развития гнойных осложнений. Стероиды характеризуются вы К лючевые слова: Ключевые слова:
реклама
ЭНДОКРИНОЛОГИЯ Клинические результаты внутрипеченочной трансплантации ксеногенных островковых клеток поджелудочной железы плодов кролика трем животным при сахарном диабете УДК 616.379-008.64:619 Л.А. Сережина 1, Н.М. Туржанская 1, Л.П. Дьяконов 2, И.К. Абдрахманов2, М.А. Селюгин3, Ю.А. Кузнецов3 1 Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина (Москва). ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (Москва). 3 «Аверс- Вет» — неотложная ветеринарная помощь (Москва). 2 К лючевые слова: клетки островков Лангерганса, лечение, трансплантация, эндокринология Сокр ащ ения: ИЗСД — инсулинзависимый сахарный диабет, Сокращ ащения: ОПЖ — островки поджелудочной железы, ПЖ — поджелудочная железа, СД — сахарный диабет Введение ИЗСД обусловлен аутоиммунной деструкцией островков ПЖ, что влечет за собой развитие абсолютной инсулиновой недостаточности, сопровождающейся выраженной гипергли кемией. Несмотря на внедрение современных технологий в практику терапии СД (генноинженерный инсулин и его ана логи, шприцручки и инсулиновые помпы, глюкометры, в т.ч. неинвазивные и др.), стойкая компенсация нарушений угле водного обмена и предупреждение развития осложнений СД остаются актуальными проблемами. Трансплантация в организм больного животного культу ры островковых клеток ПЖ — перспективный метод коррек ции ИЗСД: с его помощью удается поддерживать содержа ние глюкозы в крови на физиологическом уровне за счет по ступления эндогенного инсулина, предотвращать тяжелую гипогликемию и осложнения СД ( например, ангио, нефро, ретинопатии) [1]. Для свободной трансплантации островко вых клеток ПЖ можно использовать: изолированные ОПЖ; выделенные βклетки; чистую культуру βклеток, полученную при культивиро вании in vitro изолированных островковых клеток. Иточником островковых клеток ПЖ может служить как аллогенный материал (например, собака à собака), так и ксе ногенный (кролик à собака). Наиболее подходящим ксено генным донорским материалом на сегодняшний день счита ют ПЖ плодов [2] или новорожденных кроликов [5]. Досто инства данного материала — биодоступность и возможность получения в количествах, достаточных для трансплантации [5]. Разработаны методы получения различных культур — ор ганотипических, цитотипических однослойных, вторичных очищенных и так называемых «кластеров» из ПЖ животных. При культивировании in vitro удается избавиться от кле ток — носителей антигенов 2го класса. В дальнейшем очищен ную культуру используют для ксенотрансплантации животным с СД. Все это повышает антидиабетический эффект трансплан тации и устраняет необходимость в стандартной химической им муносупрессии. Это очень важное преимущество, поскольку у животных, больных СД, иммунитет снижен и существует риск РВЖ МДЖ №32005 развития гнойных осложнений. Стероиды характеризуются вы раженной диабетогенностью [2], циклоспорин А ( препарат для химиотерапии) токсичен для изолированных островковых кле ток и индуцирует инсулинорезистентность [3]. Поставив задачу добиться того, чтобы островковые клет ки длительно функционировали в организме реципиента без введения иммунодепрессантов, ряд исследователей после большой серии опытов по трансплантации алло и ксеноген ных тканей обнаружили, что в организме существуют опре деленные зоны ( головной, костный мозг, тимус, семенники), в которых иммунокомпетентные клетки длительно не распоз нают чужеродные антигены. Указанные зоны были названы иммунологически привилегированными [2, 8, 10, 12]. Первая в нашей стране аллотрансплантация культур плод ных островковых клеток была проведена В.И. Шумаковым в 1979 г. За период с 1981 по 1984 г. в Научноисследовательс ком институте трансплантологии и искусственных органов (НИИТиИО) было выполнено 65 аллотрансплантаций боль ным СД. 42 пациента наблюдались в течение 1 года [4]. При этом у 18 из них доза вводимого инсулина снизилась на 18…67% и только у 7 потребность в инсулине вернулась к уров ню, отмеченному до трансплантации. В НИИТиИО Н.