способность катализировать гидролиз фосфодиэфирных связей и удалять
нуклеотиды с 3’ концов, действуя в противоположном от своей полимеразной активности направлении, позволяет полимеразам проверять и устранять ошибки своей деятельности.
Если к растущей цепи добавляется неправильный нуклеотид, он немедленно удаляется до завершения синтеза. У полимеразы I и III обнаружена и 5 '-3 ' экзонуклеазная
активность, что позволяет им участвовать в процессах репарации ДНК. Эта же экзонуклеазная активность полимеразы I используется также для удаления РНК- затравок, которые инициируют синтез цепей ДНК (см. ниже). Работе ДНК- полимеразы предшествует
первичный отбор комплементарного матрице дНТФ, который проходит в общем одинаково для разных ДНК-полимераз Этот отбор начинается с образования канонических
Уотсон-Криковских пар оснований. Их образование энергетически более выгодно, поскольку при этом образуется оптимальное по сравнению с другими возможными вариантами число водородных связей. Кроме того, правильно образованные пары оказывают
влияние на конформационное изменение ДНК-полимеразы, направленное на ускорение
реакции элонгации и последующего перемещения фермента. При образовании неправильной пары резко ухудшается кинетика процесса. Скорость перемещения фермента замедляется. При кинетической задержке элонгации цепи , возникающей в результате включения
некомплементарного 3'-нуклеотидного остатка и возникновения ошибочной пары начинает проявляться активность другого центра ДНК полимеразы, расположенного вблизи центра полимеризации и, по-видимому, частично совмещающегося с ним. Этот активный
центр, катализирующий 3'->5'-экзонуклеазный гидролиз удаляет некомплементарный 3'концевой нуклеотидный остаток. Ошибочные пары возникают с частотой порядка 1: 104
- 1: 106. Дело в том, что ДНК-полимеразе на каждом шагу элонгации дДНК приходится
выбирать один из четырех различающихся по структуре дНТФ в условиях, когда матричный нуклеотидный остаток в образующейся паре также вариабелен из-за соседних нуклеотидных остатков, влияющих на конформацию односпирального участка матрицы в активном центре. Редактирующая активность фермента понижает частоту ошибок в 10-100 раз.
ДНК-полимераза копирует антипараллельные цепи ДНК
перемещаясь в 5 ' 3 ' направлении
Как можно объяснить, что ДНК-полимераза копирует антипараллельные цепи матрицы ДНК в одном 5 ' 3 ' направлении одновременно? Предложена модель, согласно
которой ДНК-полимераза формирует димер, связанный с другими необходимыми в репликативной вилке белками (реплисома) . Одна из цепей матричной ДНК, названная отстающей цепью, временно образует петли вокруг реплисомы так, что димер ДНК-полимеразы получает возможность перемещаться по обеим цепям в одном 3'  5 ' направлении одновременно на короткое расстояние. Мономер ДНК-полимеразы, копирующий эту
цепь обладает низкой процессивностью и через небольшой промежуток времени, синте-
зировав короткий отрезок ДНК, покидает матричную отстающую цепь. Эти короткие (до
1000 пар нуклеотидов) отрезки ДНК, образующиеся на отстающей цепи, получили название фрагментов Оказаки по имени Ф. Оказаки, впервые (1968) указавшего на прерывистый характер синтеза ДНК. Новое присоединение мономера ДНК-полимеразык матрице
происходит после предварительного синтеза нового праймера. Вторая половина димера
ДНК-полимеразыреплисомы , обладающая более высокой процессивностью, в чем ей помогают специфические белки, копирует дочернюю цепь ДНК без перерывов. Матричную
цепь, которая копируется без перерывов, назвали ведущей цепью. Так как репликативная
вилка довольно быстро (1000 нулеотидов в сек) продвигается по матрице вновь синтезируемые дочерние цепи и родительские цепи матрицы сразу формируют двойные спирали
ДНК. Предполагается, что только маленький отрезок матричной двойной спирали находится в одноцепочечном состоянии в данный отрезок времени. Праймеры ведущей и отстающей цепей (10-12 пар нуклеотидов) удаляются ДНК полимеразой I, обладающей репарирующей функцией с одновременной заменой рибонуклеотидов дезоксирибонуклеотидами. Промежутки, которые возникают между 3 '-ОН и 5 '- фосфатом , воссоединяются
лигазами ДНК, завершая тем самым процесс репликации.
Для перемещения ДНК-полимеразы молекулу матрицы следует «раскрутить»
Рис.8.25.Роль топоизомеразы в механизме репликации
Быстрое перемещение репликационной вилки обеспечивается непрерывным раскручиванием двойной спирали ДНК. Это способствует возникновению перед вилкой
сильного торзионного напряжение двойной спирали ДНК. Оно снимается при помощи
специальных ферментов, названных ДНК топоизомеразами. Топоизомеразы уменьшают торзионные напряжения двойных спиралей ДНК, катализируя расщепление двойной
- (топоизомеразы II) или одной цепи ДНК (топоизомеразы I). Разрывы цепей затем вновь
восстанавливаются топоизомеразами.
Ретровирусы внесли изменения в центральную догму
молекулярной билогии.
Особой формой репликации у прокариот является репликация с использованием
РНК в качестве матрицы для синтеза ДНК. Такая форма репликация обнаружена у ретровирусов (например, у HIV ретровируса, вызывающего СПИД) и катализируется ферментом РНК зависимой ДНК полимеразой или обратной транскриптазой.
Подобно другим РНК зависимым полимеразам, обратная транскриптаза - обладает высокой склонностью к ошибкам, посколько не обладает коррегирующей активностью. Схема репликации РНК ретровирусов следующая:
1. Вирусная РНК в клетке хозяина образует пары оснований со специфической молекулой тРНК, образуя праймер для репликации ДНК.
2. Обратная транскриптаза синтезирует ДНК с образованием смешаной ДНК-РНК
молекулы.
3. Рибонуклеаза H частично разрушает цепь РНК двойной РНК-ДНК спирали, удаляя 5 ' концевой отдел.
4. 3 ' конец вирусной РНК образует пары с освободившейся цепью ДНК, формируя
кольцевую структуру.
5. Обратная транскриптаза создает копию цепи ДНК генома, используя 3 ' конец
цепи ДНК в качестве праймера.
6. Оставшаяся цепь РНК удаляется , и вновь синтезированная цепь ДНК образует
комплементраную двойную спираль с первой цепью ДНК.
7. Образовавшаяся полная молекула ДНК внедряется в хромосому клетки- хозяина
Препарат 3 '-азидо-2 ' 3 '-дидезокситимидин (АZT), после превращения в соответствующий 5 ' трифосфат в клетках, является ингибитором фермента обратной транскриптазы вируса HIV. Другие аналоги нуклеозидов , типа 2 ' 3 '-дидезоксицитидин
(ддЦ) , 2 ' 3 '-дидезоксиинозин и 2 ' 3 '-дидегидро-3 '-дезокситимидин (d4T) после фосфорилирования в соответствующие трифосфаты блокируют удлинение цепи ДНК после
включения в ДНК.
Биосинтез ДНК у эукариот связан с циклом деления клетки.
