014585 B1 014585 014585 B1 B1

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
014585
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации
и выдачи патента:
2010.12.30
(21)
Номер заявки:
200800814
(22)
Дата подачи:
2006.09.14
(54)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛОКСАМЕРОВ
(72)
Изобретатель:
Росси Мара (IT)
(74)
Представитель:
PHARMACEUTICAL SCIENCES, vol. 86,
no. 7, July 1997 (1997-07), pages 808-812,
XP002366128, ISSN: 0022-3549, paragraph
"analytical methods" on page 809
WO-A-2004104025
MANOHAR KATAKAM ET AL.:
"Effect of Surfactants on the Physical
Stability of Recombinant Human Growth
Hormone" JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, AMERICAN PHARMACEUTICAL ASSOCIATION. WASHINGTON, US, vol. 84, no. 6, June 1995
(1995-06), pages 713-716, XP002114576,
ISSN: 0022-3549, the whole document
MOGHIMI S.M. ET AL.: "Causative
factors behind poloxamer 188 (Pluronic
F68, Flocor(TM))-induced complement activation in human sera - A protective role
against poloxamer-mediated complement
activation by elevated serum lipoprotein
levels" BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA
ACTA. MOLECULAR BASIS OF DISEASE, AMSTERDAM, NL, vol. 1689, no.
2, 28 June 2004 (2004-06-28), pages 103113, XP004516388, ISSN: 0925-4439Ю the
whole document
MAO Y. ET AL.: "Quantitation of
poloxamers in pharmaceutical formulations
using size exclusion chromatography and
colorimetric methods" JOURNAL OF
PHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS, NEW YORK, NY, US,
vol. 35, no. 5, 3 September 2004 (2004-0903), pages 1127-1142, XP004544072, ISSN:
0731-7085, cited in the application, the
whole document
JEWELL
R.C.
ET
AL.:
"Pharmacokinetics of RheothRx injection in
healthy male volunteers" JOURNAL OF
(57)
Изобретение относится к аналитическому определению полоксамеров в жидком образце белка.
Конкретнее, изобретение включает способ, предусматривающий стадии, в ходе которых упомянутый образец подвергается стадии разделения с помощью колонки эксклюзионной гельхроматографии; стадии элюции подвижной фазой и, необязательно, стадии детектирования полоксамера. Настоящее изобретение делает возможным количественное определение полоксамеров в образце белка, в котором белок имеет молекулярную массу, сравнимую с таковой полоксамеров.
B1
(56)
B1
Медведев В.Н. (RU)
(51) Int. Cl. B01D 15/34 (2006.01)
G01N 33/487 (2006.01)
G01N 33/68 (2006.01)
014585
(31) 05108439.0; 60/717,642
(32) 2005.09.14; 2005.09.16
(33) EP; US
(43) 2008.12.30
(86) PCT/EP2006/066383
(87) WO 2007/031566 2007.03.22
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
АРЕС ТРЕЙДИНГ С.А. (CH)
014585
(11)
014585
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области аналитического определения поверхностно-активного вещества,
принадлежащего к классу полоксамеров, в жидком образце белка.
Предшествующий уровень техники
Полоксамеры являются неионными блок-сополимерами этиленоксида (ЕО) и пропиленоксида (РО).
Они используются в фармацевтических составах в качестве поверхностно-активных веществ, эмульгирующих агентов, солюбилизирующих агентов и диспергирующих агентов.
Хорошо известным аналитическим подходом в характеризации полоксамера является калориметрический способ, в котором анализируют поглощение ультрафиолетового излучения (UV) на длинах волн
320 и 620 нм, даваемое при формировании комплекса полоксамера с тиоцианатом кобальта (II).
Yun Мао et al. (Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 35 (2004), 1127) описывают использование для определения полоксамера эксклюзионной гель-хроматографии (SEC) с применением
колонки, содержащей THF в качестве подвижной фазы, и определения коэффициента преломления (RI).
Способ был применен к фармацевтическим составам Avapro, Neurontin и Sudafed, в которых активное
начало представляет собой "малую молекулу". Малые молекулы могут быть легко отделены с помощью
SEC от полоксамеров с большой молекулярной массой.
Эксклюзионная гель-хроматография (SEC), также называемая хроматографией на проницаемом геле (GPC), использует пористые частицы для разделения молекул различных размеров. Она обычно используется для разделения полимерных молекул и для определения молекулярных масс, а также распределений молекулярных масс полимеров. Молекулы, которые меньше, чем размер поры, могут проникать
внутрь частиц, и поэтому проделывать более длинный путь, занимающий большее время, чем более
крупные молекулы, которые не в состоянии проникнуть внутрь частиц. Все молекулы, размеры которых
больше, чем размер пор, не задерживаются и элюируются вместе. Молекулы, которые в состоянии проникнуть в поры, имеют среднее время пребывания в частицах, которое зависит от размера и формы молекулы. Различные молекулы, следовательно, имеют различное общее время прохождения через колонку.
До настоящего времени не разработано способа количественного определения полоксамеров в образце белка, в котором белок имеет молекулярную массу, которая сравнима с таковой полоксамеров.
Существует, в частности, необходимость в количественном определении полоксамеров в образцах
белка, в которых белок имеет молекулярную массу между 5 и 70 кДа (килодальтон), предпочтительно
между 20 и 70 кДа.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к способу, обеспечивающему количественное определение полоксамера в образце белка, в частности в жидком образце белка, например в жидком фармацевтическом составе. В частности, данное изобретение предоставляет способ количественного измерения концентрации
полоксамера в образце белка. Таким образом, количество полоксамера в составе может быть определено
в любое время в течение срока хранения белковых составов около 2 лет.
Способ количественного определения полоксамера в жидком образце белка включает в себя стадии,
в ходе которых упомянутый образец подвергается:
(a) стадии разделения ингредиентов упомянутого образца с помощью колонки эксклюзионной гельхроматографии и
(b) стадии детектирования полоксамера с помощью анализа коэффициента преломления.
Предпочтительно данное изобретение относится к способу количественного определения полоксамера в жидком образце белка, предусматривающему стадии, в ходе которых упомянутый образец подвергается:
(a) стадии разделения, с помощью колонки эксклюзионной гель-хроматографии;
(b) стадии элюции с участием подвижной фазы и
(с) необязательно, стадии детектирования полоксамера.