Н. Скалецкий и соавт. [3] разработали способ получения культур из неонатальной ПЖ кролика без ферментной обработки, фильтрации, центрифугирования и других технических приемов выделения островков. По мне нию В.И. Шумакова и соавт. [5], благодаря использованию в качестве донорского материала островковых клеток ПЖ кро ликов удалось значительно увеличить число клинических трансплантаций. К 1994 г. было выполнено более 800 алло и ксенотрансплантаций культур островковых клеток (в т. ч. по лученных от плодов человека, крупного рогатого скота, сви ньи и новорожденных кроликов). Кроме того, за пределами НИИТиИО сотрудники этого учреждения пересадили еще около 200 культур островковых клеток ПЖ новорожденных кроликов ( ксенотрансплантации ). В 2004 г. С.И. Леонович с соавт. показали положительный эффект трансплантации культуры островковых клеток, по лученных из ПЖ эмбрионов кроликов, в организм собак с экспериментально вызванным СД [2]. Чтобы предотвратить реакцию отторжения, клеточную культуру трансплантирова ли в костный мозг, особенности строения и функции которо го (отсутствие лимфатических сосудов, наличие ретикуляр ной ткани и стволовых клеток) делают его иммунологически привилегированной зоной. В 1977 г. Najarian et al. опубликовали первое сообщение о внутрипеченочной трансплантации аллогенных островковых клеток ПЖ. При этом после введения материала через ворот 13 ЭНДОКРИНОЛОГИЯ ную вену потребность в экзогенном инсулине снизилась у 3 больных из 4 на срок до 18 мес [14]. В дальнейшем многие авторы признали трансплантацию βклеток в печень наиболее эффективной [10, 12, 16, 18, 20]. Например, в 2002 г. R. Alejandro et al. [6, 7] трансплантирова ли внутрипортально культуру островков Лангерганса, получен ную от человека, 7 больным. Результатом операции явилось полное отсутствие инсулиновой зависимости в течение 1 года. Поскольку многие экспериментаторы в качестве наиболее эффективного способа введения островковых клеток рекомен дуют интрапортальную пересадку, возникает вопрос о влиянии самой трансплантации на морфофункциональное состояние печени. По данным Bretzel et al., после внутрипеченочной транс плантации примерно 70% введенного донорского материала ло кализуется в венулах портальной системы, в перипортальных зонах, а около 30% — в мелких портальных венулах [9]. По дан ным Richardt et al., после успешной трансплантации островков Лангерганса частично восстановливаются βклетки собственной ПЖ реципиента [17]. Предполагают, что причина этого — сти мулирующее действие неидентифицированного фактора, содер жащегося в трансплантируемых клетках, на собственную желе зу реципиента. Возможно, новые βклетки образуются за счет плюрипотентных эпителиоцитов выводных протоков экзокрин ного отдела реципиента. В пользу данной гипотезы свидетель ствуют результаты исследований [11, 19, 21], показывающие дифференцировку ацинарных клеток в инсулинпродуцирующие островки как in vitro, так и in vivo. Цель исследования Целью исследования было изучить влияние транспланта ции культивированных фетальных βклеток ПЖ кролика на течение ИЗСД у собак и кошек. Материалы и методы Материал для выделения фетальных ПЖ получали в питомнике по выращиванию кроликов ООО «Алькона» пос. Дубровицы Московской области. К поиску методов выделения чистой культуры фетальных островковых клеток ПЖ кролика, предназначенных для ксе ногенной трансплантации, приступили в начале 2004 г. Ис следования проводили на базе отдела клеточной биотехно логии ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Ко валенко (ВИЭВ). В них приняли участие врачи неотложной ветеринарной помощи «Аверсвет». Были отработаны усло вия получения и культивирования βклеток, изучены их мор фофункциональные характеристики и влияние на течение экспериментально вызванного СД у лабораторных животных. Кроме того, ряд экспериментов был посвящен изучению осо бенностей культуры — ее онкогенности, гистосовместимости in vitro и аллергогенности для животных, а