Информация для специалистов

3
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
GLP
F
fd(s)
М
pd(s)
АД
АлАТ
АсАТ
в/м
ЖКТ
ЛД50
ЛДГ
МК
МИБП
ЦНС
ЩФ
СОЭ
СПП
ЧСС
ЭКГ
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
«Good Laboratory Practice» — «Добротная лабораторная практика»
female — самка
fissura dextra (sinistra) — глазная щель левая (правая)
male — самец
pupilla dexter (sinister) — зрачок правый (левый)
артериальное давление
аланинаминотрансфераза
аспартатаминотрансфераза
внутримышечно
желудочно-кишечный тракт
среднесмертельная доза
лактатдегидрогеназа
массовый коэффициент
медицинский иммунобиологический препарат
центральная нервная система
щелочная фосфатаза
скорость оседания эритроцитов
суммационно-пороговый показатель
частота сердечных сокращений
электрокардиограмма
4
РЕФЕРАТ
Отчет изложен на 57 страницах машинописного текста, содержит 37 таблиц и
включает 19 литературных источников.
В нем представлены результаты экспериментальных исследований общей токсичности (острой и подострой) при внутримышечном введении воспроизведенного препарата «Гонадотропин менопаузный, лиофилизат для приготовления раствора для
внутримышечного введения, 75 МЕ ФСГ + 75 МЕ ЛГ» (серия 011207, годен до
01.2011 г.), разработанного и выпускаемого ООО МЦ «Эллара» (Владимирская область, Петушинский район, г. Покров). Исследования проведены в сравнении с препаратом-аналогом «Пергонал» производства фирмы «Лаборатуар Сероно С.А»
(Швейцария), (рег. № П№ 014808/01-2003, серия 906233, годен до 02.2010 г.).
Показано, что воспроизведенный препарат малотоксичен и в условиях длительного (14 суток) непрерывного применения не вызывает нарушений физиологических и
биохимических показателей у крыс, не оказывает негативного воздействия на внутренние органы. Лекарственная форма препарата при внутримышечном введении не
вызывает раздражающего действия.
Для всех исследованных показателей действие «Гонадотропина менопаузного»
сравнивалось с действием зарегистрированного в России препарата-аналога. В этих
тестах степень изменения показателей, вызванная обоими препаратами, была практически одинакова: ни в одном случае достоверных различий между препаратами не
отмечалось.
По показателям острой токсичности и результатам исследования подострой токсичности лекарственная форма «Гонадотропина менопаузного» является биоэквивалентной (эквитоксичной) препарату-аналогу.
Ключевые слова:
«Гонадотропин менопаузный»; «Пергонал»;
безопасность; общая токсичность; доклинические
испытания
5
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................ 6
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ ........................................................................................................... 11
1. Материалы и методы .................................................................................................. 11
1.1. Животные и их содержание............................................................................... 11
1.2. Обработка данных .............................................................................................. 11
1.3. Перечень регистрируемых показателей ........................................................... 14
2. Исследование острой токсичности............................................................................ 19
2.1. Токсикометрия .................................................................................................... 19
2.2. Клиническая картина интоксикации ................................................................ 21
2.3. Данные вскрытия (некропсии) .......................................................................... 22
3. Исследование подострой токсичности ..................................................................... 26
3.1. Протокол исследования ..................................................................................... 26
3.2. Влияние на ректальную температуру .............................................................. 27
3.3. Влияние на офтальмологические показатели .................................................. 28
3.4. Влияние на сердечно-сосудистую деятельность............................................. 29
3.5. Влияние на суммационно-подпороговый показатель .................................... 31
3.6. Влияние на статико-силовую выносливость (мышечную силу) ................... 32
3.7. Влияние на двигательную и исследовательскую активность ........................ 32
3.8. Влияние на массу тела, потребление корма, воды, выделение
мочи и экскрементов .......................................................................................... 35
3.9. Влияние на биохимические показатели крови ................................................ 38
3.10. Влияние на состав периферической крови и характер
миелограммы ...................................................................................................... 43
3.11. Данные патоморфологического исследования................................................ 49
3.12. Результаты гистологического исследования ................................................... 52
4. Изучение пирогенности .............................................................................................. 55
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................................... 56
ЛИТЕРАТУРА ..................................................................................................................... 57
6
ВВЕДЕНИЕ
Препарат «Гонадотропин менопаузный, лиофилизат для приготовления раствора
для внутримышечного введения, 75 МЕ ФСГ + 75 МЕ ЛГ» (далее — «Гонадотропин
менопаузный») воспроизведен и выпускается ООО МЦ «Эллара» (Владимирская область, Петушинский район, г. Покров). В настоящем исследовании предстояло сравнить токсичность воспроизведенного препарата с зарегистрированным в РФ препаратом-аналогом.
Состав:
Менотропин менопаузный ("ББТ Биотех ГмбХ", Германия) -75 МЕ ФСГ + 75 МЕ
ЛГ.
Моногидрат лактозы (Европейская Фармакопея) - 10,0 мг.
Растворитель — 0,9 % раствор натрия хлорида для инъекций.
Состав: Натрия хлорид – 9,0 г , Вода для инъекций - до 1,0 л.
Активное вещество: фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) + лютеинизирующий гормон (ЛГ): 75 МЕ ФСГ + 75 МЕ ЛГ.
Вспомогательные вещества: лактоза, вода для инъекций.
Растворитель (0,9 % раствор натрия хлорида):
Активное вещество: натрия хлорид – 9 г.
Вспомогательное вещество: вода для инъекций до 1 л.
Фармакотерапевтическая группа: Фолликулостимулирующее и лютеинизирую-щее средство.
Группа менотропинов, содержит фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормоны в соотношении 1:1, полученные экстрагированием из мочи женщин в
период постменопаузы
Фармакологическое действие:
Препарат из менопаузного человеческого гонадотропина, относящийся к группе
менотропинов, содержит фолликулостимулирующий (ФСГ) и лютеинизирующий
(ЛГ) гормоны в соотношении 1:1, которые получают методом экстракции из мочи
женщин в период постменопаузы.
У женщин гонадотропин стимулирует рост и созревание фолликулов яичника,
повышает уровень эстрогенов, стимулирует пролиферацию эндометрия.
У мужчин стимулирует сперматогенез, воздействуя на клетки Сертоли семенных
канальцев.
Кроме того, препарат стимулирует выработку стероидных гормонов половыми
железами.
7
Показания к применению:
У женщин:
- при бесплодии, обусловленном гипоталамо-гипофизарным нарушениями (с целью стимуляции роста одного доминирующего фолликула);
- при проведении вспомогательных репродуктивных методик для наступления зачатия (стимуляция роста множественных фолликулов).
У мужчин:
- стимуляция сперматогенеза при азооспермии или олигоазооспермии, обусловленными первичным или вторичным гипогонадотропным гипогонадизмом (в сочетании с терапией человеческим гонадотропином).
Противопоказания:
- персистирующее увеличение яичников или возникновение кисты яичников, не
обусловленных наличием синдрома поликистозных яичников;
- аномалии развития половых органов или миома матки, несовместимые
с беременностью;
- гинекологические кровотечения невыясненной этиологии;
- рак яичников, матки или молочной железы;
- первичная недостаточность яичников;
- рак предстательной железы или любые другие андрогенозависимые опухоли
у мужчин;
- беременность;
- период кормления грудью;
- анамнестические сведения о повышенной чувствительности к менотропинам
(в частности, к препаратам Пергонал, Метродин или Профази, содержащим лютеинизирующий и/или фолликулостимулирующий гормоны).
Способ применения и дозы:
Гонадотропин вводят внутримышечно. Раствор для инъекций готовят непосредственно перед введением, используя прилагаемый растворитель. В 1 мл растворителя
может быть растворено до 5 ампул, содержащих активное вещество. Приготовленный
раствор препарата используют немедленно.
Применение у женщин:
При бесплодии, обусловленном гипоталамо-гипофизарными нарушениями, с целью стимуляции роста одного доминирующего фолликула дозу препарата устанавливают индивидуально.
Оптимальную дозу препарата и длительность лечения устанавливают в основании ультразвукового исследования яичников, определения уровня эстрогенов в крови
и моче, а также клинического наблюдения.
8
О созревании фолликула судят по увеличению уровня эстрогенов. Прием Гонадотропина продолжают до достижения адекватного уровня эстрогенов, учитывая следующие данные.
Если общая экскреция эстрогенов с мочой составляет менее 180 нмоль/сут или
если уровень 17-бета-эстрадиола в плазме крови составляет менее 1100 пмоль/л, созревание фолликула считают неадекватным. С другой стороны, если общая экскреция
эстрогенов с мочой равна или превышает 510 нмоль/сут или если уровень 17-бетаэстрадиола плазмы равен или превышает 3000 пмоль/л, то существует повышенный
риск возникновения синдрома гиперстимуляции яичников.
Используют две различные схемы введения препарата.
Первая схема – ежедневное введение препарата. Лечение начинают в первые 7
дней цикла у менструирующих женщин. Ежедневные инъекции препарата в дозе 75
МЕ продолжают до достижения адекватной стимуляции яичников, о чем судят на основании визуализации фолликула с помощью ультразвукового исследования, уровня
эстрогенов и клинического наблюдения. Созревание фолликула обычно достигается в
течение 7-12 дней лечения. При отсутствии адекватной реакции яичников доза Гонадотропин может быть постепенно увеличена, но обычно не более 150 МЕ (при тщательном медицинском наблюдении возможно превышение этой дозы.
Вторая схема – введение препарата через день. Начальная суточная доза составляет 225-375 МЕ. Если адекватная стимуляция яичников не достигается, доза препарата может быть постепенно увеличена.
После проведения лечения препаратом по любой из указанных схем и получении
адекватного (но не чрезмерного) ответа яичников (обычно после достижения максимального уровня 17-бета-эстрадиола в крови), в этот или в на следующий день производят однократную инъекцию человеческого хорионического гонадотропина
(например, препарата Профази в дозе 10000 МЕ), повышающего уровень лютеинизирующего гормона и стимулирующего выброс зрелой яйцеклетки.
Оптимальные условия для зачатия достигаются в случаях, когда пациентка имеет
половое сношение в день введения человеческого хорионического гонадотропина или
в последующие 2-3 дня.
Если овуляция наступает, но беременность не развивается, введение Гонадотропина может быть повторено по одной из приведенных схем в течение, по крайней мере, еще 2 циклов.
При необходимости достичь состояния «суперовуляции» (в случае осуществления вспомогательных репродуктивных методик для наступления зачатия), т.е. стимуляции роста множественных фолликулов, продолжительность введения препарата
может быть большей, чем указано выше.
Применение у мужчин:
При гипогонадотропном гипогонадизме Гонадотропин применяют в тех случаях,
когда предшествующая терапия человеческим хорионическим гонадотропином
9
(например, препаратом Профази) вызвала лишь андрогенную реакцию без признаков
сперматогенеза. При этом продолжают введение человеческого хорионического гонадотропина (например, препарат Профази в дозе 2000 МЕ 2 раза в неделю) и одновременно применяют Гонадотропин в дозе 75 МЕ 3 раза в неделю. При лечении мужского бесплодия и в/м введении допустимо смешивание препарата Профази и Гонадотропин в одном шприце. Это комбинированное лечение проводят минимум в течение
4 мес. Если по его завершении у больного не будет отмечено усиления сперматогенеза, лечение можно продолжить, вводя препарат Профази и по 2000 МЕ 2 раза в неделю, а Гонадотропин в дозе 75-150 МЕ 3 раза в неделю. Состояние сперматогенеза
оценивают ежемесячно, при отсутствии и положительного результата в течение последующих 3 мес лечение прекращают.
При идиопатической нормогонадотропной олигоспермии Гонадотропин менопаузный в дозе 75-150 МЕ вводят 3 раза в неделю в сочетании с человеческим хорионическим гонадотропином (например, препаратом Профази в дозе 5000 МЕ еженедельно). Курс лечения – 3 месяца.
Побочное действие:
Местные реакции: боль в месте инъекции.
Со стороны ЖКТ: желудочно-кишечные расстройства, метеоризм, боль в эпигастральной области или внизу живота.
Со стороны яичников: умеренное (неосложненное) увеличение яичников и образование кист яичников.
Синдром гиперстимуляции яичников: выраженные боли внизу живота, тошнота,
рвота, увеличение массы тела (ранние признаки); гиповолемия, гемоконцентрация,
дисбаланс электролитов, асцит, гемоперитониум, гидроторакс, тромбоэмболический
синдром.
Прочие: лихорадка, артралгии, боль в молочных железах; гинекомастия (у мужчин).
В соответствии с требованиями МЗ СР РФ (письмо генерального директора
Научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств от
28.02.2000 г., исх. № 403) для регистрации воспроизводимых лекарственных средств
необходимо представить результаты сравнительного изучения токсичности нового
препарата с зарегистрированным аналогом. Данная работа была выполнена в ФГУН
«Институт токсикологии» ФМБА России, г. Санкт-Петербург. В качестве препарата
сравнения был использован препарат-аналог «Пергонал» (далее — препарат-аналог)
производства фирмы «Лаборатуар Сероно С.А» (Швейцария).
Объем доклинических испытаний определялся:
–«Руководящими методическими материалами по экспериментальному и клиническому изучению новых лекарственных средств», части 1, 3 (Официальное издание
Фармакологического комитета, М., 1985);
10
–«Правилами доклинической оценки безопасности фармакологических средств
(GLP)» (РД 64-126-91. М., 1992);
–«Методическими указаниями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ» (в книге «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», М., ОАО «Издательство «Медицина», 2005, с. 41-53).
11
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1.1. Животные и их содержание
Эксперименты по изучению острой токсичности выполнялись на белых нелинейных мышах и крысах, подострой токсичности — на крысах. Крысы и мыши поступили из питомника РАМН «Рапполово», Ленинградская область. Крысы массой
160–180 г, возраст 13–14 недель; мыши — 18–20 г, возраст 8–9 недель.
