019505 B1 019505 B1 (11) 019505

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
019505
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2014.04.30
(21)
Номер заявки
(51) Int. Cl. C12N 5/07 (2010.01)
C07K 16/00 (2006.01)
C07K 16/08 (2006.01)
200870062
(22)
Дата подачи заявки
2006.12.15
(54)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОРТАЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК, СЕКРЕТИРУЮЩИХ
АНТИТЕЛА, ПОПУЛЯЦИЯ ИММОРТАЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
B1
019505
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
Настоящее изобретение относится к новому способу иммортализации В-клеток, которые
секретируют антитела одного или нескольких специфических изотипов. При использовании
указанного способа человеческие В-клетки, которые секретируют антитела, связывающие
человеческие цитомегаловирусы, вирус простого герпеса или белок HSP60, были эффективно
иммортализованы с использованием вируса Эпштейна-Барр. Изобретение также относится
к применениям указанной популяции иммортализованных В-клеток для идентификации
и получения антител, обладающих желаемой антигенсвязывающей специфичностью и/или
биологической активностью. Поликлональные, олигоклональные и моноклональные популяции
клеток, получаемые с использованием способа согласно настоящему изобретению, могут быть
подвергнуты скринингу на основе функциональной или связывающей активности антител,
которые они секретируют, например направленных на антигены человеческого или вирусного
происхождения, представляющие медицинский интерес, в условиях клеточной культуры.
Фунаро Ада (IT), Гаротта Джанни
(FR), Мерфи Марианн (CH)
Медведев В.Н. (RU)
B1
(56) WO-A-2004076677
ЕР-A-1566442
WO-A-9104336
WO-A-9640252
WO-A-0246233
MORGENTHALER N.G. ET AL.: "Human
immunoglobulin
G
autoantibodies
to
the
thyrotropin receptor from Epstein-Barr virustransformed В lymphocytes: characterization by
immunoprecipitation with recombinant antigen and
biological activity". THE JOURNAL OF CLINICAL
ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM. SEP
1996, vol. 81, no. 9, September 1996 (1996-09), pages
3155-3161, XP000944236 ISSN: 0021-972X, page
3156 - page 3157
STEENBAKKERS P.G. ET AL.: "Efficient
generation of human anti-cytomegalovirus IgG
monoclonal antibodies from preselected antigenspecific В cells". HUMAN ANTIBODIES AND
HYBRIDOMAS. ОСТ 1993, vol. 4, no. 4, October
1993 (1993-10), pages 166-173, XP009070174 ISSN:
0956-960X, pages 167-168; figures 1, 2; tables 1, 2
US-A-4997764
NIEDBALA W.G. ET AL.: "A COMPARISON
OF THREE METHODS FOR PRODUCTION
OF HUMAN HYBRIDOMAS SECRETING
AUTOANTIBODIES" HYBRIDOMA, LIEBERT,
NEW YORK, NY, US, vol. 17, no. 3, June 1998
(1998-06), pages 299-304, XP001015996 ISSN:
0272-457X the whole document
019505
(31) PCT/EP2005/056871
(32) 2005.12.16
(33) EP
(43) 2009.04.28
(86) PCT/EP2006/069780
(87) WO 2007/068758 2007.06.21
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
РИБОВАКС БАЙОТЕКНОЛОДЖИЗ
СА (CH)
019505
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способам получения иммортализованных клеток, которые секретируют антитела, в частности клеток человеческого происхождения, которые секретируют антитела и
которые обладают высокой специфичностью для антигенов, представляющих медицинский интерес.
Предпосылки создания изобретения
Антитела представляют собой природные белки, продуцируемые иммунной системой для целей
борьбы с инфекциями и устранения патогенных факторов. Антитела выполняют свои функции путем
связывания с белковыми или небелковыми антигенами, запуская при этом защитный механизм для их
устранения.
В последние годы была разработана целая терапевтическая стратегия (названная как пассивная иммунотерапия или пассивная серотерапия), основанная на антигенсвязывающих свойствах антител, направленных как против человеческих молекул, так и молекул из видов, отличных от человека. Пассивная
иммунотерапия состоит из введения фармацевтических композиций, включающих терапевтические антитела с определенной антигенной специфичностью к данной патогенной молекуле (например, токсину,
белку, вирусу, паразиту или клетке), пациенту, иммунная система которого неспособна продуцировать
их в количествах и/или со специфичностью, необходимыми для блокирования и/или устранения патогена
(Dunman P.M. and Nesin M., 2003; Keller M.A. and Stiehm E.R., 2000).
Данная стратегия была успешно внедрена в клиническую практику в начале 1980-х гг., и с этого
момента использование терапевтических антител позволило быстро раздвинуть границы возможностей
при лечении большого числа заболеваний, включающих инфекционные заболевания, иммунные заболевания и рак, и сказалось на постоянном росте сектора терапевтических моноклональных антител (Chatenoud L., 2005; Pavlou A. and Belsey М., 2005; Laffy E. and Sodoyer R., 2005).
Терапевтические антитела, подходящие для пассивной иммунотерапии, включают такие антитела,
которые характеризуются гомогенной, выраженной специфичностью и активностью. Указанные свойства могут быть определены более точно и надежно для моноклональных антител (т.е. антител, секретируемых одним клоном антитело-секретирующих клеток), чем для поликлональных антител (т.е. сложной
смеси антител, секретируемых разными клонами антитело-секретирующих клеток).
Начиная с 1970-х гг. были разработаны различные методики для выделения, размножения и поддержания множества клеточных линий, каждая из которых была получена из культуры одной моноклональной клетки, секретирующей моноклональное антитело (мАт), и которые далее могут быть протестированы с использованием соответствующих методик с целью идентификации указанных желаемых характеристик.
При этом в реализации всех указанных методов возникали две важные технические проблемы:
a) как обеспечить наличие антител в количествах, достаточных для функциональных тестов, которые необходимы для идентификации и характеристики антител перед проведением экспериментов in
vivo;
b) каким образом добиться гарантий того, что терапевтическое антитело само не будет распознаваться как антиген иммунной системой пациента, которая будет запускать механизм устранения терапевтического антитела и/или иммунные воспалительные реакции, представляющие потенциальную опасность для пациента.
Первая задача связана с трудностью размножения и поддержания естественных антителосекретирующих клеток в культуре в течение периода времени, достаточного для тестирования биологического материала. Эта проблема была решена за счет либо иммортализации и поддержания в культуре
первичных антитело-секретирующих клеток, в которых изначально синтезировались и экспрессировались нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, либо за счет использования методики рекомбинантных ДНК для выделения из этих клеток нуклеиновых кислот, кодирующих антитела, и переноса их в
иммортализованные клетки, в которых они могут экспрессироваться и поддерживаться.
Раньше первичные клетки, секретирующие антитела, подвергали иммортализации в клеточной
культуре либо путем слияния их с клетками, которые уже были иммортализованы (с образованием гибридных клеток или гибридом, которые легче поддерживать), либо при использовании агентов (таких как
вирус), которые изменяют клеточный механизм в первичных клетках, секретирующих антитела таким
образом, что эти клетки начинают размножаться практически неограниченно.
Проблема, связанная с гарантией достижения безопасности для пациента, в прошлом решалась либо
с использованием клеток и нуклеиновых кислот человеческого происхождения при получении антител,
либо путем модификации генов, кодирующих антитела, отличные от человеческих, которые обладают
иммуногенным потенциалом, последовательностью человеческого происхождения, т.е. за счет процесса
"гуманизации", проводимого по методам рекомбинантных ДНК.
В заключение, следует отметить, что пассивная иммунотерапия может создавать эффективную и
быструю защиту против инфекций и других патологий. Однако каждый из таких методов: выделение,
скрининг и образование моноклональных антител, полностью совместимых с лечением людей, имеет
множество различных недостатков, которые в общих чертах будут описаны ниже.
Технология, основанная на получении гибридом, впервые описанная Колером и Милштейном (Koh-1-
019505
ler G. and Milstein С., 1975), позволяет выделять клоны непрерывно растущих клеток, секретирующих
антитела, после их слияния с иммортализованной клеткой соответствующего типа. Гибридомы получают
на основе человеческих клеток, секретирующих антитела (Olsson L. and Kaplan H., 1980), однако процесс
получения человеческих гибридом не может быть широко применен в связи с отсутствием соответствующих молекул-партнеров для слияния с человеческими миеломными лимфобластоидными клетками, а
также из-за нестабильности гомогибридом (человеческих/человеческих) и гетерогибридом (человеческих/мышиных).
Гуманизация мышиных антител была достигнута за счет пересадки антигенсвязывающего участка
мышиного моноклонального антитела на скелет молекулы человеческого антитела, что привело к образованию химерной молекулы с последующим замещением специфических остатков в мышиной молекуле
другими аминокислотами человеческого происхождения для снижения антигенности, в рамках молекулярного подхода (Hwang A. and Foote J., 2005; Carter P., 2006).
В настоящее время как в клинических испытаниях, так и в медицинской практике, применяется
множество различных "гуманизированных" антител. Однако эти антитела все еще содержат 5-10% мышиных (или не полностью человеческих) белковых последовательностей, которые могут демонстрировать иммунный ответ, ограничивающий терапевтическую эффективность таких препаратов. Кроме того,
процесс гуманизации, будучи очень трудоемким, иногда приводит и к изменениям в связывании антител.
В этой связи данный способ в основном использовался для получения антитело-секретирующих
клеток, выделенных от грызунов, иммунизированных релевантным антигеном. Поскольку последовательности мышиного происхождения могут быть иммуногенными для человека, такие мАт могут вызывать токсические реакции, определяемые измененной антителозависимой клеточной цитотоксичностью
и/или быстро выводиться из организма. Дополнительно даже антитела, идентичные по вариабельному
участку, могут демонстрировать различающиеся функциональные и иммуногенные свойства (Torres M.
et al., 2005).
Основной стратегией, используемой для получения полностью человеческих моноклональных антител, является стратегия, основанная на клонировании и экспрессии генов человеческого иммуноглобулина с использованием методик рекомбинантных ДНК.
В первом случае библиотеки последовательностей ДНК, кодирующих фрагменты антител, включая
их антегинсвязывающие участки, могут быть амплифицированы после выделения из тканей человека и
встроены в бактериофаг, что позволяет "проявить" антигенсвязывающие фрагменты на поверхности фага
и впоследствии провести скрининг. Моноклональные антитела против человеческих патогенов были получены на основе большого репертуара антител, выделенных от пациентов, где данные антитела были
далее подвергнуты клонированию и скринингу с использование методик проявления фага (Mancini N. et
al., 2004).
Однако, как это имеет место в большинстве случаев, указанные библиотеки могут быть неэффективны для целей идентификации терапевтических антител, поскольку гены для таких антител не отбираются так, как это делает in vivo иммунная система, с одной стороны, для устранения последовательностей в репертуаре человеческих антител, которые могут вызвать иммунную реакцию, а с другой стороны,
для отбора антительных последовательностей, получаемых в результате процесса созревания по аффинности. Таким образом, иногда для улучшения антител, имеющихся в таких библиотеках, необходимо
применять комплекс процесса созревания по аффинности in vitro и других методик, с тем чтобы добиться
направленного изменения последовательности (Hoet R. et al., 2005).
Во втором случае трансгенные мыши, экспрессирующие гены человеческих антител, могут быть
иммунизированы представляющими интерес антигенами с целью получения мышиных клеток, экспрессирующих полностью человеческие антитела (Kellerman S. and Green L., 2002). Данная технология имеет
преимущество в сравнении с традиционными методиками проявления фага, поскольку в этом случае антитела отбираются in vivo и они могут содержать повышенный уровень антител с высокой аффинностью.
Однако мышиная иммунная система, действующая в окружении, характерном для этих животных, может
не продуцировать человеческие антитела с нужной специфичностью для эффективного терапевтического
применения.
Таким образом, идеальное для проведения пассивной иммунотерапии терапевтические антитело
представляет собой человеческое моноклональное антитело, получаемое из человеческих иммунных клеток, которые завершили процесс созревания в организме человека. Однако отбор и продукция таких антител представляет собой сложный и затратный по времени процесс, поскольку традиционные способы
получения и выделения популяций жизнеспособных иммортализованных человеческих клеток, секретирующих антитела в условиях клеточных культур, являются неэффективными.
Процессы развития и пролиферации человеческих В-клеток, ведущие к достижению присущей им
антигенной специфичности и к развитию длительных реакций in vivo, а также способы исследования
такого процесса in vitro с использованием клеток, полученных из иммунной системы, широко исследованы и обобщены в литературе (Banchereau J. and Rousset F., 1992; Crotty S. and Ahmed R., 2004; Carsetti R.,
2004; McHeyzer-Williams L. and McHeyzer-Williams M., 2005). Однако выделение человеческих В-клеток,
секретирующих мАт, представляющих интерес, сдерживается техническими проблемами, связанными с
-2-
019505
продукцией стабильных клеточных линий клеток, секретирующих человеческие антитела, даже в том
случае, когда могут быть выявлены релевантные связывающая или нейтрализующая активность.
Могут быть выделены многие различные популяции клеток, секретирующих антитела, от человеческих доноров с разными профилями специфичности (например, необученные, т.е. не имевшие предшествующего контакта с антигеном, вакцинированные, инфицированные более или менее недавно и сероположительные индивидуумы) и из разных видов тканей (например, из крови, миндалин, селезенки, лимфатических узлов), где В-клетки оседают, демонстрируя свою аффинность (Viau M. and Zouali M., 2005).
Идентификация человеческих моноклональных антител требует обширного скрининга популяций
иммортализованных В-клеток, где каждая клетка секретирует специфическое моноклональное антитело в
достаточных количествах для его характеристики в условиях клеточной культуры (Cole S. et al., 1984;
James K. and Bell G., 1987; Borrebaeck C., 1989). Однако методики отбора, активации и иммортализации
клеток, секретирующих антитело, все еще встречают ряд технических трудностей (выход антител, эффективность иммортализации, проблемы, связанные со сверхпродукцией некоторых изотипов, клеточной
стабильностью и ростом клеток), что сказывается на недостаточном количестве клеток и секретируемых
антител, доступных для скрининга.
В связи с трудностью получения стабильных гибридом на основе человеческих клеток, секретирующих антитела, одним из методов, который широко использовался для образования и выделения человеческих клеток, секретирующих антитела, является иммортализация человеческих клеток с использованием вируса Эпштейна-Барр (EBV), который, как известно, индуцирует активацию и пролиферацию
поликлональных В-клеток (Sugimoto M. et al., 2004; Bishop G. and Busch L.K., 2002).
Клетки, секретирующие антитела, получают путем EBV-иммортализации с использованием различных источников человеческих В-клеток, таких как периферическая кровь здоровых субъектов, предварительно отобранных с использованием меченого антигена (Casali P. et al., 1986), лимфатические узлы,
селезенка или периферическая кровь, взятая от пациентов (Yamaguchi H. et al., 1987; Posner M. et al.,
1991; Raff H. et al., 1988; Steenbakkers P. et al., 1993, Steenbakkers P. et al., 1994), миндалины (Evans L. et
al., 1988) или плевральная жидкость (Wallis R. et al., 1989).
Однако в связи с низкой способностью к трансформации и трудностью клонирования, а также из-за
присущей EBV-инфицированным человеческим клеткам нестабильности и гетерогенности, в ходе данной процедуры зачастую терялись ценные В-клетки, секретирующие антитела (Chan M. et al., 1986; James
K. and Bell G., 1987), что вызывало необходимость проведения дополнительной стадии слияния клеток
после EBV-инфекции (Bron D., et al. 1984; Yamaguchi H. et al., 1987; Posner M. et al., 1991). Соответственно, ряд авторов сделали вывод о том, что наилучшим способом получения стабильных человеческих моноклональных клеток, секретирующих человеческие IgG антитела, является способ, основанный на слиянии человеческих лимфоцитов с миеломной клеточной линией (Niedbala W. and Stott D., 1998; Li J. et
al., 2006), несмотря на наличие ряда технических сложностей, присущих методике получения и использования человеческих гибридом, как это указывалось выше.
Было предпринято много усилий в направлении улучшения процесса иммортализации, например, за
счет объединения разных подходов (иммортализации с использованием онкогенного вируса, трансформации онкогеном, миниэлектрослияние, гетерослияние на основе мышиных - человеческих молекул) в
рамках одного процесса (US 4997764; Steenbakker P. et al., 1993; Dessain S.K. et al., 2004). Человеческие
моноклональные антитела выделяют из В-клеток, которые были активированы и иммортализованы (в
присутствии или в отсутствие антигена) с последующим их объединением в клеточной культуре посредством различных манипуляций (Borrebaeck С. et al., 1988; Davenport С. et al., 1992; Laroche-Traineau J. et
al., 1994; Morgenthaler N. et al., 1996; Niedbala W. and Kurpisz M. et al., 1993; Mulder L. et al., 1993; WO
91/09115; Hur et al., 2005; Traggiari E. et al., 2004; Tsuchiyama L. et al., 1997; WO 04/076677; WO 88/01642;
WO 90/40252; WO 02/46233).
В основном, имеющиеся в литературе сообщения, относящиеся к методам выделения и иммортализации клеток, секретирующих антитела, в особенности человеческого происхождения, не дают четкого
понимания, как можно разработать весь процесс получения достаточно крупного репертуара иммортализованных клеток, секретирующих антитела, начиная со стадии очистки выделенных из биологических
образцов клеток, которые экспрессируют антитела, вплоть до скрининга антител, которые секретируются
в условиях клеточной культуры.
В этой связи, было бы весьма полезно иметь способы, позволяющие проводить разработки более
оптимизированных процессов, в которых, при использовании специфических средств и условий клеточной культуры для улучшения эффективности отбора и повышения жизнеспособности антителосекретирующих клеток антигеннезависимым образом (но имея в репертуаре специфические, представляющие интерес изотипы), может быть проведен масштабный анализ секретируемых антител на максимально возможной крупной популяции иммортализованных клеток, секретирующих антитела, поддерживаемых в условиях клеточной культуры. В такой процесс могли бы быть включены способы, позволяющие сохранить преимущества молекулярной стратегии клонирования генов антител, поскольку популяция В-клеток, из которых получены клонируемые антитела, имеющие соответствующий, представляющий интерес изотип, могут быть повторно проанализированы для выявления клеток, секретирующих
-3-
019505
антитела, с желаемой активностью, и которые могут храниться в жизнеспособном состоянии для проведения последующего анализа.
Описание изобретения
Настоящее изобретение основано на том обнаруженном факте, что условия и средства отбора, стимуляции и иммортализации клеток, секретирующих антитела, как следует из литературных данных, не
позволяют отбирать их и объединять эффективным образом для целей повышения жизнеспособности
клеток в условиях культивирования, а также их чувствительности к агентам для иммортализации.
Фактически, неожиданно было обнаружено, что специфические сочетания таких условий и средств
не только улучшают процесс иммортализации клеток, но и существенно повышают выход и воспроизводимость всего процесса создания, в независимом от антигена режиме, популяции иммортализованных
клеток, которые секретирует антитела специфических изотипов в высоких количества, способные храниться в жизнеспособном состоянии.
Способы согласно настоящему изобретению фактически позволяют получать поликлональные популяции клеток, которые могут быть использованы и поддерживаться в виде библиотек клеток, секретирующих антитела специфического изотипа. При использовании данного подхода могут быть выявлены
специфические олигоклональные или моноклональные популяции клеток, которые секретируют в условиях клеточной культуры антитела с разной функциональной и связывающей активностью и которые
затем могут быть выделены в любой желательный момент времени (фиг. 1).
Настоящее изобретение относится к способу иммортализации популяции клеток, которые секретируют антитела одного или более специфических изотипов, включающему следующие стадии:
a) отбор популяции клеток, которая секретирует антитела из одного или более биологических образцов, в независимом от антигена режиме и на основе экспрессии по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности;
b) стимуляция указанной популяции отобранных клеток по меньшей мере одним стимулирующим
агентом в условиях клеточной культуры;
c) удаление указанного стимулирующего агента из клеточной культуры;
d) отбор популяции стимулированных клеток, которая экспрессирует антитела указанных специфических изотипов из указанной клеточной культуры;
e) воздействие на указанную популяцию отобранных и стимулированных клеток агентом иммортализации в условиях клеточной культуры;
f) удаление указанного агента иммортализации из указанной клеточной культуры в том случае, когда агентом иммортализации является вирусный агент иммортализации.
Дополнительно после стадии f) могут быть проведены следующие стадии:
g) поддержание популяции клеток, полученных из указанной клеточной культуры, в условиях клеточной культуры;
h) определение числа, жизнеспособности и/или пролиферирующей активности популяции клеток,
которые секретируют антитела указанных специфических изотипов в данной клеточной культуре.
Данная схема процесса может быть интегрирована и адаптирована путем введения дополнительных
условий и средств, относящихся к следующим аспектам:
идентификация доноров или биологических образцов, из которых могут быть выделены клетки;
специфические методы отбора, стимуляции/или иммортализации клеток, секретирующих антитела;
условия культивирования клеток, которые позволяют поддерживать, достигать роста и пролиферации популяции иммортализованных клеток, секретирующих антитела в условиях клеточной культуры;
средства, используемые для определения числа, жизнеспособности и/или пролиферирующей активности популяции клеток, секретирующих антитела указанных специфических изотипов в указанной клеточной культуре;
желаемые свойства антител и соответствующие тесты, которые выбираются для скрининга иммортализованных клеток, секретирующих антитела.
Способы согласно настоящему изобретению включают средства и условия, необходимые для оптимизации процессов отбора, стимуляции, иммортализации и клонирования клеток, секретирующих антитела, с целью достижения наибольшего разнообразия и числа таких клеток, которые могут поддерживаться в виде популяции иммортализованных клеток в условиях клеточной культуры. Фактически, получаемая популяция клеток может рассматриваться как библиотека иммортализованных клеток, которые
секретируют антитела и которые могут быть подвергнуты одному или нескольким нужным скринингтестам, сразу после их получения, согласно способам настоящего изобретения или, частично или полностью, могут быть заморожены и использованы позже в рамках одного или нескольких скриниг-тестов.
Популяция клеток, получаемая в рамках способов согласно настоящему изобретению, может быть
разделена на множество олигоклональных или моноклональных популяций клеток, секретирующих антитела в условиях клеточной культуры, и в частности, которые секретируют антитела с желаемой антигенной специфичностью и/или биологической активностью. Фактически, супернатант клеток из таких
клеточных культур используют для выявления одной или нескольких культур, содержащих антитела,
обладающих такой антигенной специфичностью и/или биологической активностью. Такие показатели
-4-
019505
как антигенсвязывающая специфичность и/или биологическая активность могут рассматриваться применительно к любому человеческому антигену, антигену млекопитающего, вирусному антигену, бактериальному антигену, растительному, паразитарному, органическому или неорганическому антигену, представляющему определенный интерес.