также бактери альной, вирусной и микоплазменной загрязненности. Клинические исследования были начаты в марте 2005 г. на базе Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина (РОНЦ РАМН) при участии врачей ветеринарной клиники «Биоконтроль». Отобрали животных с выраженными симптомами СД: полидипси ей, полиурией, полифагией, нарастающей кахексией и ус тановленной лабораторными методами глюкозурией, ги пергликемией. На исследование было получено согласие владельцев животных. Двум собакам и одному коту в паренхиму печени под эхо графическим контролем трансплантировали культивированные фетальные островковые клетки ПЖ кролика в количестве 3 · 106. Животным, которым была назначена инсулинотерапия, дозы гормона постепенно снижали, регулярно контролируя уровень глюкозы в крови. Одна собака была стерилизована (по показаниям). В случае необходимости прибегали к симп томатическому лечению сопутствующих патологий (кот с хро 14 нической почечной недостаточностью). Содержание глюко зы в крови определяли 1 раз в одиндва дня после трансплан тации. Кровь (биохимический, клинический анализ) и мочу (общий анализ) исследовали за 2…3 дня до трансплантации и на 5 и 21 и 60й день после нее. Клинический эффект оцени вали по нормализации показателей уровня глюкозы в крови и моче, исчезновению полидипсии и полиурии. Критериями оценки эффективности считали отказ от инсулинотерапии, снижение дозы инсулина, длительность ремиссии. Животное №1. Американский стаффордширтерьер, со бака, сука, 9 лет, массой 24 кг поступила на прием в апреле 2005 г. с жалобами владельца на полидипсию, полиурию. При физикальном исследовании установлено: общее состояние удовлетворительное, слизистая ротовой полости отечна, ды хание затруднено на вдохе. Появление этих признаков, по на блюдению хозяев, связано с периодами течки. Исследовали кровь (клинический и биохимический анализы) и мочу. Вы явили: гипергликемию (19,3 моль/л), глюкозурию (55 ммоль/л) и кетонурию (1,5 ммоль/л). Животное стерилизовали, а за тем трансплантировали островковые клетки в паренхиму пе чени. Спустя 3 мес после операции концентрация глюкозы в крови составляет 4,2 моль/л. Доза вводимого инсулина сни жена до нуля ( 0 IU). Животное №2. Английский сеттер, собака, 10 лет, каст рированный кобель массой 29 кг поступил на прием в февра ле в тяжелом состоянии: были отмечены кахексия, дегидра тация (5…7%), полидипсия, анорексия, рвота. При лаборатор ном исследовании выявлена гипергликемия (32,6 моль/л), глюкозурия (55 ммоль/л). Животному проведена инфузион ная терапия, назначен инсулин в дозе 29 IU 2 раза в день. В апреле трансплантированы стволовые клетки в паренхиму пе чени. Спустя 3 мес после операции животное получает 12 IU инсулина 1 раз в день. Животное №3. Кот, метис, 11 лет, массой 6 кг поступил в клинику с признаками полиурии, анорексии. При физикальном исследовании определили, что состояние животного удовлетво рительное, при эхографии выявили увеличение эхогенности почечной коры, расплывчатость границы между кортикальным и медуллярным слоями, нечеткую внутреннюю архитектуру органа. Биохимический анализ крови показал глюкозурию (28,9 моль/л), содержание мочевины 10 моль/л, креатинина 168 моль/л. Животному провели инфузионную терапию и на значили канинсулин в дозе 5 IU 2 раза в день. В апреле транс плантировали стволовые клетки в паренхиму печени. Спустя 3 мес после операции полностью отказались от инсулинотера пии, животному назначено симптоматическое лечение в связи с нарастающей почечной недостаточностью (содержание мочеви ны в крови 21,7 моль/л, креатинина — 304 моль/л). Результаты В ходе исследований у 2 животных (№1 и 3) исчезли кли нические проявления СД, в их случае полностью отказались от инсулинотерапии, 1 животному (№2) значительно сниже на доза гормона (в 4,8 раза), что отражено в таблице 1. Ретро спективный анализ результатов лабораторных исследований крови показал, что в большинстве случаев показатели нор мализовались (табл. 2). 