КАРАНТИН
Длительность карантина (акклиматизационного периода) для всех животных составляла 14 дней. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (поведение и общее состояние), дважды в день животных наблюдали в клетках (заболеваемость и смертность). Перед началом исследования животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, были распределены на группы с помощью метода рандомизации. Животные, не соответствующие критериям, были исключены из исследования в течение карантина.
СОДЕРЖАНИЕ ЖИВОТНЫХ
Клетки с животными были помещены в отдельные комнаты. Световой режим: 12
час — свет, 12 час — темнота. Температура воздуха поддерживалась в пределах 19–
25°C, относительная влажность — 50–70%. Температура и влажность воздуха регистрировались ежедневно. При изменении погодных условий контролировался воздухообмен в помещении с помощью анемометра и путем измерения содержания в воздухе углекислого газа и аммиака. Был установлен режим проветривания, обеспечивающий около 15 объемов помещения в час, концентрацию CO2 не более 0.15 объемных %, аммиака — не более 0.001 мг/л.
ЕЖЕДНЕВНЫЙ ОСМОТР
В течение исследования каждое животное осматривалось ежедневно. Осмотр
включал в себя оценку общего поведения и общего состояния животных. При введении препарата осмотр проводился примерно через 1 час после введения.
1.2. Обработка данных
СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТА ПРЕПАРАТА
В основном обработка данных выполнялась с помощью простого сравнения средних по t-критерию Стьюдента. Однако такой метод анализа не всегда позволяет выявить эффект, вызванный применением препарата.
12
В ряде случаев, особенно при наличии естественного тренда показателей (например, прирост массы тела животных за период наблюдения, или изменение поведения
в открытом поле за счет привыкания и т.д.), использовались методы дисперсионного
анализа. Использованная нами модель предполагает, что средние значения некоторого показателя P в экспериментальных группах складываются из следующих слагаемых:
P0
ΔPt
ΔP12
ΔP2
(фон)
— Фоновое (исходное) значение показателя. Во всех
экспериментальных группах оно одинаково.
(тренд)
— Естественные изменения уровня показателя с начала
исследования до момента измерения (за счет роста
животных, смены обстановки, сезонных колебаний,
привыкания и т.д.). Одинаков во всех группах.
(вклад препа— Вклад, обусловленный фактом применения препарарата без учета
та. Одинаков во всех опытных группах, вне зависидозы)
мости от полученной дозы.
(вклад высокой — Дополнительный вклад, описывающий дозовую задозы препарависимость эффекта препарата. Учитывается только в
та)
группе, получающей большую из доз препарата и
суммируется с предыдущим вкладом.
Таким образом, для экспериментальных групп мы имеем следующие суммы:
Фоновые средние во всех группах
Среднее в контрольной группе
Среднее в 1-й опытной группе
Среднее во 2-й опытной группе
= P0
= P0 + ΔPt
= P0 + ΔPt + ΔP12
= P0 + ΔPt + ΔP12 + ΔP2
Здесь под 1-й и 2-й опытными группами подразумеваются группы, получавшие
соответственно меньшую и большую дозу препарата.
Методы дисперсионного анализа позволяют выяснить, отличаются ли статистически достоверным образом значения каких-то из величин ΔPt, ΔP12 и ΔP2 от 0, т.е. имеется ли достоверный вклад того или иного из указанных факторов. Если соответствующий вклад оказывается незначимым, он полагается равным нулю (отбрасывается). Это позволяет уменьшить число неизвестных параметров и увеличить точность
оценки остальных вкладов.
Нас, в первую очередь, интересуют вклады ΔP12 и ΔP2, которые описывают собственно действие препарата. Их интерпретация довольна очевидна:
– если оба вклада ΔP12 и ΔP2 не являются значимыми (не отличаются достоверным образом от 0), то препарат не оказывает эффект;
13
– если значимым является только вклад ΔP12, то препарата оказывает действие,
однако дозовой зависимости не выявляется;
– если значимым является только вклад ΔP2, это говорит о том, что препарат
оказывает действие только в большей из доз; в меньшей дозе его эффект не
проявляется;
– если значимыми оказываются оба вклада, то препарат оказывает достоверный
эффект в обеих дозах, причем имеет место явная дозовая зависимость.
Может оказаться, что статистически достоверным является вклад только одного
из показателей ΔP12 или ΔP2, но не обоих сразу (вклад одного на фоне другого оказывается уже незначимым). В этом случае вопрос обычно решался в пользу вклада P2,
хотя некоторый элемент произвола в таком решении остается.
Таким образом, эффект препарата в данной модели описывается двумя параметрами — величинами вкладов ΔP12 и ΔP2. Мы будем говорить, что анализ выявляет
эффект препарата, если хотя бы один из этих вкладов является значимым. Поскольку
вывод о значимости эффекта препарата не относится к какой-то конкретной группе, а
касается всех опытных групп, в этом случае отмечается не какое-то одно групповое
среднее (как это обычно делают при сравнении средних по Стьюденту), а вся строка
таблицы.
Анализ данных для самцов и для самок проводился независимо. Это позволяет не
ограничивать себя заранее какой-то конкретной моделью взаимодействия фактора
пола с остальными факторами. Если для животных разных полов получались разные
результаты, это оговаривалось отдельно.
МЕТОДИКА ОЦЕНКИ ЭКВИВАЛЕНТНОСТИ (ЭКВИТОКСИЧНОСТИ) ПРЕПАРАТОВ
В общем случае сравнение биологического действия исследуемых лекарственных
препаратов относительно «эталонных» препаратов (препаратов-аналогов, ранее известных препаратов, прототипов и т.д.) основывается на сравнении значений показателей их биологического действия Xи и Xс (индекс «и» подразумевает испытуемый
препарат, индекс «с» — препарат сравнения). В качестве таких показателей X может
выступать масса тела, время жизни, уровень гемоглобина и т.д., в зависимости от того, какой именно эффект представляет интерес. В частности, такими показателями
может быть и вклад одного из двух факторов, учитывающих применение препарата, в
указанной выше модели дисперсионного анализа.
Типичным методом сравнения является вычисление отношения:
f = X и / Xс
14
Формальным критерием для признания двух препаратов эквивалентными на основании расчета отношения f является следующий: гипотеза эквивалентности принимается, если:
ƒ
ƒ
ƒ
при P > 0.95 двухсторонний доверительный интервал для значений отношения f лежит в пределах 0.90–1.10, или
среднее значение f находится в пределах 0.90–1.10, а
различия самих показателей Xи и Xс у сравниваемых препаратов являются
статистически недостоверными при P > 0.95.
В «Правилах проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов» ( МЗМП РФ, М.1996, 9 стр.) не оговаривается сравнение произвольных показателей, поэтому здесь используется общая формулировка и выбраны самые жесткие 10% интервалы из упомянутых там допусков.
1.3. Перечень регистрируемых показателей
1.3.1.
Показатели общего состояния
ВЕС ТЕЛА
Точность используемых весов была верифицирована до начала исследования.
Взвешивание животных проводилось в соответствии с протоколом исследования
ПОТРЕБЛЕНИЕ ВОДЫ И ПИЩИ
Для учета потребления воды и пищи крысы помещались в обменные клетки на
сутки.
1.3.2.
Офтальмологическое исследование
При офтальмологическом осмотре оценивалось состояние слизистых оболочек
глаз, роговичные рефлексы, величина зрачка и ширина глазной щели.
1.3.3.
Физиологические исследования
Следующие физиологические тесты были проведены до начала исследования и
на 15-й день:
1. Спонтанная двигательная активность.
2. Тест «открытое поле».
3. Исследование суммационной способности ЦНС.
4. Регистрация ЭКГ во II стандартном отведении.
5. Измерение уровня АД.
15
1.3.4.
Лабораторные исследования
Перечисленные ниже лабораторные исследования были проведены до начала исследования и на 15-й день. Забор крови у животных осуществлялся после 14–15часового голодания.
Накануне забора крови у крыс убирали кормушку с кормом. На следующий день
в 9.00–10.00 животных умерщвляли декапитацией с помощью гильотины и собирали
кровь.
ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
Гематокрит.
Гемоглобин.
Количество эритроцитов.
Средний объем эритроцитов (вычисляется).
Среднее содержание гемоглобина в эритроците (вычисляется).
Средняя концентрация гемоглобина в эритроците (вычисляется).
СОЭ.
Количество лейкоцитов.
Лейкограмма.
Тромбоциты.
Ретикулоциты.
БИОХИМИЯ СЫВОРОТКИ КРОВИ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Общий белок.
Аспартатаминотрансфераза (АсАТ).
Аланиномионтрансфераза (АлАТ).
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ).
Щелочная фосфатаза.
Мочевина.
Креатинин.
Глюкоза.
Общие липиды.
Холестерин.
Билирубин и его фракции.
Натрий, калий, кальций.
КОАГУЛОГРАММА
1. Продолжительность свертывания.
2. Начало свертывания.
3. Окончание свертывания.
16
МИЕЛОГРАММА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
Эритробласты.
Пронормобласты.
Базофильные нормобласты.
Полихроматофильные нормобласты.
Оксифильные нормобласты.
Мегакариобласты.
Мегакариоциты.
Миелобласты.
Промиелобласты.
Промиелоциты.
Метамиелоциты.
Палочкоядерные нейтрофилы.
Сегментоядерные нейтрофилы.
Эозинофилы.
Базофилы.
Лимфоциты.
Плазматические клетки.
Моноциты.
Ретикулоэндотелиальные клетки.
Число митозов красной крови.
Число митозов белой крови.
1.3.5.
Патоморфологическое исследование
Патоморфологическому исследованию подлежали все животные в конце исследования. Патоморфологическое исследование включало в себя некропсию, макроскопическое исследование, взвешивание и гистологическое исследование внутренних органов. Некропсия выполнялась под непосредственным наблюдением патоморфолога.
После эвтаназии животные были тщательно обследованы на предмет наружных патологических признаков. Осмотр места введения позволил оценить местнораздражающее действие исследуемого препарата. Было проведено исследование состояния грудной и брюшной полости и макро- и микроскопическое исследование
внутренних органов.
ПЕРЕЧЕНЬ ОРГАНОВ, ПОДЛЕЖАВШИХ ВЗВЕШИВАНИЮ:
1.
2.
3.
4.
5.
Сердце.
Легкие без или с трахеей.
Тимус.
Печень.
Селезенка.
17
6. Почки.
7. Надпочечники.
8. Яички (два) — самцы.
9. Яичники (два) — самки.
10. Головной мозг.
Точность используемых весов была верифицирована до начала исследования.
ПЕРЕЧЕНЬ ОРГАНОВ, ПОДЛЕЖАВШИХ МАКРОСКОПИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ:
1. Лимфатические узлы.
2. Молочные железы — самки.
3. Аорта.
4. Сердце.
5. Гортань.
6. Трахея.
7. Легкие с бронхами (два).
8. Тимус.
9. Пищевод.
10. Желудок (железистый и агранулярный отделы).
11. 12-перстная кишка.
12. Тонкий кишечник.
13. Толстый кишечник.
14. Печень (две доли).
15. Поджелудочная железа.
16. Селезенка.
17. Почки (две).
18. Надпочечники.
19. Мочевой пузырь.
20. Матка (оба рога и шейка) — самки.
21. Яички вместе с эпидидимусами (два) — самцы.
22. Яичники (два) — самки.
23. Подчелюстная слюнная железа с лимфатическими узлами.
24. Щитовидная/паращитовидная железа.
25. Головной мозг (3 отдела: передний, средний и задний).
26. Кожа и мышцы в местах инъекций.
ПЕРЕЧЕНЬ ОРГАНОВ, ПОДЛЕЖАВШИХ ГИСТОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ:
1.
2.
3.
4.
Аорта.
Сердце.
Трахея.
Легкие с бронхами.
18
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Тимус.
Пищевод.
Желудок.
Поджелудочная железа.
Печень (две доли).
Селезенка.
Почки (две).
Надпочечники (два).
Яички вместе с эпидидимусами (два) — самцы.
Яичники (два) — самки.
Подчелюстная слюнная железа с лимфатическими узлами.
Щитовидная железа.
Головной мозг (3 отдела: передний, средний и задний).
Кожа и мышцы в местах инъекций.
19
2. ИССЛЕДОВАНИЕ ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ
Определение показателей острой токсичности включало эксперименты на грызунах (мышах, крысах). Животные распределялись по группам случайным образом методом рандомизации. В качестве критериев приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков заболеваний и гомогенность групп по весу тела (± 10%).
Введение обоих препаратов — исследуемого препарата «Гонадотропин менопаузный» и препарата сравнения — осуществляли внутримышечно (в/м) в мышцы бедра с соблюдением правил асептики. Для этого содержимое флакона или ампулы разводили в 1 мл прилагаемого растворителя. Для достижения больших доз препараты
вводили повторно с интервалом в 20-30 минут в разные мышечные группы.
Для исследования каждой дозы препарата использовались группы по 6 животных
одного пола. Кроме того, имелись аналогичные по численности группы контрольных
животных каждого пола, которым вводили эквивалентные объемы физиологического
раствора.
Период наблюдения составлял 14 суток.
Регистрируемые показатели: летальность, время гибели животных, симптоматика
отравления, ежедневное наблюдение общего состояния и поведения, взвешивание,
потребление корма и воды, вскрытие и макроскопическое описание погибавших и
всех выживших животных в конце исследования (эвтаназия осуществлялась передозировкой эфира), определение массовых коэффициентов внутренних органов.
2.1. Токсикометрия
Зависимые от доз эффекты исследуемого препарата и препарата сравнения представлены в таблицах 2.1.1–2.1.4.
Полученные данные показывают, что половых различий в показателях острой
токсичности у обоих препаратов не проявляется.
