ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава РФ На
реклама
ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава РФ На правах рукописи АРТЕМЬЕВА Анна Сергеевна ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА В-КЛЕТОЧНЫХ ЛИМФОМ СРЕДОСТЕНИЯ ИЗ КРУПНЫХ КЛЕТОК 14.01.12 – онкология 14.03.02 – патологическая анатомия Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: д.м.н. Семиглазова Т.Ю. д.м.н., проф. Франк Г.А. Санкт-Петербург 2015 1 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ……………………………………………………………….4 Глава 1. Обзор литературы. Клинико-морфологические особенности В-клеточных лимфом средостения из крупных клеток……………………………………………………………………..8 1.1 Лимфома Ходжкина ………………………………………………….8 1.2 Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома……………..16 1.3 Первичная медиастинальная крупноклеточная В-клеточная лимфома………………………………………………………………20 1.4 Медиастинальная лимфома серой зоны……………………………30 Глава 2. Материалы и методы……………………………………..37 2.1 Характеристика больных ……………………….…………………..37 2.2 Обследование больных……………………………………...............40 2.2.1 Гистологическое исследование.…………………………………..40 2.2.2 Иммуногистохимическое исследование……………....................42 2.2.3 FISH-исследование……….………………………..........................46 2.2.4 Клиническое обследование……….……………………………….49 2.3. 1 Лечение……….……………………………………………………51 2.3.2 Оценка эффективности лечения…………………………….…….52 2.4 Статистические методы………...........................................................54 Глава 3. Медиастинальная лимфома серой зоны……………….55 Глава 4. Первичная медиастинальная крупноклеточная Вклеточная лимфома……………………………………………………64 4.1 Морфологические изменения………………………………………64 4.2 Результаты иммуногистохимического исследования…………….68 4.3 Клиническая часть…………………………………………………..72 Глава 5. Классическая лимфома Ходжкина и диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома. 5.1 Классическая лимфома Ходжкина…….……………………………79 2 5.2 Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома……………...84 Глава 6. Обсуждение полученных результатов и заключение…...94 ВЫВОДЫ………………………………………………………………108 Практические рекомендации………………………………………..111 Список сокращений…………………………..………........................112 Список литературы…………………………………………………...113 3 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы Опухоли средостения составляют менее 1% всех опухолей человека, но чаще всего поражают людей молодого трудоспособного возраста и большую часть из них составляют лимфопролиферативные заболевания, поддающиеся системному лечению. Самая частая лимфома средостения – лимфома Ходжкина, встречается в 50-70% случаев и 90-95% из них это вариант с нодулярным склерозом. Около 10% всех лимфом средостения составляет первичная медиастинальная крупноклеточная В-клеточная лимфома, которая по своим характеристикам занимает промежуточное положение между диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой и классической Лимфомой Ходжкина [Savage K.J., 2006]. Существуют объективные трудности клинической и морфологической диагностики опухолей средостения, особенно малосимптомным течением лимфоидной часто природы. В диагностируются связи с местно распространенные формы заболевания. Получить диагностический материал сложно, для этого используют трансторакальную, трансбронхиальную пункционную биопсию либо медиастиноскопию с биопсией. Однако достаточный объем материала получить при пункции удается редко, а медиастиноскопия является довольно травматичным вмешательством для диагностической операции, и полученный материал зачастую также небольшого объема и деформирован. Помимо малого количества и деформации материала, что само по себе затрудняет морфологическую диагностику, лимфомы средостения демонстрируют значительную вариабельность гистологических и цитологических изменений, что влечет за собой необходимость выполнения иммуногистохимического исследования во всех случаях [Chan J.K.C. et al., 2000; Johnson P.W.M. et al., 2008; Martelli M. et al., 2015; Франк Г.А. с соавт., 2005]. 4 В-клеточные лимфомы средостения представляют собой группу заболеваний, имеющих общие звенья патогенеза, но при этом клиникоэпидемиологические, морфологические, иммунофенотипические особенности, различную чувствительность к терапии и прогноз. Эта группа включает: классическую лимфому Ходжкина, первичную медиастинальную крупноклеточную В-клеточную лимфому и диффузную крупноклеточную Вклеточную лимфому. Кроме того, встречаются ситуации, когда опухоль демонстрирует характеристики нозологическими формами, а промежуточные так же между композитные, двумя синхронные и метахронные образования [Carbone A., 2010; Jaffe E.S., 1992, 2004; TraverseGlehen A., 2005]. В 2005 году впервые подобные образования были выделены в самостоятельную провизорную нозологическую единицу – медиастинальную лимфому серой зоны. В 2008 году, как самостоятельная нозологическая форма, под рубрикой: В-клеточная лимфома, неклассифицируемая, с чертами промежуточными между диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой и классической лимфомой Ходжкина, эта лимфома была включена в классификацию ВОЗ [Swerdlow S.H., 2008]. Где на тот момент были даны исключительно гистологические и иммуногистохимические параметры этой опухоли, данные о генетических и эпигенетических особенностях отсутствовали. В настоящее время идет процесс накопления знаний. Выявлены отличия в эпидемиологии, клиническом течении и некоторые молекулярно-генетические особенности (преимущественно на уровне эпигенетических изменений) [Hutchinson C.B.et al., 2011; Jiro Minami et al., 2010]. Выше описанные данные диктуют необходимость поиска дифференциально-диагностических алгоритмов для четкого разграничения нозологических форм в пределах группы Вклеточных лимфом средостения из крупных клеток, куда так же следует включить и МЛСЗ. 5 Цель исследования: улучшение качества диагностики В-клеточных лимфом средостения из крупных клеток. Задачи исследования: 1. Изучить медиастинальной клинико-морфологические крупноклеточной особенности В-клеточной лимфомы первичной (ПМВЛ), лимфомы Ходжкина (ЛХ), диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (ДВКЛ) с первичным или преимущественным поражением средостения и медиастинальной лимфомы серой зоны (МЛСЗ). 2. Изучить медиастинальной иммуногистохимические крупноклеточной характеристики В-клеточной лимфомы, первичной лимфомы Ходжкина, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы с первичным или преимущественным поражением средостения и медиастинальной лимфомы серой зоны. 3. Определить дифференциально-диагностическое значение ряда иммуногистохимических маркеров. 4. Оценить эффективность интенсифицированного режима индукционной химиотерапии у больных первичной медиастинальной крупноклеточной Вклеточной лимфомой. 5. Определить оптимальные подходы к дифференциальной диагностике нозологических единиц в пределах группы В-клеточных лимфом средостения из крупных клеток и разработать дифференциально-диагностический алгоритм. Научная новизна работы 1. Определена ранее не исследованная дифференциально-диагностическая значимость ряда иммуногистохимических и молекулярно-генетических маркеров при В-клеточных лимфомах средостения из крупных клеток: 6 классической лимфоме Ходжкина, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфоме с первичным или преимущественным поражением средостения, первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфоме и новой нозологической форме - медиастинальной лимфоме серой зоны. 2. Впервые выделены 5 морфо-фенотипических вариантов медиастинальной лимфомы серой зоны МЛСЗ: - Ходжкино-подобный вариант – 1/11 случаев (кольцевидный фиброз, выраженный клеточный полиморфизм, крупные клетки, напоминающие клетки Ходжкина и Рид-Штернберга, смешанноклеточный фоновый инфильтрат; интенсивная экспрессия CD20 и других В-линейных антигенов); - ПМВЛ-подобный вариант – 1/11 случаев (относительно монотонный клеточный состав, диффузный альвеолярный фиброз стромы, скудный фоновый инфильтрат; интенсивная диффузная экспрессия CD30 и/или отсутствие экспрессии LCA и/или CD20); - смешанный вариант – 4/11 случаев (смесь клеток напоминающих ПМВЛ и ЛХ, неравномерно выраженный фиброз, отсутствие зональности; транзиторный иммунофенотип); - двухкомпонентный (композитный) вариант – 3/11 случаев (четкая зональность: участки Ходжкино-подобного и ПМВЛ-подобного строения с сохранением иммунофенотипа или его изменением); - метахронный вариант – 2/11 случаев (при прогрессировании или рецидиве медиастинальной лимфомы происходит изменение морфологических и иммуногистохимических черт). 3. Впервые на основании полученных морфологических, иммуногистохимических и молекулярно-генетических данных разработан дифференциально-диагностический алгоритм для В-клеточных лимфом средостения из крупных клеток, в том числе новой нозологической формы медиастинальной лимфомы серой зоны. 7 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. В-клеточные лимфомы средостения из крупных клеток: клиникоморфологические особенности. В группу В-клеточных крупноклеточных лимфом с первичным или преимущественным классическую поражением лимфому средостения Ходжкина, можно первичную объединить медиастинальную крупноклеточную В-клеточную лимфому, диффузную крупноклеточную Вклеточную лимфому и медиастинальную лимфому серой зоны. Эти опухоли имеют общие звенья патогенеза, в связи с чем, в части случаев представляют существенные сложности для дифференциальной диагностики, при этом подходы к терапии членов этой группы существенно разнятся. 1.1 Лимфома Ходжкина. Лимфома Ходжкина была впервые описана в первой половине XIX века Томасом Ходжкиным (Thomas Hodgkin) и Самюэлем Вилксом (Samuel Wilks), в честь первого в последующем и была названа болезнью Ходжкина. Позднее, когда было установлено, что клетки Рид-Штернберга – лимфоидные клетки, термин лимфома Ходжкина стал более предпочтительным. Только в течение последних 20 лет путем исследования клеток Ходжкина, полученных методом микродиссекции в них была выявлена клональная перестройка гена иммуноглобулинов, что доказало их опухолевую природу и В-клеточное происхождение [Foss H.D., 1999]. На сегодняшний день в рамках лимфомы Ходжкина выделяют две клинико-патологических подгруппы: нодулярный тип лимфоидного преобладания и классическую лимфому Ходжкина . В пределах классической лимфомы Ходжкина выделяют четыре варианта или подтипа: нодулярный склероз, смешанно-клеточный вариант, вариант с большим количеством лимфоцитов и вариант с лимфоидным истощением. Эти подтипы 8 представляют собой одну «болезнь», имеют единый иммунофенотип, но демонстрируют различные морфологические черты (характеристики реактивного инфильтрата, выраженность фиброза и некоторые особенности морфологии диагностических клеток), отличаются своеобразием клинической картины и частотой выявления Эпштейн-Барр вирусной инфекции (EBV) [King R.L., 2014]. Классическая лимфома Ходжкина в классификации ВОЗ определена как моноклональная лимфоидная опухоль (в подавляющем большинстве случаев В-клеточного генеза), состоящая из одноядерных клеток Ходжкина и многоядерных клеток Березовского-Рид-Штернберга (HRS), расположенных на фоне инфильтрата содержащего различное количество неопухолевых малых лимфоцитов, эозинофилов, нейтрофилов, гистиоцитов, плазматических клеток, фибробластов и коллагеновых волокон [Jaffe E.S., 2001; Swerdlow S.H., 2008]. Классическая лимфома Ходжкина составляет 15-30% среди всех лимфом и 70-95% среди лимфом Ходжкина. В развитых странах выявляется бимодальное распределение частоты встречаемости с первым пиком в 15-35 лет и вторым пиком после 55 лет, и несколько более часто выявляется у мужчин (1,5:1). Наиболее часто поражаются лимфоузлы шеи (до 75% случаев), медиастинальные, подмышечные и парааортальные. Поражение селезенки определяется в 10-20% случаев, костного мозга – в 3-5%, поражение других экстранодальных локализаций встречается редко. Всимптомы имеют место у 30-40% пациентов [Cartwright R.A., 2004]. Вариант с нодулярным склерозом (NScHL) составляет 50-80% случаев классической лимфомы Ходжкина. Заболеваемость несколько выше в развитых странах, по сравнению с развивающимися, наибольший риск отмечается среди людей имеющих более высокий социально-экономический статус. Поражение лимфоузлов и структур средостения встречается с частотой до 80%, при этом массивное поражение определяется с частотой до 54%, поражение селезенки и/или легких – около 8-10% случаев, поражение 9 костей в 5%, костного мозга – в 3%, печени – в 2% случаев. Большинство пациентов выявляется на локализованных стадиях болезни (чаще всего II стадия по Ann Arbor) и около 40% имеют В-симптомы. Опухоль имеет нодулярный характер роста, узелки окружены тяжами коллагеновых волокон. Фиброз может быть выражен в разной степени и, как правило, ассоциирован с утолщением капсулы пораженного лимфоузла. Наличие хотя бы одной нодулярной структуры, согласно классификации ВОЗ, позволяет диагностировать данный подтип лимфомы Ходжкина. Количество диагностических клеток (Hodgkin-Reed-Sternberg или HRS) и клеток реактивного инфильтрата может значительно варьировать. HRS клетки имеют более дольчатые ядра, менее заметные ядрышки и большее количество цитоплазмы, чем в других вариантах классической лимфомы Ходжкина, часто представлены лакунарными и мумифицированными формами. Диагностические клетки могут быть рассеяны среди клеток инфильтрата, образовывать группы или скопления разного размера, иногда с наличием некрозов и гистиоцитарной реакции. В зависимости от количества опухолевых клеток по отношению к фоновому окружению, NScHL делится на Grade I и Grade II (составляет 15-20% случаев) [Jaffe E.S., 2011]. Другие варианты классической лимфомы Ходжкина поражают органы средостения крайне редко. Смешанноклеточный вариант (MCcHL) составляет примерно 20-30% случаев классической лимфомы Ходжкина. Это наиболее частый вариант у ВИЧ-инфицированных пациентов и в развивающихся странах. Средний возраст заболевших 38 лет и около 70% из них мужчины. Чаще поражаются периферические лимфоузлы, вовлечение структур средостения не типично, селезенка поражается в 30% случаев, костный мозг в 10%, печень в 3%, другие органы – 1-3%. В-симптомы выявляются редко. Как правило, рисунок строения пораженного лимфоузла стерт, хотя, встречаются случаи с интерфолликулярным ростом. Диагностические клетки типичного вида (крупные одно- или двуядерные клетки с везикулярными 10 ядрами, крупным центрально расположенным эозинофильным ядрышком с просветлением ядерного хроматина вокруг него, хорошо выраженной цитоплазмой), состав микроокружения чаще всего смешанный, со значительной вариацией компонентов, один из которых может значительно преобладать. Фиброз выражен в значительно меньшей степени, чем при нодулярном склерозе, интерстициального характера, капсула узла обычно не утолщена [Jaffe E.S., 2011; King R.L., 2014]. Вариант с большим количеством лимфоцитов (LRcHL) составляет около 5% от всех случаев классической ЛХ, т.е. по частоте встречаемости сходен с нодулярным типом лимфоидного преобладания. Средний возраст так же схож и несколько выше чем в других подтипах классической ЛХ, отмечается преобладание мужчин (около 70%). Чаще всего поражаются периферические лимфоузлы, поражение средостения встречается редко. Клиническое течение сходно с NLPHL, реже встречаются множественные рецидивы. Выделяют два основных типа роста: узелковый и диффузный. Узелки состоят из малых лимфоцитов и могут включать центр размножения фолликула, обычно расположенный эксцентрично, относительно небольшой или с явлениями регрессии. HRS клетки обнаруживаются преимущественно в пределах нодулей, но вне герминального центра. Часть диагностических клеток может напоминать LP клетки или мононуклеарные лакунарные клетки, что может приводить к ошибочной диагностике случая как NLPHL. До 30% случаев ранее диагностированных как NLPHL оказались LRcHL. Эозинофилы и/или нейтрофилы в пределах узелков, как правило, не встречаются, и если и обнаруживаются, то располагаются в интерфолликулярной зоне и количество их очень незначительно. В случаях LRcHL с диффузным ростом среди фоновых малых лимфоцитов может быть рассеяно разное количество гистиоцитов, в том числе и эпителиоидного вида [Tzankov A., 2006; Swerdlow S.H., 2008; Jaffe E.S., 2011]. 11 Вариант классической ЛХ с истощением лимфоидной ткани встречается реже всех остальных – менее 1% (в западных странах), часто ассоциирован с ВИЧ-инфекцией и чаще выявляется в развивающихся странах. 60-75% пациентов – мужчины, средний возраст развития заболевания – 30-37 лет. Отмечается преимущественное поражение забрюшинных лимфоузлов, органов брюшной полости и относительно частое вовлечение в процесс костного мозга. Чаще этот вариант диагностируется на поздних стадиях, выявляются В-симптомы (чаще чем при других вариантах ЛХ). Спектр морфологических изменений очень велик, однако, всегда отмечается количественное преобладание HRS клеток над клетками микроокружения. В одних случаях морфологическая картина может напоминать смешанноклеточный вариант с множеством типичных HRS клеток, в других – могут преобладать полиморфные HRS клетки, и даже саркомоподобные. Довольно характерной особенностью является наличие диффузного фиброза с или без пролиферации фибробластов, и с наличием только очень небольшого числа диагностических клеток [Mani H., 2009; Jaffe E.S., 2011]. Различные варианты классической лимфомы Ходжкина могут значительно варьировать по своим морфологическим характеристикам, но во всех случаях диагностические клетки имеют единый фенотип. Они, практически в 100% экспрессируют CD30, CD15 выявляется в большинстве случаев (75-85%), и обычно негативны к CD45 и маркерам макрофагов. Экспрессия CD30 и CD15 мембранная с очаговым окрашиванием цитоплазмы в зоне аппарата Гольджи (dot-like паттерн). CD15 может выявляться только в части диагностических клеток, и экспрессия может ограничиваться зоной аппарата Гольджи. В 30-40% случаев HRS клетки положительны к CD20, но чаще окрашивание слабое или гетерогенное и присутствует только в части клеток. Положительная реакция с антителами к CD79a выявляется еще реже [Kuppers R., 2006]. В 95% случаев HRS клетки 12 экспрессируют РАХ-5/BSAP – белок В-клеточный специфический активатор [Krenacs L., 1998; Browne P., 2003]. Интенсивность окрашивания в HRS клетках обычно ниже чем в реактивных В-лимфоцитах. IRF4/mum1, специфический транскрипционный фактор плазматических клеток обычно интенсивно окрашивает клетки опухоли. EBV-инфицированные HRS клетки демонстрируют экспрессию LMP1 и EBNA-1, и отсутствие экспрессии EBNA-2, что характеризует II тип латентности EBV-инфекции. В некоторых случаях может быть обнаружена экспрессия (слабая мембранная или глобулярная цитоплазматическая) одного или нескольких Т-клеточных антигенов в отдельных HRS клетках, однако, оценить истинная ли это реакция зачастую бывает крайне сложно, так как диагностические клетки обычно окружены Т-лимфоцитами. ЕМА редко позитивен, а если и выявляется, то реакция слабая. В около 90% случаев HRS клетки не экспрессируют транскрипционный фактор ОСТ-2 и его коактиватор ВОВ.1. Случаи, в которых оба эти маркера позитивны редки. Большинство диагностических клеток позитивны к Ki67 [Kuppers R., 2002, 2006; King R.L., 2014]. HRS клетки демонстрируют клональную перестройку генов тяжелых цепей иммуноглобулинов более чем в 98% случаев, и редко – клональную реарранжировку гена Т-клеточного рецептора [Matin-Subero J.I., 2006]. В патогенезе классической лимфомы Ходжкина значительную роль играет активация NF-kB сигнального пути за счет мутаций в генах NFKBIA, NFKBIE, TNFAIP3, CREL и др. Активация этого сигнального пути приводит к угнетению апоптоза в опухолевых клетках и одновременно повышает их пролиферативную активность. Кроме того в диагностических клетках выявлено подавление активности всех специфических В-клеточных генов, в том числе посредством гиперметилирования (эпигенетический механизм регуляции активности генов) промотерных участков этих генов (например BOB.1 и PU.1). «Молчание» этих транскрипционных факторов-мастеров запускает сложный каскад инактивации генов, вовлеченных в сигнальный 13 путь В-клеточного рецептора (BCR), таких как CD19, CD20, SYK, CD79B. Более того, аберрантная экспрессия генов, вовлеченных в Т- и NK-клеточную дифференцировку (NOTCH1 и ID2), может содружественно с вышеупомянутыми механизмами маскировать В-клеточное происхождение HRS-клеток. Так же есть данные о вовлечении в патогенез MAP/ERK и JAK/STAT сигнальных путей, что повышает выживаемость и пролиферацию клеток в случаях классической лимфомы Ходжкина [Green M.R., 2010]. Так же существует ряд геномных аберраций, модулирующих опухолевое микроокружение, это такие как увеличение копий генов в зоне PD-L1 и PDL2, перестройки в зоне CIITA, что приводит к ускользанию опухолевых клеток от иммунного надзора и повышает их выживаемость [Kuppers R., 2006]. Сходные патогенетические механизмы имеют место вне зависимости от EBV статуса [Leich E., 2007; Mani H., 2009; King R.L., 2014]. Недавние полногеномные исследования HRS-клеток показали, что RS клетки при нодулярном склерозе и варианте с лимфоидным истощением имеют генетический профиль (карту) более напоминающий ПМВЛ; а RSклетки при смешанноклеточном варианте и варианте с большим количеством лимфоцитов – ближе к нодулярному типу лимфоидного преобладания [King R.L., 2014]. Нодулярный тип лимфоидного преобладания лимфомы Ходжкина составляет 3-8% (в среднем около 5%) среди лимфом Ходжкина в западных странах. Поражение средостения встречается в около 7% случаев. Прогноз при ЛХ определяется стадией заболевания по Ann Arbor и наличием или отсутствием факторов риска, к которым относятся: массивное медиастинальное образование; наличие экстранодального поражения; возраст старше 50 лет; повышение СОЭ (>50 мм/ч при отсутствии Всимптомов и >30 мм/ч при их наличии); поражение 3-4 зон лимфоузлов (по рекомендациям разных групп) и более [Engert A., 2010; King R.L., 2014]. Стандартом лечения локальных стадий лимфомы Ходжкина является 2-3 цикла химиотерапии по схеме ABVD (адриамицин/ блеомицин/ 14 винбластин/ дакарбазин) в сочетании с лучевой терапией на пораженные зоны в суммарной очаговой дозе 30 Гр. У пациентов с промежуточным риском и распространением процесса используют 4 курса ABVD с лучевой терапией на группы пораженных лимфоузлов. Соматически сохранным пациентам показана ранняя интенсификация лечения с использованием 2 курсов BEACOPP escalated (блеомицин/ этопозид/ адриамицин/ винкристин/ прокарбазин/ преднизолон в эскалированных дозах), затем 2 курсов ABVD и консалидирующая лучевая терапия на зоны поражения в дозе 30 Гр. Обсуждается вопрос о возможности отмены лучевой терапии у части пациентов, в связи с неблагоприятными отдаленными последствиями такого лечения [Engert A., 2010]. У пациентов с распространенными стадиями так же используется химиотерапия по схеме ABVD 4-8 курсов (терапия выбора для пациентов старше 60 лет) либо, как альтернативу, применяют 8 циклов BEACOPP escalated с последующим облучением резидуальных опухолевых масс. Широко обсуждается возможность использования промежуточного ПЭТ-КТ для выявления группы пациентов, не требующих продолжения химиотерапии, либо требующих интенсификации лечения [Grant C., 2011]. 1.2 Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома. Наиболее частый вариант неходжкинских лимфом – диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома (ДВКЛ), она составляет 25-30% из них в западных странах и до 40% в странах Азии. Чаще всего возникает на 7м десятке (средний возраст 64 года) с небольшим преобладанием мужчин (1,2:1). Клинически заболевание проявляется быстро увеличивающимися опухолевыми массами, которые могут быть локализованы в лимфоузлах или экстранодально (первично до 30-40%, вторично – до 71%). Из экстранодальных локализаций чаще всего встречается поражение желудочнокишечного тракта, но практически любой орган может быть поражен, в том числе и органы средостения. Около 50% пациентов выявляются на I-II стадии, и около 1/3 имеют В-симптомы. Поражение костного мозга 15 диагностируется в 11-27% (в среднем 16%) случаев [Swerdlow S.H., 2008, Jaffe E.S., 2011]. Гистоархитектоника пораженных лимфоузлов или тканей частично или полностью стирается за счет диффузной инфильтрации опухолевыми клетками. Часто присутствуют коагуляционный некроз и распространение на соседние структуры. Реже встречается интерфолликулярный или синусоидальный тип поражения лимфоузлов. Изредка опухолевые клетки формируют симпласты и узлы, симулирующие карциному. Может встречаться картина по типу «звездного неба», склероз. ДВКЛ представлена крупными и средними лимфоидными клетками с морфологическими чертами центробластов, иммунобластов и клеток с промежуточными характеристиками. У центробластов округлые или овальные везикулярные ядра, могут быть дольчатыми или угловатыми, с множественными мелкими, чаще базофильными, ядрышками, расположенными у ядерной мембраны; цитоплазма скудная, амфофильная или базофильная. Иммунобласты – клетки с округло-овальными везикулярными ядрами, единичным крупным, центрально расположенным ядрышком, относительно широким ободком базофильной цитоплазмы; могут демонстрировать плазмацитоидные черты. Однако, ДВКЛ может демонстрировать выраженный клеточный полиморфизм как от случая к случаю, так и в пределах одной опухоли. Встречается и анапластический вариант, который состоит из крупных клеток с уродливыми полиморфными ядрами, часто с наличием многоядерных форм и обширной цитоплазмой, может напоминать карциному [Xia Y., 2015]. Количество реактивных клеток фонового инфильтрата может значительно варьировать, преобладают малые лимфоциты (преимущественно Т-клетки), встречаются плазматические клетки, гистиоциты, и полиморфноядерные лейкоциты. Клетки опухоли экспрессируют CD45 и различные пан-В-клеточные маркеры, включая CD20, CD22, CD79a, PAX-5. Чаще всего выявляется 16 монотипическая поверхностная или цитоплазматическая экспрессия иммуноглобулинов (IgM>IgG>IgA). Пан-Т-клеточные маркеры обычно отрицательны, в очень редких случаях может выявляться экспрессия CD3. CD10 позитивен в 20-40% случаев (до 60%); bcl 6 – в около 60% (по разным данным - до 90%); bcl 2 – в около половине случаев. Небольшая часть ДВКЛ экспрессирует активационный маркер CD30, как правило, окрашивание гетерогенное и позитивна только часть опухолевых клеток. CD5 выявляется в около 10% случаев. В некоторых случаях обнаруживается позитивная реакция с маркерами ассоциированными с постгерминальными стадиями развития В-лимфоцитов и плазмоклеточными маркерами, такими как CD38, VS38 и IRF4/MUM1, экспрессия CD138 при этом выявляется крайне редко (чаще при плазмобластой лимфоме). Ki67 позитивен в более 20% клеток, обычно – около 40%, но в некоторых случаях может приближаться к 100% [Swerdlow S.H., 2008; Jaffe E.S., 2011]. На основании изучения профиля экспрессии генов выделены две группы ДВКЛ в соответствии с наличием признаков разных стадий Вклеточной дифференцировки. Одна группа демонстрирует экспрессию генов характеризующих В-клетки герминального центра – GCB-ДВКЛ, другая – генов в норме индуцируемых в течение in vitro активации В-лимфоцитов периферической крови – ДВКЛ из клеток по типу активированных В-клеток (ABC-ДВКЛ). Иммуногистохимически (Hans algorithm) выделяют GCBподтип (CD10 позитивен в 30% клеток и более или bcl 6 позитивен при отсутствии экспрессии CD10 и MUM1), и non-GCB подтип (CD10 негативен, экспрессия bcl 6 может варьировать, а MUM1 позитивен более чем в 30% клеток). Корреляция между группами выделяемыми различными способами не полная [Rosenwald A., 2003; Choi W.W., 2009; Puvvada S., 2013]. В ДВКЛ имеется клональная перестройка генов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов и генов Т-клеточного рецептора герминативной линии. В около 40% случаев выявляется гиперэкспрессия белка bcl2 (62% 17 ABC-ДВКЛ и 30% - GCB-ДВКЛ). При этом в около 15% случаев ДВКЛ выявляется t(14;18) (из них около 35% - GCB-ДВКЛ) и в около 20% выявляется амплификация гена bcl2 (большинство в ABC-подтипе). В около 30% выявляются перестройки в гене bcl6 (в 73% - соматическая мутация в этом гене). Реарранжировка в гене MYC описывается более чем в 10% случаев ДВКЛ, в 7% выявляется амплификация этого гена (22% GCBподтипа). Перестройки в зоне гена myc имеют прогностическое значение для ДВКЛ, но только в контексте конкурентной экспрессии белка bcl2. Мутации в гене ТР53 возникают в около 22% случаев, а его экспрессия обнаруживается в около 40% [Leich E., 2007; Tirado C.A., 2012]. Прогноз определяется стадией заболевания по Ann Arbor и значением международного прогностического индекса (IPI) и его возраст- адоптированного варианта (aaIPI). Стандартом терапии для всех стадий CD20-позитивной диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы на сегодняшний день считаются 6-8 курсов химиотерапии по схеме CHOP-21 в сочетании с ритуксимабом. Для молодых пациентов групп промежуточного и высокого риска используют различные схемы интенсификации терапии, а так же высокодозную терапию с последующей трансплантацией аутологичных стволовых клеток. Но подобные подходы не являются стандартом [Sehn L.H., 2005; Tilly H., 2010; Поддубная И.В., 2013]. 1.3 Первичная медиастинальная крупноклеточная В-клеточная лимфома. Первичная медиастинальная (тимическая) В-клеточная крупноклеточная лимфома (ПМВЛ) является самостоятельной клиникопатологической единицей и составляет 2-4% неходжкинских лимфом. Впервые эта опухоль была описана в 1980 году Lichtenstein A.K. с соавт. как подтип диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы. Впоследствии была включена в классификацию REAL [Harris N.L., 1994], а затем и в классификацию опухолей лимфоидной ткани ВОЗ [Jaffe E.S., 2001]. Опухоль 18 отличается клинико-морфологическим своеобразием. К характерным и иммунофенотипическим клинико-эпидемиологическим чертам относятся: - развитие заболевания преимущественно у молодых пациентов, пик приходится на 3-4е десятилетие жизни, средний возраст 35-37 лет (при ДКВЛ – 64 года); - чаще встречается у женщин, соотношение М:Ж=1:2 (в противоположность незначительному преобладанию мужчин 1,2:1 при ДКВЛ); - как правило, опухоль манифестирует клиническими симптомами, отражающими присутствие объемного образования в средостении – кашель, диспноэ (одышка), дисфагия, клиника сдавления верхней полой вены (синдром верхней полой вены). - опухоль чаще более массивная (более 10 см), чем в случае поражения средостения при диффузной В-крупноклеточной лимфоме (52% против 30%). У большинства пациентов (66%) заболевание диагностируется на I-II стадии (у 50% при ДКВЛ). Вовлечение костного мозга встречается очень редко (3% против 16% при ДКВЛ). Системные проявления в виде лихорадки и потери веса встречаются у менее 20% больных. Высока частота тромбоза глубоких вен шеи и, следовательно, риск тромбоэмболии ветвей легочной артерии, что связано с механическим сдавлением сосудов этого региона и паранеопластической гиперкоагуляцией [Франк Г.А. с соавт., 2004; Lekovic D., 2010]. Опухоль склонна к местному распространению с поражением легких, плевры, перикарда, мышцы сердца и грудной стенки, имеет тенденцию к отдаленному распространению (особенно при рецидиве) в необычные локализации, такие как: яичники, почки, надпочечники, кишечник. [AbouElella A.A., 1999; Chan J.K.C., 2000; Travis W.D., 2004; Savage K.J., 2006; Мазурок Л.А., 2006, 2007; Martelli M., 2008]. 19 ПМВЛ демонстрирует широкий спектр морфологических/цитологических характеристик от случая к случаю. Опухолевые клетки крупные и среднего размера, ядра их округлые или дольчатые, цитоплазма широкая амфофильная или светлая. Ядра в большинстве относительно мономорфные округлые или овоидные, зачастую встречаются рассеянные клетки с полиморфными или уродливыми ядрами, которые могут напоминать клетки Ходжкина-Рид-Штернберга. Хроматин ядер обычно нежно-гранулярный с одним или несколькими заметными небольшими ядрышками, ядра могут быть пузырьковидными [Addis B.J., 1986; Menestrina F., 1986; van Besien K., 2001; Джумабаева Б.Т. с соавт., 2003; Martelli M., 2008]. Есть параметры несколько чаще обнаруживаемые в ПМВЛ, но они не специфичны и не позволяют верифицировать диагноз. Светлые клетки (обнаруживаются в 40% случаев, в то время как в ДКВЛ они редки). Светлые клетки могут напоминать по морфологии моноцитоидные Вклетки [Chan J.K.C., 2000]. Часто присутствует интерстициальный склероз, в виде широких гиалиновых тяжей или деликатных (тонких) бесклеточных фиброзных лент, которые разделяют опухолевые клетки, в результате формируются узлы и «компартменты» (альвеолярный фиброз) [Steidl C., 2011]. Часто присутствуют резидуальные островки тимического эпителия, которые могут демонстрировать заметную реактивную пролиферацию, или подвергаться кистозным изменениям с формированием множественных кист расположенных в толще опухоли, либо тельца Гассаля [Savage K.J., 2006; Кременецкая А.М. с соавт., 2007]. Клетки опухоли характеризуются экспрессией В-линейных антигенов CD19, CD20, CD22 и CD79a, но при этом, как правило, отсутствует экспрессия поверхностного иммуноглобулина. Несоответствие между отсутствием экспрессии Ig и присутствием CD79a (Ig-ассциированный антиген) характерно для этого заболевания [Pileri S.A., 2003]. Мембранная экспрессия CD30 присутствует более чем в 80% случаев, однако, обычно она слабая и гетерогенная (ограничена субпопуляцией, как правило, более 20 крупных, опухолевых клеток), что отличает ПМВЛ от классической лимфомы Ходжкина [Steidl C., 2011]. Факторы танскрипции PAX5, BOB.1, Oct-2 и PU.1 всегда экспрессируются, в отличие от лимфогранулематоза [Johnson P.W.L., 2008]. Изредка присутствует CD15 [Swerdlow S.H., 2008], однако, в большинстве работ указывается на его отсутствие. Опухолевые клетки часто позитивны к IRF4/MUM1 (до 75%) и CD23 (29-70%), вариабельна экспрессия bcl 2 (55-80%) и bcl 6 (45-100%), реже, определяется CD10 (8-32%, в части работ постулируется полное отсутствие экспрессии). Для опухолевых клеток характерна экспрессия MAL-антигена (другие Тлинейные антигены отсутствуют), CD54 и CD95, обнаружена коэкспрессия TRAF1 и ядерного белка REL [Copie-Bergman C., 1999, 2002]. Имеют место различные дефекты в экспрессии молекул HLA I и/или II классов в большинстве случаев [Roberts R.A., 2006]. На или в клетках опухоли часто обнаруживаются молекулы CD38 (до 56%), PC-1, и PAX5, при отсутствии CD138 – что свидетельствует о пост-герминальной стадии созревания опухолевых клеток [Pileri S.A., 2003]. Кроме того описано отсутствие экспрессии CD21 и отсутствие или слабая экспрессия HLA-DR (около 20% случаев). Если CD30, CD15 и PAX-5 зачастую включаются в состав панели антител, используемых для верификации диагноза ПМВЛ, то данные о диагностической значимости CD23 неоднозначны. Кроме того, нет данных об эффективности использования экспрессии белка MAL и REL/р65, а так же таких транскрипционных факторов В-клеток как BOB.1 и ОСТ-2 для дифференциальной диагностики лимфом в практике. Существует два возможных механизма развития ПМБЛ: из собственных В-клеток тимуса (астероидных клеток мозговой зоны) и из Влимфоцитов прошедших через зародышевый центр и затем мигрировавших в тимус. Тимические В-клетки и клетки ПМВЛ демонстрируют соматическую гипермутацию в обоих зонах: в зоне гена тяжелых цепей иммуноглобулинов и в 5’некодирующем регионе гена BCL6, согласующуюся с переходом через зародышевый центр в процессе развития В-клеток. Вероятнее, гипермутация 21 возникает в пределах самого тимуса, вне классического зародышевого центра. Известно, что при этом экспрессия поверхностных иммуноглобулинов теряется несмотря на наличие изотип-включающих Ig генов [Savage K.J., 2006; Johnson P.W.M., 2008]. Миссенс мутации в гене TP53 обнаружены менее чем в 20% случаев. Реорагнизация в гене с-мус и точковые мутации в не-кодирующем регионе этого гена возникают со сходной частотой, инактивация CDKN2A обнаружена при гомологичной делеции, мутации и повреждении гена при метилировании в 15% случаев. Транслокации в гене BCL-2 не были обнаружены (в ДКВЛ их частота достигает 20-30%), отсутствуют мутации в гене RAS. Транслокации вовлекающие ген ингибирующий транскрипцию BCL-6 возникают в более 33% случаев ПМВЛ (около 50% в ДКВЛ). Однако, они приводят к незначительным эффектам в отношении экспрессии м-РНК и к неясному угнетению таргетных генов в случаях транслокации в зоне этих генов [Savage K.J., 2003; Steidl C., 2011]. Мембранно-связанный белок MAL, ассоциированный с поздними стадиями интратимической дифференцировки Т-клеток, экспрессируется в 70% случаев ПМВЛ и только в 3% не-медиастинальных ДВКЛ. Замечено, что некоторые случаи классической лимфомы Ходжкина (от 10 до 20%) могут так же демонстрировать экспрессию белка MAL. Среди нормальных Вклеток MAL-экспрессия резко ограничена пределами субпопуляции В-клеток мозгового слоя тимуса, из которых вероятнее и происходит ПМВЛ. Нет мутации в гене MAL, которая была бы идентифицирована, и механизм гиперэкспрессии белка MAL в ПМВЛ неясен [Copie-Bergman C., 2002; Johnson P.W.M., 2008]. Следующий молекулярный маркер, отличающий ПМВЛ - это индуцируемый интерлейкином-4 ген FIG1. Транскрипт этого гена кодирует сигнальный пептид, экспрессирующийся в малых количествах в нормальной лимфоидной ткани. В ПМВЛ – экспрессия его высока, в не-медиастинальных ДВКЛ он хоть и присутствует, но обычно в малых количествах. Наличие 22 высокой FIG1 экспрессии - ключевой момент, определяющий значимую активацию цитокинового сигнального пути в патогенезе медиастинальной Вкрупноклеточной лимфомы [Copie-Bergman C., 2003]. Частое умножение в зоне 2p14-16 имеет значение в патогенезе ПМВЛ, так как оно вовлекает REL протоонкоген, кодирующий белок из семейства NF-κB. При FISH анализе подобная геномная перестройка была идентифицирована в 75% случаев лимфом данной локализации. Таким образом становиться ясно, что активация NF-κB пути имеет важное значение в патогенезе ПМВЛ [Feuerhake F., 2005]. Кроме того выявляется гиперэкспрессия генов смейства TNF (по сравнению с ДВКЛ), TNF-рецептор ассоциированных факторов, других членов NF-kB-комплекса. В 36% ПМВЛ выявляются деструктивные или биаллельные мутации в гене TNFAIP3, кодирующем белок А20. А20 – белок, действующий как убиквитинмодифицирующий фермент, который подавляет активность сигнального пути NF-kB, взаимодействуя с RIP1, TRAF1 и TRAF2, что приводит к негативной регуляции IkB киназного комплекса. Соматические мутации в гене TNFAIP3 и/или делеции 6q описаны и в ABC-подтипе ДВКЛ. Выживание клеточной линии ПМВЛ критически зависит от белков семейства NF-κB, определенный генный профиль белков этого семейства при ПМВЛ, непосредственно направляет активацию генов клеточного выживания и ингибиторов апоптоза [Steidl C., 2011]. BCL11А ген, кодирующий ингибитор транскрипции белков семейства «цинковых пальцев» - критичен для развития лимфоидной ткани, он так же вовлечен в амплификацию 2р участка при ПМВЛ и отборе в процессе онкогенного дрейфа. При ПМВЛ количество копий BCL11A увеличено в 75% случаев, хотя это увеличение коррелирует с изменениями в количестве транскрипта и уровней белков в меньшинстве случаев [Weniger M.A., 2006]. Частое умножение участка 9р, определяемое путем сравнительной геномной гибридизации при ПМВЛ, обычно связано с регионом, имеющим высокий уровень амплификации, и локализующимся в дистальной части 9р23 23 и 9р24 [Bentz M., 2001]. При использовании FISH метода умножение в этой локализации определяется в 75% ПМВЛ. При классической лимфоме Ходжкина также определяется умножение в зоне 9р, идентичное подобному региону при ПМВЛ. В этом регионе располагаются гены JAK2, JMJD2C, PDL1, PDL2, они являются частью ампликона 9р24.1. Гиперэкспрессия JAK2 повышает пролиферацию опухолевых клеток за счет активации сигнального пути JAK/STAT [Guiter C., 2004]. JAK2 транскрипционно усиливает экспрессию PD-1 лиганда, который подавляет активацию Т-клеток в опухолевом микроокружении. Амплификация JAK2 совместно с JMJD2C приводит к эпигенетическими повреждениям в ПМВЛ посредством модификации гистона Н3, что активирует пролиферацию и увеличивает выживание опухолевых клеток. Активирующие мутации в гене JAK2 в значительной степени определяют активность этого пути патогенеза, однако, они не были выявлены в ПМВЛ или в лимфоме Ходжкина, более того, последние соглашения относительно геномных исследований предполагают, что JAK2 не является геном мишенью в 9р ампликоне, а является ложным внешним регионом амплификации при ПМВЛ [Melzner I., 2005; Green M.R., 2010]. Киназная активность JAK белка отрицательно регулируется Srcгомологом 2 домена, содержащим супрессор цитокиновых сигнальных (SOCS) белков. Биаллельная делеция SOCS-1обнаружена в клеточной линии при ПМВЛ с эктопической экспрессией дикого типа SOCS-1, приводящей к редукции фосфорилирования JAK2 и задержке роста. Мутации в SOCS-1 выявлены в 9 из 20 исследованных первичных тканевых случаев ПМВЛ, хотя замечено, что наличие мутации в SOCS-1 не было связано исключительно с умножением участка 9р. В последующем, был обнаружен дополнительный механизм инактивации SOCS-1 посредством большей биаллельной делеции. Сайты делеции так же могут включать другие потенциальные гены онкосупрессоры, PIG7/LITAF, которые играют роль в регуляции апоптоза. SOCS1 делеция была обнаружена и при лимфоме Ходжкина [Kimm L.R., 2007]. 24 В 38% ПМВЛ выявляется транслокация/несбалансированная реарранжировка CIITA, в которую включены гены: SOCS1, CIITA, партнеры CIITA по слиянию (PDL1 и PDL2). Сниженная функциональная активность CIITA, гиперэкспрессия супрессорных генов парнеров может слияния, быть и удаление следствием опухольединичного несбалансированного транслокационного события. Подобное событие может привести к активации пролиферации за счет активации JAK/STAT сигнального пути в опухолевых клетках путем делеции SOCS1, содружественно с ускользанием от иммунного надзора в следствие гиперэкспрессии PDL1 и понижения активности HLA II класса [Steidl C., 2011; Mottok A., 2015]. Так же для ПМВЛ характерны эпигенетические нарушения в виде гиперметилирования зоны генов EPHA7 и DAPK1, в то время как для лимфомы Ходжкина свойственно гиперметилирование в зоне гена MMP9. Эти данные согласуются с результатами некоторых исследований, свидетельствующих о связи молчания генов ЕРНА7 и DAPK1 с Вклеточными лимфомами. Гиперметилирование в зоне гена ММР9 при лимфоме Ходжкина, может отражать склеротическую морфологию данной опухоли, связанную с низкой экспрессией матричных металлопротеиназ [Eberle F.C., 2011]. В случаях ПМВЛ выявляются изолированные и комплексные мутации в генах, отвечающих за регуляцию свертывающей и противосвертывающей систем крови. Так обнаружена изолированная гетерозиготная мутация в гене метилентетрагидрофолат редуктазы (МТГФР), мутации в гене протромбина (G20210А) и V фактора (мутация Лейдена) [Франк Г.А., 2004; Leickovic D., 2010]. Факторы прогноза, используемые при других вариантах лимфом, имеют ограниченное значение при ПМВЛ, в том числе IPI. Что, повидимому, определяется молодым возрастом данной категории больных и ограниченным поражением средостения в подавляющем большинстве 25 случаев. В использовать некоторых в ретроспективных качестве исследованиях прогностических предлагается параметров уровень лактатдегидрогены крови, пол (мужской пол ассоциирован с менее благоприятным прогнозом), общий статус (по шкале ECOG), стадию заболевания (по Ann Arbor) [Rosenwald A., 2003; Zhu Y.J., 2011; Dunleavy K., 2015]. ПМВЛ относительно редкое заболевание и не так давно выделенное в самостоятельную нозологическую единицу, в связи с чем имеется очень небольшое число проспективных данных в отношении лечения и нет рандомизированных исследований [Bieri S., 1999; Dunleavy K., 2015]. Существует множество противоречий в отношении оптимальных подходов к терапии. Результаты лечения пациентов при прогрессировании или рецидиве очень плохие, что определяет необходимость подбора максимально эффективной индукционной терапии [Тюрина Н.Г., 2014]. Ретроспективные исследования демонстрируют преимущества интенсивных режимов химиотерапии (MACOP-B, VACOP-B, ProMACE-CytaBOM) по сравнению с CHOP, даже в сочетании с ритуксимабом [Джумабаева Б.Т. с соавт., 2001 и 2005; Кременецкая А.М., 2001; Франк Г.А., 2003; Тумян Г.С., 2008; Zinzani P.L., 2001; Savage K.J., 2006; Rieger M., 2011; Schneider T., 2011; Tai W.M., 2011]. Хотя первичный ответ на терапию в разных группах был сходным в разных группах, но время до прогрессирования (PFS) и общая выживаемость (OS) были выше среди пациентов, получивших терапию третьего поколения. По данным Zinzani P.L. et al. (IELSG, 2002) добавление ритуксимаба к терапии приводит к значительному увеличению PFS и OS в случаях ПМВЛ. В связи с этим возникает вопрос, может ли комбинация ритуксимаба с химитерапевтическими режимами второго-третьего поколения позволить избежать использования облучения для консолидации ремиссии? В ряде исследований получены данные о возможности использовании подобного подхода, сейчас он тестируется в мультицентровых исследования. При таком варианте лечения очень важна роль метода, который используется для 26 оценки эффекта индукционной терапии. На сегодняшний день для оценки резидуальной болезни высокое применяется FDG-PET. Этот метод имеет очень негативное предиктивное значение, но низкое позитивное предиктивное значение. Таким образом, при выборе терапии при ПМВЛ должны учитываться риски отдаленных осложнений, связанных с облучением зоны средостения, особенно у молодых женщин. Режим R-CHOP в сочетании с облучением может быть эффективен у пациентов низкого риска, но такое лечение недостаточно для пациентов группы высокого риска и у пациентов с высоким риском первично рефрактерного течения заболевания. Одним рекомендуемых режимов является DA-EPOCH-R без лучевой из терапии [Dunleavy K., 2015]. В конце курса рекомендуется выполнять FDG-PET, но позитивный результат должен быть интерпретирован с осторожностью, чтобы избежать необоснованного назначения лучевой терапии. 1.4 Медиастинальная лимфома серой зоны. В 2005 году впервые была выделена лимфома демонстрирующая морфологические и иммунофенотипические характеристики промежуточные между ПМВЛ и классической ЛХ, так называемая, медиастинальная лимфома серой зоны. В 2008 году, как самостоятельная нозологическая единица «В-клеточная - промежуточными между лимфома, неклассифицируемая, диффузной крупноклеточной с чертами В-клеточной лимфомой и классической лимфомой Ходжкина» - эта лимфома была включена в классификацию гистологических генетических и и ВОЗ на иммуногистохимических эпигенетических основании исключительно параметров, особенностях этого данные о заболевания отсутствовали [Swerdlow S.H., 2008]. Медиастинальная лимфома серой зоны (МЛСЗ) чаще встречается у молодых мужчин, обычно в возрасте 20-40 лет. Однако описаны случаи у 13 летнего подростка и у пожилых взрослых старше 70 лет. Вирус ЭпштейнаБарр определяется не более чем в 20% случаев. Чаще всего болезнь 27 представлена объемными массами в переднем средостении, с или без вовлечения надключичных лимфоузлов. Другие группы периферических лимфоузлов вовлечены значительно реже. Опухоль может распространяться на ткань легкого посредством прямой инвазии, также может метастазировать в печень, селезенку и поражать костный мозг. Нелимфоидные органы редко поражаются в отличие от ПМВЛ. Объемное образование в средостении может быть ассоциировано с синдромом верхней полой вены, или дыхательными нарушениями [Jiro Minami, 2010; Guahua Yu, 2011; Oschlies I., 2011]. Феномен, который может быть связан с лимфомами серой зоны – это возникновение классического варианта лимфогранулематоза и ПМВЛ как сложной (составной, двухкомпонентной) лимфомы, или развитие их последовательно в различные отрезки времени. Хотя любой вариант лимфомы может быть первым, более часто изначально возникает лимфома Ходжкина, которая рецидивирует в виде ПМВЛ, часто в течение первых нескольких лет [Jaffe E.S., 2004; Hutchinson C.B., 2011]. Лимфома типично состоит из сливающихся, растущих в виде гнезд, полиморфных опухолевых клеток, расположенных диффузно в фиброзной строме. Фиброзные тяжи могут быть расположены фокально в части случаев. Клетки большего размера и более полиморфны чем в типичных случаях ПМВЛ, хотя Плеоморфные могут присутствовать центробласто-подобные клетки. клетки, напоминающие лакунарные клетки клетки и Ходжкина, составляют большую часть инфильтрата. Характерным является широкий спектр цитологических характеристик в различных полях опухоли, так в некоторых полях опухолевые клетки могут сильно напоминать классическую лимфому Ходжкина, а в других выглядеть как ДВКЛ. Обычно воспалительный инфильтрат редкий, хотя эозинофилы, лимфоциты и гистиоциты могут присутствовать. Некрозы встречаются часто, но в отличие от лимфогранулематоза, поля некроза лишены нейтрофильного инфильтрата [Carbone A. 2010; Steidl C., 2011]. 28 Клетки опухоли демонстрируют иммунофенотип промежуточный между нодулярным склерозом лимфомы Ходжкина и ПМВЛ. Обычно экспрессируют CD45. В противоположность лимфоме Ходжкина Вклеточная программа часто сохранена, но аберрантно экспрессируется в сочетании с маркерами характерными для лимфогранулематоза, такими как CD30 и CD15. CD20 и CD79a часто положительны и могут стойко выявляться в большинстве опухолевых клеток. CD30, CD15 – позитивны в большинстве случаев. Поверхностный или цитоплазматический иммуноглобулины отсутствуют. Транскрипционные факторы PAX5, OCT-2 и ВОВ.1 обычно экспрессируются. BCL6 вариабельно позитивен, CD10 обычно отрицателен. ALK негативен. Фоновые лимфоциты преимущественно представлены CD3+, CD4+ клетками как при классическом варианте лимфомы Ходжкина. В случаях, морфологически напоминающих нодулярный склероз классической лимфомы Ходжкина мономорфная выраженная экспрессия CD20 и других В-клеточных маркеров, при отсутствии CD15, позволяет установить диагноз лимфомы серой зоны. В случаях напоминающих ПМВЛ, при отсутствии CD20, экспрессии CD15 или наличие EBV, так же может быть установлен такой диагноз. MAL, как маркер ассоциированный с ПМВЛ, экспрессируется в небольшой части случаев МЛСЗ. Ядерный белок REL/p65, имеющий отношение к ПМВЛ, обнаружен в тестированных случаях лимфом серой зоны. Необходимо значимость этих определить маркеров в дифференциально-диагностическую практике. В одной из серий, р53 экспрессировался в большинстве случаев [Swerdlow S.H., 2008; Carbone A., 2010; Grant C., 2011]. В случаях композитных или метахронных лимфом, выявляются различные компоненты демонстрирующие фенотипические характеристики той или иной лимфомы (классической лимфомы Ходжкина или ПМВЛ). 29 Специфических генетических изменений, ассоциированных с трансформацией лимфомы или ее компонентов в ту или иную (классическую лимфому Ходжкина или ПМВЛ) не обнаружено. Так как морфологические и фенотипические изменения обратимы, более вероятны эпигенетические, чем генетические повреждения, которые и ответственны за изменение морфологии и иммунофенотипа [Eberle F.C., 2011]. Близкая взаимосвязь между нодулярным склерозом лимфомы Ходжкина и ПМВЛ продемонстрирована при изучении профилей экспрессии генов. При изучении эпигентического профиля ПМВЛ, MЛСЗ и классической лимфомы Ходжкина, варианта с нодулярным склерозом, было выявлено, что профиль MЛСЗ имеет отличительные черты при общем сходстве профилей всех этих заболеваний [Eberle F.C., 2011; Evens A.M., 2015]. Обнаружение пластичности опухолевых клеток при комбинированных опухолях с двумя различными направлениями морфологической и иммунофенотипической экспрессии, предполагает непосредственное отношение к MЛСЗ, однако, клетки композитных опухолей могут демонстрировать параметры характерные для обоих лимфом, ПМВЛ и классической лимфомы Ходжкина (при использовании методики микродиссекции для исследования отдельных клеток). Метилирование ДНК – лучший адоптированный эпигенетический маркер. Изучение метилирования ДНК помогает лучше определить факторы, влияющие на поведение опухоли, и может быть полезно не только для клинической диагностики, но и для подбора противоопухолевой терапии. Гипометилирование в зоне гена НОАХ5, обнаруживаемое при MЛСЗ, может свидетельствовать об уникальной роли данного гена в туморогенезе данной лимфомы. НОАХ5 ген описан как промотор лейкемической трансформации в сочетании с определенной хромосомной транслокацией [Eberle F.C., 2011]. