МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М. В. ЛОМОНОСОВА Диагностика лазерно-индуцированных структурных изменений

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ
М. В. ЛОМОНОСОВА
На правах рукописи
Баранов Степан Андреевич
Диагностика лазерно-индуцированных структурных изменений
в хрящевой ткани методом спекл-интерферометрии.
02.00.04 - Физическая химия
02.00.09 - Химия высоких энергий
Диссертация
на соискание ученой степени кандидата химических наук.
Научные руководители:
академик РАН, проф. Лунин Валерий Васильевич
к.ф.-м.н., с.н.с. Свиридов Александр Петрович
Москва - 2007
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
2
Содержание.
Введение. ..................................................................................................................................................... 5 Глава 1. Обзор литературы. .................................................................................................................. 11 1.1. Хрящевая ткань и коллаген. ..................................................................................................... 11 1.1.1. Состав хрящевой ткани. ...................................................................................................... 11 1.1.2. Структура и денатурация коллагена II в хряще. ............................................................ 13 1.1.3. Определение содержания коллагена в образцах ткани биохимическими методами.
............................................................................................................................................................. 20 1.2. Влияние лазерного ИК нагрева на протеогликановую подсистему и выделение воды. 26 1.3. Взаимодействие лазерного излучения с биологическими тканями. .................................. 37 1.3.1. Распределение энергии при лазерном облучении биологических тканей. ................ 37 1.3.2. Виды лазерного воздействия по типу инициируемых процессов. ............................... 38 1.3.2.1. Фотохимическое воздействие. ....................................................................................... 38 1.3.2.2. Тепловое воздействие. ..................................................................................................... 39 1.3.3. Виды лазерного воздействия на биоткани по интенсивности. ..................................... 41 1.3.3.1. Низкоинтенсивное лазерное воздействие. ..................................................................... 41 1.3.3.2. Субабляционное лазерное воздействие. ......................................................................... 41 1.3.3.3. Абляционное лазерное воздействие. ............................................................................... 42 1.4. Метод спекл-интерферометрии. ................................................................................................ 44 1.4.1. Когерентность: пространственная и временная. ............................................................ 44 1.4.2. Формирование спеклов в дальней зоне дифракции. ...................................................... 48 1.4.3. Дифракция и спеклы. ........................................................................................................... 49 1.4.4. Биоспеклы. ............................................................................................................................. 53 1.4.5. Статистические функции описания спеклов. .................................................................. 58 1.4.6. Использование оптоволоконного жгута для передачи спекл-картин. ....................... 59 1.5. Заключение. ................................................................................................................................... 63 Глава 2. Спекл-интерферометрический анализ состояния вещества при нагреве. ................... 64 Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
3
2.1. Введение. ........................................................................................................................................ 64 2.2. Схема экспериментальной установки. ..................................................................................... 66 2.2.1. Общая аппаратная схема. .................................................................................................... 66 2.2.2. Основные элементы. ............................................................................................................. 68 2.2.2.1. Держатель ткани. ........................................................................................................... 68 2.2.2.2. He-Ne лазер. ...................................................................................................................... 68 2.2.2.3. ПЗС-камера. ...................................................................................................................... 69 2.2.2.4. Апертурная диафрагма. .................................................................................................. 70 2.2.2.5.ИК лазер. ............................................................................................................................ 71 2.2.2.6. ИК радиометр. ................................................................................................................. 74 2.2.2.7. Оптоволоконный жгут. .................................................................................................. 76 2.2.3. Расположение и временная синхронизация. .................................................................... 77 2.3. Сбор и расчет данных. ................................................................................................................. 78 2.3.1. Сбор данных. .......................................................................................................................... 78 2.3.2. Расчет статистических функций спеклов. ....................................................................... 79 2.3.3. Расчет интегральной приповерхностной температуры. ............................................... 81 2.4. Методика проведения спекл-интерферометрического анализа.......................................... 82 Глава 3. Динамика спеклов при нагреве низкомолекулярных соединений и белков. .............. 89 3.1. Введение. ........................................................................................................................................ 89 3.2. Материалы. ................................................................................................................................... 95 3.3. Результаты и обсуждение............................................................................................................ 96 Глава 4. Динамика спеклов при ИК лазерном нагреве хрящевой ткани. ................................. 101 4.1. Введение. ...................................................................................................................................... 101 4.2. Материалы. ................................................................................................................................. 105 4.2.1. Интактная хрящевая ткань. ............................................................................................. 105 4.2.2. Хрящевая ткань без протеогликановой подсистемы. .................................................. 105 4.3. Анализ коллагена биохимическим методом. ........................................................................ 107 Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
4
4.3.1. Предварительная подготовка образцов. ......................................................................... 107 4.3.2. Анализ гидроксипролина. ................................................................................................. 108 4.3.2.1. Реагенты. ........................................................................................................................ 108 4.3.2.2. Техника эксперимента. .................................................................................................. 109 4.3.3. Определение степени денатурации. ................................................................................. 110 4.4. Термический анализ. ................................................................................................................. 111 4.5. Результаты и обсуждение.......................................................................................................... 112 4.5.1. Динамика спеклов при диффузии и испарении воды в биологических тканях в
процессе ИК лазерного нагрева. ................................................................................................. 112 4.5.2. Динамика спеклов при ИК лазерном нагреве хрящевой ткани, обработанной
трипсином. ...................................................................................................................................... 116 4.5.3. Динамика спеклов при ИК лазерном нагреве интактной хрящевой ткани. ........... 121 4.5.4. Использование оптоволоконного жгута для регистрации спекл-картин. ............... 129 Выводы. ................................................................................................................................................... 132 Список литературы. ............................................................................................................................. 134 Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
5
Введение.
В связи с бурным развитием новых методов лазерной коррекции
формы хрящей и лазерной регенерации межпозвоночных дисков и суставных
хрящей увеличивается разрыв между практическим применением этих
методов и фундаментальными исследованиями. Решение этой проблемы
лежит в области междисциплинарных исследований и требует проведения
дополнительных исследований.
В настоящее время для коррекции формы перегородки носа,
регенерации
межпозвоночных
дисков,
гипертермии
опухолевых
новообразований успешно применяется умеренный локальный нагрев (до 70
- 80°C) биологических тканей лазерным излучением. Требуемый лечебный
эффект достигается, когда в нагреваемом объеме биологической ткани
происходят заданные условиями эксперимента (воздействия) изменения
физико-химических свойств, прежде всего механических, оптических и
термических. Особое научное и практическое значение приобретает
мониторинг этих свойств, который позволяет управлять процессом лазерного
воздействия на ткани с помощью систем обратной связи. Такой контроль
значительно снижает вероятность осложнений после лазерных процедур в
медицинской практике. Для мониторинга биологических тканей наиболее
оптимальны
неинвазивные
(неразрушающие),
экспрессные,
высокочувствительные методы, к которым можно отнести и метод
динамического измерения спеклов.
Формирование спекл-картин обычно происходит при отражении
когерентного света от случайно рассеивающей среды. В результате
интерференции световых лучей, пришедших от случайно распределенных
рассеивателей, на экране создается случайная структура распределения
интенсивности света в виде ярких и темных пятен (их и называют спеклами)
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
6
— спекл-картина. Если в случайно рассеивающей среде происходит
изменение движения рассеивателей или изменение их физико-химического
состояния, то эти изменения обязательно найдут отражение на спеклкартине. Динамика спеклов отличается высокой чувствительностью к
движению внутритканевой жидкости, к изменению скорости движения
рассеивателей и к структурным переходам. Так, например, неинвазивное
экспрессное измерение скорости кровотока – это один из способов
практического применения метода спекл-интерферометрии.
Однако при ИК лазерном нагреве биологических тканей, как правило,
одновременно происходят несколько физико-химических процессов, что
значительно усложняет интерпретацию динамических характеристик спеклкартин. В частности, ИК лазерный нагрев хрящей вызывает переход
связанной внутритканевой воды в свободное состояние, усиливает процессы
диффузии и испарения воды, приводит к денатурации белков, таких, как
коллаген.
Поэтому
для
диагностики
и
контроля
методом
спекл-
интерферометрии процессов, протекающих в биологических тканях под
действием ИК лазерного излучения, необходимо было выявить характерные
особенности поведения спекл-картин во время протекания изолированных
друг от друга (одиночных) процессов.
Кроме характерных особенностей поведения спекл-картин при ИК
лазерном нагреве, необходимо было выявить и факторы, влияющие на
динамику спеклов.
Хрящевая ткань является сложным объектом для исследований из-за
своего строения и состава. В ней крайне трудно разделить протекание
большинства физико-химических процессов. В связи с этим становятся
актуальными как проведение серии экспериментов на модельных системах
для изучения заданных физико-химических процессов, так и сопоставление
результатов этих экспериментов с результатами экспериментов, полученных
для
интактной
(незатронутой)
хрящевой
ткани.
В
частности,
для
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
7
моделирования процессов диффузии и испарения воды была предложена
модельная система “фильтровальная бумага – вода”, для моделирования
процесса денатурации коллагена – модельная система “хрящевая ткань,
обработанная трипсином, с разрушенной протеогликановой подсистемой”.
При изучении динамики спеклов важны и способы доставки
изображения.
Для
внедрения
метода
спекл-интерферометрии
в
хирургическую практику необходимо обеспечить передачу спекл-картин из
труднодоступных зон (полость носа, суставная сумка, межпозвоночный
диск). Передача изображения осуществляется посредством оптических
жгутов, какими обычно пользуются в эндоскопии. Оптический жгут состоит
из множества тонких оптических волокон, каждое из которых независимо
передает интенсивность света с входной поверхности жгута на выходную.
Для расширения области практического применения спекл-интерферометрии
важно сопоставить результаты измерения динамики спеклов с помощью
оптического жгута с результатами, полученными регистрацией спекл-картин
напрямую.
Целью
данной
работы
являлось
выявление
и
исследование
взаимосвязей динамического поведения спекл-картин и физико-химических
процессов, протекающих при ИК лазерном нагреве хрящей, в частности, при
денатурации коллагена, диффузии и испарении воды, а также развитие
неинвазивного (бесконтактного) метода диагностики и контроля состояния
хрящевой
ткани
при
ИК
лазерном
нагреве
на
основе
спекл-
интерферометрического анализа. В связи с поставленной целью работа была
направлена на решение следующих задач:
1.
Создание
методики
спекл-интерферометрического
анализа.
Разработка аппаратной схемы эксперимента для проведения в режиме
реального времени с осуществлением системы обратной связи спекл-
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
8
интерферометрического анализа структурных изменений в веществах при
умеренном ИК лазерном нагреве.
2. Исследование динамики спеклов при структурном переходе “твердое
тело - жидкость” (плавление низкомолекулярных органических соединений).
Определение характерных зависимостей статистических функций спеклкартин для данного процесса.
3. Исследование динамики спеклов при диффузии и испарении воды,
вызванных умеренным ИК лазерным нагревом, как в случае модельной
системы “фильтровальная бумага - вода”, так и в случае интактной хрящевой
ткани. Определение характерных зависимостей статистических функций
спекл-картин для данного процесса.
4. Исследование динамики спеклов при структурных изменениях,
вызванных денатурацией коллагена при умеренном ИК лазерном нагреве, в
модельной системе - “хрящевая ткань, обработанная трипсином, с
разрушенной протеогликановой подсистемой”. Определение характерных
зависимостей статистических функций спекл-картин для данного процесса.
5. Исследование динамики спеклов при структурных изменениях,
вызванных
умеренным
(неповрежденных)
ИК
хрящевых
лазерным
тканях.
нагревом,
Сопоставление
в
интактных
полученных
результатов с результатами от модельных систем. Определение характерных
зависимостей статистических функций спекл-картин для данного процесса.
6. Изучение возможности регистрации с помощью оптического жгута
динамики спеклов из скрытых
для прямого наблюдения участков.
Сопоставление результатов измерения динамики спеклов с помощью
оптического жгута с результатами, полученными съемкой спекл-картин
напрямую.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
9
Научная новизна диссертационной работы состоит в следующем:
1.
Впервые
была
представлена
методика
проведения
спекл-
интерферометрического анализа при умеренном ИК лазерном нагреве с
обеспечением временной и пространственной синхронизации измерительных
приборов, объединенных в систему с обратной связью в режиме реального
времени, для регистрации структурных превращений в веществах при
нагреве.
2. Впервые показана и изучена чувствительность статистических
функций спекл-картин к структурным переходам, вызванным фазовыми
переходами
первого
рода,
в
частности,
к
процессу
плавления
низкомолекулярных органических соединений.
3. Впервые выявлены и изучены факторы, приводящие к изменениям
динамики спеклов при умеренном ИК лазерном нагреве интактной
(незатронутой) хрящевой ткани. Показано, что основными факторами,
влияющими на статистические функции спекл-полей при умеренном ИК
лазерном нагреве биологических тканей, являются диффузия и испарение
воды, денатурация коллагена.
4.
Впервые
была
показана
возможность
использования
оптоволоконного жгута для регистрации динамики спеклов из скрытых для
прямого наблюдения участков, что может найти широкое применение в
медицинских системах.
Практическая значимость диссертационной работы состоит в
следующем:
1. Создан комплекс программ и предложена аппаратная схема
проведения спекл-интерферометрического анализа в режиме реального
времени с системой обратной связи для управляемого лазерного нагрева.
2. На основе найденных закономерностей показана возможность
контроля мощности умеренного ИК лазерного излучения методом спеклCopyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
10
интерферометрии для предотвращения денатурации коллагена в хрящевых
тканях, что может найти широкое применение в медицинских системах.
3.
Показана
интерферометрии
возможность
для
неинвазивной
использования
метода
(бесконтактной),
спекл-
экспрессной
регистрации структурных изменений, вызванных фазовыми переходами
первого рода, в частности, плавления низкомолекулярных органических
соединений.
Апробация работы.
Основные результаты работы были доложены на международных
конференциях “Saratov Fall Meeting: Coherent Optics of Ordered and Random
Media IV” (Саратов, Россия, 2003, 2005), на конференции “IV Съезд
фотобиологов России” (Саратов, Россия, 2005), на юбилейной конференции,
посвященной 25-летию ИПЛИТ РАН и 70-летию академика Е.П. Велихова
(Шатура, Московская область, 2005), на международной конференции
студентов и аспирантов по фундаментальным наукам (Москва, Россия, 2005).
Результаты работы включены в книгу “Лазерная инженерия хрящей”
[1].
Публикации.
По материалам работы опубликованы 5 статей и 2 тезиса докладов.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения
результатов и их обсуждения (три главы), выводов, списка цитируемой
литературы и приложения.
Работа изложена на 146 страницах машинописного текста и содержит
66 рисунков и 3 таблицы. Список литературы включает 142 наименования.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
11
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Хрящевая ткань и коллаген.
Действие ИК лазерного излучения на хрящевую ткань приводит к ее
термическому
нагреву
и
вызывает
протекание
множества
физико-
химических процессов, таких как денатурация, дегидратация, диффузия и
испарение внутритканевой воды. Хрящ – это сложный объект для
исследования. Тем не менее, в нем можно выделить два основных
структурных компонента – протеогликановую и коллагеновую трехмерные
надмолекулярные структуры – сетки. Лазерный нагрев может вызывать
структурные изменения в этих компонентах, приводить к их денатурации.
Важным
становится
регистрация
начала
процесса
денатурации
в
эксперименте и количественное измерение степени денатурации при ИК
лазерном облучении.
1.1.1. Состав хрящевой ткани.
Хрящевая ткань – одна из разновидностей соединительной ткани,
относящаяся
к
группе
тканей
опорной
функции.
Характерными
особенностями соединительных тканей являются малое количество клеток
(около 1% по массе), отсутствие нервов, и практически полное отсутствие
кровеносных сосудов. Хрящевая ткань содержит специализированные
метаболически
активные
клетки,
хондроциты,
интегрированные
в
межклеточный матрикс, который, в свою очередь, образован коллагеновыми
волокнами
и
основным
гликопротеинов). Функция
поддержанию
веществом
протеогликанов
и
хондроцитов сводится к производству
и
молекулярного
состава
(комплексом
и
регенерации
матрикса.
В
большинстве своем хондроциты формируют поликлеточные образования,
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
12
хондроны. Физико-механические и другие свойства хрящевой ткани
обусловлены свойствами матрикса.
Из органических веществ матрикс гиалинового хряща наиболее богат
коллагеном (от 50 до 70% сухого веса в зависимости от источника ткани).
Остальная часть матрикса состоит в основном из гликозаминогликанов
(ГАГ),
который
является
вторым
после
коллагена
преобладающим
компонентом матрикса хряща, из всех видов соединительной ткани хрящ
богат ими в наибольшей степени. Еще одним важным компонентом матрикса
являются неколлагеновые белки, состоящие в основном из гликопротеинов, к
полипептидным цепям которых присоединены небольшие углеводные
группы (олигосахариды), состоящие из гексозаминов, гексоз, фукозы и
сиаловых
кислот. Гликопротеины
и ГАГ образуют более крупные
макромолекулы – протеогликаны, которые, в свою очередь, отличаются
высокой плотностью отрицательного заряда, за счет которого и удерживается
внутритканевая вода. Коллагеновые волокна фиксируют протеогликановые
агрегаты.
Особенности структуры хряща на молекулярном и морфологическом
уровнях обеспечивают его прочность и эластоупругие свойства, то есть
способность к обратимой деформации с одновременным сохранением
возможности активного метаболизма.
Химический
состав
и
параметры
надмолекулярной
структуры
хрящевой ткани варьируются в зависимости от биологического вида и
возраста донора образца, а также от типа хряща и локализации донорской
зоны в пределах одного органа. Например, содержание гликозаминогликанов
может меняться от 2% до 7%, а содержание коллагена - от 5% до 26% для
хряща носовой перегородки человека. Это приводит к тому, что все
количественные
измерения,
отнесённые
к
коллагену
или
гликозаминогликанам, следует проводить на образцах хряща одной особи.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
13
Установлено, что матрикс хряща высокогидратирован – около 75%
сырого веса всех тканей приходится на тканевую жидкость, содержащуюся в
гелеобразной структуре матрикса. Тканевая жидкость является важным
компонентом
в
поддержании
жизнедеятельности
хондроцитов,
а
ее
взаимодействие с протеогликанами и коллагеном является решающим
фактором в формировании физико-химических свойств хряща.
Матрикс представляет собой гель, доли основных компонентов
представлены
в
пространственную
таблице
сетку
1.
Каркас
коллагеновых
матрикса
фибрилл,
представляет
сложным
собой
образом
связанную с протеогликановыми агрегатами. Каркас заполнен водой, часть
которой является свободной, а часть связанной, то есть входящей в
сольватную оболочку макромолекул. [1-10].
Таблица 1. Состав внеклеточного хрящевого матрикса.
Коллаген
10-30%
Протеогликаны
3-10%
Вода и растворенные электролиты
65-80%
1.1.2. Структура и денатурация коллагена II в хряще.
Как уже отмечалось выше, из органических веществ матрикс
гиалинового хряща наиболее богат коллагеном (от 50 до 70% сухого веса в
зависимости от источника ткани). Коллаген – основной белок (точнее
семейство белков) соединительной ткани, составляющий около 30% сухого
веса тела млекопитающих. Существуют коллагены разных типов (I-XX),
наиболее распространенными являются фибриллярные коллаген I (кожа,
сухожилия связки, фибриллярный хрящ) и коллаген II (гиалиновый хрящ). [1,
11].
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
14
Рисунок
1.
Схема
внутриклеточного
биосинтеза
и
внеклеточной
последовательной молекулярной самосборки коллагеновых структур. [1].
На схеме (Рис. 1) показаны основные этапы внутриклеточного синтеза
и
внеклеточной
самосборки
молекул
коллагена,
последовательной
организации надмолекулярных структур. [1]. Наиболее важной стадией из
перечисленных
на
схеме
(Рис.
1)
являются
гидроксилирование
аминокислотных остатков пролина и лизина с помощью пролил- и
лизилгидролаз
с
последующим
образованием
гидроксипролина
и
гидроксилизина (химических маркеров коллагена, специфичных только для
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
15
этого белка). Гидроксилированию преимущественно подвергаются остатки
пролина, находящиеся во втором положении после глицина [12].
Ещё один важный этап внутриклеточного синтеза – образование
дисульфидных связей между про-α-цепями, соединяющих как некоторые
участки одной и той же цепи, так и пропептиды соседних цепей. Межцепные
связи необходимы для формирования трёхспиральных макромолекул.
Собранные трёхспиральные макромолекулы проколлагена (транспортная
внутриклеточная
форма
коллагена)
–
предшественника
коллагена
–
представляют собой главную форму, в которой коллаген присутствует
внутри
синтезирующих
его
клеток.
В
этом
виде
макромолекулы
секретируются во внеклеточный матрикс, и только там происходит их
окончательное
межклеточный
превращение
матрикс
в
коллаген.
проколлаген
Так,
секретированный
подвергается
в
расщеплению
проколлаген-пептидазой с последующей посттрансляционной модификацией
(с образованием протофибриллы). Посттрансляционная модификация связана
с окислением лизина до аллизина (под действием лизилоксидазы) с
последующим
образованием
продуктов
конденсации
со
свободными
аминогруппами лизина, гистидина и аргинина и формированием внутри- и
межмолекулярных ковалентных поперечных связей (сшивок). [13,14].
Поскольку коллаген в течение жизни особи практически не претерпевает
изменений, сшивки накапливаются в организме, приводя к увеличению
жесткости коллагенсодержащих тканей с возрастом [15] и другим физикохимическим изменениям, в частности, к увеличению фракции коллагена с
более высокой температурой денатурации [16].
Таким образом, макромолекула фибриллярного коллагена представляет
собой три полипептидных цепи типа полипролина (тройная спираль),
закрученных в суперспираль (протофибрилла). По наиболее принятой
модели Smith (1968) [13, 17] пять молекул коллагена, сдвинутых между
собой на четверть длины молекулы, соприкасаясь боковыми поверхностями,
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
16
уложены в цилиндрический филамент (Рис. 2). Агрегация филаментов
формирует
типичную
гликопротеинов
образования
и
–
фибриллу
коллагена.
протеогликанов
коллагеновые
Фибриллы
объединяются
волокна
(которые
в
с
помощью
более
уже
крупные
видны
на
светооптическом уровне). При этом на всех уровнях сохраняется спиральное
скручивание элементов в структуре следующего порядка (наподобие жил в
канате), что придает коллагеновым образованиям особую прочность. При
анализе
рентгенограмм
коллагенсодержащих
тканей
и
препаратов
наблюдают дискретные брегговские рефлексы или пятна, что является
основанием утверждать, что коллагеновое волокно имеет кристаллическую
структуру
[18,19].
Упорядоченная
структура
коллагеновых
волокон
проявляется и при исследовании тканей другими структурными методами
[20,21,22].
Коллагеновые структуры хряща имеют уникальную организацию,
соответствующую биомеханической функции хрящевой ткани. В гиалиновом
хряще коллагеновые волокна не формируют пучки (в отличие от
волокнистого хряща). Они образуют сложную сеть, которая видна только при
электронной микроскопии, так как на светооптическом уровне волокна
маскируются протеогликанами. При частичном протеолизе протеогликанов
коллагеновые
волокна
визуализируются.
Прежние
представления
о
беспорядочном (неориентированном) расположении коллагеновых волокон в
гиалиновом хряще являются, таким образом, необоснованными.
В гиалиновом хряще подавляющее число коллагена принадлежит ко II
типу, который является маркером для хрящевой ткани. Он формирует
фибриллы с четкой периодичностью 64 нм, но более тонкие, чем фибриллы
из коллагена I типа (в среднем вдвое тоньше) и не образует плотных пучков.
Такая супермолекулярная организация способствует связыванию воды и
поддержанию гипергидратации ткани. [1].
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
17
Кроме коллагена II типа при гистоиммунохимическом исследовании в
гиалиновых хрящах обнаружены и другие коллагены. Так, согласно
господствующим в настоящее время представлениям [23] коллагены II, IX и
XI типов при фибриллогенезе образуют своеобразный гетерополимер, где
они связаны между собой поперечными связями, формируя гетерофибриллы
(Рис. 2).
Рисунок 2. Схема коллагеновой протофибриллы, состоящей из молекул
коллагенов II, IX и XI типов (по [23]). [1].
Идентифицировано шесть участков, где молекулы коллагена IX типа
ковалентно связаны с молекулами коллагена II типа или с другими
молекулами IX типа [24], причем каждая из трех цепей коллагена IX типа
(α1(IX), α2(IX) и α3(IX)) имеет от одного до трех участков поперечных
связей. Таким образом, коллаген IX типа, располагаясь на фибриллах
коллагена II типа, образует ковалентные мостики между ними, увеличивая
биомеханическую интеграцию и прочность коллагеновой сети, а также
сдерживая давление осмотического набухания протеогликанов. [1].
Под денатурацией белков понимают разрушение вторичной, третичной
и четвертичной структуры. Для коллагена это означает разрушение волокон,
раскручивание тройных спиралей макромолекул с образованием случайных
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
18
клубков полипептидных цепей, в которых возможно внутреннее вращение
звеньев вокруг простых связей [13,25]. На рентгенограммах таких систем
брегговские рефлексы исчезают. Это свидетельствует о том, что коллаген
перешел в аморфное состояние, которое называется желатиной [13,26-35].
Разрушение упорядоченной структуры волокна сопровождается его усадкой
[26,33], потерей двойного лучепреломления [34], кроме того, коллаген
становится
подвержен
действию
протеолитических
ферментов
[35].
Денатурация коллагена происходит в узком температурном диапазоне,
сопровождается
значительным
тепловым
эффектом
(60-70
Дж/г)
и
изменением объема (увеличением), давление в ходе денатурации не зависит
от соотношения фаз нативного и денатурированного коллагена. В тоже
время, при охлаждении коллагена и выдерживании в течение нескольких
часов, наблюдалось некоторое уменьшение объёма и восстановление
рентгеновских рефлексов, что было связано с частичным восстановлением
упорядоченной структуры. [19]. Все эти данные подтверждают, что
денатурация
коллагена
в
фибриллах
обладает,
подобно
плавлению
синтетических полимеров, характеристиками фазового перехода первого
рода
[18,26].
статистической
Теоретический
анализ
термодинамики,
плавления
проведенный
коллагена
Флори,
методами
показал,
что
температура плавления Tm коллагенового волокна должна увеличиваться по
мере уменьшения гидратации коллагеновых фибрилл (явление, аналогичное
криоскопии)
[18].
экспериментальными
Этот
факт
подтверждается
исследованиями
плавления
многочисленными
коллагена
методами
калориметрии и дилатометрии. Так, в работах Церетели [27,36-38] было
показано, что при уменьшении содержания воды от 80% до 5% температура
пика денатурации увеличивается от 65°C до 150ºС. Второй особенностью
плавления коллагена является зависимость Tm от количества поперечных
сшивок в коллагеновом волокне. Восстановление образующихся в первой
стадии
конденсации
оснований
Шиффа
и
искусственное
сшивание
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
19
коллагенового
увеличивает
волокна
органическими
температуру
искусственное
денатурации.
увеличение
количества
и
неорганическими
Так,
было
кросс-сшивок
агентами
показано,
что
добавлением
глутарового альдегида приводит к увеличению температуры денатурации
коллагена с 49,5°С до 70°С. [29-31, 33]. Температура плавления коллагена I в
нативном, полностью гидратированном волокне (30 и более молекул на
трипептид или свыше 70 % воды по весу), достигает 60-70°С. В работах
Игнатьевой [39,40,41] было показано совпадение термических свойств
коллагена II с термическими свойствами коллагена I (Tд = 65-80°C, ΔHд = 5560
Дж/г
коллагена),
была
установлена
стабилизирующая
роль
протеогликановых агрегатов на степень денатурации коллагена II в
гиалиновом хряще, препятствующая полной денатурации коллагена II в
биологических тканях.
Таким образом, коллаген является наиболее важным структурным
компонентом хрящевой ткани, выступая её каркасом, который, тем не менее,
имеет сложную структуру и взаимодействие с другими компонентами
биологической ткани. Биологическая ткань – динамическая система,
претерпевающая модификацию на протяжении всего времени своего
функционирования, что приводит к постоянному изменению свойств
коллагеновой
подсистемы,
например, температуры
денатурации.
Это
существенно усложняет контроль состояния ткани и требует разработки
специальных методов, позволяющих учесть индивидуальность строения
заданного образца хрящевой ткани.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
20
1.1.3. Определение содержания коллагена в образцах ткани
биохимическими методами.
Оценка степени денатурации коллагена при умеренном ИК лазерном
нагреве является ключевым при проведении термических экспериментов на
хрящевой ткани. В силу сложности строения биологической ткани очень
важно разработать методику определения коллагена нечувствительную к
другим компонентам ткани, которые могут внести в методику измерения
существенную ошибку. Как уже отмечалось выше, коллаген имеет
специфические маркеры гидроксипролин и гидроксилизин, поэтому анализ
степени денатурации коллагена должен быть основан на анализе содержания
именно этих специфических маркеров для избегания влияния других
компонентов.
Методы определения коллагена в образцах ткани можно разделить на
две большие группы, в одну из которых входят иммунохимические методы, а
в другую – все остальные. Иммунохимический анализ позволяет определять
непосредственно конкретные типы коллагена как определенной белковой
структуры, детектируемой как единое целое. Другой подход состоит в
первоначальном разрушении данной структуры на отдельные фрагменты (а
именно, полный гидролиз до аминокислот) и дальнейшем определении
заданной группы фрагментов или отдельных фрагментов. Именно такой
подход
реализуется
во
всех
остальных
методах,
основанных
на
аминокислотном анализе гидролизата белка.
Из иммунохимических методов применяется ELISA (Enzyme Linked
ImmunoSorbent Assay). Данный метод основан на абсолютной специфичности
связывания
Антиген-Антитело.
Он
широко
применяется
во
многих
биохимических исследованиях и позволяет оперативно получать данные о
наличии или отсутствии коллагена в образце, кроме того дает возможность
детектирования определенного типа коллагена [42,43]. К недостаткам метода
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
21
следует отнести необходимость получения антитела к данному коллагену и
применение специальных препаратов, что обуславливает его дороговизну и
применимость лишь в условия крупной и хорошо финансируемой научной
группы.
Иммунохимическое определение коллагена можно проводить как с
предварительным
разделением
белковых
компонентов
образца
электрофоретическим методом, так и без него [43,44].
Аминокислотный
анализ
основан
на
определении
содержания
гидроксипролина – иминокислоты, специфичной для коллагена (содержание
~ 13%). Наиболее точные результаты дает метод с предварительным
хроматографическим разделением аминокислот, так как это позволяет
обеспечить
“чистоту”
последующего
спектрофотометрического
детектирования гидроксипролина. Так, один из методов включает в себя
хроматографическое
детектирование
FMOC-производных
иминокислот
(пролина и гидроксипролина) [35]. Из недостатков метода можно назвать
сложность процедуры анализа, особенно стадии хроматографического
разделения, требующей наличия дорогостоящей аппаратуры.