Успешное выделение таких популяций клеток определяется возможностями выращивания клеток,
доступностью теста для их скрининга и частотой встречаемости антиген-специфичных В-клеток в исходном материале (в основном, в периферической крови донора или в пуле от нескольких доноров).
Практически, иммортализованные клетки, секретирующие антитела, должны культивироваться в условиях, которые позволяют достичь максимальной пролиферации клеток и максимальной секреции иммуноглобулинов, а также в рамках которых можно непосредственно использовать культуральные супернатанты для выявления желаемой активности. При необходимости, популяция клеток может быть далее
разделена на отдельные пулы для целей скрининга пулов клеток, демонстрирующих желаемую антигенную специфичность и/или биологическую активность, до стадии выделения одной или нескольких клеточных культур, каждая из которых секретирует моноклональное антитело, обладающее желаемой антигенной специфичностью и/или биологической активностью в клеточном супернатанте.
В этой связи, моноклональное антитело с желаемой антигенной специфичностью и/или биологической активностью может быть получено путем размножения клеточной культуры с последующей очисткой моноклонального антитела из супернатанта такой клеточной культуры. Дополнительно может быть
выделена ДНК, кодирующая моноклональное антитело, и далее использована для рекомбинантной экспрессии антитела в хозяйских клетках.
Другие объекты настоящего изобретения включают популяции иммортализованных клеток, секретирующих антитела и поддерживаемых в условиях клеточной культуры (в частности, в условиях культур
поликлональных, олигоклональных или моноклональных клеток, секретирующих антитела), получаемых
согласно способам настоящего изобретения, которые могут далее использоваться для идентификации и
получения моноклональных антител, обладающих желаемой антигенной специфичностью и/или биологической активностью. Указанные антитела могут быть непосредственно выделены и очищены из культур или получены в виде рекомбинантных белков с использованием последовательностей ДНК, кодирующих их и выделяемых из специфической клеточной культуры. Дополнительно библиотеки ДНК, содержащие последовательности ДНК, которые кодируют последовательности антител одного или более
специфических изотипов, могут быть получены с использованием нуклеиновых кислот, выделяемых из
популяции клеток согласно настоящему изобретению, в частности из популяции клеток, которые, как
было показано, секретируют антитела, обладающие любой представляющей интерес активностью: связывающей активностью и/или биологической активностью.
Другие объекты настоящего изобретения относятся к применению популяции клеток, клеточных
культур, супернатантов клеточных культур и библиотек ДНК, получаемых согласно способам настоящего изобретения из клеток, секретирующих антитела, с целью идентификации и продукции моноклональных антител. Указанные продукты, получаемые согласно способам настоящего изобретения, могут быть
включены в состав наборов, применяемых для идентификации и продукции моноклональных антител,
обладающих желаемой антигенсвязывающей спефицичностью и/или биологической активностью, или
могут применяться для определения признаков специфичного по изотипу иммунного ответа на аутологичный или гетерологичный антиген, вирус, бактериальную клетку, токсин, паразитарную клетку или
вакцину в организме индивидуума (или в популяции индивидуумов).
Популяции клеток и клеточных культур, получаемые согласно способам настоящего изобретения,
могут быть включены в формат методик, используемых для получения клеточных культур, которые секретируют моноклональные антитела в супернатант культуры клеток и которые затем могут быть размножены с целью дальнейшей очистки мноклональных антител.
Приведенные в тексте примеры описывают средства и условия применения способов согласно настоящему изобретению с целью создания EBV-иммортализованных популяций человеческих В-клеток с
получением из одного и того же биологического образца моноклональных или олигоклональных популяций клеток, экспрессирующих антиген- или вирус-специфические человеческие IgG антитела.
Описание чертежей
Фиг. 1 - схема процесса выделения и экспрессии моноклональных антител, включающего способы
согласно настоящему изобретению для целей получения иммортализованных клеток, секретирующих
антитела.
Фиг. 2 - эффект на пролиферацию первичных В-клеток, культивируемых в присутствии IL-2 (1000
Ед/мл), одного или в сочетании с CpG2006, LPS, SAC или CD40L. Человеческие CD22-положительные
В-клетки очищают с использованием магнитного разделения из ПМНК, объединенных от пяти доноров.
В-клетки культивируют в течение 4 дней в присутствии данных концентраций указанных соединений. К
культуре добавляют 3Н тимидин только в последний день и инкубируют с меченым нуклеотидом в течение 8-12 ч. Во всех экспериментах образцы культивируют только со средой, содержащей IL-2, или со
средой, содержащей CpG2006. Эффекты сочетания IL-2 со стимулирующими агентами LPS (A), SAC (В)
и CD40L (С) оценивают, как было указано выше. Показатель числа импульсов в минуту (имп./мин) реги-5-
019505
стрируется в виде среднего значения для трех ячеек. Различные абсолютные значения показателя
имп./мин для (А), (В) и (С) связаны с различиями в удельной активности партий 3Н тимидина, используемых в каждом из экспериментов.
Фиг. 3 - дозозависимый эффект CpG2006 на пролиферацию человеческих CD22-положительных Вклеток. Человеческие CD22-положительные клетки очищают путем магнитного разделения ПМНК, собранных от пяти доноров. В-клетки культивируют с указанной концентрацией CpG2006 и IL-2 (1000
Ед/мл) в течение 2 дней. Под микроскопом по методике исключения красителя трипанового синего определяют число жизнеспособных клеток (А). Параллельно, методом проточной цитометрии анализируют
десять тысяч вариантов для каждого указанного условия культивирования (В) и определяют процент
жизнеспособных клеток (черные прямоугольники) и бластных клеток (клетки с более высоким прямым и
ортогональным рассеянием, белые прямоугольники).
Фиг. 4 - FACS-анализ жизнеспособности и бластной дифференциации CD22- или CD19положительных В-клеток, очищенных с использованием методов магнитного разделения ПНМК, объединенных от пяти доноров. Анализ проводят до (А) или после (В) 4-дневного культивирования с сочетанием CpG2006 (1 мкг/мл) и IL-2 (1000 Ед/мл) (В). Для каждой панели анализируют 10000 событий по
прямому рассеянию (горизонтальная ось) и ортогональному рассеянию (вертикальная ось), рассматриваемому в качестве меры размера и гранулярности соответственно. Жизнеспособные В-клетки проходят
в R1 участок. Мертвые клетки со сниженным уровнем прямого рассеяния собираются по вертикальной
оси за пределами R1 участка. Клетки, подвергающиеся бластной дифференциации, обладают более высоким прямым и ортогональным рассеянием.
Фиг. 5 - кинетика клеточной пролиферации и сохранения жизнеспособности В-клеток, стимулированных соответствующим агентом (стимуляция сочетанием CpG2006 и IL-2). Человеческие CD22положительные клетки отбирают путем магнитного разделения ПМНК, объединенных от пяти доноров.
Клетки культивируют в присутствии CpG2006 (1 мкг/мл) и IL-2 (1000 Ед/мл) в течение указанного периода времени до соответствующих временных точек. Пролиферацию оценивают по включении 3Нтимидина.
Фиг. 6 - влияние сочетания CpG2006 и IL-2 на EBV-опосредованную иммортализацию человеческих В-клеток. (A) CD22-положительные В-клетки выделяют и очищают из пула, собранного от 5 доноров, путем селекции с использованием магнитных шариков и культивируют в течение 2 дней, только в
среде (черные прямоугольники) или в среде, содержащей CpG2006 (1 мкг/мл) и IL-2 (1000 Ед/мл) (белые
прямоугольники). Затем клетки промывают и снижают уровень IgM-положительных клеток в процессе
клеточной сортировки. CD22-положительные, IgM-отрицательные клетки подвергают иммортализации
путем культивирования в течение ночи с использованием 50% (об./об.) супернатанта, содержащего EBV,
в культуральной среде. Отбирают среду от клеточной культуры, которая содержит EBV, клетки культивируют в среде, содержащей IL-2 (1000 Ед/мл) и облученные аллогенные ПМНК, в течение указанного
количества дней (В). CD22-положительные, IgM-отрицательные В-клетки выделяют и очищают из пула
от 5 доноров путем селекции с использованием магнитных шариков и подвергают иммортализации в
культуре с использованием 30% (об./об.) культуральной среды, содержащей EBV, в отсутствие (черные
прямоугольник) или в присутствии (белые прямоугольники) CpG2006 (1 мкг/мл) и IL-2 (1000 Ед/мл) с
использованием облученных аллогенных ПМНК в качестве питательного слоя. И в варианте (А), и варианте (В) количество жизнеспособных лимфобластов (крупные клетки) оценивают под микроскопом по
методике исключения красителя трипанового синего.
Фиг. 7 - показан фенотип CD22-положительных, IgM-отрицательных В-клеток после 2 дней предварительной стимуляции CpG2006 и IL-2, EBV-иммортализации и культивирования в течение 10 дней (с
использованием IL-2 и питательного слоя облученных аллогенных ПМНК в отсутствие EBV и CpG2006).
(А) Анализируют 10000 событий в рамках FACS-дот-анализа, где вертикальная ось изображает уровень
флуоресценции IgM и горизонтальная ось показывает прямое рассеяние (как меру размера клеток). Все
жизнеспособные бластные клетки с высокими уровнями прямого рассеяния собираются в правых квадратах. IgM отрицательные клетки показаны в двух квадратах нижних, при этом жизнеспособные бластные клетки, которые не экспрессируют IgM антитела (и которые в большей мере экспрессируют IgG антитела), присутствуют в нижнем правом квадрате. (В) Проиллюстрирован анализ методом иммунодиффузии, проводимый с использованием супернатантов EBV-иммортализованных CD22-положительных,
IgM-отрицательных В-клеток, стимулированных и отобранных в соответствии с условиями пункта (А).
Отработанную среду концентрируют в 5 раз перед тестированием. Тест проводят в присутствии полного
набора секретированных человеческих иммуноглобулинов (αhIg), человеческих IgM (αhIgM) и человеческих IgG (αhIgG) в супернатанте клеточной культуры с использованием специфичных по изотипу антител.
Фиг. 8 - сравнение поликлональных популяций клеток, полученных по методам BASIC, COMBINED и SEQUENTIAL: (A) схематическое представление процедуры получения поликлональных популяций клеток в соответствии с методами BASIC, COMBINED и SEQUENTIAL. (В) Популяции подвергают сравнению с точки зрения общего числа клеток (измеряемого методом проточной цитометрии) и
-6-
019505
содержания фракции жизнеспособных клеток (измеряемого по методу исключения иодида пропидия и по
методу проточной цитометрии, как описано в разделе "Материалы и методы").
Фиг. 9 - CD22-положительные, IgG-положительные клетки получают с использованием протоколов
BASIC, COMBINED и SEQUENTIAL, описанных применительно к фиг. 8 и в рамках примера 2. Полученные популяции анализируют методом проточной цитометрии (при использовании процедуры исключения иодида пропидия, левая панель) и, в частности, применительно к клеткам, собравшимся в зоне R2,
для оценки экспрессии CD23 (с использованием метода прямой иммунофлуоресценции: правая панель) в
конце десятидневного культивирования. Уровень экспрессии CD23 в этих клетках, которые, по существу, представляют собой жизнеспособные фибробласты, проиллюстрирован как log флуоресценции на
горизонтальной оси (высокий и средний уровень) и в виде относительного числа клеток, экспрессирующих данное количество CD23, которое показано на вертикальной оси. Уровень флуоресценции, рассматриваемый как отрицательный (neg), определяют с использованием меченого, отрицательного по данному
изотипу контрольного антитела.
Фиг. 10 - анализ IgG секреции в клеточных культурах, проводимый с использованием методов BASIC, COMBINED и SEQUENTIAL. Бесклеточные супернатанты собирают после 10-дневного культивирования (см. фиг. 8А) и определяют концентрацию IgG в серийных разведениях супернатанта с использованием коммерческого набора для проведения ИФТФА с целью оценки общего содержания человеческих IgG. Определяют абсолютное количество IgG в каждом супернатанте и сравнивают его со стандартной кривой для очищенного человеческого IgG, включенной производителем в набор для ИФТФА, где
линейный диапазон концентрации достигает плато в концентрации примерно 150 мкг/мл. Все разведения
супернатанта в формате последовательного процесса приводят к получению измерений, выходящих за
пределы линейного диапазона стандартной кривой и при экстраполяции на основе этих результатов может быть сделан вывод, что общая концентрация IgG превышает 200 мкг/мл. По этой причине полученный результат изображен на чертеже в виде прерывистой линии.
Фиг. 11 - схематическое изображение общего процесса идентификации человеческих В-клеток, секретирующих IgG антитела, которые связывают и/или нейтрализуют человеческий цитомегаловирус
(CMV), включающего способы настоящего изобретения по иммортализации клеток, секретирующих антитела, таких как человеческие В-клетки.
Фиг. 12 - идентификация культур EBV-иммортализованных, IgG секретирующих человеческих Вклеток, которые были получены с использованием процесса, представленного на фиг. 11, для целей выделения IgG антител с разной активностью. (А) Супернатанты от культур иммобилизованных EBVклеток CMV сероположительного донора инкубируют с указанными изолятами человеческого цитомегаловируса (CMV) и затем добавляют к указанным человеческим клеткам. AD169 представляет собой лабораторный штамм человеческого CMV. VR1814 представляет собой клинический изолят человеческого
CMV. HELF обозначает человеческие эмбриональные фибробласты легкого, и HUVEC представляют
собой эндотелиальные клетки пупочной вены человека. Нейтрализующую активность культуральных
супернатантов, содержащих выбранные человеческие IgG антитела, выражают в виде снижения инфицирующей активности CMV (оцениваемого, по меньшей мере, по результатам двух тестов). Приведенные
данные были получены при оценке иммуногистохимического окрашивания очень раннего антигена CMV
(IEA). В качестве отрицательного контроля использовали только культуральную среду для клеток. (В)
Объединяют супернатанты культур EBV-иммортализованных человеческих В-клеток (5 супернатантов/пул) и анализируют по методу ИФТФА для выявления человеческих IgG антител, которые связываются с человеческим белком HSP60. Приведенные данные относятся к средним значениям, полученным
при повторном анализе ячеек. Приведенная линия указывает стандартное значение (3 раза превышает
уровни, наблюдаемые только для клеточной культуры (RPMI1640 и 10% ФСТ). Образцы положительного контроля (коммерческое мышиное противочеловеческое антитело к HSP60 в указанных концентрациях) и образец отрицательного контроля (mIgG, неспецифический мышиный IgG) анализируют с использованием противомышиного IgG. Все другие контрольные образцы (два отрицательных контроля, включающих только среду или нерелевантный человеческий IgG, hIgG, и образцы, содержащие супернатанты
клеточных культур, анализируют с использованием коммерческого противочеловеческого IgG антитела.
Фиг. 13 - графическое представление процедуры получения популяций иммортализованных клеток,
секретирующих антитела, согласно настоящему изобретению, начиная от получения образца крови от
донора-человека, демонстрирующего CMV нейтрализующую активность. Олигоклональные и монклональные популяции иммортализованных клеток идентифицируют в соответствии со свойствами антител,
выявленных в супернатантах клеточных культур: секретируемые антитела, которые связываются общим
белковым экстрактом CMV (по данным тестирования с использованием набора, BEIA-CMV для
ИФТФА), которые связывают специфические антигены (по данным тестирования с использованием
фрагментов CMV белков, gB и gH) и/или которые нейтрализуют CMV инфекцию в тесте in vitro.
Фиг. 14 - идентификация культур EBV-иммортализованных, IgG-секретирующих человеческих Вклеток, которые были получены в рамках процесса, изображенного на фиг. 13, для выделения IgG антител, связывающихся с белками CMV. CD22-положительные, IgG-положительные В-клетки от CMV донора, обладающие нейтрализующей активностью в сыворотке, получают с использованием протокола
-7-
019505
SEQUENTIAL, описанного в примере 2. Супернатант из 10-дневной клеточной культуры (объемной
культуры CMV5), полученный на основе созданной популяции, собирают и хранят при температуре 4°С,
после чего анализируют с использованием набора BEIA-CMV для ИФТФА, как описано в разделе "Материалы и методы". Затем клеточную культуру распределяют по 20 ячейкам в 96-ячеечных планшетах и
культивируют в присутствии облученных аллогенных ПМНК в качестве питательных клеток, CpG2006 и
IL-2 в течение 4 недель. Бесклеточные супернатанты, которые были получены из ячеек, содержащих популяции активно пролиферирующих клеток, подвергают скринингу с использованием набора BEIA-CMV
для ИФТФА. Используется положительный контроль (калибратор 2, 10 AU/мл), включенный в набор для
ИФТФА в соответствии с инструкциями производителя. Отрицательный контроль представлен только
средой (IMDM с добавлением L-глютамина, NEAE, 10% ФСТ, CpG2006 и IL-2). Показаны результаты,
полученные для 20 репрезентативных клеточных культур. Горизонтальная линия указывает двукратное
значение пороговой величины для данного теста.
Фиг. 15 - белковая последовательность вариабельных участков тяжелой цепи (A; VH; SEQ ID NO:
3) и легкой цепи (В; VL; SEQ ID NO: 8) для антител, секретированных клетками в ячейке 9G8 (см. фиг.
14). CDR последовательности для тяжелой цепи (HCDR1, SEQ ID NO: 4; HDCR2, SEQ ID NO: 5; HCDR3,
SEQ ID NO: 6) и легкой цепи (LCDR1, SEQ ID NO: 9; LDCR2, SEQ ID NO: 10; LCDR3, SEQ ID NO: 11)
были предсказаны по результатам тестирования с использованием разных методик, в основе которых
лежит сравнение известных последовательностей антител, в частности по таким протоколам, как VQuest, поставляемый компанией IMGT (Giudicelli V. et al., 2004; доступный на сайте компании
http://imgt.cines,fr/IMGT vguest/share/textes/index.html), где данные последовательности подчеркнуты. Используют десять тысяч клеток из клеточной культуры для определения двух последовательностей с использованием стандартных протоколов. Клетки осаждают и экстрагируют мРНК для продукции кДНК
путем 5'-RACE амплификации с использованием вырожденных праймеров VH и VL. Затем указанные
последовательности клонируют в плазмидах, используемых для трансформации бактериальных клеток.
Определяют консенсусные последовательности ДНК, кодирующей вариабельные участки в тяжелой цепи (SEQ ID NO: 2) и легкой цепи (SEQ ID NO: 7), с использованием последовательностей, отобранных
независимо по меньшей мере из 4 клонов бактериальных клеток.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам повышения эффективности получения иммортализованных клеток, секретирующих антитела и скрининга на основе антигенной специфичности и/или биологической активности секретированных антител.
В частности, приведенные примеры показывают как пролиферирующая активность, жизнеспособность и процесс секреции антител человеческими В-клетками в условиях клеточной культуры, которая
была иммортализована с использованием вируса Эпштейна-Барр, могут быть улучшены за счет использования соответствующих сочетаний средств и условий, воздействующих на первичные клетки, выделенные от доноров.
Было обнаружено, что выбор специфических средств и условий, имеющих отношение к отбору клеток и их стимуляции, неожиданно оказывает выраженный усиливающий эффект на процесс получения
жизнеспособных и пролиферирующих клеток, секретирующих антитела, что вносит определенный вклад
в достижение большего разнообразия и числа иммортализованных клеток, секретирующих антитела, которые позже могут быть подвергнуты непосредственно скринингу с использованием культуральных супернатантов.
Приведенные в тексте примеры также показывают, что первоначальный отбор клеток из биологических образцов может быть основан на использовании одного или более маркеров клеточной поверхности, после чего следует фаза стимуляции, в рамках которой клетки подвергают воздействию одного или
более стимулирующих агентов. Однако стимулирующие агенты демонстрируют свою максимальную
активность, без воздействия на жизнеспособность клеток и их пролиферацию, только лишь при их использовании в определенных концентрациях и в определенных соотношениях на специфически отобранной популяции клеток в течение определенного периода времени. Кроме того, должно быть проведено
четкое временное и физическое разграничение между стадиями стимуляции и иммортализации, поскольку отмечались отрицательные эффекты при одновременной экспозиции клетки со стимулирующим агентом и агентом иммортализации.
В частности, приведенные примеры показывают, как эти элементы могут быть объединены для установления эффективных и воспроизводимых методов EBV-иммортализации человеческих IgM отрицательных (или IgG-положительных) В-клеток, которые могут быть впоследствии клонированы и скринированы с использованием супернатантов клеточных культур и в соответствии со связывающими и/или с
функциональными свойствами продуцируемых ими антител (такими как нейтрализующая активность в
отношении цитомегаловирусной инфекции в человеческих клетках) и которые в итоге могут быть выделены и клонированы с целью дальнейшей характеристики и продукции антител в виде рекомбанантных
белков.
Последовательные методы, включающие отдельные стадии отбора клеток и их активации перед
иммортализацией, описаны в литературе только лишь применительно к антиген-специфическим популя-8-
019505
циям клеток, которые были предварительно иммунизированы in vitro, зачастую с использованием протоколов слияния с миеломными клетками, в дополнение к использованию (или вместо использования) вирусного агента иммортализации.
Таким образом, проводят либо истощение по специфическим типам клеток первичных популяций
В-клеток с использованием цитотоксического агента с последующим воздействием антигена, объединенного с цитокинами и факторами роста (Borrebaeck С. et al., 1988; Davenport С. et al., 1992; LarocheTraineau J. et al., 1994), либо проводят обработку в рамках антиген-специфической процедуры обработки,
после чего размножают на слое питательных клеток перед проведением окончательной селекции (Steenbakkers P. et al., 1993; Steenbakkers P. et al., 1994).
Популяции клеток, секретирующие антитела, были иммортализованы с использованием стандартной процедуры EBV-иммортализации или с использованием объединенной трансформации под действием EBV и онкогена (US 4997764), в рамках процедуры EBV-иммортализации или неспецифической активации клеток, с последующим слиянием с миеломной клеточной линией (Niedbala W. and Stott D., 1998;
WO 02/46233) и отбором клеток, экспрессирующих антитела, обладающие специфическим изотипом после EBV-иммортализации (Morgenthaler N. et al., 1996), или при отборе клеток с последующим проведением EBV-иммортализации в присутствии агента, активирующего В-клетки (WO 91/09115; Hur D. et al.,
2005; Traggiai E. et al., 2004; Tsuchiyama L. et al., 1997; WO 04/076677).
Однако ни в одном из указанных документов не описывается эффективный способ, ассоциированный со средствами и условиями, применяемыми для достижении отбора и активации клеток перед иммортализацией с достижением эффективности процесса вирусной иммортализации, который приводит, в
частности, к получению поликлональных популяций клеток, которые могут быть широко и направленно
использоваться для идентификации олигоклональных или моноклональных популяций клеток, экспрессирующих антитела с желаемым изотипом и желаемой биологической активностью.