В отличие от прокариот, которые делятся постоянно, синтез ДНК у эукариот тесно
связан с клеточным циклом. Клеточный цикл включает строго детерминированный ряд
последовательных процессов, которые можно разделить на два периода:
1) период клеточного роста , называемый " интерфаза ", и
2) период клеточного деления , называемый " фаза М " (от слова mitosis). В свою
оче
Рис.8.26.Фазы клеточного цикла.
редь, в каждом периоде выделяют несколько фаз (см рис.8.26). Основное время всего клеточного цикла занимает интерфаза (не менее 90% ) времени. Так, например, у быстро делящихся клеток высших эукариот последовательные деления происходят один раз в 16-24
часа, и фаза М длится 1-2 часа. Большая часть компонентов клетки синтезируется на протяжении всей интерфазы, и это затрудняет выделение в ней отдельных стадий. В интерфазе выделяют фазу G1, фазу S и фазу G2. Репликация ДНК клеточного ядра происходит в
" фазу S " (от слова synthesis). Период между фазой М и началом фазы S обозначен как
фаза G1 (от слова gap - промежуток), а период между концом фазы S и последующей фазой М - как фаза G2. Период клеточного деления (фаза М ) включает две стадии: митоз (деление клеточного ядра) и цитокинез (деление цитоплазмы).
Клетки могут выходить из митотического цикла на неопределенное время, сохраняя жизнеспособность и пролиферативный потенциал. Такие клетки называют покоящимися клетками, а сам переход называется переходом в состояние пролиферативного покоя или в G0-фазу.
Выход из состояния пролиферативного покоя требует специальных регуляторов.
Сигналы, стимулирующие пролиферацию очень разнообразны, они зависят от типа
клетки, стадии развития организма и других особенностей. Роль таких сигналов могут
выполнять различные факторы роста, интерлейкины, гормоны , способные поддерживать
или индуцировать пролиферацию определенных типов клеток. Пролиферативные сигналы
распознаются определенными рецепторами на поверхности клеток, в результате активируются внутриклеточные пути передачи сигналов , что, в свою очередь, приводит к активации определенного набора транскрипционных факторов , кодируемых генами раннего ответа .
Эти транскрипционные факторы ( c-Ets ,c-Jun, c-Myc ,c-Myb ,B-Myb ) активируют
синтез циклинов и циклин-зависимых киназ, которые кодируются генами позднего
ответа .
Затем комплексы циклинов и циклин-зависимых киназ , фосфорилируют белок
рRB , что оказывает положительный эффект на активность факторов E2F и приводит к
переходу через точку рестрикции ( G1/S ). Факторы E2F функционируют координированно с другими важными регуляторами клеточного цикла. Уровень и активность этих факторов по существу отражает интегральный ответ клетки на совокупность принятых ею сигналов пролиферации и дифференцировки. Отрицательными регуляторами пролиферации
являются супрессоры опухолей белки р53 и рRB, сходные по структуре белки р107 и р130
, а также ингибиторы циклин-киназных комплексов р15 , р16 , р21.
Правильное функционирование циклин-киназных комплексов, фосфорилирующих
белок рBR в строго определенных фазах, играет ключевую роль в регуляции клеточного
цикла. Исследования показали, что фосфорлирование pRB в конечном счете, регулирует
активность транскрипционных факторов семейства E2F и прохождение клеточного цикла
в целом.
Описание клеточного деления базируется на данных световой микроскопии в сочетании с микрокиносъемкой и на результатах световой и электронной микроскопии фиксированных и окрашенных клеток.
Во время S фазы кластеры репликационных вилок активируются одновременно во
всех хромосомах. Среднее расстояние между местами начала репликации сравнимо со
средним расстоянием между соседними петлями хроматина, что позволяет предположить,
что в каждой петле имеется лишь один участок начала репликации.
При расхождении двух репликационных вилок от одной точки начала репликации
по разные стороны от этой точки родительские нуклеосомы будут попадать в разные дочерние спирали ДНК. В этом случае от точного расположения места начала репликации в
транскрипционной единице (гене) будет зависеть распределение предсуществующих родительских гистонов между двумя дочерними генами. Не все нуклеосомы абсолютно одинаковы - в разных областях генетического материала структура хроматина различна.
Точное положение места начала репликации в гене могло бы поэтому иметь важное биологическое значение, так как определяло бы структуру хроматина этого гена в следующем
поколении клеток. По мере прохождения клетками фазы S активируются все новые и новые точки начала репликации . Так как соседние точки в каждой репликативной единице
разделены расстояниями от 30 000 до 300 000 пар оснований, время, необходимое для завершения синтеза, начатого в любой из точек, составляет от 5 до 50 минут. Поскольку
обычно фаза S продолжается 8 часов, уже где-то в середине этой фазы возникает сложная
задача, связанная с тем, что некоторые точки начала репликации к этому времени будут
полностью реплицированы и, по-видимому, идентичны (по крайней мере в отношении последовательностей ДНК) другим точкам начала репликации, которые еще не использовались. Тем не менее, каждая такая точка должна быть использована в фазе S только один
раз.
Однократность воспроизведения каждого участка ДНК связывают с существованием специальных ингибиторов, препятствующих повторной репликации уже реплицированных участков ДНК
У эукариот свой набор ДНК полимераз
Эукариоты отличаются от прокариот и по набору ДНК полимераз. Клетки млекопитающих содержат четыре различных ДНКполимеразы, а дрожжевые клетки, по крайней
мере, пять –α, β, γ, δ и ε.  Краткая характеристика свойств каждого фермента выглядит
следующим образом:
α - Характеризуется праймазной активностью, высокочувствительна к афидиколину –ингибитору полимеразной активности. Функционирует на отстающей цепи..
β - имеет низкую процессивность. Участвует в процессе репарации ДНК. В отличие от α обладает низкой чувствительностью к афидиколину.
γ - митохондриальная ДНКполимераза. Характеризуется низкой чувствительностью
к афидиколину.
δ - основная полимераза лидирующей цепи. Обладает высокой процессивностью,
которая поддерживается специальным белком, называемым антигеном ядер пролиферирующих клеток (PCNA) подобна холоферменту ДНКполимеразы III E. coli.
ε - функция этой полимеразы еще не полностью изучена.
Теломеры – «молекулярные часы клетки»
Особенностью репликации линейных молекул ДНК эукариот является сложность
репликации концевых отделов материнских цепей. Отстающая цепь репликативной вилки
в синтезе ДНК не может синтезироваться до 5'-конца в отсутствие праймера, который, в
свою очередь, не образуется непосредственно на концевом фрагменте. Потери концевой
ДНК делают невозможной бесконечную пролиферацию. Принято считать, что эта особенность лежит в основе «молекулярных часов», определяющих продолжительность жизни
соматических клеток Хромосомы позвоночных оканчиваются последовательностью
ТТАGGG, которая повторяется сотни и тысячи раз. Эти повторяющиеся последовательности получили название теломеры. Существование специальных структур на концах хромосом было постулировано в 1938 году классиками генетики, лауреатами Нобелевской
премии Барбарой Мак-Клинток и Германом Мёллером . Независимо друг от друга они обнаружили, что фрагментация хромосом (под действием рентгеновского облучения) и появление у них дополнительных концов ведут к хромосомным перестройкам и деградации
хромосом . В сохранности оставались лишь области хромосом, прилегающие к их естественным концам . Лишенные концевых теломер, хромосомы начинают сливаться с
большой частотой, что ведет к тяжелым генетическим аномалиям . Следовательно, заключили они, естественные концы линейных хромосом защищены специальными структурами . Г . Мёллер предложил называть их теломерами (от греч. телос - конец и мерос –
часть). В последующие годы выяснилось, что теломеры не только предотвращают деградацию и слияние хромосом (и тем самым поддерживают целостность генома хозяйской
клетки), но и, по-видимому, ответственны за прикрепление хромосом к специальной внутриядерной структуре [своеобразному скелету клеточного ядра], называемой ядерным
матриксом. Таким образом, теломеры играют важную роль в создании специфической архитектуры и внутренней упорядоченности клеточного ядра. Наличие на концах хромосом
специальной теломерной ДНК позволяет решить и так называемую проблему концевой
недорепликации ДНК .