Наиболее
интересной
спектрофотометрических
представляется
методов
для
возможность
определения
применения
содержания
гидроксипролина в образце без предварительного разделения компонентов
ткани, что значительно упрощает анализ и снижает его стоимость. При этом
на первое место выходит выбор спектрофотометрической реакции.
Один
из
способов
спектрофотометрического
определения
гидроксипролина основан на взаимодействии последнего с нингидрином
[45]. Нингидрин – гидрат 1,2,3-триоксоиндана – соединение, дающее
окрашенные продукты при взаимодействии с веществами, содержащими
аминогруппу.
аминокислоты,
Таким
образом,
поэтому
с
нингидрином
первоначально
взаимодействуют
производят
все
обработку
анализируемого раствора нитритом натрия, приводящую к окислению всех
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
22
аминогрупп с образованием спиртов и алкенов. Ключевым недостатком
метода является определение суммарного содержания гидроксипролина и
пролина по причине невозможности определения их отдельно при
совместном присутствии. Кроме того, спорно предположение об отсутствии
каких-либо химических превращений иминокислот на стадии избавления от
аминокислот, поскольку вторичные амины также взаимодействуют с
азотистой кислотой с образованием N-нитрозаминов [46].
Другой
метод
определения
гидроксипролина
основан
на
взаимодействии реактива Эрлиха с продуктом окисления гидроксипролина
[47-49]. Достоинством данного метода является высокая селективность по
отношению к гидроксипролину в присутствии других аминокислот, а также
различных полисахаридов (например, гликозаминогликанов хряща). Химизм
процесса можно описать следующим образом.
Структура гидроксипролина содержит в себе пирролидиновое кольцо,
способное к окислительному дегидрированию в пиррольное, которое
впоследствии может быть определено с помощью реакции взаимодействия с
реактивом Эрлиха – 4-(N,N-диметиламино)бензальдегидом [50]:
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
23
Соответствующая
хиноидная
структура
является
интенсивно
окрашенной (цвет зависит от заместителей и меняется от оранжевого до
сиреневого).
Окисление пирролидинового кольца облегчается за счет наличия
гидрокси-группы в четвертом положении.
В качестве окислителя используют различные хлорамины, в частности
хлорамин-Т
(натриевая
соль
N-хлоро-4-толуолсульфонамида).
К
достоинствам данной окислительной системы следует отнести дешевизну,
легкость разрушения избытка окислителя, отсутствие окрашенных продуктов
восстановления.
Первым
этапом,
по-видимому,
гидроксипролина
по
одновременно
окислителем,
и
атому
азота.
и
является
Поскольку
основанием,
хлорирование
хлорамин
как
является
натриевая
соль
сульфонамида, то из образующегося N-хлорпирролидина отщепляется
молекула хлороводорода с образованием пирролиновой системы.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
24
Далее происходит окисление спиртовой группы с последующей
енолизацией.
Образующаяся
2-H-пиррольная
структура
перегруппировывается в 1-H-пиррольную структуру посредством сдвига
протона. В общем виде схему превращений можно представить следующим
образом:
Образующийся пиррол вступает в реакцию Эрлиха с образованием
рубиново-красного соединения.
Реакция окисления ведется в водной среде в присутствии буферного
раствора с pH~6. Поскольку при данном pH среды реактив Эрлиха
нерастворим в воде, в систему добавляется органический растворитель,
хорошо смешивающийся с водой (первые члены гомологического ряда
алифатических спиртов, моноэфиры гликоля). В связи с возможностью
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
25
окисления бензальдегида хлорамином избыток последнего разрушают
добавлением хлорной кислоты. Выделение разрушения избытка окислителя в
отдельную
стадию
процесса,
предшествующую
обработке
п-
диметиламинобензальдегидом, имеет преимущества перед одновременным
добавлением реактива Эрлиха и кислоты, поскольку в последнем случае
остается возможным частичное окисление реактива Эрлиха [51].
Таким образом, исходя из литературных данных, был выбран и описан
метод определения содержания коллагена в хрящевой ткани, основанный на
взаимодействии реактива Эрлиха с продуктом окисления гидроксипролина,
на основе которого была разработана методика определения степени
денатурации коллагена, предложенная в главе 4 настоящей работы.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
26
1.2. Влияние лазерного ИК нагрева на протеогликановую
подсистему и выделение воды.
Движение воды в хрящевой ткани играет важную роль, так как из-за
отсутствия в ней сосудов именно за счёт диффузии внутритканевой воды с
растворёнными в ней питательными веществами происходит питание хряща.
Также вода помогает обеспечивать необходимые механические свойства
хрящевой ткани: она вытесняется из участка, испытывающего давление,
возвращаясь в него после прекращения воздействия [52]. В настоящее время
принята гипотеза, по которой вода, содержащаяся в хрящевой ткани,
классифицируется на два типа: "свободная" и "связанная". Несвязанная вода,
свободно перемещается, тогда как "связанная" вода при обычных условиях
остаётся неподвижной внутри ткани. [53-57]. Данная гипотеза стала
центральной
релаксации
при
рассмотрении
напряжения
и
механизма
изменения
лазерно-индуцированной
формы
хрящевой
ткани
под
воздействием умеренного ИК лазерного нагрева (решейпинг хрящевой
ткани). [1]. Несмотря на то, что точный механизм решейпинга хрящевой
ткани не известен, основной гипотезой на данное время является фазовое
превращение "связанной" воды внутри ткани в "свободную", происходящее
заметно при температуре около 70°С. [58].
Исходя из гипотезы перехода в хрящевой ткани "связанной" воды в
"свободную" при нагревании, авторы работы [59] провели изучение
термически-обусловленного поведения воды в хрящевой ткани носовой
перегородки кролика методами дифференциальной микрокалориметрии и
инфракрасной Фурье-спектроскопии. Они также провели теоретическое
моделирование
процессов
движения
воды
в
хряще
и
определили
коэффициент диффузии и энергию активации перехода внутритканевой воды
из связанного состояния в свободное.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
27
Рисунок 3. Термограмма поглощения. [59].
На полученных термограммах (Рис. 3) хрящевой ткани присутствовали
несколько пиков, но наиболее интересным оказался пик при 351К (~78°C)
(кривая 1), так как он исчезал при повторном нагревании образца хрящевой
ткани (кривая 2), но снова появлялся после его регидратации. Авторы работы
[59] связали данную температуру и процесс, проходящий при ней как раз с
переходом воды из связанного состояния в свободное. Оценка энергии
процесса исходя из кривой нагрева дала величину порядка 1.5±0.3 кДж/г, что
менее, чем наполовину больше величины энергии испарения обычной воды.
Это значение энергии также было отнесено к переходу "связанной" воды в
"свободное" состояние и названо теплотой процесса [60,61].
Параллельное измерение деформации (Рис. 4, кривая 2) образца
хрящевой ткани в процессе нагрева показало, что до определённого момента
нагревания размеры хряща увеличиваются (в связи с термическим
расширением), а потом наступает перелом, после которого следует только
уменьшение
линейных
размеров
образца
(в
связи
с
интенсивным
высвобождением воды) [60]. Примечательно, что перелом по времени
совпадает с началом плато на кривой нагрева (Рис. 4, кривая 1). Второй пик
на термограммах (Рис. 3) лежит в районе 373К и является энергией
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
28
испарения свободной воды. Авторы [59] провели оценку процентного
содержания связанной воды в хряще на основе сравнительного измерения
площадей пиков на термограммах и получили значение порядка 4% для
хряща носовой перегородки кролика.
Рисунок 4. Показаны два временных процесса. Кривая 1 – нагрев. Кривая 2 –
относительная деформация. [60].
Фурье-спектры "связанной" (спектр снимался с высушенного в течение
долгого времени хряща) (Рис. 5, кривая 3) и "свободной" (Рис. 5, кривая 2)
воды в хряще оказались различны между собой и также отличались от
Фурье-спектра дистиллированной воды (Рис. 5, кривая 1), в частности в
районе первого обертона при 5300 см-1. [59]. Кинетика выхода воды из хряща
и кинетика обратного набухания при разных температурах были изучены при
помощи Фурье-спектроскопии. Оказалось, что для невысоких температур
(298К, 300К, 321К) процесс выхода воды из ткани обратим, и кривая выхода
воды имеет три чётко различимых участка.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
29
Рисунок 5. Фурье-спектры поглощения для (1) чистой воды, (2) “свободной”
воды хрящевой ткани, (3) “связанной” воды хрящевой ткани. [59].
Рисунок 6. Содержание воды в хрящевой ткани при 321K со временем. [59].
Для более высоких температур первый участок отсутствовал (был
неразличим). Все три участка (Рис. 6) были описаны для всех температур при
помощи теоретической модели диффузии в бруске. Были рассчитаны
коэффициенты диффузии. Исходя из коэффициентов диффузии, была
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
30
определена энергия активации диффузии на участке II кривой (Рис. 6) как 1.7
кДж/г, которая оказалась близка к значению 1.5±0.3 кДж/г, полученному в
работе [61]. Участок кривой III (Рис. 6), который начинается, когда
количество оставшейся в хряще воды имеет порядок 4%, предположительно
отвечает переходу "связанной" воды в "свободную". Описание этого участка
с использованием кинетической теории превращения фаз оказалось
возможным только при температурах ниже 340К. Для этого диапазона
температур была рассчитана энергия фазового превращения (перехода
"связанной" воды в "свободную"), составившая 1.6 кДж/г, что хорошо
согласуется с теплотой перехода "связанной" воды в "свободную" 1.5±0.3
кДж/г, рассчитанной на основе кривых нагрева [61]. На основе теоретических
выкладок из экспериментальных данных был сделан вывод о том, что
процесс выхода воды из хряща обратим, если он происходит при
температуре, которая ниже температуры процесса превращения "связанной"
воды в "свободную". При более высоких температурах предположительно
происходят изменения в коллагеновой и протеогликановой подсистемах
хряща, ведущие к уменьшению свободного объёма внутри ткани и частичной
необратимости процесса высыхания хряща. Более того, процессы высыхания
и набухания (полностью или частично обратимые) могут быть описаны
одним и тем же решением задачи о диффузии в бруске с использованием
одних и тех же коэффициентов диффузии.
Другая, более поздняя работа этой же исследовательской группы была
посвящена изучению изменений коэффициентов адсорбции света хрящевой
тканью носовой перегородки и роговицей быка при нагревании методом
пульсовой фототермальной радиометрии [62]. Для нагревания использовался
лазер на свободных электронах с изменяемой длиной волны. Излучение этого
же лазера использовалось для измерения его адсорбции биологической
тканью. Набор длин волн включал в себя шесть и семь различных длин волн,
расположенных симметрично в пределах полос поглощения воды 2.9µм и
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
31
6.1µм соответственно. В результате получилось, что для всех длин волн до ~
50°C коэффициенты поглощения практически не меняются, а после 50°С они
начинают убывать с постоянной скоростью. В случае чистой воды известно,
что падение коэффициентов поглощения связано с дезагрегацией молекул
воды при росте температуры. В случае биологической ткани можно
предположить сходную причину, состоящую в разрыве связей водабиополимер (коллаген, протеогликановые агрегаты).
Как уже отмечалось выше, вода удерживается протеогликанами,
поэтому разрушение протеогликанов должно вести к высвобождению
“связанной” воды.
В работах [63,64] было показано, что лазерное облучение хрящевой
ткани уха свиньи вызывает диффузию из неё макромолекулярного материала
в раствор, тогда как из необлучённой ткани такой диффузии нет. При
помощи специфического красителя толуидинового синего подтвердили, что в
диффузате присутствуют протеогликановые компоненты. При помощи
хлорида бария было определено наличие в них сульфатных групп, что
характерно
для
гликозаминогликанов
хондроитинсульфата
и
кератансульфата. На хроматограмме раствора, в котором выдерживался
облучённый
хрящ,
присутствовали
два
пика.
Масса
макромолекул,
соответствующих пикам, по предварительным оценкам находилась в
промежутке между массой молекул хондроитинсульфата и массой молекул
кератансульфата. Таким образом, диффузия макромолекулярного материала
из облучённой хрящевой ткани, по-видимому, была связана с термическиобусловленным разрушением составляющих внеклеточного матрикса хряща,
предположительно,
протеогликановых
агрегатов
(отщепление
протеогликанов от цепочки гиалуроновой кислоты).
В работе [65] при помощи спектрофотометрического метода были
получены
и
охарактеризованы
кинетические
зависимости
диффузии
протеогликанового макромолекулярного материала из образцов хрящевой
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
32
ткани носовой перегородки коровы после лазерного облучения эрбиевым
волоконным лазером (длина волны 1.54 µм) до температур нагрева 50°С,
60°С и 70°С. Кинетические кривые диффузии из хрящевой ткани имели
логарифмическую форму и предел, когда количество вышедшего из ткани
макромолекулярного
материала
приближался
к
максимальному
его
количеству в хряще. Скорость диффузии макромолекул из образцов
хрящевой ткани (также, как и предельное их количество) рос в следующем
порядке: необлучённый образец < нагретый до температуры 50°С < нагретый
до температуры 60°С. Скорость диффузии из образца хряща, нагретого до
70°С,
оказалась
даже
ниже,
чем
из
необлучённого
образца,
что
предположительно связано с диффузионными ограничениями в хряще,
появившимися вследствие частичной денатурации коллагена в результате
нагрева до 70°С. В отличие от работ [63,64], где не было обнаружено
никакого выхода макромолекул из необлучённой ткани, в данной работе [65]
было показано, что для неё всё же происходит процесс диффузии. Вероятнее
всего, это связано с гораздо большим временем инкубации, которое здесь
составило от двух до семидесяти двух часов. Частичное разрушение
протеогликановой подсистемы хрящевой ткани в результате ИК лазерного
облучения было подтверждено гистологически при помощи окраски
толуидиновым
синим,
специфически
окрашивающим
кислые
мукополисахариды. Степень метахромазии в облучённых образцах хрящевой
ткани оказалась значительно ниже, чем в нативных. Оценка максимального
количества протеогликанового материала, вышедшего из ткани в раствор (из
образца, нагретого до 60°С) дала 23% от общего содержания протеогликанов
в хряще.
В работе [66] изучали поведение протеогликановых агрегатов в
различных условиях, в том числе и при нагревании в растворе методом
динамического светорассеяния. Изучались нативные агрегаты из культур
куриных хондроцитов и крысиной хондросаркомы и реконструированные
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
33
агрегаты из бычьего носового хряща и бычьего зародышевого эпифиза. В
результате
работы
протеогликановых
было
агрегатов
показано,
что
происходит
термическая
с
течением
диссоциация
времени
по
экспоненциальной зависимости (70°С, pH 7.4, 0.15 М NaCl). Выдерживание
реконструированных протеогликановых агрегатов в течение 5 часов при 70°С
(pH 7.4, 0.15 М NaCl) приводил к росту коэффициента диффузии до
величины, характерной для отдельной протеогликановой субъединицы (то
есть происходила диссоциация протеогликановых агрегатов с отщеплением
протеогликановых субъединиц от гиалуроновой кислоты). Однако, в
результате последующего охлаждения раствора до комнатной температуры,
коэффициент диффузии только незначительно падал и не возвращался к
начальному значению в течение нескольких недель (период наблюдения), что
явно свидетельствовало о необратимой денатурации, произошедшей либо со
связующим белком, либо с участком прикрепления протеогликанов к
гиалуроновой кислоте. Нагрев нативных протеогликановых агрегатов до
50°С и 60°С в 0.4M Gdn - HCl (ассоциативные условия), также привёл к
диссоциации их до протеогликановых субъединиц и гиалуроновой кислоты.
Примечательно, что при охлаждении растворов нативные агрегаты также не
вернулись к своим исходным размерам, а в случае 60°С размер частиц,
полученных при диссоциации, остался без изменения. Отсюда был сделан
вывод, что плотноупакованная нативная структура протеогликановых
агрегатов не может восстановиться после термической диссоциации.
В
работе
[67]
продемонстрирована
значительная
термическая
стабильность гиалуронан-связующего участка протеогликанов из гортанного
хряща свиньи. Протеогликаны нагревали до температур 80°С и 100°С в 0.5M
Gdn - HCl, pH 5.8 (ассоциативные условия), остужали через различные
промежутки времени и смешивали с гиалуронатом для определения
связывания. Количество связавшихся протеогликановых единиц определяли
при помощи гель-хроматографии. Выяснилось, что при 80°С период
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
34
полуразрушения гиалуронан-связующего участка протеогликанов составляет
148 минут, а при 100°С - 14 минут.
В следующей работе того же автора [68] методом вискозиметрии
изучалось влияние связующего белка на стабильность протеогликановых
агрегатов. В 0.5M Gdn - HCl, pH 5.8 (ассоциативные условия) агрегаты без
связующего белка активно диссоциировали в диапазоне температур 20°С60°С, тогда как стабилизированные связующим белком агрегаты имели
стабильную вязкость вплоть до 45°С. После достижения 55°С вязкость резко
падала и принимала новое стабильное значение через 90 минут. При 60°С эти
протеогликановые агрегаты имели такую же вязкость, как и агрегаты,
изначально не стабилизированные связующим белком. При охлаждении
вязкость снова возросла, но только до 82% от начального значения, и при
повторном нагревании агрегаты уже вели себя как не стабилизированные
связующим белком. Таким образом, падение вязкости при 55°С (50°С)
оказалось
необратимым.
Так
как
галуронан-связующий
участок
протеогликанов имеет очень высокую термическую стабильность, то падение
вязкости при 50°С можно отнести к необратимой денатурации связующего
белка, тогда как этого не происходит в 0.15М NaCl (pH 7.4). В 0.15М NaCl
(pH 7.4) связующий белок стабилизировал протеогликановые агрегаты даже
до 60°С.
Авторы работ [63,64] при помощи эксклюзионной хроматографии и
скорости
осаждения
изучали
изменения,
происходящие
с
хондроитинсульфатом в результате лазерного облучения Ho:YAG лазером.
Хондроитинсульфат, растворённый в фосфатном буфере до концентрации
10мг/мл, нагревали при помощи инфракрасного лазера до температур 70°С и
90°С.
Выяснилось,
что
лазерный
нагрев
приводит
к
уменьшению
молекулярной массы молекул хондроитинсульфата в растворе, тем более
сильному, чем выше температура облучения.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
35
В работе [69] действие лазерного излучения на хрящевую ткань
изучали методом сканирующей микроскопии атомных сил. Облучение
проводилось CO2 лазером с мощностью 50W/cm2 в течение 3 секунд и в
течение 30 секунд. На полученных изображениях было видно, что нагрев в
течение 3-х секунд не проводил к значительным изменениям структуры
хряща, только появлялись небольшие каналы с размерами 100-400 нм. В
связи с тем, что характерные размеры протеогликановой единицы
составляют 300-400нмХ80нм, было предположено, что вышеописанные
каналы являлись следами передвижения отщепившихся от гиалуроновой
кислоты в процессе нагрева протеогликановых единиц. В случае же образца,
облучавшегося 30 секунд, наблюдалось полное исчезновение структур
матрикса, которые присутствовали у необлучённой и облучённой в течение
3-х секунд хрящевой ткани. Матрикс выглядел бесструктурным и полностью
расплавленным. Под облучённой поверхностью также были обнаружены
субмикрометровые плоские кристаллы, которые преимущественно состоят из
карбоната натрия. Так как карбонат натрия является легкорастворимым
соединением, то вряд ли такая минерализация хрящевой ткани отвечала за
долговременный эффект изменения формы хрящевой ткани.
В работе [70] проводилось изучение сорбции воды препаратами
хрящевой и фиброзной соединительной тканей (в отличие от хрящевой
ткани, межклеточное вещество фиброзной соединительной ткани почти
полностью состоит из параллельных пучков коллагеновых волокон с
небольшим содержанием протеогликанов, которые декорируют волокна
коллагена и определяют их морфологию), высушенных до и после облучения
инфракрасным лазером (Er: fiber, длина волны 1.56 µм и Nd:YAG, длина
волны 1.32 µм) до температур 50°С и 70°С. Были рассчитаны коэффициенты
k и сорбционные ёмкости монослоя по уравнениям БЭТ и ГАБ. Оказалось,
что сорбционная ёмкость монослоя в облучённых образцах ткани меньше,
чем в необработанных. Для фиброзной соединительной ткани, нагретой до
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
36
70°С этот эффект связали с усадкой коллагена вследствие денатурации
(денатурация волокон коллагена, равновесно набухших в воде при
нормальных условиях происходит в районе 70°С). Из-за разрушения тройной
спирали коллагена исчезала связанная структурная вода, стабилизирующая
эту тройную спираль - она переходила в межфибриллярное пространство.
Для фиброзной ткани, нагретой до 50°С, уменьшение сорбционной ёмкости
слоя вероятнее всего происходило в связи с изменением надмолекулярной
структуры
ткани,
происходящей
из-за
нарушения
взаимодействий
коллагеновое волокно - декорирующие протеогликаны. В ряде работ было
показано, что при облучении фиброзных соединительных тканей до высоких
температур (не обязательно превышающих 70°С) происходит заметное
утолщение фибрилл коллагена за счёт слипания более тонких без изменения
их внутренней кристаллической структуры, причём тем более сильное, чем
выше мощность облучения. Слипание фибрилл и приводит к уменьшению их
общей поверхности, на которой происходит сорбция. В хрящевой ткани
также
наблюдали
уменьшение
сорбционной
ёмкости
монослоя
с
повышением максимальной температуры облучения, что тоже может
являться следствием нарушения взаимодействия в системе коллагенпротеогликаны.
Таким образом, ИК лазерный нагрев вызывает изменение и разрушение
протеогликановой подсистемы хрящевой ткани, что наравне с изменением и
разрушением
коллагеновой
подсистемы
ведет
и
высвобождению
и
выделению связанной воды, что может вести к существенному изменению
оптических свойств биологической ткани и её поверхности. Вторым важным
выводом служит обоснование необратимости разрушения протеогликановой
подсистемы, вызванным термическим воздействием.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
37
1.3. Взаимодействие лазерного излучения с биологическими
тканями.
1.3.1.
Распределение
энергии
при
лазерном
облучении
биологических тканей.
Цель лазерного облучения – ввести энергию излучения в локальный
объем ткани и стимулировать в нем требуемые фотохимические или
тепловые процессы, дающие благоприятный медицинский эффект. Для
решения этой задачи во многих случаях лазерное излучение не имеет
альтернативы. Однако следует учитывать, что значительная часть энергии
света отражается, рассеивается, или проходит сквозь целевой участок ткани.
На рисунке 7 схематично изображены процессы перераспределения световой
энергии падающего луча.
Рисунок 7. Распространение света при облучении биологических тканей. [1].
При попадании излучения на поверхность ткани примерно 4% энергии
излучения зеркально отражается согласно закону Френеля. Оставшаяся часть
излучения преломляется на шероховатостях поверхности и распространяется
в конусе, который расширяется по мере прохождения луча к цели. Поскольку
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
38
биологическая ткань обычно оптически неоднородная, то излучение
претерпевает множество актов рассеяния, при которых фотон меняет свое
направление, не теряя энергию. Из-за актов рассеяния фотоны случайно
блуждают в объеме биологической ткани, или, другими словами, диффузно
рассеиваются. Некоторые фотоны после многократного рассеяния выходят
обратно из ткани под случайными углами. Это диффузно отраженный свет.
Он спектрально зависим. Доля энергии диффузно отраженного света может
достигать 30 - 40% от энергии падающего луча.
Рассеянные фотоны постепенно удаляются от оси пучка, но в среднем
они сохраняют ее направление и формируют ореол вокруг конуса основного
пучка. Размер этого ореола и доля энергии, которая в нем содержится, в
значительной степени зависят от оптических свойств биологической ткани и
от поперечного диаметра пучка света.
Наиболее важным процессом, в результате которого энергия лазерного
излучения передается от лазерного луча в ткань, является поглощение. Оно
происходит при возбуждении электронных, колебательных и вращательных
состояний хромофоров,
входящих в состав биологической ткани. После
быстрой релаксации энергия возбужденных хромофоров трансформируется в
тепло. [1].
1.3.2. Виды лазерного воздействия по типу инициируемых
процессов.
1.3.2.1. Фотохимическое воздействие.
Лазерный луч с достаточно большой энергией фотонов (например, в
УФ - области спектра) может инициировать в биологических тканях цепь
химических превращений, которые способны вызывать как позитивные, так и
негативные отклики организма. К негативным явлениям обычно относят
неуправляемое генерирование свободных радикалов. Полагают, что они
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
39
могут оказывать мутагенное и канцерогенное действие [71]. В работе [72]
экспериментально показано, что УФ - излучение ArF эксимерного лазера (λ =
193 нм) индуцирует свободные радикалы в роговице глаза. В работе [73]
методом ЭПР доказано существование свободных радикалов в твердых
биологических
тканях
(кость,
хрящ)
и
их
компонентах
(коллаген,
хондроитинсульфат) при воздействии УФ - излучения эксимерных KrF (λ =
248 нм) и XeCl (λ = 308 нм) лазеров. Однако энергия фотонов видимого и тем
более ИК-диапазонов спектра чаще всего недостаточна для осуществления
подобных процессов. В той же работе [73] при исследовании воздействия ИК
- волоконного эрбиевого лазера (λ = 1.56 мкм) на хрящевую ткань показано
отсутствие радикалов.
1.3.2.2. Тепловое воздействие.
Тепловое воздействие лазерного излучения на биологические ткани
основывается на поглощении излучения и преобразовании его энергии в
тепло. Эффект зависит как от температуры, так и от длительности
воздействия. В таблице 2 приведена классификация реакций биологической
ткани на её нагрев в зависимости от температуры.
Стоит
отметить,
что
указанные
температуры
соответствуют
равновесным процессам, протекающим при медленном нагреве.
При температуре до 45°С не ожидается каких-либо необратимых
повреждений ткани (лишь при достаточно длительном нагреве может
произойти гибель клеток).
Прогрев тканей до температуры 42 – 45°С в медицинской практике
используется при стимулирующей локальной термотерапии [74].
При температуре около 60°С достаточно быстро наступает денатурация
белков. Она может быть полной и частичной, обратимой и необратимой.
Следует помнить, что скорость денатурации для различных белковых
структур может сильно отличаться друг от друга [75]. Так, быстрая
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
40
денатурация нативных волокон коллагена, благодаря многоуровневой
организации, происходит лишь при температуре около 80°С. В реальных
условиях
критическая
температура
начала
денатурации
большинства
тканевых компонент составляет около 55°С [71].
Таблица
2. Лазерное воздействие
на биологическую
ткань
в
зависимости от температуры:
Температура, °C
37
40-45
Реакция биологической ткани
нет изменений
активация ферментов, образование отеков, изменение
мембран и, в зависимости от времени воздействия,
смерть клеток
60
денатурация белков, начало коагуляции и некрозы
80
денатурация коллагена, дефекты мембраны
100
Обезвоживание
свыше 150
300>
Обугливание
выпаривание, газообразование
Заметное обезвоживание биологических тканей начинается при
температуре около 70°С. При достижении температуры кипения воды
внутритканевая вода превращается в пар и при этом создается значительное
избыточное давление. При медленном нагреве образующийся пар успевает
выйти из объема биологической ткани через множество пор. Такой процесс
называют фотовыпариванием [71].
Скорость нагрева ткани вблизи 100°С существенно уменьшается из-за
значительных затрат энергии на парообразования. После ухода воды
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
41
высушенная ткань быстро нагревается до температуры 150°С, при которой
начинается процесс карбонизации. При карбонизации из органических
молекул выходит водород и образуется мелкодисперсный углерод (сажа), то
есть происходит обугливание [76].
При температуре выше 300°С испаряется органический матрикс ткани.
1.3.3. Виды лазерного воздействия на биоткани по интенсивности.
1.3.3.1. Низкоинтенсивное лазерное воздействие.
Обработка тканей и органов в режиме низкоинтенсивного воздействия
не приводит к существенным изменениям структуры тканей, поскольку
температура ткани повышается всего на несколько градусов. Такое
повышение температуры приводит к стимуляции клеточной деятельности и
репарационных
процессов.
воспалительных
процессов
Авторы
в
[77]
коленном
отмечают
хряще
уменьшение
свиней
после
низкоинтенсивной обработки He-Ne лазером. Гистологические исследования
показали,
что
после
лазерного
воздействия
происходит
замена
повреждённого коллагена новым и образование хрящевых мостиков на месте
повреждённого хряща. Тот же эффект был отмечен авторами [78] после
облучения коллагенсодержащих тканей Ho:YAG - лазером.
1.3.3.2. Субабляционное лазерное воздействие.
Режим лазерной обработки ткани, при котором доза лазерного
излучения
ниже
порога
абляции,
называется
субабляционным.
Субабляционное лазерное воздействие на биологические ткани отличается от
низкоинтенсивного тем, что в нем средняя температура биологической ткани
повышается на несколько десятков градусов. В субабляционном режиме
осуществляются термотерапия (43 – 60°С), гипертермия (60 - 100°С),
остановка
кровотечения
(60-150°С),
термопластика
хрящей
и
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
42
коллагенсодержащих тканей (65 - 75°С) [61,79,80]. В пластической хирургии
субабляционный режим используют для лазерной сшивки и сварки
повреждённых хрящевых и других коллагенсодержащих тканей [81][82].
Температура должна находиться в диапазоне 60 – 80°С.
Сравнительно новая технология изменения формы хрящей с помощью
лазерной обработки также осуществляется в субабляционном режиме
[58,61,83]. Эта технология уже успешно используется в клинике для
коррекции
формы
носовой
перегородки.
Она
открывает
широкие
перспективы для осуществления принципиально новых типов операций в
пластической и эстетической хирургии с применением лазерного излучения.
Метод
основан
на
эффекте
релаксации
внутренних
механических
напряжений хрящевых тканей при нагреве до температуры примерно 65 –
75°С. При этом хрящ устойчиво сохраняет новую форму. С помощью
лазерного излучения прогрев хрящевой ткани можно осуществить во всем
объеме за время, в течение которого не успеют произойти существенные
разрушения матрикса, а клетки сохраняют свою жизнеспособность, и в то же
время успевают произойти процессы, изменяющие физико-химические
свойства хрящей.
1.3.3.3. Абляционное лазерное воздействие.
При
достаточно
высокой
интенсивности
лазерного
излучения
органические компоненты биологической ткани механически разрушаются
под действием импульса давления, создаваемого паром, и распадаются на
атомы и молекулы под действием высокой температуры (пиролиз).
Описанный процесс называется лазерной абляцией биологической ткани.