Таблица 2.1.1
Летальные эффекты (пало/всего) препаратов при в/м введении мышам-самцам
Доза, МЕ/кг
500
1000
2000
5000
8000
10000
«Гонадотропин
менопаузный»
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
Препарат-аналог
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
20
Таблица 2.1.2
Летальные эффекты (пало/всего) препаратов при в/м введении мышам-самкам
Доза, МЕ/кг
500
1000
2000
5000
8000
10000
«Гонадотропин
менопаузный»
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
Препарат-аналог
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
Таблица 2.1.3
Летальные эффекты (пало/всего) препаратов при в/м введении крысам-самцам
Доза, МЕ/кг
100
200
500
1000
1500
2000
«Гонадотропин
менопаузный»
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
Препарат-аналог
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
Таблица 2.1.4
Летальные эффекты (пало/всего) препаратов при в/м введении крысам-самкам
Доза, МЕ/кг
100
200
500
1000
1500
2000
«Гонадотропин
менопаузный»
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
Препарат-аналог
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
Как можно видеть, летальности достичь не удалось. Дозу 2000 МЕ/кг превысить
не удалось, так как одному животному приходилось вводить до 3 ампул препарата.
Таким образом, по показателям острой токсичности оба препарата являются малотоксичными и практически эквивалентными.
Следовательно, можно заключить, что уровни доз препаратов, вызывающие летальные эффекты при в/м пути введения, находятся заведомо выше 2000 МЕ/кг для
крыс. Учитывая, что максимальная терапевтическая доза для человека составляет
150 МЕ (приблизительно 2 МЕ/кг), можно заключить, что дозы «Гонадотропина менопаузного» в 1000 раз большие нетоксичны для теплокровных лабораторных животных.
21
2.2. Клиническая картина интоксикации
У животных, получавших препараты, как мышей, так и крыс, в течение первых
суток отмечались заторможенность, вялость, снижение потребления корма и воды,
более выраженные при более высоких дозах (большем числе введений). Аналогичное
состояние отмечалось и у животных контрольных групп. Последнее позволяет предполагать, что ухудшение общего состояния животных являлось не результатом токсического действия препарата, а связано со стрессом, вызванным многократными в/м
инъекциями.
На протяжении последующего периода наблюдения общее состояние и поведение
животных всех экспериментальных групп нормализовалось и соответствовало обычному. Различий по этим показателям между опытными и контрольными группами не
отмечалось.
Результаты измерения массы тела животных всех экспериментальных групп
представлены в таблицах 2.2.1 и 2.2.2.
Таблица 2.2.1
Влияние острого введения сравниваемых препаратов на массу
тела мышей, г (M±m)
Группы
Контроль
Время
наблюдения
«Гонадотропин
менопаузный»
Препарат-аналог
M
F
M
F
M
F
Фон
19.9±0.4
19.4±0.1
19.6±0.5
18.8±0.3
20.9±0.5
18.5±0.09
2-й день
20.1±0.4
18.6±0.4
20.1±0.1
20.8±0.09
20.3±0.2
18.3±0.5
7-й день
20.0±0.3
20.6±0.3
20.2±0.1
21.4±0.4
21.9±0.3
21.2±0.2
14-й день
21.4±0.5
20.8±0.4
20.6±0.4
22.1±0.1
22.5±0.2
22.0±0.5
Таблица 2.2.2
Влияние острого введения сравниваемых препаратов на массу тела крыс, г (M±m)
Группы
Контроль
Время
наблюдения
M
«Гонадотропин
менопаузный»
F
M
F
Препарат-аналог
M
F
Фон
184.1±4.4
181.0±2.2
182.9±4.6
197.2±2.9
181.4±3.2
180.8±2.6
2-й день
186.4±3.5
188.7±3.1
187.9±4.7
179.5±4.0
175.7±4.4
192.2±2.5
7-й день
198.4±4.4
185.8±3.0
197.1±5.5
191.7±3.2
197.8±4.8
202.1±2.9
14-й день
205.3±4.4
210.9±3.7
207.9±5.1
198.0±2.8
198.4±3.5
199.7±2.7
22
Анализ полученных данных показывает некоторое снижение средней массы тела
у всех животных, получавших препараты, на второй день после введения. Этот эффект был более заметен у крыс, чем у мышей. В обоих случаях он не являлся статистически значимым. В последующие дни динамика массы тела опытных животных во
всех группах не отличалась от контроля.
Достоверных различий в динамике массы тела в группах животных, получавших
сравниваемые препараты, также не выявляется.
2.3. Данные вскрытия (некропсии)
На вскрытии крыс и мышей, умерщвленных в конце эксперимента (через 14
дней), а также на вскрытии контрольных животных, умерщвленных тем же способом,
различий между ними не установлено.
Шерсть опытных животных имела опрятный вид, была блестящей, без очагов облысения. Питание животных было удовлетворительным.
Кожа, подкожная клетчатка и мышцы в месте введения препарата изменений не
представляли. Раздражения или некроза тканей в месте введения не наблюдалось. Регионарные лимфатические узлы не изменены.
При осмотре грудной и брюшной полостей нарушений в расположении внутренних органов не отмечалось.
Подчелюстные лимфатические узлы и слюнные железы имели овальную или
округлую форму, однородный розоватый или желтоватый цвет и умеренную плотность.
Щитовидная железа плотно прилежала к гортани, имела обычные размеры и
плотность, розовато-красноватый цвет. Тимус имел треугольную форму, беловатый
цвет и умеренно плотную консистенцию.
Величина и форма сердца изменений не представляли. Мышца сердца была коричневатой, плотной.
Поверхность легких имела бледно-розовую окраску; легкие спадались при вскрытии грудной клетки. Ткань на разрезе также имела однородную бледно-розовую
окраску. Слизистая оболочка внелегочных бронхов была гладкой, блестящей, бледнорозовой.
Селезенка имела темно-вишневый цвет, гладкую поверхность и плотноватую консистенцию.
Желудок имел обычную форму и размеры, просвет был заполнен плотным пищевым содержимым. Слизистая тела желудка была бледно-розовой, блестящей, складчатой. Слизистая тонкой и толстой кишки была блестящей, гладкой.
Поджелудочная железа была бледно-розовой, дольчатой.
Величина и форма печени изменений не представляли. Капсула печени была тонкой, прозрачной. Ткань печени имела коричневатый цвет и умеренно плотную консистенцию.
23
Величина и форма почек не отличались от контроля, капсула легко снималась.
Поверхность органа была гладкой, однородной коричневато-сероватой окраски. На
разрезе почек отчетливо различались корковое и мозговое вещество.
Форма, размеры и плотность надпочечников, яичников или яичек не отличались
от контроля.
Оболочки головного мозга были тонкими, прозрачными. Вещество головного
мозга имело умеренную плотность. Расширения желудочков мозга не наблюдалось.
В таблицах 2.3.1 и 2.3.2 приведены массовые коэффициенты внутренних органов
мышей и крыс, усредненные по группам.
Таблица 2.3.1
Массовые коэффициенты (МК) органов у выживших белых мышей при остром
введении сравниваемых препаратов (г/кг веса тела)
Группы
Контроль
Орган
«Гонадотропин
менопаузный»
Препарат-аналог
M
F
M
F
M
F
Сердце
3.2±0.3
3.4±0.4
3.8±0.09
3.3±0.3
3.4±0.4
3.7±0.4
Легкие с трахеей
6.5±0.4
6.9±0.2
5.9±0.2
6.6±0.3
6.6±0.5
6.6±0.1
Тимус
0.90±0.04 0.86±0.06 0.85±0.04 0.89±0.07 0.89±0.09 0.83±0.07
Печень
40.1±0.7
36.4±1.5
40.0±2.7
36.7±2.5
38.2±0.6
37.3±1.3
Селезенка
3.0±0.09
3.3±0.09
3.4±0.5
3.4±0.4
3.1±0.1
3.0±0.2
Почка (левая)
4.4±0.2
4.2±0.4
4.4±0.4
4.6±0.09
4.3±0.3
4.3±0.3
Надпочечники
0.17±0.02 0.18±0.01 0.19±0.01 0.16±0.01 0.20±0.02 0.17±0.01
Головной мозг
15.7±0.6
15.8±0.4
15.8±0.3
16.4±0.6
14.1±0.3
15.6±0.7
Яички или яичники
4.2±0.09
0.27±0.03
3.4±0.4
0.20±0.01
3.4±0.1
0.20±0.03
24
Таблица 2.3.2
Массовые коэффициенты (МК) органов у выживших белых крыс при остром
введении сравниваемых препаратов (г/кг веса тела)
Группы
Контроль
Орган
«Гонадотропин
менопаузный»
Препарат-аналог
M
F
M
F
M
F
Сердце
3.8±0.3
4.1±0.4
4.1±0.5
4.0±0.3
4.3±0.1
4.4±0.2
Легкие с трахеей
7.1±0.2
7.2±0.8
7.7±0.3
8.4±0.7
7.8±0.1
8.4±0.6
Тимус
1.37±0.14
1.28±0.07
1.42±0.12
1.28±0.09
1.26±0.07
1.26±0.11
Печень
36.5±1.5
35.9±1.9
38.4±1.6
35.7±2.0
33.0±2.1
35.3±1.5
Селезенка
4.2±0.1
4.5±0.3
3.6±0.1
3.8±0.1
4.0±0.4
3.5±0.4
Почка (левая)
4.5±0.09
4.4±0.2
4.5±0.09
4.5±0.3
4.9±0.2
4.5±0.09
Надпочечники
0.11±0.02
0.09±0.01
0.09±0.02
0.09±0.01
0.10±0.01
0.12±0.01
Головной мозг
8.8±0.6
8.3±0.2
8.8±0.1
8.8±0.1
8.5±0.2
8.9±0.2
0.32±0.02
12.4±0.09
0.28±0.01
12.1±0.4
0.24±0.03
Яички или яичники 13.4±0.09
Анализ величин массовых коэффициентов не выявил каких-либо достоверных отличий как между группами животных, получавшими два сравниваемых препарата,
так и по отношению к контрольной группе.
Таким образом, результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 дней после острого введения, а
также данные некропсии, позволяют отнести «Гонадотропин менопаузный» к
малотоксичным лекарственным веществам (H. Hodge et al. Clinical Toxicology of
Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimore, 1975, 427 p.; K.K. Сидоров,
1973).
Проведенные исследования свидетельствуют об отсутствии различий по показателям острой токсичности между препаратом «Гонадотропин менопаузный» производства ООО МЦ «Эллара» и зарегистрированным препаратоманалогом. Состояние животных после острого введения нового препарата свидетельствует о его хорошей переносимости и безвредности в дозах, превышающих максимальные для человека сотни и тысячи раз.
Это свидетельствуют об отсутствии противопоказаний по показателям
острой токсичности для клинических испытаний лекарственной формы препарата «Гонадотропин менопаузный».
25
Таблица 2.3.3
Степени токсичности лекарственных средств (по Hodge и Sterner)
Степень
токсичности
Термин
ЛД50, однократно
per os, крысы
(мг/кг)
ЛД50, однократно
i/v*, крысы (мг/кг)
1
Чрезвычайно токсично
<1
< 0.1
2
Высокотоксично
1-50
0.1-50
3
Умереннотоксично
50-500
5-50
4
Малотоксично
500-5000
50-500
5
Практически нетоксично
5000-15000
500-1500
6
Относительно безвредно
> 15000
> 1500
* – градации степеней токсичности при внутривенном пути введения определяются
посредством умножения значений стандартных доз для оценки токсичности препарата при пероральном пути введения на коэффициент 0.1
26
3. ИССЛЕДОВАНИЕ ПОДОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ
3.1. Протокол исследования
Учитывая малую токсичность препаратов, показанную в остром эксперименте,
рекомендации нормативных документов РФ и правил GLP, а также исходя из длительности, кратности применения у человека и величины максимальной однократной
дозы (2 МЕ/кг), для оценки подострой токсичности был выбран срок 14 дней.
Все полученные экспериментальные данные были подвергнуты статистической
обработке с применением t-критерия Стьюдента и F-критерия Фишера.
Постановка исследований включала следующие позиции:
ЖИВОТНЫЕ
Крысы обоего пола, нелинейные, масса 180–190 г.
ПУТЬ ВВЕДЕНИЯ
Внутримышечно.
ДОЗЫ
1 доза — 40 МЕ/кг (в 20 раз превышающая максимальную терапевтическую
дозу для человека).
2 доза — 400 МЕ/кг (в 200 раз превышающая максимальную терапевтическую
дозу для человека).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ГРУППЫ
«Гонадотропин менопаузный»
1 доза — 15 самцов, 15 самок;
2 доза — 15 самцов, 15 самок.
Препарат-аналог
1 доза — 15 самцов, 15 самок;
2 доза — 15 самцов, 15 самок.
Контроль — 15 самцов, 15 самок.
Общее количество — 150 животных, из них 30 — контрольная группа.
ДЛИТЕЛЬНОСТЬ НАБЛЮДЕНИЯ
Общая продолжительность введения и наблюдения — 14 дней.
После окончания введения животные всех групп были забиты передозировкой
эфира и направлены на вскрытие и патоморфологическое исследование.
РЕГИСТРАЦИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
Общее состояние оценивалось при ежедневном осмотре животных. Взвешивание,
измерение ректальной температуры, потребления воды и корма выполнялось раз в
неделю и после окончания введения.
27
Физиологические, гематологические и биохимические исследования проводились
до начала опыта и через 14 дней после начала исследования.
Исследования костного мозга, макроскопическое и гистологическое исследование
внутренних органов проводилось посмертно после окончания введения.
Все исследования проводились по общепринятым клиническим и физиологическим методам.
3.2. Влияние на ректальную температуру
Данные измерения ректальной температуры крыс (по 10 животных каждого пола
из экспериментальных групп) с помощью электрического медицинского термометра
ТПЭМ-1 (допустимая основная погрешность от диапазона измеряемых температур,
% ± 1) представлены в таблицах 3.2.1. и 3.2.2.