Соматические клетки теряют от 50 до 200 нуклеотидов при каждом клеточном делении, что и является основой молекулярного механизма, определяющего продолжительность жизни этих клеток. В противоположность соматическим смертным клеткам, то есть
клеткам, обладающим пределом размножения in vitro, большинство «бессмертных» клеток, обладающих способностью к бесконечной пролиферации, содержит специальный
фермент теломеразу. Теломераза - это фермент, достраивающий свободные 3'- концы хромосом короткими повторяющимися последовательностями (в случае позвоночных TTGGGG) . Теломераза содержит собственную РНК-матрицу (рис.8ю27 ), поэтому может
быть отнесена к обратным транскриптазам.. Используя рибонуклеотид как матрицу, теломераза удлиняет молекулу ДНК, которая затем реплицируется с участием ДНК-полимеразы. Можно предположить, что ингибиторы обратных транскриптаз, такие как азидотимидин и карбовир, могут подавлять ее работу в клетке, вызывая процесс, похожий на старение клеток in vitro и включающий в себя постепенное прекращение пролиферации и специфическое изменение морфологии клеток
Рис.8.27.Синтез теломеров при участии теломеразы.
Генетический материал может изменяться и перестраиваться
Пострепликативная модификация ДНК. Одна из главных пострепликативных
реакций, которая оказывает влияние на структуру ДНК - метилирование. Субстратом естественного (не индуцируемого химически) метилирования эукариотической ДНК – являются остатки цитозина, которые входят в структуру динуклеотида ЦфГ. Цитидин ме-
тилируется по 5 положению кольца пиримидина с образованием 5-метиллцитидина. Метилирование ДНК хорошо изучено у прокариот. Функция этого процесса у бактерий защита распада своих молекул ДНК под влиянием рестриктаз, синтезируемых бактериями для борьбы с вирусами, молекулы ДНК которых не метилируются. Метилированый геном бактерии устойчив к действию этих ферментов. Точная роль метилирования ДНК у
эукариот недостаточно ясна. Первоначально предполагалось, что метилированная ДНК
реже участвует в транскрипции. Это нашло экспериментальное подтверждение для некоторых генов. Например, снижение метилирования MyoD гена (ген, регулирующий дифференцировку мышечных клеток путем регуляции экспрессии специфических для мышц генов) приводило к преобразованию фибробластов в миобасты. Эксперименты были выполнены на фибробластах, в условиях внедрения в фибробласты 5-азацитидина во вновь синтезируемую ДНК. Этот аналог цитидина не метилируется . В результате возникала ДНК с
низкой способностью к метилированию. Однако, снижение метилирования еще не является индикатором того, будет ли ген транскрипционно активным или нет.
Пострепликативное метилирование катализируется специальной метилазной системой . Эта система узнает образцы метилированых остатков Ц в материнской цепи
ДНК после репликации и меилирует остатки цитозина ЦфГ динуклеотидов дочерней
цепи.
Точечные мутации – результат влияния внешней среды на геном.
ДНК – удивительно устойчивая молекула. Недавно, часть ДНК, полученной от
2400 летней мумии, была изолирована и в ней исследована последовательность нуклеотидов. И, тем не менее, ДНК в хромосомах может изменять нуклеотидную последовательность под влиянием химических соединений, высокой температуры или радиации. Изменения в структуре ДНК могут также происходить спонтанно. Можно выделить повреждения ДНК четырех типов:
А. Повреждения, затрагивающие единичные нуклеотиды
Б. Повреждения, затрагивающие пары нуклеотидов.
В. Разрыв цепей
Г. Поперечные сшивки.
Отдельные примеры таких повреждений приведены в таблице 8.9.
Таблица 8.9. Повреждение ДНК и причины их вызывающие.
Повреждение ДНК
Примеры причин
Отсутствие основания
Депуринация (5000 пуринов за сутки на клетку)
удаление урацила (дезаминирование Ц) (100 за сутки
на клетку)
Измененное основание
Неправильное основание
Интеркаляция
Димеры пиримидинов
Одноцепочечные разрывы ДНК
Попепречные сшивки между цепями
Двуцепочечные разрывы
Ионизирующая радиация, алкилирующие реактивы
Мутация, вызванная неправильной коррекцией
ошибочно включенного основания
Ароматические соединения, вызывающие делеции и
вставки
Циклобутановые димеры, образующиеся под действием УФ облучения
Разрыв ионизирующей радиацией или химическим
реактивами (например блеомицином)
Ковалентное связывание цепей бифункциональными алкилирующими реактивами (митомицин)
Разрыв молекулы свободными радикалами
Рис.8.28.Некоторые формы точечных мутаций и их влияние на первичную структуру белка.
Такие изменения постоянно восстанавливаются целым рядом различных процессов репарации. Однако иногда изменившуюся последовательность нуклеотидов в ДНК не
удается восстановить к ее первоначальному состоянию; тогда возникает мутация. Мутация обычно происходит на одной из двух цепей ДНК. Для проявления мутации, клетка
должна разделится с образованием одной дочерней клетки несущей мутацию.
Различают несколько типов мутации. Замены одной пары оснований называются
точечными мутациями. Если в результате такой замены возникает бессмысленный кодон, мутацию называют нонсенс мутацией, если образуется кодон для другой аминокислоты - миссенс мутацией. Миссенс мутация, которая приводит к утрате функции гена
полностью, называется ноль (пустой) мутацией. Однако, многие миссенс-мутации оказывают более тонкие эффекты на функцию гена.
Например, они могут изменять функцию белка таким способом, что белок становится активным только при некоторых температурах. Такие чувствительные к температуре мутации - ценные инструменты, для изучения эффектов некоторых продуктов гена на
организм. Есть два вида точечных мутаций. Если пуриновое основание заменено другим
пуриновым, или пиримидиновое другим пиримидиновым, мутацию называют транзицией.
Замена пурина пиримидином, или наоборот, называют трансверсией.
Потеря одной или более пар нуклеотидов называется делецией. Вставка или делеция любого числа пар нуклеотидов, которое не кратно трем, вызывает изменение в рамке
считывания генетического кода. Такие мутации, поэтому, называют мутациями сдвига
рамки считывания. Мутация сдвига рамки часто генерируют бессмысленный кодон в рамке считывания, вызывая тем самым преждевременное завершение синтеза белка.