При импульсной абляции [83,84] вместе с перегретым материалом из ткани
удаляется и большая часть тепловой энергии, а ее незначительный остаток
приводит к минимальным термическим повреждениям за пределами
абляционного кратера. Изменения в хрящевой ткани при воздействии
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
43
импульсного СО2-лазера, интенсивность которого более чем в 20 раз
превышает пороговое значение (50 Вт/см2), необходимое для лазерного
изменения формы хрящей, выглядят следующим образом (по мере убывания
интенсивности излучения и удалении от облучаемой поверхности [83]):
1) обугливание хрящевой ткани;
2) коагуляционный некроз с полным разрушением хондроцитов и
термической деструкцией матрикса;
3) спекание и значительная деформация хондроцитов, выпаривание
тканевой жидкости и нарушение упорядоченной структуры матрикса;
4) повреждение оболочки и незначительная деформация хондроцитов,
изменение тонкой структуры протеогликанов, незначительные изменения
внутренней структуры хондроцитов без заметного изменения матрикса.
Таким образом, лазерный нагрев биологических тканей может
приводить к изменениям (часто - к весьма существенному) их оптических и
механических свойств. Варьируя мощность и время лазерного излучения
можно добиться желаемого режима воздействия на биологическую ткань
неивазивным, экспрессным и направленным способом. Лазерные системы
обладают минимальным временем отклика и наиболее перспективны для
использования в системах с обратной связью. Более того, так как лазерный
нагрев, как правило, локальный, то это обуславливает неравновестность
распространения тепла в ткани, что может приводить к существованию более
прогретых зон, находящихся в глубине ткани, к локальному перегреву в
заданных глубинных или приповерхностных областях, не затрагивая
прилегающие ткани, что, в свою очередь, позволяет осуществлять
уникальные режимы воздействия лазерного излучения на ткань, которые
невозможно
добиться
предпочтительным
иными
режимом
источниками
нагрева
нагрева.
хрящевой
ткани
Наиболее
является
субабляционный режим нагрева, который был использован при проведении
экспериментов в настоящей работе (Глава 4).
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
44
1.4. Метод спекл-интерферометрии.
В последние время исследователи уделяют все большее внимание
моделированию
химических
и
экспериментальному
изучению
динамики
физико-
процессов, происходящих в биологических тканях при
механических и термических воздействиях. Повышенный интерес к ним в
основном связан с развитием термических лазерных технологий для
медицины.
Наиболее
перспективными
для
изучения
динамических
превращений в биологических тканях являются оптические методы. Они
обладают рядом характерных преимуществ:
- неинвазивность;
- высокое пространственное разрешение;
-высокая чувствительность датчиков оптического излучения;
- спектральная селективность по отношению к различным компонентам
тканей;
- возможность применения оптических зондов in vivo.
В качестве оптического динамического метода может быть выбран
метод
спекл-интерферометрии.
Этот
метод
позволяет
наблюдать
за
изменением структуры поверхности в отраженном свете или структуры
рассеивателей в объеме в прошедшем рассеянном свете.
1.4.1. Когерентность: пространственная и временная.
При когерентном освещении случайно-неоднородных объектов, таких,
например,
как
шероховатая
поверхность
или
прозрачная
среда
с
флуктуирующим в пространстве показателем преломления, в рассеянном
поле формируется спекл-структура. Спекл-структура (англ. speckle —
крапинка, пятнышко) — это случайная интерференционная картина, которая
образуется при взаимной интерференции когерентных волн, имеющих
случайные сдвиги фаз и/или случайный набор интенсивностей. На такой
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
45
картине, как правило, можно отчётливо наблюдать светлые пятна, крапинки
(их и называют спеклами), которые разделены тёмными участками
изображения. Когерентное излучение может быть реализовано как лазерами,
так и обычными источниками света широкого спектрального диапазона с
протяжённым телом светимости, излучающим частично когерентный свет с
малой длиной временной когерентности и малой областью пространственной
когерентности. При рассмотрении
временной
когерентности
важным
является способность светового пучка интерферировать с запаздывающим
(но не смещенным в пространстве) вариантом этого луча. Такое разделение
светового луча называется делением амплитуды. Когда речь идет о
пространственной когерентности, важным становится способность светового
пучка интерферировать со смещенным в пространстве (но не задержанным
во времени) вариантом этого пучка. Такой тип разделения света называется
делением волнового фронта.
В оптике понятие когерентности вводится для характеристики
cкоррелированности световых колебаний в различных точках пространства и
в различные моменты времени. Поэтому наиболее логично степень
когерентности определять посредством корреляционной функции светового
поля. Рассмотрим для простоты поляризованное поле, вектор напряженности
электрического поля E в котором колеблется в определенном направлении.
Если вектор напряженности содержит компоненту, случайным образом
изменяющуюся по пространственным координатам r и по времени t, то
можно построить следующую корреляционную функцию:
B ( r1 , t1 , r2 , t 2 ) = E ( r1 , t1 ) E ∗ (r2 , t 2 ) ,
где угловые скобки означают усреднение по всему пространству и по
всему интервалу времени наблюдения, а «звездочка» при втором множителе
обозначает комплексно сопряженную величину. Для полей, статистические
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
46
характеристики которых во времени не меняются (такие поля называются
стационарными):
B(r1 , t1 , r2 , t 2 ) = B(r1 , r2 , t1 − t 2 ).
Принято выделять также статистически однородные поля, для которых
корреляционная функция зависит лишь от разности r2 - r1:
B(r1 , t1 , r2 , t 2 ) = B(r2 − r1 , t1 , t 2 ).
Однородное
случайное
поле
называется
изотропным,
если
корреляционная функция зависит лишь от абсолютного значения расстояния
между
двумя
точками ρ = r2 − r1
Таким
образом,
для
стационарных,
однородных и изотропных полей с изменяющимся по случайному закону
вектором E:
B(r1 , t1 , r2 , t 2 ) = B(r2 − r1 , t 2 − t1 ),
где τ = t 2 − t1 . Корреляционная функция B ( ρ ,τ ) принимает максимальное
значение при ρ = τ = 0 .
Введем теперь применительно к световому пучку нормированную
корреляционную функцию γ:
γ (r1 , r2 , t1 , t 2 ) =
B (r1 , r2 , t1 , t 2 )
I (r1 , t1 ) ⋅ I ( r2 , t 2 )
,
где I(r1,t1) I(r2,t2) - значение интенсивности пучка в указанных
пространственных точках и в указанные моменты времени. В случае
стационарности поле светового пучка:
γ (r1 , r2 ,τ = t 2 − t1 ) =
B (r1 , r2 ,τ )
I ( r1 , t1 ) ⋅ I (r2 , t 2 )
.
Построенную таким образом величину γ называют комплексной
степенью когерентности, так как корреляционные функции в общем случае
комплексны.
Абсолютную
величину
γ
называют
модулем
степени
когерентности или просто степенью когерентности. Степень когерентности
всегда удовлетворяет неравенству:
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
47
γ (r2 , r1 ,τ ) ≤ 1.
γ (r2 , r1 ,τ )
при
τ=0
дает
значение
степени
пространственной
когерентности, а при r1=r2 - значение степени временной когерентности.
Значения ρ=ρк и τ=τк, при которых степени пространственной и временной
когерентности уменьшаются в два раза, называются соответственно
размером зоны когерентности и временем когерентности.
Заметим, что размер зоны пространственной когерентности для
спеклов определяет размер спеклов, а временная когерентность на большом
ансамбле
частиц
определяет
функцию
контраст,
которая
позволяет
описывать поведение спеклов. [85-88].
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
48
1.4.2. Формирование спеклов в дальней зоне дифракции.
Рассмотрим некоторые оптические схемы наблюдения спекл-картин в
дальней зоне дифракции, представляющих собой результат интерференции
когерентных волн от отдельных неоднородностей поверхности объекта. На
рисунке 8,а представлен фрагмент спекл-структуры.
Рисунок 8. Спекл-картина в поле дифракции лазерного пучка на шероховатой
поверхности (а) и различные оптические схемы наблюдения спекл-картин (б,
в). 1 – источник света, 2 – случайно-неоднородный объект или среда, 3 –
схематичный вид продольного сечения слоя спекл-структуры, 4 – хаотически
искаженный волновой фронт, 5 – изображающая оптическая система. [86].
В схеме на рисунке 8,б спекл-структура формируется в свободном
пространстве и называется объективной спекл-картиной. Такие картины
легко наблюдать с использованием лазерного излучения. Субъективные
спекл-картины (Рис. 8,в) наблюдаются в изображающих оптических
системах. При формировании субъективных спекл-картин следует учитывать
влияние оптической системы, что существенно усложняет интерпретацию
результатов.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
49
Объективная спекл-картина легче описывается, поэтому исследователи
при эксперименте часто используют именно открытую систему регистрации
спекл-картин. [86,89,90].
1.4.3. Дифракция и спеклы.
Спекл-структура несет информацию о свойствах объекта, на котором
рассеялся свет лазера. При этом следует разделять два типа спекл-полей:
развитое и частично-развитое. Первый тип, развитое спекл-поле наблюдается
при
дифракции
широких
лазерных
пучков
на
сильношероховатой
поверхности или сильнорассеивающем случайном транспаранте. При этом
предполагается, что если число неоднородностей освещенного участка
поверхности достаточно велико, то комплексная амплитуда рассеянного поля
подчиняется гауссовому распределению. При этом не играет роли, какова
была исходная статистика отдельных компонентов En, участвовавших в
формировании результирующего поля. В соответствии с принципом
Гюйгенса-Френеля выражение для амплитуды рассеянного поля может быть
записано в виде суммы:
N
U s = ∑ En ,
n =1
где N – число независимых областей на освещенном участке
поверхности, En – вклад в дифрагированное поле от n-го рассеивающего
участка.
Второй тип, частично-развитое спекл-поле формируется, как правило,
при
дифракции
широких
лазерных
пучков
на
слабошероховатых
поверхностях, слаборассеивающих пропускающих транспарантах или в
случайной
среде,
характеризуемой
малой
кратностью
рассеяния.
Формирование частично развитых спеклов может быть рассмотрено с
использованием соотношения:
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
50
N
U s = E0 + ∑ En ,
n =1
где E0 соответствует амплитуде нерассеянной
волны, которая
значительно превосходит по абсолютной величине все остальные члены
суммы. Следует отметить, что частично-развитое спекл-поле отличается от
развитого наличием зеркального компонента (нерассеянной волны) в
дифракционной
картине.
При
увеличении
степени
неоднородности
рассеивающего объекта амплитуда зеркального компонента уменьшается и
частично развитое спекл-поле переходит в развитое.
Последний тип спекл-полей встречается наиболее часто в практике. В
этом случае в отраженном свете наблюдаются «блеклые», «смазанные»
спеклы, статистический анализ для которых характеризуется низкой
точностью. В результате при анализе поведения спеклов в отраженном свете
приходится создавать схемы эксперимента, которые бы увеличивали
амплитуду рассеянной компоненты или уменьшали амплитуду зеркальной
компоненты, то есть позволяли бы наблюдать более «яркие», четко
выраженные спеклы.
При наблюдении спеклов следует также учитывать, в какой зоне
дифракции
формируется
изображение
спеклов.
В
оптике
выделяют
несколько зон дифракции: ближнюю, зону Френеля и дальнюю зону (ее
также называют зоной Фраунгофера). Каждая из этих зон характеризуется
своим значением волнового параметра
D=
λz
d2
,
где λ – длина волны падающего излучения, z – расстояние между
плоскостью рассеяния и плоскостью наблюдения, d – размер освещенного
участка поверхности. Так, ближней зоне соответствует значение D << z для
зоны Френеля свойственно значение D ~ z, для зоны Фраунгофера D >> z.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
51
Отметим, что большинство работ, посвященных анализу и описанию
поведения спеклов, рассматривают формирование спекл-структур в дальней
зоне дифракции, в зоне Фраунгофера, при отражении или пропускании
«гауссовых» лазерных лучей. Это существенно облегчает математическое
описание спекл-структур. Так, дифракция Фраунгофера хорошо описывается
с помощью представлений Фурье-оптики. При Фурье-анализе распределения
светового поля в любой плоскости пространственные составляющие его
Фурье-образа можно отожествить с плоскими волнами, идущими в разных
направлениях. Складывая амплитуды этих волн и учитывая их фазовые
набеги, можно вычислить амплитуду поля в любой интересующей точке
пространства. Особенно интересным становится изучение световой волны,
которая имеет в поперечном сечении гауссово распределение амплитуды. Эта
волна будет иметь Фурье-образ, который также будет характеризоваться
функцией Гаусса. Благодаря этому обстоятельству, «гауссовый» световой
пучок, распространяясь в свободном пространстве, будет сохранять
неизменную форму распределения амплитуды поля.
Если рассеяние лазерного пучка происходит на неподвижных
поверхностях, то спеклы также неподвижны в плоскости наблюдения. В
случае
движения
поверхности
или
движения
неоднородностей
на
поверхности спекл-картины постоянно динамически изменяются, то есть
каждый раз образуются новые реализации спекл-полей. Если смещение
невелико по сравнению с диаметром пучка, то две рассматриваемые
реализации спекл-поля будут похожи друг на друга (поскольку они
сформировались в схожих условиях). Очевидно, что одна реализация спеклов
полностью сменит другую, когда все прежние рассеиватели уйдут из области
освещения, а на их смену придут новые. Наблюдателю кажется, что спеклы
как бы следуют за шероховатой поверхностью в ближней зоне, а в дальней
зоне дифракции происходит кипение (boiling) спеклов.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
52
Свет, рассеянный неподвижными областями поверхности, образует в
плоскости наблюдения отчетливую неподвижную спекл-картину. Однако
освещенность
спеклов
в
других
точках
изображения
периодически
флуктуирует при изменении поверхности, и, если изображение наблюдают
визуально или фотографируют со временем экспозиции, превышающим
период флуктуаций, то освещенность спеклов усредняется, создавая
относительно однородную засветку. Наблюдатель может обнаружить те
участки поверхности, которые практически не изменялись, поскольку спеклы
в этих местах имеют высокий контраст, там, где происходило существенное
изменение поверхности, контраст спеклов низкий. Таким образом, по
структуре спекл-поля можно судить о динамике смещения отдельных
участков поверхности (Рис. 9):
Рисунок 9. Зависимость контраста от сдвига спеклов. [91].
Важной характеристикой спеклов является функция контраст:
C=
σI
<I>
,
где σI – среднеквадратичное отклонение флуктуаций интенсивности,
вычисленное при смене реализаций рассеивающего объекта, <I> усредненная интенсивность. Контраст спеклов характеризует глубину
пространственной модуляции рассеянного поля. Он является аналогом
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
53
видности
интерференционных
полос,
которые
наблюдаются
при
интерференции гладких полей. Контраст развитых спеклов для линейно
поляризованного света всегда равен единице, а частично-развитый всегда
меньше единицы. [92-98].
Таким образом, поведение спеклов можно связать с динамическими
процессами как на поверхности, так и в приповерхностном слое, и описать
через статистическую функцию – контраст.
1.4.4. Биоспеклы.
Спеклы, наблюдаемые при отражении от биологических тканей
(биоспеклы), очень сложны для изучения в силу сложности структуры
наблюдаемого объекта – биологической ткани. Тем не менее, движение
биоспеклов может быть представлено как сумма двух более простых
движений: смещение и «кипение».
Полезно ввести специальное понятие «фазовый экран» для описания
поведения биоспеклов. Под фазовым экраном понимается совокупность
одинаковых рассеивателей, для которых можно предполагать, в общем
случае, схожесть коэффициентов преломления (отражения), геометрических
размеров и внутренней структуры. Таким образом, любую ткань можно
представить, как совокупность различных рассеивателей, фазовых экранов,
на которых свет испытывает многократное отражение и рассеивание.
Рассмотрим освещение объекта «гауссовым» пучком света. Будем
считать, что спеклы образуются в дальней зоне дифракции, в зоне
Фраунгофера, в результате интерференции лазерных лучей, прошедших
через случайно-неоднородную среду. В этом случае радиус светового пятна
на объекте ω будет задаваться соотношением:
⎡ ⎛ z
ω = ω 0 ⎢1 + ⎜⎜
⎢⎣ ⎝ z 0
1
⎞
⎟⎟
⎠
2
⎤2
⎥ ,
⎥⎦
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
54
а радиус кривизны переднего фронта пучка ρ будет определяться
соотношением:
⎡ ⎛ z
ρ = z ⋅ ⎢1 + ⎜⎜
⎢⎣ ⎝ z 0
1
⎞
⎟⎟
⎠
2
⎤2
⎥ ,
⎥⎦
где z – расстояние от «горловины» пучка, z = πω 02 / λ , ω0 – радиус
«горловины» пучка.
Скорость движения фазового экрана или экранов влияет на величину
времени корреляции (когерентности) и погрешности времени корреляции,
которые также зависят от параметров оптической системы. Все параметры
могут быть измерены независимо друг от друга и связаны между собой
следующими уравнениями:
для случая одного фазового экрана (Рис. 10):
Рисунок 10. Схема наблюдения 1-ого фазового экрана. [91].
1
2 2
1 ⎡ σ i di ⎛
1 ⎞ ⎤
τ c = ⎢ 2 + 2 ⎜⎜ ε ⋅ σ i − ⎟⎟ ⎥ ,
v ⎢D
d0 ⎠ ⎥
rc ⎝
⎣
⎦
2
2
τ ⋅d ⎛
1 ⎞
τ d = c 2 i ⎜⎜ ε ⋅ σ i − ⎟⎟ ⋅ v ⋅ r ,
d0 ⎠
rc ⎝
где S1 – фазовый экран, L1 – линза для фокусировки падающего
лазерного излучения, L2 - линза для фокусировки прошедшего рассеянного
излучения, d0 – расстояние от поверхности облучаемого образца до линзы L2,
di – расстояние от поверхности, на которой наблюдают спекл-картину, до
линзы L2, D – диаметр линзы L2, ε – коэффициент дефокусировки, равный:
ε=
1
1 1
+ − ,
d0 di r
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
55
σi = 1 + d0/ρ, τi – время корреляции, τd – погрешность вычисления
времени корреляции, v – скорость движения фазового экрана, r – радиусвектор до точки на исследуемой поверхности, в которой вычисляется время
корреляции;
для случая двух фазовых экранов (Рис. 11):
Рисунок 11. Схема наблюдения 2-ух фазовых экранов. [91].
2
2
τ c = a11 ⋅ v1 − 2 ⋅ a12 ⋅ v1 ⋅ v 2 + a 22 ⋅ v 22 ,
где v1 и v2 – скорости движения фазовых экранов, a11, a12, a22 –
коэффициенты, зависящие от параметров оптической системы. Было
показано, что в случае трех фазовых экранов и более зависимости становятся
крайне сложными, но, тем не менее, средняя скорость перемещения фазовых
экранов обратно пропорциональна времени корреляции, что прекрасно
согласуется с экспериментальными данными. [91,99-104].
При дифракции сфокусированных гауссовых пучков (например,
лазерного луча) в некоторых случайных средах (например, в живых
объектах) образуется два спекл-поля, в общем случае статистически
зависимых: динамическое, формирующиеся в результате дифракции света на
движущихся объектах, и статическое, возникающее при рассеянии света
неподвижными рассеивателями. Эти поля интерферируют, при этом
неподвижное спекл-поле выступает в качестве опорной волны. В этом случае
проявляется эффект Доплера. Если случайно-неоднородная среда (или
шероховатая поверхность) является слаборассеивающей, то в этом случае
спекл-поле представляет собой результат интерференции зеркальной и
рассеянной компонент.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
56
Так в рамках эффекта Доплера свет, прошедший через среду с
движущимися рассеивателями, имеет частотное распределение, аналогичное
распределению скоростей рассеивателей. В случае близкого расположения
частот, частоты складываются, давая пульсирующую частоту. Так или иначе,
детектор регистрирует флуктуирующий сигнал, частотное распределение
которого согласуется с распределением скоростей рассеивателей. Далее
получают автокорреляционную функцию, которую раскладывают в ряд
Фурье по частотам. В случае эффекта Доплера рассматривают частный
эффект смещения частот. Так если все рассеиватели двигаются в одном
направлении, то для всех частот можно наблюдать одинаковый частотный
сдвиг при изменении скорости по сравнению с объектом, для которого
скорость не менялась. На распределении частот это выражается пиком,
смещенным относительно пика распределения частот объекта сравнения.
Рисунок 12. Эффект Доплера. [105].
Частотный сдвиг связан с общей (усредненной) скоростью потока
рассеивателей следующим соотношением:
δv = ( 2u / c ) ⋅ v
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
57
где ν – частота, связанная с движением объекта сравнения, δν –
частотный сдвиг, u – скорость потока, усредненная скорость движения
рассеивателей, c – скорость света.
Несмотря на то, что все предыдущее описание спеклов было для спеклполей с гауссовой статистикой, эффект Доплера оказывается крайне
полезным также и в случае формирования спекл-полей негауссовой
статистики. В этом случае центральная предельная теорема не выполняется.
Формирование
спекл-полей
с
негауссовой
статистикой
происходит,
например, при дифракции сильно сфокусированных пучков в случайной
среде. В этом случае спекл-картина состоит из нескольких пятен. Данное
поле статистически неоднородно, что означает зависимость статистических
характеристик от координат точки наблюдения. Если эффект Доплера в
случае гауссовой статистики проявляется при интерференции с опорной
волной (от неподвижного спекл-поля), то при негауссовой статистике роль
опорной волны играет зеркальная компонента. Кроме того, частотное
положение доплеровского пика в спектре флуктуаций интенсивности
определяется не только углом наблюдения, но и средним числом
рассеивателей в освещенном объеме.
Дифракция при малом числе рассеивателей далеко не единственный
случай,
приводящий
к
появлению
негауссовых
спеклов.
Спеклы,
характеризующиеся негауссовой статистикой, могут формироваться при
рассеянии
широких
лазерных
пучков
на
некоторых
специфических
поверхностях (например, высоты шероховатостей которых подчиняются Краспределению).
Как
правило,
негауссовыми
являются
спекл-
модулированные спеклы (speckled speckles). Такие спеклы образуются при
прохождении когерентного излучения через слоистую среду со случайнонеоднородными границами разделов.
Часто в литературе проводится сопоставление доплеровского и спеклинтерферометрического методов. Как правило, отмечается их чрезвычайное
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
58
сходство. Между тем теоретические основы спекл-интерферометрии и
доплеровской диагностики существенно различаются между собой. В первом
случае рассматривается дифракция непрерывных волн (временной подход).
Во
втором
случае
анализируются
сдвиги
частот,
приобретаемых
парциальным волнами в процессе рассеяния (частотный подход). [105-110].
Таким образом, спекл-интерферометрический метод позволяет связать
время когерентности со скоростью спеклов, которые, в свою очередь,
связаны с поведением рассеивателей в приповерхностном слое.
1.4.5. Статистические функции описания спеклов.
В
работе
[91]
для
экспериментального
описания
спеклов,
формирующихся в дальней зоне дифракции при интерференции «гауссовых»
пучков, были приведены три метода по анализу статистических функций методы, основанные на анализе декорреляционной, автокорреляционной и
кросскорреляционных функций.
Декорреляционная функция имеет выражение:
(I k − I n )2
Dk − n =
,
Ik ⋅ In
где I – интенсивность, k и n – номера спекл-картин в общей
последовательности спекл-картин. Значение декорреляционной функции
прямо пропорционально скорости движения фазовых экранов [111].
Автокорреляционная функция имеет вид:
Ck =
σI
k
Ik
=
Ik
2
− I
Ik
2
k
=
⎡ 1
⎢M ⋅ N
⎣
2
1
⎤
Ik ⎥ −
∑∑
M ⋅N
m =1 n =1
⎦
M N
1
∑∑ I k
M ⋅ N m =1 n =1
M
N
M
N
∑∑ I
m =1 n =1
2
k
,
где M – ширина спекл-картин в пикселях, N – высота спекл-картин в
пикселях, Ik – значение интенсивности в точке кадра k. Автокорреляционная
функция, она же функция контраста, обратно зависит от скорости фазовых
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
59
экранов. Показано, что функция контраста падает при увеличении
относительного смещения спеклов во время длительных экспозиций, а также
при больших смещениях неоднородностей относительно друг друга.
Кросскорреляционная функция имеет вид:
⎡ M − p N −q
⎤
I i (m, n) ⋅ I j (m + p, n + q) ⎥
∑
∑
⎢
M ⋅N
⎥.
⋅ ⎢ m =1 n =M1 N
Rij ( p, q ) =
( M − p) ⋅ ( N − q) ⎢
⎥
I i (m, n) ⋅ I j (m, n)
∑∑
⎢
⎥
m =1 n =1
⎣
⎦
Кросскорреляционная
корреляцию
для
функция,
выделенной
по
зоны
смыслу,
размера
позволяет
{p;q}
со
найти
временем.
Кросскорреляционная функция определяет направление преимущественного
сдвига спеклов. [91,109].
1.4.6. Использование оптоволоконного жгута для передачи спеклкартин.
При
изучении
спеклов
важным
становится
способ
доставки
изображения. Иногда необходимо передавать спекл-картины из трудно
доступных зон (полость носа, суставная сумка). Для этого удобно применять
оптические жгуты, какими обычно пользуются для передачи изображения в
эндоскопии. Оптический жгут состоит из множества тонких оптических
волокон, каждый из которых независимо передает интенсивность света с
входной поверхности жгута на выходную. При этом взаимное расположение
волокон
не
изменяется.
Для
обоснования
возможности
применения
оптического жгута в измерениях динамики спеклов важно сопоставить
результаты измерения динамики спеклов с помощью оптического жгута, с
результатами, полученными съемкой спекл-картин напрямую (Рис. 13).
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
60
Рисунок 13. Проецирование изображения с изучаемой поверхности на
передний торец жгута. Посередине установлена линза, расположенная в
плоскости фокуса. [112].
В
работе
[113]
использовали
метод
анализа
спектрального
распределения мощности. Теоретически и практически было показано, что с
оптическим жгутом наблюдаются аналогичные закономерности для спеклов,
что и без него. На спектральное распределение мощности влияли диаметр
волокон жгута и скорость движения рассеивателей в облучаемом образце.
Так в случае увеличения скорости движения спектральное распределение
сдвигается в область высоких частот, а меньший диаметр волокон позволяет
дальше наблюдать область высоких частот.
В работе [112] в качестве переносчика спекл-картины использовали
жгут. На выходе свет («гауссовые» пучки) от всех оптических волокон
испытывает интерференцию. Тем самым картина, передаваемая оптическим
жгутом, отличается от картины, передаваемая единичным волокном. С
помощью оптического жгута изучали перемещение негомогенных объектов.
Изучено, что главное значение при анализе спекл-картин оказывает качество
фокусировки изображения. Так при увеличении степени дефокусировки
(удаление торца жгута от плоскости изображения объекта) спекл-картина
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
61
становится все более размытой, что приводит к падению значений
автокорреляционной функции (Рис. 14).
Рисунок
14.
Распределения
интенсивностей
(слева)
и
значения
автокорреляционной функции (справа) даны для различных расстояний
дефокусировки. Расстояние увеличивается сверху вниз. [112].
Однако даже при размытии спекл-картин вполне можно получить
зависимости времени корреляции от скорости перемещения рассеивающих
объектов в изучаемой среде (Рис. 15).
Тем самым, можно сделать вывод, что дефокусировка влияет на
величину автокорреляционной функции и на значение тангенса наклона
обратной зависимости времени корреляции от скорости. Однако время
корреляции всегда обратно пропорционально скорости рассеивателей и не
зависит от дефокусировки. [114,115].
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
62
Рисунок 15. Показаны обратные зависимости контраста от скорости
рассеивателей для различных значений расстояний дефокусировки. С
увеличением степени дефокусировки тангенс наклона прямых зависимостей
уменьшается. Тем самым уменьшается чувствительность метода. [112].
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
63
1.5. Заключение.
При умеренном ИК лазерном нагреве (субабляционный режим) в
хрящевой ткани протекают три основных процесса, как это было показано
выше:
-) диффузия и испарение воды;
-)
структурные
изменения
и
химические
превращения
в
протеогликановой подсистеме;
-) структурные изменения и денатурация в коллагеновой подсистеме.
Эти три явления взаимосвязаны друг с другом и не имеют четкого
разделения в случае биологической ткани. Тем не менее, на основе
проведенного анализа метода спекл-интерферометрии можно предположить,
что в случае субабляционного ИК лазерного нагрева хрящевой ткани спеклы
окажутся чувствительными к диффузии, испарению воды и денатурации
коллагена, так как эти два процесса приводят к существенным изменениям
положения и структуры рассеивающих центров. Так, денатурация коллагена
должна приводить к трансформации поверхности и приповерхностного слоя,
а диффузия и испарение воды к появлению воды на поверхности, что
обязательно должно найти отражение в динамике спеклов. Анализ
литературных
источников
связывающих
изменение
показал
статистики
отсутствие
научных
спекл-картин
с
данных,
одиночными,
изолированными друг от друга, процессами, такими, например, как
испарение, плавление, денатурация, что важно для контроля состояния при
нагреве биологических тканей. Не были также детально изучены факторы,
приводящие к изменению статистики спекл-картин в случае нагрева
коллагенсодержащих
тканей.
Таким
образом,
требовалось
провести
дополнительные исследования, расширяющие возможность применения
метода спекл-интерферометрии для анализа и контроля структурных и
фазовых переходов при нагреве в биологических объектах.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
64
Глава 2. Спекл-интерферометрический анализ
состояния вещества при нагреве.
2.1. Введение.
В
настоящее
время
метод
спекл-интерферометрии
широко
используется для измерения скоростей рассеивателей, находящихся в
приповерхностном слое, для регистрации трансформаций поверхности и
изменений её микрорельефа, которые могут быть вызваны, как внутренними
массопереносами (например, ток крови в капиллярах), так и механическими
или акустическими воздействиями. Тем не менее, несмотря на большой
объем публикаций, посвященных развитию и применению метода спеклинтерферометрии,
и
на
имеющиеся,
в
частности,
сведения
о
чувствительности спеклов к нагреву биологических тканей, до сих пор нет
примеров использования этого метода для фиксирования структурных
изменений в тканях во время ИК лазерного нагрева, а также не были
детально установлены причины чувствительности поведения спеклов к
нагреву. Поэтому было необходимо определить основные факторы, которые
могут влиять на поведение спеклов при нагревании биологических объектов,
а также при нагревании чистых белков и низкомолекулярных органических
соединений. Для этого требовалось разработать и реализовать схему
эксперимента и цифровой обработки спекл-картин во время нагрева. Кроме
того,
было
необходимо
разработать
схему
эксперимента,
которая
удовлетворяла бы следующим дополнительным требованиям:
-) бесконтактный способ регистрации – данное требование важно для
последующего практического использования в медицинских системах;
-) работа в режиме реального времени – данное требование необходимо
для реализации систем с обратной связью, что позволяет использовать
систему для широкого круга научных и прикладных задач, где значения
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
65
статистических
функций
спекл-картин
выступают
измеряемыми
параметрами, по которым ведется контроль;
-) устойчивость к изменению конфигурации – данное требование важно
для упрощения практического использования;
-) цифровая регистрация и сохранение данных на компьютерах для
последующей реконструкции эксперимента с целью более детального
изучения оптических и термических параметров.