Основным объектом настоящего изобретения является способ иммортализации клеток, которые
секретируют антитела одного или более специфических изотипов, где указанный способ включает следующие стадии:
a) отбор популяции клеток из одного или более биологических образцов, которые секретируют антитела в независимом от антигена режиме, и на основе экспрессии по меньшей мере одного маркера клеточной поверхности;
b) стимуляция указанной популяции отобранных клеток по меньшей мере одним стимулирующим
агентом в условиях клеточной культуры;
c) удаление указанного стимулирующего агента из клеточной культуры;
d) отбор из данной клеточной культуры популяции стимулированных клеток, которые экспрессируют антитела указанных специфических изотипов;
e) воздействие на указанную популяцию отобранных и стимулированных клеток агентом иммортализаци в условиях клеточной культуры;
f) удаление указанного агента иммортализации из указанной клеточной культуры в том случае, когда агентом иммортализации является вирусный агент иммортализации.
Указанный метод может быть объединен с серией дополнительных стадий, которые имеют отношение к анализу и использованию популяции клеток, получаемых при использовании данного метода (фиг.
10). В частности, приведенные ниже две стадии должны проводиться после стадии (f), поскольку они
важны для установления клеточных культур, включающих указанную популяцию клеток:
g) поддержание популяции клеток, полученных из указанной клеточной культуры, в условиях клеточной культуры;
h) определение числа, жизнеспособности и/или пролиферирующей активности популяции клеток,
которые секретируют антитела указанных специфических изотипов в данной клеточной культуре.
Приведенные в описании чертежи дополнительно поясняют, как рассматриваемые в настоящем
изобретении способы могут быть применены, в частности, на человеческих В-клетках, выделенных из
образцов периферической крови, для получения культур моноклональных клеток, секретирующих антитела, представляющих интерес.
Фактически, способы согласно настоящему изобретению позволяют получать, с одной стороны,
популяции клеток, которые эффективно представляют в независимом от антигена режиме гетерогенность
репертуара антител желаемых изотипов, экспрессируемых в первичных клетках, которые были взяты от
индивидуумов и которые были отобраны для вирусной иммортализации.
С другой стороны, чем более однородными по жизнеспособности и по высокой пролиферативной
активности являются популяции иммортализованных клеток, секретирующих антитела, которые получают согласно способам настоящего изобретения, тем более глубокий анализ репертуара таких клеток
может быть проведен применительно к различным биологическим продуктам, получаемым либо в условиях клеточной культуры (например, в популяции клеток, в супернатантах клеточных культур, содержащих высокие количества антител), либо в составе других молекулярных структур (например, в библиотеках ДНК, получаемых с использованием нуклеиновых кислот, экстрагированных из олигоклональных
популяций клеток).
-9-
019505
Кроме того, способы согласно настоящему изобретению обеспечивают возможность получать достаточное количество антител и иммортализованных клеток, секретирующих антитела, которые могут
быть непосредственно охарактеризованы в клеточных культурах, образуемых при делении поликлональной популяции иммортализованных клеток, секретирующих антитела (свежеполученные или ранее изготовленные замороженные и оттаявшие клетки) в пулах, статистически содержащих 20 или менее клеток,
и растущих в стандартных условиях. Сниженное число стадий клонирования (фактически, одна единственная стадия, в отличие от обычно используемых двух или более стадий) сокращает время, необходимое для модификации иммортализованных клеток, секретирующих антитела, представляющие интерес,
ограничивает риск их потери на стадиях субклонирования и ускоряет весь процесс характеристики антител в различных тестах in vivo или in vitro. Это чрезвычайно важно для выделения редких антител, специфичных для терапевтических целей, которые могут быть получены более быстро и удачно.
В этой связи способы согласно настоящему изобретению могут быть адаптированы и интегрированы в более сложные комплексные стратегии идентификации и продукции моноклональных антител специфических изотипов, которые описаны в приведенном ниже тексте (см., в частности, пример 3) и проиллюстрированы на чертежах (см., в частности, фиг. 1, 11 и 13).
Определения и дополнительные характеристики средств и условий, применимых к способам согласно настоящему изобретению, указаны в следующих абзацах, вместе с описанием возможных вариантов использования этих методов и продуктов, которые могут быть получены в рамках таких методов (с
использованием популяций клеток, культур клеток, супернатантов клеточных культур, антител, в частности человеческих моноклональных антител).
Термин "популяция", применительно к клеткам, относится к любой группе клеток (в данном случае
клеток, секретирующих антитела), которые выделяют с использованием одних и тех же критериев или
получаемых в рамках одних и тех же способов. Так, например, рассматриваемые популяции клеток представляют собой такие популяции, которые получают на стадии селекции (т.е. на стадии сортировки клеток), на стадии обработки (например, стимулирующим агентом или вирусным агентом иммортализации)
или на стадии деления культуры или популяции клеток с получением более мелких пулов клеток, содержащих статистически то же количество клеток (например, в том случае, когда проводят субклонирование
клеточной культуры или получают ампулы с иммортализованными клетками, подлежащими замораживанию для длительного хранения). Популяция должна быть жизнеспособной, но она не обязательно
должна демонстрировать специфическую биологическую активность (например, рост, пролиферацию
или секрецию антител), что обязательно в условиях клеточной культуры.
Термин "культура", применительно к клеткам, относится к популяции клеток, которые поддерживаются в контейнере (например, в ячейке планшета, чашке Петри, в колбе, бутыли) с возможностью для
клеток демонстрировать биологическую активность (например, рост, пролиферацию или секрецию антител) и/или с возможностью обработки их специфическими соединениями (например, стимулирующими
агентами или агентами иммортализации). Такие экспериментальные условия (т.е. условия клеточной
культуры) включают использование инкубаторов, поддерживаемых в условиях температуры и атмосферы (в сочетании с использованием соответствующей среды для культивирования клеток), соответствующим образом выбранных для достижения роста и пролиферации клеток.
Соответственно, клеточная культура состоит из популяции клеток в сочетании с определенной средой для культивирования клеток (включающей сыворотку, ростовые факторы, цитокин, питательные
компоненты и т.п.) и, как в случае клеток, секретирующих антитела, дополнительные клетки, которые
также культивируют для поддержания роста и пролиферации популяции клеток (так называемые "питательные" клетки). Через несколько дней или недель состав среды в клеточной культуре изменяется не
только за счет потребления клеток, но также за счет образования большого разнообразия молекул, которые клетки секретируют или просто высвобождают, когда они входят в стадию апоптоза и погибают.
Таким образом, среда для клеточной культуры регулярно замещается новой средой или она может быть
частично отобрана для анализа состава данной культуральной среды. Использованная среда от клеточной
культуры (определяемая в литературе как "супернатант" клеточной культуры, а также как "отработанная" или "кондиционированная" среда от клеточной культуры) может быть отобрана в фиксированные
временные точки для определения, например содержания и активности антител, которые были секретированы популяцией клеток в условиях культивирования клеток. Эта информация в сочетании с данными
по жизнеспособности и пролиферирурющей активности таких клеток должна использоваться для определения состояния и возможного варианта использования клеточной культуры (например, для выделения
мРНК, в скрининг-тестах, для очистки моноклональных антител, для сбора клеток, подлежащих замораживанию и т.п.).
Термин "поликлональные", применительно к культуре или популяции клеток, которые экспрессируют высокое количество различных антител (например, 103, 104, 105 или более), где каждое из них экспрессируется одной или группой клеток в культуре или в популяции. В частности, это относится к культуре или популяции клеток, получаемых по методам согласно настоящему изобретению (поскольку они
создаются в независимом от антигена режиме в клетках, присутствующих в биологическим образце),
которые не делятся в культурах или популяциях или, в максимальном варианте, делятся в культурах или
- 10 -
019505
популяциях, исходно содержащих 50 или более клеток (например, 200, 500, 1000 или более клеток), как
может быть статистически определено на основе данных по разведению исходной поликлональной культуры или популяции.
Термин "олигоклональный" относится к культуре или популяции клеток, получаемых при делении
культуры или популяции клеток с образованием культур или популяций, исходно содержащих менее чем
50 клеток (например, 40, 20, 10, 5, 1 или менее чем 1 клетка), что может быть статистически определено
на основе данных по разведению исходной культуры или популяции клеток.
Олигоклональные культуры или популяции клеток, которые получают при делении культуры или
популяции клеток с образованием культур или популяций, исходно содержащих 20 клеток или менее,
представляют особый интерес. Фактически, если в полученной клеточной культуре выявляется единственная или в высшей степени доминирующая биологическая особенность (например, антитело, идентифицированное как белок, секретируемый в супернатант клеточной культуры по результатам биологического теста, или как транскрибированный ген в виде мРНК, выделенной из культуры по процедуре ОТПЦР), такая клеточная культура может рассматриваться как моноклональная клеточная культура.
"Моноклональная клеточная культура" представляет собой клеточную культуру, которая включает
(или содержит в подавляющем большинстве) клетки, идентичные друг другу, которые образуются в результате пролиферации (и необязательно дифференциации) одной клетки (клона), как это может быть
оценено, по меньшей мере, на основе одной специфической биологической особенности (например, секреции специфического антитела), которая используется для селекции клеточной культуры. Таким образом, антитело, популяция клеток или клеточная культура, полученные из такой культуры, могут быть
идентифицированы как моноклональное/ая, хотя могут потребоваться дополнительные эксперименты
для оценки активности с целью более точного установления клональности.
Термин "иммортализованный" относится в основном к культурам и популяциям клеток, получаемым согласно способам настоящего изобретения после воздействия на отобранную и стимулированную
популяцию клеток вирусного агента иммортализации. Несмотря даже на то, что вирусная иммортализация может быть ассоциирована с наличием специфических вирусных продуктов (например, белков,
транскриптов), клетки определяются как иммортализованные, если они демонстрируют непрерывный
рост и пролиферацию в условиях клеточной культуры. Как показано в приведенных ниже примерах, первичные человеческие В-клетки. которые получают из биологического образца и которые экспрессируют
антитела, могут быть успешно использованы для получения поликлональных популяций клеток, которые
затем используют для получения олигоклональных культур клеток, содержащих по меньшей мере 104
клеток. В том случае, когда культуру начинают растить от 100, 50, 20 или даже 5 клеток, такое суммарное
число клеток совместимо только с числом клеточных делений (10 или более клеточных линий), которое в
основном могут осуществлять в условиях клеточной культуры только иммортализованные клетки.
Термин "клетки, секретирующие антитела" относится к первичным клеткам, которые содержат гены, необходимые для экспрессии антител и которые обладают способностью секретировать их во внеклеточное пространство (например, в условиях in vivo в кровь или в супернатант клеточной культуры в
условиях in vitro).
Термин "иммортализованные клетки, секретирующие антитела" относится к клеткам, секретирующим антитела, которые после воздействия на них вирусного агента иммортализации, растут, пролиферируют и секретируют антитела в условиях клеточной культуры неопределенно долго или, по меньшей
мере, в течение периода времени и/или с достижением числа клеточных делений, которое в значительно
мере превосходит таковое, наблюдаемое для первичных клеток, которые не подвергались воздействию
вирусного агента иммортализации. В частности, поликлональные популяции клеток, получаемые в рамках методов согласно настоящему изобретению, являются обогащенными жизнеспособными, растущими
лимфобластами, которые являются иммортализованными клетками, секретирующими антитела, и которые затем формируют олигоклональные и моноклональные популяции клеток в условиях клеточной
культуры.
Термин "стимулирующий агент" относится к соединению или специфическому сочетанию соединений, способных вызывать стимулирующий ответ, опосредованный клетками, секретирующими антитела,
способных к индукции пролиферации и бластного преобразования этих клеток и к формированию лимфобластов (крупных жизнеспособных клеток, определяемых под микроскопом и по методу прямого/ортогонального рассеяния в рамках FACS-анализа) в условиях клеточной культуры.
Термин "фаза стимуляции" относится к периоду времени, в течение которого выбранные клетки,
секретирующие антитела, подвергаются воздействию стимулирующего агента.
Термин "вирусный агент иммортализации" относится к любому виду вирусной частицы, ДНК или
белка, который позволяет создавать иммортализованные клетки на основе первичных клеток, выделенных из биологических образцов. В данном случае первичные клетки представляют собой клетки, секретирующие антитела, в частности человеческие В-клетки, для которых были идентифицированы различные вирусные агенты иммортализации.
Термин "фаза иммортализации" относится к периоду времени, в течение которого выбранные и
стимулированные клетки, секретирующие антитела, подвергаются воздействию вирусного агента им- 11 -
019505
мортализации.
Стадии, предшествующие осуществлению способов согласно настоящему изобретению, являются
стадиями идентификации индивидуумов или тканей, из которых могут быть выделены биологические
образцы, содержащие клетки, секретирующие антитела.
Как было указано в разделе "Предпосылки создания изобретения", клетки, которые экспрессируют
и секретируют антитела, были выделены и иммортализованы из разных типов тканей и органов, включая
кровь, миндалины, селезенку, биологические жидкости (такие как цереброспинальная жидкость или
плевральная жидкость), лимфатические узлы и другие лимфатические органы.
Клетки, которые могут быть иммортализованы с использованием способов согласно настоящему
изобретению, должны быть выделены из тканей и органов млекопитающих. Разумеется, клетки человеческого происхождения являются предпочтительными для получения клеточных культур, секретирующих человеческие моноклональные антитела с терапевтическими или диагностическими свойствами,
полезными для использования. Тем не менее, указанные способы могут быть применимы и для клеток
животных, отличных от человека, которые секретируют антитела (в частности, в случае клеток грызунов
или клеток обезьян).
Может быть выделено множество различных типов популяции первичных клеток, секретирующих
антитела, от доноров-людей, с разными профилями, которые могут быть предпочтительны, в зависимости от состояния иммунитета донора клеток, а также в соответствии с изотипом и активностью антитела.
Способы согласно настоящему изобретению могут быть применимы для идентификации моноклональных антител, экспрессируемых человеческими В-клетками, отобранными от доноров, таких как пациенты, которые были подвержены воздействия инфицирующего агента или которые имеют специфические формы рака или аутоиммунного заболевания. Таким образом, указанный донор может представлять
собой организм, не подвергавшийся ранее воздействию антигена, вакцинированный организм, организм,
пораженный одним или несколькими заболеваниями или инфекциями, организм, который уже подвергался и/или является резистентным к специфическим терапевтическим процедурам, который демонстрирует специфический клинический индекс или статус, который непроизвольно подвергался воздействию
патогена и т.п.
Донорская сыворотка может быть использована как таковая для проведения исходного определения
ее серопозитивной реакции на антиген, поскольку специфичность и длительное поддержание адаптивных иммунных реакций (вплоть до нескольких лет после последнего воздействия антигена) могут позволить провести качественное определение, достаточное для отбора доноров. Природа и чувствительность
используемого для скрининга теста является решающим фактором в определении наиболее подходящего
донора и предпочтительно тест, используемый для скрининга донорской сыворотки, должен быть тем
же, что и тест, используемый для скрининга супернатантов от иммортализованных В-клеток, секретирующих антитела, и разработанный с целью выявления антитела с желаемой функциональной активностью (например, препятствующих поступлению вирусов в клетки или связывающихся с опухолеассоциированным антигеном).
В клиническом контексте выбор тканей или органов, из которых клетки могут быть выделены и
очищены, диктуется доступностью таких клеток в достаточном количестве для проведения всего процесса. В связи с тем, что клетки могут быть получены из клинических образцов человека в небольших количествах и/или получены в тех местах, где не могут быть проведены методы иммортализации, клетки могут быть получены из замороженных образцов и/или из образцов, взятых от большого числа индивидуумов, после их объединения с получением достаточного количества исходного материала.
Таким образом, первичный скрининг может быть проведен на панели доноров-кандидатов с использованием образцов, содержащих клетки, секретирующие антитела (таких как объединенная периферическая кровь или объединенная периферическая сыворотка). В частности, мононуклеарные клетки могут быть выделены из крови или лимфатических тканей с использованием стандартных методик очистки,
подходящих для целей выделения мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК), таких как
центрифугирование в градиенте плотности. После и/или перед указанной стадией разделения образцы
сыворотки (или плазмы), супернатантов клеточной культуры или клеток (получаемых от разных пациентов, из разных тканей и/или в разные временные точки) могут быть подвергнуты предварительному
скринингу с использованием стандартных методик, направленных на выявление наличия антител и клеток, секретирующих антитела (например, ИФТФА, BIACORE, Вестерн-блоттинг, FACS, SERPA, антигенсодержащие микрочипы, методы оценки нейтрализации вирусной инфекции в клеточной культуре
или тест по методу ELISPOT).
В литературе приводятся примеры таких технологий, в которых, например, используется метод
ELISPOT для характеристики иммунного ответа у вакцинированных доноров (Crotty S. et al., 2004), используются антигенсодержащие микрочипы в качестве диагностических инструментов для недавно инфицированных пациентов (Mezzasoma L. et al., 2002) и другие методы определения уровня антигенспецифических иммунных ответов (Kern F. et al., 2005). Выбор доноров может быть также основан на
ассоциации серопозитивности на специфический вирус с изменениями онкогенного характера (Butel J. et
al., 2000).
- 12 -
019505
Предварительный качественный анализ образования антител на терапевтическую мишень (при
оценке уровня общей или специфичной по изотипу активности) должен позволить осуществить идентификацию доноров, содержащих В-клетки, которые экспрессируют более высокий титр антител, направленных на желаемый очищенный антиген (например, на специфический человеческий рекомбинантный
белок, связанный с раком, или на специфический вирусный антиген), смесь близкородственных антигенов (например, полученных из частично очищенного вирусного препарата) или в рамках биотеста (например, теста на нейтрализацию вирусной инфекционности).
Как только одни или несколько доноров будут выбраны, источником В-клеток может стать селезенка, кровь, лимфатические узлы, костный мозг, опухолеинфильтрующие лимфоциты, лимфоциты из сайтов хронической инфекции/воспаления. Однако обычно периферическую кровь легче получать от доноров, хранить и оценивать по серологическому ответу против антигена в течение определенного периода
времени.
Так, например, начиная с объема 5-50 мл периферической крови, может быть выделено и очищено
примерно 10-100 млн ПМНК (периферические мононуклеарные клетки крови), т.е. такое число клеток,
которое позволяет получить достаточно крупную популяцию клеток, секретирующих антитела, подлежащие скринингу после иммортализации по методу согласно настоящему изобретению.
После выделения ПМНК из биологических образцов может быть проведен специфический отбор
клеток, секретирующих антитела, с использованием одного из множества методов, приведенных в литературе, на основе экспрессии на их поверхности маркеров клеточной поверхности и, если это применимо, других белков, а также путем оценки пролиферативной активности, метаболического и/или морфологического статуса клеток.
В частности, могут с успехом использоваться различные методики выделения и очистки клеток,
секретирующих антитела, из человеческих образцов, включающих различные средства и условия для
положительной или отрицательной селекции. Указанные клетки могут быть легче и более эффективно
отобраны с использованием физических методов разделения клеток, экспрессирующих маркеры клеточных поверхностей, специфичные для таких клеток, которые экспрессируют и секретируют антитела (например, для человеческих В-клеток). В литературе описаны соответствующие процедуры проведения
таких методик (см. Callard R. and Kotowicz K. "Human B-cell responses to cytokines" in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F. (ed.) Oxford University Press, 2000, pg. 17-31).
Отбор обычно проводят с использованием антител, которые специфически связываются с одним из
таких белков на поверхности клеток и которые могут быть связаны с твердыми подложками (например, с
микрошариками или пластиковыми пластинами) или которые мечены флуорохромом, выявляемым при
использовании флуоресцентных сортировщиков активированных клеток (FACS-анализ). Так, например,
человеческие В-клетки были отобраны на основании данных об их аффинности для подложек (таких как
микрошарики), за счет которой они связывают CD17-, CD27- и/или CD22-микрошарики, или по данным
об отсутствии связывающей аффинности для антител, специфичных для некоторых изотипов, перед проведением EBV-иммортализации (Li H. et al., 1995, Bernasconi N. et al., 2003; Traggiai E. et al., 2004).
Скорее всего, выбор клеточных маркеров может быть релевантным для достижения эффективности
процесса иммортализации в связи с наличием внутриклеточных сигналов, которые запускаются процессом селекции и которые могут менять показатели клеточного роста и их жизнеспособности. Фактически,
примеры, приведенные в данной патентной заявке, демонстрируют, что CD22, который представляет
собой ограниченный трансмембранный белок В-клеток, контролирующий пути сигнальной трансдукции,
связанные с распознаванием антигена и активацией В-клеток (Nitschke L., 2005), по всей видимости, является предпочтительной молекулой для первичного отбора В-клеток. Поскольку CD22-положительная
популяция содержит клетки, которые экспрессируют антитела с различными изотипами и с разной специфичностью, другие маркеры клеточной поверхности могут использоваться для отбора клеток, либо до,
либо после стимуляции.
Альтернативно или дополнительно, может быть достигнуто специфическое увеличение клеток, секретирующих антитела, при проведении селекции на основе CD27, дополнительно к селекции на основе
CD22. CD27 известен как маркер человеческих В-клеток, которые содержат соматически мутированные
гены вариабельного участка (Borst J. et al., 2005). Дополнительные маркеры, такие как CD5, CD24, CD25,
CD86, CD38, CD45, CD70 или CD69, также могут использоваться для снижения или для повышения
уровня желаемой популяции клеток. Таким образом, в зависимости от наличия в истории болезни донора
предшествующей экспозиции с антигеном (например, вирусного, бактериального или паразитарного
происхождения) и от титра антител может быть принято решение использовать полные, CD22обогащенные В-клетки или еще более обогащенные субпопуляции В-клеток, такие как CD27положительные В-клетки.
После отбора клеток, но до фазы иммортализации, популяцию клеток следует обработать соответствующим стимулирующим агентом. В контексте настоящего описания рассматриваются три основные
категории соединений как возможные и применимые стимулирующие агенты, особенно если их использовать в сочетании.
Первая группа стимулирующих агентов представлена активатором врожденного иммунитета, таким
- 13 -
019505
как агонист Toll-подобного рецептора, который экспрессируется на В-клетках. Toll-подобные рецепторы
(TLR) играют, по известным данным, важную роль в распознавании бактериальных олигонуклеотидов и
других соединений, демонстрирующих поликлональную активацию большого числа клеток, вовлекаемых в механизм как врожденного, так и приобретенного иммунитета (Akira S. and Takeda K. et al., 2004;
Peng S., 2005). Этот путь, функционирующий в механизме врожденного иммунитета, связанный, по
меньшей мере частично, с Toll-рецепторами, представляет собой вариант самого раннего ответа организма на внедряющиеся организмы и играет важную роль в создании соответствующего окружения и
цитокиновой среды, необходимых для мощного и специфического ответа, вовлекающего В- и Т-клетки
по механизму адаптивного иммунитета (Gay et al., 2006). Отзывчивость человеческих клеточных линий и
первичных клеток связана с некоторыми Toll-подобными рецепторами (TLR2, TLR4, TLR6, TLR7, TLR8,
TLR9, TLR10), каждый из которых характеризуется специфическим профилем экспрессии, предпочтительными лигандами и потребностями процесса распознавания.