Таблица 3.2.1
Влияние «Гонадотропина менопаузного» на температуру тела белых крыс
(оС, М±m)
Сроки
исследования
(дни)
Экспериментальная группа и пол
Контроль
M
F
40 МЕ/кг
M
F
400 МЕ/кг
M
F
Фон
35.5±0.2 36.6±0.1 35.6±0.2 35.4±0.1 36.0±0.1 35.6±0.2
7-й день
36.9±0.2 36.1±0.2 36.3±0.1 35.8±0.3 35.9±0.1 35.6±0.1
14-й день
35.9±0.2 36.3±0.1 36.3±0.1 36.7±0.1 36.6±0.2 35.9±0.1
Таблица 3.2.2
Влияние препарата-аналога на ректальную температуру
белых крыс (°С, М ± m)
Сроки
исследования
(дни)
Экспериментальная группа и пол
Контроль
M
F
40 МЕ/кг
M
F
400 МЕ/кг
M
F
Фон
35.5±0.2 36.6±0.1 36.0±0.3 35.4±0.1 36.2±0.2 35.9±0.1
7-й день
36.9±0.2 36.1±0.2 35.7±0.2 36.1±0.1 36.9±0.1 36.6±0.1
14-й день
35.9±0.2 36.3±0.1 36.6±0.1 36.1±0.1 35.5±0.1 35.9±0.2
Результаты измерения ректальной температуры свидетельствуют о том, что у животных всех экспериментальных групп, включая контрольную, температура не отличалась от фоновых данных.
28
3.3. Влияние на офтальмологические показатели
При офтальмологическом исследовании у животных оценивали состояние слизистых оболочек, наличие правильных роговичных рефлексов, измеряли величину
зрачка (p) и ширину глазной щели (f) левого (s) и правого (d) глаз. В течение 14дневного наблюдения у животных контрольной и опытных групп отечности или гиперемии слизистых не отмечалось.
В таблицах 3.3.1 и 3.3.2 представлены результаты измерения величины зрачка и
ширины глазной щели. Как видно из таблиц, указанные параметры ни у животных
контрольной группы, ни у подопытных животных почти не менялись в течение всего
периода наблюдения. Достоверных отличий от контроля не наблюдалось.
Таблица 3.3.1
Влияние препарата «Гонадотропин менопаузный» на величину зрачка и
ширину глазной щели у белых крыс (мм, М ± m)
Экспериментальная группа и пол
Показатель
Контроль
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
M
F
M
F
M
F
1.04
±0.05
1.05
±0.10
2.80
±0.09
2.70
±0.15
1.05
±0.09
1.08
±0.04
2.82
±0.14
2.75
±0.11
1.02
±0.04
0.98
±0.04
2.83
±0.11
2.90
±0.14
0.95
±0.05
1.01
±0.02
2.87
±0.10
2.98
±0.1
1.00
±0.05
1.03
±0.02
2.92
±0.15
2.85
±0.12
1.02
±0.05
1.03
±0.05
2.76
±0.13
2.77
±0.13
14-й день
1.13
±0.03
1.15
±0.05
2.76
±0.15
2.74
±0.18
1.12
±0.02
1.16
±0.05
2.68
±0.16
2.81
±0.16
1.07
±0.04
1.17
±0.06
2.82
±0.15
2.89
±0.15
1.08
±0.04
1.18
±0.08
2.98
±0.17
3.02
±0.14
1.09
±0.04
1.12
±0.04
2.90
±0.12
3.01
±0.14
1.08
±0.002
1.09
±0.08
2.96
±0.20
2.97
±0.16
Фон
pd
ps
fd
fs
pd
ps
fd
fs
29
Таблица 3.3.2
Влияние препарата-аналога на величину зрачка и
ширину глазной щели у белых крыс (мм, М ± m)
Экспериментальная группа и пол
Показатель
Контроль
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
M
F
M
F
M
F
1.04
±0.05
1.05
±0.10
2.80
±0.09
2.70
±0.15
1.05
±0.09
1.08
±0.04
2.82
±0.14
2.75
±0.11
0.95
±0.04
1.05
±0.06
2.86
±0.15
2.89
±0.15
1.06
±0.06
1.13
±0.04
2.97
±0.14
2.80
±0.14
1.10
±0.05
1.08
±0.05
2.96
±0.15
2.91
±0.14
0.99
±0.04
1.02
±0.04
2.97
±0.11
2.92
±0.10
14-й день
1.13
±0.03
1.15
±0.05
2.76
±0.15
2.74
±0.18
1.12
±0.02
1.16
±0.05
2.68
±0.16
2.81
±0.16
1.13
±0.04
1.16
±0.04
2.84
±0.18
2.93
±0.15
1.10
±0.001
1.09
±0.07
2.85
±0.23
2.93
±0.15
1.11
±0.04
1.06
±0.06
2.82
±0.12
2.92
±0.18
1.07
±0.03
1.08
±0.08
2.76
±0.21
2.83
±0.20
Фон
pd
ps
fd
fs
pd
ps
fd
fs
3.4. Влияние на сердечно-сосудистую деятельность
Данные по влиянию введения обоих препаратов на систолическое артериальное
давление представлены в таблице 3.4.1.
И у самок, и у самцов контрольной группы наблюдалась тенденция к снижению
АД. В то же время, снижение АД у животных, получавших «Гонадотропин менопаузный», составило порядка 10 и 15 мм рт.ст. на дозе 40 МЕ/кг и 400 МЕ/кг соответственно, а при введении препарата-аналога — 12 и 20 мм рт.ст. на дозе 40 МЕ/кг и
400 МЕ/кг соответственно (при этом дозовая зависимость эффекта является статистически достоверной и выявляется методами дисперсионного анализа, зависимость от
пола не является достоверной).
Данные о влиянии обоих препаратов на частоту сердечных сокращений представлены в таблице 3.4.2.
30
Таблица 3.4.1
Влияние сравниваемых препаратов на систолическое артериальное
давление у белых крыс (мм рт. ст., М ± м)
Сроки
исследования
(дни)
Экспериментальная группа и пол
Контроль
M
40 МЕ/кг
F
M
F
400 МЕ/кг
M
F
«Гонадотропин менопаузный»
Фон
120.3±9.1 119.6±7.9 116.2±3.7 121.0±6.2 117.4±9.0 119.2±3.2
14-й день
118.4±6.5 116.7±6.1 111.5±5.9 105.5±3.7 102.7±3.9 104.7±5.9
Снижение
2.6±0.6
1.8±0.8
6.7±2.1
13.1±3.1
14.8±5.8
16.5±7.3
Препарат-аналог
Фон
120.3±9.1 119.6±7.9 117.3±4.8 122.5±5.5 118.7±7.6 121.6±9.3
14-й день
118.4±6.5 116.7±6.1 106.7±6.7 107.4±6.8 100.8±6.2 98.9±5.0
Снижение
2.6±0.6
1.8±0.8
10.5±4.5
14.0±5.5
18.3±6.0
22.4±8.3
Таблица 3.4.2
Влияние сравниваемых препаратов на ЧСС крыс
Сроки
исследования
(дни)
Экспериментальная группа и пол
Контроль
M
40 МЕ/кг
F
400 МЕ/кг
M
F
M
F
«Гонадотропин менопаузный»
Фон
390±21
387±17
390±18
384±17
375±23
384±22
14-й день
393±19
393±14
407±23
402±19
410±15
411±20
11±3
14±7
27±8
24±6
Увеличение
——
Препарат-аналог
Фон
390±21
387±17
398±15
404±19
373±16
368±14
14-й день
393±19
393±14
414±17
407±21
397±20
403±16
12±3
27±5
24±4
Увеличение
——
Анализ полученных данных подтверждает, что увеличение ЧСС у крыс, получавших препараты, было достоверным. При этом дозовая зависимость эффекта является достоверной.
31
Разницы в степени увеличения ЧСС между сравниваемыми препаратами не выявляется. Без учета пола для препарата «Гонадотропин менопаузный» оно составило
13±4 и 27±8 уд/мин на дозах 40 и 400 МЕ/кг, для препарата-аналога — соответственно 12±3 и 26±6 уд/мин.
3.5. Влияние на суммационно-подпороговый
показатель
Данные по влиянию препаратов на суммацию подпороговых импульсов представлены в таблице 3.5.1.
Таблица 3.5.1
Влияние сравниваемых препаратов на порог возбудимости
у белых крыс (В, М ± м)
Сроки
исследования
(дни)
Экспериментальная группа и пол
Контроль
M
40 МЕ/кг
F
400 МЕ/кг
M
F
M
F
«Гонадотропин менопаузный»
Фон
9.0±1.1
9.2±0.8
9.4±0.5
8.1±0.2
8.5±0.7
8.8±0.6
14-й день
9.0±0.5
8.8±0.7
9.7±0.8
9.8±0.8
9.3±0.9
10.1±0.8
Препарат-аналог
Фон
9.0±1.1
9.2±0.8
8.8±0.9
8.6±0.4
8.7±0.6
8.9±0.1
14-й день
9.0±0.5
8.8±0.7
9.2±1.1
9.0±0.6
8.7±1.1
10.0±1.4
Из таблицы видно, что в обеих опытных группах не наблюдалось увеличения величины СПП по отношению как к фону, так и контролю.
32
3.6. Влияние на статико-силовую выносливость
(мышечную силу)
Таблица 3.6.1
Продолжительность физической выносливости крыс в тесте статической
силовой нагрузки собственным весом (мин, М±m)
Сроки
исследования
(дни)
Экспериментальная группа и пол
Контроль
M
40 МЕ/кг
F
400 МЕ/кг
M
F
M
F
«Гонадотропин менопаузный»
Фон
22.3±1.7
19.2±1.9
19.6±1.6
17.0±2.0
18.9±2.7
18.1±2.3
14-й день
21.3±1.8
21.3±2.0
19.8±2.2
18.1±1.8
19.4±1.7
17.6±2.1
Препарат-аналог
Фон
22.3±1.7
19.2±1.9
19.7±1.5
16.9±2.0
18.6±2.7
18.4±2.3
14-й день
21.3±1.8
21.3±2.0
20.8±1.8
17.9±1.6
19.1±1.7
18.1±1.9
Влияние препаратов на статико-силовую выносливость изучали, регистрируя
время висения крыс на вертикальной сетке. Критерием истощения статической силы
считали время, когда крыса уже не могла удерживать вес своего тела и падала с сетки
вниз. Результаты эксперимента представлены в таблице 3.6.1.
Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что оба препарата в исследованных дозах не изменяют статико-силовую выносливость экспериментальных животных.
3.7. Влияние на двигательную и исследовательскую
активность
В таблицах 3.7.1. и 3.7.2. представлены данные по влиянию «Гонадотропина менопаузного» и препарата-аналога на спонтанную двигательную активность крыс
(СДА). Эксперименты проведены на 6 крысах каждого пола из каждой экспериментальной группы. Крысы по одной помещались в регистрационную камеру автоматического регистратора «Coulburn Instruments», где в течение 35 минут у них регистрировалось количество движений.
33
Таблица 3.7.1
Влияние «Гонадотропина менопаузного» на СДА белых крыс, (М ±m)
Препарат
Время
наблюдения
День регистрации
самцы
самки
фон
14
фон
14
Контроль
0-35
154.1±43.4
178.7±54.4
154.2±52.1
181.9±48.0
40 МЕ/кг
0-35
162.3±38.1
182.4±45.0
163.5±37.3
191.0±44.8
400 МЕ/кг
0-35
153.9±40.1
178.7±47.4
158.6±49.9
177.9±34.7
Таблица 3.7.2
Влияние зарегистрированного аналога на СДА белых крыс, (М ±m)
Препарат
Время
наблюдения
День регистрации
самцы
фон
самки
14
фон
14
Контроль
0-35
154.1±43.4
178.7±54.4
154.2±52.1
181.9±48.0
40 МЕ/кг
0-35
159.2±39.3
178.9±46.0
165.0±38.3
174.3±33.1
400 МЕ/кг
0-35
155.7±39.8
177.5±45.7
159.7±49.9
191.9±43.9
Как видно из таблицы, достоверных изменений двигательной активности после
14-дневного введения «Гонадотропина менопаузного» и препарата-аналога у животных из всех экспериментальных групп не наблюдалось.
Данные по влиянию «Гонадотропина менопаузного» и препарата-аналога на
структуру поведения крыс в «открытом поле» представлены в таблице 3.6.3. Эксперименты были проведены на 8 животных каждого пола из каждой экспериментальной
группы.
Таблица 3.7.3
Влияние «Гонадотропина менопаузного» и препарата-аналога на структуру
поведения белых крыс (М ±m)
Показатели
День наблюдения
самцы
фон
Латентный
период, сек
Горизонтальная
активность
самки
14
фон
14
29.6±15.1
Контроль
47.2±10.4
36.2±9.0
49.4±13.0
20.8±9.4
11.6 ± 5.3
23.5±11.9
9.7±3.6
Продолжение таблицы 3.7.3
34
Вертикальная
активность
Заглядывания
Груминг
Болюсы
Латентный
период, сек
Горизонтальная
активность
Вертикальная
активность
Заглядывания
Груминг
Болюсы
Латентный
период, сек
Горизонтальная
активность
Вертикальная
активность
Заглядывания
Груминг
Болюсы
Латентный
период, сек
Горизонтальная
активность
Вертикальная
активность
Заглядывания
Груминг
Болюсы
Латентный
период, сек
Горизонтальная
активность
Вертикальная
активность
Заглядывания
Груминг
Болюсы
13.9±1.4
9.5±0.6
8.4±2.4
5.7±1.1
10.7±1.8
5.7±0.6
7.2±1.3
1.0± 0.2
1.9±0.3
1.5±0.3
1.0±0.4
1.3±0.4
1.6±0.6
«Гонадотропин менопаузный», 40 МЕ/кг
30.0±10.8
39.8±10.7
33.8±14.1
6.4±0.8
1.4±1.9
2.1±1.4
56.6±15.9
19.6±10.4
12.1±8.4
16.5±3.6
10.5±0.8
12.2±3.8
11.6±0.9
14.0±6.9
10.5±3.5
11.9±6.3
9.9±3.9
10.8±4.7
0
1.3±0.2
0.7±0.2
1.9±0.5
1.5±0.2
1.9±0.3
«Гонадотропин менопаузный», 400 МЕ/кг
31.6±12.5
49.8±21.4
26.3±28.4
9.3±6.3
0.4±0.09
1.5±0.6
56.3±39.4
18.7±5.2
23.1±6.7
21.4±9.5
16.3±2.7
14.2±5.2
10.4±2.1
12.9±2.2
15.2±5.5
11.6±3.4
9.8±4.3
12.1±3.7
0.6±0.2
1.5±0.5
0
2.2±0.8
1.6±0.1
1.9±0.7
Зарегистрированный аналог, 40 МЕ/кг
23.5±10.2
39.2±9.1
33.8±14.0
12.9±3.8
0.3±0.1
1.7±0.09
47.0±25.4
10.0±3.5
21.6±9.7
14.8±3.9
10.1±2.7
13.7±4.0
12.2±2.3
13.9±6.3
11.4±3.4
12.2±3.5
10.9±3.1
10.4±3.9
0
0.9±0.09
0.6±0.8
2.5±0.3
2.1±0.3
1.6±0.6
Зарегистрированный аналог, 400 МЕ/кг
29.2±12.7
53.1±21.9
28.6±26.4
9.9±3.0
0.1±0.2
1.9±0.6
57.8±35.4
20.0±6.8
13.9±10.2
15.3±9.7
20.6±8.0
14.0±5.1
11.1±2.8
13.5±2.0
15.1±4.5
11.2±3.9
0.5±0.09
2.0±0.3
10.0±4.3
0
1.4±0.09
12.0±3.6
1.3±0.3
1.9±0.1
13.5±4.0
0.2±0.1
1.6±0.09
35
Как видно из представленных данных, достоверных изменений в структуре поведения животных из всех экспериментальных групп не наблюдалось. Отмечалось характерное для животных, вторично помещаемых в ситуацию «открытого поля», изменение поведенческого рисунка, в основном, за счет удлинения латентного периода,
носившего недостоверный характер.