Рекомбинация ДНК. Рекомбинация ДНК относится к явлению, при котором две
родительских цепи ДНК подвергаются сплайсингу, обмениваясь частями их соответствующих цепей. Этот процесс приводит к образованию новых молекул ДНК, которые содержат смешанную генетическую информацию от каждой родительской цепи. Существует 3
главных формы генетической рекомбинации. Это - гомологичная рекомбинация, сайтспецифическая рекомбинация и транспозиция.
Гомологичная рекомбинация - процесс генетического обмена, который происходит
между любыми двумя молекулами ДНК, которые обладают областью (или областями) гомологичных последовательностей ДНК. Эта форма рекомбинации часто происходит,
когда сестринские хроматиды соединяются во время мейоза. Процесс гомологичной рекомбинации между материнскими и отцовскими хромосомами придает генетическое разнообразие организму. Гомологичная рекомбинация вовлекает в обмен большие области
хромосом.
Сайтспецифическая рекомбинация включает обмен между небольшими областями
последовательности ДНК (приблизительно 20 - 200 пар оснований) и требует узнавания
специфических последовательностей белками, вовлекаемыми в процесс рекомбинации.
Сайт специфическая рекомбинации используется, прежде всего, для изменения программ
генов, экспрессируемых на определенных стадиях развития. Наиболее изученная сайтспе-
цифическая рекомбинация у человека происходит при переустройстве генов иммуноглобулинов в В-лимфоцитах в ответ на презентацию антигенов. Это приводит к образованию чрезвычайно большого числа вариантов антител. Типичная молекула антитела состоит из тяжелых и легких цепей. Гены этих пептидных цепей модифицируются при участии
механизма сайтспецифической рекомбинации. Результатом такой модификации становится образование приблизительно 3000 различных комбинаций легких цепей и приблизительно 5000 комбинаций тяжелых цепей. Учитывая механизм сборки молекул иммуноглобулинов, возникает возможность образования свыше 10 000 000 различных молекул
антител.
Транспозиция ДНК- уникальная форма рекомбинации, при которой специальные
подвижные генетические элементы могут перемещаться от одной области в другую в
пределах одной хромосомы или на другую хромосому. Поскольку существует вероятность нарушения жизненно важных генов при транспозиции, этот процесс должен тщательно регулироваться. Однако точный механизм такой регуляции остается слабо изученным.
Транспозиция происходит чаще у бактерий и дрожжей чем у человека. Впервые о
возможности транспозиции в человеческом геноме стало известно после обнаружения в
геноме процессированных генов. Эти гены были комплементарны иРНК, кодируемой
нормальными генами. Они содержали поли(A) хвосты и в них отсутствовали участки,
комплементарные интронам нормального гена. Такие специфические формы генов возникли, по-видимому, путем обратной транскрипции, подобно генам ретровирусов с последующим включением их в геном путем транспозиции. Большинство таких процессированных генов функционально неактивны, поэтому они получили название псевдогены.
Некоторые перестройки генетического материала могут быть восстановлены.
Репаративные механизмы, которые использует клетка для поддержания стабильности информации, заложенной в ДНК универсальны - функциональная, а иногда и
структурная гомология элементов, образующих эти механизмы, прослеживается от бактерий до человека.
Рис.8.29. Общие принципы репаративного синтеза ДНК.
Чем сложнее клетка, тем большее количество структурных и регуляторных генов и
их продуктов участвуют в процессах репарации ДНК, хотя принципиальная схема конкретного процесса, как правило, остается неизменной.
Ключевой частью всех репаративных систем является распознавание дефекта в
структуре ДНК, который затем или сразу восстанавливается или маркируется специфическими белками.
Эксцизионная репарация ведущий способ восстановления изменений структуры ДНК
Основной механизм репарации большинства дефектов получил название эксцизионной репарации, в основе которой лежит удаление измененного основания или нуклеотида. Различают два принципа такой репарации - эксцизионная репарация оснований
(ЭРО) и эксцизионная репарация нуклеотидов (ЭРН). Биологическая функция ЭРО заключается в восстановлении исходной структуры модифицированных оснований ДНК.
Эта система высокоспецифична и состоит из специализированных ДНК-N-гликозилаз ,
которые опознают и удаляют поврежденные основания, АР-эндонуклеаз или АР-лиаз , которые, соответственно, расщепляют нить ДНК с 5'- или 3'-конца апуринового или апиримидинового (АР) участка; фосфодиэстераз (соответственно 5'или 3'), которые выщепляют
дезоксирибофосфатный остаток, и, наконец, ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы . К концу
90-х г.г. из бактерий (E. coli, Micrococcus luteus и др.) выделено до 8 различных N-гликозилаз, способных репарировать все известные модификации оснований. Несколько различных N гликозилаз обнаружены и в клетках человека. В целом, система ЭРО - чрезвычайно действенный барьер мутациям оснований. Обычно цепь реакций ЭРО начинается с
обнаружения и удаления одного из оснований, катализируемого соответствующим ферментом группы AP-эндонуклеаз типа II (апуриновых / апиримидиновых эндонуклеаз). Затем происходит гидролитическое расщепление 3'-фосфоэфирной связи, причем фосфат
остается в 5'-положении уходящей цепи ДНК. Далее с 3'-концом в месте расщепления
цепи связывается β -ДНК-полимераза , катализирующая гидролитическое удаление дезоксирибозилфосфатного остатка, таким образом освобождая 3'-конец для включения соответствующего канонической паре нуклеотида. Далее, после включения в освободившееся
положение соответствующего нуклеотидного остатка, ДНК-лигаза воссоединяет непрерывную цепь ДНК. Как в любой другой репаративной реакции, в системе ЭРО завершающим является ресинтетический этап, восстанавливающий правильность спаривания с помощью ДНК-полимеразы I (у E. coli) и ДНК-лигазы. Генетических заболеваний, сопряженных с нарушением системы ЭРО пока не обнаружено.
В отличие от реакций ЭРО, которые специфичны для достаточно узкого круга повреждений ДНК, система ЭРН, хотя и с разной эффективностью, удаляет все возможные
повреждения, и потому роль ее в поддержании стабильности генома велика. ЭРН детально
изучена у E. coli и активно изучается в клетках дрожжей и человека, причем у человека
благодаря раскрытию генетической природы таких заболеваний, как пигментная ксеродерма (XP), синдром Кокейна ( СS ) и трихотиодистрофия ( ТТD ) Стратегия ЭРН во всех
случаях, от бактерии до человека одинакова, хотя по мере усложнения объекта количество задействованных в реакции генов и их продуктов возрастает с 6-8 у E. coli до 30 у человека. Основные этапы ЭРН подобны ЭРО.