В частности, человеческий TLR9 распознает олигонуклеотиды, более конкретно олигонуклеотиды
на основе CpG (Hemmi G. et al., 2000). TLR9-опосредованная активация соединениями на основе CpG,
такими как CpG2006, запускает изменения в окислительно-восстановительном балансе клеток и индукцию сигнальных путей в клетке, включающих митоген-активируемые протеинкназы (МАРК) и NF-κВ, с
последующей продукцией провоспалительных цитокинов, интерферонов и хемокинов (Takeshita F. et al.,
2001; Hartmann G. et al., 2000; Hartmann G. and Krieg A., 2000; Ulevich R., 2004). Человеческие не имевшие ранее контакта "необученные" подмножества В-клеток и подмножества клеток, обладающих памятью, характеризуются специфической пролиферацией и способностью к дифференцировке в ответ на
поликлональные стимулы, такие как CpG олигонуклеотиды, в результате жесткой регуляции экспрессии
TLR (Bernasconi N. et al., 2003; Bernasconi N. et al., 2002; Bourke E. et al., 2003). CpG олигонуклеотиды
индуцируют активацию врожденного иммунитета и могут защищать от летального воздействия множества патогенов (Krieg A., 2002). Так, например, указанные олигонуклеотиды, которые содержат мотив,
обозначенный как CpG-B, представляют собой особенно мощные активаторы первичных В-клеток (Krieg
A. et al., 1995; Gursel M. et al., 2002; Klinman D., 2004; Eaton-Bassiri A. et al., 2004).
Было идентифицировано несколько категорий соединений, которые активны в качестве агонистов
для Toll-подобных рецепторов (Coban С. et al., 2005; Kandimalla E.R. et al., 2005; Hayashi E. et al., 2005;
Bourke E. et al., 2003; Ambach A., et al., 2004; Sen G. et al., 2004), и, кроме того, доступны специфические
методики скрининга для оценки дифференциальной продукции классов и подклассов иммуноглобулинов
(Henault M. et al., 2005; Cognasse F., et al., 2005).
Вторая группа стимулирующих агентов представлена цитокинами, в частности интерлейкинами, в
отношении которых известно, что они обладают такой иммуностимулирующей активностью (IL-2, IL-4,
IL-6, IL-10, IL-13), и которые описаны в литературе в сравнительном аспекте (см. Callard R. and Kotowicz
K. "Human B-cell responses to cytokines" in Cytokine Cell Biology: A practical Approach. Balkwill F. (ed.)
Oxford University Press, 2000, pg. 17-31).
Третья группа стимулирующих агентов представлена агонистами рецепторов клеточных мембран
семейства TNF-рецепторов, в частности агонистами, которые активируют NF-κB путь и пролиферацию
В-клеток, такие как APRIL, BAFF или CD40L (Schneider P., 2005; Не В. et al., 2004; Craxton A. et al., 2003;
Tangye S. et al., 2003).
Важно отметить, что выбор стимулирующего агента, его концентрация, их возможное сочетание, а
также длительность фазы стимуляции должны быть такими, чтобы достичь оптимального эффекта как с
точки зрения стимуляции клеток, так и экспрессии белков, позволяющих или усиливающих иммортализацию клеток, секретирующих антитела.
Приведенные ниже примеры показывают, что используемые стимулирующие агенты, в частности,
когда вирусным агентом иммортализации является вирус Эпштейна-Барр, могут быть выбраны среди
следующих сочетаний соединений:
a) сочетание олигонуклеотида на основе CpG и цитокина;
b) сочетание агониста рецептора клеточной мембраны из семейства TNF-рецепторов и цитокина.
На основе своих стимулирующих свойств, CpG2006 был использован в одновременном режиме с
EBV для получения иммортализованных человеческих В-клеток (Traggiai et al., 2004; WO 04/76677), как
это было сделано с растворимым CD40 лигандом или агонистским антителом против CD40 (WO
91/09115; WO 94/24164; Tsuchiyama L. et al., 1997; Imadome K. et al., 2003).
Однако такого рода подход негативно влияет на поддержание и скрининг иммортализованных Вклеток, поскольку поликлональные активаторы, такие как CpG2006, обладают, как известно, мощным
воздействием на множество типов клеток, которые могут присутствовать при клонировании и/или после
процесса скрининга в культуре клеток (Hartmann G. and Krieg A., 2000; Hartmann G. et al., 2000). В частности, CpG являются мощными индукторами секреции мононуклеарными клетками цитокинов, таких
как IL-12 и IFN-γ, а наличия таких цитокинов следует избегать в последующих биотестах, особенно при
скрининге антивирусных антител (Klinman D. et al., 1996, Fearon K. et al., 2003; Abel K. et al., 2005).
Приведенные примеры показывают, как может быть получен оптимизированный ответ человече- 14 -
019505
ских CD22-положительных В-клеток на сочетание CpG2006 и IL-2 при использовании специфических
концентраций соединений, и что другие известные стимулирующие агенты (например, LPS или SAC) не
обеспечивают генерирования такого ответа.
Длительность периода времени, в течение которого выбранные клетки, секретирующие антитела,
подвергают воздействию стимулирующих агентов, имеет большое значение для установления эффективных методов иммортализации таких клеток. Соответственно, в примерах показано, что сочетание стимулирующих агентов (CpG2006 и IL-2) оказывает максимальный эффект на жизнеспособность клеток и их
пролиферацию, в частности, в специфическом временном отрезке (например, от приблизительно 2 до
приблизительно 4 дней после стимуляции). Однако альтернативные сочетания стимулирующих агентов и
временных рамок также могут быть эффективны для EBV-иммортализации или в случае использования
других вирусных агентов иммортализации.
Сочетание стимулирующих агентов может быть добавлено к клеточной культуральной среде перед
фазой иммортализации, во время иммортализации или в последовательном режиме (например, первый
стимулирующий агент добавляют сразу же после исходной селекции клеток и второй стимулирующий
агент добавляют через несколько часов или дней), если такой подход был подтвержден как полезный для
достижения лучшего ответа в случае клеток, секретирующих антитела.
Стимулирующие агенты могут быть непосредственно добавлены в среду для культивирования клеток из разбавленных стандартных растворов до или после их соответствующего изготовления, например,
с использованием липосом или других соединений, которые могут улучшать их поглощение и повышать
иммуностимулирующую активность (Gursel I. et al., 2001). Стимулирующие агенты могут быть также
присоединены к твердым матрицам (к микрошарикам или непосредственно к планшетам для культивирования клеток), что также позволяет достичь более эффективного удаления.
Учитывая указанное выше наблюдение относительно важности применения стимулирующих агентов в течение определенного периода времени и на специфической стадии реализации метода согласно
настоящему изобретению, клетки, секретирующие антитела, должны быть далее подвергнуты манипуляциям для эффективного удаления стимулирующего агента с тем, чтобы избежать любого возможного
отрицательного воздействия на последующую иммортализацию и поддержание в условиях клеточной
культуры.
В этой связи клетки могут быть промыты свежей средой один или несколько раз и необязательно
могут поддерживаться в нормальной среде для клеточной культуры (например, в течение 1-6 дней) с тем,
чтобы дополнительно разбавить и удалить любые остаточные эффекты стимулирующих агентов, которые могут быть даже подвергнуты ингибированию за счет добавления специфических соединений в клеточную культуру.
Способы согласно настоящему изобретению могут быть применены на клетках, которые были дополнительно отобраны на основе изотипа экспрессированного антитела после стимуляции таких клеток и
перед воздействием на указанные отобранные стимулированные клетки, агента иммортализации (например, между фазой стимуляции и фазой иммортализации).
Изотипический отбор клеток должен проводиться при использовании средств для положительного
(позволяющего выделение специфических клеток) или отрицательного (позволяющего удалить нежелательные клетки) отбора. Так, например, при условии, что большинство терапевтических антител, разрешенных для фармацевтического применения, представляют собой IgG (Laffi E. and Sodoyer R., 2005),
только одна популяция стимулированных IgG-положительных клеток может быть отобрана при положительной селекции (по процедуре FACS-анализа или на магнитных сепараторах клеток) или путем снижения числа клеток, которые экспрессируют IgM, в популяции клеток с последующим обогащением клетками, которые экспрессируют IgG. Методы разделения клеток, секретирующих антитела, с использованием флуоресцентной активации или магнитных сепараторов клеток известны и описаны в литературе
(Li H. et al., 1995; Traggiai E. et al., 2004). В зависимости от источника клеток, секретирующих антитела, и
их целевого использования может быть также желательно снижение (или повышение) числа клеток, экспрессирующих IgG или IgA.
Аналогичный подход может быть использован для выделения клеток с учетом специфического
подкласса, если желателен такой точный отбор (например, при разграничении человеческих В-клеток,
которые экспрессируют IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 антитела).
Выбранные и стимулированные популяции клеток, которые экспрессируют антитела, обладающие
специфическим изотипом, можно рассматривать как подготовленные для иммортализации с использованием вирусного агента иммортализации. В литературе описаны различные агенты иммортализации, которые могут использоваться применительно к клеткам, секретирующим антитела, и которые даже могут
быть объединены в рамках одного процесса с тем, чтобы достичь иммортализации клеток, секретирующих антитела.
Среди вирусных агентов иммортализации предпочтительно должен использоваться вирус, который
инфицирует и иммортализует клеток, секретирующие антитела, используемые в способах настоящего
изобретения. Вирусы, обладающие таким предпочтением, широко известны как лимфотропные вирусы,
которые сгруппированы в класс γ-вирусов герпеса. Представители данного семейства вирусов инфици- 15 -
019505
руют лимфоциты в специфическим для вида образом и ассоциированы с лимфопролиферативными расстройствами и с развитием некоторых видов злокачественных новообразований (Nicholas J., 2000; Rickinson A., 2001). EBV (вирус Эпштейна-Барр, также известный как вирус герпеса 4) и HHV-8 (человеческий вирус герпеса 8, также известный как KSHV, вирус герпеса, ассоциированный с саркомой Капоши)
инфицируют и иммортализуют человеческие лимфоциты. MHV-68 (мышиный вирус герпеса 68), HVS
(герпесвирус Samiri), RRV (резус-радиновирус), LCV (лимфокриптовирус приматов), EHV-2 (лошадиный
герпесвирус 2), HVA (herpesvirus Ateles) и AHV-1 (Alcelaphine Herpesvirus 1) представляют собой другие
онкогенные герпесвирусы, обладающие некоторыми общими консервативными генетическими свойствами и демонстрирующие близкие патогенные эффекты в разных хозяйских клетках млекопитающих.
Указанные вирусы могут использоваться во всех способах согласно настоящему изобретению и применимы к клеткам, секретирующим антитела, полученным от таких млекопитающих.
Однако не только полный вирус может быть использован для иммортализации В-клеток, но рекомбинантная конструкция ДНК, которая содержит специфические вирусные белки, получаемые посредством
таких специфических вирусов, а также другие вирусы, были успешно использованы для иммортализации
В-клеток (Damania В. 2004; Kilger E. et al., 1998). Аналогичные векторы, содержащие вирусные гены, могут
быть трансдуцированы в клетки, при этом в способах согласно настоящему изобретению иногда могут использоваться ретровирусные системы или вирусоподобные частицы в составе объединенных клеточных
линий, которые обеспечивают все необходимые факторы для образования таких частиц.
Фаза иммортализации может длиться от 1 до нескольких часов, вплоть до 2-4 дней, даже несмотря
на то, что, как показано в примерах, более длительная фаза иммортализации может оказывать неблагоприятный эффект на жизнеспособность клеток, а в случае EBV может быть достаточно по меньшей мере
4 ч для установления поликлональных популяций лимфобластов (крупных жизнеспособных клеток, определяемых под микроскопом и в рамках FACS-анализа; см. фиг. 9), которые обеспечивают получение
иммортализованных клеток, секретирующих антитела.
В приведенных примерах показано, что человеческие В-клетки могут быть эффективно иммортализованы с использованием EBV супернатантов, если они были вначале отобраны для экспрессии CD22,
затем подвергнуты стимуляции в течение соответствующего периода времени (от примерно 2 дней до
примерно 4 дней) с использованием соответствующего сочетания стимулирующих агентов (CpG2006 и
IL-2) и в итоге отобраны на основе предпочтительно изотипа (IgG-положительный или обогащенный
изотип; IgM-отрицательный или истощенный изотип).
Для проведения EBV-опосредованной иммортализации В-клеток необходима экспрессия рецептора
клеточной поверхности CD21, который рассматривается как основной рецептор EBV. CD21 присутствует
в большинстве субпопуляций В-клеток и регулирует В-клеточные ответы за счет образования комплекса
с CD19 и рецептором В-клеточного антигена (Fearon D. and Carrol M., 2000). Однако CD21 удаляется с
клеточной поверхности после интенсивной активации клеток и при их трансформации в плазматические
клетки. Таким образом, способность EBV трансформировать клетки может быть усилена при добавлении
агентов стимуляции В-клеток, но используемые условия должны гарантировать, что CD21 сохраняется
на клеточной поверхности, позволяя достичь EBV-иммортализации с высокой эффективностью.
В настоящем описании показано, как могут быть эффективно получены иммортализованные популяции клеток, секретирующих антитела. Фактически, популяции клеточных культур, обогащенные Вклетками, которые были отобраны и позже иммортализованы, будут с большей вероятностью продуцировать полезные терапевтические антитела, сохраняя при этом свою способность расти в условиях иммортализации EBV вирусом в латентном, но не литическом состоянии. В отличие от других способов, в
рамках которых В-клетки могут быть стимулированы для секреции IgG, данный процесс иммортализации позволяет "захватывать" популяцию в состоянии высокопролиферативной и IgG-секретирующей
способности. Супернатант, взятый от популяции иммортализованных В-клеток, может быть проанализирован на наличие антител с желаемой активностью. Популяция иммортализованных В-клеток может
быть затем клонирована для выделения клонов клеток, секретирующих антитела, которые затем используют в рамках молекулярной стратегии для выделения генов антител или для хранения в замороженном
состоянии до проведения дальнейших анализов.
EBV-опосредованная иммортализация представляет собой сложный процесс, вовлекающий иммортализацию В-клеток, которая осуществляется благодаря белкам, экспрессируемым в EBV, с последующей регуляцией иммортализации за счет взаимодействия между EBV и белками хозяйских клеток (Sugimoto M. et al., 2004; Bishop G. and Busch L.K, 2002). Фактически, процесс иммортализации может отслеживаться путем измерении экспрессии специфических EBV белков и транскриптов, таких как EBNA2,
EBNA1, LMP2, LMP1 или EBER (Thorley-Lawson D.A., 2001). Указанные белки могут быть выявлены
методами ПЦР, иммунофлюоресценции, вестерн-блоттинга или по процедуре других анализов, позволяющих выявить ДНК и белки EBV в инфицированных клетках (Schlee M. et al., 2004; Park C.H. et al.,
2004; Hume S. et al., 2003; Konishi K. et al., 2001; Haan K. et al., 2001).
Количество EBV супернатанта, который добавляют к клеточной культуре, может быть определено с
учетом данных, приведенных в литературе (10, 20, 30% и более), но авторы полагают, что рассматриваемые способы могут соответствующим образом работать в тех условиях, когда количество EBV суперна- 16 -
019505
танта относительно высокое (50 об.%), а время экспозиции относительно короткое (от примерно 4 до
примерно 24 ч).
Однако важно также, чтобы вирусные агенты иммортализации удалялись (аналогично тому, что
было сказано по поводу стимулирующего агента), например, путем промывки и последующего культивирования популяции клеток в свежей культуральной среде.
EBV супернатанты, которые могут использоваться в способах согласно настоящему изобретению,
могут быть получены по процедурам известных методик, широко используемых для инфицирования
культур человеческих клеток и клеток грызунов штаммом EBV, лабораторным, частично делетированным или рекомбинантным (а также с использованием mini-EBV или других векторов на основе EBV), с
последующим отделением инфицированных клеток от EBV-обогащенных супернатантов (Speck P. et al.,
1999; Oh H.M. et al., 2003; Bass H. and Darke C., 2004; Radons J. et al., 2005; US 5798230).
Экспериментальные данные, представленные в приведенных ниже примерах, дают основание полагать, что аналогичный вариант может использоваться применительно к другим агентам иммортализации.
Подходящее сочетание способов селекции, позволяющее проводить далее очистку клеток, секретирующих антитела, из биологических образцов в условиях клеточной культуры, а также стимулирующих
агентов, определенных выше, и длительности фазы стимуляции, проводимой в диапазоне от нескольких
часов до нескольких дней (но всегда отделенной по времени от фазы иммортализации), могут улучшить
иммортализацию, опосредованную не только применением EBV, но также другими вирусными агентами
иммортализации, такую как иммортализация путем инфекции другими онкогенными вирусами и/или
трансформации, опосредованной онкогенами.
После удаления вирусного агента иммортализации из клеточной культуры полученная популяция
клеток становится относительно обогащенной (в сравнении с результатами использования других методов) жизнеспособными, пролиферирующими лимфоцитами (см. фиг. 9), где отсутствуют погибшие или
дифференцированные клетки, которые не только являются неприменимыми для целей установления олигоклональных и моноклональных клеточных культур, но которые также высвобождают вещества (такие
как цитокины, реакционные радикалы кислорода как промежуточные продукты) в культуральную среду,
которые могут отрицательно повлиять на рост, пролиферацию и/или секрецию антител выбранными и
стимулированными клетками.
В этом смысле поликлональная популяция клеток, получаемая согласно способам настоящего изобретения, является особенно полезной, а также олигоклональные или моноклональные популяции клеток
(содержащие иммортализованные клетки, секретирующие антитела), которые получают при делении
такой поликлональной популяции.
Указанные популяции клеток могут использоваться в серии разных применений, в частности при
выделении антител, для их характеристики и продукции.
Примером такого применения является библиотека ДНК, включающая последовательности ДНК,
которые кодируют антитела одного или более специфических изотипов, где указанную библиотеку ДНК
получают с использованием нуклеиновых кислот, выделенных из указанной популяции клеток. В рамках
обычных методов молекулярной биологии мРНК или геномная ДНК может быть экстрагирована из образца клеток, с последующей обратной транскрипцией (при необходимости) и специфической амплификацией всех последовательностей, присутствующих в образце, которые кодируют антитело полностью
или лишь частично (например, только вариабельные участки, которые связываются с антигеном), как
описано в литературе применительно к иммунизированным животным или гибридомам, с целью достижения экспрессии этих последовательностей в качестве рекомбинантных белков, подлежащих скринингу
(Gilliland L.K. et al., 1996; Lightwood D. et al., 2006).
В этой связи способы согласно настоящему изобретению обеспечивают получение популяции клеток, культур клеток, супернатантов клеточных культур и библиотек ДНК, которые могут использоваться
для идентификации и получения моноклональных антител, обладающих желаемой антигенсвязывающей
специфичностью и/или биологической активностью.
Альтернативно, такие биологические продукты, при их получении из клеток, секретирующих антитела, взятых от индивидуума, могут использоваться для определения свойств специфичного по изотипу
иммунного ответа на аутологичный или гетерологичный антиген, вирус, бактериальную клетку, токсин,
паразитарный организм или вакцину конкретного индивидуума (например, для идентификации преимущественно продуцируемых антител и/или антигенов, которые предпочтительно распознаются иммунной
системой индивидуума).
В связи с широким использованием и стабильностью (в виде замороженных образцов) таких биологических продуктов (например, популяций клеток, культур клеток, супернатантов клеточных культур и
библиотек ДНК согласно настоящему изобретению) они могут быть включены в наборы для идентификации и получения моноклональных антител, обладающих желаемой антигенсвязывающей специфичностью и/или биологической активностью. Так, например, при использовании такого набора можно проводить скрининг в лабораторных условиях панели супернатантов клеточных культур или библиотек ДНК
для выявления моноклональных антител, обладающих желаемыми свойствами.
Настоящее изобретение относится к поликлональным популяциям иммортализованных клеток, сек- 17 -
019505
ретирующих антитела, получаемым согласно описанным выше методам. Указанные популяции клеток
могут использоваться в способе получения клеточной культуры, секретирующей моноклональыне антитела с желаемой антигенсвязывающей специфичностью и/или биологической активностью, где указанный способ включает следующие стадии:
a) достижение деления популяции клеток по п.5 или клеточной культуры по п.6, в клеточных культурах, каждая из которых содержит 50 или более клеток;
b) скрининг супернатантов указанных клеточных культур для выявления таких супернатантов, которые демонстрируют желаемую антигенсвязывающую специфичность и/или биологическую активность;
c) достижения деления клеточных культур, демонстрирующих желаемую антигенсвязывающую
специфичность и/или биологическую активность, в клеточных культурах или популяциях;
d) повторение стадий (b) и (с) на указанных клеточных культурах до тех пора, пока одна или более
клеточных культур, каждая из которых секретирует моноклональное антитело, будет иметь желаемую
антигенсвязывающую специфичность и/или биологическую активность в супернатанте клеточной культуры.
Альтернативно, указанные популяции клеток могут использоваться в способе получения клеточной
культуры, секретирующей моноклональное антитело с желаемой антигенсвязывающей специфичностью
и/или биологической
активностью, где указанный способ включает следующие стадии:
a) скрининг супернатанта указанных клеточных культур, полученного из множества популяций согласно п.6), для выявления одного или нескольких супернатантов, которые секретируют антитела с желаемой антигенсвязывающей специфичностью и/или биологической активностью;
b) определение последовательности антитела, секретируемого такими клеточными культурами, которое демонстрирует указанную активность в супернатанте:
c) выделение клеточной культуры, которая секретирует моноклональное антитело в супернатанте
клеточной культуры, обладающее указанной активностью.
Для корректного проведения таких методов поликлональные, олигоклональные и моноклональные
популяции клеток должны поддерживаться в соответствующих условиях культивирования клеток для
определения их свойств, в частности, относящихся к антигенсвязывающей и/или функциональной активности антитела, которое секретируется в супернатант клеточной культуры.
В этом смысле, выбор условий культивирования клеток после иммортализации является особенно
важным для достижения жизнеспособности, пролиферации и секреции антител иммортализованными
клетками, секретирующими антитела.
В данном контексте выбор условий культивирования может быть решающим фактором для целей
установления, отбора и роста олигоклональных и моноклинальных клеточных культур. В этой связи,
пулы клеток, секретирующих антитела, могут поддерживаться в среде для культивирования клеток, содержащей один или несколько агентов, стимулирующих рост В-клеток.
В случае EBV-опосредованной иммортализации инфекция вирусом EBV должна поддерживаться в
латентном состоянии для усиления жизнеспособности, пролиферации и IgG продукции этими клетками.
Однако специфические условия культивирования клеток могут повысить эффективность клонирования и
эффективность отбора представляющих интерес моноклональных клеточных культур, как это было описано в литературе (James K. and Bell G., 1987).
Первым важным аспектом является питательный слой, используемый для культивирования клеток,
секретирующих антитела с последующей фазой иммортализации, когда клетки культивируют в условиях
низкой плотности. Питательный слой может быть представлен препаратами облученных неаллогенных/
аллогенных клеток периферической крови, лимфобластоидными или фибробластными клетками, лимфоцитами спинного мозга или различными типами эмбриональных клеток. Примером клеточной линии,
обладающей такими свойствами, является EL4-B5, мутантные клеточные линии тимомы EL4, которые
эффективно поддерживают рост и пролиферацию В клеток (Ifversen P. et al., 1993; Wen et al., 1987).
Вторым важным аспектом является то, как клетки поддерживаются в культуре с использованием
соответствующего контейнера. При этом могут использоваться различные процедуры и материалы,
включая стационарную культуру (в ячейках или колбах), гомогенную суспензионную культуру (в непрерывно перемешиваемом реакторе или в качалочных колбах) или иммортализованные культуры (на полых волокнах или других подложках).
Третьим важным аспектом является выбор среды для клеточной культуры, позволяющей поддерживать жизнеспособность и рост клеток при осуществлении способов согласно настоящему изобретению, и культивирование клеток после фазы иммортализации. Особенно в указанный период иммортализации важен выбор среды для клеточной культуры (такой как IMDM или RPMI-1640) и питательных
компонентов для клеток (например, аминокислот, сыворотки) для усиления роста и репликации популяции клеток, даже в случае высева клеток с низкой плотностью, как в случае олигоклональных клеточных
культур.
И, наконец, четвертым важным аспектом является добавление в среду для клеточной культуры
- 18 -
019505
агентов, ускоряющих рост специфических В-клеток, таких как агенты, используемые в фазе стимуляции,
как было указано выше (например, олигонуклеотиды на основе CpG, интерлейкины) или любое другое
соединение, в отношении которого известно, что оно обладает аналогичным ростостимулирующим эффектом на иммортализованные клетки, секретирующие антитела, в частности, после EBV иммортализации, такое как 4-гидроксиноненал (Ranjan D. et al., 2005), некоторые формы тиоредоксина (WendelHansen D. et al., 1994), растворимый лиганд CD40 или агонистские антитела против CD40 (WO 91/09115;
WO 94/24164; Tsuchiyama L. et al., 1997; Imadome K. et al., 2003) или циклоспорин (Tanner J.E. and Menezes J., 1994; Chen С. et al., 2001).
Выбор ростстимулирующего агента для В-клеток, а также длительность периода времени, в течение
которого указанный агент следует применять (например, только в течение нескольких дней сразу после
иммортализации клеток), зависит от типа метода скрининга, который будет позже использован. Если
такой агент может мешать, например, проведению клеточных тестов, за счет модификации ответа целевых клеток, то супернатанты клеточных культур не могут быть использованы непосредственно для анализа, если специфический агент не будет удален из среды или не будет замещен. Альтернативно, антитела могут быть, по меньшей мере частично, очищены после выделения из супернатантов клеточных культур (например, путем осаждения белка, диализа и/или аффинной очистки). Однако предпочтительно
провести скрининг-анализ, как можно скорее после высева пулов клеток, в случае которого нет необходимости удалять ростстимулирующие агенты для В-клеток (или любой другой элемент, присутствующий
в супернатанте культуры клеток), при создании соответствующих условий активирования, которые не
будут вызывать проблем для скрининга, путем промывки клеток или за счет изменения среды для культивирования клеток.
Клетки, продуцирующие антитела, выделяют, стимулируют и иммортализуют согласно способам
настоящего изобретения и затем выдерживают в объемных культурах в течение различного периода времени (например, от 1 до 10 дней или дольше, например в течение 2-4 недель), после чего их разделяют на
несколько пулов, где каждый из пулов включает популяции клеток, которые будут культивироваться
раздельно (например, 60-, 12-, 24-, 32- или 96-ячеечных планшетов).
Такая объемная поликлональная популяция клеток, поддерживаемая в условиях клеточной культуры, может быть протестирована с использованием анализов, проводимых уже на сыворотке, для выбора
донора или с использованием любого подходящего теста для последующего анализа клеток с тем, чтобы
подтвердить наличие этих клеток. Кроме того, некоторые аликвоты поликлональной популяции клеток
могут быть внесены во флаконы и далее храниться в замороженном состоянии (как это обычно делают
для установленных клеточных линий млекопитающих), которые затем оттаивают и снова культивируют.
Используют множество пул, насчитывающих от 10 до нескольких сотен (или даже тысяч, как показано в примере 3), где каждый пул содержит статистически 10, 102, 103, 104, 105 или более клеток. Приведенные примеры показывают, как могут быть установлены клеточные культуры, секретирующие антитела, начиная с популяций, содержащих статистически 5, 20, 50 и 100 клеток. По прошествии варьирующего числа дней (например, от примерно 1 до примерно 10 дней, или более длительных периодов времени,
таких как 2-4 недели), указанные пулы клеток должны содержать секретируемые антитела в количестве,
достаточном для их характеристики, например, в случае использования супернатантов клеточных культур (непосредственно или после частичной очистки содержащихся в них антител) в рамках клеточного
теста или любого другого теста на связывание.
Клеточные культуры, которые содержат по меньшей мере 103, 104 или 105 клеток, могут секретировать антитела, количество которых накапливается в супернатанте клеточной культуры (например, от 1 до
300 мкг/мл или более), что может быть легко измерено с использованием коммерческих наборов для
ИФТФА, и которых в основном достаточно для проведения аналогичных анализов in vitro. Более того,
105, 104, 103 или даже меньшего числа клеток достаточно для получения информации о последовательностях секретированных антител при проведении экстракции, амплификации, клонирования и секвенирования ассоциированной мРНК из указанных клеток (как показано в примере 3).
Таким образом, аликвоты супернатантов клеточной культуры далее могут быть подвергнуты затем
скринингу для определения их связывающей и/или функциональной активности в рамках высокомасштабного анализа с тем, чтобы идентифицировать положительные ячейки, содержащие желаемую активность, возможно, с использованием анализа, позволяющего определить зависимость доза-ответ на серийно разведенных культуральных супернатантах или на частично очищенных препаратах антител (например, полученных путем аффинной хроматографии на колонках с белком А) в рамках параллельных экспериментов.
Положительные пулы клеток (например, клеток, демонстрирующих желаемую антигенную специфичность и/или биологическую активность) могут быть далее использованы для получения новой серии
пулов с тем, чтобы в дальнейшем ограничить скрининг до уровня одной или нескольких клеточных
культур и затем выделить клеточные культуры, секретирующие моноклональные антитела с желаемой
специфичностью и активностью, по меньшей мере, по данным одного исходного скрининг-теста. Выбранные моноклональные антитела далее повергают повторной оценке с использованием других, более
требовательных функциональных тестов и характеризуют их на уровне изотипов и последовательности
- 19 -
019505
VH/VL после выделения из стабильных EBV-иммортализованных клонов с использованием методов рекомбинантных ДНК, применимых на В-клетках.
Исходные характеристики, если они подтверждаются последующими данными, полученными с использованием релевантных моделей и клинических экспериментов, могут привести к идентификации
моноклонального антитела, выделенного и очищенного из указанных супернатантов (или позже экспрессированного в виде рекомбинантного белка), который может быть полезен для диагностических/терапевтических целей. В частности, если исходная популяция клеток, которая была иммортализована согласно способам настоящего изобретения, представляла собой IgG-положительную популяцию
человеческих В-клеток, то указанное моноклональное антитело представляет собой человеческое моноклональное IgG антитело, которое может быть непосредственно использовано для лечения инфекционных и других заболеваний человека.
Масштабная продукция антител может быть осуществлена с использованием клеточных систем
млекопитающих, бактерий или растений, в которых клонированные последовательности, кодирующие
полную тяжелую и легкую цепи (или только их антигенсвязывающие участки) в выбранных антителах,
клонируют с использованием векторов и экспрессируют в виде рекомбинантных белков.
Способы настоящего изобретения обеспечивают получение иммортализованных олигоклональных
и моноклональных клеточных культур, секретирующих антитела, которые могут быть выделены на основе желаемой антигенной специфичности и/или биологической активности, что может быть определено, например, путем скрининга супернатанта клеточной культуры, полученного из исходных поликлональных популяций клеток, секретирующих антитела, и олигоклональных или моноклональных клеточных культур, секретирующих антитела.
Указанные клетки могут быть затем использованы для идентификации и получения моноклональных антител, обладающих желаемой антигенной специфичностью и/или биологической активностью. В
этой связи, специфические технологии автоматизируют, что позволяет существенно повысить выход
продукции из нескольких моноклональных клеточных культур (Chambers R., 2005).
Скрининг-тесты, проводимые применительно к супернатантам клеточных культур и к очищенным
препаратам, должны быть выбраны и установлены таким образом, чтобы выявлялись представляющие
интерес антитела с максимально возможной точностью. Указанные скрининг-тесты должны включать
соответствующие положительные и отрицательные контроли (например, другие антитела, полученные в
других скринингах или антитела коммерческого происхождения) и должны быть достаточно чувствительными для определения связывающей и/или функциональной активности в диапазоне концентраций,
которые являются приемлемыми для желаемого направления использования антител (например, для диагностического, терапевтического или профилактического использования).
Так, например, если ожидается, что антитело будет использоваться в качестве терапевтического соединения, то данный тест должен позволять выявлять существенную активность в концентрации антитела 100, 10 или 1 мкг/мл (или ниже). Соответственно, на данной ранней стадии характеристики антител
указанная активность, измеряемая в данном тесте, должна быть достаточно чувствительной к используемому тесту и даже в некоторой степени предсказуемой, применительно к возможному варианту терапевтического использования. Дополнительные тесты на очищенном или рекомбинантном IgG являются более важными с точки зрения оценки терапевтической эффективности и соответствующей подлежащей
введению дозы.
Скриниг-тесты должны быть установлены таким образом, чтобы определять антигенсвязывающую
специфичность и/или биологическую активность, на которую направлены данные антитела, чтобы можно было использовать преимущества ауто/аллоантигенов (соединений, выделенных от человека, млекопитающего, бактериальных соединений, вирусных соединений, паразитарных, органических, химических и других антигенных/аллергенных соединений), которые были очищены и включены в клеточный
или биохимический тест, позволяющий продемонстрировать специфичность взаимодействия с антигеном или эффект, оказываемый на клетки, ткани, вирус или модели животных.
Альтернативно, тесты могут быть также установлены для определения антигенсвязывающей специфичности и/или биологической активности в отношении комплекса биологических неочищенных мишеней, таких как клетки или ткани (например, пути миграции в эндотелиальных клетках, онкогенный
рост клеток и т.п.).
Результаты такого рода тестов, проводимых на поликлональных или, еще лучше, олигоклональных
популяциях клеток в условиях клеточной культуры, могут использоваться для отбора популяций, которые можно либо хранить в замороженном состоянии во флаконах, либо использовать для конструирования библиотек ДНК, включающих последовательности ДНК, которые кодируют антитела одного или
более специфических изотипов.
В литературе описано несколько методик, подходящих для скрининга антител in vitro, которые могут быть релевантными для ряда направлений специфического использования моноклональных антител
и которые позволяют также проводить точную и высокомасштабную характеристику антител. В сочетании с классическими методиками, такими как иммунопреципитация, вестерн-блоттинг, ИФТФТА и иммунофлоуресценция, другие хорошо разработанные стратегии позволяют использовать клетки малых
- 20 -
019505
органов, культуры органов, чипы или полиокрашенные наночастицы для проведения эффективного
скрининга (Bradbury A. et al., 2003; Haab B.B., 2005; Lal S.P. et al., 2002; Olivo P., 1996; Potera S., 2005;
WO 05/82926; WO 05/003379; WO 05/83064; WO 05/76013).
В зависимости от происхождения клеток, секретирующих антитела, и от методов скрининга, используемых для отбора специфических моноклональных клеточных культур и характеристики моноклональных антител, могут быть разработаны различные варианты использования таких антител, например
в качестве диагностических инструментов (для вирусных, бактериальных паразитарных инфекций, опухолей или для типирования клеток), а также в качестве профилактических и терапевтических инструментов (например, для лечения злокачественных инфекций, иммунных или воспалительных расстройств или
при ведении пациентам после трансплантации), в исследованиях иммунной системы и в целом антигенов, имеющих клиническую значимость. Таким образом, указанные антитела, в частности человеческие
моноклональные антитела, могут использоваться при получении фармацевтических композиций, включающих моноклональное антитело или фрагмент антитела и фармацевтически приемлемый носитель, в
процессе производства лекарственного средства, предназначенного для лечения пациентов и для диагностики инфекционных, онкогенных, аутоиммунных или аллергических заболеваний у людей. Настоящее
изобретение также относится к способу получения моноклонального антитела, где указанный способ
включает следующие стадии:
a) размножение клеточной культуры, полученной согласно описанному выше способу; и
b) очистка моноклонального антитела, выделенного из супернатанта указанной клеточной культуры.
В частности, явные преимущества EBV-иммортализации заключаются в том, что клеточные культуры после проведения исходной характеристики и валидации секретированных антител могут непосредственно использоваться для очистки достаточного количества антител (в количествах от микрограмм
до миллиграмм) с целью проведения более полной характеристики антител и их валидации в рамках тестов in vitro или in vivo (других биохимических тестов, тестов на тканях, клетках, с использованием моделей заболеваний, установленных на грызунах, биофизических методов оценки аффинности, эпитопного
картирования и т.п.).
Таким образом, исходная клеточная культура после контроля клональности указанной культуры
может быть далее оптимизирована путем соответствующей адаптации клеточной среды и условий культивирования для целей подержания роста клеток и повышения экспрессии и секреции антител (Ling N.,
2000). Далее антитела могут быть выделены и очищены из супернатантов клеточной культуры с использованием описанных в литературе соответствующих методик, подходящих для выделения антител из
сложной белковой смеси, с использованием аффинной хроматографии (Nisnevitch M. and Firer M.A.,
2001; Huse K. et al., 2002). Указанные методы очистки антител могут быть основаны на показателях общей аффинности антител для таких субстратов, как белок А, белок G или синтетические субстраты (Verdoliva A. et al., 2002: Roque A.C. et al., 2004; Danczyk R. et al., 2003), a также могут быть очищены методами аффинной хроматографии, включающей антиген или эпитопы (Murray A. et al., 2002; Sun L. et al.,
2003; Jensen L.B. et al.,2004). Были разработаны также другие устройства для препаративного разделения
антител, например на основе электрофореза (Thomas T.M. et al., 2003).
Очевидно, что моноклональная клеточная культура может также использоваться для идентификации последовательностей ДНК, которые кодируют моноклональные антитела, посредством амплификации и клонирования их в векторе, перед проведением экспрессии рекомбинантного антитела в соответствующих хозяйских клетках. Белковая последовательность антител, секретируемых выбранными клональными клеточными культурами, может быть легко определена при выделении нуклеиновых кислот,
кодирующих указанные антитела, с помощью методов рекомбинантных ДНК, описанных в литературе
(Poul M.A. et al., 1995; Jovelin F. et al., 1995; Heinrichs A. et al., 1995; Dattamajumbar A.K. et al., 1996; Norderhaug L. et al., 1997; Chardes T. et al., 1999; Jarrin A. and Andreieux A., 1999; Essono S. et al., 2003).
Указанные методики могут также использоваться для дальнейшей характеристики структурных и
функциональных свойств антител и оптимизации терапевтических антител (Kim S.J. et al., 2005) или для
целей получения векторов, позволяющих осуществлять стабильную доставку моноклональных антител
in vivo (Fang J. et al., 2005).
Вкратце, данная методика состоит в том, что мРНК может быть выделена из клеточной культуры и
подвергнута обратной транскрипции с получением библиотеки кДНК, которая может использоваться в
качестве матрицы для проведения полимеразно-цепьевой реакции (ПЦР), включающей вырожденные
праймеры для специфической амплификации полных тяжелой и легкой цепей или только частей указанных цепей (например, их вариабельных участков). В том случае, когда выделяют только вариабельные
участки (ответственные за связывание с антигеном), указанные последовательности могут быть клонированы в векторе, который позволяет достичь слияния этой последовательности с константными (Fc) участками антитела желаемого изотипа (например, человеческого IgG-γ1). ПЦР-амплифицированные фрагменты ДНК могут быть далее непосредственно подвергнуты секвенированию или клонированию с использованием адапторов или сайтов рестрикции в соответствующих векторах для секвенирования кодирующей последовательности, которая может быть адаптирована и повторно клонирована в других векторах для экспрессии антител в виде рекомбинантных белков.
- 21 -
019505
мРНК из поликлональных или олигоклональных популяций клеток может быть также использована
для конструирования библиотек кДНК, специфичных для клеток, секретирующих антитела специфических изотипов, которые можно сделать доступными, например, в качестве библиотек проявления фагов,
бактериальных библиотек, библиотек дрожжевых организмов или биологической библиотеки любого
другого формата, которая может использоваться для репликации и поддержания ДНК, в частности ДНК,
кодирующей белки. Так, например, может быть получена библиотека рекомбинантных последовательностей антител с использованием мРНК, экстрагированной из одной или нескольких олигоклональных популяций клеток, используемых для продукции антител в бактериальных или эукариотических хозяйских
клетках, с последующим скринингом таких антител с целью идентификации одного или более видов антител, которые обладают желаемой антигенсвязывающей специфичностью и/или желаемой биологической активностью.
После клонирования и характеристики полученные антитела могут быть экспрессированы в виде
рекомбинантных белков в прокариотических организмах (например, Е. coli; Sorensen H. and Mortensen
K., 2005; Venturi et al., 2002), в растениях (Ma J.K. et al., 2005) или в эукариотических клетках, в частности в клеточных линиях клеток человека, грызунов или в других эукариотических клеточных линиях
(например, СНО, COS, HEK293), которые позволяют достичь высокого уровня экспрессии в виде временно или стабильно трансформированных клеток (Schmidt F., 2004). Это может потребоваться, в частности, в том случае, когда характеристику антител проводят с использованием более сложных тестов,
включающих тесты in vivo. Хозяйские клетки могут быть также отобраны на основе уровня рекомбинантной экспрессии клонированного моноклонального антитела.
В этой связи, клонированные последовательности антител могут быть модифицированы в рамках
процедуры ПЦР или с использованием других методов рекомбинантной ДНК только на уровне ДНК (например, путем удаления или добавления сайтов рестрикции, оптимизации используемых кодонов, соответствующей адаптации регуляторных последовательностей транскрипции и/или трансляции) или на
уровне и ДНК, и белка (например, путем добавления других белковых последовательностей или путем
модификации внутренних аминокислот). Кроме того, фрагменты (Fv, Fab, F(ab)' или F(ab)") или белки
слияния, полученные на основе указанных антител, могут быть созданы с использованием методов рекомбинантных ДНК.
Так, например, рекомбинантные антитела могут быть также модифицированы на уровне их структуры и/или активности при выборе специфического Fc участка, подлежащего слиянию с вариабельными
участками (Furebring С. et al., 2002), путем добавления стабилизирующих пептидных последовательностей (WO 01/49713), при создании рекомбинантных одноцепочечных фрагментов антител (Gilliland L.K.
et al., 1996) или при добавлении радиоактивных химических соединений или полимеров к химически
модифицированным остаткам (Chapman A. et al., 1999).
Были использованы различные векторные системы для создания стабильных пулов трансфицированных клеточных линий (Aldrich T.L. et al., 2003; Bianchi A. and McGrew J.T., 2003). Был достигнут высокий уровень оптимизированной стабильной экспрессии рекомбинантных антител (Schlatter S. et al.,
2005; Dinnis D. and James D., 2005; Kretzmer G., 2002), благодаря оптимизации условий культивирования
клеток (Grunberg J. et al., 2003; Yoon S.K. et al., 2004) и за счет выбора или конструирования клонов с
высокими уровнями продукции антител (Bohm E. et al., 2004; Borth N., 2002; Chen K. et al., 2001; Butler
M., 2005).
Очистка нерекомбинантных/рекомбинантных антител из клеточных культур может быть проведена
в рамках методик, описанных выше, а также других методик, приведенных в литературе (Hale G. et al.,
2004; Horenstein A.L. et al., 2003). Однако клиническая разработка и использование должны базироваться
на характеристике антител с точки зрения фармакокинетики и фармакодинамики (Lobo E. et al., 2004) и
их соответствия международным требованиям по производству и контролю качества мышиных, человеческих и конструированных моноклональных антител для терапевтического и диагностического использования in vivo на людях (EUDRA document 3AB4a).
Далее настоящее изобретение описывается с помощью примеров, которые не следует трактовать
как ограничивающие каким-либо образом настоящее изобретение.
Примеры
Пример 1. Влияние используемых методов клеточной очистки и стимуляции клеток на жизнеспособность и пролиферацию В-клеток в условиях клеточной культуры.
Материалы и методы.
Выделение и поддержание человеческих В-клеток.
Свежие мононуклеарные клетки периферической крови (ПМНК) получают и очищают из периферической крови путем обычного центрифугирования в градиенте плотности на Ficoll/Hypaque. В зависимости от экспериментальных условий клетки могут быть обработаны с использованием ПМНК от одного
донора или пула ПМНК от пяти разных доноров с тем, чтобы оценить средний показатель ответа на разные экспериментальные условия и ограничить различия, имеющие отношение к вариабельности, определяемой разными донорами.
Человеческие В-клетки выделяют из ПМНК путем иммуномагнитной сортировки клеток с исполь- 22 -
019505
зованием методики VarioMACS (Miltenyi Biotec Inc.) по инструкции производителя. В общих чертах,
процедура состоит в том, что ПМНК суспендируют в ФБР (фосфатно-буферный раствор) с добавкой
0,5% БСА (бычий сывороточный альбумин) и 2 мМ ЭДТА (этилендиамин-N,N,N',N'-тетраацетат) и инкубируют с разными антителами, конъюгированными с микрошариками (против CD19, CD22 или CD27).
Связанные с микрошариками антитела далее промывают и пропускают через колонку для положительной селекции (колонка LS; Miltenyi cod. 30-042-401) в магнитном поле. Затем клетки высвобождают из
шариков с использованием высвобождающего реагента MACS MiltiSort (20 мкл/мл) при 4°С в течение 10
мин в соответствии с инструкциями производителя (Miltenyi Biotec Inc.).
IgG-положительные В-клетки получают путем отрицательной селекции IgM-положительных клеток
по процедуре сортировки клеток или магнитного отбора IgG-положительных клеток с использованием
методики VarioMACS (Miltenyi Biotec Inc.) в соответствии с инструкциями производителя. Для сортировки клеток CD22-положительные В-клетки (которые подвергались предварительной стимуляции или
не подвергались, независимо) инкубируют с оптимальными концентрациями противочеловеческого IgMFITC (Becton Dickinson n.555782) в течение 1 ч на льду. Клетки тщательно промывают ФБР и затем сортируют на IgM-положительные и IgM-отрицательные клетки в стерильных условиях с использованием
высокоскоростного сортировщика клеток (MoFloHigh-Performance Cell Sorter).
Отобранные клетки суспендируют и поддерживают в культуральной среде RPMI-1640 с добавкой
10% (об./об.) инактивированной нагреванием ФСТ (фетальная сыворотка теленка), 1 мМ пирувата натрия, 100 мкг/мл стрептомицина и 100 Ед пенициллина/мл и культивируют в 24-ячеечных планшетах при
температуре 37°С и содержании 5% CO2.
Стимуляция В-клеток в клеточной культуре.
CpG2006 (5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'; SEQ ID NO: 1) получают от компании Coley
Pharmaceutical Group. Рекомбинантный человеческий интерлейкин 2 (IL-2) получают от компании Roche.
Рекомбинантный человеческий интерлейкин 4 (IL-4) получают от компании Peprotech. Рекомбинантный
человеческий лиганд CD40 (растворимый фрагмент, включающий аминокислоты 108-261) получают от
компании R&D Systems. Staphylococcus aureus, штамм Cowan (SAC) и липополисахариды (LPS) получают от компании Sigma.
Определение уровня пролиферации В-клеток по поглощению 3Н-тимидина.
Клетки (2×106/мл) высевают в ячейки 96-ячеечных планшетов (50 мкл/ячейку) в тройном повторе в
указанных условиях культивирования и метят добавлением 3Н-тимидина (NET-027X тимидин, метил-3Н;
удельная активность 20 Кюри/моль: PerkinElmer), который добавляют (0,5 мкКюриCi/ячейку) за 8-16 ч до
окончания эксперимента. Поглощение 3Н-тимидина определяют, собирая клетки на стекловолокнистые
фильтры, которые затем подсчитывают на β-счетчике (Wallach Instrument).
Анализ экспрессии поверхностного маркера по методу FACS.
Клетки (3×105/образец) суспендируют в ФБР с добавкой 0,5% бычьего сывороточного альбумина и
инкубируют в течение 30 мин при температуре 4°С с выбранными моноклональными антителами против
CD22, меченого FITC. После промывки определяют уровень флуоресценции с использованием проточного цитометра FACSCalibur и программного обеспечения CellQuest (Becton Dickinson). Фоновую активность по связыванию для моноклональных антител оценивают с использованием отобранных по изотипам отрицательных контрольных моноклональных антител. Количество клеток, полученных в данном
анализе, составляет 10000.
Сортировка клеток по методу FACS.
Сортировку клеток проводят с использованием высокоэффективного прибора для сортировки клеток MoFloHigh-Performance Cell Sorter (Dako). Отрицательную селекцию IgG-экспрессирующих клеток
проводят на основе клеток (107/мл), которые инкубировали с противочеловеческим моноклональным
IgM-FITC (10 мкл/106 клеток; Becton Dickinson Cat. No. 555782) или с противочеловеческим поликлональным (2 мкл/106 клеток; Jackson, Cat. No. 309-096-043) в течение 1 ч при температуре 4°С. Затем клетки промывают и суспендируют (10-20×106/мл) в буфере для сортировки (ФБР с 5 мМ ЭДТА, 20 мМ
Hepes и 1% ФСТ). Клетки просеивают на основе их морфологических параметров (R1). CD22положительные, IgM-отрицательные В-клетки собираются в R1 зоне.
Результаты.
В литературе приводится мало сравнительной информации по тому эффекту, который разные методики очистки и стимуляции В-клеток оказывают на жизнеспособность клеток и их пролиферацию в условиях клеточной культуры.
Интерлейкин (IL-2) используют в качестве эталонного соединения, поскольку ростостимулирующие эффекты этого цитокина на первичные человеческие В-клетки в клеточной культуре хорошо исследованы (Banchereau J. and Rousset F., 1992). Первый вариант сравнения был проведен с использованием
первичных В-клеток, которые были выделены и очищены из человеческих ПМНК с учетом экспрессии
CD22 на их поверхности, и затем их культивировали с известными стимуляторами поликлональных Вклеток: CpG2006, липополисахариды (LPS), растворимый лиганд CD40 (CD40L) и Staphylococcus aureus,
штамм Cowan (SCA).
- 23 -
019505
Положительный характер зависимости доза-ответ на клеточную пролиферацию выявляется, по данным 4-дневного теста по оценке поглощения 3Н-тимидина, в том случае, когда LPS, SAC и CD40L добавляют к клеточной культуре вместе с IL-2. Однако результаты использования сочетания с CpG2006,
добавляемого в концентрациях, которые в основном описаны в литературе (Bernasconi N. et al., 2003;
Traggiai E. et al., 2004), показывают, что это соединение при сочетании с IL-2 обладает существенно
большим потенциалом по индукции пролиферации В-клеток в клеточной культуре (фиг. 2). В рамках
этого теста были получены результаты, указывающие на индукцию пролиферации, аналогичную результатам, полученным в случае сочетания CpG2006 и IL-2, когда объединяли растворимый CD40L (в концентрации, равной по меньшей мере 0,5 мкг/мл) с другим цитокином, IL-4 (по меньшей мере, в концентрации 20 нг/мл), что позволяет полагать, что данное сочетание соединений может использоваться в качестве стимулирующего агента в способах согласно настоящему изобретению, поскольку были выявлены оптимальная кинетика и эффект на секрецию IgG.
В связи с выраженностью эффекта, идентифицированного в случае сочетания IL-2 и CpG2006, было
проведено титрование CpG2006 применительно к оптимальной пролиферации В-клеток и бластного образования в диапазоне концентраций CpG2006 от 0 до 2,5 мкг/мл, при сохранении постоянной концентрации IL-2.
Существенная индуцированная CpG2006 пролиферация CD22-положительных человеческих Вклеток была выявлена в концентрациях до 0,15 мкг/мл, при этом плато достигалось в концентрации 0,3
мкг/мл (фиг. 3А). Когда те же популяции клеток анализировали по флуоресцентной сортировке активированных клеток (FACS-анализ) для определения процента жизнеспособных клеток и бластов (крупных
клеток с высоким прямым рассеянием), оптимальная концентрация CpG2006, по всей видимости, несколько повышалась (от 0,6 до 1,25 мкг/мл), поскольку в этих концентрациях образуется больший процент бластных клеток (фиг. 3В).
Рассматриваемый эффект сочетания CpG2006/IL-2, подтверждающий предшествующие результаты,
которые продемонстрировали стимулирующий эффект CpG2006 на В-клетки, может быть получен в
концентрациях ниже 1 мкг/мл, указывая на то, что пролиферация и образование бластов стимулированных CD22-положительных клеток может иметь место в определенном диапазоне концентраций CpG2006
(0,3-1 мкг/мл).
В описываемых экспериментах IL-2 добавляют в постоянных концентрациях (1000 Ед/мл), но аналогичная картина доза-ответ может быть получена при использовании IL-2 в разных концентрациях, тогда как концентрация CpG2006 остается постоянной, что дополнительно определяет оптимальную концентрацию IL-2, способную индуцировать пролиферацию человеческих В-клеток и образование бластов
в присутствии CpG2006. Последующие эксперименты также показали, что IL-2 может использоваться в
диапазоне концентрации от 100 до 1000 Ед/мл.
Таким образом, кроме выбора стимуляторов поликлональных В-клеток, определение концентрации,
при которой специфические соединения следует использовать (поодиночке или в сочетании), является
важным фактором, позволяющим достичь желаемый эффект на пролиферацию клеток. Отзывчивость и
пролиферация В-клеток в ответ на добавление CpG2006-активаторов и цитокинов были продемонстрированы для CD17/CD27-положительных клеток (Bernasconi et al., 2002; Jung J. et al., 2002). Однако по
меньшей мере некоторые из указанных отрицательных эффектов CpG2006 на жизнеспособность клеток,
известные в литературе (Hartmann et al., 2000; Klinmann D. et al., 1996; Fearon K. et al., 2003), могут быть,
по всей видимости, снижены при использовании специфических условий, концентраций и сочетаний
соединений.
Способ очистки первичных В-клеток из биологических образцов может быть еще одним элементом,
который следует учитывать при установлении процесса, в рамках которого жизнеспособность и потенциал пролиферации указанных первичных В-клеток не ухудшается в условиях клеточной культур и в
манипуляциях in vitro в присутствии симулирующих агентов.
В литературе описаны два поверхностных маркера клеток, которые преимущественно применяются
для положительной селекции человеческих В-клеток с использованием, в частности, твердых подложек
CD19 и CD22. Протокол стимуляции, сочетающий IL-2 и CpG2006, был использован применительно к
очищенным человеческим В-клеткам с включением в него CD19- или CD22-специфических микрошариков.
FACS-анализ жизнеспособности клеток и образования бластных клеток был проведен до и после
стимуляции. Сравнение результатов обоих подходов, применительно к очистке клеток, явно продемонстрировал, что сразу после очистки CD22-положительная популяция клеток характеризуется большей
гомогенностью, чем CD19-положительная популяция (фиг. 4А). Этот ответ клеток на процедуру очистки
становится еще более явным после 4 дней стимуляции (фиг. 4В), когда CD22-положительная популяция
характеризуется наличием большего числа жизнеспособных клеток и значительно повышенной долей
крупных, активированных клеток, чем в CD19-положительной популяции. Повышенная жизнеспособность В-клеток, очищенных с использованием микрошариков с CD22-специфическим антителами, но не
с CD9-специфическими антителами, может быть связана с различными эффектами, развивающимися в
направлении считывания информации, на ростовой потенциал указанных клеток, который выявляется в
рамках двух разных способов селекции.
- 24 -
019505
Кроме того, CD22-положительные клетки могут быть отобраны и стимулированы с использованием
дополнительных средств селекции, таких как микрошарики, подходящие для положительной селекции
IgG-экспрессирующих клеток или любого другого релевантного подмножества В-клеток, такого как
CD27-положительные В-клетки, демонстрирующие вторичный иммунный ответ.
Поскольку было показано, что выбор средств для стимуляции и отбора оказывает влияние на жизнеспособность клеток и их пролиферацию, другим элементом, который может вовлекаться и который
следует учитывать, является кинетика сохранения жизнеспособности клеток и пролиферативного ответа
CD22 положительных человеческих В-клеток на стимуляцию IL-2 и CpG2006.
Клеточную жизнеспособность и пролиферацию измеряют через 2, 4 и 6 дней после начала стимуляции и было показано, что объединенный эффект CpG2006 (1 мкг/мл ) и IL-2 (1000 Ед/мл) обеспечивает
выраженную кинетику. Максимальное включение 3Н-тимидина, индуцированное одним CpG2006, наблюдается уже в 2-дневной культуре и затем быстро снижается. Кинетика пролиферативного ответа клеток на один IL-2 более постепенная, при этом включение 3Н-тимидина возрастает до 6 дня культивирования. Однако объединенная стимуляция с использованием CpG2006 и IL-2 обеспечивает кинетику
включения 3Н-тимидина, аналогичную таковой в случае CpG2006, но при этом на 2 день отмечается неожиданное усиление ответа, которое продолжается до 4 дня и снижается к 6 дню культивирования (фиг.
5). Параллельно измеряют общее число жизнеспособных клеток в культуре, стимулированных CpG2006
и IL-2, и при этом вновь было показано большее число жизнеспособных клеток в культуре на 2 день и 4
день.
Таким образом, преимущество объединения двух стимулирующих агентов становится еще более
выраженным, когда, особенно к 4 дню культивирования, достигается равновесие между эффектами, запускаемыми по отдельности IL-2 и CpG2006, имеющими кинетику разной направленности. Эти данные
также позволяют предполагать возможность того, что аналогичные, или даже лучшие, эффекты на пролиферацию и жизнеспособность клеток могут быть оказаны на клетки, секретирующие антитела, не
только при одновременном добавлении стимулирующих агентов, но и при их последовательном добавлении (например, когда один из агентов добавляют в начале фазы стимуляции, а другой - через несколько часов или дней).
Пример 2. Влияние способов очистки клеток и их стимуляции на жизнеспособность, пролиферацию
В-клеток и секрецию антител В-клетками, которые были иммортализованы с использованием EBV.
Материалы и методы.
Отбор В-клеток и анализ их пролиферации и жизнеспособности.
Отбор человеческих В-клеток, их стимуляцию и анализ проводят по процедуре, описанной в примере 1, если особо не указано иное.
Анализ экспрессии маркера клеточной поверхности по методу FACS.
CD21-положительные клетки выявляют методами иммунофлоуресценции и проточной цитометрии
с использованием анти-CD21-РЕ конъюгата (Caltag Laboratories, cat. No. MHCD2104, партия 04061206),
как было указано выше для CD22.
Получение супернатантов после культивирования вирусом Эпштейна-Барр.
EBV-продуцирующие В95-8 клетки лимфомы мартышки (АТСС No. CRL-1612; 5×105 /мл) растят в
среде RPMI-1640 для культивирования клеток с добавкой 1% ФСТ (полная среда) в течение 4 дней.
Клетки В95-8 в экспоненциальной фазе роста стимулируют 10 мМ форболовым эфиром (например,
РМА; Sigma) в течение 2 ч (Oh H.M. et al., 2003), затем тщательно промывают HBSS (сбалансированный
солевой раствор Хэнкса, Sigma) для удаления РМА в растворе. РМА-стимулированные В95-8 клетки
культивируют в полной среде RPMI-1640 для культивирования клеток с добавкой 10% ФСТ в течение 48
ч и далее собирают супернатант, центрифугируют и фильтруют через мембрану с размером пор 0,22 мкм.
Эффективность иммортализации оценивают с использованием трех разных препаратов CD22положительных В-клеток, взятых от разных доноров крови. Во всех случаях наблюдается быстрая иммортализация, и полученные поликлональные лимфобластоидные линии демонстрируют быструю репликацию. Процессы иммортализации, проводимые параллельно с партией вируса, полученного в обычных условиях, в отсутствие РМА-стимуляции, демонстрируют сниженную репликацию.
EBV-опосредованная иммортализация человеческих CD22 положительных, IgM отрицательных
стимулированных В-клеток.
После 4 дней стимуляции IL-2 (1000 Ед/мл) и CpG2006 (1 мкг/мл) CD22-положительные, IgMотрицательные клетки тщательно промывают свежей средой для удаления стимулирующих агентов перед экспозицией с EBV супернатантами.
Иммортализацию в объемном материале клеток проводят путем инкубации их (106/мл) с EBV супернатантом (50 об.% в RPMI-1640 с добавкой 10% ФСТ) в течение периода времени, равного минимум
4-18 ч, и затем промывают свежей средой. Пролиферацию и жизнеспособность клеток, обработанных
50% EBV супернатантом в течение 4-18 ч, сравнивают с показателями пролиферации и жизнеспособности клеток, которые обрабатывали 30% EBV супернатантом в течение 7 дней.
Затем клетки концентрируют (106/мл в RPMI-1640 с добавкой 10% ФСТ и IL-2, 1000 Ед/мл) и высе- 25 -
019505
вают на 0,5×105 облученных (3000 rad) аллогенных ПМНК на ячейку в 24-ячеечном планшете на 8-16
дней.
Качественное и количественное сравнение результатов использования разных методик иммортализации человеческих В-клеток с использованием EBV.
Человеческие В-клетки выделяют в виде CD22-положительных мононуклеарных клеток периферической крови (ПМНК), объединенных от 5 нормальных доноров по методу магнитной селекции, как было описано в примере 1, и далее разделяют на три пула клеток, которые подвергают разным методам обработки с применением EBV для EBV-иммортализации В-клеток.
В рамках основного (BASIC) метода отбирают IgG-положительную фракцию указанных клеток путем сортировки клеток с использованием высокоскоростного сортировщика клеток MoFlo (MoFlo Cytomation) и противочеловеческого IgG FITC (Becton Dickinson). Затем 8×105 CD22-положительных, IgGположительных клеток культивируют в течение 12 ч с EBV супернатантом (полученным по описанной
выше процедуре), промывают и культивируют с плотностью l,5×106 клеток/мл в течение 10 дней при
температуре 37°С в среде IMDM (Gibco-BRL) с добавкой L-глютамина, добавкой не из группы незаменимых аминокислот (NEAE) и 10% ФСТ в присутствии, в качестве питательного слоя, облученных аллогенных ПМНК.
В рамках объединенного (COMBINED) метода 8×105 CD22-положительных, IgG-положительных
клеток выделяют по методу BASIC и затем культивируют с плотностью 1,5×106 клеток/мл с CpG2006 (1
мкг/мл), IL-2 (200 Ед/мл) и EBV супернатантом (полученным по описанной выше процедуре) в среде
IMDM (Gibco-BRL) с добавкой L-глютамина, NEAE и 10% ФСТ в течение 10 дней при температуре 37°С
в присутствии в качестве питательного слоя облученных аллогенных ПМНК.
В рамках последовательного (SEQUENTIAL) метода CD22-положительные ПМНК вначале подвергают предварительной стимуляции сочетанием CpG2006 (1 мкг/мл) и IL-2 (200 Ед/мл) в среде IMDM
(Gibco-BRL) с добавкой L-глютамина, NEAE и 10% ФСТ в течение 4 дней при температуре 37°С. Затем
клетки промывают ФСТ и IgG-положительные клетки обогащают путем магнитной селекции, как было
описано выше. Предварительно стимулированные клетки (8×105 CD22-положительных, IgGположительных ПМНК) далее подвергают инфекции EBV супернатантом (как было описано в методе
BASIC) в течение 12 ч при температуре 37°С, промывают и культивируют с плотностью 1,5×106 клеток/мл в среде IMDM (с L-глютамином, NEAE и 10% ФСТ) в течение 10 дней при температуре 37°С в
присутствии в качестве питательного слоя облученных аллогенных ПМНК.
Определение количества клеток и их жизнеспособности с использованием иодида пропидия и проточной цитометрии.
Общее число В-клеток определяют путем подсчета под микроскопом, а их жизнеспособность определяют по методу исключения варианта интеркаляции ДНК с использованием флуоресцентного красителя иодида пропидия в проточном цитометре FACSCalibur и программного обеспечения CellQuest Software (Becton Dickinson Biosciences). В общих чертах, процедура состоит в том, что клетки при комнатной
температуре обрабатывают иодидом пропидия (PI: Sigma; конечная концентрация в ФБР-2,5 мкг/мл) и
анализируют методом проточной цитометрии в течение 30 мин. Жизнеспособные клетки определяют как
клетки с высоким прямым и ортогональным рассеянием, с характерными лимфоцитами и фибробластами
и в которых отсутствует PI. Клетки, которые были окрашены PI и которые имеют низкий показатель
прямого рассеяния, представляют собой мертвые клетки и осколки клеток.
Анализ поверхностной экспрессии CD23.
Экспрессию CD23 определяют в жизнеспособных лимфобластах, которые в потоке электронов были собраны по методу FACS с использованием прямой иммунофлуоресценции (область R2) и с использованием метода проточной цитометрии на основе противочеловеческого конъюгата CD23-PE (Becton
Dickinson, no. по каталогу 555711), как было описано в примере 1.
Определение уровня секретированных IgG.
Секрецию суммарного человеческого IgG в культуральных супернатантах определяют с использованием метода ИФТФА (Immuno-Tek/Zeptometrics, no. по каталогу ZMC 0801182), в соответствии с инструкциями производителя. В общих чертах, процедура состоит в том, что культуральный супернатант
собирают и хранят при температуре 4°С. Образцы супернатанта подвергают серийному разведению и
сравнивают со стандартной кривой, построенной на основе очищенного человеческого IgG, которая
включена в состав набора для ИФТФА. Результаты измерения отражают общее количество IgG, накопленного в культурах в течение 10-дневного периода культивирования.
Результаты.
Поскольку задачей всего процесса является получение иммортализованных человеческих клеток,
секретирующих антитела наиболее прямым способом, в качестве агента иммортализации был выбран
EBV, который можно непосредственно установить и применять в виде супернатанта клеток, инфицированных данным вирусом. Однако хорошо известно, что фактически инфицируется лишь фракция клеток,
подвергнувшихся воздействию EBV, возможно, за счет ограниченной экспрессии CD21 рецептора, присутствующего на поверхности клеток, который вирус используют для входа в клетки (Jondal and Klein,
- 26 -
019505
1973; Nemerow et al., 1985; Boyd and Fecondo, 1988). В этой связи, важно было определить, положительно
или отрицательно влияют на экспрессию CD21 выбранные способы и условия стимуляции и очистки
клеток, описанные выше.
С этой целью оценивают кинетику пролиферации В-клеточных популяций, выбранных на основе
наличия в них разных клеточных маркеров (только CD22-положительные, CD22-положительные и CD27положительные, CD22- и IgG-положительные, CD22-положительные и IgM-отрицательные) после 4 дней
стимуляции с использованием IL-2 (1000 Ед/мл) и CpG2006 (1 мкг/мл), и далее определяют долю CD21положительных клеток в разные временные точки. Во всех экспериментах CD21 экспрессируется на
уровне >90% от жизнеспособных и пролиферирующих клеток, подтверждая возможность проведения
двойной селекции в рамках способов настоящего изобретения.
В этой связи, после демонстрации мощного позитивного эффекта на пролиферативную активность
клеток, оказываемого выбранными средствами и условиями клеточной стимуляции и очистки, следует
выяснить, каким образом данный подход может обеспечивать также улучшение характера ответа клеток
на агент иммортализации. Хорошо известно, что после обработки В-клеток с использованием EBV значительная фракция клеток перестает расти и погибает в течение первой недели культивирования, с последующим возобновлением пролиферации за счет EBV-иммортализованных клеток (James K. and Bell
G., 1987). Таким образом, очень важно понять, может ли адекватная часть соответствующим образом
стимулированных и отобранных человеческих В-клеток не только быть иммортализована EBV, но также,
могут ли указанные иммортализованные В-клетки лучше противостоять критическому периоду, наступающему после иммортализации с использованием EBV.
Человеческие CD22-положительные, IgG-отрицательные В-клетки, при наличии или в отсутствие
предшествующей стимуляции с использованием CpG2006 и IL-2, подвергают экспозиции с супернатантом EBV в течение ночи, промывают и высевают в среду, включающую IL-2 (1000 Ед/мл), на питательный слой облученных аллогенных ПМНК. В течение нескольких последующих дней оценивают пролиферацию данных клеток. При этом было показано, что предварительная обработка В-клеток с использованием CpG2006 и IL-2 приводит к повышению скорости и уровня восстановления пролиферации Вклеток после EBV-иммортализации. Наиболее явно это было выражено на 7 день после экспозиции с
супернатантами EBV, где в предварительно стимулированных культурах отмечается примерно на 50%
больше клеток, чем в культурах, которые не подвергали предварительной стимуляции (фиг. 6А). Этот
результат был также подтвержден для варианта, когда предварительно стимулированные CD22положительные В-клетки не были дополнительно истощены по IgM-положительным клеткам.