3.8. Влияние на массу тела, потребление корма, воды,
выделение мочи и экскрементов
Точность используемых весов (ВЛ-500) была верифицирована до начала исследования. Результаты взвешивания белых крыс представлены в таблицах 3.8.1 и 3.8.2.
Таблица 3.8.1
Влияние препарата «Гонадотропин менопаузный» на массу тела белых крыс (г,
М±m)
Сроки
исследования
(дни)
Экспериментальная группа и пол
Контроль
M
F
40 МЕ/кг
M
F
400 МЕ/кг
M
F
Фон
186±3.0
182±1.9 187±3.9 181±1.7 184±2.9 186±2.9
7-й день
194±3.8
188±2.3 190±3.9 183±2.7 182±3.5 10.4±3.0
14-й день
211±4.6
201±2.5 207±3.4 208±3.0 214±3.0 204±2.5
Таблица 3.8.2
Влияние препарата-аналога на массу тела белых крыс (г, М±m)
Сроки
исследования
(дни)
Экспериментальная группа и пол
Контроль
M
F
40 МЕ/кг
M
F
400 МЕ/кг
M
F
Фон
186±3.0
182±1.9 194±2.9 184±2.5 184±2.7 190±2.9
7-й день
194±3.8
188±2.3 200±2.7 188±2.6 183±2.6 191±2.9
14-й день
211±4.6
201±2.5 210±3.1 205±3.1 207±2.9 209±2.3
Анализ приведенных в таблицах данных показывает, что вес животных равномерно увеличивался на протяжении всего срока исследования как в контрольной, так
и во всех опытных группах. Каких-либо различий, связанных с уровнем дозирования,
не отмечается. Не отмечается также различий между приростом в группах, получавших два сравниваемых препарата.
36
В эти же временные сроки, через 2 часа после введения препаратов, для учета суточного потребления воды и пищи, а также количества выделенной мочи и экскрементов, крысы высаживались в обменные клетки фирмы «Tecniplast Gazzada» на 24
часа. Данные этого эксперимента представлены в таблицах 3.8.3 — 3.8.8.
Таблица 3.8.3
Влияние «Гонадотропина менопаузного» на потребление корма (М±m , г) белыми
крысами в подостром эксперименте
Сроки
исследования
Доза, МЕ/кг
Контроль
40
400
M
F
M
F
M
F
Фон
18.1±1.9
18.5±1.0
17.8±1.4
16.5±1.8
21.0±2.0
19.4±1.8
14 дней
17.6±0.5
17.4±0.9
19.7±1.0
19.7±1.2
18.8±1.1
19.4±1.5
Таблица 3.8.4
Влияние препарата-аналога на потребление корма (М±m , г) белыми крысами в
подостром эксперименте
Доза, МЕ/кг
Сроки
исследования
40
Контроль
400
Фон
M
18.1±1.9
F
18.5±1.0
M
18.3±1.4
F
16.8±2.0
M
21.4±1.9
F
20.3±2.0
14 дней
17.6±0.5
17.4±0.9
18.6±1.0
19.6±1.2
19.0±1.3
18.6±1.2
Таблица 3.8.5
Влияние «Гонадотропина менопаузного» на потребление воды (М±m , мл) белыми
крысами в подостром эксперименте
Доза, МЕ/кг
Сроки
исследования
40
Контроль
400
Фон
M
21.2±1.8
F
20.1±1.9
M
19.6±1.9
F
21.1±1.8
M
23.3±3.9
F
18.0±2.0
14 дней
24.8±2.9
23.0±1.9
19.0±1.7
19.9±3.0
20.3±1.9
20.6±2.7
37
Таблица 3.8.6
Влияние препарата-аналога на потребление воды (М±m , мл) белыми крысами в
подостром эксперименте
Доза, МЕ/кг
Сроки
исследования
40
Контроль
400
Фон
M
21.2±1.8
F
20.1±1.9
M
20.4±1.9
F
19.8±1.9
M
22.3±3.8
F
19.5±2.1
14 дней
24.8±2.9
23.0±1.9
21.3±1.8
22.5±2.6
19.6±1.9
20.5±2.9
Таблица 3.8.7
Количество выделенной мочи и экскрементов у белых крыс при подостром
введении «Гонадотропина менопаузного», (М±m)
Доза, МЕ/кг
Показатели
Контроль
M
40
F
400
M
F
M
F
Фон
Объем
выделенной
мочи, мл
14.0
±1.2
15.1
±1.1
13.4
±0.5
16.1
±0.4
16.0
±0.1
14.8
±0.2
Масса
экскрементов, г
7.6
±0.5
8.6
±0.6
9.0
±0.8
8.7
±0.4
9.8
±0.6
8.2
±0.4
14 дней
Объем
выделенной
мочи, мл
17.6
±1.9
15.4
±2.1
14.7
±2.8
15.7
±2.0
16.5
±3.0
13.8
±2.7
Масса
экскрементов, г
8.3
±0.6
8.8
±0.7
7.9
±0.7
8.8
±0.9
8.1
±1.2
8.3
±0.9
38
Таблица 3.8.8
Количество выделенной мочи и экскрементов у белых крыс при подостром
введении препарата-аналога, (М±m)
Доза, МЕ/кг
Показатели
Контроль
M
40
F
400
M
F
M
F
Фон
Объем
выделенной
мочи, мл
14.0
±1.2
15.1
±1.1
13.4
±1.6
16.0
±0.6
16.6
±1.3
16.0
±0.6
Масса
экскрементов, г
7.6
±0.5
8.6
±0.6
9.6
±0.9
9.8
±0.9
9.9
±1.1
8.5
±1.0
14 дней
Объем
выделенной
мочи, мл
17.6
±1.9
15.4
±2.1
15.4
±2.7
14.8
±2.1
16.4
±2.0
14.8
±1.5
Масса
экскрементов, г
8.3
±0.6
8.8
±0.7
8.7
±1.1
8.7
±1.2
8.6
±0.9
9.2
±1.4
Как видно из представленных результатов, потребление корма и воды возрастало
в течение эксперимента. При этом существенной разницы в исследуемых показателях
в экспериментальных группах по сравнению с контрольными не отмечалось.
3.9. Влияние на биохимические показатели крови
В таблицах 3.9.1 и 3.9.2 представлены данные по влиянию «Гонадотропина менопаузного» и препарата сравнения на основные биохимические показатели крови белых крыс, в таблицах 3.9.3 и 3.9.4 — на активность ферментов и баланс ионов.
Следует отметить, что изменения биохимических показателей не превышали 20%,
т.е. укладывались в диапазон естественного физиологического варьирования.
Сравнение величин эффектов для двух препаратов не выявило достоверных различий между ними. Патологических изменений не отмечалось.
39
Таблица 3.9.1
Влияние препарата «Гонадотропин менопаузный» на основные биохимические
показатели периферической крови белых крыс (М ± m)
Экспериментальная группа и пол
Контроль
Показатель
M
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
F
M
F
M
F
75.9±2.5
80.3±3.4
74.1±3.3
72.6±3.8
75.2±3.5
73.9±4.4
76.6±3.9
74.2±2.9
71.1±4.5
76.0±4.0
77.5±3.0
79.0±4.0
7.0±0.1
6.9±0.2
6.9±0.2
6.9±0.5
6.9±0.2
7.0±0.5
7.3±0.1
7.3±0.5
7.0±0.2
7.4±0.2
7.0±0.3
7.5±0.3
58.7±0.09 57.0±4.4
57.9±1.2
58.2±4.4
58.3±1.5
52.0±7.9
51.3±2.0
53.6±3.4
50.1±3.3
55.9±5.1
52.5±2.4
56.5±7.4
6.3±0.1
6.8±0.09
6.6±0.1
6.9±0.5
6.9±0.2
6.9±0.3
7.1±0.1
6.7±0.1
6.7±0.2
7.0±0.3
6.8±0.3
6.9±0.3
Общий белок, г/л
Фон
15-й день
Мочевина, ммоль/л
Фон
15-й день
Креатинин, мкмоль/л
Фон
15-й день
Глюкоза, ммоль/л
Фон
15-й день
Липиды общие, г/л
Фон
15-й день
2.27±0.15 2.25±0.22 2.29±0.19 2.37±0.23 2.27±0.24 2.28±0.15
2.42±0.23 2.34±0.11 2.52±0.40 2.31±0.56 2.38±0.25 2.49±0.38
Холестерин общий, ммоль/л
Фон
15-й день
1.59±0.11 1.60±0.14 1.61±0.10 1.59±0.09 1.59±0.03 1.57±0.11
1.53±0.10 1.82±0.25 1.53±0.16 1.54±0.16 1.78±0.16 1.54±0.11
Билирубин общий, ммоль/л
Фон
15-й день
12.2±0.1
10.7±0.2
11.5±0.2
12.5±0.2
12.2±0.3
12.4±0.4
10.6±0.8
11.9±0.1
11.1±0.4
11.2±0.2
11.3±0.2
9.9±0.6
Билирубин связанный, ммоль/л
Фон
15-й день
2.85±0.42 3.01±0.23 3.23±0.33 2.69±0.24 3.07±0.22 2.76±0.18
2.54±0.31 2.52±0.33 2.46±0.24 2.40±0.21 2.76±0.28 2.70±0.13
40
Таблица 3.9.2
Влияние препарата-аналога на основные биохимические
показатели периферической крови белых крыс (М ± m)
Экспериментальная группа и пол
Контроль
Показатель
M
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
F
M
F
M
F
75.9±2.5
80.3±3.4
75.7±3.2
74.7±3.5
74.6±4.5
70.4±6.2
76.6±3.9
74.2±2.9
76.2±3.4
75.1±3.8
71.6±4.8
71.3±2.2
7.0±0.1
6.9±0.2
6.9±0.1
6.8±0.3
6.9±0.1
7.0±0.2
7.3±0.1
7.3±0.5
6.8±0.09
7.2±0.3
7.0±0.2
7.0±0.3
58.7±0.09 57.0±4.4
59.3±1.1
59.5±4.3
57.1±1.4
57.2±8.0
51.3±2.0
53.6±3.4
55.3±3.2
56.7±4.9
55.8±2.4
57.1±7.2
6.3±0.1
6.8±0.09
6.5±0.2
6.5±0.3
6.8±0.09
6.7±0.1
7.1±0.1
6.7±0.1
6.5±0.2
6.9±0.2
6.1±0.4
6.9±0.1
Общий белок, г/л
Фон
15-й день
Мочевина, ммоль/л
Фон
15-й день
Креатинин, мкмоль/л
Фон
15-й день
Глюкоза, ммоль/л
Фон
15-й день
Липиды общие, г/л
Фон
15-й день
2.27±0.15 2.25±0.22 2.38±0.28 2.50±0.33 2.40±0.21 2.42±0.24
2.42±0.23 2.34±0.11 2.54±0.42 2.53±0.48 2.33±0.23 2.42±0.24
Холестерин общий, ммоль/л
Фон
15-й день
1.59±0.11 1.60±0.14 1.61±0.11 1.62±0.17 1.59±0.13 1.60±0.14
1.53±0.10 1.82±0.25 1.52±0.15 1.56±0.15 1.59±0.14 1.56±0.11
Билирубин общий, ммоль/л
Фон
15-й день
12.2±0.1
10.7±0.2
9.9±0.2
12.9±0.4
10.4±0.3
10.4±0.2
10.6±0.8
11.9±0.1
9.8±0.2
10.9±0.1
10.1±0.2
10.9±0.4
Билирубин связанный, ммоль/л
Фон
15-й день
2.85±0.42 3.01±0.23 2.92±0.22 2.67±0.18 2.88±0.23 2.84±0.16
2.54±0.31 2.52±0.33 2.56±0.22 2.54±0.19 2.82±0.20 2.76±0.13
41
Таблица 3.9.3
Влияние препарата «Гонадотропин менопаузный» на активность ферментов и
электролитный состав плазмы крови белых крыс (М ± m)
Экспериментальная группа и пол
Показатель
Контроль
M
40 МЕ/кг
F
M
F
400 МЕ/кг
M
F
АсАТ, ммоль/л·ч
Фон
15-й день
0.96±0.06 0.98±0.11 1.10±0.06 1.06±0.17 0.97±0.03 1.03±0.05