Таким образом, эксклюзионная гель-хроматография, скомбинированная со стадией элюции подвижной фазой, позволяет отделить полоксамер от остальных ингредиентов.
Полоксамер детектируется в ходе следующей стадии путем анализа элюированной фазы, например,
с использованием системы детектирования RI (коэффициента преломления).
Краткое описание чертежа
Чертеж показывает хроматограмму количественного определения полоксамера 188 в составе, включающем hCG. Площадь пика полоксамера 188 в этом примере получена при времени элюции около 14-16
мин (время удержания может варьировать в зависимости от скорости потока). Площадь под кривой позволяет количественно определить полоксамер 188 в образце hCG.
Сокращения
В описании данного изобретения используются нижеследующие сокращения:
FSH: фолликулостимулирующий гормон;
r-FSH, r-LH, r-hCG, r-GH, r-IFNβ, r-TSH: рекомбинантный FSH, LH, hCG, GH, INFβ, TSH;
hFSH: FSH человека;
-1-
014585
r-hFSH: рекомбинантный FSH человека;
RI: коэффициент преломления;
KD, или Kd, или kDa: килодальтон;
SEC: эксклюзионная гель-хроматография;
RT: комнатная температура;
WFI: вода для инъекций;
полоксамер 188: синоним Pluronic F68 (фирма BASF Inc.).
Подробное описание изобретения
Данное изобретение относится к удобному способу, обеспечивающему количественное определение полоксамера, который представляет собой поверхностно-активное вещество, в образце белка. Предпочтительно образец белка представляет собой жидкий образец белка. Жидкий образец белка может
быть в форме какого-либо жидкого состава, предпочтительно это жидкий фармацевтический состав, как
описано ниже. В одном варианте воплощения упомянутый жидкий фармацевтический образец белка содержится в пузырьке для разового или многодозового введения.
В еще одном варианте воплощения образец белка для анализа высушен замораживанием, и он должен быть перед анализом солюбилизирован в подходящем водном растворителе.
Способ количественного определения полоксамера в жидком образце белка предусматривает стадии, в ходе которых исследуемый образец подвергается:
(a) стадии разделения ингредиентов упомянутого образца с помощью колонки для эксклюзионной
гель-хроматографии (в частности, колонки SE-HPLC); и
(b) стадии детектирования полоксамера с помощью анализа коэффициента преломления.
Предпочтительно данное изобретение представляет способ количественного определения полоксамера в жидком образце белка, предусматривающий стадии, в ходе которых упомянутый исследуемый
образец подвергается:
(a) стадии разделения ингредиентов с помощью колонки для эксклюзионной гель-хроматографии;
(b) стадии элюции подвижной фазой и
(c) необязательно, стадии детектирования полоксамера.
Обычной колонкой для эксклюзионной гель-хроматографии является колонка SE-HPLC.
В одном варианте воплощения полоксамер представляет собой полоксамер 188.
В предпочтительном варианте воплощения белок в жидком образце белка имеет молекулярную
массу, которая сравнима с массой полоксамера.
В особенно предпочтительном варианте воплощения белок в жидком образце белка имеет молекулярную массу между 5 и 70 кДа, более предпочтительно между 20 и 70 кДа.
Соотношение массы белка к соответствующей массе полоксамера может предпочтительно составлять между 1:3 и 10:1, предпочтительно между 1:2 и 7:1.
Примеры белков по данному изобретению включают в себя белки млекопитающих, такие как, например, гормон роста, включая в себя гормон роста человека и гормон роста быка; рилизинг-фактор гормона роста; гормон околощитовидной железы; тиреоид-стимулирующий гормон; липопротеины; а-lантитрипсин; цепь А инсулина; цепь В инсулина; норинсулин; фолликулостимулирующий гормон; хорионический гонадотропин; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания,
такие как фактор VIIIC, фактор IX, тканевой фактор и фактор фон Виллебранда; противосвертывающие
факторы, такие как белок С; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор
плазминогена, такой как азурокиназа или активатор плазминогена тканевого типа (t-PA); бомбезин;
тромбин; фактор некроза опухолей-α и -β; энкефалиназа; RANTES (экспрессируется и выделяется Тклетками при активации); воспалительный протеин макрофагов человека (MIP-I-α); сывороточный альбумин, такой как сывороточный альбумин человека; антимюллеров гормон; цепь А релаксина; цепь В
релаксина; прорелаксин; белок, связанный с гонадотропин-рилизинг гормоном; ДНКаза; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы гормонов или факторов роста; интегрин; белки
А или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как нейротрофический фактор костного мозга (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), или фактор роста нервов,
такой как NGF-P; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и
bFGF, в частности FGF-18; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF),
такой как TGF-α и TGF-β, включая TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулиноподобный
фактор роста-I и -II (IGF-I и IGF-II); дез(I-3)-IGF-I (IGF-I мозга); белки, связывающие инсулиноподобный
фактор роста; белки CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD19 и CD20; эритропоэтин (ЕРО); тромбопоэтин
(ТРО); остеоиндуктивные факторы; остеопонтин; иммунотоксины; морфогенетический белок кости
(BMP); интерферон, такой как интерферон-α, -β и -γ; колониестимулирующие факторы (CSF), например,
M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например, IL-1-IL-10; супероксиддисмутаза; рецепторы Тклеток; белки поверхностной мембраны; фактор гемолиза (DAF); вирусный антиген, такой как, например, часть оболочки вируса приобретенного иммунодефицита (AIDS); транспортные белки; "хоминг"рецепторы; адресины; регуляторные белки; иммуноадгезины; антитела; и биологически активные фраг-2-
014585
менты или варианты какого-либо из перечисленных полипептидов.
Предпочтительно белки по данному изобретению выбраны из фолликулостимулирующего гормона
(FSH), хорионического гонадотропина (CG), лютеинизирующего гормона (LH), интерферона-β (IFN-β),
пегилированного интерферона-β (PEG-IFN-β), гормона роста (GH), тиреоидстимулирующего гормона
(TSH), фактор роста-18 фибробластов (FGF-18) или остеопонтина.
FSH, CG, LH и TSH являются гликопротеинами, относящимися к классу гонадотропинов. Гонадотропины используют в лечении бесплодия.