Известные ранее способы демонстрируют полезность применения активаторов поликлональных Вклеток в процессе (и не только до) их иммортализации с использованием EBV супернатантов, в отсутствие стадии, на которой из клеточной культуры удаляются активаторы (WO 91/09115; Hur D. et al., 2005;
Traggiai E. et al., 2004; Tsuchiyama L. et al., 1997; WO 04/076677), Таким образом, в этих случаях выявляют количество клеток в культурах CD22-положительных, IgM-отрицательных В клеток, которые обрабатывают в течение 7 дней EBV супернатантами, в присутствии или в отсутствие CpG2006 (1 мкг/мл) и IL2 (1000 Ед/мл). Однако присутствие CpG2006 и IL-2 в процессе EBV-иммортализации приводит к снижению числа жизнеспособных клеток, выявляемому при подсчете под микроскопом (фиг. 6В). Это снижение становится значимым при сравнении с клетками, которые подвергали воздействию только супернатантом EBV, но еще более существенным это снижение становится, когда анализируют данные, полученные на отдельной фазе с предварительной стимуляцией (фиг. 6А).
Полученные данные позволяют полагать, что выраженная фаза стимуляции, на которой культуры
человеческих В-клеток обрабатывают стимулирующими агентами (используемыми поодиночке или в
сочетании, таком как CpG2006 и IL-2), оказывает благоприятный эффект на весь процесс отбора и иммортализации IB-клеток с использованием EBV. Такой положительный эффект может быть еще больше
усилен при использовании дополнительных специфических сочетаний стимуляторов (например, сниженных концентраций CpG2006 и/или IL-2) и/или за счет ограничения фазы стимуляции до периода времени (например, от 2 до 4 дней), в течение которого В-клетки демонстрируют оптимальную пролиферативную активность и экспрессию релевантных маркеров (таких как CD21). Удаление стимулирующих
агентов до фазы иммортализации является важным инструментом получения наилучших результатов при
реализации данного метода, поскольку рост и жизнеспособность CD22-положительных В-клеток отрицательно реагирует на непрерывное и значительное присутствие стимулирующих агентов в сочетании с
EBV супернатантами.
Представленные выше данные позволяют продемонстрировать не только возможность использования данного метода для специфического подмножества человеческих В-клеток, где указанное специфическое подмножество определяется с учетом экспрессии поверхностных маркеров клеток (например,
CD21, CD23, CD24, CD27 и/или CD22), но также применимость других критериев селекции антител, секретируемых В-клетками. В данном случае предусматривается использование методов удаления клеток,
экспрессирующих антитела специфического изотипа (IgM), перед проведением иммортализации.
Фактически, анализ по процедуре FACS CD22-положительных, стимулированных CpG2006/IL-2,
истощенных по IgM, EBV-иммортализованных В-клеток, проводимый через 10 дней после EBV инфек- 27 -
019505
ции, подтверждает, что почти все жизнеспособные клетки (на что указывает более высокое прямое рассеяние в двух правых квадратах) продолжают оставаться IgM-отрицательными (нижний правый квадрат), демонстрируя фенотип, который более желателен для получения терапевтических антител (фиг.
7А). Дополнительные данные в пользу того, что иммортализованные, специфические по изотипу Вклеточные культуры могут быть получены и далее поддерживаться с использованием способов согласно
настоящему изобретению, были получены при тестировании супернатантов В-клеток, описанных выше,
по методу иммунодиффузии, проводимому согласно процедуре, описанной в литературе (Mancini G. et
al., 1965), результаты которого подтвердили, что такие В-клетки, по существу, являются клетками, секретирующими IgG (фиг. 7В).
Неожиданный положительный эффект сочетания специфической стимуляции В-клеток и селекции
В-клеток по изотипу перед фазой EBV-иммортализации может быть еще более усилен при включении
других способов сеоекции В-клеток.
Эффективность данного подхода может быть оценена по эффективности клонирования CD22положительных, CpG2006/IL-2-стимулированных, IgM-отрицательных В-клеток. Полученные клетки
размножают in vitro в присутствии CpG2006 и IL-2 в течение 2-4 дней, затем обогащают IgGположительной субпопуляцией при проведении положительной или IgM-отрицательной селекции. CD22положительные, IgM-отрицательные В-клетки инфицируют EBV и клонируют по методу предельных
разведений в ячейках 96-ячеечных планшетов через 1-4 недели после инфекции. Эффективность клонирования из объемной культуры оценивают при подсчете числа ячеек, содержащих растущие клетки, для
каждого исследуемого разведения объемной культуры (например, разведения 1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:100,
1:200) или для каждой концентрации клеток в ячейке (например, 1,5, 10, 20, 25, 50, 100, 200 или более
клеток на ячейку).
Одним из наиболее важных показателей, который нужно учитывать при проведении EBVиммортализации, является поддержание жизнеспособности клеток, используемых для последующего
клонирования. Это особенно важно в том случае, когда следует идентифицировать антигенспецифические В-клетки, которые могут присутствовать в периферической крови с очень низкой частотой
(<1:1000). Было установлено, что EBV представляет собой стимулятор поликлональных В-клеток, но
воздействие EBV на В-клетки приводит вначале к гибели клеток в культуре (Sugimoto M. et al., 2004).
Другие данные, подтверждающие настоящее изобретение, были получены при сравнении результатов проведения трех методов EBV-опосредованной иммортализации клеток на основе одной и той же
исходной популяции CD22-положительных мононуклеарных клеток периферической крови (ПМНК),
собранных от 5 нормальных доноров (фиг. 8А).
В рамках основного (BASIC) способа используется очень простой подход, в соответствии с которым CD22-положительные, IgG-положительные клетки обрабатывают только EBV-содержащим супернатантом в течение 12 ч, промывают и культивируют в течение 10 дней в соответствующих культуральных средах и на питательных клетках. В рамках другого объединенного (COMBINED) метода CD22положительные, IgG-положительные клетки подвергают одновременному воздействию EBV и поликлональных активирующих агентов (CpG2006 и IL-2) в клеточной культуре в течение 10 дней аналогично
процедуре, описанной в литературе для случая использования таких соединений в одновременном режиме (Traggiai Е. et al., 2004; Tsuchiyama L. et al., 1997). В рамках последовательного (SEQUENTIAL) метода, который представляет собой один из возможных путей осуществления способов согласно настоящему изобретению, CD22-положительные клетки вначале подвергают экспозиции с сочетанием CpG2006 и
IL-2 и промывают. Затем IgG-положительные клетки очищают и CD22-положительные, IgGположительные клетки подвергают воздействию EBV-содержащего супернатанта в течение 12 ч, промывают и культивируют в течение 10 дней, также в соответствующих культуральных средах и на питательных клетках.
Поскольку абсолютное число CD22-положительных, IgG-положительных клеток было нормализовано для всех условий в начале экспозиции с EBV, то полученные при анализе клеточных культур и супернатантов данные, определенные в конце 10-дневного культивирования, должны обеспечивать возможность точного сравнения результатов трех методов. Фактически, оба метода: основной (BASIC) и
последовательный (SEQUENTIAL), обеспечивают повышение общего числа клеток, приводя примерно к
2-кратному (200%) увеличению количества клеток относительно исходных значений, в большей мере,
чем в рамках объединенного (COMBINED) метода, который приводит лишь к 1,5-кратному увеличению
(150%). Более важно то, что, по результатам определения числа жизнеспособных клеток, популяция клеток, полученная с использованием последовательного метода (SEQUENTIAL), демонстрирует увеличенное число жизнеспособных клеток в сравнении и с BASIC методом и даже более выражено в сравнении с
объединенным (COMBINED) методом.
Далее проводились другие качественные анализы популяций клеток, которые были получены с использованием трех методов, и указанные анализы проводились с использованием разных критериев.
В рамках FACS-анализа было показано, что за исключением того, что все это были популяции клеток, экспрессирующих IgG, их состав отличался, в целом и в частности, в том, что касается зоны, соответствующей жизнеспособным лимфобластам, которые растут и делятся (отрицательны по результатам
- 28 -
019505
окрашивания иодидом пропидия и характеризуются более высоким прямым рассеянием; это R2 зона на
фиг. 9). Популяция клеток, которую получают с использованием последовательного (SEQUENTIAL) метода, характеризуется значительно большей концентрированностью в данной области, в сравнении с популяцией, которую получают с использованием основного (BASIC) метода и, что еще более удивительно, в сравнении с популяцией, которую получают с использованием объединенного (COMBINED) метода. Клетки с более высоким уровнем флуоресценции, связанным с накоплением иодида пропидия, являются либо мертвыми, либо погибающими, и обе популяции, полученные с использованием основного
(BASIC) и объединенного (COMBINED) методов, характеризуются накоплением значительно большего
числа клеток этого вида, которые не могут быть дальше клонированы или подвергнуты скринингу (фиг.
9, левая панель).
Популяцию жизнеспособных лимфобластов, имеющихся в образцах, анализируют также с целью
определения уровня экспрессии CD23, маркера клеточной поверхности, который присутствует в низких
количествах в большинстве В-клеток периферической крови, но экспрессия которого обычно усиливается при активации (Azim T. and Crawford D., 1988). Представляется важным подтвердить наличие такого
эффекта, поскольку в популяциях EBV-иммортализованных В-клеток человека была продемонстрирована прямая корреляция между экспрессией CD23 и секрецией IgG (Wroblewski J. et al., 2002). Уровни экспрессии CD23 показаны в логарифмической шкале на горизонтальной оси, а относительное число клеток,
экспрессирующих данное количество CD23, показано на вертикальной оси (фиг. 9, правая панель). Из
приведенных данных видно, что оба метода: и основной (BASIC), и последовательный (SEQUENTIAL),
индуцируют высокий уровень экспрессии CD23 в значительно большей доле клеток, чем это наблюдалось в популяции клеток, полученных с использованием объединенного (COMBINED) метода, когда выявлялось лишь небольшое число клеток, экспрессирующих высокие уровни CD23, и накапливались клетки, которые были отрицательными по CD23 или характеризовались низким уровнем экспрессии CD23.
Качественный анализ популяции клеток, полученных согласно трем описанным выше методам, которые проводили на одном и том же пуле первичных В-клеток, дал важную информацию относительно
специфических положительных особенностей способов согласно настоящему изобретению. Фактически,
было подтверждено, что разделение двух фаз: EBV-иммортализации и поликлональной стимуляции,
вместо одновременного воздействия на клетки двумя типами агентов, приводит к получению популяции
клеток с повышенной жизнеспособностью, повышенной экспрессией CD23 и усиленным пролиферативным потенциалом. Кроме того, результаты FACS-анализа показали, что способы согласно настоящему
изобретению позволяют получать популяцию клеток, которая, в некоторых аспектах, соответствует популяции клеток, полученных по основному (BASIC) методу, но характеризуются более высокой частотой
жизнеспособных бластоподобных клеток (см. фиг. 9, левая панель).
Этот аспект является дополнительным, важным и неожиданным фактором, определяющим результаты сравнения разных методов, а именно: количество IgG, которое популяции клеток накапливают в
супернатанте клеточной культуры за относительно короткий период культивирования клеток (8-10 дней).
Очевидно, что любое повышение уровня IgG секреции в супернатанте таких культур положительно влияет
на результаты скрининга антител, поскольку это может сократить период времени, необходимый для выделения олигоклональных или моноклональных клеточных культур, экспрессирующих такие антитела.
Сравнение общего числа IgG, которое накапливается в клеточных культурах, полученных с использованием трех методов на одной и той же исходной популяции клеток, которая была нормализована количественно перед экспозицией с EBV, дополнительно подтверждает преимущества последовательного
(SEQUENTIAL) метода, проводимого согласно настоящему изобретению. Фактически, если основной
(BASIC) и объединенный (COMBINED) методы обеспечивают достижение близких концентраций суммарного IgM (80-100 мкг/мл), то супернатант клеток, получаемых при проведении процедуры по последовательному (SEQUENTIAL) методу, содержит клетки, экспрессирующие суммарный IgG на уровне,
превышающем линейный диапазон концентраций в наборе для ИФТФА (~150 мкг/мл), для всех исследованных степеней разбавления (фиг. 10А).
Таким образом, поликлональная популяция клеток, полученная согласно способам настоящего изобретения, характеризуется наличием клеток, которые не только активно пролиферируют и являются
жизнеспособными, но также экспрессируют уровни суммарного IgG, которые достаточны для проведения множества различных скрининг-тестов, и при этом отсутствуют потенциальные, мешающие тестированию, соединения, такие как поликлональные стимулирующие агенты, что в итоге ускоряет процесс
выявления клеток, экспрессирующих интересующие IgG антитела.
Пример 3. Отбор, стимуляция, имортализация и скрининг человеческих В-клеток, экспрессирующих IgG антитела, которые способны связывать или нейтрализовать терапевтические мишени.
Материалы и методы.
Получение человеческих иммортализованных В-клеток, экспрессирующих IgG антитела.
Общее описание данной процедуры показано на фиг. 11. Условия и средства, используемые в этой
процедуре, описаны в примерах 1 и 2.
Тест на микронейтрализацию CMV.
Человеческие эмбриональные фибробласты легкого (HELF) вносят в ячейки 96-ячеечного планшета
- 29 -
019505
с плоским дном (1,0-2,5×104/ячейку) в 100 мкл минимальной эссенциальной среды Игла (MEM) с добавкой 10% фетальной сыворотки теленка (ФСТ), 1 мМ пирувата натрия (NaP), 2 мМ глютамина, 10 Ед/мл
пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (GPS) и культивируют в течение 24 ч при температуре 37°С.
50 мкл супернатанта из каждой культуры/клона В-клеток инкубируют с лабораторным штаммом
CMV (AD169; 500 БОЕ, в 50 мкл MEM с добавкой 5% ФСТ; общий объем смеси составляет 100 мкл) в
круглодонных ячейках 96-ячеечного планшета в течение 1 ч при температуре 37°С. Среду от культур
HELF отбирают и заменяют вирусной смесью. Затем планшеты центрифугируют при 2000 g в течение 30
мин и инкубируют в течение 90 мин при температуре 37°С в атмосфере СО2. Далее среду удаляют, добавляют 100 мкл ростовой среды и культуру выдерживают в инкубаторе еще в течение 72 ч.
Эффект В-клеточных супернатантов на CMV-инфицирующую активность определяют по результатам окрашивания промежуточного раннего антигена CMV (IEA) при проведении непрямого окрашивания HELF клеток иммунопероксидазой. Монослойные клетки фиксируют 50% ацетоном и 50% раствором метанола (хранят при температуре -20°С) в течение 1 мин при комнатной температуре (КТ) и затем
промывают ФБР. Клетки подвергают пермеабилизации в 0,1% Тритоне Х-100 в ФБР с добавкой 1% Н2О2
в течение 5 мин на льду и затем промывают ФБР. Эндогенную пероксидазу блокируют ФБР с добавлением 50% метанола и 0,6% Н2О2 в течение 30 мин при КТ в темноте и затем промывают ФБР. Добавляют на
10 мин при КТ 50 мкл агента, блокирующего белок (Ultra Tech HRP 500-600 Test; универсальная система
детекции стрептавидина-биотина; PN IM2391) и затем все промывают ФБР. На 60 мин при КТ к ячейкам
добавляют оптимальные концентрации первичного антитела (противочеловеческий IEA CMV; Argene
Biosoft; Ref No. 11-003). Ячейки промывают, затем к ячейкам на 10 мин при КТ добавляют 50 мкл биотинилированного вторичного антитела (Ultra Tech HRP 500-600 Test; универсальная система детекции
стрептавидина-биотина; PN IM2391). Далее ячейки тщательно промывают ФБР и DAB субстратом
(Merck; ref. no. 2029240001) в 0,1% Н2О2, добавляемым на 30-45 мин при КТ в темноте. Реакцию останавливают путем разбавления ФБР и под микроскопом определяют число IEA-положительных ядер.
В-клеточные супернатанты также анализируют с использованием эндотелиальных клеток пупочной
вены человека (HUVEC) и клинического штамма CMV VR1814.
В качестве отрицательного контроля используют В-клеточные супернатанты, содержащие нерелевантные IgG антитела. В качестве положительного контроля используют коммерческий препарат человеческих IgG антител, полученный из сыворотки пациентов, который специфичен для CMV (Cytotect; Biotest) (с использованием метода последовательных разбавлений, начиная с концентрации 125 мкг/мл).
Анализ по методу ИФТФА, используемый для выявления CMV связывающих белков.
Первый тест проводят с использованием коммерческого набора для количественного иммуноферментного твердофазного анализа (ИФТФА), применяемого для выявления специфических IgG антител,
связывающихся с белковым экстрактом CMV в сыворотке или плазме человека. Коммерческий набор для
ИФТФА (BEIA CMV IgG Quant Kit; Bouty) применяют согласно инструкции производителя и его пригодность подтверждают на основе коммерческой смеси IgG антител, специфичных для CMV (Cytotect;
Biotest), в дозе 50 Ед/мл.
В общих чертах, процедура состоит в том, что анализируемые полоски, покрытые инактивированной смесью CMV белка (полученной из лабораторного штамма AD169), помещают в микропланшеты и
инкубируют с В-клеточными супернатантами, разведенными в соотношении 1:81 (10 мкл супернатантов
добавляют к 800 мкл разбавителей для образца в системе BEIA), и планшеты инкубируют при комнатной
температуре в течение 30 мин. После цикла промывки добавляют предварительно разбавленное моноклональное противочеловеческое IgG антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (100 мкл), и
планшет инкубируют при комнатной температуре еще в течение 30 мин. После второго цикла промывки
добавляют предварительно разбавленный раствор субстрата ТМВ (100 мкл) и планшет инкубируют при
комнатной температуре еще в течение 15 мин. Реакцию останавливают добавлением блокирующего раствора (100 мкл/ячейку) и определяют оптическую плотность в приборе для оценки бихроматизма при
длинах волн 450/620 нм.
Дополнительные анализы проводят в рамках методики ИФТФА, установленной в лаборатории с
использованием специфических пептидов и рекомбинантных CMV белков, иммобилизованных на твердых поверхностях.
Рекомбинантный иммунодоминантный участок антигена gB CMV получают в виде рекомбинантного белка слияния вместе с глютатион-S-трансферазой (GST) и очищают путем аффинной хроматографии
(GST-аффинная очистка; Biodesign Int, cat. No. R18102) или в виде пептида. Рекомбинантный иммунодоминантный участок антигена gH CMV (штамм VR1814) также получают в Е. coli и подвергают очистке
после выделения из лизата бактериальных клеток, используя метод на основе GST-аффинности. Указанные анализы по процедуре ИФТФА проводят в формате известного протокола ИФТФА в 96-ячечных
планшетах с небольшими модификациями. В общих чертах, процедура состоит в том, что антиген разбавляют в ФБР до концентрации 2 мкг/мл в ФБР и используют 50 мкл данного раствора белка для внесения в ячейку EIA полистиролового планшета (Nunc, cat. No. 469949), с последующей инкубацией в течение ночи при температуре 4°С. Далее указанный белковый раствор удаляют из ячеек и ячейки промывают четыре раза с использованием 100 мкл промывочного буфера (ФБР, содержащий 0,05% Твина 20).
- 30 -
019505
Обработку для блокирования неспецифического связывания проводят путем раскапывания в ячейки по
100 мкл ФБР, содержащего 1% молока, с последующим инкубированием планшета в течение 1 ч при
температуре 37°С. После проведения четырех циклов промывки с использованием 150 мкл промывочного буфера, в каждую ячейку добавляют аликвоты супернатанта из клеточных культур по 50 мкл, с использованием в качестве отрицательного контроля среды от данной клеточной культуры в количестве 50
мкл на ячейку. После инкубации в течение 2 ч при температуре 37°С планшет промывают четыре раза,
используя по 150 мкл промывочного буфера, и затем добавляют 50 мкл противочеловеческого IgG антитела, меченного пероксидазой хрена (Fc-специфичное противочеловеческое козье IgG; Sigma, cat. No.
A0170), которое разбавляют в пропорции 1:30000 промывочным буфером. После инкубации в течение 1
ч при комнатной температуре планшет промывают четыре раза с использованием 150 мкл промывочного
буфера перед раскапыванием в ячейки по 50 мкл/ячейку раствора субстрата ТМБ (3,3'5,5' тетраметилбензидин; Sigma, cat. no. Т0440). После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре хромогенную реакцию останавливают добавлением 100 мкл/ячейку блокирующего раствора (1н. серной кислоты)
и определяют оптическую плотности при 450 нм.
Тест на связывание HSP60 по методу ИФТФА.
Процедура по методу ИФТФА для выявления антител, связывающих HSP60, была разработана с
использованием EIA/RIA ячеечных полосок, в которые вносили по 50 мл рекомбинантного человеческого белка HSP60 (Stressgen), разбавленного 0,1 М NaHCO3, pH 9,6, до 1 мкг/мл, и выдерживают в течение
ночи при комнатной температуре. Полоски промывают 3 раза ФБР с добавкой 0,5% Твина 20, рН 7,4 и
сайты неспецифического связывания блокируют добавлением ФБР с содержанием 1% БСА и 5% сахарозы на 30 мин при комнатной температуре. После 4 промывок полоски инкубируют в течение 3 ч при
комнатной температуре с панелью первичных антител: противочеловеческий HSP60 (разбавленный ФБР
с 1% БСА до 5 или 10 мкг/мл; Santa Cruz Biologicals), мышиный IgG изотип в качестве отрицательного
контроля (5 мкг/мл в ФБР с добавкой 1% БСА), неродственное человеческое рекомбинантное IgG антитело (Herceptin, 5 мкг/мл), только клеточная среда и супернатанты от EBV-иммортализованных человеческих В-клеток, секретирующих IgG. После 4 промывок полоски инкубируют с противомышиным IgG
или противочеловеческим IgG (Dako), конъюгированным с пероксидазой хрена, разбавленным в ФБР с
содержанием 1% БСА, в течение 1 ч при комнатной температуре. После 4 промывок к данным полоскам
добавляют раствор субстрата ТМБ и оставляют для развития реакции окрашивания при комнатной температуре. Планшеты анализируют при длине волны 450 нм.
Результаты.
Способы согласно настоящему изобретению тестируют на человеческих В-клетках, полученных от
доноров, в отношении которых было подтверждено, что их кровь содержит антитела, связывающие и/или
нейтрализующие человеческий вирус, в частности человеческий цитомегаловирус (CMV), β-герпесвирус,
вызывающий врожденные дефекты и высокопатогенный для пациентов со сниженным иммунитетом
(Landolfo S. et al., 2003).
CMV представляет собой хороший пример вирусной мишени, представляющей клинический интерес, которая может быть нейтрализована антителами, секретируемыми в природном состоянии выбранными человеческими В-клетками, которые были стимулированы и иммортализованы согласно способам
настоящего изобретения, в общих чертах показанным на фиг. 11. Кроме того, среди различных терапевтических стратегий, применяемых в случае CMV, введение внутривенного CMV иммуноглобулина (в
коммерческом варианте поставляемого компанией Cytotect или CytoGam) представляет собой раствор,
лишь частично походящий для блокирования CMV инфекции, в частности, у пациентов со сниженным
иммунитетом, которым мощные антивирусные препараты зачастую вводятся вместе (Bonaros N.E. et al.,
2004; Kocher A.A. et al., 2003; Kruger R.M. et al., 2003). Указанные препараты охарактеризованы как подходящие для клинического использования и которые могут быть легко получены из объединенной человеческой плазмы с высокими титрами анти-CMV антител. Однако для целей лечения CMV инфекций
были бы полезны более мощные препараты, включающие очищенные человеческие моноклональные
антитела, получаемые при экспрессии в клетках млекопитающих, разрешенных для такого рода целей.
Человеческие В-клетки, экспрессирующие CMV-нейтрализующие антитела, могут быть получены
от доноров, выбранных на основе одного или нескольких иммунологических скрининг-тестов (таких как
иммуноблоттинг, ИФТФА или ELISPOT), или могут быть получены в виде антигенных микрочипов, которые доступны от ряда коммерческих источников (Sorin Biomedica, Italy; BioMerieux, France).
Человеческие В-клетки выделяют из клинических образцов от выбранных доноров, которые характеризуются высокими титрами анти-CMV антител в крови, по данным анализа методом ИФТФА, ELISPOT или теста на нейтрализацию. Затем клетки анализируют по способам согласно настоящему изобретению (фиг. 11). Полученную популяцию CD22-положительных, IgM-отрицательных, EBVиммортализованных человеческих В-клеток подвергают скринингу с использованием, непосредственно
или опосредованно, супернатантов клеточных культур, полученных путем субклонирования исходной
популяции для целей выявления таких популяций, которые содержат CMV-нейтрализующие и/или CMVсвязывающие IgG антитела. Исходные В-клетки, продуцирующие указанные антитела, могут быть выделены далее, на последующих стадиях субклонирования, с целью клонирования и секвенирования ДНК,
- 31 -
019505
кодирующей эти антитела.
Первый тип первичного скрининга был применен на более чем в 400 субкультурах в 96-ячеечных
планшетах, где каждая ячейка содержит примерно 100 В-клеток. Супернатанты из указанных ячеек подвергают скринингу в тесте на микронейтрализацию CMV для определения их способности блокировать
инфекцию человеческих клеток лабораторным штаммом (AD169) или клиническим штаммом (VR1814)
человеческого CMV. Четыре из 453 В-клеточных культур, подвергнутых скринингу, демонстрируют значительную нейтрализующую активность в повторных экспериментах с использованием лабораторного
изолята CMV, а одна из культур продемонстрировала нейтрализацию клинического изолята CMV в повторных тестах (фиг. 12А).
Второй тип первичного скрининг-теста был применен на популяции В-клеток, полученных от другого CMV-сероположительного донора, которая также была подвергнута процедурам согласно настоящему изобретению. В данном случае CMV-специфическая реактивность была выявлена с использованием коммерчески доступного набора ИФТФА, который является более чувствительным. CMVположительные субкультуры, в частности указанные выше, могут использоваться в начале процесса субклонирования с целью идентификации клеточных культур и последовательностей, соответствующих антителам, ответственным за нейтрализующую или связывающую активности, выявленные с использованием первичных скрининг-тестов.
Указанные антитела в виде очищенных препаратов из супернатантов В-клеток или в виде экспрессированных рекомбинантных белков, могут быть далее подвергнуты валидации с использованием известных тестов in vitro, включающих органы или клетки (Reinhardt В. et al., 2003; Forthal D.N. et al., 2001;
Goodrum F.D. et al., 2002). Кроме того, релевантные доклинические тесты могут быть проведены с использованием CMV инфицированных животных, в частности, на моделях, в рамках которых клетки человека-хозяина могут быть трансплантированы грызунам со сниженным иммунитетом (Gosselin J. et al.,
2005; Thomsen M. et al., 2005). Антиген/эпитоп CMV, распознаваемый указанными антителами, может
быть идентифицирован в разных тестах in vitro, основанных, например, на методе ИФТФА или вестернблоттинге, с использованием CMV-специфичных усеченных белков или синтетических белков, или в
рамках конкурентных реакций с другими CMV-специфичными антителами, для которых известен антиген/эпитоп (Greijer A. et al., 1999; Schoppel K. et al., 1996; Ohlin M. et al., 1993).
Могут быть проведены также другие скрининг-тесты с использованием супернатантов от клеточных культур, исследованных на активность по нейтрализации человеческого цитомегаловируса или по
связыванию с человеческим цитомегаловирусом. Фактически, доступность большого репертуара IgGсекретирующих клеток позволяет проводить идентификацию большого числа человеческих IgG, обладающих связывающей специфичностью к разным эпитопам или антигенам CMV, которые могут быть
ассоциированы с CMV инфекцией. Так, например, известно, что кровь пациента с атеросклерозом содержит высокие уровни антител, распознающих фрагмент человеческого белка теплового шока 60
(HSP60), который аналогичен CMV белкам. В частности, один из таких белков, названный US28, экспрессируется на поверхности эндотелиальных клеток, и антитела, связывающие этот белок, могут индуцировать апоптоз эндотелиальных клеток, и это позволяет предположить, что CMV инфекция может запускать аутоиммунный ответ, вовлекаемый в патогенез атеросклероза (Bason С. et al., 2003).
Соответственно, подвергают скринингу 65 супернатантов клеточных культур (каждый из которых
содержит супернатант из 5 ячеек EBV-иммортализованных клеток, полученных на основе первичных Вклеток, взятых от CMV-сероположительного индивидуума) на наличие иммунореактивности к HSP60 с
использованием процедуры ИФТФА на основе рекомбинантного человеческого HSP60. Шесть пулов
продемонстрировали статистически значимую реактивность, которая в три раза превышает фоновое значение, по данным ИФТФА в повторных экспериментах (фиг. 12В). Указанные культуры иммортализованных клеток, секретирующих антитела, могут быть далее субклонированы в пулах клеток при повторе
процесса скрининга и субклонирования до выделения клеточных культур, секретирующих человеческие
моноклональные IgG антитела, которые связывают человеческий HSP60.
Второй тип первичного скрининга применяют на популяции В-клеток, полученных от специфичного CMV-сероположительного донора, и указанную популяцию вновь подвергают обработке согласно
способам настоящего изобретения. В одном случае CMV-специфическая реактивность была выявлена
параллельно с использованием панели разных тестов, с целью отбора из одной популяции первичных
клеток олигоклональных или моноклональных популяций иммортализованных клеток, где каждая из них
экспрессирует антитела против разных CMV-специфичных эпитопов, и таким образом обеспечивается
полное представление иммунной реакции на CMV инфекцию у индивидуума (фиг. 13).
Поликлональный препарат EBV-иммортализованных клеток был размножен примерно до 4000 пулов для установления клеточных культур в 96-ячеечных планшетах, каждая из которых содержит статистически 20 клеток, и каждая ячейка содержит олигоклональную популяцию клеток. Однако в связи с
низкой частотой клеток, продуцирующих антитела, специфические для определенного антигена, любая
из указанных клеточных культур, для которой в супернатанте выявлен CMV-специфичный IgG, скорее
всего, будет представлять собой моноклональную клеточную культуру, экспрессирующую человеческое
моноклональное антитело.
- 32 -
019505
Исходные тесты позволяют оценить CMV-связывающие свойства антител, продуцируемых олигоклональной/моноклональной клеточной культурой, которая специфична либо для смеси CMV белков,
либо для специфических антигенов, в отношении которых известно, что они распознаются CMVнейтрализующими антителами. Затем культуры, положительные по результатам по меньшей мере одного
из указанных тестов, оценивают в тесте на CMV микронейтрализацию.
Были выбраны два CMV-специфичных антигена для исходного скрининга олигоклональных/моноклональных препаратов клеток: гликопротеины оболочки gB и gH. Указанные белки, которые
играют решающую роль в прикреплении вируса и в процессе слияния, являются мишенями для человеческих CMV-нейтрализующих антител, о которых в литературе имеется более подробная информация.
Сыворотки от сероположительных индивидуумов, а также моноклональные антитела против указанных
гликопротеинов ингибируют HCMV инфекцию клеточных культур in vitro. Была продемонстрирована
эффективная роль антител, направленных против gB и gH, вовлекаемых в вирус-нейтрализующую способность человеческий сыворотки, за счет выявления корреляции между анти-gB и анти-gH титрами и
общей нейтрализующей активностью человеческой сыворотки выздоравливающих пациентов, а также за
счет выраженного падения нейтрализующей способности сыворотки после адсорбции gB- и gHспецифичных антител (см. обзор Cytomegaloviruses, Molecular Biology and Immunology, Reddehase, M.
(ed.) Norfolk: Caister Academic Press (2006) и, в частности, Boehme K. and Compton T., p. 111-130, Mach
M., pp. 265-283).
Как показано на фиг. 13, при использовании олигоклональных клеточных культур, в которых клетки активно пролиферируют (примерно в 35% от всех ячеек, в которые были высеяны клетки), можно
идентифицировать ячейки, которые содержат IgG, реактивный с CMV белком, по меньшей мере в одном
из тестов, специфичных для некоторых белков CMV (gB- и gH-ИФТФА) или для полного белкового экстракта CMV (BEIA CMV ELISA). В частности, некоторые ячейки содержат человеческий IgG, который
нейтрализует CMV in vitro.
Среди восьми олигоклональных клеточных культур, которые являются положительными только по
результатам BEIA CMV ELISA, ячейка, обозначенная как 9G8, содержит человеческий IgG, выявленный
как высокоположительный по CMV реактивности (фиг. 14). Образец из ячейки 9G8, содержащий десять
тысяч клеток, был использован для получения кДНК, и последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепи человеческих IgG были специфически амплифицированы в рамках ПЦР. Продукты
реакции амплификации подвергают клонированию и секвенированию, так что в результате было подтверждено, что 9G8 содержит моноклональную клеточную культуру, секретирующую новый связывающий CMV человеческий IgG, обладающий специфическими вариабельными участками (фиг. 15). ДНК,
кодирующая вариабельный участок данного антитела, также была использована для определения специфических CDR последовательностей, которые, сами по себе или в сочетании с 9G8, могут использоваться
для создания антител, связывающих CMV.
Таким образом, процесс, включающий способы согласно настоящему изобретению по иммортализации клеток, секретирующих антитела, позволяет проводить идентификацию новых VH и VL последовательностей из олигоклональных клеточных культур, создаваемых непосредственно из поликлональной
популяции клеток, которые были иммортализованы. Антитела, такие как 9G8 или любой другой белок,
содержащий один или несколько CDR из данного антитела (например, только HCDR3; HCDR1, HCDR2 и
HCDR3; LCDR1; LCDR; и LCDR3), могут быть использованы в клинических и экспериментальных стратегиях, связанных с CMV, в частности для выявления CMV в биологических образцах.
Способы согласно настоящему изобретению также были использованы для иммортализации первичных В-клеток, полученных от HIV-1-, HSV-1- и/или HSV-2-сероположительных индивидуумов.
Например, были отобраны шесть HSV-1/HIV-1-сероположительных индивидуумов на основании
того, что их плазма демонстрировала высокие титры IgG антител, связывающих HSV-1 белки, по данным
анализа с использованием коммерческого набора для ИФТФА (Bouty BEIA HSV-1; cat. no. 20921).
ПМНК от этих индивидуумов были объединены и подвергнуты иммортализации с использованием методики, описанной выше для ПМНК, полученных от донора CMV5.
Исходные 70 млн ПМНК приводят к получению популяции из 1,9 млн CD22-положительных, IgMотрицательных клеток, которые продолжают секретировать HSV-1-специфичные IgG антитела в количествах, достаточных для выявления в супернатанте клеточной культуры не только с использованием набора для ИФТФА, но также с использованием теста in vitro по выявлению антител, нейтрализующих
HSV-1 инфекцию, который основан на null мутанте вируса, где gC-кодирующая последовательность замещена lacZ геном (Laquerre S. et al., 1998).
Поликлональная популяция клеток была частично использована для скрининг-тестов, проводимых
с целью идентификации клеток, секретирующих антитела, обладающие HSV-1-нейтрализующей активностью, путем высева сотен олигоклональных клеточных культур, где каждая из них содержит статистически 50-100 клеток, сразу после получения клеточной культуры.
Дополнительно аликвоты клеточной культуры, полученные после иммортализации, были заморожены в ампулах, как это обычно делают с установленными клеточными линиями млекопитающих. Некоторые из указанных ампул были разморожены через несколько месяцев, клетки культивировали в тече- 33 -
019505
ние нескольких дней в качестве исходных поликлональных клеточных культур и затем были использованы для получения тысяч олигоклональных клеточных культур, каждая из которых содержит статистически 5 клеток.
Тест на HSV-1-нейтрализацию проводят на обоих типах олигоклональных клеточных культур (т.е.
полученных сразу после высева 50-100 клеток на ячейку или полученных путем высева 5 клеток на ячейку после оттаивания ампул, содержащих аликвоты исходной поликлональной популяции клеток), где оба
используемых способа привели к идентификации олигоклональных клеточных культур, экспрессирующих человеческие IgG антитела, которые нейтрализуют in vitro HSV-1.
В частности, клетки, которые секретируют антитела, нейтрализующие HSV-1, полученные в указанном выше процессе, были идентифицированы в более чем 20 таких олигоклональных клеточных
культурах. Несмотря на то что антитела, как может быть показано, идентичны в нескольких таких клеточных культурах, большое число положительных ячеек и возможность непосредственно идентифицировать последовательности таких антител по методу ОТ-ПЦР позволяют тестировать многочисленные
альтернативные олигоклональные клеточные культуры (которые, возможно, растут с разной скоростью),
для целей последующего отбора. Фактически, не только последовательности антител могут быть идентифицированы и охарактеризованы, но представляющие интерес моноклональные антитела могут быть
подвергнуты очистке для тестирования активности, и при этом отсутствует необходимость их клонирования и экспрессии в виде рекомбинантных белков, что ускоряет идентификацию человеческих моноклональных антител, представляющих наибольший интерес.
Заключение.
Результаты, представленные в приведенных примерах, демонстрируют многочисленные преимущества способов согласно настоящему изобретению и значительное усовершенствование относительно достигнутого в данной области уровня.
Соответствующая последовательность стадий отбора, стимуляции и иммортализации позволяет получать особенно полезные поликлональные популяции клеток, которые, будучи выделенными с учетом
изотипа, но независимо от специфических антигенсвязывающих свойств антител, секретируемых этими
клетками, могут использоваться для выявления антител, обладающих разными свойствами, из клеток,
полученных от одного донора или из донорского пула.
Фактически, способы настоящего изобретения обеспечивают получение поликлональных, олигоклональных или моноклональных препаратов популяций клеток, которые могут быть далее подвергнуты
скринингу и отбору с использованием разных критериев, применяемых параллельно или в серии. Как
показано в табл. 2, разнообразие репертуара антител у субъекта охватывается способами настоящего
изобретения таким образом, что обеспечивается наличие большого числа жизнеспособных и пролиферирующих клеток, которые секретируют антитела на высоком уровне, подходящем для обширных скрининг-анализов. Кроме того, более однородный состав получаемой популяции клеток создает возможность однозначного доступа, без дополнительных стадий отбора или сортировки клеток, к чрезвычайно
широкому (если не полному) набору клеток во всей их полноте и разнообразию, которые характерны для
того или иного донора. Как было показано при последовательном скрининге анти-CMV и анти-HSP60
антител, если специфический тест проводят на сыворотке с целью выбора донора клеток, подлежащих
иммортализации, то полученная популяция клеток может быть далее использована для более тонкого
анализа иммунного ответа, при поиске антител, обладающих широким спектром свойств.
Более того, возможно непосредственно создавать, используя соответствующие преимущества, клеточные культуры, высеваемые с очень низкой плотностью клеток, для целей идентификации моноклональных антител. Полученные клеточные культуры могут также поддерживаться и подвергаться скринингу параллельно, либо с целью оценки разных условий культивирования клеток (например, на питательных клетках, в среде, с ростовыми факторами) или для тестирования панели антигенов и биологической активности (как было показано для клеток, полученных от донора CMV5), но всегда процедуру начинают с оной популяции клеток.
И наконец, данный подход применим для создания поликлональных популяций иммортализованных клеток, секретирующих антитела, которые могут использоваться для селекции сотен или тысяч олигоклональных клеточных культур в автоматизированном режиме, а также для получения серии ампул,
которые могут быть заморожены, и где каждая из них содержит аликвоту из популяций клеток, полученных по способам настоящего изобретения.
В частности, указанные клетки могут рассматриваться в качестве библиотеки клеток, секретирующих антитела, которые могут быть разморожены и протестированы, при желании, как было показано в
примере с использованием клеток, полученных от HSV-1-сероположительного донора, с целью более
полного анализа или для повторного анализа популяции иммортализованных клеток на наличие желаемой антительной специфичности. Таким образом, идентификация и продукция моноклональных антител,
обладающих желаемыми свойствами, может быть достигнута даже для мишеней, которые не рассматривались (или даже были неизвестны), когда проводился отбор донора, или когда популяции клеток уже
были иммортализованы и хранились в виде аликвот в замороженном состоянии.
- 34 -
019505
Список литературы
- 35 -
019505
- 36 -
019505
- 37 -
019505
- 38 -
019505
- 39 -
019505
- 40 -
019505
- 41 -
019505
Список последовательностей
- 42 -
019505
- 43 -
019505
- 44 -
019505
- 45 -
019505
- 46 -
019505
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения популяции иммортализованных В-клеток, которые секретируют антитела одного или более специфических изотипов, включающий следующие стадии, выполняемые последовательно:
a) отбор популяции В-клеток, которая экспрессирует антитела, из одного или более биологических
образцов в независимом от антигена режиме и на основе экспрессии по меньшей мере одного маркера
клеточной поверхности;
b) стимуляция указанной популяции выбранных В-клеток по меньшей мере одним стимулирующим
агентом в условиях клеточной культуры, где стимулирующий агент выбран из группы, состоящей из активаторов врожденного иммунитета, цитокинов, агонистов рецепторов клеточных мембран семейства
TNF-рецепторов и их сочетаний;
c) удаление указанного стимулирующего агента из клеточной культуры;
d) отбор популяции стимулированных В-клеток, которая экспрессирует антитела одного или более
специфических изотипов, из указанной клеточной культуры;
e) воздействие на указанную популяцию выбранных и стимулированных клеток агентом иммортализации, представляющим собой вирус Эпштейна-Барра, в условиях клеточной культуры;
f) удаление указанного агента иммортализации из указанной клеточной культуры.
2. Способ по п.1, где В-клеточный поверхностный маркер представляет собой CD22, CD19 или
CD27.
3. Способ по п.1 или 2, где указанный стимулирующий агент выбирают из
a) сочетания олигонуклеотида на основе CpG и цитокина и
b) сочетания агониста рецептора клеточной мембраны из семейства TNF-рецепторов и цитокина.
4. Способ по любому из пп.1-3, где указанная популяция В-клеток стадии d) экспрессирует IgG антитела.
5. Популяция иммортализованных В-клеток, получаемая способом по любому из пп.1-4.
6. Клеточная культура, включающая популяцию В-клеток по п.5.
7. Супернатант клеточной культуры по п.6.
8. Применение популяции клеток по п.5 для идентификации и получения моноклонального антитела, обладающего желаемой антигенсвязывающей специфичностью и/или биологической активностью.
9. Применение клеточной культуры по п.6 для идентификации и получения моноклонального антитела, обладающего желаемой антигенсвязывающей специфичностью и/или биологической активностью.
10. Применение супернатанта по п.7 для идентификации и получения моноклонального антитела,
- 47 -
019505
обладающего желаемой антигенсвязывающей специфичностью и/или биологической активностью.
11. Применение популяции клеток по п.5 для определения признаков специфичного по изотипу иммунного ответа на аутологичный или гетерологичный антиген, вирус, бактериальную клетку, токсин,
паразитарную клетку и вакцину у указанного индивидуума.
12. Применение клеточной культуры по п.6 для определения признаков специфичного по изотипу
иммунного ответа на аутологичный или гетерологичный антиген, вирус, бактериальную клетку, токсин,
паразитарную клетку и вакцину у указанного индивидуума.
13. Применение супернатанта по п.7 для определения признаков специфичного по изотипу иммунного ответа на аутологичный или гетерологичный антиген, вирус, бактериальную клетку, токсин, паразитарную клетку и вакцину у указанного индивидуума.
14. Набор для идентификации и получения моноклонального антитела, обладающего желаемой антигенсвязывающей специфичностью и/или биологической активностью, где указанный набор включает
популяцию клеток по п.5, клеточную культуру по п.6 или супернатант по п.7.
15. Способ получения клеточной культуры, которая секретирует моноклональное антитело, обладающее желаемой антигенсвязывающей специфичностью и/или биологической активностью, включающий следующие стадии:
a) размножение популяции клеток по п.5 или клеточной культуры по п.6 с получением клеточных
культур, каждая из которых содержит статистически 20 или более клеток;
b) скрининг супернатанта от указанных клеточных культур для выявления таких супернатантов, которые демонстрируют желаемую антигенсвязывающую специфичность и/или биологическую активность;
c) разделение клеточных культур, демонстрирующих желаемую антигенсвязывающую специфичность и/или биологическую активность;
d) повторение стадий (b) и (с) в отношении указанных клеточных культурах до выделения одной или
более клеточных культур, каждая из которых секретирует моноклональное антитело с желаемой антигенсвязывающей специфичностью и/или биологической активностью в супернатант клеточной культуры.
16. Способ получения клеточной культуры, которая секретирует моноклональное антитело, обладающее желаемой антигенсвязывающей специфичностью и/или биологической активностью, включающий следующие стадии:
a) скрининг супернатанта от клеточных культур, полученных путем разделения популяций клеток
по п.5 или клеточной культуры по п.6 на множественные клеточные популяции, содержащие статистически 20 или менее таких клеток, для выявления одной или более указанных популяций клеток, которые
секретируют антитела с желаемой антигенной специфичностью и/или биологической активностью;
b) выделение клеточных культур, секретирующих моноклональное антитело с желаемой специфичностью и/или биологической активностью.
17. Способ получения моноклонального антитела, включающий:
a) размножение клеточной культуры, полученной способом по п.15 или 16; и
b) очистку моноклонального антитела из супернатанта указанной клеточной культуры.
18. Способ по любому из пп.15-17, где желаемая антигенсвязывающая специфичность и/или биологическая активность направлены на человеческий антиген, антиген млекопитающего, вирусный антиген,
бактериальный антиген, растительный антиген, паразитарный антиген, органический или неорганический антиген.
- 48 -
019505
Фиг. 1
- 49 -
019505
Фиг. 2
Фиг. 3
- 50 -
019505
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 6
- 51 -
019505
Фиг. 7
Фиг. 8
- 52 -
019505
Фиг. 9
Фиг. 10
- 53 -
019505
Фиг. 11
- 54 -
019505
Фиг. 12
Фиг. 13
- 55 -
019505
Фиг. 14
Фиг. 15
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 56 -