Данным требованиям удовлетворяют ИК радиометрический метод
регистрации температуры и электронный метод регистрации спекл-картин –
их и использовали в качестве основы для реализации методики проведения
спекл-интерферометрического анализа.
Поставленная задача обозначила ряд методических проблем:
1) разработка аппаратной схемы эксперимента;
2)
разработка
алгоритма
расчетов
спекл-интерферометрических
данных;
3) разработка методики проведения спекл-интерферометрического
анализа.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
66
2.2. Схема экспериментальной установки.
2.2.1. Общая аппаратная схема.
Для
проведения
и
последующего
обсчета
экспериментальных
результатов была разработана специальная схема автоматического сбора и
обработки информации, позволяющая в режиме реального времени связать
все приборы и организовать систему обратной связи.
Рисунок 16. Схема экспериментальной установки. 1,10,11, компьютеры; 2,
ПЗС камера; 3, система линз с диафрагмой; 4, He-Ne лазер; 5, ИК-зеркало; 6,
система линз с поляризатором света; 7, ИК нагревающий лазер; 8, образец; 9,
ИК-камера.
На рисунке 16 представлена принципиальная схема экспериментальной
установки
для
проведения
спекл-интерферометрического
и
ИК
радиометрического анализов. На рисунке 17 приведена фотография
экспериментальной установки с включением электрической плитки с
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
67
контролируемым нагревом для нагревания белков и низкомолекулярных
органических соединений.
Рисунок 17. Фотография экспериментальной установки.
Предложенная
схема
(Рис.
16)
базируется
на
бесконтактных,
экспрессных способах регистрации оптических и термических данных с
помощью ПЗС и ИК радиометрической камер, а также включает в себя
использование лазера как бесконтактного источника нагрева. Все элементы
схемы, с помощью которых производится сбор данных, были впервые
объединены в единую информационную систему, позволяющую в режиме
реального времени организовать обратную связь для управления мощностью
ИК
лазерного
излучения,
что
представляется
крайне
важным
для
последующего практического использования, например, при проведении
хирургических процедур на хрящевых тканях.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
68
2.2.2. Основные элементы.
2.2.2.1. Держатель ткани.
При изучении динамики спеклов биологических тканей, образец
фиксировался в специальном держателе, который предотвращал изменение
формы ткани или её движение, что было необходимо для нивелирования
влияния механических деформаций и движения на статистику спекл-картин.
2.2.2.2. He-Ne лазер.
Для формирования спекл-структур в отраженном свете поверхность
образца облучалась когерентным источником света - He-Ne лазером (λ =
632,8 нм, Uniphase 1135P, P = 20мВт), излучение которого проходило через
систему линз и поляризатора, что было необходимо для линейной
поляризации лазерного излучения и увеличения зоны облучения (освещения)
на поверхности образца. Для обеспечения равномерного освещения
исследуемого участка ткани старались добиться как можно более широкой
зоны облучения (8x8 мм.).
Рисунок 18. He-Ne лазер Uniphase 1135P.
Использование He-Ne лазера было обусловлено тем, что он обладает
высокой степенью монохроматичности, высокой стабильностью мощности,
низкой интенсивностью лазерного излучения, что позволяло избежать
модификации облучаемого объекта, и достаточно большим ресурсом работы.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
69
[116]. Для линейно поляризованного света контраст не превышает значения
1.0, достигая максимального значения для полностью развитых спеклструктур. Отклонение контраста от единицы указывает на наличие
постоянной составляющей (зеркальной компоненты нерассеянной волны) в
отраженном свете, которая снижает чувствительность метода спеклинтерферометрии.
Таким
образом, оптическую систему
настраивали,
стараясь достигнуть максимально высокого контраста для объектов, не
подвергшихся нагреву, для увеличения чувствительности метода. Кроме
того, поляризатор позволял контролировать интенсивность отраженного от
поверхности излучения для предотвращения насыщения фотоэлементов
используемых ПЗС камер.
2.2.2.3. ПЗС-камера.
Рисунок 19. ПЗС камера Sony XCD-V50.
Отраженный от образца свет He-Ne лазера фиксировался ПЗС камерой
Sony XCD-V50 (разрешение 640 x 480 пикселей, 60/30/15 Гц, 8/14-бит,
монохромная, Япония) или ПЗС камерой «ВИДЕОСКАН» VS-CTT-075-2001
(разрешение 752 х 582 пикселей, 25 Гц, 8-бит, монохромная, Россия). ПЗС
камера регистрировала спекл-картины с передачей их на персональный
компьютер, что позволяло производить параллельно расчет в режиме
реального времени в случае реализации системы обратной связи и сохранять
данные для последующей численной обработки. Выбор монохромной ПЗС
(прибор с зарядовой связью) камеры был обусловлен рядом таких
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
70
преимуществ, как высокая чувствительность к свету, низкий уровень шумов,
линейная зависимость величины заряда на фотоматрице от величины
падающего светового излучения. [117].
2.2.2.4. Апертурная диафрагма.
Оптическая система регистрации спеклов была сконфигурирована для
наблюдения спеклов в дальней зоне дифракции, в зоне Фраунгофера, в
соответствии с нижеприведенным неравенством:
λz
d2
>> 1,
где λ – длина волны падающего излучения, z – расстояние между
плоскостью рассеяния и плоскостью наблюдения, d – размер освещенного
участка поверхности.
Для этого между ПЗС камерой и образцом была установлена систем
линз с диафрагмой для увеличения передаваемого изображения (уменьшение
параметра d) и оптического пути (увеличение параметра z). Регистрация
спеклов происходила в зоне Фраунгофера, так как в дальней зоне дифракции
статистика спекл-картин практически не зависит от смещения плоскости
наблюдения, а сложение амплитуд в точке наблюдения происходит почти
синфазно, что уменьшает флуктуации интенсивности света и увеличивает
отношение сигнал/шум. Также в ближней зоне дифракции или в зоне
Френеля сильная кривизна отражающей поверхности, которую имеет,
например, биологическая ткань, приводит к значительному отклонению
флуктуации интенсивности отраженного излучения от гауссовой статистики,
что существенно осложняет интерпретацию данных. [92,118,119].
Систему также конфигурировали таким образом, чтобы линейный
размер
спеклов
был
в
пределах
5-10
пикселей,
исходя
из
ниже
представленной формулы:
l ≈ 1.22(1 + M )λF ,
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
71
где l – линейный размер регистрируемых спеклов, M – оптическое
увеличение, даваемое линзами, λ – длина лазерного излучения, F – F-стоп
фактор для камеры, который можно рассчитать по уравнению:
F=
f
D,
где f – фокусное расстояние для линз, D – диаметр диафрагмы. [120].
Таким образом, с уменьшением диаметра отверстия в диафрагме, а также с
ростом увеличения линз, линейный размер спеклов увеличивается. Тем не
менее, стоит избегать формирования достаточно протяженных спеклов, так
как в этом случае контраст спекл-картин становится низким, что приводит к
ухудшению чувствительности метода спекл-интерферометрии.
2.2.2.5.ИК лазер.
Рисунок 20. Волоконный эрбиевый лазер ЛС-1,56 (ИРЭ “Полюс”).
Для нагревания биологической ткани использовался управляемый с
компьютера оптоволоконный эрбиевый лазер ЛС-1,56 (λ = 1560 нм, «ИРЭПолюс», Россия) или неуправляемый с компьютера Nd:YAG лазер New Star
Model 130 (λ = 1320 нм, США). Выбор данных лазеров был обусловлен тем,
что они дают умеренный нагрев биологической ткани в приповерхностном
слое. [1].
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
72
Показатель поглощения μeff в биологических тканях для заданной
длины волны определяется суммарным вкладом показателей поглощения ее
различных компонентов, таких как вода, белки, углеводы. Зная показатель
поглощения, можно определить глубину проникновения лазерного излучения
в ткань по следующей формуле:
δ=
1
μ eff
,
где δ – глубина проникновения лазерного излучения, μeff – суммарный
(эффективный) показатель поглощения для биологической ткани.
Рисунок 21. Спектр поглощения воды в спектральном диапазоне 200нм 200мкм. [1].
При этом вклад воды в поглощение является существенным (а часто –
и решающим) практически во всех областях спектра поглощения. Например,
в инфракрасной области, для длин волн более 1 мкм, спектры поглощения
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
73
биологических тканей в основном определяются спектром поглощения воды.
Поэтому они мало отличаются друг от друга и от спектра воды,
приведенного на рисунке 21.
Для спектра поглощения воды видно, что показатель поглощения μ
воды в диапазоне 200нм-200мкм. меняется почти на 8 порядков, составляя
приблизительно ~ 10 см-1 для длин волн 1560 нм и 1320 нм, что при
примерном содержании воды в биологической ткани 70-80% дает глубину
поглощения лазерного излучения δ на уровне 1.2-1.4 мм. Для He-Ne лазера (λ
= 632,8 нм) глубина поглощения лазерного излучения δ находится на уровне
0.3-0.4 мм.
Таким
образом,
при
реализации
эксперимента
по
нагреву
биологической ткани в соответствии со схемой, представленной на рисунке
16, изменение статистики спекл-картин было обусловлено в первую очередь
процессами, происходящими в приповерхностном слое, что могло приводить
к существенному отклонению от результатов, получаемых для объёма.
Для
нагревания
белков
или
низкомолекулярных
органических
соединений использовали управляемую электрическую плитку VMR hotplate
810 Digital (P = 900 Вт., США). Нагревание образцов производилось в
непрерывном режиме. Требуемые температуры и скорость нагрева образцов
достигались варьированием мощности лазерного луча или электрической
плитки.
При
реализации
системы
обратной
связи
управление
оптоволоконным эрбиевым лазером ЛС-1,56 производилось по алгоритму
ПИД (пропорционально-интегрально-дифференциальное) регуляции, что
позволяло линейно нагревать образец с заданной скоростью и поддерживать
продолжительно требуемую температуру.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
74
2.2.2.6. ИК радиометр.
Рисунок 22. Термовизионная камера ИРТИС-200.
Рисунок 23. Графики зависимостей спектральной плотности энергетической
яркости потока (Lλ) и фотонной спектральной плотности энергетической
яркости потока теплового излучения (Lpλ) от длины волны для черного тела
при различных температурах. Прерывистая линия на обоих графиках
указывает местоположение максимумов для температурных кривых через
каждые 10K (сами кривые приведены для каждых 100K). [121].
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
75
Для регистрации температуры поверхности использовалась ИК камера
ИРТИС-200 (InSb, спектральный диапазон 3 - 5 мкм, разрешение 256 х 256
пикселей, 1.1 Гц, Россия) или ИК камера Phoenix Laboratory MWIR (InSb,
спектральный диапазон 3 - 5 мкм, разрешение 320 х 256 пикселей, 200 Гц,
США).
Метод ИК радиометрии использовался для измерения температур из-за
таких преимуществ, как бесконтактный способ регистрации и возможность
одновременной
регистрации
температуры
для
всей
исследуемой
поверхности. Так как большая часть спектра ИК излучения для тел, нагретых
до температур -100-200 °C, лежит в диапазоне длин волн 2-50 мкм (Рис. 23),
то использовали полупроводниковые диоды, которые обладают высокой
чувствительностью к данному диапазону ИК спектра. Так, InSb фотодиод
регистрирует тепловое излучение в узком спектральном диапазоне - 3 - 5
мкм, что обуславливает как его высокую селективность к тепловому
излучению ткани, так и высокую чувствительность к перепаду температур.
[122].
Обе ИК камеры позволяли сохранять и обрабатывать ИК изображения
на персональном компьютере. Перед проведением эксперимента ИК камеры
калибровались по черному телу Micron M310 (США).
Рисунок 24. Схема экспериментальной установки для калибровки ИК
камеры. 1, компьютер; 2, ИК камера; 3, ИК зеркало; 4, черное тело.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
76
На рисунке 24 представлена аппаратная схема калибрования ИК
камеры по черному телу. Схема калибровки полностью воспроизводила
геометрию приборов, как они использовались в схеме (Рис. 16), что
позволяло
избежать
возможных
ошибок
при
расчете
температур.
Экспериментальные калибровочные кривые полностью коррелировали с
теоретически
рассчитанными
кривыми
по
закону
Планка-Вина
в
исследуемом диапазоне температур (Рис. 25).
Рисунок 25. Теоретическая калибровочная кривая для InSb фотодиода.
Представлена кривая зависимости фотонной спектральной плотности
энергетической яркости потока теплового излучения (Lpλ) от температуры в
диапазоне длин волн 3-5 мкм.
2.2.2.7. Оптоволоконный жгут.
Наряду с представленной выше схемой экспериментальной установки
(Рис. 16) использовали модифицированную схему, куда был включен
оптический жгут. Между жгутом и изучаемой поверхностью образца
помещали линзу, с помощью которой изображение поверхности образца
передавалось на плоскость входного торца оптического жгута. Выходной
торец жгута располагался на расстоянии примерно 12-15 см от плоскости
ПЗС матрицы камеры (Рис. 26).
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
77
Рисунок 26. Модификация экспериментальной установки с включением
оптоволоконного жгута. 1, компьютер; 2, ПЗС камера; 3, оптоволоконный
жгут; 4, система линз; 5, образец.
2.2.3. Расположение и временная синхронизация.
Все приборы запускались одновременно для обеспечения временной
синхронизации по сигналу с программного таймера или с внешнего триггера.
Зона облучения лазеров совпадала с зоной наблюдения камер как в
случае нагрева биологических тканей, так и в случае нагрева чистых белков
или низкомолекулярных органических соединений и имела размер 2x2 мм.,
что соответствовало размеру зоны наблюдения 200x200 пикселей (размер
зерна - 0,01 мм) на кадрах ПЗС камеры, и размеру зоны наблюдения 20x20
пикселей (размер зерна - 0,10 мм) на кадрах ИК камер. Во всех
экспериментах все лазеры и камеры были сфокусированы и центрированы
относительно одной и той же точки поверхности объекта. Пространственное
центрирование и временная синхронизация позволяли соотносить временные
зависимости, полученные отдельно на каждом измерительном приборе, для
последующего
расчета
и
построения
производных
зависимостей
от
температуры.
Для связывания всех приборов в единую информационную систему
управления с обратной связью было разработано и создано программное
обеспечение
на
основе
программного
продукта
LabView
(National
Instruments, США).
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
78
2.3. Сбор и расчет данных.
2.3.1. Сбор данных.
Сбор
информации
производился
со
всех
камер
в
исходном
необработанном формате, который конвертировался в набор интенсивностей,
в режиме реального времени с сохранением на компьютер. Для ИК камер
дополнительно переводили значения интенсивностей в температуры по
экспериментально определенной градуировке. Значения интенсивностей,
регистрируемые ПЗС камерами, использовались для расчетов статистических
функций спекл-картин, таких как контраст, среднее значение интенсивности,
кросскорреляционный коэффициент Пирсона.
Рисунок 27. Пример спекл-картины.
На рисунке 27 представлен фрагмент спекл-картины, регистрируемой
ПЗС камерой. Каждой точке этого рисунка, или пикселю, соответствует
значение интенсивности, диапазон которого зависит от разрешающей
способности (битности) ПЗС камеры. Таким образом, каждую спекл-картину
можно
рассматривать
в
качестве
двумерной
матрицы
значений
интенсивностей Ixy, каждый элемент которой соответствует пикселю
реального изображения.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
79
Рисунок 28. Пример температурного профиля поверхности объекта.
Таким же образом из данных ИК камер можно построить двумерные
матрицы температур Txy, соответствующие реальным температурным полям
поверхности объектов. На рисунке 28 представлен пример температурной
карты поверхности, по вертикальной оси которой отложены значения
температур.
2.3.2. Расчет статистических функций спеклов.
Спекл-картины
(Рис.
16),
регистрируемые
ПЗС
камерой,
использовались для расчета статистических функций спекл-картин, таких,
как средняя интенсивность света, контраст (автокорреляционная функция),
кросскорреляционный коэффициент Пирсона (декорреляционная функция).
Среднее значение интенсивности рассчитывалось по уравнению:
Ik =
1
M ⋅N
M
N
∑∑ I
m =1 n =1
k
,
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
80
Где <Ik> - значение средней интенсивности для кадра k, Ik – значение
интенсивности в точке кадра k с координатами {m,n}.
Для
вычисления
функции
контраста
пользовались
следующим
соотношением:
Vk =
σI
k
Ik
Ik
=
2
− I
2
k
=
Ik
⎡ 1
⎢M ⋅ N
⎣
2
1
⎤
Ik ⎥ −
∑∑
M ⋅N
m =1 n =1
⎦
M N
1
∑∑ I k
M ⋅ N m=1 n =1
M
N
M
N
∑∑ I
m =1 n =1
2
k
,
где Vk – значение функции контраста, вычисляемое для каждого кадра
k, M – ширина спекл-картин в пикселях, N – высота спекл-картин в пикселях,
Ik – значение интенсивности в точке кадра k с координатами {m,n}.
Кросскорреляционный
коэффициент
Пирсона
рассчитывался
по
следующему уравнению:
D k ,l =
cov I k , I l
σI σI
k
Ik Il − Ik ⋅ Il
=
l
1
M ⋅N
=
⎡ 1
⎢M ⋅ N
⎣
Ik
2
M
N
− I k2 ⋅
∑∑ I k I l −
m =1 n =1
2
1
⎤
Ik ⎥ −
∑∑
M ⋅N
m =1 n =1
⎦
M
N
Il
1
M ⋅N
2
− I l2
M
=
N
∑∑ I k ⋅
m =1 n =1
⎡ 1
I k2 ⋅ ⎢
∑∑
m =1 n =1
⎣M ⋅ N
M
N
1
M ⋅N
M
N
∑∑ I
m =1 n =1
l
2
1
⎤
Il ⎥ −
∑∑
M ⋅N
m =1 n =1
⎦
M
N
,
M
N
∑∑ I
m =1 n =1
2
l
где Dk,l – значение кросскорреляционного коэффициента Пирсона,
вычисляемое для каждой пары кадров k и l, M – ширина спекл-картин в
пикселях, N – высота спекл-картин в пикселях, Ik – значение интенсивности в
точке кадра k с координатами {m,n}, Il – значение интенсивности в точке
кадра l с координатами {m,n}.
Предложенные математические функции использовались в качестве
основы статистического рассмотрения динамики спеклов.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
81
2.3.3. Расчет интегральной приповерхностной температуры.
При обработке температурных данных ИК камер использовали
следующую процедуру:
1) определяли точку с максимальной температурой;
2) вокруг точки с максимальной температурой определяли сто самых
горячих точек-соседей для зоны сканирования размером 20x20 пикселей (2x2
мм);
3) полученный набор из ста значений температур усредняли для
получения усредненной температуры Tk, где индекс k соответствует номеру
кадра ИК камеры.
Предложенная процедура определения усредненной температуры
позволила решить ряд проблем – в первую очередь, неустойчивость точки с
максимальным нагревом и возможные флуктуации её значений. Вторая
проблема заключалась в том, что, так как значения контраста и
кросскорреляционного коэффициента Пирсона являются интегральными
значениями, вычисляемыми для некоторой области поверхности, то нужно
было также определить интегральную величину температуры для той же
области для
построения зависимостей одной величины от другой.
Предложенная величина усредненной температуры позволяет определить
такую интегральную величину, пригодную для построения температурных
зависимостей
контраста
спекл-картин
и
кросскорреляционного
коэффициента Пирсона.
При одновременном проведении спекл-интерферометрического и ИКрадиометрического анализов настраивали экспериментальную аппаратуру
так, чтобы для области облучения температура спадала незначительно с
расстоянием. Это достигалось как уменьшением геометрических размеров
области наблюдения, так и увеличением размеров пучка нагревающего ИК
лазера.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
82
2.4. Методика проведения спекл-интерферометрического
анализа.
В предыдущих частях настоящей главы были описаны схема
расположения и настройки оборудования, критерии выбора расстояний
между элементами, цифровая обработка результатов. Тем не менее, в силу
сложности проведения спекл-интерферометрического анализа и высокой
чувствительности спеклов к различным шумам было важно вести контроль
поведения статистических функций на протяжении всего эксперимента, так
как анализ этих функций позволяет избежать неточности при проведении
эксперимента и последующего его расчета.
Для
быстрого
расчета
значений
функции
контраст,
кросскорреляционного коэффициента Пирсона и интегральной температуры
были написаны оптимизированные программы на языке программирования
C++, которые позволяли производить расчет в режиме реального времени
огромного массива данных. Был разработан и реализован алгоритм быстрого
перевода первоначальных данных ИК камер в температуры на основе закона
Планка-Вина (Рис. 25) и экспериментально полученной калибровочной
кривой.
Тексты
написанных
программ
доступны
для
свободного
использования, анализа и модификации (см. Приложение).
На рисунке 29 представлен характерный график зависимости значений
средней интенсивности от времени проведения эксперимента при нагреве
биологической ткани. Поведение временной функции средней интенсивности
контролировали,
стараясь
получить
как
можно
более
сглаженные
зависимости, так как значительные флуктуации в её поведении могут
приводить к таким же флуктуациям в значениях других статистических
функций, рассчитываемых для спекл-картин, что существенно осложнило бы
последующий анализ.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
83
Рисунок 29. Характерная зависимость средней интенсивности спекл-картин
от времени нагрева.
Рисунок 30. Характерная зависимость значений функции контраста спеклкартин от времени нагрева.
На рисунке 30 представлен характерный график зависимости значений
функции контраста спекл-картин от времени проведения эксперимента при
нагреве биологической ткани. Диапазон изменения значений для функции
контраста спекл-картин контролировали в районе 0.3-1.0 абсолютных
единиц, так как более низкие значения приводили бы к падению
чувствительности метода спекл-интерферометрии.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
84
Рисунок 31. Характерная зависимость значений кросскорреляционного
коэффициента Пирсона спекл-картин от времени нагрева.
На рисунке 31 представлен характерный график зависимости значений
кросскорреляционного коэффициента Пирсона от времени проведения
эксперимента при нагреве биологической ткани. Поведение временной
зависимости кросскорреляционного коэффициента Пирсона контролировали,
стараясь получить как можно более сглаженные зависимости, так как
значительные флуктуации в её поведении могут указывать на механическое
движение нагреваемого объекта или существенное изменение его формы.
Поэтому приходилось использовать специальные держатели в случае нагрева
биологических тканей таких, как хрящ носовой перегородки животных,
который начинал выгибаться и деформироваться при нагреве.
На рисунке 32 представлен характерный график зависимости значений
интегрального значения температуры от времени проведения эксперимента
при нагреве биологической ткани.
Предложенная схема (Рис. 16) позволяет организовать сбор спеклинтерферометрических и температурных данных как с временной, так и с
пространственной синхронизацией. Это, в свою очередь, позволяет перейти
от рассмотрения временных зависимостей статистических функций спеклкартин к температурным зависимостям, что необходимо для изучения
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
85
структурных изменений, происходящих в веществах при нагреве. Анализ
зависимостей статистических функций спекл-картин от температуры нагрева
был выбран для качественного описания чувствительности спеклов к
процессу
нагрева
сложных
биологических
объектов
и
простых
низкомолекулярных органических соединений.
Рисунок 32. Характерная зависимость температуры от времени нагрева.
Рисунок 33. Характерная зависимость средней интенсивности спекл-картин
от температуры нагрева.
На рисунке 33 представлен характерный график зависимости значений
средней интенсивности от температуры при нагреве биологической ткани.
Так как температура возрастает монотонно со временем, температурный
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
86
график для средней интенсивности, как правило, практически повторяет её
временную зависимость.
Рисунок 34. Характерная зависимость значений функции контраста спеклкартин от температуры нагрева.
На рисунке 34 представлен характерный график зависимости значений
функции контраста спекл-картин от температуры при нагреве биологической
ткани.
Так
как
температура
возрастает
монотонно
со
временем,
температурный график для контраста, как правило, практически повторяет её
временную зависимость.
Эти закономерности служили верификацией (критериями верности)
проведения спекл-интерферометрического анализа для предотвращения
возможных ошибок при проведении исследований. Был обнаружен сходный
характер
изменений
временных
и
температурных
зависимостей
статистических параметров спекл-картин в случае постоянного роста
температуры. Это позволяет реализовать на практике системы управления с
обратной связью, использующие временные зависимости статистических
функций спекл-картин при условии постоянного роста температуры, что, в
свою очередь, позволяет отказаться от измерения температуры для систем
диагностики состояния биологических тканей при ИК лазерном нагреве.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
87
Рисунок 35. Схема алгоритма расчета результатов.
Сбор и обработка данных производились по следующему алгоритму
(Рис. 35):
1) расчет значений функций контраст, средней интенсивности и
кросскорреляционного коэффициента Пирсона от времени на основе данных
ПЗС-камеры;
2) анализ на монотонное поведение функции средней интенсивности от
времени и кросскорреляционного коэффициента Пирсона от времени;
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
88
3) расчет функции интегральной температуры от времени на основе
данных термографа и экспериментально определенной калибровки;
4) расчет зависимостей контраста спекл-картин от температуры на
основе зависимостей контраста от времени и температуры от времени;
5) расчет зависимостей средней интенсивности спекл-картин от
температуры на основе зависимостей средней интенсивности от времени и
температуры от времени;
6) анализ поведения полученных температурных зависимостей V(Т) и
<I>(T) для описания протекания различных процессов.
Таким образом, впервые была создана и отработана методика спеклинтерферометрического анализа, позволяющая регистрировать структурные
изменения при нагреве веществ. Был создан комплекс программ и
предложена аппаратная схема проведения спекл-интерферометрического
анализа в режиме реального времени с системой обратной связи для
управления мощностью лазерного излучения.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
89
Глава 3. Динамика спеклов при нагреве
низкомолекулярных соединений и белков.
3.1. Введение.
Нагрев вещества вызывает протекание ряда физико-химических
процессов, среди которых можно выделить такие недеструктивные процессы,
как фазовые переходы первого рода – плавление, испарение, и тепловое
расширение (сжатие), которые, в свою очередь, могут приводить к
модификации объема и трансформации поверхности. Эти процессы приводят
к изменениям оптических свойств матрикса вещества, оптических свойств и
числа рассеивающих частиц (центров) в глубине и в приповерхностном слое
изучаемого объекта, что находит отражение в эволюции спекл-картин и
динамике спеклов.
В работе [123] была предложена методика измерения коэффициента
теплового расширения методом спекл-интерферометрии, подробно были
рассмотрены теоретическая сторона вопроса, преимущества и ограничения
метода. Суть предложенной методики заключалась в измерении разницы
ходов двух оптических лучей L1 и L2, вызванной и связанной со смещением
поверхности вдоль оси X в результате теплового расширения, при этом лучи
направлялись под одинаковым углом к поверхности, как это показано на
рисунке 36, для существенного упрощения математического аппарата.
Если поверхность деформируется на величину u, то в плоскости
регистрации происходит смещение спекл-картины из-за изменения разницы
оптических путей лучей L1 и L2, которая может быть оценена по уравнению:
L1 − L2 = 2u cos θ ,
где θ – угол наклона обоих лазерных лучей к поверхности.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
90
Рисунок 36. Схема освещения поверхности двумя лазерными лучами под
одинаковым углом θ. [123].
При вычитании интерференционных картин, зарегистрированных до и
после нагрева, проявляется картина (Рис. 37), на которой можно отчетливо
наблюдать интерференционные полосы, расстояние между которыми прямо
пропорционально величине деформации u [124-126].
Если параметры оптической и регистрирующей систем не меняются во
время эксперимента, то число интерференционных полос n можно связать с
величиной деформации u следующим уравнением:
n λ = 2 u cos θ ,
где λ – длина волны лазерного излучения.
На основе вышеприведенных уравнений можно выявить связь между
коэффициентом
теплового
расширения
α
и
расстоянием
между
интерференционными полосами F (Рис. 37):
α=
λ
2 FΔT cos θ
,
где ΔT – разница температур, достигаемая во время эксперимента.
Данное уравнение было выведено в работе [123] и показывает применимость
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
91
метода
спекл-интерферометрии
для
количественного
измерения
коэффициентом теплового расширения α на основе анализа спекл-картин.
Рисунок 37. Пример интерференционной картины, полученной вычитанием
исходных
спекл-картин
до
и
после
нагрева.
Отчетливо
видны
интерференционные полосы. [123].
В ряде работ спекл-интерферометрия использовалась для регистрации
момента начала плавления простых химических соединений, таких как
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
92
инертные газы, металлы, неорганические соли [127-132]. В работе [128] были
подробно рассмотрены причины чувствительности спеклов к фазовому
переходу
“твердое
тело-жидкость”,
описана
методика
практического
применения спекл-интерферометрии для регистрации плавления веществ.
Следует отметить, что большинство работ, где метод спекл-интерферометрии
был использован для детектирования фазовых переходов, были посвящены
плавлению веществ при сверхвысоких давлениях, где традиционные методы
менее точны и более сложны в реализации. Суть предложенной методики
заключалась в детектировании изменений интерференционных спекл-картин
во время проведения нагрева, которые претерпевали существенную
модификацию
при
достижении
точки
плавления
вещества.
Интерференционная картина, формируемая в отраженном от поверхности
твердого тела свете, остается стабильной в отсутствии любых движений и
нагрева поверхности. При нагреве вещества спекл-картина претерпевает
плавные изменения, характеризующееся, в первую очередь, изменением
расстояния между интерференционными полосами, как это было описано
выше. При достижении точки плавления плавные изменения прекращаются,
происходит
резкое
разрушение
структуры спекл-картины,
как
из-за
появления новой жидкой фазы, так и из-за исчезновения твердой фазы,
характеризующиеся
стохастическим
интерференционных
полос,
резким
изменением
положения
изменением
в
и
числа
распределении
интенсивностей, а также их временной эволюции. Обычно эти изменения
поверхности можно наблюдать визуально, как это показано на рисунке 38,
взятом из работы [127].
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
93
Рисунок 38. Приведены примеры спекл-картин до (c) и после (d) начала
плавления твердого аргона. В овалах показаны спекл-картины при
использовании
интерференционного
фильтра
(апертурная
диафрагма).
Отчетливо видно изменение структуры спекл-картины при плавлении. [127].