1. Сут очные дозы, вво димог о инс Суто вводимог димого инсуулина, IU IU,, до и после тр ансплант ации трансплант ансплантации Животное До трансплантации После трансплантации, сут 1-е 7-е 14-е 30-е 60-е №1 20 0 0 0 0 0 №2 44 44 20 18 16 12 №3 10 0 3 0 0 0 ЭНДОКРИНОЛОГИЯ 2. К онцентр ация гглюк люк озы, ммо ль/л, в крови до и после тр ансКонцентр онцентрация люкозы, ммоль/л, трансации плантации плант Животное До трансплантации Начало Перед транслечения плантацией №1 После трансплантации, сут 1-е 7-е 14-е 30-е 60-е 4,4 4,2 — 3,9 19,3 19,3 5,2 №2 32,6 32,6 19,5 7,2 — 8,0 21,7 №3 44,3 7,8 6,4 3,7 6,6 4,4 4,2 Выводы Анализ отечественных и зарубежных источников, а также проведенные клинические исследования позволяют предполо жить, что при ксеногенной трансплантации культивированных кроличьих фетальных βклеток ПЖ собакам и кошкам, боль ным СД, начинает вырабатываться эндогенный инсулин. При этом в крови повышается содержание гормона и нормализует ся уровень сахара, изменяются другие клинические показате ли, определяющие СД. Кроме того, у животных снижается ин тенсивность проявления сопутствующих СД осложнений — ангиопатии, нефропатии, ретинопатии, или они полностью исчезают, что значительно улучшает качество жизни живот ного и устраняет риск появления новых осложнений. В заключение остается добавить, что мы продолжаем иссле дования в этом направлении, накапливаем и систематизируем данные, о чем постараемся доложить в ближайшее время. БИБ ЛИОГР АФИЯ БИБЛИОГР ЛИОГРА 1. Дедов И.И., Балаболкин М.И., Клебанова Е.М. Современные аспекты транс плантации островков поджелудочной железы при сахарном диабете. 3й Все российский диабетологический конгресс. 2. Леонович С.И., Слука Б.А., Игнатович И.Н., Горанов В.А. Трансплантация культуры островковых клеток поджелудочной железы в красный костный мозг. Белорусский медицинский журнал. Минск, 2004. — №1.— с.44. 3. Скалецкий H.H., Кирсанова Л.А., Блюмкин В.Н. Проблемы трансплантоло гии и искусственных органов. М, 1994. — С.73—80. 4. Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Игнатенко С.Н. и др. Проблемы эндокрино логии. М., 1985. — №5. — С.67—70. 5. Шумаков В. И., Блюмкин В. Н., Скалецкий Н.Н. и др. Трансплантация ост ровковых клеток поджелудочной железы. М., Канон, 1995.— 384 с. 6. Alejandro R., Caulfield A., Fround Т. et al., Cell Transplant. — 2001. — Vol. 10. — P. 520. 7. Alejandro R., Ferreira J. V., Caulfield A. et al. Am J Transplant. — 2002. —Vol. 2. — Suppl. 3. — P. 227. 8. Berney T., Bьhler L., Caulfield A., Oberholzer J., Toso Ch., Alejandro R. Transplantation of islets of Langerhans: new developments. Swiss. Med. Wkly 2002; 132:671—680. 9. Bretzel R.G., Manus E., Schomber C. The liver as a site for implantation of islets of Langerhans in experimental diabetes. Morphologic and metabolic observation. «Acta Endocrinol.», 1978, 87, Suppl.215, 69. 10. Federlin K., Pozza G. Indications for clinical islet transplantation today and in the foreseeable future – the diabetologist“s point of view. J Mol Med 1999; 77:148— 152. 11. Henryk Zulewski, Elizabeth J. Abraham, Melissa J. Gerlach, et al. Multipotential NestinPositive Stem Cells Isolated From Adult Pancreatic Islets Differentiate Ex Vivo Into Pancreatic Endocrine, Exocrine, and Hepatic Phenotypes. Diabetes, Vol. 50, March 2001. 12. Kolb E., Largiader F. Clinical islet transplantation. «Transpl. Proc.», 1980, 12, №4, 205—207. 13. Lechner A., Habener J. Stem/progenitor cells derived from adult tissues: potential for the treatment of diabetes mellitus. AJPEndocrinol Metab • VOL 284 • FEBRUARY 2003. 14. Najarian J.S., Sutherland D.E.R. et al. Human islet autotransplantation. A preliminary report. «Transplant. Proc.», 1977, 9, №1, 233—236. 15. Nielsen J., Svensson C., Galsgaard E. Beta cell proliferation and growth factors. J Mol Med (1999) 77:62—66. 16. Oberholzer et al. βCell Replacement for the Treatment of Diabetes. Annals of the New York Academy of Sciences 944:373—387 (2001). 17. Richardt M., Menden A., Bretzel R. Islet transplantation in experimental diabetes of the rat. Hormone and metab. Res., 1984, 16, №10, 551—552. 