0.98±0.04 0.99±0.04 1.02±0.02 1.00±0.15 0.9±0.04 1.09±0.15
АлАТ, ммоль/л·ч
Фон
15-й день
0.40±0.03 0.37±0.02 0.40±0.07 0.43±0.05 0.40±0.06 0.47±0.03
0.45±0.07 0.39±0.02 0.47±0.07 0.49±0.05 0.49±0.05 0.40±0.06
ЛДГ общая, ммоль/л·ч
Фон
15-й день
35.4±2.5
35.6±2.5
37.0±2.6
35.5±3.1
36.5±2.8
34.5±2.0
36.7±3.1
34.9±2.6
36.4±2.9
38.1±2.0
35.8±2.7
36.3±2.6
Щелочная фосфатаза, U/л
Фон
15-й день
6.23±0.51 2.65±0.73 5.76±0.57 5.28±0.31 5.95±0.54 5.78±0.94
5.60±0.92 3.21±0.53 6.79±0.33 5.73±0.53 7.43±0.95 5.15±0.74
Na, ммоль/л
Фон
15-й день
141.2±1.1 144.6±0.9 154.4±1.0 148.5±0.9 152.5±2.1 144.2±0.7
147.8±1.0 153.6±0.9 152.5±1.1 155.2±0.6 151.9±2.2 144.6±0.9
K, ммоль/л
Фон
15-й день
4.9 ± 0.1 5.3 ± 0.09 5.5 ± 0.09 5.2 ± 0.1 5.1 ± 0.09 4.6 ± 0.1
5.2 ± 0.1
4.8 ± 0.1
5.6 ± 0.1
5.2 ± 0.1
5.2 ± 0.1 4.8 ± 0.09
2.9 ± 0.1
3.3 ± 0.1 3.0 ± 0.09 3.0 ± 0.1
2.7 ± 0.1
2.9 ± 0.1 3.0 ± 0.09 3.0 ± 0.09 2.9 ± 0.09 2.9 ± 0.09
Ca, ммоль/л
Фон
15-й день
3.0 ± 0.1
3.1 ± 0.1
42
Таблица 3.9.4
Влияние препарата-аналога на активность ферментов и электролитный состав
плазмы крови белых крыс (М ± m)
Экспериментальная группа и пол
Показатель
Контроль
M
40 МЕ/кг
F
M
F
400 МЕ/кг
M
F
АсАТ, ммоль/л·ч
Фон
15-й день
0.96±0.06 0.98±0.11 1.08±0.06 1.10±0.06 1.04±0.11 1.01±0.1
0.98±0.04 0.99±0.04 1.01±0.03 1.00±0.07 0.98±0.10 1.07±0.13
АлАТ, ммоль/л·ч
Фон
15-й день
0.40±0.03 0.37±0.02 0.40±0.06 0.40±0.02 0.40±0.05 0.44±0.01
0.45±0.07 0.39±0.02 0.51±0.06 0.49±0.04 0.51±0.03 0.42±0.04
ЛДГ общая, ммоль/л·ч
Фон
15-й день
35.4±2.5
35.6±2.5
32.8±2.5
35.0±2.9
36.1±2.4
32.3±1.5
36.7±3.1
34.9±2.6
34.6±2.7
33.8±1.7
36.0±2.5
38.1±2.5
Щелочная фосфатаза, U/л
Фон
15-й день
6.23±0.51 2.65±0.73 5.76±0.55 3.88±0.30 5.21±0.55 3.54±0.94
5.60±0.92 3.21±0.53 5.64±0.32 3.92±0.55 5.13±0.86 3.22±0.70
Na, ммоль/л
Фон
15-й день
141.2±1.1 144.6±0.9 147.4±1.0 150.6±0.7 140.7±1.9 147.9±0.7
147.8±1.0 153.6±0.9 154.5±0.9 153.9±0.7 148.3±1.9 144.1±0.7
K, ммоль/л
Фон
15-й день
4.9 ± 0.1 5.3 ± 0.09 5.1 ± 0.09 4.7 ± 0.1 4.9 ± 0.09 5.0 ± 0.1
5.2 ± 0.1
4.8 ± 0.1
5.0 ± 0.1
4.9 ± 0.1 4.9 ± 0.09 4.6 ± 0.09
2.9 ± 0.1
3.3 ± 0.1
3.0 ± 0.1
2.7 ± 0.1 3.0 ± 0.09 3.0 ± 0.09
2.7 ± 0.1
2.9 ± 0.1
2.9 ± 0.1
3.2 ± 0.1
Ca, ммоль/л
Фон
15-й день
2.9 ± 0.1
2.9 ± 0.1
43
3.10. Влияние на состав периферической крови и
характер миелограммы
Гематологические исследования проводились у фоновой группы до начала введения препаратов и через 14 дней после ежедневного введения в остальных группах на
10 животных каждого пола из каждой группы. Кровь получали после одномоментного гильотинирования с последующим извлечением бедренной кости для исследования
миелограммы. Статистическая обработка результатов проводилась по методу
Стъюдента. Полученные данные представлены в таблицах 3.10.1.и 3.10.2.
Таблица 3.10.1
Влияние «Гонадотропина менопаузного» и препарата-аналога на состав
периферической крови у белых крыс (М ±m) (через 14 дней)
Исследуемые
показатели
Контроль
«Гонадотропин «Гонадотропин
менопаузный», менопаузный»,
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
Препаратаналог,
Препаратаналог,
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
Самцы
Гемоглобин,
г/дл
12.6 ± 0.1
12.0 ± 0.1
11.6 ± 0.09
12.3 ± 0.3
11.9 ± 0.2
Гематокрит,
%
51.4 ± 1.8
46.9 ± 2.0
49.5 ± 0.8
50.2 ± 2.0
50.5 ± 1.1
Эритроциты,
1012/л
6.8 ± 0.1
6.5 ± 0.2
6.4 ± 0.09
6.3 ± 0.1
6.1 ± 0.1
Цветной
19.2 ± 0.4
показатель, пг
17.7 ± 0.2
16.8 ± 0.2
17.2 ± 0.09
19.6 ± 0.3
Средний объ- 75.9 ± 0.7
ем эритроцитов, мкл3
81.5 ± 0.6
76.5 ± 0.7
75.5 ± 0.8
79.2 ± 1.1
Средняя конц. 24.7 ± 0.1
гемоглобина в
эритроците, %
22.7 ± 0.1
23.5 ± 0.3
24.4 ± 0.09
22.8 ± 0.3
СОЭ, мм/ч
4.2 ± 0.6
4.5 ± 0.3
4.7 ± 0.7
4.5 ± 0.3
4.5 ± 0.6
Тромбоциты,
10 9/л
609.8 ± 11.6 634.6 ± 10.6
668.5 ± 12.1
601.0 ± 11.6
642.9 ± 13.2
44
Продолжение таблицы 3.10.1
Исследуемые показатели
Контроль
«Гонадотропин «Гонадотропин
менопаузный», менопаузный»,
40 МЕ/кг
Препаратаналог,
Препаратаналог,
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
400 МЕ/кг
Ретикулоциты,
‰
21.1 ± 0.9
21.5 ± 0.4
21.3 ± 0.5
23.1 ± 0.5
21.8 ± 0.8
Лейкоциты,
7.1 ± 0.1
6.7 ± 0.2
6.5 ± 0.09
6.2 ± 0.1
7.2 ± 0.1
Палочкоядерные 0.2 ± 0.1
нейтрофилы, %
0.1 ± 0.09
0.2 ± 0.09
0.1 ± 0.09
0.2 ± 0.1
Сегментоядерные нейтрофилы, %
12.1 ± 1.0
12.6 ± 1.2
13.0 ± 1.1
11.6 ± 1.4
13.3 ± 1.0
Базофилы, %
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
Эозинофилы, %
4.0 ± 0.6
3.7 ± 0.5
4.1 ± 0.5
3.5 ± 0.6
3.9 ± 0.5
Моноциты, %
3.8 ± 0.6
3.3 ± 0.6
3.0 ± 0.6
3.1 ± 0.5
3.3 ± 0.4
Лимфоциты, %
76.5 ± 1.0
74.9 ± 1.3
79.4 ± 1.1
78.3 ± 1.4
73.5 ± 1.2
Плазматические
клетки, %
0.2 ± 0.1
0.1 ± 0.1
0.1 ± 0.09
0.3 ± 0.1
0.1 ± 0.09
Продолжительность свертывания крови, сек
46.6 ± 2.6
51.0 ± 2.2
61.3 ± 1.7
65.0 ± 2.5
65.1 ± 2.0
Начало сверты- 29.3 ± 1.4
вания крови, сек
26.2 ± 0.9
27.2 ± 0.6
25.9 ± 1.2
25.9 ± 0.6
Окончание
свертвания крови, сек
75.0 ± 2.0
90.4 ± 1.6
92.6 ± 2.6
91.6 ± 1.9
10 9/л
75.4 ± 2.6
Самки
Гемоглобин, г/дл 11.9 ± 0.09 12.3 ± 0.3
12.1 ± 0.09
12.5 ± 0.2
11.9 ± 0.1
Гематокрит, %
51.4 ± 1.9
46.5 ± 3.0
50.8 ± 1.9
49.4 ± 2.9
46.1 ± 2.6
Эритроциты,
1012 /л
6.3 ± 0.09
6.2 ± 0.09
6.0 ± 0.1
6.3 ± 0.1
5.9 ± 0.09
Цв. показатель,
пг
17.5 ± 0.5
18.7 ± 0.09
19.6 ± 0.4
19.8 ± 0.09
19.3 ± 0.4
Средний объем
эритроцитов,
мкл3
75.5 ± 0.5
77.0± 1.0
81.1 ± 0.8
72.7± 1.0
71.5 ± 1.0
45
Продолжение таблицы 3.10.1
Исследуемые показатели
Контроль
«Гонадотропин
менопаузный»,
«Гонадотропин
менопаузный»,
Препаратаналог,
Препаратаналог,
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
Средняя концен- 24.7 ± 0.09 26.5 ± 0.2
трация гемоглобина в эритроците, %
23.3 ± 0.09
26.0 ± 0.1
23.3 ± 0.2
СОЭ, мм/ч
4.5 ± 0.6
4.8 ± 0.5
4.5 ± 0.5
4.7 ± 0.7
5.1 ± 0.4
Тромбоциты,
601.8 ±
17.4
662.5 ± 15.7
618.1 ± 13.5
638.0 ± 16.9
652.5 ± 14.6
Ретикулоциты,
‰
21.5 ± 0.8
22.8 ± 0.8
24.1 ± 0.5
22.4 ± 1.0
24.4 ± 0.8
Лейкоциты,
109/л
6.9 ± 0.2
6.9 ± 0.1
6.7 ± 0.1
7.3 ± 0.09
6.2 ± 0.1
Палочкоядерные 0.2 ± 0.1
нейтрофилы, %
0.09 ± 0.01
0.2 ± 0.09
0.4 ± 0.1
0.2 ± 0.09
Сегментоядерные нейтрофилы, %
12.8 ± 1.1
13.6 ± 0.9
13.4 ± 0.8
13.5 ± 1.0
12.0 ± 1.2
Базофилы, %
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
Эозинофилы, %
3.1 ± 0.1
2.6 ± 0.4
1.8 ± 0.8
2.7 ± 0.6
1.8 ± 0.6
Моноциты, %
3.8 ± 1.0
3.8 ± 1.2
3.8 ± 0.8
3.9 ± 1.1
3.9 ± 0.7
Лимфоциты, %
83.0 ± 2.1
79.9 ± 0.9
83.8 ± 0.8
75.4 ± 1.2
86.2 ± 1.0
Плазматические
клетки, %
0.09 ± 0.1
0.2 ± 0.09
0.09 ± 0.09
0.09 ± 0.1
0.1 ± 0.09
Продолжительность свертывания крови, сек
47.6 ± 2.5
58.5 ± 2.1
62.9 ± 1.8
67.5 ± 2.5
67.7 ± 2.1
Начало сверты- 29.5 ± 1.4
вания крови, сек
26.2 ± 0.8
27.0 ± 0.7
26.2 ± 1.1
25.9 ± 0.7
Окончание
свертвания крови, сек
85.1 ± 2.1
91.3 ± 1.5
91.9 ± 2.5
92.2 ± 1.8
9
10 /л
74.9 ± 2.7
Лимфоциты имеют сильно пикнотическое ядро, иногда обнаруживается значительная азурофильная зернистость. Основная масса сегментоядерных клеток имеет
нежную, нейтрофильную, не вполне ясно выраженную зернистость в мазках. Ядра
эозинофильных клеток образованы из рыхлого хроматинового вещества и имеют почти круглую форму. Ядра эозинофилов и нейтрофилов образуются по кольчатому типу, поэтому нередко встречаются кольцеобразные ядра у палочковидных форм. Моноциты сильно отличаются от лимфоцитов. Последние равны по величине двум эрит-
46
роцитам, имеют большое бобовидное ядро и широкую протоплазматическую кайму,
которая окрашивается в синий или фиолетовый цвет с нежной грануляцией. Кровяные пластинки лежат большими кучками. Достоверных отличий между показателями
контрольной и опытных групп не наблюдается. Половых различий не выявлено.
Таким образом, периферическая кровь крыс всех экспериментальных групп после
14-дневного введения «Гонадотропина менопаузного» и препарата-аналога по своему
количественному и качественному составу соответствовала видовой физиологической норме.
Таблица 3.10.2.