Спекл-интерферометрия
является
методом,
регистрирующим
процессы, происходящие на поверхности и в приповерхностном слое. Как
известно, термодинамические величины для приповерхностного слоя
отличаются от величин, полученных для объема, так как энергия границ (а
значит, и химический потенциал атомов (молекул) в границе) выше, чем в
объеме, тем самым граница может перейти в жидкое состояние раньше (то
есть при более низкой температуре), чем объем. Кроме того, для
кристаллических веществ было обнаружено явление “предплавление”
(нелинейная термодинамика), которое приводит к существенному изменению
структуры приповерхностного слоя за несколько градусов до равновесной
температуры плавления в объеме. В настоящее время намечается рост числа
публикаций в связи с бурным развитием нанотехнологий, посвященных
обнаружению
этого
явления
для
других
веществ,
характеристике
соответствующего этому процессу неравновесного состояния вещества –
“квазижидкость” (quasiliquid, disordered state, premelting), хотя до сих пор нет
ясного понимания этого процесса и стройного математического аппарата для
его описания [133]. Для состояния “квазижидкость” обнаруживается
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
94
существенное отклонение структуры, как от структуры жидкости, так и от
структуры твердой фазы, выражающееся, в частности, в изменении
симметрии с появлением икосаэдрических структур, не свойственных
кристаллическому
состоянию;
в
изменении
координационного
числа
кристаллов; в изменении фотоакустического отклика; в существенной
дезориентации молекул в кристаллической решетке; в резком росте вакансий,
дефектов и дислокаций в кристаллической решетке. При этом, фаза,
соответствующая состоянию “квазижидкость”, является метастабильной, и её
появление, как и время существования, сильно зависит от неравновестности
протекания процесса нагрева. [133-136].
Таким образом, в ряде работ была показана практическая ценность
метода спекл-интерферометрии для фиксации точки начала плавления, а
также коэффициента теплового расширения. Тем не менее, не было изучено
поведение статистических функций спекл-картин при плавлении, а также не
была изучена возможность регистрации денатурации чистых белков, что
было необходимо для понимания процесса нагревания биологической ткани
в аспекте изменения динамики спеклов.
В
настоящей
главе
были
проведены
ряд
экспериментов
с
низкомолекулярными органическими соединениями и чистыми белками для
изучения влияния процессов плавления и денатурации на поведение
статистических функций спекл-картин.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
95
3.2. Материалы.
Следующие химические вещества и белки использовались для анализа
их плавления и денатурации методом спекл-интерферометрии:
1) коричная кислота (транс) (CAS 140-10-3) со степенью чистоты 98% с
температурой плавления в районе 131-136°C и кипения - ~ 300°С;
2)
акриламид
(CAS
79-06-1)
со
степенью
чистоты
99,9%
с
температурой плавления в районе 82-86°C и точкой возгонки при ~ 138°C;
3) бычий сывороточный альбумин (CAS 9048-46-8) со степенью
чистоты 96%;
4) бычий коллаген I (CAS 9007-34-5) со степенью чистоты 99%.
Выбор приведенных веществ был обусловлен рядом таких факторов,
как доступность веществ в виде порошка, значительное отражение от
поверхности, устойчивость оптических свойств, химическая устойчивость
при нагреве, низкие температуры плавления и денатурации в районе 60140°C. Все эти критерии были необходимы для нивелирования побочных
процессов, а также для моделирования умеренного ИК лазерного нагрева.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
96
3.3. Результаты и обсуждение.
При проведении спекл-интерферометрического анализа использовали
методику, приведенную в главе 2 настоящей работы. Образцы нагревались на
электрической плитке по линейному закону с заданной скоростью. Во время
нагрева производилась регистрация спекл-картин ПЗС камерой с передачей
данных на компьютер. Расчет статистических функций производился по
алгоритму, приведенному в главе 2 настоящей работы.
Рисунок 39. Фрагмент спекл-структуры поверхности акриламида до начала
плавления.
Рисунок 40. Фрагмент спекл-структуры поверхности акриламида во время
плавления.
На рисунках 39 и 40 представлены фрагменты спекл-структур
поверхности
акриламида
до
и
после
момента
начала
плавления
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
97
соответственно: визуально видно отличие спекл-структур из-за плавления.
На
рисунке
40
видно
значительное
уменьшение
интенсивности
и
локализация кристаллов, которые не успели расплавиться: им соответствуют
более светлые участки изображения.
Рисунок 41. Зависимость значений функции средней интенсивности спеклкартин от температуры при нагреве акриламида.
Рисунок 42. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры при нагреве акриламида.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
98
Рисунок 43. Зависимость значений функции средней интенсивности спеклов
от температуры при нагреве коричной кислоты.
Рисунок 44. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры при нагреве коричной кислоты.
На рисунках 41 и 43 приведены графики зависимостей значений
функционала средней интенсивности спекл-картин от температуры при
нагреве акриламида и коричной кислоты соответственно. На основе анализа
приведенных графиков был сделан вывод, что средняя интенсивность спеклкартин флуктуирует незначительно на всем протяжении нагрева ниже
температуры плавления веществ, но при достижении точки плавления за
несколько градусов (2-4 °C) она начинает равномерно спадать, достигая
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
99
минимума после прохождения точки плавления. Такое поведение функции
средней интенсивности спекл-картин объясняется появлением жидкой фазы
и постепенным исчезновением твердой фазы, что приводит к уменьшению
отражения от поверхности исследуемых веществ.
На рисунках 42 и 44 приведены зависимости значений функции
контраста спекл-картин от температуры при нагреве акриламида и коричной
кислоты соответственно. На основе анализа приведенных графиков был
сделан вывод, что контраст спекл-картин флуктуирует незначительно на всем
протяжении нагрева ниже температуры плавления веществ, но при
достижении точки плавления за несколько градусов (2-4 °C) он начинает
равномерно спадать, достигая минимума после прохождению точки
плавления.
Так
как
контраст
спекл-картин
обратно
зависит
от
средней
интенсивности, то падение контраста не было обусловлено этим фактором.
Как было показано ранее в обзоре литературы, падение контраста спеклкартин
можно
объяснить
следующими
причинами:
увеличением
относительных смещений неоднородностей относительно друг друга за
время экспозиции, что ведет к изменению распределения интенсивностей
спекл-картин;
увеличением
скорости
движения
рассеивателей
в
поверхностном слое образца из-за теплового Броуновского движения;
изменением концентрации и состава рассеивающих центров, что приводит к
изменению их оптических свойств, из-за образования новых и исчезновения
старых фаз, что согласуется с литературными данными. Таким образом,
поведение функции контраста спекл-картин должно быть напрямую связано
с изменениями структуры исследуемого образца, например, при фазовом
переходе, которым является плавление.
Отклонение температуры, после которой регистрировали падение
статистических функций спекл-картин, от температуры фазового перехода
было незначительным, порядка 2-4 °C, и может быть связано как с отличием
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
100
приповерхностных процессов от процессов в объеме, так и с точностью
измерения величины интегральной температуры для поверхности.
При нагреве белков, коллагена и альбумина, на всем протяжении
нагрева значения функций средней интенсивности и контраста спекл-картин
незначительно флуктуировали, не претерпевая никаких изменений при
прохождении температурного диапазона нагрева вплоть до температур,
значительно
превосходящих
температуру
денатурации
на
40-50
°C.
Нечувствительность спеклов к нагреву чистых белков в порошкообразном
состоянии обусловлена тем, что денатурация белков не сопровождается
резким изменением оптических свойств, появлением жидкой фазы, которая
приводила бы к большой подвижности поверхности и увеличению скорости
рассеивателей. Тем не менее, как это будет показано позже в настоящей
работе, денатурация белков может вести к существенному изменению
трехмерных молекулярных решеток и фибрилл биологических тканей, что, в
свою очередь, обуславливает резкое изменение статистики спекл-картин при
нагреве тканей.
Таким образом, на основе полученных результатов был сделан вывод о
чувствительности статистики спекл-картин к структурному переходу,
вызванному
фазовым
переходом
“твердое
тело
-
жидкость”
низкомолекулярных органических соединений. Были выявлены основные
закономерности в изменениях статистических функций спекл-картин до - и
во время структурного перехода, вызванного фазовым переходом первого
рода при нагреве.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
101
Глава 4. Динамика спеклов при ИК лазерном нагреве
хрящевой ткани.
4.1. Введение.
В последние время уделяется все большее внимание моделированию и
экспериментальному изучению динамики физико-химических процессов,
происходящих в биологических тканях при механических и термических
воздействиях. Повышенный интерес к ним в основном связан с развитием
лазерных технологий для медицины. Наиболее перспективными для
изучения динамических превращений в биологических тканях являются
оптические методы. В данной работе изучалась возможность применения
метода спекл-интерферометрии для изучения фазовых и структурных
переходов, протекающих в хрящевой ткани при ИК лазерном нагреве.
Так, в работе [137] впервые была показана возможность регистрации
модификаций коллагенсодержащих тканей методом спекл-интерферометрии,
была выявлена высокая чувствительность статистики спекл-картин к нагреву
тканей. В этой работе было высказано предположение, что динамика спеклов
должна отличаться высокой чувствительностью к движению внутритканевой
жидкости, её испарению и к денатурации белков.
Однако при ИК лазерном нагреве биологических тканей, как правило,
одновременно происходят несколько физико-химических процессов, что
значительно усложняет интерпретацию динамических характеристик спеклкартин. В частности, ИК лазерный нагрев хрящей вызывает переход
связанной внутритканевой воды в свободное состояние, усиливает процессы
диффузии и испарения воды, приводит к денатурации белков, таких, как
коллаген.
Поэтому
для
диагностики
и
контроля
методом
спекл-
интерферометрии процессов, протекающих в биологических тканях под
действием ИК лазерного излучения, необходимо было выявить характерные
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
102
особенности поведения спекл-картин во время протекания изолированных
друг от друга (одиночных) процессов.
Кроме характерных особенностей поведения спекл-картин при ИК
лазерном нагреве, необходимо было выявить и факторы, влияющие на
динамику спеклов.
Так как биологическая ткань является сложным объектом для изучения
и в ней одновременно могут протекать несколько физико-химических
процессов при умеренном ИК лазерном нагреве, то было важно установить
основные факторы, влияющие на чувствительность спеклов при нагреве. На
основе анализа литературных источников были определены основные
физико-химические
процессы,
вызывающие
в
биологической
ткани
значительные структурные изменения, которые, в свою очередь, могут
значительно влиять на статистику спекл-картин. К основным процессам,
протекающим при лазерном нагреве до 80°C и приводящим к изменениям как
приповерхностного слоя, так и поверхности хрящевой ткани, были отнесены:
-) диффузия и испарение воды с поверхности биологической ткани;
-) структурные изменения в коллаген-протеогликановом матриксе
хрящевой ткани.
Так, для установления взаимосвязи между диффузией, испарением
воды и динамикой спеклов были поставлены эксперименты с нагревом ИК
лазером слегка смоченной фильтровальной бумаги (модельная система) и с
недеструктивным нагревом ИК лазером хрящевой ткани при низких
температурах.
В первой главе настоящей работы (обзоре литературы) отмечается, что
хрящевая ткань имеет сложную структуру, в которой, тем не менее,
выделяют два основных компонента - протеогликановую и коллагеновую
трехмерные надмолекулярные сетки. Тепловое воздействие приводит к
денатурации белков, входящих в состав хряща, главным образом коллагена,
который
является
основным
компонентом
межклеточного
матрикса
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
103
хрящевой ткани. При этом коллагеновые фибриллы являются “каркасом”
хрящевой ткани, поэтому структурные изменения матрикса хрящевой ткани,
происходящие при ИК лазерном нагреве и чувствительные для спеклинтерферометрии, в первую очередь были связаны с денатурацией коллагена.
Для проверки этого предположения было проведено физико-химическое
исследование на модельной системе – “хрящевая ткань, обработанная
трипсином, с разрушенной протеогликановой подсистемой”, в которой
содержится только одна трехмерная сетка - коллагеновая.
Результаты, полученные на описанных выше модельных системах,
“фильтровальная бумага - вода” для выявления влияния воды и “хрящевая
ткань,
обработанная
трипсином,
с
разрушенной
протеогликановой
подсистемой” для выявления влияния денатурации коллагена, были
сопоставлены с результатами, полученными при ИК лазерном нагреве
интактных образцов хряща.
При изучении динамики спеклов важны и способы доставки
изображения.
Для
внедрения
метода
спекл-интерферометрии
в
хирургическую практику необходимо обеспечить передачу спекл-картин из
труднодоступных зон (полость носа, суставная сумка, межпозвоночный
диск). Передача изображения осуществляется посредством оптических
жгутов, какими обычно пользуются в эндоскопии. Оптический жгут состоит
из множества тонких оптических волокон, каждое из которых независимо
передает интенсивность света с входной поверхности жгута на выходную.
Для обоснования возможности применения оптического жгута в измерениях
динамики спеклов было важно сопоставить результаты измерения динамики
спеклов с помощью оптического жгута с результатами, полученными
съемкой спекл-картин напрямую.
Таким образом, в рамках настоящей главы был поставлен ряд
экспериментов
для
выявления
факторов,
приводящих
к
изменению
статистики спекл-картин при ИК лазерном нагреве:
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
104
-) изучение метода на модельной системе – “фильтровальная бумага вода”, позволяющей определить чувствительность метода к движению и
испарению воды;
-) изучение метода на модельной системе - “хрящевая ткань,
обработанная трипсином, с разрушенной протеогликановой подсистемой”,
позволяющей определить чувствительность метода к денатурации коллагена;
-) изучение метода на реальной системе: интактная (незатронутая)
хрящевая ткань;
-) изучение метода при использовании оптоволоконного жгута
(адаптация метода для практического применения в медицине).
В настоящей главе также приводятся методики приготовления
интактных образцов хрящевой ткани, ферментативной обработки хрящевой
ткани для получения образцов с разрушенной протеогликановой системой на
основе действия трипсина, относящегося к классу сериновых протеиназ,
методика количественного анализа содержания коллагена на основе
определения содержания гидроксипролина (Hyp), коллаген-специфической
аминокислоты, методика проведения ДСК анализа (дифференциальная
сканирующая калориметрия).
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
105
4.2. Материалы.
4.2.1. Интактная хрящевая ткань.
Исходным материалом служил гиалиновый хрящ носовой перегородки.
Ткани были изъяты у телят или поросят в возрасте до 12 месяцев. Хрящевая
ткань очищалась от надкостницы и рыхлой соединительной ткани. Хрящи
выделялись в день проведения эксперимента и хранились при 4°С в
физиологическом
солевом
растворе.
Известно,
что
такой
способ
использования сводит к минимуму денатурацию коллагена, вызванную
естественными
процессами
разложения
при
длительном
хранении.
Выделенные хрящи нарезались на тонкие пластинки толщиной 1,5-2 мм
размером 3x5 см, которые закреплялись в экспериментальной установке и
подвергались ИК лазерному нагреву.
Рисунок
45.
Изображение
очищенного
хряща
носовой
перегородки
поросёнка.
4.2.2. Хрящевая ткань без протеогликановой подсистемы.
Интактная хрящевая ткань носовой перегородки телят или поросят
была подвергнута ферментативной обработке 0,1 % раствором трипсина в
инкубационном буфере с целью удаления протеогликановой компоненты.
Обработке подвергали образцы хрящевой ткани весом около 50 мг при
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
106
соотношении фермент/субстрат 1:20 в течение 20 часов при 37°С. Состав
инкубационного буфера: 0.1М трисгидрохлорид (TrisHCl), 25mM ЭДТА,
5000 единиц пенициллина и 5 мг стрептомицина (на 1000 мл). Все реагенты
были аналитически чистыми. Наличие ЭДТА и антибиотиков предотвращало
действие экзогенных и эндогенных протеаз.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
107
4.3. Анализ коллагена биохимическим методом.
Аминокислотный
анализ
основан
на
определении
содержания
гидроксипролина – иминокислоты, специфичной для коллагена (содержание
~ 13,3 % от сухого остатка).
4.3.1. Предварительная подготовка образцов.
Определение
степени
денатурации
коллагена
основывалось
на
особенности воздействия трипсина на коллагеновое волокно. Известно, что
трипсин гидролизует только денатурированные или повреждённые молекулы
коллагена, однако, нативные молекулы коллагена не подаются гидролизу и
остаются
нетронутыми
ферментом
трипсин
из-за
конформационных
затруднений. Следствием этого является невозможность образования
фермент-субстратного комплекса.
После облучения хрящевую ткань обрабатывали трипсином по
методике, описанной в пункте 4.2.2. При этом денатурированный коллаген
разрушался трипсином до олигопептидов и аналогично протеогликанам
переводился
в
раствор
(супернатант).
Раствор
супернатанта
далее
гидролизовался и анализировался на содержание гидроксипролина.
После
обработки
трипсином
единственным
нерастворившимся
компонентом ткани оставались неповрежденные молекулы коллагена
(остаток). Для определения содержания непроденатурированного коллагена в
остатке проводили гидролиз коллагена. Последний раствор, образующийся
после гидролиза, также анализировался на содержание гидроксипролина.
Гидролиз раствора супернатанта и твердого остатка проводили
сильнокислой смесью соляной кислоты с трифторуксусной кислотой (2 об.
частей 12 М HCl и 1 об. части трифторуксусной кислоты) и с последующей
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
108
нейтрализацией раствора гидроксидом калия (до pH=6-7 – контроль по
универсальному индикатору).
4.3.2. Анализ гидроксипролина.
Анализ был основан на проведении спектрофотометрической реакции
взаимодействия окисленной формы гидроксипролина с реактивом Эрлиха.
Структура гидроксипролина содержит в себе пирролидиновое кольцо,
способное к окислительному дегидрированию в пиррольное. Окисленная
форма гидроксипролина впоследствии определялась с помощью реакции
взаимодействия с реактивом Эрлиха (образуется окрашенная хиноидная
структура).
4.3.2.1. Реагенты.
Приготовление стандарта гидроксипролина. 25 мг гидроксипролина
растворяли в 250 мл 10-3 N HCl. Отбирали 80 μл полученного раствора и
доводили до объема пробы - 4 мл. 2 мл пробы шли на приготовление образца
с содержанием гидроксипролина 4 μг/2 мл. Оставшиеся 2 мл пробы
разбавляли в два раза и вновь отбирали 2 мл на приготовление образца с
содержанием гидроксипролина 2 μг/2 мл. Аналогичным образом получали
образцы с содержанием гидроксипролина 1 μг/2 мл и 0.5 μг/2 мл. Стандарт с
содержанием 5 μг/2 мл был приготовлен разбавлением 50 μл исходного
раствора гидроксипролина до 2 мл.
Приготовление раствора щелочи. 2.24 г гидроксида калия растворяли в
100 мл дистиллированной воды. Полученная концентрация (0.4 М) позволяла
заранее предотвратить наличие в нейтрализованном образце повышенной
(>0.4
М)
концентрации
неорганических
солей,
неблагоприятно
сказывающейся на результатах анализа.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
109
Приготовление буфера. 10 г моногидрата лимонной кислоты, 2.4 мл
ледяной уксусной кислоты, 24 г тригидрата ацетата натрия и 6.8 г гидроксида
натрия доводили до суммарного объема 200 мл дистиллированной водой.
Приготовление раствора хлорамина-Б. 2.14 г хлорамина-Б растворяли
в
40
мл
дистиллированной
воды,
после
чего
добавляли
60
мл
этилцеллозольва и 100 мл буфера. Раствор хранили при 4°С не более 12
часов.
Приготовление очищенного раствора этилцеллозольва. Исходный
раствор этилцеллозольва высушивали над безводным хлоридом кальция,
затем перегоняли при атмосферном давлении, собирая фракцию с tкип 135 ºС.
Приготовление 15 % раствора хлорной кислоты. 27 мл исходной 70%ной кислоты (ρ=1,643) растворяли в 100 мл воды.
Приготовление раствора 4-(N,N-диметиламино)бензальдегида. 20%ный раствор готовили непосредственно перед каждой серией опытов
растворением 2 г реактива Эрлиха в 10 мл этилцеллозольва при легком
нагреве (50-60°С). Используется исходный реагент, при необходимости его
можно очистить перекристаллизацией из этилцеллозольва или спирта.
Чистота используемых реагентов была не ниже марки Х.Ч.
4.3.2.2. Техника эксперимента.
К образцам и стандартам прибавляли по 1 мл раствора хлорамина-Б,
энергично встряхивали и выдерживали 20 мин при комнатной температуре.
Затем добавляли по 1 мл раствора хлорной кислоты, перемешивали и
выдерживали 5 мин при комнатной температуре. После этого приливали по 1
мл раствора реактива Эрлиха, тщательно перемешивая, и выдерживали 20
мин при 60-70 ºС. Полученные окрашенные растворы разбавляли в два раза
этилцеллозольвом и определяли их оптическую плотность в 10 мл-вых
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
110
кюветах при длине волны λ = 557 нм. В качестве образца сравнения
использовали дистиллированную воду.
4.3.3. Определение степени денатурации.
По результатам аминокислотного анализа супернатантов и твёрдых
остатков рассчитывали долю денатурированного коллагена по формуле:
α(%)=m(Hyp)снт/( m(Hyp)снт+ m(Hyp)тво)
где m(Hyp)снт – количество гидроксипролина в супернатанте, а
m(Hyp)тво – количество гидроксипролина в твёрдом остатке ткани после
обработки ферментом. Общая схема биохимического определения степени
денатурации представлена на рисунке 46.
Рисунок 46. Схема биохимического анализа.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
111
4.4. Термический анализ.
Термический
анализ
препаратов
проводили
методом
дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) с использованием
сканирующего калориметра (DSC 30, Mettler TA 4000, Швейцария). Образцы
герметично закрывали в стандартных алюминиевых тиглях (40µl), образцом
сравнения служила аналогичный пустой тигель. Калибровку осуществляли
по теплоте плавления индия. Начальная, конечная температура и скорость
нагрева для калориметрического исследования хряща составляли 0°С, 100°С,
10 K/мин соответственно.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
112
4.5. Результаты и обсуждение.
4.5.1. Динамика спеклов при диффузии и испарении воды в
биологических тканях в процессе ИК лазерного нагрева.
Как уже отмечалось выше, при нагреве биологической ткани
происходят диффузия и испарение воды. Это может приводить к изменению
спекл-картин и их статистики. При анализе литературы не были обнаружены
научные данные по статистике спекл-картин при диффузии или испарении
воды. Поэтому было необходимо провести исследование для выяснения
характера чувствительности статистики спекл-картин к диффузии и
испарению воды при ИК лазерном нагреве, как в случае нагрева модельной
системы “фильтровальная бумага – вода”, так и в случае нагрева
биологической ткани.
При проведении спекл-интерферометрического анализа пользовались
методикой, приведенной в главе 2 настоящей работы. Образцы нагревались
ИК лазером по линейному закону с заданной скоростью. Во время нагрева
производилась регистрация спекл-картин ПЗС камерой с передачей данных
на компьютер. Расчет статистических функций производился по алгоритму,
приведенному в главе 2 настоящей работы.
В качестве объекта исследования использовали образцы хрящевой
ткани, которые подвергались нагреву до 50°C для предотвращения
денатурации
белков.
Для
сопоставления
спекл-интерферометрических
данных, полученных на образцах биологической ткани, проводили также
нагрев фильтровальной бумаги, смоченной водой и слегка высушенной.
Нагрев фильтровальной бумаги велся до 75°С.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
113
Рисунок 47. Зависимость значений функции средней интенсивности спеклкартин от температуры при нагреве слегка смоченной фильтровальной
бумаги.
Рисунок 48. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры при нагреве слегка смоченной фильтровальной бумаги.
На рисунках 47 и 49 приведены графики зависимостей значений
функции средней интенсивности спекл-картин от температуры при нагреве
слегка смоченной фильтровальной бумаги до 75°C и интактных образцов
хрящевой ткани до 50°C соответственно. На основе анализа приведенных
графиков был сделан вывод, что средняя интенсивность спекл-картин
медленно растет на всем протяжении нагрева. Такой рост средней
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
114
интенсивности спекл-картин объясняется увеличением числа рассеивателей и
появлением воды на поверхности объектов (наблюдается визуально через
систему с большим увеличением), что приводит к увеличению отражения
лазерного излучения от поверхности объекта. Рост средней интенсивности
спекл-картин интактной хрящевой ткани менее выражен, чем в случае с
фильтровальной бумаги. Это обусловлено более сильным связыванием
(удержанием) воды матриксом биологической ткани по сравнению с
фильтровальной бумаги и меньшей пористостью хряща. [1].
Рисунок 49. Зависимость значений функции средней интенсивности спеклкартин от температуры при нагреве образцов интактной хрящевой ткани до
50°C.
На рисунках 48 и 50 приведены графики зависимостей значений
функции контраста спекл-картин от температуры при нагреве слегка
смоченной фильтровальной бумаги до 75°C и интактных образцов хрящевой
ткани до 50°C соответственно. На основе анализа приведенных графиков был
сделан вывод, что контраст спекл-картин медленно уменьшается на всем
протяжении
ИК
лазерного
нагрева.
Это
уменьшение
объясняется
увеличением значений функций средней интенсивности спекл-картин, так
как контраст спекл-картин обратно пропорционален средней интенсивности.
Кроме того, это наблюдаемое уменьшение контраста спекл-картин можно
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
115
связать как с увеличением скорости рассеивателей из-за роста температуры,
так и с увеличением деформаций поверхности.
Рисунок 50. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры при нагреве образцов интактной хрящевой ткани до 50°C.
Приведенные данные находятся в хорошем согласии с данными,
представленными в работах [138,139]. В этих работах указывается, что фронт
испарения жидкости локализован не только на поверхности пористого
материала, какими, например, являются фильтровальная бумага или
биологическая ткань, но и в объеме, при этом роль динамических
рассеивателей играют движущиеся локальные границы раздела между
жидкой и газообразной фазами. Развитие фронта испарения в слое пористой
среды
сопровождается
спектральных
рассеивания.
существенным
характеристик
Так,
изменением
регистрируемого
спектральный
анализ
статистических
и
сигнала
динамического
флуктуаций
интенсивности
когерентного излучения, рассеянного от границы, проведенный в работах
[138,139], дал следующие результаты:
-) движение локальных границ раздела фаз в зоне испарения может
быть интерпретировано как обобщенное броуновское движение, что, в свою
очередь, может быть обусловлено значительным разбросом направлений и
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
116
скоростей движения локальных границ, а также конечностью времени их
существования в порах;
-)
уже
на
самых
начальных
этапах
испарение
происходит
преимущественно в объеме;
-) в процессе нагрева фронт испарения жидкости смещается в глубину,
что приводит к росту числа динамических рассеивателей;
-) на конечных стадиях испарения происходит разрушение фронта
испарения, его кластеризация, что приводит к быстрому уменьшению числа
рассеивателей.
В работе [140] было также высказано предположение, что в районе
температур
35-65°C
протеогликановых
может
агрегатов
происходить
или
частично
денатурация
конформационные
превращения
гликозаминогликанов, как одного из компонентов, входящих в состав
протеогликановых
агрегатов.
Данные
превращения
приводят
к
освобождению и выделению дополнительной воды, которая связана с
протеогликановыми агрегатами.
Таким
образом,
в
настоящей
работе
была
установлена
чувствительность статистики спекл-картин к диффузии и испарению воды,
как в случае нагрева модельной системы “фильтровальная бумага - вода”, так
и в случае ИК лазерного нагрева интактной хрящевой ткани. Был обнаружен
сходный характер изменений статистических параметров спекл-картин этих
систем.
4.5.2. Динамика спеклов при ИК лазерном нагреве хрящевой
ткани, обработанной трипсином.
В
хрящевой
ткани
белок
коллаген
образует
трехмерную
надмолекулярную решетку – сетку. Денатурация коллагена приводит к
структурным изменениям в трехмерной коллагеновой сетке. Поэтому эти
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
117
структурные изменения обязательно найдут отражение в изменении
статистики спекл-картин. При анализе литературы не были обнаружены
научные данные по статистике спекл-картин при структурных изменениях
трехмерных надмолекулярных решеток на основе белков.
Для изучения связи процесса денатурации коллагена с изменением
статистики спекл-картин биологической ткани при ИК лазерном нагреве
необходимо было провести исследование на модельной системе “хрящевая
ткань,
обработанная
подсистемой”,
трипсином,
содержащей
только
с
разрушенной
одну
протеогликановой
неразрушенную
сетку
–
коллагеновую.
Препараты хрящевой ткани без протеогликанов подвергались ИК
лазерному нагреву с одновременным снятием динамики спеклов и
температурных полей. После лазерной обработки образцы помещались в
раствор трипсина для диагностики денатурации коллагена II.
Рисунок 51. Зависимости температуры ИК лазерного нагрева от времени
облучения образцов хрящевой ткани, обработанной трипсином, при
различных режимах нагрева.
На рисунке 51 приведены температурные кривые для некоторых
образцов. Отметим, что температурный рост происходит достаточно
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
118
монотонно, за исключением образца 1, где скачки температурного поля
могли быть вызваны внешними воздействиями.
Если температура поверхности образцов превышала 55°С (Рис. 53, 54),
то после облучения такие образцы полностью растворялись в трипсине.
Поскольку
трипсин
катализирует
гидролиз
только
поврежденных
макромолекул трипсина, то этот факт однозначно свидетельствует о полной
денатурации коллагена II в образцах, подвергшихся ИК лазерному нагреву
свыше 55°C. Образцы хрящевой ткани, облученные в режиме 1 (T ≤ 55°C)
(Рис. 52), лишь незначительно (10±3 %) теряли массу твердого остатка. Такая
потеря массы коррелирует с потерей массы в контрольных образцах (9±2 %),
которые не подвергались ИК лазерному нагреву. Это свидетельствует о том,
что процесс денатурации коллагена в образцах, облученных до температуры
55°C, не протекает значительно.
Рисунок 52. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры
при
нагреве
образцов
хрящевой
ткани,
обработанной
трипсином, до 53°C. Длительность нагревания свыше 45°C – 70 секунд
(режим 1). После нагрева образец не растворился в трипсине.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
119
Рисунок 53. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры
при
нагреве
образцов
хрящевой
ткани,
обработанной
трипсином, до 80°C. Длительность нагревания свыше 55°C – 70 секунд
(режим 2). После нагрева образец растворился в трипсине.
Рисунок 54. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры
при
нагреве
образцов
хрящевой
ткани,
обработанной
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
120
трипсином, до 57°C, длительность нагревания свыше 55°C – 35 секунд
(режим 3). После нагрева образец растворился в трипсине.
На рисунках 52-54 приведены типичные зависимости функции
контраста спекл-картин от температуры для образцов, подвергшихся ИК
лазерному
воздействию
в
разных
режимах
нагрева.
Отличительной
особенностью таких зависимостей является существование диапазонов
температур, в которых проявляется резкое падение автокорреляционной
функции (контраст) спекл-картин. В случае ИК лазерного нагрева в режимах
2 и 3 наблюдаются два уменьшения контраста спекл-картин в диапазонах
температур 35-45°C и 55-75°C, а для образцов, нагретых в режиме 1, только
одно - при 35-45°C.
Известно, что функция контраста спекл-картин падает при увеличении
скорости рассеивателей. Такое увеличение скорости движения рассеивателей
можно объяснить либо деградацией надмолекулярной структуры матрикса, в
результате которой рассеиватели становятся «лабильнее», либо увеличением
скорости движения жидкости в матриксе ткани.