1) узнавание повреждения и изменения конформации ДНК вокруг него;
2) раскручивание участка ДНК в области повреждения;
3) эксцизия поврежденного участка ДНК и
4) ресинтетический этап, осуществляемый ДНК-полимеразой и ДНК-лигазой
Хотя детали процесса ЭРН у человека не ясны, так как не определена роль целого
ряда генов, в первом приближении он выглядит так. Белок ХРА в комплексе с белком
связывающим одноцепочечные ДНК RPA ( репликационным белком А ), перемещаясь
вдоль одноцепочечной ДНК, опознает конформационнoе повреждениe. Взаимодействуя
через другой участок белка ХРА с базальным фактором транскрипции TFIIH (две из субъединиц которого, белки ХРВ и ХРD , обладают геликазной активностью с противоположной ориентацией раскручивания двухцепочечной ДНК), они образуют комплекс, который
расплетает ДНК в области повреждения (в состав этого комплекса входит и белок ХРС с
неясными функциями). Через третий участок белка ХРА к комплексу примыкает гетеродимер ERCC1-XPF , который вносит однонитевой разрыв в ДНК с 5'-конца на расстоянии
16-25 нуклеотидных пар. от повреждения, тогда как белок XPG , входящий в комплекс
белков эксцинуклеазы через взаимодействие с белком RPA, делает надрез с 3'-конца на
расстоянии 2-9 нуклеотидных пар. (в разрезании принимает участие и белок ХРС, а белок
ХРЕ активирует реакцию). В результате бимодальной инцизии участок ДНК размером
около 29 нуклеотидов. высвобождается, а образующаяся брешь ресинтезируется с помощью ε ДНК-полимеразы или δ ДНК-полимеразы, сопутствующего репликации фактора
PCNА, репликационного фактора C-RFС и ДНК-лигазы I . Представленная картина во
многом основана на реконструировании процесса в открытой системе с участием 10 хорошо очищенных белков и не охватывает всех возможных участников этого процесса.
Димеры пиримидинов в ДНК удаляются двумя механизмами.
УФ облучение индуцирует образование пиримидин-пиримидиновых пар, чаще
всего между тиминами расположенными рядом в одной цепи ДНК. Для удаления таких
димеров используются 2 механизма репарации: ЭРН и фотореактивационная репарация. В
последнем случае участвует специальный фермент ДНК фотолиаза или фотореактивируемый фермент. Этот фермент связывается в темноте с димерами тимина и затем под действием света активируется
и исправляет повреждение.
Одноцепочечные
разрывы ДНК репарируются непосредственно с участием ДНК-лигазы или с
участием рекомбинации.
Таким образом, в клетке действует несколько систем репарации, позволяющих
сохранять генетическую информацию. Нарушение работы таких систем приводит к заболеваниям.
Пигментная ксеродермия. Аутосомно-рецессивное наследственное заболевание.
Существуют две основные клинических формы проявления XP, одна из них сопровождается прогрессирующими дегенеративным изменениям в глазах и коже, а другая, кроме
того, сопровождается прогрессирующей неврологической дегенерацией. Одним их тяжелых осложнений этого заболевания является рак кожи. Причины развития заболевания
связывают с дефектами ферментов, участвующих в репарации тиминовых димеров, однако генетические нарушения при этом заболевании насчитывают девять комплементационных групп, что указывает на сложность причин вызывающих это заболевание.
Синдром Кокейна – заболевание подобно пигментной ксеродермии, сопровождается чувствительностью к свету, дегенеративными изменениями нервной системы, но значительно более низкой склонностью к опухолям кожи.
Атаксия телеангиэктазия (АТ) - аутосомно-рецессивное заболевание, проявляющееся в мозжечковой атаксии и нарушении иммунной системы, что сопровождается
склонностью к инфекционным болезням. Больные проявляют высокую чувствительность
к рентгеновскому облучению, что предполагает возможность дефекта систем репарации у
таких людей. Известны и другие заболевания, вызываемые нарушением системы репарации.
Транскрипция – первый шаг на пути экспрессии генетической информации в клетке.
Информация, приведенная в предыдущем разделе, описывает механизмы передачи
и
Рис 8-30.Центральная «догма» молекулярной биологии.
хранения генетической информации. Однако молекула ДНК не используется в качестве
непосредственной матрицы в процессах фенотипической экспрессии генетической информации в клетке. Поток генетической информации идет в следующем направлении
Первый шаг, копирование информации с ДНК на РНК, назван транскрипцией, что
ассоциируется с работой средневековых монахов, проводивших свою жизнь в кельях за
копированием символ за символом, старых Латинских рукописей. При этом чаще всего
переписывались рукописи не целиком, а отдельными главами и хотя символы и слова в
новой версии - те же, что и в старой, однако они написаны уже другой рукой и тем самым
имели несколько иной вид.
Второй шаг, при котором аминокислоты полимеризуются согласно информации,
записанной в РНК, назван трансляцией. Продолжая аналогию с жизнью монахов, этот
процесс напоминает работу других монахов (уже много столетий спустя), которые, пользуясь переписанными прежде рукописями, находят эквиваленты старых латинских слов на
других языках (например, белорусском или английском) и создают новые рукописи, напи-
санные на отличающемся от исходного языке, в данном случае на языке аминокислотной
последовательности.
Настоящий раздел посвящен первому этапу – транскрипции.
Механизм синтеза РНК во многом напоминает синтез ДНК
Об участии в синтезе белков РНК известно с 40-х годов ХХ столетия, но роль иРНК как молекулы посредника стала известна в 1961 году благодаря работам французских
биохимиков Ф.Жакоба и Ж. Моно. В начале 60-х открывается и фермент, катализирующий синтез РНК – РНК-полимераза. В целом, механизм синтеза РНК по многим свойствам напоминает синтез ДНК. Для работы РНК-полимеразы необходимы:
1. Матрица. Роль матрицы, как правило, выполняет двуцепочечная ДНК.
2. Субстраты. Необходимы все четыре рибонуклеозид трифосфата АТФ, ГТФ, ЦТФ и
УТФ.
3. Ионы двухвалентных металлов. Обычно это ионы Mg2+.
Схема синтеза РНК может выглядеть следующим образом:
аАТФ+bГТФ+cЦТФ+dУТФ  РНК + (a+b+c+d) пирофосфат.
Синтез молекулы РНК идет в направлении 5’ 3’ с перемещением фермента по
матрице в направлении 3’ 5’. Механизм соединения нуклеотидов под влиянием РНК-полимеразы подобен синтезу ДНК и заключается в нуклеофильной атаке внутреннего фосфата очередного рНТФ 3’-ОН группой на конце растущей цепи. Необратимость реакции
связана с гидролизом пирофосфата, высвобождаемого в реакции синтеза РНК.
Однако существует и ряд особенностей в синтезе РНК. РНК-полимераза не нуждается в затравочном олигонуклеотиде (праймере), не обладает нуклеазной активностью,
перемещается значительно медленнее по матрице (приблизительно 50-100 оснований/сек
для РНК против около 1000 осн/сек для ДНК). Точек инициации транскрипция намного
больше чем у репликации. Число молекул РНКполимераз в клетке намного больше, чем
ДНК-полимераз. Наконец, точность полимеризации РНК - намного ниже, чем ДНК. Это
допустимо, так как дефектные молекулы РНК могут быть просто удалены и взамен синтезированы новые «правильные» молекулы.
Транскриптон (оперон) - единица транскрипции.