IFN-β является гликопротеином, относящимся к классу интерлейкинов. IFN-β используют в лечении рассеянного склероза.
PEG-IFN-β представляет собой IFN-β, дериватизированный цепью полиэтиленгликоля, которая
придает повышенную стабильность.
Гормон роста является негликозилированным белком. Он применяется в лечении детей или взрослых с дефицитами гормона роста.
FGF-18 применяют в лечении остеоартрита.
Остеопонтин является гликозилированным одноцепочечным полипептидом.
В одном предпочтительном варианте воплощения упомянутый белок представляет собой гетеродимер, такой как гонадотропины (FSH, LH, CG, TSH, а также варианты). В еще одном варианте воплощения белок представляет собой гормон роста (GH) или интерферон-β (IFN-β или варианты, например, пегилированные варианты). В еще одном варианте воплощения белок представляет собой FGF-18 или остеопонтин.
В предпочтительном варианте воплощения жидкий образец белка включает в себя один или более
терапевтических белков. Предпочтительно такой образец не включает в себя небелковое терапевтическое
средство, такое как низкомолекулярные химические соединения.
Фолликулостимулирующий гормон или FSH, так как это используется в данном документе, означает FSH, продуцированный как полноразмерный зрелый белок, который включает в себя, но не ограничивается или, FSH человека или "hFSH", продуцирован ли он рекомбинантно или выделен из человека как
источника, такого как моча постменопаузных женщин.
Способ пригоден для природных, так же как и рекомбинантных белков. В одном варианте воплощения состав белка представляет собой рекомбинантный FSH, LH, CG, TSH, GH или IFN-β человека.
Фолликулостимулирующий гормон (FSH) представляет собой гликопротеин, относящийся к классу
гонадотропинов. FSH применяют при лечении бесплодия и нарушений функции воспроизводства у пациентов как женского, так и мужского пола, например, для индукции сперматогенеза у мужчин, страдающих олигоспермией.
Лютеинизирующий гормон (LH) представляет собой гонадотропин, секретируемый передней долей
гипофиза. LH применяют в комбинации с FSH у пациентов женского пола при индукции овуляции (OI) и
в контролируемой гиперстимуляции яичников (СОН), особенно у тех пациентов, которых имеют очень
низкий уровень эндогенного LH или обладают резистентностью к LH, таких как женщины, страдающие
гипогонадотрофным гипогонадизмом (НН, Всемирная Организация Здравоохранения (WHO) группа I)
или у пожилых пациентов (например, 35 лет и старше), а также у пациенток, имеющих проблемы с имплантацией зародыша или с ранним выкидышем.
Хорионический гонадотропин (CG) представляет собой гонадотропин, продуцируемый плацентой и
полученный из мочи беременных женщин. CG действует на тот же рецептор, что и LH, и вызывает те же
самые реакции. CG обладает более длительным временем полужизни при циркуляции, чем LH, и поэтому обычно используется как долговременно действующий источник активности LH. CG применяют при
режимах OI и СОН с целью имитировать естественный пик LH и запустить овуляцию. Инъекция хорионического гонадотропина человека (hCG) применяется для запуска овуляции в конце стимуляции с помощью FSH или смеси FSH и LH. CG может также быть использован вместе с FSH в ходе стимуляции
для OI и СОН, с целью обеспечить активность LH в ходе стимуляции у пациенток, у которых желательна
активность LH, таких как упомянуты выше.
FSH, LH и CG являются членами семейства гетеродимерных гликопротеиновых гормонов, которое
также включает в себя тиреоид-стимулирующий гормон (TSH). Члены этого семейства являются гетеродимерами, включающими в себя α- и β-субъединицы. Субъединицы связаны нековалентными взаимодействиями.
Гетеродимер FSH человека (hFSH) состоит из (i) зрелой α-субъединицы гликопротеина, содержащей 92 аминокислоты, которая также является общей для других членов этого семейства у человека (т.е.
хорионический гонадотропин ("CG"), лютеинизирующий гормон ("LH") и тиреоид-стимулирующий гормон ("TSH"); и (ii) зрелой β-субъединицы, содержащей 111 аминокислот, которая уникальна для FSH.
Гетеродимер LH человека состоит из (i) зрелой α-субъединицы гликопротеина, содержащей 92 аминокислоты; и (ii) зрелой β- субъединицы, содержащей 112 аминокислот, которая уникальна для LH. α- и βсубъединицы гликопротеинов могут быть склонны к диссоциации в составах вследствие взаимодействия
с консервантом, поверхностно-активным веществом и другими эксципиентами. Диссоциация субъединиц
-3-
014585
ведет к утрате биологической активности.
FSH готовят в составах для внутримышечной (IM) или подкожной (SC) инъекции. В одном варианте воплощения FSH поставляется в лиофилизированной (твердой) форме в пузырьках или ампулах 75
международных единиц (ME)/пузырек и 150 МЕ/пузырек с временем хранения полтора года и два года,
если хранится при 2-25°С. Раствор для инъекции получают путем разбавления лиофилизированного продукта в воде для инъекций (WFI). К тому же жидкие составы FSH доступны (Gonal-F pen) с содержанием
22 мкг/0,5 мл, 33 мкг/0,75 мл или 66 мкг/1,5 мл FSH, а также полоксамера 188, сахарозы, буфера, метионина и м-крезола.
Следовательно, FSH готовят как в однодозовой, так и в многодозовой формах, в пузырьках или ампулах. Однодозовые формы должны оставаться стабильными и действенными при хранении до использования. Многодозовые формы должны не только оставаться стабильными и действенными при хранении до использования, но также должны оставаться стабильными и действенными и относительно свободными от бактерий в течение периода многодозового введения после того как герметичность ампулы
была нарушена. По этой причине многодозовые формы обычно содержат бактериостатический агент,
например, бензиловый спирт или м-крезол.
LH готовят в составах для внутримышечной (IM) или подкожной (SC) инъекции. LH поставляют в
лиофилизированной (твердой) форме в пузырьках или ампулах по 75 МЕ/пузырек с временем хранения
от полутора до двух лет при 2-25°С. Раствор для инъекции получают разбавлением лиофилизированного
продукта водой для инъекций (WFI). Luveris™ содержит помимо LH следующие эксципиенты: сахарозу,
буфер, Polysorbat 20, метионин. В последнее время описаны составы LH, содержащие полоксамер 188
(WO 2004/087213).