Таким образом, было выявлено, что второе уменьшение контраста
спекл-картин в диапазонах температур 55-75°C (2-ой процесс на Рис. 53, 54)
связано с полной денатурацией коллагена II хрящевой ткани (полное
растворение в растворе трипсина). Первое уменьшение контраста спеклкартин в районе температур 35-45°C (1-ый процесс на Рис. 52-54)
наблюдалось для всех образцов хрящевой ткани, обработанной трипсином.
При этих температурах (35-45°C) на поверхности образцов хрящевой ткани
визуально наблюдалось появление воды из-за движения жидкости в матриксе
ткани.
Данный
полученными
результат
при
ИК
полностью
лазерном
соотносится
нагреве
как
с
результатами,
модельной
системы
“фильтровальная бумага - вода”, так и интактной хрящевой ткани до 50°C.
Более значительное уменьшение контраста спекл-картин (1-ый процесс на
Рис. 52-54) образцов модельной системы “хрящевая ткань, обработанная
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
121
трипсином, с разрушенной протеогликановой подсистемой” по сравнению с
аналогичным уменьшением контраста спекл-картин образцов интактной
ткани объясняется тем, что в связывании (удержании) воды в хрящевой ткани
значительную роль играет протеогликановая система, которая для модельной
системы была разрушена действием трипсина. [1].
Отметим, что для образцов, нагретых в режиме 3 (Рис. 54), оба
уменьшения контраста спекл-картин наглядно разделены на температурных
зависимостях. Это разделение объясняется меньшей скоростью ИК лазерного
нагрева, которое, в свою очередь, приводит к временному разделению двух
процессов: движение и испарение жидкости и денатурация коллагена - в
случае модельной системы “хрящевая ткань, обработанная трипсином, с
разрушенной протеогликановой подсистемой”.
Таким образом, эксперименты, поставленные на препаратах хрящевой
ткани с разрушенной протеогликановой подсистемой, убедительно доказали
возможность регистрации структурных изменений в коллагенсодержащих
тканях,
вызванных
денатурацией
коллагена,
методом
спекл-
интерферометрии при ИК лазерном нагреве.
4.5.3. Динамика спеклов при ИК лазерном нагреве интактной
хрящевой ткани.
Необходимо было сопоставить результаты экспериментов изучения
динамики спеклов при нагреве интактной хрящевой ткани с уже
полученными результатами экспериментов, в которых изучалась динамика
спеклов при диффузии, испарении воды и денатурации коллагена в хрящевой
ткани,
обработанных
трипсином,
с
разрушенной
протеогликановой
подсистемой. Данное исследование было проведено впервые и позволило
установить основные факторы, влияющие на статистику спекл-картин при
ИК лазерном нагреве биологической ткани.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
122
Препараты интактной хрящевой ткани подвергались ИК лазерному
нагреву с одновременной регистрацией спекл-картин и температурных
полей. После лазерной обработки образцы помещались в раствор трипсина
для дальнейшего биохимического анализа на степень денатурации или для
термического анализа методом ДСК.
Рисунок 55. Зависимости температуры ИК лазерного нагрева от времени
облучения образцов интактной хрящевой ткани при различных режимах
нагрева.
На рисунке 55 приведены температурные кривые для некоторых
образцов. Отметим, что температурный рост происходит достаточно
монотонно, за исключением образца 1, где скачки температурного поля
могли быть вызваны внешними воздействиями.
Степень денатурации для образцов определялась биохимическим
методом. На представленных кривых (Рис. 56-58) видно, что в значительной
степени денатурация протекала только в тех образцах, для которых
наблюдалось существенное уменьшение контраста спекл-картин после ИК
лазерного нагрева свыше 55-57°C (Рис. 57, 58).
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
123
Рисунок 56. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры при нагреве образцов интактной хрящевой ткани до 57°C,
длительность нагревания свыше 50°C – 15 секунд (режим 1). Степень
денатурации после нагрева – 4,9%.
Рисунок 57. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры при нагреве образцов интактной хрящевой ткани до 76°C,
длительность нагревания свыше 60°C – 60 секунд (режим 2). Степень
денатурации после нагрева – 14,3%.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
124
Рисунок 58. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры при нагреве образцов интактной хрящевой ткани до 76°C,
длительность нагревания свыше 60°C – 45 секунд (режим 3). Степень
денатурации после нагрева – 9%.
Для образцов с температурой поверхности ~ 50°C заметной степени
денатурации коллагена не наблюдали даже при длительном ИК лазерном
воздействии. Таким образом, лазерная обработка умеренной интенсивности
(T ≤ 50°C) даже в течение 60 секунд не приводит к заметной деградации
матрикса. Степень денатурации увеличивалась при увеличении длительности
нагрева (Рис. 57, 58), становясь значительной при температурах свыше 70°C.
Данные результаты находятся в хорошем согласии с работами [39,141], где
частичная денатурация коллагена II наблюдалась для температур свыше
65°C.
Кроме определения степени денатурации коллагена биохимическим
методом, использовался метод ДСК (дифференциальная сканирующая
калориметрия). Типичные термограммы приведены на рисунке 59 для
образцов, предварительно обработанных для удаления протеогликанов
трипсином. Тепловые эффекты приведены в таблице 3.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
125
Рисунок 59. Термограмма образцов хрящевой ткани.
Таблица 3. Тепловые эффекты денатурации образцов хрящевой ткани.
N образца
Состояние
образца
Тепловой эффект,
Дж/г сухого
остатка ткани
Температура максимума
пика, ºC
3*
Необлученный
32,75
62,48
3
Облученный
23,86
65,12
9
Облученный
26,52
61,45
12
Облученный
22,09
63,71
ДСК анализ подтвердил, что ИК лазерная обработка интактной
хрящевой ткани не приводит к полной денатурации коллагена, что также
согласуется с литературными данными. Однако тепловой эффект, связанный
с денатурацией коллагена в образцах, нагретых ИК лазерным излучением
свыше 60°C, значительно меньше теплового эффекта необлученных
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
126
образцов. Это свидетельствует о модификации коллагена II в образцах,
нагретых ИК лазерным излучением до температур 60°C и выше (Рис. 61-63).
Зависимости
значений
функции
контраста
спекл-картин
от
температуры для образцов 3, 9, 12 представлены на рисунках 61-63. На всех
зависимостях, изображенных на рисунках 61-63, видны резкие падения
контраста после 57-60 °С, что свидетельствует о начале процесса
денатурации во всех образцах.
Рисунок 60. Зависимости температуры ИК лазерного нагрева от времени
облучения образцов интактной хрящевой ткани при различных режимах
нагрева.
Из представленных рисунков (Рис. 61-63) видно, что контраст спеклкартин начинает падать после 55-57°C. Но до 60-65°C денатурация, по всей
видимости, происходит преимущественно в приповерхностном слое, в то
время как в объеме хряща степень денатурации остается незначительной, на
уровне контрольных образцов. Таким образом, понижение функции
контраста спекл-картин в районе температур 55-57°C, возможно, связано с
повреждением целостности структуры матрикса на поверхности интактной
хрящевой ткани при подготовке образцов к эксперименту и с особым
состоянием макромолекул коллагена на поверхности.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
127
Рисунок 61. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры при нагреве образцов интактной хрящевой ткани до 70°C,
длительность нагревания свыше 60°C – 50 секунд.
Рисунок 62. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры при нагреве образцов интактной хрящевой ткани до 63°C,
длительность нагревания свыше 60°C – 25 секунд.
В работе [142] было показано, что поверхностная температура, которая
детектируется
ИК
радиометрическим
методом,
не
всегда
является
максимальной, и существуют такие слои ткани, которые имеют более
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
128
высокую температуру и располагаются глубже в объеме ткани. Этот
“неожиданный” результат вытекает из нестационарного решения уравнения
теплопроводности и может быть объяснено более активным испарением
воды с поверхности по сравнению с отводом тепла в объем. Более того, в
этой
же
работе
было
показано,
что
температура
поверхности
стабилизируется быстрее (“выходит на плато”), чем в объеме. Всё это может
указывать на “перегрев” приповерхностного слоя, достаточный для начала
денатурации коллагена и чувствительный для спекл-интерферометрии, но
“скрытый” от ИК радиометрического метода.
Рисунок 63. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры при нагреве образцов интактной хрящевой ткани до 73°C,
длительность нагревания свыше 60°C – 25 секунд.
На всех приведенных температурных зависимостях контраста спеклкартин интактных образцов хрящевой ткани наблюдается постепенное
уменьшение
значений
функции
контраста
спекл-картин
с
ростом
температуры до момента начала денатурации коллагена II. И хотя это
падение выражено менее, чем в случае с хрящевой тканью, обработанной
трипсином, оно также связано с диффузией и испарением воды, как и при
неразрушающем нагреве интактной хрящевой ткани.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
129
На основании экспериментальных данных можно сделать следующие
выводы:
-) денатурация коллагена имеет пороговый характер по температуре:
денатурация протекает только при температуре выше 55-57°C;
-) степень денатурации увеличивается при увеличении времени
нагрева.
Таким образом, эксперименты, поставленные на препаратах интактной
хрящевой
ткани,
убедительно
показали
возможность
регистрации
структурных изменений белков (денатурация коллагена), диффузии и
испарения воды методом спекл-интерферометрии при ИК лазерном нагреве.
Были установлены основные факторы, приводящие к изменению динамики
спеклов при ИК лазерном нагреве интактной хрящевой ткани: денатурация
коллагена, диффузия и испарение воды.
4.5.4. Использование оптоволоконного жгута для регистрации
спекл-картин.
Препараты интактной хрящевой ткани подвергались ИК лазерному
нагреву с одновременной регистрацией спекл-картин через оптоволоконный
жгут. Образцы нагревались лазером до температур примерно 80°C (Рис. 64).
На рисунках 65, 66 приведены характерные зависимости функции
контраста спекл-картин от температуры образцов интактной биологической
ткани,
подвергшихся
ИК
лазерному
воздействию.
Отличительной
особенностью таких зависимостей является существование диапазонов
температур, в которых проявляется резкое падение автокорреляционной
функции (контраст). В случае ИК лазерного нагрева наблюдались два таких
падения в диапазонах температур 35-45°C и 55-75°C.
На приведенных кривых (Рис. 65, 66) видно, что во всех образцах
функция контраста спекл-картин оказалась чувствительной к началу
процесса денатурации коллагена: функция контраста спекл-картин начинала
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
130
резко падать после достижения температуры 57-60°C, что согласуется с
данными,
полученными
в
предыдущих
экспериментах,
где
съемка
осуществлялась напрямую.
Рисунок 64. Зависимости температуры ИК лазерного нагрева от времени
облучения образцов интактной хрящевой ткани при различных режимах
нагрева.
Рисунок 65. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры при нагреве интактных образцов хрящевой ткани до 86°C.
Регистрация спекл-картин происходила через оптоволоконный жгут.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
131
Рисунок 66. Зависимость значений функции контраста спекл-картин от
температуры при нагреве интактных образцов хрящевой ткани до 82°C.
Регистрация спекл-картин происходила через оптоволоконный жгут.
При использовании оптоволоконного жгута в случае ИК лазерной
обработки интактной хрящевой ткани более отчетливо видно падение
функции контраста спекл-картин в районе температур 35-55°C, что
соответствует поведению функции контраста спекл-картин при нагревании
образцов хряща, предварительно обработанных трипсином. Это объясняется
дополнительным увеличением линзы, установленной перед жгутом, из-за
чего процесс образования диффузии и испарения воды стал более заметным.
Эксперименты с оптическим жгутом показали, что измерения
оптических
свойств
облучаемых
биологических
тканей
становятся
возможными и в тех случаях, когда хрящевая ткань скрыта от прямого
визуального наблюдения, например, в носовой полости (перегородка носа), в
суставных сумках или между позвонками, без изменения основных
закономерностей
поведения
функции
контраста
спекл-картин.
Все
статистические характеристики спекл-картин, полученные с использованием
оптического
жгута,
совпали
с
соответствующими
характеристиками,
полученными без использования жгута.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
132
Выводы.
1.
Впервые
создана
и
отработана
методика
спекл-
интерферометрического анализа, позволяющая регистрировать структурные
изменения при нагреве веществ. Создан комплекс программ и предложена
аппаратная схема проведения спекл-интерферометрического анализа в
режиме реального времени с системой обратной связи для управления
мощностью лазерного излучения.
2. Впервые показана чувствительность статистики спекл-картин к
структурным переходам, вызванным фазовыми переходами первого рода, на
примере
плавления
низкомолекулярных
органических
соединений.
Установлены характерные зависимости в изменении статистики спеклкартин для данного процесса.
3. Впервые показана чувствительность статистики спекл-картин к
диффузии
и
испарению
воды
как
в
случае
модельной
системы
“фильтровальная бумага – вода”, так и в случае интактной хрящевой ткани.
Установлены характерные зависимости в изменении статистики спеклкартин для данного процесса.
4. Впервые показана чувствительность статистики спекл-картин к
структурным изменениям в хрящевой ткани, обработанной трипсином, с
разрушенной протеогликановой подсистемой, вызванным денатурацией
коллагена при лазерном нагреве. Установлены характерные зависимости в
изменении статистики спекл-картин для данного процесса.
5. Впервые определены характерные особенности поведения функции
контраста спекл-картин, по которым можно осуществлять мониторинг
состояния хрящей в процессе умеренного ИК лазерного нагрева и определять
такие специфические особенности, как начало денатурации коллагена.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
133
6. Впервые изучены возможности регистрации динамики спекл-картин
из скрытых для прямого наблюдения участков с помощью оптического
жгута.
Показано,
полученные
с
что
статистические
использованием
характеристики
оптического
жгута,
спекл-картин,
совпадают
с
соответствующими характеристиками, полученными без использования
жгута.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
134
Список литературы.
1. Лазерная инженерия хрящей. / Под ред. Баграташвили В.Н., Соболь Э.Н.,
Шехтер А.Б. М: ФИЗМАТЛИТ, 2006. 488 с.
2. Хрящ. / Павлова В.Н., Копьева Т.П., Слуцкий Л.И., Павлов Г.Г. М.:
Медицина, 1988. 320 с.
3. Comper W.D. Physicochemical Aspects of Cartilage Extracellular Matrix. //
Hall B.K., Newman S.A. Cartilage: Molecular Aspects. Boston-London: CRC
Press, 1991. 268 p.
4. Хэм А., Кормак Д. Гистология. Т.2-3. М.: Мир, 1983.
5. Muir H. The chondrocyte, architect of cartilage. Biomechanics, structure,
function and molecular biology of cartilage matrix macromolecules. // Bioessays,
1995, v.17(12), pp.1039-1048.
6. Simunek Z., Muir H. Changes in the protein-polysaccharides of pig articular
cartilage during prenatal life, development and old age. // Biochemical Journal,
1972, v.126, pp.515-523.
7. Homicz M.R., McGowan K.B., Lottman L.M., Beh G., Sah R.L., Watson D. A
Compositional Analysis of Human Nasal Septal Cartilage. // Archives of Facial
Plastic Surgery, 2003, v.5(1), pp.53-58.
8. Rotter N., Tobias G., Lebl M., Roy A.K., Hansen M.C., Vacanti C.A., Bonassar
L.J. Age-related changes in the composition and mechanical properties of human
nasal cartilage. // Archives of Biochemistry and Biophysics, 2002, v.403(1),
pp.132-140.
9. Fessler J.H. A Structural Function of Mucopolysaccharide in Connective Tissue.
// Biochemical Journal, 1960, v.76, pp.124-132.
10. Hu K., Radhakrishnan P., Patel R.V., Mao J.J. Regional Structural and
Viscoelastic Properties of Fibrocartilage upon Dynamic Nanoindentation of the
Articular Condyle. // Journal of Structural Biology, 2001, v.136, pp.46-52.
11. Bollet A.J., Handy J.R., Sturgill B.C. Chondroitin sulfate concentration and
proteinpolysaccharide composition of articular cartilage in osteoarthritis. // Journal
of Clinical Investigation, 1963, v.42(6), pp.853-859.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
135
12. Kivirikko K.I., Prockop D.J. Hydroxylation of Proline in Synthetic
Polypeptides with Purified Protocollagen Hydroxylase. // The Journal of Biological
Chemistry, 1967, v.242(18), pp.4007-4012.
13. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков. М.:
Высшая школа, 1996. 335 c.
14. Bailey A.J. Molecular mechanisms of ageing in connective tissues. //
Mechanisms of Ageing and Development, 2001, v.122(7), pp.735-755.
15. Verzijl N., DeGroot J., Ben Z.C., Brau-Benjamin O., Maroudas A., Bank R.A.,
Mizrahi J., Schalkwijk C.G., Thorpe S.R., Baynes J.W., Bijlsma J.W., Lafeber
F.P., TeKoppele J.M. Crosslinking by advanced glycation end products increases
the stiffness of the collagen network in human articular cartilage: a possible
mechanism through which age is a risk factor for osteoarthritis. // Arthritis and
rheumatism, 2002, v.46(1), pp. 114-123.
16. Kronick P., Maleeff B., Carroll R. The locations of collagens with different
thermal stabilities in fibrils of bovine reticular dermis. // Connective Tissue
Research, 1988, v.18(2), pp. 123-134.
17. Smith J.W. Molecular Pattern in Native Collagen. // Nature, 1968, v.219,
pp.157-158.
18. Манделькерн Л. Кристаллизация полимеров. M., Ленинград: Химия, 1966.
336 с.
19. Bigi A., Cojazzi G., Roveri N., Koch M.H.J. Differential scanning calorimetry
and Xray diffraction study of tendon collagen thermal denaturation. // International
journal of biological macromolecules, 1987, v.9, pp.363-367.
20. Yamamoto S., Hashizume H., Hitomi J., Shigeno M., Sawaguchi S., Abe H.,
Ushiki T. The subfibrillar arrangement of corneal and scleral collagen fibrils as
revealed by scanning electron and atomic force microscopy. // Archives of
histology and cytology, 2000, v.63(2), pp. 127-135.
21. Meek K.M., Fullwood N.J. Corneal and scleral collagens - a microscopist‘s
perspective. // Micron, 2001, v.32, pp. 261–272.
22. Holmes D.F., Graham H.K., Trotter J.A., Kadler K.E. STEM/TEM studies of
collagen fibril assembly. // Micron, 2001, v.32, pp.273-285.
23. Eyre D.R., Wu J.-J., Fernandes R.J., Pietka T.A., Weis M.A. Recent
developments in cartilage research: matrix biology of the collagen II/IX/XI
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
136
heterofibril network. // Biochemical Society Transactions, 2002, v.30(6), pp.894899.
24. Diab M., Wu J.-J., Eyre D.R. Collagen type IX from human cartilage: a
structural profile of intermolecular cross-linking sites. // Biochemical Journal,
1996, v.314, pp.327-332.
25. Жоли М. Физическая химия денатурации белков. М.: Мир, 1968. 364 c.
26. Flory P.J., Carret R.R. Phase Transition in Collagen and Gelatin Systems. //
Journal of the American Chemical Society, 1958, v.80(18), pp.4836-4845.
27. Церетели Г.И. Тепловая денатурация коллагена в растворе и фибриллах. //
Биофизика, 1982, т.27(5), сс.780-784.
28. Luescher M., Ruegg M., Schindler P. Effect of Hydration upon Thermal
Stability of Tropocollagen and its Dependence on the Presence of Neutral Salts. //
Biopolymers, 1974, v.13(12), pp.2489-2503.
29. Kopp J., Bonnet M., Renou J.P. Effect of collagen crosslinking on collagenwater interactions (a DSC investigation). // Matrix, 1989, v.9(6), pp.443-450.
30. Friess W., Lee G. Basic thermoanalytical studies of insoluble collagen
matrices. // Biomaterials, 1996, v.17(23), pp.2289-2294.
31. Wallace D.G., Condell R.A., Donovan J.W., Paivinen A., Rhee W.M., Wade
S.B. Multiple denaturational transitions in fibrillar collagen. // Biopolymers, 1986,
v.25(10), pp.1875-1893.
32. Miles C.A., Ghelashvili M. Polymer-in-a-Box Mechanism for the Thermal
Stabilization of Collagen Molecules in Fibers. // Biophysical Journal, 1999,
v.76(6), pp.3243-3252.
33. Usha R., Ramasami T. Effect of crosslinking agents (basic chromium sulfate
and formaldehyde) on the thermal and thermomechanical stability of rat tail tendon
collagen fibre. // Thermochimica Acta, 2000, v.356, pp.59-66.
34. Sankaran V., Walsh J.T. Birefringence measurement of rapid structural
changes during collagen denaturation. // Photochemistry and photobiology, 1998,
v.68(6), pp.846-851.
35. Bank R.A., Krikken M., Beekman B., Stoop R., Maroudas A., Lafebers
F.P.J.G., Koppele J.M. A simplified measurement of degraded collagen in tissues:
Application in healthy, fibrillated and osteoarthritic cartilage. // Matrix Biology,
1997, v.16(5), pp.233-243.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
137
36. Церетели Г.И., Смирнова О.И. Калориметрическое исследование
стеклования денатурированного коллагена. // Биофизика, 1990, т.35(2),
сс.217-220.
37. Церетели Г.И., Белопольская Т.В. Тепловые свойства системы коллагенвода. Часть I. // Биофизика, 1997, т.42(1), сс.68-74.
38. Церетели Г.И., Белопольская Т.В. Тепловые свойства системы коллагенвода. Часть II. // Биофизика, 1997, т.42(3), сс.584-590.
39. Ignatieva N.Yu., Lunin V.V., Averkiev S.V., Maiorova A.F., Bagratashvili
V.N., Sobol E.N. DSC investigation of connective tissues treated by IR-laser
radiation. // Thermochimica Acta, 2004, v.422, pp.43-48.
40. Игнатьева Н.Ю., Соболь Э.Н., Аверкиев С.В., Лунин В.В., Гроховская
Т.Е., Баграташвили В.Н., Янцен Е.С. Термическая стабильность коллагена II
в хряще. // Доклады Академии Наук, 2004, т.395(5), сс.696-698.
41. Игнатьева Н.Ю., Аверкиев С.В., Соболь Э.Н., Лунин В.В. Денатурация
коллагена II в хрящевой ткани при термическом и лазерном нагреве. //
Журнал физической химии, 2005, т.79(8), сс.1505–1513.
42. Billinghurst R.C., Buxton E.M., Edwards M.G., McGraw M.S., Mcllwraith
C.W. Use of an antineoepitope antibody for identification of type-II collagen
degradation in equine articular cartilage. // American Journal of Veterinary
Research, 2001, v.62(7), pp.1031-1039.
43. Hollander A.P., Heathfield T.F., Webber C., Iwata Y., Bourne R., Rorabeck C.,
Poole A.R. Increased damage to type II collagen in osteoarthritic articular cartilage
detected by a new immunoassay. // The Journal of Clinical Investigation, 1994,
v.93(4), pp.1722–1732.
44. Visconti C.S., Kavalkovich K., Wu J.-J., Niyibizi C. Biochemical Analysis of
Collagens at the Ligament-Bone Interface Reveals Presence of Cartilage-Specific
Collagens. // Archives of Biochemistry and Biophysics, 1996, v.328(1), pp.135142.
45. Марч Дж. Органическая химия. М.: Мир. 1987.
46. Bergman I., Loxley R. New spectrophotometric method for the determination
of proline in tissue hydrolyzates. // Analytical Chemistry, 1970, v.42(7), pp.702706.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
138
47. Woessner J.F.. The determination of hydroxyproline in tissue and protein
samples containing small proportions of this imino acid. // Archives of
Biochemistry and Biophysics, 1961, v.93, pp.440-447.
48. Schwartz D.E., Choi Y., Sandell L.J., Hanson W.R. Quantitative analysis of
collagen, protein and DNA in fixed, paraffin-embedded and sectioned tissue. // The
Histochemical Journal, 1985, v.17(6), pp.655-663.
49. Ohara R., Tanaka A., Ohara O. Automated fluorescent DNA sequencing by a
simplified solid-phase chemical sequencing method. // BioTechniques, 1997,
v.22(4), pp.653-656.
50. Юровская М.А. Методы Синтеза и Химические Свойства Ароматических
Гетероциклических Соединений. М., 1998. 227 с.
51. N. Blumenkrantz, G. Asboe-Hansen. An assay for total hexosamine and a
differential assay for glucosamine and galactosamine. // Clinical biochemistry,
1976, v.9(6), pp.269-274.
52. Быков В.Л. Цитология и общая гистология. С.-П.: СОТИС, 2003. 520 с.
53. Maroudas A. Distribution and diffusion of solutes in articular cartilage. //
Biophysics Journal, 1970, v.10(5), pp.365-379.
54. Maroudas A., Schneiderman R. ‘Free’ and ‘exchangeable’ or ‘trapped’ and
‘non-exchangeable’ water in cartilage. // Journal of Orthopedic Research, 1987,
v.5(1), pp.133-138.
55. Torzilli P.A., Rose D.E., Dethmers D.A. Equilibrium water partition in
articular cartilage. // Biorheology, 1982, v.19(4), pp.519-537.
56. Torzilli P.A. Influence of cartilage conformation on its equilibrium water
partition. // Journal of Orthopedic Research, 1985, v.3(4), pp.473-483.
57. Torzilli P.A. Water content and equilibrium water partition in immature
cartilage. // Journal of Orthopaedic Research, 1988, v.6(5), pp.766-769.
58. Sobol E., Sviridov A., Omel'chenko A., Bagratashvili V., Kitai M., Harding
S.E., Jones N., Jumel K., Mertig M., Pompe W., Ovchinnikov Y., Shekhter A.,
Svistushkin V. Laser reshaping of cartilage. // Biotechnology & genetic
engineering reviews, 2000, v.17, pp.553-578.
59. Bagratashvili V.N., Sobol E.N., Sviridov A.P., Popov V.K., Omel'chenko A.I.,
Howdle S.M. Thermal and diffusion processes in laser-induced stress relaxation
and reshaping of cartilage. // Journal of biomechanics, 1997, v.30(8), pp.813-817.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
139
60. Sobol E.N., Bagratashvili V.N., Omel'chenko A.I., Sviridov A.P., Helidonis
E.S., Kavvalos G., Christodoulou P., Naoumidi I., Velegrakis G., Ovchinnikov
Yu.M., Shechter A.. Laser shaping of cartilage. // Proceedings of SPIE, 1994,
v.2128, pp.43-49.
61. Sobol E., Bagratashvili V., Sviridov A., Omelthenko A., Ovchinnikov Yu.,
Svistushkin V., Shekhter A., Jones N., Howdle S., Helidonis E. Phenomenon of
cartilage shaping using moderate heating and its applications in
otorhinolaryngology. // Proceedings of SPIE, 1996, v.2623, pp. pp.548-552.
62. Sobol E.N., Sviridov A.P., Kitai M.S., Edwards G.S. Temperature alterations
of infrared light absorption by cartilage and cornea under free-electron laser
radiation. // Applied Optics, 2003, v.42(13), pp.2443-2449.
63. Sobol E.N., Omel‘chenko A.I., Sviridov A.P., Hardin S.E., Jumel K., Jones N.
Hydrodynamic study of the behavior of chondroitin sulphate under nondestructive
laser irradiation of cartilage. // Proceedings of SPIE, 2000, v.3914, pp.88-93.
64. Jumel K., Harding S.E., Sobol E.N., Ome1‘chenko A.I., Sviridov A.P., Jones
N.. Aspects of the structural integrity of chondroitin sulphate after laser irradiation.
// Carbohydrate polymers, 2002, v.48(3), pp.241-245.
65. Yansen E.S., Ignatieva N.Yu., Averkiev S.V., Shekhter A.B., Lunin V.V.,
Sobol E.N. Changes in Proteoglycan Subsystem of Cartilage as a Result of
Infrared-Laser Treatment. // Laser Physics, 2005, v.15(12), pp.1660-1663.
66. Jamieson A.M., Blackwell J., Reihanian H., Ohno H., Gupta R., Carrino D.A.,
Caplan A.I., Tang L.H., Rosenberg L.C. Thermal and solvent stability of
proteoglycan aggregates by quasielastic laser light-scattering. // Carbohydrate
Research, 1987, v.160, pp.329-341.
67. Hardingham T.E., Ewins R.J., Muir H. Cartilage proteoglycans. Structure and
heterogeneity of the protein core and the effects of specific protein modifications
on the binding to hyaluronate. // Biochemical Journal, 1976, 157, pp.127-143.
68. Hardingham T.E. The Role of Link-Protein in the Structure of Cartilage
Proteoglycan Aggregates. // Biochemical Journal, 1979, 177, pp.237-247.
69. Sobol E., Omel'chenko A., Mertig M., Pompe W. Scanning Force Microscopy
of the Fine Structure of Cartilage Irradiated with a CO2 Laser. // Lasers in Medical
Science, 2000, v.15(1), pp.15-23.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
140
70. Аверкиев С.В., Игнатьева Н.Ю., Лунин В.В., Соболь Э.Н. Влияние
лазерного излучения на адсорбцию воды сухими препаратами хрящевой
ткани и коллагена. // Биофизика, 2003, т.48(3), сс.505-510.
71. Берлиен Х.-П., Мюллер Г.Й. Прикладная лазерная медицина. М.:
Интерэксперт, 1997.
72. Pettit G.H., Ediger M.N., Hahn D.W., Landry R.J., Weiblinger R.P.,
Morehouse K.M. Electron paramagnetic resonance spectroscopy of free radicals in
corneal tissue following excimer laser irradiation. // Lasers in Surgery and
Medicine, 1996, v.18(4), pp.367-372.
73. Bagratashvili V.N., Omel'chenko A.I., Sviridov A.P., Sobol' E.N., Lunina E.V.,
Zhitnev Yu.N., Markaryan G.L., Lunin V.V. An EPR and Optical Spectroscopy
Study of the Effect of Laser Radiation on Biological Tissues. // High Energy
Chemistry, 2001, v.35(6), pp.423-429.
74. Müller G., Roggan A. Laser-Induced Interstitial Thermotherapy. Bellingham,
Washington: SPIE Optical Engineering Press, 1995.
75. Huttmann G., Birngruber R. On the possibility of high-precision photothermal
microeffects and the measurement of fast thermal denaturation of proteins. IEEE
Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, 1999, v.5(4), pp.954-962.
76. Bagratashvili V.N., Sobol E.N., Sviridov A.P., Helidonis E.S., Kavvalos G.A.
Carbonization of Bony Tissue by Pulsed Lasers // Lasers in the Life Sciences,
1997, v.7(3), pp.181-198.
77. Guerino M.R., Baranauskas V., Guerino A.C., Parizotto N. Laser treatment of
experimentally induced chronic arthritis. // Applied Surface Science, 2000, v.154155, pp.561-564.
78. Hayashi K., Hecht P., Thabit G., Peters D.M., Vanderby R., Cooley A.J.,
Fanton G.S., Orwin J.F., Markel M.D. The Biologic Response to Laser Thermal
Modification in an In Vivo Sheep Model. // Clinical Orthopedics and related
Research, 2000, v.373, pp.265-276.