Влияние «Гонадотропина менопаузного» и препарата-аналога на характер
миелограммы у белых крыс
Исследуемые
показатели
Контроль
«Гонадотропин «Гонадотропин
менопаузный», менопаузный»,
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
Препаратаналог,
Препаратаналог,
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
Самцы
Кол-во исследованных клеток на
бедро, ± х 106)
16.6 ± 0.5
16.2 ± 0.6
16.8 ± 0.6
16.4 ± 0.7
17.1 ± 0.6
Недифференцированные бласты, %
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
Проэритробласты, 0.0
%
0.0
0.0
0.0
0.0
Эритробласты, %
0.53 ± 0.11 0.64 ± 0.10
0.61 ± 0.10
0.56 ± 0.13
0.58 ± 0.13
Пронормобласты,
%
0.54 ± 0.11 0.70 ± 0.12
0.54 ± 0.12
0.70 ± 0.12
0.57 ± 0.12
Базофильные нормобласты, %
6.28 ± 1.08 6.92 ± 0.64
6.97 ± 0.71
6.69 ± 0.65
7.37 ± 0.66
Полихроматофильные нормобласты, %
12.71 ±
1.23
10.79 ± 0.99
11.24±0.85
10.21 ± 1.24
Эозинофильные
нормобласты, %
6.13 ± 1.11 7.19 ± 0.79
7.16 ± 0.78
6.85 ± 0.73
7.50 ± 0.80
Число митозов
красной крови, %
0.62 ± 0.10 0.57 ± 0.10
0.59 ± 0.1
0.55 ± 0.10
0.63 ± 0.09
Миелобласты, %
2.00 ± 0.45 1.91 ± 0.31
1.93 ± 0.25
1.84 ± 0.29
1.99 ± 0.28
Промиелоциты, %
3.85 ± 0.72 3.70 ± 0.60
3.32 ± 0.36
3.91 ± 0.63
3.55 ± 0.36
Миелоциты, %
5.72 ± 0.47 5.92 ± 0.64
6.12 ± 0.70
6.07 ± 0.64
5.56 ± 0.69
10.18 ±0.94
47
Продолжение таблицы 3.10.2
Исследуемые
показатели
Контроль
«Гонадотропин
менопаузный»,
«Гонадотропин
менопаузный»,
Препаратаналог,
Препаратаналог,
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
Метамиелоциты,
%
7.51 ± 0.92
8.51 ± 0.67
Палочкоядерные
нейтрофилы, %
13.36 ± 1.27 14.74 ±0.89
7.46 ± 0.98
7.94 ± 0.75 7.91 ± 1.03
14.16 ± 1.80
13.45±0.97 14.92 ± 1.83
Сегментоядерные 16.91 ±1.27
нейтрофилы, %
18.00 ± 1.29
18.07 ± 0.95
18.63 ±
1.34
18.18 ± 0.91
Эозинофилы, %
8.16 ± 0.98
8.16 ± 0.73
9.08 ± 0.79
7.91 ± 0.65 9.41 ± 0.74
Базофилы, %
0.0
0.0
0.0
0.0
Число митозов
белой крови, %
0.69 ± 0.1
0.67 ± 0.09
0.68 ± 0.19
0.69 ± 0.10 0.68 ± 0.20
Пролимфоциты,
%
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
Лимфоциты, %
9.88 ± 0.95
10.81 ± 0.71
9.79± 0.92
10.58 ±
0.62
10.43± 0.84
Плазматические
клетки, %
1.25 ± 0.17
1.23 ± 0.13
1.34 ± 0.16
1.33 ± 0.18 1.37 ± 0.16
Промоноциты, % 0.0
0.0
0.0
0.0
Моноциты, %
0.76 ± 0.15
0.72 ± 0.13
0.68 ± 0.14
0.71 ± 0.20 0.66 ± 0.19
Ретикулоциты, % 1.65 ± 0.12
1.61 ± 0.16
2.01 ± 0.65
1.75 ± 0.09 1.89 ± 0.74
Мегакариоциты и 0.45 ± 0.09
мегакариобласты,
%
0.43 ± 0.03
0.50 ± 0.05
0.44 ± 0.04 0.43 ± 0.07
0.0
0.0
Самки
Кол-во исследо- 17.7 ± 0.6
ванных клеток на
бедро, ±х 106)
15.4 ± 0.7
16.3 ± 0.7
15.9 ± 1.1
17.0 ± 0.7
Недифференцированные бласты,%
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
Проэритробласты, %
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
Эритробласты, % 0.60 ± 0.13
0.82 ± 0.15 0.67 ± 0.13
0.77 ± 0.19
0.71 ± 0.20
Пронормобласты, 0.44 ± 0.09
%
0.65 ± 0.12 0.78 ± 0.10
0.65 ± 0.17
0.80 ± 0.19
Базофильные
нормобласты, %
7.45 ± 1.35 7.25 ± 1.39
7.48 ± 1.36
7.17 ± 1.45
8.37 ± 1.04
48
Продолжение таблицы 3.10.2
Исследуемые
показатели
Контроль
«Гонадотропин
менопаузный»,
«Гонадотропин
менопаузный»,
Препаратаналог,
Препаратаналог,
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
Полихроматофильные нормобласты, %
13.38 ± 1.19
11.50 ± 1.13
12.19 ± 1.41
12.40 ±
1.27
12.44 ± 1.48
Эозинофильные
нормобласты, %
6.10 ± 0.82
6.15 ± 0.33
5.34 ± 0.63
5.97 ± 0.42
5.30 ± 0.73
Число митозов
0.58 ± 0.1
красной крови, %
0.61 ± 0.05
0.54 ± 0.1
0.58 ± 0.07
0.61 ± 0.10
Миелобласты, %
1.60 ± 0.42
1.70 ± 0.39
1.28 ± 0.44
1.59 ± 0.43
1.35 ± 0.47
Промиелоциты,
%
3.15 ± 0.26
3.80 ± 0.52
4.01 ± 0.16
3.86 ± 0.49
4.16 ± 0.18
Миелоциты, %
5.23 ± 0.56
5.48 ± 0.46
5.68 ± 0.53
5.70 ± 0.48
5.01 ± 0.56
Метамиелоциты,
%
6.65 ± 0.86
6.77 ± 0.87
7.40 ± 0.60
6.79 ± 0.99
7.48 ± 0.55
Палочкоядерные
нейтрофилы, %
14.18 ± 1.60
14.39 ± 1.54
15.04 ± 1.37
15.65 ±
1.41
13.90 ± 1.33
Сегментоядерные 18.44 ± 1.05
нейтрофилы, %
17.27 ± 1.21
19.76 ± 1.19
16.71 ±
1.34
17.62 ± 1.23
Эозинофилы, %
Базофилы, %
10.42 ± 0.99
7.13 ± 0.80
6.93 ± 0.61
7.15 ± 0.80
7.30 ± 0.59
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
Число митозов
белой крови, %
Пролимфоциты,
%
Лимфоциты, %
0.61 ± 0.05
0.59 ± 0.05
0.59 ± 0.09
0.59 ± 0.08
0.57 ± 0.1
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
9.56 ± 0.73
10.35 ± 0.94
9.51 ± 1.11
11.20 ±
0.76
10.37 ± 1.14
1.15 ± 0.18
1.16 ± 0.35
1.26 ± 0.21
1.16 ± 0.39
0.0
0.0
0.0
0.0
0.97 ± 0.20
1.04 ± 0.19
0.95 ± 0.17
0.94 ± 0.18
2.10 ± 0.88
1.26 ± 0.42
2.18 ± 0.87
1.21 ± 0.48
0.35 ± 0.04
0.39 ± 0.06
0.39 ± 0.06
0.44 ± 0.1
Плазматические 1.49 ± 0.29
клетки, %
Промоноциты, % 0.0
Моноциты, %
0.65 ± 0.1
Ретикулоциты, % 1.12 ± 0.05
Мегакариоциты и 0.42 ± 0.09
мегакариобласты,
%
Органы кроветворения крыс содержат круглоядерные клетки, нейтрофильные и
эозинофильные миелоциты, полинуклеарные нейтрофилы и эозинофилы, нормобласты и гигантские клетки. Основная масса клеток костного мозга состоит из круглоядерных клеток, полинуклеаров и переходных форм с большей или меньшей перешнуровкой ядра. Одноядерные клетки достаточно разнообразны, ядра их мелкие, рас-
49
положены центрально или эксцентрично, в ряде случаев полностью заполняют клетку. Полинуклеарные формы чаще нейтрофильны и реже эозинофильны. Нейтрофильная грануляция нежна и не очень обильна. Эозинофильная грануляция хорошо выражена. Базофилы имеют круглое или лопастное ядро. Гигантские клетки с гомогенной
плазмой и многочисленными мелкими центрально лежащими ядрами попадаются
редко. Нормобласты имеют типичные ядра и протоплазму.
Костный мозг крыс как контрольной, так и опытных групп по своему количественному составу соответствовал видовой физиологической норме. Половых различий не наблюдалось.
3.11. Данные патоморфологического исследования
Крысы правильного телосложения, удовлетворительного питания. При наружном
осмотре выделений из естественных отверстий не обнаружено. Шерсть блестящая,
опрятного вида, очагов облысения не определяется. Зубы сохранены. Видимые слизистые оболочки бледной окраски, блестящие. Молочные железы самок без уплотнений
на ощупь, выделения из сосков отсутствовали. Половые органы самцов развиты правильно, деформации или отека конечностей нет.
Кожа, подкожная клетчатка и мышцы в месте введений препарата без изменений,
раздражения или некроза тканей в месте введения не наблюдалось. Регионарные
лимфатические узлы не изменены.
Грудная и брюшная полости выпота не содержат. Положение внутренних органов
грудной и брюшной полостей нарушений не представляет. Париетальный и висцеральный листки плевры и брюшины тонкие, блестящие, гладкие.
Подчелюстные лимфатические узлы и слюнные железы овальной формы, бледножелтого или розоватого цвета, с гладкой поверхностью, тонкой капсулой, не спаяны
между собой и подлежащими тканями. Поверхность разреза однородной окраски.
Щитовидная железа красноватого цвета, обычной величины и формы, умеренно
плотной консистенции. Тимус треугольной формы, беловатого цвета, умеренно плотной консистенции, обычных размеров.
Интима аорты гладкая, блестящая, беловатого цвета. Диаметр аорты не изменен.
Листки перикарда тонкие, прозрачные, гладкие. Величина и форма сердца изменений
не представляют. Левый желудочек сокращен, в правом содержится незначительное
количество темной жидкой крови. Клапаны сердца тонкие, блестящие, гладкие.
Мышца сердца на разрезе однородной коричневатой окраски, умеренно плотная.
Просвет трахеи и крупных бронхов не изменен, слизистая оболочка блестящая,
гладкая, бледного цвета. Легкие воздушные, без уплотнений на ощупь, бледнорозовой окраски.
Слизистая пищевода блестящая, гладкая, бледного цвета. Желудок обычной величины и формы, заполнен пищевым содержимым. Слизистая оболочка безжелезистой
50
части желудка складчатая, розоватая, блестящая. Слизистая тела желудка складчатая,
розоватая, блестящая.
Слизистая оболочка тонкого кишечника бледно-розового цвета, блестящая, гладкая. Слизистая оболочка толстой кишки сероватого цвета, блестящая, гладкая.
Форма и величина печени изменений не представляют. Поверхность печени гладкая, однородной темно-красной окраски, капсула тонкая, прозрачная. Ткань печени на
разрезе полнокровная, умеренно плотная.
Поджелудочная железа плоской формы, бледно-розового цвета, дольчатая, умеренно плотной консистенции.
Селезенка обычной формы, темно-вишневого цвета, умеренно плотной консистенции. Поверхность органа гладкая, капсула тонкая. На разрезе на темно-красном
фоне селезенки видны мелкие сероватого цвета фолликулы.
Величина и форма почек не изменены. Поверхность почек коричневатого цвета,
гладкая, капсула тонкая, прозрачная, легко снимаемая. На разрезе органа хорошо различимы корковое и мозговое вещество.
Надпочечники округлой формы, бледно-желтого цвета, с гладкой поверхностью,
умеренно плотные. На разрезе выделяется темно-окрашенное мозговое вещество.
Мочевой пузырь заполнен прозрачной мочой. Слизистая оболочка пузыря гладкая, блестящая, бледной окраски.
Тело матки самок обычной плотности, величины и формы. Рога матки тонкие,
слизистая — блестящая, бледная. Яичники темно-красного цвета, с неровной поверхностью, умеренно плотные. Яички самцов беловатого цвета, обычных размеров и
плотности.
Оболочки головного мозга тонкие, прозрачные. Вещество мозга обычной плотности, поверхность мозга гладкая. На фронтальных разрезах мозга отчетливо выделяются серое и белое вещество. Желудочки мозга обычной величины, расширения нет.
В таблицах 3.11.1 и 3.11.2 представлены данные по массовым коэффициентам органов у белых крыс из всех экспериментальных групп.
51
Таблица 3.11.1
Массовые коэффициенты (МК) внутренних органов белых крыс
после 14-дневного введения препарата «Гонадотропин менопаузный» (М ± m)
Экспериментальная группа и пол
Орган
Контроль
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
M
F
M
F
M
F
Сердце
4.0±0.2
4.3±0.09
4.0±0.4
3.5±0.4
4.4±0.09
3.3±0.2
Легкие
с трахеей
7.1±0.5
6.4±0.7
7.4±0.2
6.8±0.5
7.3±0.09
6.8±0.2
Тимус
1.36±0.28
1.3±0.09
1.30±0.17 1.52±0.20 1.59±0.44 1.51±0.40
Печень
36.1±1.1
28.9±0.5
36.6±1.9
34.1±2.6
31.4±1.6
29.2±1.5
Селезенка
4.5±0.09
4.6±0.09
5.1±0.3
5.3±0.4
4.8±0.09
4.6±0.5
Почка (левая)
5.6±0.09
5.9±0.2
5.5±0.5
6.3±0.3
6.1±0.4
6.7±0.6
Надпочечник
(левый)
0.09±0.01
0.1±0.01
Головной мозг
7.6±0.6
7.6±0.1
Яички или
яичники
0.10±0.03 0.1±0.009 0.11±0.03 0.13±0.03
7.5±0.2
7.8±0.09
7.5±0.1
7.3±0.1
7.44±0.20 0.30±0.01 7.02±0.28 0.28±0.04 7.80±0.37 0.30±0.06
Таблица 3.11.2
Массовые коэффициенты (МК) внутренних органов белых крыс
после 14-дневного введения препарата-аналога (М ± m)
Экспериментальная группа и пол
Орган
Контроль
40 МЕ/кг
400 МЕ/кг
M
F
M
F
M
F
Сердце
4.0±0.2
4.3±0.09
4.0±0.1
3.9±0.2
4.0±0.1
4.2±0.09
Легкие
с трахеей
7.1±0.5
6.4±0.7
7.1±0.1
6.7±0.3
6.7±0.1
6.8±0.2
Тимус
1.36±0.28
1.3±0.09
1.36±0.20 1.39±0.18 1.51±0.20 1.44±0.25
Печень
36.1±1.1
28.9±0.5
35.6±1.9
31.7±2.4
34.6±1.2
30.1±1.2
Селезенка
4.5±0.09
4.6±0.09
5.1±0.1
5.1±0.4
4.8±0.08
4.6±0.2
Почка (левая)
5.6±0.09
5.9±0.2
5.2±0.4
5.7±0.1
6.0±0.2
6.7±0.3
Надпочечник
(левый)
0.09±0.01
0.1±0.01
0.09±0.01 0.09±0.01 0.11±0.01 0.10±0.02
Головной мозг
7.6±0.6
7.6±0.1
7.4±0.09
Яички или
яичники
7.6±0.09
7.2±0.1
7.5±0.07
7.44±0.20 0.30±0.01 6.91±0.33 0.25±0.03 7.22±0.35 0.29±0.05
52
Из приведенных таблиц следует, что достоверных отличий массовых коэффициентов внутренних органов крыс ни в одной из опытных групп от контрольных нет.