Жидкие фармацевтические композиции, содержащие hCG, также присутствуют на рынке, например
Ovitrelle™, содержащий маннитол в фосфатном буфере при pH 7, метионин, полоксамер 188.
Выражение "вариант" предназначено охватить такие молекулы, которые отличаются по последовательности аминокислот, типу гликозилирования или соединению между субъединицами от FSH, LH, CG,
TSH, IFN-β или GH человека, но проявляющие соответствующую биологическую активность FSH, LH,
CG, TSH, IFN-β или GH. Примеры включают в себя CTP-FSH, рекомбинантный FSH с пролонгированным действием, содержащий α-субъединицу дикого типа и гибридную β-субъединицу, в которой карбоксиконцевой пептид hCG соединен с С-концом β-субъединицы FSH, как описано в LaPolt et al.; Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520; or Klein et al.; Development and characterization of a long-acting r-hFSH
agonist; Human Reprod. 2003, 18, 50-56]. Также включен одноцепочечный CTP-FSH, одноцепочечная молекула, состоящая из следующих последовательностей (от N-конца к С-концу):
в которой pFSH обозначает β-субъединицу FSH, βhCG CTP (113-145) означает карбоксильный конец пептида hCG, a αFSH означает α-субъединицу FSH, как описано в Klein et al.; (Pharmacokinetics and
pharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulating hormone containing the human
chorionic ganodotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey, Fertility & Sterility, 2002, 77, 12481255). Другие примеры вариантов FSH включают в себя молекулы FSH, имеющие дополнительные сайты гликозилирования, включенные в α- и/или β-субъединицу, как описано в WO 01/58493 (фирма Maxygen), особенно, как описано в пп.10 и 11 WO 01/58493, и молекулы FSH с S-S-связями между субъединицами, как описано в WO 98/58957.
Варианты FSH, упоминаемые в данном документе, также включают в себя делеции карбоксильного
конца β-субъединицы, которая короче, чем полноразмерный зрелый белок FSH. Гетеродимеры FSH или
варианты гетеродимеров FSH могут быть получены любым подходящим способом, таким как рекомбинантный, путем выделения или очистки из естественных источников, что может быть наиболее верным,
или путем химического синтеза, или какой-либо их комбинацией.
"Варианты" также включают в себя пэгилированные формы белков.
Использование термина "рекомбинантный" относится к препаратам FSH, LH, CG, TSH, GH, IFN-β
или вариантам, которые получены с помощью рекомбинантной ДНК-технологии (см., например,
WO 85/01958). Один из примеров способа экспрессирования FSH или LH с помощью рекомбинантной
технологии - это трансфекция эукариотических клеток последовательностями ДНК, кодирующими α- и
β-субъединицу FSH или LH, независимо от того, на одном векторе или на двух векторах для каждой
субъединицы, имеющих отдельные промоторы, как описано в Европейских патентах № ЕР 0211894 и
ЕР 0487512. Другим примером применения рекомбинантной технологии для получения FSH или LH является использование гомологичной рекомбинации для вставки гетерологического регуляторного сегмента в оперативном соединении с эндогенными последовательностями, кодирующими субъединицы
FSH или LH, как описано в Европейском патенте № ЕР 0505500 (фирма Applied Research Systems ARS
Holding NV).
FSH или вариант FSH, используемые в соответствии с данным изобретением, могут быть получены
не только рекомбинантными средствами, включая в себя таковые на клетках млекопитающих, но также
-4-
014585
могут быть очищены из других биологических источников, таких как моча. Приемлемые методологии
включают в себя таковые, описанные в Hakola, K. Molecular and Cellular Endocrinology, 127:59-69,1997;
Keene, et al., J. Biol. Chem., 264:4769-4775, 1989; Cerpa-Poljak, et al., Endocrinology, 132:351-356, 1993;
Dias, et al., J. Biol. Chem., 269:25289-25294, 1994; Flack, et al., J. Biol. Chem., 269:14015-14020, 1994; и
Valove, et al., Endocrinology, 135:2657-2661, 1994, патент США 3119740 и патент США № 5767067.
Термин "лютеинизирующий гормон" или LH, так как он используется в данном документе, относится к LH, полученному как полноразмерный зрелый белок, который включает в себя, но не ограничивается им, LH человека, получен ли он рекомбинантно или выделен из источников человеческого происхождения, таких как моча постменопаузных женщин. Белковая последовательность α-субъединицы гликопротеина человека представлена в SEQ ID NO: 1, а белковая последовательность β-субъединицы LH
человека дана в SEQ ID NO: 6. В предпочтительном варианте воплощения LH является рекомбинантным.
Выражение "вариант LH" предназначено, чтобы охватить такие молекулы, которые отличаются по
аминокислотной последовательности, типу гликозилирования или связи между субъединицами LH человека, но проявляют активность LH.
Гетеродимеры LH или гетеродимеры вариантов LH могут быть получены каким-либо подходящим
способом, таким как рекомбинантный, путем выделения или очистки из природных источников, что наиболее обычно, или путем химического синтеза, или какой-либо их комбинации.
Жидкие образцы белков по данному изобретению также включают в себя смеси FSH/LH и варианты
(WO 2004/087213), так же как FSH и hCG, и варианты (WO 2004/105788).
Термин "водный разбавитель" относится к жидкому растворителю, который содержит воду. Водные
растворительные системы могут состоять только из воды или могут состоять из воды с добавлением одного или более смешивающихся растворителей и могут содержать растворенные вещества, такие как
сахара, буферы, соли или другие наполнители. Более обычными в использовании неводными растворителями являются органические спирты с короткими цепями, такие как метанол, этанол, пропанол, кетоны
с короткими цепями, такие как ацетон, и многоосновные спирты, такие как глицерин.
Термин "бактериостатик" или "бактериостатический агент" относится к соединению или композициям, добавленным к составу, чтобы действовать как антибактериальный агент. Составы, содержащие
FSH или вариант FSH, или FSH и LH с консервантом по данному изобретению, предпочтительно соответствуют законным или регулирующим правилам для эффективности консерванта, чтобы быть коммерчески жизнеспособным продуктом многоразового использования, предпочтительно на человеке. Примеры бактериостатиков включают в себя фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол, хлоркрезол, бензиловый
спирт, алкилпарабен (метил, этил, пропил, бутил и подобное), бензалкония хлорид, бензетония хлорид,
дегидроацетат натрия и тимеросал.