18. Shapiro A.M., Lakey J.R., Ryan E.A. et al. N. Engl. J. Med. — 2000. —Vol. 27. — P. 230—238. 19. Song K. et al. In vitro transdifferentiation of adult pancreatic acinar cells into insulinexpressing cells. Biochem Biophys Res Commun 2004; 316: 1094–1100. 20. Valente U., Ferro M., Barocci S. Report of clinical cases of human fetal transplantation. «Transplant. Proc.», 1980, 12, №4, 213—214. 21. Vijayakumar K. RamiyA, Michael Maraist et al., Reversal of insulindependent diabetes using islets generated in vitro from pancreatic stem cells. Nature Medicine • Vol. 6 • Number 3 • March 2000. 22. Berney T., Bьhler L., Caulfield A., Oberholzer J., Toso Ch., Alejandro R. Transplantation of islets of Langerhans: new developments. Swiss. Med. Wkly 2002; 132:671—680. РВЖ МДЖ №32005 SUMM ARY SUMMARY s kka a y a, L.P ono L . A . Ser ezhin a, N.M. T u r z h an ezhina, ha ns L.P.. D i a kkono onovv , al I.K. Abdr ak hm ano A . Seliuguin, YY.. A . K uznetso linic Abdrak akhm hmano anovv, M. M.A uznetsovv . C Clinic linical o b ser ahep atic tr an s p l ant at aion of xxenog enog eneic enogeneic servv ation of intr intrahep ahepatic tran ans antat ataion anc ee anim al s w ith Di abet es r abb it β — c el elll s p panc ancrr e a s b byy thr three animal als with Diabet abete abbit u s. Diabetes exacts its toll on many animals, young and old. mel lit litu mellit For years, researchers have been painstakingly dissecting this complicated disease caused by the destruction of insulin producing islet cells of the pancreas. Despite progress in understanding the underlying disease mechanism for diabetes, there is still a paucity of effective therapies. For years, investigators have been making slow, but steady progress on experimental strategies for pancreatic transplantation and islet cell replacement. This article is about the trial of transplantation of fetal cells of pancreas of rabbit, 2 dogs and 1cat. Cells were infused into liver in the dose of 3 · 106 into 5 places. As a result: 1 dog and 1 cat absolutely refused from insulin. One dog’s dose was noticeably reduced. НОВОСТИ ВЕТЕРИНАРНЫХ НАУКИ И ПРАКТИКИ УДК 616.379-008.64:616.08:619 Современные методы лечения сахарного диабета Н.М. Туржанская, Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина (Москва) Сокр ащ ения Сокращ ащения ения: в/в — внутривенный/но, в/м — внутримышечный/но, ИЗСД — инсулинзависимый сахарный диабет, ИНСД — инсулиннезависимый сахарный диабет, МТ — масса тела, ПЖ — поджелудочная железа, СД — сахарный диабет, Т СП — таблетезированные сахаропонижающие препараты Т ермином СД обозначают метаболические нарушения вследствие недостаточного образования собственного инсулина (диабет I типа/ИЗСД) или нарушения его действия на ткани (диабет II типа/ИНСД, встречается у ко шек). СД характеризуется развитием хронической гиперглике мии и сопровождается изменением углеводного, жирового и бел кового обмена, что приводит к поражению, дисфункции и раз витию недостаточности различных органов и систем, особенно глаз, почек, нервов и сердца вследствие ангиопатий [5, 9]. ИЗСД возникает у наследственно предрасположенных к нему животных в результате образования антител против кле ток островков Лангерганса. Эти антитела разрушают инсулин образующие клетки. Клинически СД проявляется лишь при потере 80% βклеток. Секреция инсулина значительно снижа ется, что приводит к абсолютной недостаточности гормона. ИНСД развивается вследствие толерантности тканей к биологическому действию инсулина. При этом для него ха рактерна избыточная продукция инсулина. Основные цели лечения СД — устранение клинической симптоматики заболевания, предупреждение возникновения инсулининдуцированной гипогликемии, предотвращение ос трых и хронических осложнений, достижение высокого каче ства жизни. В настоящее время применяют следующие мето ды лечения: 1) немедикаментозные (диета); 2) ТСП; 3) инсу линотерапия; 4) трансплантация ПЖ и βклеток ПЖ. 15