79. Naseef G.S., Foster T.E., Trauner K., Solhpour S., Anderson R.R., Zarins B.
The Thermal Properties of Bovine Joint Capsule: The Basic Science of Laser- and
Radiofrequency-Induced Capsular Shrinkage. // The American Journal of Sports
Medicine, v.25(5), pp.670-674.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
141
80. Hayashi K., Thabit G., Bogdanske J.J., Mascio L.N., Markel M.D. The effect
of nonablative laser energy on the ultrastructure of joint capsular collagen. // The
Journal of Arthroscopic and Related Surgery, 1996, v.12(4), pp.474-481.
81. McNally K.M., Sorg B.S., Welch A.J., Dawes J.M., Owen E.R.. Photothermal
effects of laser tissue soldering. // Physics in medicine & biology, 1999, v.44(4),
pp.983-1002.
82. Tang J., O'Callaghan D., Rouy S., Godlewski G. Quantitative changes in
collagen levels following 830-nm diode laser welding. // Lasers in Surgery and
Medicine, 1998, v.22(4), pp.207-211.
83. Овчинников Ю.М., Никифорова Г.Н., Свистушкин В.М., Гамов В.П.,
Соболь Э.Н., Баграташвили В.Н., Омельченко А.И., Свиридов А.П., Наумиди
И., Хелидонис Э. Произвольное изменение формы хряща под влиянием
лазерного излучения. // Вопросы оториноларингологии, 1995, т.3, сс.5-10.
84. Fisher P.E., Khomoto T., Derosa C.M., Spotnitz H.M., Smith C.R., Burkhoff
D. Histologic analysis of transmyocardial channels: comparison of CO2 and
holmium: YAG lasers. // The Annals of Thoracic Surgery, 1997, v.64(2), pp.466472.
85. Гудмен Дж. Статистическая оптика. М.: Мир, 1988. 528 с.
86. Рябухо В.П. Спекл-интерферометрия. Web-site:
[http://optics.sgu.ru/info/edu/method/sp-in/], 2001.
87. Короленко П.В. Оптика когерентного излучения. Web-site:
[http://optics.npi.msu.su/co/toc.html], 1997.
88. Исимару А. Распространение и рассеяние волн в случайно-неоднородных
средах. Т. 1. М.: Мир, 1981.
89. Goodman J.W. Some fundamental properties of speckle. // Journal of Optical
Society of America, 1976, v.66(11), pp.1145-1150.
90. Goodman J. Statistical properties of laser speckle patterns. // J.C. Dainty. Laser
Speckle and Related Phenomena, Heidelberg, Berlin, New York: Springer-Verlag,
1975.
91. Bazulev N., Fomin N., Fuentes C., Hirano T., Lavinskaya E., Martemianov S.,
Mizukaki T., Nakagawa A., Rubnikovich S., Saulnier J.-B., Takayama K., Tuhault
J.-L. Laser Monitor for Soft and Hard Biotissue Analysis Using Dynamic Speckle
Photography. // Laser Physics, 2003, v.13(5), pp.786-795.
92. Франсон М. Оптика спеклов. М.: Мир, 1980. 171 с.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
142
93. Ulyanov S. Laser speckle metrology: Implication for biomedical diagnostics. //
Journal of X-Ray Science and Technology, 2003, v.11(2), pp.45-49.
94. Briers J.D., Webster S. Laser speckle contrast analysis (LASCA): a
nonscanning, full-field technique for monitoring capillary blood flow. // Journal of
Biomedical Optics, 1996, v.1(2), pp.174-179.
95. Cheng H., Luo Q., Zeng S., Chen S., Cen J., Gong H. Modified laser speckle
imaging method with improved spatial resolution. // Journal of Biomedical Optics,
2003, v.8(3), pp.559-564.
96. Forrester K.R., Stewart C., Tulip J., Leonard C., Bray R.C. Comparison of
laser speckle and laser Doppler perfusion imaging: Measurement in human skin
and rabbit articular tissue. // Medical & Biological Engineering & Computing,
2002, v.40(6), pp.687-697.
97. Kirkpatrick S.J., Cipolla M.J. High resolution imaged laser speckle strain
gauge for vascular applications. // Journal of Biomedical Optics, 2000, v.5(1),
pp.62-71.
98. Гордин А.И., Маругин А.В. Оптическая диагностика динамики
биологических микрообъектов с помощью согласованной фильтрации
лазерной спекл-структуры рассеяния. // Известия АН. Серия Физическая,
2002, Т. 66(8), сс.1167-1171.
99. Рябухо В.П. Интерференция спекл-полей в зоне дифракции
сфокусированного пространственно-модулированного лазерного пучка на
случайном фазовом экране. // Оптика и спектроскопия, 2003, Т.94(3), сс.498505.
100. Yoshimura T. Statistical properties of dynamic speckles. // Journal of the
Optical Society of America, 1986, v.3(7), pp.1032-1054.
101. Li E.B., Tieu A.K., Wang K.F. Dynamic laser speckle method for determining
the relative velocity between two objects. // Optics Communications, 2003, v.219,
pp.1-8.
102. Okamoto T., Asakura T. Velocity Measurements of Two Moving Diffusers
Using a Temporal Correlation Length of Doubly-scattered Speckle. // Journal of
Modern Optics, 1990, v.37(3), pp.389-408.
103. Okamoto T., Asakura T. Detection of the Object Velocity Using
Doublyscattered Dynamic Speckles Under Gaussian Beam Illumination. // Journal
of Modern Optics, 1991, v.38(9), pp.1821-1839.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
143
104. Takai N., Iwai T., Asakura T. Correlation distance of dynamic speckles. //
Applied Optics, 1983, v.22(1), pp.170-177.
105. Briers J.D., Richards G., He X.W. Capillary Blood Flow Monitoring Using
Laser Speckle Contrast Analysis (LASCA). // Journal of Biomedical Optics, 1999,
v.4(1), pp.164-175.
106. Ульянов С.С. Особенности проявления эффекта Доплера при дифракции
сфокусированных гауссовых пучков в движущихся случайно-неоднородных
средах. // Известия АН. Серия Физическая, 1995, т.59(6), сс.151-155.
107. Ulyanov S. Speckled Speckle Statistics with a Small Number of Scatterers:
Implication for Blood Flow Measurement. // Journal of Biomedical Optics, 1998,
v.3(3), pp. 237-245.
108. Ulyanov S.S., Tuchin V.V., Bednov A.A., Brill G.E., Zakharova E.I. The
Application of Speckle Interferometry for Monitoring of Blood and Lymph Flow
in Microvessels. // Lasers in Medical Science, 1997, v.12, pp.31-41.
109. Briers J.D. Laser Doppler, speckle and related techniques for blood perfusion
mapping and imaging. // Physiological Measurement, 2001, v.22(4), pp.R35-R66.
110. V.V. Tuchin. Handbook of Optical Biomedical Diagnostics. Bellingham:
SPIE Press, 2002.
111. Oulamara A., Tribillon G., Duvernoy J. Biological Activity Measurement on
Botanical Specimen Surfaces Using a Temporal Decorrelation Effect of Laser
Speckle. // Journal of Modern Optics, 1989, v.36(2), pp.165-179.
112. Takai N., Kimura S., Asakura T. Dynamic Properties of Laser Speckles on
Images Transmitted Through an Image Fibre-bundle. // Journal of Modern Optics,
1989, v.36(2), pp.181-193.
113. Fujii H., Okamoto T., Asakura T. Power spectra of speckle signals detected
by optical-fiber probe. // Journal of the Optical Society of America, 1987, v.4(8),
pp.1366-1375.
114. Holder L., Okamoto T., Asakura T. A digital speckle correlation
interferometer using an image fibre. // Measurement Science and Technology,
1993, v.4(7), pp.746-753.
115. Takai N., Asakura T. Statistical properties of laser speckles produced under
illumination from a multimode optical fiber. // Journal of the Optical Society of
America, 1985, v.2(8), pp.1282-1290.
116. Звелто О. Принципы лазеров. М: Мир, 1990.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
144
117. Анциферов В.В., Кашников Б.П., Смирнов Г.И.. Зарядовая связь на
основе резонансной поверхностной фотоионизации. // Письма в ЖТФ, 1999,
т.25(3), сс.14-18.
118. Jakeman E., McWhirter J.G., Pusey P.N. Enhanced fluctuations in radiation
scattered by a moving random phase screen. // Optical Society of America, Journal,
1976, v.66, pp.1175-1182.
119. Jakeman E., Welford W.T. Speckle statistics in imaging systems. // Optics
Communications, 1977, v.21, pp.72-79.
120. Fomin N.A. Speckle Photography for Fluid Mechanics Measurements. New
York: Springer, 1998.
121. McHugh M. Calculation of Blackbody Radiance. // Web-site:
[http://www.spectralcalc.com/blackbody_calculator/Calculating Blackbody
Radiance.pdf].
122. Fullam B. Infrared thermometers: theory and construction. // Web-site:
[http://www.mikroninfrared.com/mikron_university/Sensor_Theory.pdf].
123. Kim K.S., Kim J.H., Lee J.K., Jarng S.S. Measurement of thermal expansion
coefficients by electronic speckle pattern interferometry at high temperature. //
Journal of Materials Science Letters, 1997, v.16(21), pp.1753-1756.
124. Denby D., Leendertz J.A. Plane-surface strain examination by speckle-pattern
interferometry using electronic processing. // The Journal of Strain Analysis for
Engineering Design, 1974, v.9(1), pp.17-25.
125. Leendertz J.A. Interferometric displacement measurement on scattering
surfaces utilizing speckle effect. // Journal of Physics E: Scientific Instruments,
1970, v.3, pp.214-218.
126. Yamaguchi I. Speckle Displacement and Decorrelation in the Diffraction and
Image Fields for Small Object Deformation. // Journal of Modern Optics, 1981,
v.28(10), pp.1359-1376.
127. Jephcoat A.P., Besedin S.P. Temperature Measurement and Melting
Determination in the Laser-Heated Diamond-Anvil Cell. // Philosophical
Transactions: Mathematical, Physical and Engineering Sciences, 1996,
v.354(1711), pp.1333-1360.
128. Boehler R. Melting and element partitioning Fe-FeS eutectic temperatures to
620 kbar. // Physics of the Earth and Planetary Interiors, 1996, v.96, pp.181-186.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
145
129. Boehler R., Ross M., Boercker D.B. Melting of LiF and NaCl to 1 Mbar:
Systematics of Ionic Solids at Extreme Conditions. // Physical Review Letters,
1997, v.78(24), pp.4589-4592.
130. Errandonea D., Boehler R., Ross M. Melting of the Rare Earth Metals and fElectron Delocalization. // Physical Review Letters, 2000, v.85(16), pp.3444-3447.
131. Boehler R., Ross M., Söderlind P., Boercker D. B. High-Pressure Melting
Curves of Argon, Krypton, and Xenon: Deviation from Corresponding States
Theory. // Physical Review Letters, 2001, v.86(25), pp.5731-5734.
132. Angurel L.A., Díez J.C., de la Fuente G.F., Gimeno F., Lera F., LópezGascón C., Martínez E., Mora M., Navarro1 R., Sotelo A., Andrés N., Recuero S.,
Arroyo M.P. Laser technologies applied to the fabrication and characterization of
bulk Bi-2212 superconducting materials for power applications. // Physica Status
Solidi (A), Applied Research, 2006, v.203(11), pp.2931-2937.
133. Битюцкая Л.А., Машкина Е.С. Переходные процессы при плавлении
германия в динамических и квазидинамических режимах. // Журнал
технической физики, 1999, т.69(12), сс.57-61.
134. Wei X., Miranda P.B., Shen Y.R. Surface Vibrational Spectroscopic Study of
Surface Melting of Ice. // Physical Review Letters, 2001, v.86(8), pp.1554-1557.
135. Hayes W. Premelting. // Contemporary Physics, 1986, v.27(6), pp.519-532.
136. Hainovsky N., Maier J. Simple phenomenological approach to premelting and
sublattice melting in Frenkel disordered ionic crystals. // Physical Review B
(Condensed Matter), 1995, v.51(22), pp.15789-15797.
137. Zimnyakov D.A., Agafonov D.N., Sviridov A.P., Omel’chenko A.I.,
Kuznetsova L.V., Bagratashvili V.N. Speckle-contrast monitoring of tissue thermal
modification. // Applied Optics, 2002, v.41(28), pp.5989-5996.
138. Зимняков Д.А., Захаров П.В., Трифонов В.А., Чанилов О.И.
Исследование эволюции границы раздела фаз в пористых средах с
использованием динамического рассеяния света. // Письма в ЖЭТВ, 2001,
т.74(4), сс.237-243.
139. Захаров П.В., Зимняков Д.А. Вейвлет-анализ флуктуаций лазерного
излучения при рассеянии межфазными границами в пористых средах. //
Письма в ЖТФ, 2002, т.28(23), сс.87-94.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
146
140. Zimnyakov D.A. Sviridov A.P. Kuznetsova L.V. Baranov S.A., Ignatieva
N.Yu. Monitoring of tissue thermal modification with a bundle-based full-field
speckle analyzer. // Applied Optics, 2006, v.45(18), pp. 4480-4490.
141. Ignat’eva N.Yu., Sobol’ E.N., Averkiev S.V., Lunin V.V., Grokhovskaya
T.E., Bagratashvili V.N., Yantsen E.S. Thermal stability of collagen II in cartilage.
// Doklady Biochemistry & Biophysics, 2004, v.395(5), pp. 696–698.
142. Sobol E.N., Kitai M.S., Jones N., Sviridov A.P., Milner T., Wong B.J.F.
Heating and Structural Alterations in Cartilage Under Laser Radiation. // IEEE
journal of quantum electronics, 1999, v.35(4), pp.532-539.
Copyright 2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
1
Приложение.
1. Код C++ динамической библиотеки для расчета
статистических функций спекл-картин.
1.1. Основное тело программы.
/*********************************************************************
* $Id: rsm_stat.cpp 150 2007-07-17 22:15:15Z rosmir $
* Copyright (C) 2000-2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
* All rights reserved.
* web-site: www.rosmir.org
*********************************************************************/
#include <cmath>
#include <numeric>
using namespace std;
#if defined(_MSC_VER) // M$ Visual Studio
#pragma warning (disable: 4996)
#define DllExport __declspec( dllexport )
#else
#define DllExport
#endif
// to define some constants we use such header
#include "rsm_main.h"
#ifdef __cplusplus
extern "C" {
#endif
// rsm_mean
DllExport float rsm_mean(unsigned, unsigned short *);
DllExport float rsm_mean_fl(unsigned, float *);
DllExport double rsm_mean_dbl(unsigned, double *);
// rsm_contrast
DllExport float rsm_contrast(unsigned, unsigned short *);
DllExport float rsm_contrast_fl(unsigned, float *);
DllExport double rsm_contrast_dbl(unsigned, double *);
// rsm_decorr
DllExport float rsm_decorr(unsigned, unsigned short *,
unsigned short *);
2
DllExport float rsm_decorr_fl(unsigned, float *, float *);
DllExport double rsm_decorr_dbl(unsigned, double *, double *);
// null_map
DllExport short null_map(unsigned, unsigned, unsigned,
unsigned short *, float *);
// mean_map
DllExport short mean_map(unsigned, unsigned, unsigned,
unsigned short *, float *);
DllExport short mean_map_fl(unsigned, unsigned, unsigned,
float *, float *);
DllExport short mean_map_dbl(unsigned, unsigned, unsigned,
double *, double *);
// contrast map
DllExport short contrast_map(unsigned, unsigned, unsigned,
unsigned short *, float *);
DllExport short contrast_map_fl(unsigned, unsigned, unsigned,
float *, float *);
DllExport short contrast_map_dbl(unsigned, unsigned, unsigned,
double *, double *);
// pearson map
DllExport short pearson_map(unsigned, unsigned, unsigned,
unsigned short *, unsigned short *, float *);
DllExport short pearson_map_fl(unsigned, unsigned, unsigned,
float *, float *, float *);
DllExport short pearson_map_dbl(unsigned, unsigned, unsigned,
double *, double *, double *);
// rsm_lin_regr
DllExport short rsm_lin_regr(unsigned, float &, float &,
unsigned short *, unsigned short *);
DllExport short rsm_lin_regr_fl(unsigned, float &, float &,
float *, float *);
DllExport short rsm_lin_regr_dbl(unsigned, double &, double &,
double *, double *);
// rsm_peak_width
DllExport float rsm_peak_width(unsigned, unsigned short *,
unsigned short *);
DllExport float rsm_peak_width_fl(unsigned, float *, float *);
DllExport double rsm_peak_width_dbl(unsigned, double *, double *);
// rsm_factor
DllExport float rsm_factor(unsigned, unsigned short *);
DllExport float rsm_factor_fl(unsigned, float *);
DllExport double rsm_factor_dbl(unsigned, double *);
#ifdef __cplusplus
}
3
#endif
/*************rsm_null************/
//
template <class T1, class T2>
inline T1
rsm_null(unsigned SIZE, T2 *ptr)
{
return (T1)(*ptr);
}
float (*fp_null)(unsigned, ushort *) = rsm_null;
/*************rsm_mean************/
// mean
template <class T1, class T2>
inline T1
mean(unsigned SIZE, T2 *ptr)
{
return accumulate(ptr, ptr+SIZE, (T1)ZERO)/SIZE;
}
float (*fp_mean)(unsigned, ushort *) = mean;
float (*fp_mean_fl)(unsigned, float *) = mean;
double (*fp_mean_dbl)(unsigned, double *) = mean;
// rsm_mean for unsigned short
float
rsm_mean(unsigned SIZE, ushort *ptr)
{
return fp_mean(SIZE, ptr);
}
// rsm_mean for float
float
rsm_mean_fl(unsigned SIZE, float *ptr)
{
return fp_mean_fl(SIZE, ptr);
}
// rsm_mean for double
double
rsm_mean_dbl(unsigned SIZE, double *ptr)
{
return fp_mean_dbl(SIZE, ptr);
}
4
/*************rsm_contrast********/
// contrast
template <class T1, class T2>
inline T1
contrast(unsigned SIZE, T2 *ptr)
{
T1 sum_value = (T1)ZERO;
T1 mean_value = accumulate(ptr, ptr+SIZE, (T1)ZERO)/SIZE;
for (T2 *t = ptr; t < ptr+SIZE; t++)
{
sum_value = sum_value + (*t-mean_value)*(*t-mean_value);
}
return sqrt(sum_value/(SIZE-ONE))/mean_value;
}
float (*fp_contrast)(unsigned, ushort *) = contrast;
float (*fp_contrast_fl)(unsigned, float *) = contrast;
double (*fp_contrast_dbl)(unsigned, double *) = contrast;
// rsm_contrast for unsigned short
float
rsm_contrast(unsigned SIZE, ushort *ptr)
{
return fp_contrast(SIZE, ptr);
}
// rsm_contrast for float
float
rsm_contrast_fl(unsigned SIZE, float *ptr)
{
return fp_contrast_fl(SIZE, ptr);
}
// rsm_contrast for double
double
rsm_contrast_dbl(unsigned SIZE, double *ptr)
{
return fp_contrast_dbl(SIZE, ptr);
}
/*************rsm_decorr**********/
// decorr
template <class T1, class T2>
inline T1
5
decorr(unsigned SIZE, T2 *ptr1, T2 *ptr2)
{
T1 sum_value1 = (T1)ZERO;
T1 sum_value2 = (T1)ZERO;
T1 sum_value3 = (T1)ZERO;
T1 mean_value1 = accumulate(ptr1, ptr1+SIZE, (T1)ZERO)/SIZE;
T1 mean_value2 = accumulate(ptr2, ptr2+SIZE, (T1)ZERO)/SIZE;
for (T2 *t1 = ptr1, *t2 = ptr2; t1 < ptr1+SIZE; t1++, t2++)
{
sum_value1 = sum_value1 + (*t1-mean_value1)*(*t1-mean_value1);
sum_value2 = sum_value2 + (*t2-mean_value2)*(*t2-mean_value2);
sum_value3 = sum_value3 + (*t1-mean_value1)*(*t2-mean_value2);
}
return (SIZE*sum_value3)/((SIZE-1)*sqrt(sum_value1*sum_value2));
}
float (*fp_decorr)(unsigned, ushort *, ushort *) = decorr;
float (*fp_decorr_fl)(unsigned, float *, float *) = decorr;
double (*fp_decorr_dbl)(unsigned, double *, double *) = decorr;
// rsm_decorr for unsigned short
float
rsm_decorr(unsigned SIZE, ushort *ptr1, ushort *ptr2)
{
return fp_decorr(SIZE, ptr1, ptr2);
}
// rsm_decorr for float
float
rsm_decorr_fl(unsigned SIZE, float *ptr1, float *ptr2)
{
return fp_decorr_fl(SIZE, ptr1, ptr2);
}
// rsm_decorr for double
double
rsm_decorr_dbl(unsigned SIZE, double *ptr1, double *ptr2)
{
return fp_decorr_dbl(SIZE, ptr1, ptr2);
}
/*************rsm_frame***********/
//
template <class T1, class T2>
6
inline short
rsm_frame(unsigned X, unsigned Y, unsigned radius,
T2 *lineIN, T1 *lineOUT, T1 (*fp)(unsigned, T2 *))
{
unsigned r2=2*radius, x_d=X-r2, d=r2+ONE, MAX=(d-ONE)*d, size=Y*d;
T2 *line = new T2[size];
for (unsigned k=ZERO, y; k<x_d; k++)
{
y=ZERO;
for (T2 *pos=line; pos<line+MAX; pos=pos+d, y++)
{
copy(lineIN+y*X+k, lineIN+y*X+k+d, pos);
}
y=r2;
for (T2 *pos=line+MAX; pos<line+size; pos=pos+d, y++)
{
copy(lineIN+y*X+k, lineIN+y*X+k+d, pos);
lineOUT[(y-r2)*x_d+k] = fp(MAX+d, pos-MAX);
}
}
delete [] line;
return ZERO;
}
/*************rsm_frame2**********/
//
template <class T1, class T2>
inline short
rsm_frame2(unsigned X, unsigned Y, unsigned radius, T2 *line_1,
T2 *line_2, T1 *lineOUT, T1 (*fp)(unsigned, T2 *, T2 *))
{
unsigned r2=2*radius, x_d=X-r2, d=r2+ONE, MAX=(d-ONE)*d, size=Y*d;
T2 *line1 = new T2[size];
T2 *line2 = new T2[size];
for (unsigned k=ZERO, y; k<x_d; k++)
{
y=ZERO;
for (T2 *pos1 = line1, *pos2 = line2;
pos1 < line1 + MAX;
pos1 = pos1 + d, pos2 = pos2 + d, y++)
{
copy(line_1+y*X+k, line_1+y*X+k+d, pos1);
7
copy(line_2+y*X+k, line_2+y*X+k+d, pos2);
}
y=r2;
for (T2 *pos1 = line1 + MAX, *pos2 = line2 + MAX;
pos1 < line1 + size;
pos1 = pos1 + d, pos2 = pos2 + d, y++)
{
copy(line_1+y*X+k, line_1+y*X+k+d, pos1);
copy(line_2+y*X+k, line_2+y*X+k+d, pos2);
lineOUT[(y-r2)*x_d+k] = fp(MAX+d, pos1-MAX, pos2-MAX);
}
}
delete [] line1;
delete [] line2;
return ZERO;
}
/*************null_map************/
// null map for unsigned short
short
null_map(unsigned X, unsigned Y, unsigned radius,
ushort *lineIN, float *lineOUT)
{
return rsm_frame(X, Y, radius, lineIN, lineOUT, fp_null);
}
/*************mean_map************/
// mean map for unsigned short
short
mean_map(unsigned X, unsigned Y, unsigned radius,
ushort *lineIN, float *lineOUT)
{
return rsm_frame(X, Y, radius, lineIN, lineOUT, fp_mean);
}
// mean map for float
short
mean_map_fl(unsigned X, unsigned Y, unsigned radius,
float *lineIN, float *lineOUT)
{
return rsm_frame(X, Y, radius, lineIN, lineOUT, fp_mean_fl);
}
// mean map for double
8
short
mean_map_dbl(unsigned X, unsigned Y, unsigned radius,
double *lineIN, double *lineOUT)
{
return rsm_frame(X, Y, radius, lineIN, lineOUT, fp_mean_dbl);
}
/*************contrast_map********/
// contrast map for unsigned short
short
contrast_map(unsigned X, unsigned Y, unsigned radius,
ushort *lineIN, float *lineOUT)
{
return rsm_frame(X, Y, radius, lineIN, lineOUT, fp_contrast);
}
// contrast map for float
short
contrast_map_fl(unsigned X, unsigned Y, unsigned radius,
float *lineIN, float *lineOUT)
{
return rsm_frame(X, Y, radius, lineIN, lineOUT, fp_contrast_fl);
}
// contrast map for double
short
contrast_map_dbl(unsigned X, unsigned Y, unsigned radius,
double *lineIN, double *lineOUT)
{
return rsm_frame(X, Y, radius, lineIN, lineOUT, fp_contrast_dbl);
}
/*************pearson_map*********/
// pearson map for unsigned short
short
pearson_map(unsigned X, unsigned Y, unsigned radius,
ushort *line1, ushort *line2, float *lineOUT)
{
return rsm_frame2(X, Y, radius, line1, line2, lineOUT, fp_decorr);
}
// pearson map for float
short
pearson_map_fl(unsigned X, unsigned Y, unsigned radius,
float *line1, float *line2, float *lineOUT)
9
{
return rsm_frame2(X, Y, radius, line1, line2, lineOUT,
fp_decorr_fl);
}
// pearson map for double
short
pearson_map_dbl(unsigned X, unsigned Y, unsigned radius,
double *line1, double *line2, double *lineOUT)
{
return rsm_frame2(X, Y, radius, line1, line2, lineOUT,
fp_decorr_dbl);
}
/*************rsm_lin_regr********/
// linear regression
// y=ax+b
template <class T1, class T2>
short linear_regression(unsigned SIZE, T1 &a, T1 &b, T2 *x, T2 *y)
{
T1 s_xy = (T1)ZERO, s_x = (T1)ZERO, s_y = (T1)ZERO,
s_x2 = (T1)ZERO;
for (T2 *ptr1=x, *ptr2=y; ptr1<x+SIZE; ptr1++, ptr2++)
{
s_xy = s_xy + (*ptr1)*(*ptr2);
s_x = s_x + (*ptr1);
s_y = s_y + (*ptr2);
s_x2 = s_x2 + (*ptr1)*(*ptr1);
}
b = (SIZE*s_xy-s_x*s_y)/(SIZE*s_x2-s_x*s_x);
a = (s_y - b*s_x)/SIZE;
return ZERO;
}
// linear regression for unsigned short
short
rsm_lin_regr(unsigned SIZE, float &a, float &b, ushort *x, ushort *y)
{
return linear_regression(SIZE, a, b, x, y);
}
// linear regression for float
10
short
rsm_lin_regr_fl(unsigned SIZE, float &a, float &b, float *x, float *y)
{
return linear_regression(SIZE, a, b, x, y);
}
// linear regression for double
short
rsm_lin_regr_dbl(unsigned S, double &a, double &b, double *x,
double *y)
{
return linear_regression(S, a, b, x, y);
}
/*************rsm_peak_width******/
// peak_width
template <class T1, class T2>
inline T1
peak_width(unsigned SIZE, T2 *ptr1, T2 *ptr2)
{
T1 tmp = (T1)ZERO;
T1 sum = accumulate(ptr2, ptr2+SIZE, (T1)ZERO);
T1 mean = inner_product(ptr2, ptr2+SIZE, ptr1, (T1)ZERO)/sum;
T1 sum2 = (T1)ZERO;
for (T2 *t1 = ptr1, *t2 = ptr2; t1 < ptr1+SIZE; t1++, t2++)
{
tmp = tmp + (*t1-mean)*(*t1-mean)*(*t2);
sum2 = sum2 + (*t2)*(*t2);
}
return sqrt(tmp*sum/(sum*sum-sum2));
}
float (*fp_peak_width)(unsigned, ushort *, ushort *) = peak_width;
float (*fp_peak_width_fl)(unsigned, float *, float *) = peak_width;
double (*fp_peak_width_dbl)(unsigned, double *, double *)= peak_width;
// rsm_peak_width for unsigned short
float
rsm_peak_width(unsigned SIZE, ushort *ptr1, ushort *ptr2)
{
return fp_peak_width(SIZE, ptr1, ptr2);
}
// rsm_peak_width for float
11
float
rsm_peak_width_fl(unsigned SIZE, float *ptr1, float *ptr2)
{
return fp_peak_width_fl(SIZE, ptr1, ptr2);
}
// rsm_peak_width for double
double
rsm_peak_width_dbl(unsigned SIZE, double *ptr1, double *ptr2)
{
return fp_peak_width_dbl(SIZE, ptr1, ptr2);
}
/*************rsm_factor**********/
// factor
template <class T1, class T2>
inline T1
factor(unsigned SIZE, T2 *ptr)
{
T1 sum = accumulate(ptr, ptr+SIZE, (T1)ZERO);
T1 sum2 = inner_product(ptr, ptr+SIZE, ptr, (T1)ZERO);
return sum*sum/(sum*sum-sum2);
}
float (*fp_factor)(unsigned, ushort *) = factor;
float (*fp_factor_fl)(unsigned, float *) = factor;
double (*fp_factor_dbl)(unsigned, double *) = factor;
// rsm_factor for unsigned short
float
rsm_factor(unsigned SIZE, ushort *ptr)
{
return fp_factor(SIZE, ptr);
}
// rsm_factor for float
float
rsm_factor_fl(unsigned SIZE, float *ptr)
{
return fp_factor_fl(SIZE, ptr);
}
// rsm_factor for double
double
rsm_factor_dbl(unsigned SIZE, double *ptr)
12
{
return fp_factor_dbl(SIZE, ptr);
}
/********************************************************************/
13
1.2. Заголовочный файл rsm_main.h
/*********************************************************************
* $Id: rsm_main.h 132 2007-06-14 21:34:45Z rosmir $
* Copyright (C) 2000-2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
* All rights reserved.