Синтез молекул РНК начинается в определенных местах ДНК, называемых промоторами и завершается в терминаторах. Участок ДНК, ограниченный промотором и терми-
натором, представляет собой единицу транскрипции - транскриптон (оперон у
прокариот). В пределах каждого транскриптона копируется только одна из двух нитей
ДНК, которая называется значащей или матричной. Во всех транскриптонах, считываемых в одном направлении, значащей является одна нить ДНК, в транскриптонах, считываемых в противоположном направлении, значащей является другая нить ДНК.
Рис.8.31. Структура промотора прокариот
Соседние транскриптоны могут быть отделены друг от друга нетранскрибируемыми участками ДНК, а могут и перекрываться, в частности так, что в пределах участка
перекрывания матричными оказываются обе нити. Разбиение ДНК на множество транскриптонов обеспечивает возможность независимого считывания разных генов, их индивидуального включения и выключения. У эукариот в состав транскриптона, как правило,
входит только один ген, у прокариот транскриптон может содержать несколько структурных генов.
Промоторы имеют сходное строение
Исследование структурных особенностей транскриптонов (оперонов) у прокариот
позволило выявить ряд общих последовательностей у всех прокариот в областях начала
транскрипции (промоторы) и терминации транскрипции. Согласование частот встречаемости оснований выявило 2 коротких консервативных участка последовательностей, расположенных на расстоянии 35 нуклеотидных пар в сторону 5’ конца от начала транскрипции
(область -30 на рис.8.31) и на расстоянии 10 нуклеотидов в ту же сторону (область -10).
АТ богатый участок области -10 получил название ТАТА бокса или Прибнов бокса. Учитывая более низкую температуру плавления такого участка, считается, что эта последовательность может быть легко денатурирована РНК-полимеразой и является удобным местом начала транскрипции. Обнаружены и консенсусные последовательности в областях
окончания транскрипции. Копирование таких последовательностей позволяет формировать в этой области первичного транскрипта шпилечные структуры РНК, которые способствуют диссоциации РНК-полимеразы и окончанию транскрипции.
Транскриптоны эукариот устроены значительно сложнее. В промоторной зоне
транскриптона выявляются зоны, которые указывают не только место начала транскрипции (как у прокариот), но частоту этого процесса.
Значительные различия коснулись регуляторной части транскриптона.. На расстоянии 27-30 пар нуклеотидов от сайта инициации расположен TATA-бокс, консенсусная последовательность которого выглядит как TATA(A/T)A(A/T) . Положение TATA-элемента
строго определяет сайт инициации транскрипции , т.е. 5'-конец транскрипта . При повреждении или удалении TATA-элемента образуется набор молекул РНК с разными 5'-концами. Отдельные нуклеотидные замены в TATA-элементе могут приводить к резкому снижению эффективности транскрипции. Промоторная зона некоторых генов (например, гена
гидроксиметилглутарилKoA-редуктазы - ключевого фермента биосинтеза холестерола у
человека) не содержит TATA-элемента, и транскрипция начинается с нескольких разных
сайтов. Образующиеся РНК различаются по 5'-концам в районе нетранслируемой лидерной последовательности. Возможно, различные лидерные зоны определяют характер регуляции экспрессии генов на уровне трансляции .
Расположенный дальше к 5’ концу участок регулирует базовую частоту транскрипции (ЦААТ бокс). Еще далее от начала сайта инициации располагаются последовательности, участвующие в изменении базового уровня транскрипции (энхансеры ускоряют, а
сайленсеры замедляют этот уровень) и, наконец, имеется группа последовательностей,
участвующих в регуляции экспрессии генов под действием различных внутри и внеклеточных регуляторов (гормонов, белков теплового шока, ионов металлов и т.д.). Указанные
регуляторные последовательности представляют собой места связывания специфических
бековых факторов.
Терминация транскрипции у эукариот - это пока довольно плохо изученный процесс. Известно лишь, что зона терминации расположена далеко за пределами 3’- конца кодирующей области. Эксперименты с разными искусственными конструкциями показывают, что для терминации транскрипции нужно существование в геноме зоны терминации и
обязательно расположенного перед нею сайта полиаденилирования . Если последний убрать, то транскрипция идет за зону терминации. В то же время зону терминации можно
удалять и приближать к сайту полиаденилирования, и терминация все равно будет происходить в ее пределах.
Нуклеотидные последовательности зон терминации, прилежащих к разным генам,
содержат ряд гомологичных областей, однако в настоящий момент вопрос о природе сигналов терминации остается открытым.
РНК-полимераза у прокариот –основной фермент синтеза всех РНК
РНК-полимераза, выделеная у прокариот катализирует синтез всех типов РНК
клетки. Это сложно устроенный фермент, состоящий из нескольких субъединиц, функции
которых приведены в следующей таблице.
Таблица 8.10. Свойства и функции субъединиц РНК-полимеразы.
Субъединица
Ген
Размеры
(кД)
Число на холофермент
Функция
β
rpoB
151
1
Полимеразная активность
β'
rpoC
155
1
Связывание с матрицей
α
rpoA
37
2
Структурный организатор полимеразы
σ
rpoD
70
1
Узнавание промотора
Коровый (основной) фермент состоит из 4-х субъединиц α2ββ’, после соединения с
σ - субъединицей превращается в холофермент, который и обеспечивает процесс инициации синтеза РНК.
У эукариот – 3 РНК- полимеразы
Из клеток эукариот выделены три типа РНК-полимераз, каждая из которых ответственна за транскрипцию различных групп генов. Эти ферменты названы РНК-полимераза I , РНК-полимераза II и РНК-полимераза III (Pol I,II,III). Полимеразы структурно сходны друг с другом. Молекулярная масса около 500 кД. В их состав может входить до 10
полипептидных цепей, причем некоторые из них одинаковы у разных полимераз, однако
есть и уникальные, характерные для каждой полимеразы субъединицы. РНК-полимеразы
эукариот и бактерий эволюционно родственны.
Pol I
рРНК
Pol II все иРНК, U1, U2, U4, U5 snRNA
Pol III 5S РНК, тРНК, U6 snRNA и другие маленькие РНК
Как видно, только одна из полимераз, РНК-полимераза II , участвует в синтезе иРНК, которая затем используется для синтеза белков. Кроме того эта же полимераза
участвует в образовании большинства малых РНК, которые образуют snRNP.
Что касается остальных полимераз, то РНК-полимераза I синтезирует высокомолекулярную рибосомную РНК , а РНК-полимераза III - разнообразные низкомолекулярные
стабильные РНК, в том числе тРНК и рибосомную 5S-РНК. РНК-полимеразы эукариот нечувствительны к ингибиторам бактериальных РНК-полимераз - рифампицину и стрептолидигину. Специфическим ингибитором РНК-полимеразы II является токсин бледной поганки - α-аманитин, использование которого помогло в открытии разных РНК полимераз:
РНК-полимераза I не чувствительна к нему; РНК-полимераза II обладает очень высокой
чувствительностью ; РНК-полимераза III ингибируется только под действием высоких доз
этого токсина.