Патологических сдвигов не отмечено.
Таким образом, внутримышечное применение «Гонадотропина менопаузного»
в дозах 40 и 400 МЕ/кг, а также препарата-аналога не вызывает патологических
морфологических изменений внутренних органов и не оказывает раздражающего
действия на ткани в местах введения.
3.12. Результаты гистологического исследования
Объекты фиксировали в 10–15% формалине или жидкости Карнуа и заливали в
парафин. Головной мозг фиксировали в 96% спирте и заливали в целлоидин или парафин. Срезы внутренних органов окрашивали гематоксилин-эозином и по ВанГизону, срезы головного мозга окрашивали по Нисслю.
При просмотре гистологических препаратов изучаемых органов контрольных животных и животных, получавших максимальную дозу препарата, различий между
группами не обнаружено.
Цитоархитектоника коры больших полушарий головного мозга не нарушена, очагов выпадения нет. Сосуды мозговых оболочек умеренно полнокровные; кортикальные сосуды равномерного диаметра. Содержат единичные эритроциты. Признаки
острого или хронического заболевания нейронов отсутствуют. Ядра нейронов светлые, ядерная мембрана тонкая, ядрышки четкие. В цитоплазме определяется достаточное количество хроматофильной зернистости Ниссля: пылевидной в цитоплазме
нейронов 2–3-го слоев и более крупной — в цитоплазме нейронов 5-го слоя коры
больших полушарий. Нейроны разных ядерных образований среднего и продолговатого мозга содержат крупные глыбки тигроида. Ядра нервных и глиальных клеток не
изменены — ядерная мембрана тонкая, содержание хроматина нормальное, ядрышки
четкие.
Клетки эндотелия внутренней оболочки аорты с четкими ядрами. Деструкций
эластических волокон средней оболочки нет. Поперечная исчерченность миофибрилл
во всех отделах сердца отчетливая, ядра кардиомицитов содержат достаточное количество хроматина, ядерная оболочка тонкая. Очагов нарушений тинкториальных
свойств цитоплазмы нет. Избыточного разрастания стромы (кардиофиброза) нет.
Эпителий гортани, трахеи, крупных бронхов не изменен, ядра четкие. Альвеолы
всех долей легких содержат воздух. Ядра альвеолярного эпителия четкие, цитоплазма
оксифильная. Эпителий внутрилегочных бронхов без изменений. Острые воспалительные изменения легочной ткани отсутствовали.
Трабекулярное строение печени на срезах, полученных из объектов разных долей
печени, нарушений не представляет. Границы гепатоцитов отчетливые, цитоплазма
зернистая, слабо оксифильная. Очаговых нарушений тинкториальных свойств цито-
53
плазмы нет. Ядра содержат четкие ядрышки и достаточное количество хроматина.
Ядерная мембрана тонкая. Синусоиды печени полнокровные.
Капилляры клубочков и интерстициальной ткани почек полнокровные, цитоплазма эпителия проксимальных канальцев почек оксифильная, клеточные границы различимы, ядра нефроэпителия светлые, четкие.
Сосуды коры и мозгового вещества надпочечников полнокровные. Все зоны коры
надпочечников отчетливо выражены, клеточные ядра содержат достаточное количество хроматина. Цитоплазма клеток пучковой зоны вакуолизирована за счет содержания большого количества липидов. Клетки мозгового вещества крупные, овальной
формы, объединенные в гроздья и тяжи.
Лимфоретикулярные элементы лимфатических узлов и селезенки с четкими ядрами, деструкции или атрофии фолликулов нет. В красной пульпе селезенки видны
очаги кроветворения с единичными мегакариоцитами.
Слизистая оболочка безжелезистой части желудка выстлана многослойным плоским эпителием, клетки которого изменений не представляют. Покровный эпителий
слизистой тела желудка образован слизистыми цилиндрическими клетками, дефектов
эпителиальной выстилки нет. Главные и обкладочные клетки желез тела желудка не
изменены. Дефектов многослойного плоского неороговевающего эпителия слизистой
пищевода нет.
Дольчатое строение поджелудочной железы сохранено. Клетки островков Лангерганса содержат светлые, четкие ядра, цитоплазма слабо оксифильная. Эпителиальные клетки внешнесекреторной части железы базофильные, ядра, расположенные в
средней части, четкие, с достаточным количеством хроматина Сосуды стромы поджелудочной железы умеренно полнокровные.
Фолликулы щитовидной железы заполнены небольшим количеством оксифильного, слабовакуолизированного коллоида. Эпителий фолликул обычной высоты, ядра
четкие. Сосуды стромы умеренно полнокровные. Строение подчелюстных желез
нарушений не представляет. Эпителиальные клетки концевых отделов и выводных
протоков с четкими ядрами, деструкции клеток нет.
Тимус сохраняет выраженное дольчатое строение. Корковое вещество долек заполнено лимфоцитами/тимоцитами. Мозговое вещество тимуса содержит меньшее
количество лимфоцитов, а также светлые эпителиальные клетки, местами образующие концентрические фигуры и тельца Гассаля. Строма тимуса умеренно полнокровная.
В корковом веществе яичников самок видны фолликулы разной величины и степени созревания. Фолликулярный эпителий не изменен, ядра светлые, четкие, мозговое вещество яичников полнокровное. Клетки семенных канальцев яичек самцов
находятся на разных стадиях сперматогенеза. Эпителий семенных канальцев и интерстициальные клетки не изменены. Ядра четкие.
54
Место введения препарата — кожа, подкожная клетчатка и мышцы изменений не
представляли. Базальная мембрана эпидермиса была четкой, слоистое строение эпидермиса нарушений не представляло, сосуды сосочкового слоя дермы имели обычный диаметр, отека или воспаления нет.
Таким образом, по результатам некропсии и гистологического исследования
ежедневное внутримышечное введение лекарственной формы препарата «Гонадотропин менопаузный» в дозах 40 и 400 МЕ/кг в течение 14 дней крысам обоего
пола не вызывает раздражения, воспаления или деструкции тканей в месте введения, а также не сопровождается развитием дистрофических, деструктивных,
очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме
внутренних органов.
55
4. ИЗУЧЕНИЕ ПИРОГЕННОСТИ
Настоящие испытания были выполнены в ФГУН «Институт токсикологии»
ФМБА России в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 2, стр. 183, на кроликах
массой 3.1–3.3 кг.
Для испытаний после растворения содержимого флаконов в стерильном физиологическом растворе флаконы препарата подогревали в водяной бане до 37°C и растворы медленно вводили в ушную вену кроликов в объеме 0.1 и 1.0 мл/кг.
Температуру измеряли в фоне (до начала исследования) и три раза с промежутками в 1 час после введения. Измерения температуры проводили с помощью электрического медицинского термометра ТПЭМ-1 (допустимая основная погрешность от диапазона измеряемых температур ± 1%). Результаты представлены в таблице 4.1.
Таблица 4.1
Температурная реакция кроликов на введение лекарственной формы препарата
«Гонадотропин менопаузный»
Дозы,
мл/кг
0.1
Номера
кроликов
Фон
1 час
2 часа
3 часа
Макс. подъем
температуры,
°C
1
39.0
39.0
39.2
39.0
0.2
2
39.1
39.4
39.0
39.3
0.3
3
39.1
39.0
38.8
39.0
–0.1
Температура после введения, °C
СУММА
1.0
0.4
1
39.3
39.5
39.1
39.5
0.2
2
39.6
39.4
39.4
39.5
–0.1
3
39.0
39.2
39.0
39.0
0.2
СУММА
0.3
Ни в одной из испытанных доз препарата сумма повышения температуры в
группе из 3 кроликов не превысила 1.4°C (максимальный уровень повышения —
0.4°C), что в соответствии с требованиями ГФ XI, вып. 2, свидетельствует об
отсутствии пирогенности у лекарственной формы.
56
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные сравнительные экспериментальные исследования токсичности воспроизведенного лекарственного средства «Гонадотропин менопаузный» и зарегистрированного препарата-аналога «Пергонал» показали, что они являются практически биоэквивалентными; величины токсичности и изменения физиологических показателей, вызванных применением «Гонадотропина менопаузного», достоверно не отличались от таковых в случае применения препарата-аналога.
На основании результатов подострого эксперимента можно рассчитать индекс
безопасности (ИБ) воспроизведенного препарата при применении в клинике в соответствии с прилагаемой инструкцией (Т.А. Гуськова, 2003 г.): крысы – доза
400 МЕ/кг; длительность введения – 14 дней. Сдвиги в состоянии сердечнососудистой системы после введения в течение 10 дней в дозе 400 мг/кг. Гибели животных нет. Расчетный безопасный курс (РБК) препарата в днях равен:
РБК =
400 МЕ/кг х 14
2 МЕ/кг х 5.9
= 475 дней,
а индекс безопасности (ИБ) составляет:
ИБ =
475
30
= 16
В соответствии с классификацией опасности лекарственных препаратов для клинического применения (ИБ > 5) «Гонадотропин менопаузный» относится к III
классу малотоксичных (малоопасных) лекарственных препаратов.
ПОЛУЧЕННЫЕ
ФОРМУ
РЕЗУЛЬТАТЫ ПОЗВОЛЯЮТ РЕКОМЕНДОВАТЬ ЛЕКАРСТВЕННУЮ
ПРЕПАРАТА
«ГОНАДОТРОПИН
МЕНОПАУЗНЫЙ,
ЛИОФИЛИЗАТ
ДЛЯ
ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАСТВОРА ДЛЯ ВНУТРИМЫШЕЧНОГО ВВЕДЕНИЯ, 75 МЕ ФСГ + 75
МЕ ЛГ» ПРОИЗВОДСТВА ООО МЦ «ЭЛЛАРА», (ВЛАДИМИРСКАЯ ОБЛАСТЬ,
ПЕТУШИНСКИЙ РАЙОН, Г. ПОКРОВ) В МЗ СР РФ В КАЧЕСТВЕ МАЛОТОКСИЧНОГО
СРЕДСТВА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ РЕГИСТРАЦИИ.
57
ЛИТЕРАТУРА
1. Бейли Н. Статистические методы в биологии. М., «Мир», 1963, 271 стр.
2. Биохимические методы исследования в клинике. Справочник. (Под ред. акад.
АМН СССР А.А. Покровского). М., «Медицина», 1969, 256 стр.
3. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж. П. Материалы и основные эксперименты по
изучению мозга и поведения. М., «Высшая школа», 1991, 397 стр.
4. Гацура В.В. Методы первичного фармакологического исследования биологически
активных веществ. М., «Медицина», 1974, 143 стр.
5. Додсон Р., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М., «Мир», 1991, 543 стр.
6. Гуськова Т.А. Токсикология лекарственных средств. М., «Русский врач», 2003, с.
99-116.
7. Кигель Г. Б., Харабаджахьян Я.В. Показатели биологической нормы для лабораторных животных. Ростов-на-Дону, 1978, 95 стр.
8. Лабораторные методы исследования в клинике (под ред. проф. Меньшикова В.В.).
М., «Медицина», 1987, 282 стр.
9. Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств (РД 64126-91). М., МЗ России, ФК, 1992, 45 стр.
10. Правила проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов, МЗМП РФ, М. 1996, 9 стр.
11. Проблемы нормы в токсикологии (Под ред. проф. И.М. Трахтенберга). М. «Медицина», 1991, 203 стр.
12. Прозоровский В.Б., Прозоровская М., Демченко В.М. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки — Фармакол. и токсикол., 1978, №4,
стр. 497–502.
13. Руководящие методические материалы по экспериментальному и клиническому
изучению новых лекарственных средств (Официальное издание). Части 1, 3. Фармакологический комитет. М., 1975, 1981.
14. Требования к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ (временные методически рекомендации). М., МЗ СССР,
ФК, 1985, 19 стр.
15. Drug registration requirements in Japan (5-th edition). Japan, Tokyo, Yakuji Nippo
LTD, 1993, 306 p.
16. Methods of determination of chemical substances toxicity and danger (Edited by I.V.
Sanotsky). M., Medicine, 1986, 343 p.
17. Nonclinical laboratory studies. — GLP Federal Registered. 43, 247, December 22,
1978, p. 59986–60024.
18. Paged G.E., Thomson R. Standard Operating Procedures in Toxicology. England, Lancaster, MTP Press, 1979.
19. The rules governing medical products in the European Community. Volume III. Guidelines on the quality, safety and efficiency of medical products for human use. Luxembourg, Office for official publications of the European Community, 1989, 272 p.