* web-site: www.rosmir.org
*********************************************************************/
#ifndef RSM_MAIN_H
#define RSM_MAIN_H
#ifdef __cplusplus
typedef unsigned short ushort;
// some constants
#define ZERO 0
#define ONE 1
#define MAXI 16384
// some macros for parsing argument options
// very primitive macros
#define PARAM_BEG(str1, str2) \
if (ZERO == strcmp(#str1, argv[str2]+1)) \
{\
cout << "option... " << #str1 << "\t";
#define PARAM_OBL_BEG(str1, str2) \
PARAM_BEG(str1, str2) \
if (argv[str2+ONE]) \
{\
cout << "(" << argv[str2+ONE] << ")\t";
#define PARAM_OBL_END(str1) \
}\
else { return ONE; }
#define PARAM_END \
cout << endl; \
}
// macros to read and check UINT option and its parameter
#define ATOI_PARAM(str1, str2, str3) \
PARAM_OBL_BEG(str1, str2) \
str1 = atoi(argv[str2+ONE]); \
14
if (str1 <= ZERO) return ONE; \
str3; \
PARAM_OBL_END(str1) \
PARAM_END
// macros to read flag
#define FLAG_PARAM(str1, str2, str3) \
PARAM_BEG(str1, str2) \
str3; \
PARAM_END
#endif
#endif
/********************************************************************/
15
1.3. Заголовочный файл rsm_stat.h
/*********************************************************************
* $Id: rsm_stat.h 144 2007-07-17 06:10:37Z stepan.baranov $
* Copyright (C) 2000-2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
* All rights reserved.
* web-site: www.rosmir.org
*********************************************************************/
#ifndef RSM_STAT_H
#define RSM_STAT_H
#if defined(_MSC_VER) // M$ Visual Studio
#define DllImport __declspec( dllimport )
#else
#define DllImport
#endif
#ifdef __cplusplus
extern "C" {
#endif
// rsm_mean
DllImport float rsm_mean(unsigned, unsigned short *);
DllImport float rsm_mean_fl(unsigned, float *);
DllImport double rsm_mean_dbl(unsigned, double *);
// rsm_contrast
DllImport float rsm_contrast(unsigned, unsigned short *);
DllImport float rsm_contrast_fl(unsigned, float *);
DllImport double rsm_contrast_dbl(unsigned, double *);
// rsm_decorr
DllImport float rsm_decorr(unsigned, unsigned short *,
unsigned short *);
DllImport float rsm_decorr_fl(unsigned, float *, float *);
DllImport double rsm_decorr_dbl(unsigned, double *, double *);
// null_map
DllImport short null_map(unsigned, unsigned, unsigned,
unsigned short *, float *);
// mean_map
DllImport short mean_map(unsigned, unsigned, unsigned,
unsigned short *, float *);
DllImport short mean_map_fl(unsigned, unsigned, unsigned,
float *, float *);
DllImport short mean_map_dbl(unsigned, unsigned, unsigned,
16
double *, double *);
// contrast map
DllImport short contrast_map(unsigned, unsigned, unsigned,
unsigned short *, float *);
DllImport short contrast_map_fl(unsigned, unsigned, unsigned,
float *, float *);
DllImport short contrast_map_dbl(unsigned, unsigned, unsigned,
double *, double *);
// pearson map
DllImport short pearson_map(unsigned, unsigned, unsigned,
unsigned short *, unsigned short *, float *);
DllImport short pearson_map_fl(unsigned, unsigned, unsigned,
float *, float *, float *);
DllImport short pearson_map_dbl(unsigned, unsigned, unsigned,
double *, double *, double *);
// rsm_lin_regr
DllImport short rsm_lin_regr(unsigned, float &, float &,
unsigned short *, unsigned short *);
DllImport short rsm_lin_regr_fl(unsigned, float &, float &,
float *, float *);
DllImport short rsm_lin_regr_dbl(unsigned, double &, double &,
double *, double *);
// rsm_peak_width
DllImport float rsm_peak_width(unsigned, unsigned short *,
unsigned short *);
DllImport float rsm_peak_width_fl(unsigned, float *, float *);
DllImport double rsm_peak_width_dbl(unsigned, double *, double *);
// rsm_factor
DllImport float rsm_factor(unsigned, unsigned short *);
DllImport float rsm_factor_fl(unsigned, float *);
DllImport double rsm_factor_dbl(unsigned, double *);
#ifdef __cplusplus
}
#endif
#endif
/********************************************************************/
17
2. Код C++ программы для расчета спекл-картин.
/*********************************************************************
* $Id: speckles.cpp 150 2007-07-17 22:15:15Z rosmir $
* Copyright (C) 2000-2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
* All rights reserved.
* web-site: www.rosmir.org
*********************************************************************/
#include <iostream>
#include <string>
#include <fstream>
#include <algorithm>
using namespace std;
#if defined(_MSC_VER) // M$ Visual Studio
#pragma warning (disable: 4996)
#endif
// here we use "http://FREEIMAGE.sourceforge.net/"
#include "FreeImage.h"
// here we use some functions from library RSM_STAT
// http://rosmir.googlecode.com/svn/trunk/science/rsm-stat/
#include "rsm_stat.h"
// to read parameters and define some constants we use such header
#include "rsm_main.h"
ushort background = ZERO;
ushort
no_background(ushort value)
{
return value-background;
}
ushort
to_ushort(float value)
{
return (ushort)value;
}
ushort
to_ushort2(float value)
18
{
return (ushort)(MAXI*value);
}
int
main(int argc, const char *argv[])
{
string output, name, name_mean, name_contrast, name_decorr;
ifstream infile;
unsigned x_d = ZERO, y_d = ZERO, num = ZERO, radius = ZERO,
size = ZERO;
bool flag_no_input = true, flag_no_output = true,
flag_no_radius = true, flag_no_background = true,
flag_mean = false, flag_contrast = false,
flag_initial = false, flag_decorr = false;
// check if we have any arguments
if (argc < 2)
{
cout << endl << "SPECKLES" << endl << endl;
cout << "Copyright (C) 2000-2007 "
<< "Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)" << endl
<< "All rights reserved." << endl
<< "web-site: www.rosmir.org"
<< endl << endl;
cout << "Usage: SPECKLES <options>"
<< endl << " "
<< "required parameters:"
<< endl << "\t"
<< "-input: the name of input file (UINT16)"
<< endl << "\t"
<< "-output: the name of output images files"
<< endl << "\t\t"
<< "images files will be named as <NAME>.tif"
<< endl << "\t"
<< "-x_d: the width of each frame"
<< endl << "\t"
<< "-y_d: the height of each frame"
<< endl << "\t"
<< "-radius: the window (2*radius x 2*radius)"
<< endl << "\t"
<< "-num: the total number of frames"
<< endl << " "
<< "optional parameters:"
<< endl << "\t"
19
<< "-initial: write initial image frames"
<< endl << "\t"
<< "-mean: write mean image frames"
<< endl << "\t"
<< "-contrast: write contrast image frames"
<< endl << "\t"
<< "-decorr: write decorrelation image frames"
<< endl << "\t"
<< "-background: the value for background" << endl;
return ZERO;
}
// parsing of command line arguments
for (int count = ONE; count < argc; count++)
{
// Check of input file and open it
PARAM_OBL_BEG(input, count)
// Check that we have real input file
// see also
// http://www.cplusplus.com/doc/tutorial/files.html
infile.open(argv[count+ONE],
ios::in|ios::binary|ios::ate);
if (!infile)
{
cout << "wrong name of file!" << endl;
infile.close();
return ONE;
}
size = (unsigned) infile.tellg();
infile.seekg(ZERO, ios::beg);
PARAM_OBL_END(input)
flag_no_input = false;
PARAM_END
// Check of name for output images
PARAM_OBL_BEG(output, count)
output = argv[count+ONE];
PARAM_OBL_END(output)
flag_no_output = false;
PARAM_END
// Check of x_d
ATOI_PARAM(x_d, count, )
// Check of y_d
20
ATOI_PARAM(y_d, count, )
// Check of num
ATOI_PARAM(num, count, )
// Check of radius
ATOI_PARAM(radius, count, flag_no_radius = false)
// Check of background
ATOI_PARAM(background, count, flag_no_background = false)
// Check of name for flag "initial"
FLAG_PARAM(initial, count, flag_initial = true)
// Check of name for flag "mean"
FLAG_PARAM(mean, count, flag_mean = true)
// Check of name for flag "contrast"
FLAG_PARAM(contrast, count, flag_contrast = true)
// Check of name for flag "decorr"
FLAG_PARAM(decorr, count, flag_decorr = true)
}
// check that all parameters are defined correctly
if (flag_no_input || flag_no_output || flag_no_radius)
{
cout << endl << "Please, define all options"
<< endl << endl;
return ONE;
}
if (x_d*y_d*num*sizeof(ushort) != size)
{
cout << endl << "Please, define all options correctly"
<< endl << endl;
return ONE;
}
// set sizes
unsigned fsize = x_d*y_d, bsize = fsize*sizeof(ushort),
fsize_d = (x_d-2*radius)*(y_d-2*radius),
bsize_d = fsize_d*sizeof(ushort);
ushort *frame = new ushort[fsize], *frame_d = new ushort[fsize_d],
*_frame = new ushort[fsize];
char *buff = new char[bsize];
float *tmp = new float[fsize_d];
// set the name of multipage TIFF UINT16 image files
name = output + ".tif";
name_mean = output + ".mean.tif";
name_contrast = output + ".contrast.tif";
name_decorr = output + ".decorr.tif";
21
// create multipage TIFF UINT16 images
FIMULTIBITMAP *src = FreeImage_OpenMultiBitmap(FIF_TIFF,
name.c_str(), true, false, true);
if(! src)
{
cout << "can't create multipage TIFF UINT16 image file";
return ONE;
}
FIMULTIBITMAP *src_mean = FreeImage_OpenMultiBitmap(FIF_TIFF,
name_mean.c_str(), true, false, true);
if(! src_mean)
{
cout << "can't create multipage TIFF UINT16 image file";
return ONE;
}
FIMULTIBITMAP *src_contrast = FreeImage_OpenMultiBitmap(FIF_TIFF,
name_contrast.c_str(), true, false, true);
if(! src_contrast)
{
cout << "can't create multipage TIFF UINT16 image file";
return ONE;
}
FIMULTIBITMAP *src_decorr = FreeImage_OpenMultiBitmap(FIF_TIFF,
name_decorr.c_str(), true, false, true);
if(! src_decorr)
{
cout << "can't create multipage TIFF UINT16 image file";
return ONE;
}
// create TIFF UINT16 frames
FIBITMAP *bitmap = FreeImage_AllocateT(FIT_UINT16, x_d, y_d);
if(! bitmap)
{
cout << "can't create frame for TIFF UINT16 image file";
return ONE;
}
FIBITMAP *bitmap_d = FreeImage_AllocateT(FIT_UINT16, x_d-2*radius,
y_d-2*radius);
if(! bitmap_d)
{
cout << "can't create frame for TIFF UINT16 image file";
return ONE;
}
// get array of pixels
22
ushort *bits = (ushort *)FreeImage_GetBits(bitmap);
ushort *bits_d = (ushort *)FreeImage_GetBits(bitmap_d);
// writing frames inside multipage TIFF UINT16 images
cout << "the output format is:" << endl;
cout << "i\tbackground\tmean\tcontrast\tdecorr" << endl << endl;
for (unsigned i = ZERO; i<num; i++)
{
// read frame to char buff from file
infile.read(buff, bsize);
// convert char buff to ushort frame
memcpy(frame, buff, bsize);
// substract background
if (flag_no_background)
{
background = *min_element(frame, frame+fsize);
}
transform(frame, frame+fsize, frame, no_background);
// calculate mean and contrast for the whole frame
cout << i << "\t" << background << "\t"
<< rsm_mean(fsize, frame) << "\t"
<< rsm_contrast(fsize, frame) << "\t";
if (i == ZERO) { cout << endl; }
else { cout << rsm_decorr(fsize, frame, _frame) << endl; }
// write initial images
if (flag_initial)
{
// set the values for pixels
memcpy(bits, buff, bsize);
// append image frame to multipage TIFF UINT16
FreeImage_FlipVertical(bitmap);
FreeImage_AppendPage(src, bitmap);
}
// write mean images
if (flag_mean)
{
// apply mean_map
mean_map(x_d, y_d, radius, frame, tmp);
// float -> ushort
transform(tmp, tmp+fsize_d, frame_d, to_ushort);
// set the values for pixels
23
memcpy(bits_d, frame_d, bsize_d);
// append image frame to multipage TIFF UINT16
FreeImage_FlipVertical(bitmap_d);
FreeImage_AppendPage(src_mean, bitmap_d);
}
// write contrast images
if (flag_contrast)
{
// apply contrast_map
contrast_map(x_d, y_d, radius, frame, tmp);
// float -> ushort
transform(tmp, tmp+fsize_d, frame_d, to_ushort2);
// set the values for pixels
memcpy(bits_d, frame_d, bsize_d);
// append image frame to multipage TIFF UINT16
FreeImage_FlipVertical(bitmap_d);
FreeImage_AppendPage(src_contrast, bitmap_d);
}
// write decorrelation images
if (flag_decorr && (i > ZERO))
{
// apply pearson_map
pearson_map(x_d, y_d, radius, frame, _frame, tmp);
// float -> ushort
transform(tmp, tmp+fsize_d, frame_d, to_ushort2);
// set the values for pixels
memcpy(bits_d, frame_d, bsize_d);
// append image frame to multipage TIFF UINT16
FreeImage_FlipVertical(bitmap_d);
FreeImage_AppendPage(src_decorr, bitmap_d);
}
// frame -> _frame
memcpy(_frame, frame, bsize);
}
// close multipage TIFF UINT16 images and frames
FreeImage_Unload(bitmap);
FreeImage_Unload(bitmap_d);
FreeImage_CloseMultiBitmap(src, ZERO);
FreeImage_CloseMultiBitmap(src_mean, ZERO);
FreeImage_CloseMultiBitmap(src_contrast, ZERO);
FreeImage_CloseMultiBitmap(src_decorr, ZERO);
24
// close input file
infile.close();
// delete all dynamic data
delete [] frame;
delete [] _frame;
delete [] frame_d;
delete [] buff;
delete [] tmp;
return ZERO;
}
/********************************************************************/
25
3. Код C++ программы для расчета ИК-термограмм.
/*********************************************************************
* $Id: IR-tif-anyl.cpp 157 2007-07-20 21:11:20Z rosmir $
* Copyright (C) 2000-2007 Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)
* All rights reserved.
* web-site: www.rosmir.org
*********************************************************************/
#include <iostream>
#include <string>
#include <fstream>
#include <numeric>
#include <algorithm>
#include <cmath>
#include <vector>
#include <map>
using namespace std;
#if defined(_MSC_VER) // M$ Visual Studio
#pragma warning (disable: 4996)
#endif
// here we use "http://FREEIMAGE.sourceforge.net/"
#include "FreeImage.h"
// here we use some functions from library RSM_STAT
// http://rosmir.googlecode.com/svn/trunk/science/rsm-stat/
#include "rsm_stat.h"
// to read parameters and define some constants we use such header
#include "rsm_main.h"
// some constants
#define BAND_FROM_NM 3.0f
#define BAND_TO_NM 5.0f
#define TEMP_STEP 0.02f
#define TEMP_EXT 20.0f
// some physical constants
float Planck = 6.6260693e-34f;
float Boltzmann = 1.3806504e-23f;
float Speed_of_light = 299792458.0f;
float c1 = 1.e2f*Planck*Speed_of_light/Boltzmann;
26
float Kelvin = 273.15f;
float sigma1 = 1.e4f*c1/BAND_FROM_NM;
float sigma2 = 1.e4f*c1/BAND_TO_NM;
// initialize of map
map<unsigned, float> planck;
map<unsigned, float>::iterator planck_p;
typedef pair<unsigned, float> UD_Pair;
float
find_value(unsigned key)
{
planck_p = planck.lower_bound(key);
if (planck_p == planck.end())
{
cout << "Ooops!" << endl;
return ZERO;
}
return planck_p->second;
}
float
fl_value(unsigned value)
{
return (float)value;
}
// here we use
// "http://www.spectralcalc.com/blackbody_calculator/"
float
planck_integral(float temperature)
{
float dn;
// compute powers of x, the dimensionless spectral coordinate
float x_1 = sigma1/temperature, x_2 = sigma2/temperature,
x2_1 = x_1*x_1, x2_2 = x_2*x_2;
// decide how many terms of sum are needed
int iterations_1 = int(2+20/x_1), iterations_2 = int(2+20/x_2);
int iterations = max(iterations_1, iterations_2);
iterations = (iterations<512) ? iterations : 512;
// add up terms of sum
float sum_1 = ZERO, sum_2 = ZERO;
for (int n = ONE; n < iterations; n++)
{
dn = 1.0f/n;
27
sum_1 = sum_1 + exp(-n*x_1)*(x2_1+2.0f*(x_1+dn)*dn)*dn;
sum_2 = sum_2 + exp(-n*x_2)*(x2_2+2.0f*(x_2+dn)*dn)*dn;
}
// return result, in units of photons/s/m2/sr * 1.e19
float kTohc = 1.e2f*temperature/c1;
float c2 = 2.0f*kTohc*kTohc*kTohc*Speed_of_light;
return c2*(sum_2-sum_1)/1.e19f;
}
bool
CheckImageFormat(const char* input)
{
FREE_IMAGE_FORMAT fif = FIF_UNKNOWN;
// check the file signature and deduce its format
fif = FreeImage_GetFileType(input);
// check that the plugin has reading capabilities ...
if((fif == FIF_TIFF) && FreeImage_FIFSupportsReading(fif))
{
cout << "File Type is TIFF (" << fif << ")... ok!" << endl;
FIBITMAP *bitmap = FreeImage_Load(FIF_TIFF, input,
TIFF_DEFAULT);
if (bitmap)
{
// bitmap successfully loaded!
FREE_IMAGE_TYPE fit = FreeImage_GetImageType(bitmap);
FreeImage_Unload(bitmap);
if (fit == FIT_UINT16)
{
cout << "Image Type is UINT16 (" << fit << ")... ok!";
return true;
}
}
}
cout << "Ooops!.. Unsupported format!" << endl;
return false;
}
int
main(int argc, const char *argv[])
{
char input[4096];
unsigned x_c = ZERO, y_c = ZERO, x_r = ZERO, y_r = ZERO,
tiff = ZERO, size, part = ZERO, i, x_d = ZERO, y_d = ZERO,
num = ZERO, one = ONE;
bool flag = false, flag_calibr = false;
28
ifstream infile;
FIMULTIBITMAP *src;
FIBITMAP *bitmap;
float mx, mn;
float *tmp;
// check if we have any arguments
if (argc < 2)
{
cout << endl << "IR-tif-anyl" << endl << endl;
cout << "Copyright (C) 2000-2007 "
<< "Stepan A. Baranov (rosmir@gmail.com)" << endl
<< "All rights reserved." << endl
<< "web-site: www.rosmir.org"
<< endl << endl;
cout << "Usage: IR-tif-anyl <options>" << endl << "\t"
<< "-tiff: the name of multipage TIFF (UINT16)"
<< endl << "\t"
<< "-cali: the name of file with calibration in format:"
<< endl << "\t"
<< "\t" << "temperature" << "\t" << "value"
<< endl << "\t"
<< "-x_c: the X position of the center"
<< endl << "\t"
<< "-y_c: the Y position of the center"
<< endl << "\t"
<< "-x_r: the region width (2*x_r+1)"
<< endl << "\t"
<< "-y_r: the region height (2*y_r+1)"
<< endl << "\t"
<< "-part: the percents of points with the highest values"
<< endl;
return ZERO;
}
// parsing of command line arguments
for (int count = ONE; count < argc; count++)
{
// Check of TIFF file
PARAM_OBL_BEG(tiff, count)
strcpy(input, argv[count+ONE]);
cout << endl;
// Check that we have TIFF UINT16 file
if (!CheckImageFormat(argv[count+ONE])) return ONE;
29
// Open src file (read-only, use memory cache)
src = FreeImage_OpenMultiBitmap(FIF_TIFF, argv[count+ONE],
false, true, true);
// get num
num = FreeImage_GetPageCount(src);
// open first frame to read width and height
bitmap = FreeImage_LockPage(src, ZERO);
// get x_d
x_d = FreeImage_GetWidth(bitmap);
// get y_d
y_d = FreeImage_GetHeight(bitmap);
// get size
size = x_d*y_d;
// close first image
FreeImage_UnlockPage(src, bitmap, false);
PARAM_OBL_END(tiff)
flag = true;
tiff = count+ONE;
PARAM_END
// Check of file with calibration
PARAM_OBL_BEG(cali, count)
// Check that we have real cali_file
infile.open(argv[count+ONE], ios::in);
if (!infile)
{
cout << "wrong name of file!" << endl;
infile.close();
return ONE;
}
PARAM_OBL_END(cali)
flag_calibr = true;
PARAM_END
// Check of x_c
ATOI_PARAM(x_c, count, )
// Check of y_c
ATOI_PARAM(y_c, count, )
// Check of percents
ATOI_PARAM(part, count,
if ((part <= ZERO ) || (part > 100)) return ONE)
// Check of x_r
ATOI_PARAM(x_r, count, )
// Check of y_r
ATOI_PARAM(y_r, count, )
30
}
// NO TIFF file!!!
if (! flag)
{
cout << "please, define TIFF file with option -tiff" << endl;
return ONE;
}
// some checks
flag = false;
if ((x_r > x_c) || (x_r > (x_d - x_c))) flag = true;
if ((y_r > y_c) || (y_r > (y_d - y_c))) flag = true;
if (flag)
{
cout << endl << "Please, define region to extract correctly"
<< endl << endl;
return ONE;
}
// if we have only Y line coordinate
if ((x_c > ZERO) && (y_c == ZERO) && (y_r == ZERO))
{
y_r = (unsigned)(y_d/2);
y_c = y_r;
cout << "scan Y line..." << endl;
}
// if we have only X line coordinate
if ((y_c > ZERO) && (x_c == ZERO) && (x_r == ZERO))
{
x_r = (unsigned)(x_d/2);
x_c = x_r;
cout << "scan X line..." << endl;
}
// if we have only one point
if ((x_r == ZERO) && (y_r == ZERO))
{
y_r = (unsigned)(y_d/2);
y_c = y_r;
x_r = (unsigned)(x_d/2);
x_c = x_r;
cout << "scan only one point..." << endl;
}
// set sizes and borders
31
size = max(2*x_r, one) * max(2*y_r, one);
unsigned xl = x_c-x_r, xr = max(x_c+x_r, x_c+one), yt = y_c-y_r,
yb = max(y_c+y_r, y_c+one), d = max(2*x_r, one),
pos = y_r*d+x_r;
ushort *frame = new ushort[size];
float *comp_temp = new float[size];
// set number of hottest points
unsigned nsize = size;
if (part != ZERO) nsize = max(part*size/100, one);
// create index array
float *index = new float[nsize];
i = ZERO;
for(float *ptr = index; ptr < index+nsize; ptr++, i++)
*ptr = (float)i;
// some reports
cout << "x_c: " << x_c << endl;
cout << "y_c: " << y_c << endl;
cout << "x_r: " << x_r << endl;
cout << "y_r: " << y_r << endl;
cout << "xl: " << xl << endl;
cout << "xr: " << xr << endl;
cout << "yt: " << yt << endl;
cout << "yb: " << yb << endl;
cout << "size of frame: " << size << endl << endl;
// analyzing of file with calibration
if (flag_calibr)
{
char seps[] = " ,\t\n";
float temperature = ZERO, intensity = ZERO, temp;
string line;
char *number;
vector<float> real_intens, planck_intens, real_temps;
// reading and parsing of cali_file
while (! infile.eof() )
{
getline(infile, line);
number = strtok((char *)line.c_str(), seps);
if ( number != NULL )
{
temperature = (float)atof(number);
32
// Get next number:
number = strtok(NULL, seps);
if (number != NULL)
{
intensity = (float)atof(number);
real_temps.push_back(temperature);
real_intens.push_back(intensity);
planck_intens.push_back(planck_integral(
temperature + Kelvin));
cout << temperature << "\t" << intensity << "\t"
<< planck_integral(temperature+Kelvin)
<< endl;
}
}
}
// y = a + bx (linear regression equation analysis)
float a, b;
rsm_lin_regr_fl(real_intens.size(), a, b,
&planck_intens[ZERO], &real_intens[ZERO]);
cout << "a: " << a << "\tb: " << b << endl;
// MAX T
vector<float>::iterator max_pos =
max_element(real_temps.begin(), real_temps.end());
mx = *max_pos;
// MIN T
vector<float>::iterator min_pos =
min_element(real_temps.begin(), real_temps.end());
mn = *min_pos;
cout << "MAX T: " << mx << "\t" << "MIN T: " << mn << endl;
// fill the map
for (i=ZERO; i<(unsigned)((mx-mn+2*TEMP_EXT)/TEMP_STEP); i++)
{
temp = TEMP_STEP*i+mn-TEMP_EXT;
planck.insert(UD_Pair((unsigned)(a + \
b*planck_integral(temp+Kelvin)), temp));
}
// delete dynamic data
real_intens.clear();
planck_intens.clear();
real_temps.clear();
}
33
// Create a DATA file
std::string data_file(strtok(input, ".") + std::string(".txt"));
fstream dataFile(data_file.c_str(), ios::out);
cout << "The format of DAT file is \"counter value_in_point "
<< "max mean weighted_variance\"" << endl;
// reading multipage TIFF file
for (i = ZERO; i < num; i++)
{
// lock frame
bitmap = FreeImage_LockPage(src, i);
FreeImage_FlipVertical(bitmap);
// select points from frame
ushort *frame_pos = frame;
for(unsigned y = yt; y < yb; y++, frame_pos=frame_pos+d)
{
ushort *bits = (ushort *)FreeImage_GetScanLine(bitmap, y);
copy(bits+xl, bits+xr, frame_pos);
}
// transform values to temperature or to float values
if (flag_calibr)
{
transform(frame, frame+size, comp_temp, find_value);
} else {
transform(frame, frame+size, comp_temp, fl_value);
}
// to get the position of point with maximum value
tmp = max_element(comp_temp, comp_temp+size);
mx = *tmp;
// output to DATA file
dataFile << i+ONE << "\t" << comp_temp[pos] << "\t" << mx;
// output to terminal
cout << i+ONE << "\t" << comp_temp[pos] << "\t" << mx
<< " (" << (tmp-comp_temp)%d << ", "
<< (tmp-comp_temp)/d << ")";
// sorting all values from minimum to maximum
make_heap(comp_temp, comp_temp+size);
sort_heap(comp_temp, comp_temp+size);
34
tmp = comp_temp+size-nsize;
// to get mean value for nsize points
float mean = rsm_mean_fl(nsize, tmp);
// write mean value to file and to terminal
dataFile << "\t" << mean;
cout << "\t" << mean;
// substract min value
mn = *min_element(tmp, tmp+nsize);
for (float *ptr = tmp; ptr < tmp+nsize; ptr++)
*ptr = *ptr - mn;
// to get peak width for nsize points
float width = rsm_peak_width_fl(nsize, index, tmp);
// write peak width value to file and to terminal
dataFile << "\t" << width << endl;
cout << "\t" << width << endl;
// unlock frame
FreeImage_UnlockPage(src, bitmap, false);
}
// delete dynamic data
delete [] frame;
delete [] comp_temp;
delete [] index;
// close multipage TIFF UINT16 image and frame
FreeImage_CloseMultiBitmap(src, ZERO);
// close the file with calibration
if (flag_calibr) infile.close();
// close the DATA file
dataFile.close();
// return status
return ZERO;
}
/********************************************************************/
35
4. Лицензионное соглашение.
Распространение кода, его использование и модификация регулируется свободной BSDлицензией, следующего содержания.
Copyright 2000-2007 Баранов Степан Андреевич. Все права защищены.
Распространение и использование исходных и 'скомпилированных' форм с модификацией
или без оной, разрешены при соблюдении следующих соглашений:
Распространяемые копии исходного кода должны сохранять вышеупомянутые объявления
copyright, этот список положений и сохранять следующий отказ от прав.
Распространяемые копии скомпилированных форм должны повторять вышеупомянутые
объявления copyright, этот список положений и следующий отказ в документации и/или
других материалах, поставляемых с дистрибьюцией.
ЭТА ДОКУМЕНТАЦИЯ ПОСТАВЛЯЕТСЯ БАРАНОВЫМ СТЕПАНОМ
АНДРЕЕВИЧЕМ "КАК ЕСТЬ" И ЛЮБЫЕ ЯВНЫЕ ИЛИ НЕЯВНЫЕ ГАРАНТИИ,
ВКЛЮЧАЯ, НО НЕ ОГРАНИЧИВАЯСЬ НЕЯВНЫМИ ГАРАНТИЯМИ,
КОММЕРЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ И ПРИГОДНОСТИ ДЛЯ КОНКРЕТНОЙ ЦЕЛИ
ОТРИЦАЮТСЯ. НИ В КОЕМ СЛУЧАЕ БАРАНОВ СТЕПАН АНДРЕЕВИЧ НЕ
ДОЛЖНЕН БЫТЬ ОТВЕТСТВЕННЫМ ЗА ЛЮБОЙ ПРЯМОЙ, КОСВЕННЫЙ,
СЛУЧАЙНЫЙ, СПЕЦИАЛЬНЫЙ, ОБРАЗЦОВЫЙ ИЛИ ПОСЛЕДУЮЩИЙ УЩЕРБЫ
(ВКЛЮЧАЯ, НО НЕ ОГРАНИЧИВАЯСЬ ПОСТАВКОЙ ТОВАРОВ ЗАМЕНЫ ИЛИ
УСЛУГ; ПОТЕРЮ ДАННЫХ ИЛИ ИХ НЕПРАВИЛЬНУЮ ПЕРЕДАЧУ ИЛИ ПОТЕРИ;
ПРИОСТАНОВЛЕНИЕ БИЗНЕСА), И ТЕМ НЕ МЕНЕЕ ВЫЗВАННЫЕ И В ЛЮБОЙ
ТЕОРИИ ОТВЕТСТВЕННОСТИ, НЕЗАВИСИМО ОТ КОНТРАКТНОЙ, СТРОГОЙ
ОТВЕТСТВЕННОСТИ, ИЛИ ПРАВОНАРУШЕНИИ (ВКЛЮЧАЯ ХАЛАТНОСТЬ ИЛИ
ИНЫМ СПОСОБОМ), ВОЗНИКШЕМ ЛЮБЫМ ПУТЕМ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ
ЭТОГО ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ, ДАЖЕ ЕСЛИ БЫ БЫЛО СООБЩЕНО О
ВОЗМОЖНОСТИ ТАКОГО УЩЕРБА.
Мнения и соглашения, содержащиеся в программном обеспечении и документации,
авторские и не должны быть интерпретированы как представление официальных правил,
явных или скрытых, Баранова Степана Андреевича.
36
5. Примечание.
Представленные тексты программ могут быть скомпилированы компиляторами C/C++
такими, как бесплатно распространяемым компилятором Visual C++ 2008 Express Edition
компании Microsoft или свободным и бесплатно распространяемым компилятором GNU
C++ Compiler Фонда свободного программного обеспечения.
Представленные тексты программ для своей работы требуют использование внешних
заголовочных файлов и библиотек свободной и бесплатно распространяемой графической
библиотеки FreeImage (http://freeimage.sourceforge.net/).
Самые последние тексты представленных программ доступны свободно на ресурсе
http://rosmir.googlecode.com/svn/trunk/science/