Термин "буфер" или "физиологически приемлемый буфер" относится к растворам соединений, которые известны как безопасные для фармацевтического или ветеринарного применения в составах и которые имеют эффект поддержания или контроля pH состава в желаемом для состава диапазоне pH. Приемлемые для контроля pH на уровне умеренного кислого pH - умеренно основного pH буферы включают
в себя, но не ограничиваются ими, такие вещества, как фосфат, ацетат, цитрат, аргинин, TRIS и гистидин.
"TRIS" обозначает 2-амино-2-гидроксиметил-1,3,-пропандиол и некоторые его фармакологически приемлемые соли.
Предпочтительные буферы представляют собой фосфатные буферы с физиологическим раствором
или приемлемой солью.
Термин "фосфатный буфер" относится к растворам, содержащим фосфорную кислоту или ее соли,
установленным на желаемом уровне pH. В целом, фосфатные буферы готовят из фосфорной кислоты или
солей фосфорной кислоты, включая в себя, но, не ограничиваясь ими, натриевую и калиевую соли. Несколько солей фосфорной кислоты известны в данной области техники, такие как одноосновный натрий
и калий, двухосновные и трехосновные соли кислоты. Также известно, что соли фосфорной кислоты
встречаются как гидраты встречающихся солей. Фосфатные буферы могут охватывать диапазон pH, такой как от около pH 4 до около pH 10, а предпочтительные диапазоны от около pH 5 до около pH 9, а
наиболее предпочтительным является диапазон от 6,0 или около того до 8,0 или около того, наиболее
предпочтительно pH 7,0 или около того.
Термин "пузырек" относится в широком смысле к резервуару, пригодному, чтобы содержать FSH в
твердой или жидкой форме в стерильном состоянии. Примеры пузырьков, как они употребляются в данном документе, включают в себя ампулы, кассеты, блистерные упаковки или другие такие емкости, пригодные для введения FSH пациенту с помощью шприца, насоса (включая в себя осмотический), катетер,
трансдермальный пластырь, легочный спрей или спрей для слизистой. Пузырьки, пригодные для упаковки продуктов для парентерального, легочного, через слизистую или трансдермального введения, известны и признаны в данной области техники.
Выражение "многодозовое применение" предназначено, чтобы включить в себя использование одного пузырька, ампулы или кассеты с составом FSH или составом белка для более чем одной инъекции,
например 2, 3, 4, 5, 6 или более инъекций. Инъекции проводят предпочтительно в период по меньшей
-5-
014585
мере 12, 24, 48 ч и т.д. или около того, предпочтительно в период 12 дней или около того. Инъекции могут быть разделены промежутками времени, например в 6, 12, 24, 48 или 72 ч.
Термин "стабильность" относится к физической, химической и конформационной стабильности
данного белка в составе по данному изобретению (включая в себя поддержание биологической активности). Нестабильность состава белка может быть вызвана химическим разложением или агрегацией молекул белка с образованием полимеров более высокого порядка, диссоциацией гетеродимеров в мономеры,
дегликозилированием, модификацией гликозилирования, окислением (особенно в гетеродимерах αсубъединицы) или какой-либо другой структурной модификацией, которая уменьшает по меньшей мере
один вид биологической активности полипептида, включенного в данное изобретение.
"Стабильный" раствор или состав является таким, в котором степень разложения, модификации, агрегации, утраты биологической активности и подобного белков в растворе или составе приемлемым образом контролируется и не возрастает неприемлемым образом с течением времени. Предпочтительно
состав сохраняет по меньшей мере 80% или около того активности упомянутого белка в период до 2 лет.
Проблема, лежащая в основе данного изобретения, состоит в том, чтобы предоставить удобный и
быстрый способ определения количества полоксамера в образце белка. Полоксамер может быть использован как поверхностно-активное вещество и выбирается из блок-сополимеров этиленоксида и пропиленоксида, предпочтительно Pluronic® F77, Pluronic F87, Pluronic F88 и Pluronic® F68, особенно предпочтительно Pluronic F68 (фирма BASF, Pluronic F68 также известен как полоксамер 188).
Как упоминалось выше, фармацевтические составы должны иметь время хранения до 2 лет при
температуре хранения 2-25°С. Это подразумевает, что состав остается стабильным в течение этого времени. Поскольку жидкие составы содержат различные наполнители, которые могут влиять непосредственно или опосредованно через разложение на стабильность состава белка, существует необходимость в
аналитическом инструменте, чтобы добиться упомянутой стабильности состава.
Более конкретно, полоксамерные поверхностно-активные вещества являются блок-сополимерами
этиленоксида (ЕО) и пропиленоксида (РО). Блок пропиленоксида (РО) заключен между двумя блоками
этиленоксида (ЕО).
Полоксамеры синтезируют в двухстадийном процессе:
гидрофобное вещество желаемой молекулярной массы образуется путем контролируемого добавления пропиленоксида к двум гидроксильным группам пропиленгликоля; и
этиленоксид добавляли к сэндвичу гидрофобного вещества между гидрофильными группами.
Полоксамерные поверхностно-активные вещества также известны как плюроники.
В Pluronic® F77 процент полиоксиэтилена (гидрофильного) составляет 70%, и молекулярная масса
гидрофобного вещества (полиоксипропилен) составляет приблизительно 2306 Да.
В Pluronic F87 процент полиоксиэтилена (гидрофильного) составляет 70%, и молекулярная масса
гидрофобного вещества (полиоксипропилен) составляет приблизительно 2644 Да.
В Pluronic F88 процент полиоксиэтилена (гидрофильного) составляет 80%, и молекулярная масса
гидрофобного вещества (полиоксипропилен) составляет приблизительно 2644 Да.
В Pluronic F68 процент полиоксиэтилен (гидрофильного) составляет 80%, и молекулярная масса
гидрофобного вещества (полиоксипропилен) составляет приблизительно 1967 Да.
Типичные свойства Pluronic F77 перечислены ниже.
Средняя молекулярная масса: 6600;
Температура плавления/застывания: 48°С;
Физическая форма при 20°С: твердая;
Вязкость (Brookfield) сантипуаз: 480 [жидкости при 25°С, пастообразные при 60°С и твердые при
77°С];
Поверхностное натяжение, дин/см 25°С;
конц. 0,1%: 47,0,
конц. 0,01%: 49,3,
конц. 0,001%: 52,8;
Натяжение на границе раздела фаз, дин/см 25°С против Nujol;
конц. 0,1%: 17,7,
конц. 0,01%: 20,8,
конц. 0,01%: 25,5;
Время смачивания по Дрэйвзу, секунд при 25°С
конц. 1,0%: >360,
конц. 0,1%: >360,
Высота пены
-6-
014585
Проба Росса и Майльса на пенообразующую способность, 0,1%, мм, 50°С: 100;
Проба Росса и Майльса на пенообразующую способность, 0,1%, мм, 26°С: 47;
Динамическая, 0,1%, мм, 400 мл/мин: >600;
Температура помутнения в водном растворе, °С
конц. 1%: >100
конц. 10%: >100
HLB (гидрофильно-липофильный баланс): 25
Типичные свойства Pluronic F87 перечислены ниже:
Средняя молекулярная масса: 7700;
Температура плавления/застывания: 49°С;
Физическая форма при 20°С: твердая;
Вязкость (Brookfield) сантипуаз: 700 [жидкости при 25°С, пастообразные при 60°С и твердые при
77°С];
Поверхностное натяжение, дин/см 25°С;
конц. 0,1%: 44,0,
конц. 0,01%: 47,0,
конц. 0,001%: 50,2;
Натяжение на границе раздела фаз, дин/см, 25°С против Nujol;
конц. 0,1%: 17,4,
конц. 0,01%: 20,3,
конц. 0,01%: 23,3;
Время смачивания по Дрэйвзу, секунд при 25°С
конц. 1,0%: >360,
конц. 0,1%: >360;
Высота пены
Проба Росса и Майльса на пенообразующую способность, 0,1%, мм, 50°С: 80;
Проба Росса и Майльса на пенообразующую способность, 0,1%, мм, 26°С: 37;
Динамическая, 0,1%, мм, 400 мл/мин: >600;
Температура помутнения в водном растворе, °С
конц. 1%: >100,
конц. 10%: >100,
HLB (гидрофильно-липофильный баланс): 24;
Типичные свойства Pluronic F88 перечислены ниже:
Средняя молекулярная масса: 11400;
Температура плавления/застывания: 54°С;
Физическая форма 20°С: твердая;
Вязкость (Brookfield) сантипуаз: 2300 [жидкие при 25°С, пастообразные при 60°С и твердые при
77°С];
Поверхностное натяжение, дин/см 25°С;
конц. 0,1%: 48,5,
конц. 0,01%: 52,6,
конц. 0,001%: 55,7,
Натяжение на границе раздела фаз, дин/см, 25°С против Nujol;
конц. 0,1%: 20,5,
конц. 0,01%: 23,3,
конц. 0,001%: 27,0;
Время смачивания по Дрэйвзу, секунд при 25°С
конц. 1,0%: >360,
конц. 0,1%: >360;
Высота пены
Проба Росса и Майльса на пенообразующую способность, 0,1%, мм, 50°С: 80,
Проба Росса и Майльса на пенообразующую способность, 0,1%, мм, 26°С: 37,
Динамическая, 0,1%, мм, 400 мл/мин: >600;
Температура помутнения в водном растворе, °С;
конц. 1%: >100,
конц. 10%: >100;
HLB (гидрофильно-липофильный баланс): 28;
Типичные свойства Pluronic F68 перечислены ниже:
Средняя молекулярная масса: 8400;
Температура плавления/застывания: 52°С;
Физическая форма 20°С: твердая;
Вязкость (Brookfield) сантипуаз: 1000 [жидкие при 25°С, пастообразные при 60°С и твердые при 77°С];
-7-
014585
Поверхностное натяжение, дин/см 25°С;
конц. 0,1%: 50,3,
конц. 0,01%: 51,2,
конц. 0,001%: 53,6;
Натяжение на границе раздела фаз, дин/см, 25°С в сравнении с Nujol;
конц. 0,1%: 19,8,
конц. 0,01%: 24,0,
конц. 0,01%: 26,0;
Время смачивания по Дрэйвзу, секунд при 25°С
конц. 1,0%: >360,
конц. 0,1%: >360;
Высота пены
Проба Росса и Майльса на пенообразующую способность, 0,1%, мм 50°С: 35;
Проба Росса и Майльса на пенообразующую способность, 0,1%, мм 26°С: 40;
Динамическая, 0,1%, мм 400 мл/мин: >600;
Температура помутнения в водном растворе, °С
конц. 1%: >100,
конц. 10%: >100;
HLB (гидрофильно-липофильный баланс): 29.
Другие полоксамерные полимеры, имеющие свойства, сходные с таковыми, перечисленными выше,
также могут быть использованы в составах по данному изобретению. Предпочтительным полоксамерным поверхностно-активным веществом, присутствующим в составах белка, которые анализируются
данным способом, является Pluronic F68 (=полоксамер 188).
Предпочтительно концентрация Pluronic, особенно Pluronic F68, в жидких составах белка составляет от 0,01 мг/мл или около того до 1 мг/мл или около того, более предпочтительно от 0,05 мг/мл или около того до 0,5 мг/мл или около того, особенно более предпочтительно - от 0,2 мг/мл или около того до 0,4
мг/мл или около того, наиболее предпочтительно 0,1 мг/мл или около того.
Составы белка, анализируемые в соответствии со способом по данному изобретению, имеют pH
между 6,0 или около того и 8,0 или около того, более предпочтительно от 6,8 или около того до 7,8 или
около того, включая в себя pH около 7,0, pH 7,2 и 7,4. Предпочтительным буфером является фосфат, с
предпочтительным противоионом, являющимся ионом натрия или калия. Фосфатные солевые буферы
хорошо известны в данной области техники, такие как фосфатный солевой буфер Дульбекко. Концентрации буферов в суммарном растворе могут варьировать между 5, 9,5, 10, 50, 100, 150, 200, 250 и
500 мМ или около того. Предпочтительно концентрация буфера составляет 10 мМ или около того. Особенно предпочтителен буфер 10 мМ с ионами фосфата и pH 7,0.
Предпочтительно составы FSH, анализируемые в соответствии со способом по данному изобретению, имеют pH между 6,0 или около того и 8,0 или около того, более предпочтительно от 6,8 или около
того до 7,8 или около того, включая в себя pH около 7,0, pH 7,2 и 7,4. Предпочтительным буфером является фосфат с предпочтительными противоионами, являющимися ионами натрия или калия.
Предпочтительно составы смесей FSH и LH, анализируемые в соответствии со способом по данному изобретению, имеют pH между 6,0 или около того и 9,0 или около того, более предпочтительно от 6,8
или около того до 8,5 или около того, включая в себя pH около 7,0, pH 8,0 и 8,2, наиболее предпочтительно на уровне pH 8,0 или около того.
Предпочтительно, составы hCG, анализируемые в соответствии со способом по данному изобретению, имеют pH между 6,0 или около того и 8,0 или около того, более предпочтительно между 6,8 или
около того и 7,8 или около того, включая в себя pH около 7,0, pH 7,2 и 7,4.
Образец белка предпочтительно представляет собой жидкий состав для разового или многодозового
введения. Жидкие составы по данному изобретению, которые предназначены для многодозового применения, предпочтительно включают в себя бактериостатик, такой как фенол, м-крезол, п-крезол, о-крезол,
хлоркрезол, бензиловый спирт, алкилпарааминобензойной кислоты (метил, этил, пропил, бутил и им подобное), тимол, бензалкония хлорид, бензетония хлорид, дегидроацетат натрия и тимеросал. Особенно
предпочтительными являются фенол, бензиловый спирт и м-крезол, более предпочтительными являются
фенол и м-крезол, наиболее предпочтительным является м-крезол. Бактериостатический агент используют в количестве, которое дает концентрацию, эффективную для поддержания состава в целом свободного от бактерий (пригодной для инъекции) в период многодозовых инъекций, который может составлять
от 12 или 24 ч или около того до 12 или 14 дней или около того, предпочтительно от 6 дней или около
того до 12 дней или около того. Бактериостатик предпочтительно присутствует в концентрация от 0,1%
или около того (масса бактериостатика/масса растворителя) до 2,0% или около того, более предпочтительно на уровне 0,2% или около того до 1,0% или около того. В случае бензилового спирта особенно
предпочтительной является концентрация 0,9%. В случае фенола особенно предпочтительной является
концентрация 0,5% или около того. В случае м-крезола особенно предпочтительно является концентрация 0,3% или около того (например, на уровне 3 мг/мл или около того в WFI).
-8-
014585
Колонки для эксклюзионной гель-хроматографии хорошо известны специалистам в данной области
техники. Их выбирают исходя из соответствующего белка и полоксамера в образце. Гель в колонке должен быть матрицей на полимерной основе. Предпочтительной колонкой является колонка SE-HPLC,
имеющая обозначение TSK G3000PW фирмы TosoHaas Inc. Шарики матрицы имеют размер частиц 10
или 17 мкм, размер пор около 200Å. Колонка коммерчески доступна.
Стадия определения может быть выполнена с помощью какой-либо системы определения RI, которая известна специалистам в данной области техники.
Было обнаружено, что в более кислых условиях полоксамер может быть более легко отделен от
белков.
Таким образом, подвижная фаза, используемая в соответствии со способом по данному изобретению, представляет собой водный растворитель, такой как вода или буферный раствор.
В конкретном варианте воплощения pH подвижной фазы устанавливают на уровне ниже чем 7,
предпочтительно ниже чем 3, более предпочтительно между около 1,6 и 2,0, а наиболее предпочтительно
между 1,9 и 2,0. В одном варианте воплощения белок представляет собой гетеродимер, такой как FSH,
CG, LH или TSH. В кислых условиях гетеродимерный белок склонен к распаду на субъединицы, которые
двигаются более легко, улучшая таким образом стадии разделения и детектирования (разрешения). Кислотные агенты, пригодные для установления pH, могут быть подобраны специалистами в данной области техники. Наиболее предпочтительной кислотой является трифторуксусная кислота (TFA).
Обычно, образцы, которые должны быть определены, готовят и инъецируют в колонку. Что касается коэффициента преломления на стадии детектирования по данному способу, получали хроматограмму,
содержащую площадь пика полоксамера, так же как и по меньшей мере еще один пик соответствующий
белку (белкам) и наполнителям. Оценка площади пика позволяет количественную оценку полоксамера,
присутствующего в анализируемом образце. Количественное определение возможно, поскольку готовили стандартную кривую полоксамеров (см. примеры).
Примеры
Здесь данное изобретение будет проиллюстрировано с помощью примеров.
Пример 1 (иллюстрирован чертежом).
Целью данного примера было проанализировать концентрацию полоксамера 188 в образце коммерчески доступного жидкого состава hCG Ovitrelle™ через 18 месяцев хранения при комнатной температуре. Таким образом, оценивали стабильность жидкого состава по отношению к полоксамеру 188. Концентрация полоксамера 188 в момент изготовления составляла около 100 мкг/мл. Протокол количественного
определения полоксамера 188 в Ovitrelle™ был следующим.
Жидкий инъекционный Ovitrelle™ содержал следующие ингредиенты: хорионический гонадотропин-α, маннит, L-метионин, полоксамер 188, фосфорная кислота, NaOH и вода.
1. Оборудование и материалы.
2. Процедура.
2.1. Элюент A (H2O/TFA 0,5%).
-9-
014585
К 950 мл очищенной воды в 1-литровом градуированном цилиндре добавляли 5 мл трифторуксусной кислоты (TFA) и при перемешивании доводили до 1000 мл. pH элюента составлял между 1,7 и 1,9.
2.2. Элюент В (20% этанол).
К 750 мл очищенной воды в 1-литровом градуированном цилиндре добавляли 200 мл этанола и доводили при перемешивании до 1000 мл.
2.3. Отмывочный раствор для автоматической пипетки для отбора проб (10% метанол).
К 850 мл очищенной воды в 1-литровом градуированном цилиндре добавляли 100 мл метанола и
доводили при перемешивании до 1000 мл.
2.4. Растворитель для укупорки (5% метанол).
К 900 мл очищенной воды в 1-литровом градуированном цилиндре добавляли 50 мл метанола и доводили при перемешивании до 1000 мл.
2.5. Раствор для стандартной кривой разбавления (жидкий состав без полоксамера 188).
К 850 мл очищенной воды в 1-литровом градуированном цилиндре добавляли 54,6 г D(-)маннита,
0,98 г 85%-ной орто-фосфорной кислоты и 200 мкг L-метионина. Раствор доводили до pH 7,0 капельным
добавлением 50% гидроксида натрия и доводили до 1 мл. Раствор фильтровали через фильтр 0,45 мкм.
В качестве альтернативы как раствор для стандартной кривой разбавления может быть использована вода.
2.6 Концентрированный раствор для стандартной кривой.
200 мг полоксамера 188 растворяли в 80 мл очищенной воды в градуированном цилиндре на 100 мл
и доводили до 100 мл. Стандартную кривую готовили, основываясь на ожидаемой концентрации в анализируемом образце. В этом примере в жидком инъекционном Ovitrelle™ концентрация полоксамера 188
ожидалась около 100 мкг/мл, таким образом, стандартная кривая построена в диапазоне 50-160 мкг/мл.
3. Приготовление образцов.
Пустой образец.
Инъецировали 0,05 мл раствора для стандартной кривой разбавления.
Образцы.
Все образцы тестировали без какой-либо предварительной обработки и инъецировали 0,05 мл.
4. Эксплуатационные условия.
4.1. Набор инструментов.
Нижеследующие растворы подавали в линии HPLC:
линия А: Элюент A (H2O/TFA 0,5%),
линия В: Элюент В (Этанол 20%).
Линии А и В заполняли, систему продували и промывали при скорости потока 2 мл/мин в течение
3 мин. Включали встроенный дегазатор при наличии такового.
Перед анализом соленоидный клапан детектора RI потока включали в режиме продувки по меньшей мере на 30 мин на линии А. Продувку проточной ячейки выполняли для впуска свежей подвижной
фазы в эталонную часть ячейки.
Соединение колонки с инструментами и ввод следующих параметров:
4.2. Уравновешивание колонки.
Колонку промывают элюентом А для уравновешивания колонки. Уравновешивание заканчивается,
когда базовая линия становится стабильной.
4.3. Хранение колонки.
После завершения анализа колонку промывают по меньшей мере 30 мл очищенной воды, после чего 30 мл 20% этанола.
4.4. Определение концентрации полоксамера 188 в образцах Ovitrelle.
Моделью, использованной для расчета концентрации полоксамера 188 в образцах Ovitrelle, является линейная регрессия.
- 10 -
014585
где Y - общая площадь пика полоксамера 188,
а - величина отрезка,
b - величина угла наклона,
х - концентрация полоксамера 188 в мкг/инъецированный мл.
Пики образца интегрировали, как показано на чертеже.
Рассчитывали величину отрезка (а) и угол наклона (b) стандартной кривой, с помощью математического обеспечения Statgraphics plus рассчитывали линейную регрессию.
Следующую формулу применяли для расчета концентрации полоксамера 188.
Уравнение 1
FD - показатель разбавления.
Решение уравнения 1 дает концентрацию полоксамера 188 в каждом из образцов Ovitrelle, выраженную в мкг/мл.
Концентрация полоксамера, обнаруженная в образцах по данному примеру (см. чертеж), составила
около 94 мкг/мл.
Пример 2.
Цель этого примера состоит в том, чтобы проанализировать концентрацию полоксамера 188 в образце коммерчески доступного жидкого состава hFSH - Gonal-F RFF Pen™ через 18 месяцев хранения
при комнатной температуре. Таким образом, была оценена стабильность жидкого состава, что касается
полоксамера 188.
Концентрация полоксамера 188 в момент приготовления составляла около 100 мкг/мл. Протокол
количественного определения полоксамера 188 в Gonal-F RFF Pen™ был идентичен показанному в примере 1 для Ovitrelle, за исключением того, что скорость потока через колонку составляла 0,75 мл/мин.
Полоксамер мог быть отделен от hFSH и количественно определен отдельно.
Пример 3.
Цель этого примера состоит в том, чтобы проанализировать концентрацию полоксамера 188 в образце коммерчески доступного жидкого состава hGH Serostim™. Протокол был идентичен таковому в
примере 2. Полоксамер мог быть отделен от hGH и количественно определен отдельно.
Пример 4.
Целью этого примера был анализ концентрации полоксамера 188 в образце жидкого состава hlFN-β.
Протокол был идентичен таковому примера 2.
Полоксамер мог быть отделен от hlFN-β и количественно определен отдельно.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ количественного определения полоксамера в жидком образце белка, предусматривающий
стадии, в ходе которых упомянутый образец повергается:
(a) стадии разделения с помощью колонки эксклюзионной гель-хроматографии;
(b) стадии элюции подвижной фазой и
(c) необязательно, стадии детектирования полоксамера,
где белок имеет молекулярную массу 5-70 кДа, предпочтительно 20-70 кДа, при этом pH подвижной фазы, используемой на стадии элюции, установлен ниже 3.
2. Способ по п.1, в котором полоксамер представляет собой полоксамер 188.
3. Способ по п.1 или 2, в котором белок представляет собой гетеродимерный белок.
4. Способ по п.3, в котором белок представляет собой гонадотропин, выбранный из FSH, LH, hCG,
TSH.
5. Способ по п.1 или 2, в котором анализируемый белок представляет собой интерферон-β или гормон роста (GH).
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором образец представляет собой водную фармацевтическую
композицию, содержащую FSH, LH, hCG, TSH, GH или интерферон-β.
7. Способ по любому из пп.1-6, в котором подвижной фазой является водный, в частности буферный, растворитель.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором pH подвижной фазы установлен около 1,92,0.
9. Способ по любому из пп.1-8, в котором стадия детектирования полоксамера включает анализ коэффициента преломления.
10. Способ по любому из пп.1-9, в котором колонка эксклюзионной гель-хроматографии представляет собой колонку SE-HPLC, заполненную матрицей на полимерной основе, содержащей шарики.
11. Способ по п.10, в котором шарики в матрице имеют размер частиц 10 или 17 мкм.
12. Способ по п.10 или 11, в котором шарики матрицы имеют размер пор около 200 Å.
- 11 -
014585
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 12 -