Хотя синтезированные РНК-полимеразой II транскрипты составляют более половины РНК, синтезированной в результате транскрипции ДНК, большая часть РНК таких
транскриптов нестабильна и, соответственно, имеет короткий промежуток жизни. Следовательно, производные от нее гетерогенные ядерные РНК (гяРНК) в клеточном ядре и цитоплазматическая мРНК составляют лишь минорную фракцию тотальной клеточной РНК
Различия в механизмах транскрипции у про и эукариот связаны также с особенностями пространственной организации этого процесса. У прокариот отсутствует ядро и
поэтому синтезируемая иРНК без каких-либо изменений сразу включается в трансляцию,
продолжительность использования этой РНК небольшая и следует принципу одна РНК –
один белок. У эукариот эти процессы разобщены и молекулы РНК претерпевают значительные постранкрипционные изменения.
В транскрипции у прокариот важная роль принадлежит σ-фактору
Полный процесс инициации транскрипции и элонгации суммирован на рис.9-37.
Первый шаг в транскрипции связывание РНК-полимеразы с ДНК, с последующим перемещением к инициирующему участку ДНК.
1.Поиск промотора РНК-полимеразой начинается (рис.9-37, этап 1) с неспецифического (низкое сродство) связывания холофермента с ДНК, и последующего перемещения по ДНК, без диссоциации до достижения последовательности промотора, с которым
фермент связывается со значительно более высокой аффинностью. Этому способствует σ
фактор, потому что базовый фермент имеет одинаковое сродство к любой последовательности ДНК.
2.Первоначальное взаимодействие между холоферментом РНК-полимеразы и
промотором образует закрытый комплекс. с константой асссоциации Ka 106 и 109 M-1 в
0.1 М. NaCl. Цепь ДНК в этом комплексе не раскручена. Взаимодействие между компонентами электростатическое, поскольку Ka зависит от ионной силы. Комплекс относительно неустойчив, время его полураспада приблизительно 10 секунд.
3.РНК-полимераза раскручивает несколько пар оснований ДНК, от приблизительно -10 до -1, образуя открытый промоторный комплекс, названный так потому, что в нем
цепи ДНК, открыты, или раскручены. Эта чувствительная к температуре реакция происходит с полупериодом распада приблизительно от 15 секунд до 20 минут, в зависимости
от структуры промотора. Открытый промоторный комплекс чрезвычайно устойчив; его
трудно разрушить высокой ионной силой (Ka более чем 1014 M-1). Затем происходит Mg2+ зависимая изомеризация , формируя модифицированную форму открытого комплекса
промотора с раскрученной областью ДНК, занимающего от-12 до +2.
После того как РНК-полимераза свяжется с промотором с образованием открытого промоторного комплекса , фермент готов начать синтез цепи РНК. Во время элонгации РНК-полимераза использует участок связывающий один нуклеозидтрифосфат.
. Он связывает любой из четырех нулеозид трифосфатов (рНТФ). Другой связывающий
участок используется для инициации. Он связывает преимущественно АТФ или ГТФ, а
это означает, что большинство иРНК имеют пуриновые нуклеотиды на 5 ' конце.
1. Рост цепи начинается со связывания указанного матрицей рНТФ на специфическом инициирующем участке РНКполимеразы (рис.9-37. шаг 4),
2. Следующий нуклеотид связывается со специфическим участком элонгации .
3. Нуклеофильная атака 3 ' ОН группой первого нуклеотида на (внутренний) фосфат второго нуклеотида образует первую фосфодиэфирную связь и оставляет интактной трифосфатную половину на 5 ' положении первого нуклеотида.
Рис.8-32.Основные этапы процесса транскрипции
Большинство инициирований абортивно, и завершается высвобождением олигонуклотида от 2 до 9 нуклеотидов длиной. Еще не ясно, почему это случается. После синтеза
первых 10 нуклеотидов, σ− субъединица отделяется от комплекса транскрипции, и дальнейший процесс транскрипции катализируется базовой (коровой) полимеразой (Рис,
шаги 5 и 6). Хотя и σ субъединица покинула фермент, элонгирующий комплекс является
довольно устойчивым. Транскрипция, как показано in vitro, больше не ингибируется рифампицином. Элонгация, таким образом, продолжается до заключительного этапа.
Во время элонгации (рис.8.32, шаги 5 и 6), коровый феремент перемещается по
двуцепочечной матрице ДНК, и одновременно раскручивает ДНК, экспонируя одноцепочечную матрицу для образования пар с поступающими нуклеотидами и с образованием
транскрипта (вновь синтезируемая РНК). Фермент скручивает матрицу позади 3 ' конца
растущей цепи РНК. В модели, показанной в рис.8-33 приблизительно 18 пар оснований
ДНК раскручены, формируя движущийся " пузырь транскрипции. " Как только одна пара
оснований стано
Рис.8.33.Схема «пузыря транскрипции» в области активного центра РНК-полимеразы
вится раскрученной перед 3 ' концом возникающей цепи РНК, одна пара оснований скручивается у хвоста молекулы полимеразы РНК. Приблизительно 8 пар оснований 3 ' конца
возникающего транскрипта спарены с матричной цепью ДНК.
У E. coli терминация транскрипции может происходить двумя способами: фактор
зависимым и фактор независимыми способами. При фактор независимом способе роль
терминирующего сигнала выполняют 2 симметричных богатых ГЦ сегмента, которые
способны к формированию структуры шпильки. Формирование шпильки в РНК дестабилизирует ассоциацию между полимеразой и матрицей ДНК. Эта дестабилизация усиливается благодаря более слабым характером связей пар оснований AУ, которые формируются между матрицей и РНК, расположенных после шпильки. Транскрипция
большинства генов у E. coli терминируется этим способом.
Факторзависимая терминация требует узнавания последовательностей терминирующим белком rho. Этот фактор узнает и связывается с последовательностями на 3 ' конце РНК. Связывание дестабилизирует взаимодействие матрицы и полимеразы и останавливает транскрипцию.
У эукариот молекула РНК модифицируется после транскрипции.
По окончании транскрипции бактериальных р-РНК и т-РНК, они могут быть сразу использованы в трансляции. Никаких дополнительных изменений в структуре этих молекул
не происходит. Трансляция бактериальных иРНК может начинаться даже до окончания
транскрипции. Это связано с отсутствием границ между ядром и цитоплазмой. Способность инициировать трансляцию прокариотических РНК, до завершения транскрипции,
предоставляет уникальную возможность регуляции транскрипции некоторых генов. Еще
одна особенность бактериальных иРНК – они полицистронны
. Это означает, что один транскрипт является копией нескольких структурных генов У эукариот иРНК –копия одного гена.
В отличие от прокариот все типы эукариотических РНК подвергаются значитель-
ной
Рис 8.34. Строение «кэпа» и-РНК эукариот
посттранскрипционной модификации (процессингу). Вся совокупность ядерных транскриптов РНК-полимеразы II известна как гетерогенная ядерная РНК ( гяРНК ), поскольку
одна из основных характеристик, отличающих эту фракцию ядерных РНК - это чрезвычайно высокая вариабельность размеров входящих в нее транскриптов.
По мере синтеза эти транскрипты ковалентно модифицируются по 5'-концам и 3'концам таким образом, что они становятся отличными от транскриптов, синтезированных
другими РНК-полимеразами. Эти модификации будут позже использованы в цитоплазме
как сигналы того, что данные информационные РНК должны быть транслированы в белки.
Все 3 класса РНК транскрибируются с генов, которые содержат интроны. Последовательности, кодируемые интронами ДНК, должны быть удалены из первичного транскрипта до того, как РНК станет биологически активной. Процесс удаления копий интронных последовательностей получил название сплайсинга РНК.
Кэпирование и полиаденилирование иРНКопределяют дальнейшие особенности функций иРНК
В дополнение сплайсингу, у и-РНК происходит модификация 3’и 5’ концов. К 5 '
концу всех эукариотических иРНК (который синтезируется первым в процессе транскрипции) присоединяется во время процессинга остаток 7-метилгуанозина с образованием
уникальной 5 ' 5 ' фосфодиэфирной связи. Этот дополнительный нуклеотид получил название кэп или колпачек. Кэпирование происходит еще до завершения синтеза всей молекулы. Образующаяся структура на 5’ конце иРНК защищает РНК от экзонуклеаз и, что
не менее важно, ответственна за последующее связывание молекулы мРНК с рибосомой.
Рис.8.35.Схема полиаденилирования иРНК.
Сразу после завершения транскрипции или после специфического расщепления в
определенном месте растущей цепи РНК происходит полиаденилирование. Оно заключа-
ется в том, что специальный фермент - полиаденилатполимераза присоединяет к 3'-концу
каждого РНК-транскрипта, которому суждено стать молекулой мРНК, от 20 до 250 остатков адениловой кислоты (поли(А)), что и завершает процесс образования первичного
РНК-транскрипта. Полиаденилатполимераза узнает специфическую последовательность
AAУAAA. Этот фермент, обладающий несколькими активностями отщепляет от первичного транскрипта небольшрй фрагмент в 11-30 нуклеотидов и затем присоединяет
поли(А) последовательность Функции этой последовательности неизвестны. Принять считать, что такой "хвост" способствует последующему процессингу РНК и экспорту зрелых
молекул мРНК из ядра.
Процессы 5'-кэпирования и 3'- полиаденилирования характерны только для транскриптов, синтезируемых РНК-полимеразой II. Это можно объяснить специфическим взаимодействием ферментов, катализирующие эти процессы с РНК-полимеразой II, но не
взаимодействующих с РНК-полимеразами I и III . Необходимость маркировать подобным
образом концы молекул-предшественников и-РНК может служить объяснением, почему
эти молекулы синтезируются специальной РНК-полимеразой.
Сплайсинг – способ создания многообразия белков
После модификации концов иРНК наступает одна из самых сложных реакций процессинга -точное вырезание различных по длине внутренних участков (интронов ) и сшивание оставшихся, несущих смысловую нагрузку для кодируемого белка - экзонов . Совокупность реакций, происходяших при этом получила название сплайсинг.
На первый взгляд присутствие интронов в генах эукариот, казалось бы, является
бессмысленной тратой клеточной энергии затрачиваемой вначале на их включение в первичный транскрипт только для того, чтобы быть удаленным позже. Однако, присутствие
интронов защищают функционально активную часть генома клетки от повреждающего
действия химических илифизических (лучевых) факторов. Еще одна важная функция интронов позволяет при помощи так называемого альтернативного сплайсинга увеличить генетическое разнообразие генома без увеличения числа генов. В результате изменения распределение экзонов одного транскрипта во время сплайсинга возникают различные РНК
и следовательно различные белки. Альтернативный сплайсинг происходить или в определенных стадиях развития организма или в различных типах клеток.
Известны уже более 40 генов, транскрипты которых подвергаются альтернативному сплайсингу. Например, транскрипт гена кальцитонина, в результате альтернативного
сплайсинга дает РНК, которая служит матрицей для синтеза кальцитонина (в щитовидной железе ) или специфический белок, называемый белок, связанный с геном кальцито-
нина (CGRP, в мозге). Еще более сложному альтернативному сплайсингу подвергается
транскрипт гена α-тропомиозина. Были идентифицированы по крайней мере 8 различных
тропомиозиновых иРНК, полученных из одного транскрипта (см рис)
Нарушения процессов сплайсинга может вести к различным заболеваниям. Например, β талассемии связаны с дефектами генов, кодирующих β–глобины. Некоторые из
этих дефектов вызываются мутациями в последовательностях гена, обеспечивающих
узнавание интронов
В результате происходит нарушение процессинга первичного транскрипта гена β глобина.
Еще один тип заболеваний, связанный с нарушением сплайсинга связан с образованием
антител к белкам, участвующим в сплайсинге.
Рис.8.36.Схематическое изображение сплайсинга первичного транскрипта гена α-тропомиозина
. Так, например, причиной системной красной волчанки - одного из тяжелых заболеваний соединительной ткани, является образование антител к комплексу белок - U1
РНК сплайсеосомы .
Процессинг продуктов РНК-полимераз I и III не похож на процессинг иРНК
Если РНК-полимераза II катализирует транскрипцию большинства генов, кодирующих белки, гены, которые кодируют РНК с самостоятельным функциональным значением, транскрибируются РНК-полимеразой I и РНК-полимеразой III . Обычно эти гены
представлены в геноме большим числом копий, часто образующих кластеры тандемных
повторов.
Первичные транскрипты генов рРНК, известные как 45S-РНК образуются РНК-полимеразой I. Их длина около 13000 нуклеотидов. Перед тем как покинуть ядро в составе
собранной рибосомной частицы , молекула 45S-РНК подвергается специфическому расщеплению , в результате чего образуется по одной копии 28S-РНК (около 5000 нуклеотидов), 18S-РНК (около 2000 нуклеотидов) и 5,8S-РНК (около 160 нуклеотидов), которые
собственно и являются компонентами рибосом. Общее происхождение всех трех типов
рРНК из одного и того же первичного транскрипта служит гарантией того, что они образуются в равных количествах. Остальная часть этого транскрипта (около 6000 нуклеотидов) распадается в ядре. Возможно, что эти «лишние» последовательности молекулыпредшественника рРНК играют определенную роль в сборке рибосом, происходящих непосредственно по завершении синтеза 45S-РНК. Синтез предшественника рибосомных
РНК происходит в ядрышке, в котором находятся гены рибосомных РНК (рДНК). рДНК
представляет собой специализированные участки ( ядрышковые организаторы) нескольких хромосом. Для транскрипции рДНК in vitro, помимо самой РНК- полимеразы I, необходимы два фактора транскрипции - UBF и SL1
Транспортные РНК также синтезируются в форме больших молекул предшественников, которые затем подвергаются процессингу. Один из предшественников тРНК E.
coli –представляет первичный транскрипт в 950 нуклеотидов длиной, который расщепляется рибонуклеазой P на 7 различных молекул тРНК. Рибонуклеаза P – рибонуклеопротеид, содержащий молекулу РНК в 377 нуклеотидов, которая является фактическим ферментом. Это был первый пример так называемых рибозимов – ферментов, которые представляют собой РНК, а не полипептидные цепи. После завершения расщепления первичного
транскрипта тРНК происходит удаление дополнительных нуклеотидов на 5 ' и 3 ' концах
и к 3' концу каждой тРНК присоединяется последовательность 5 '-ЦЦА-3' ,а несколько
нуклеотидов основной структуры подвергаются модификации. В т-РНК были идентифицированы больше 60 различных измененных оснований .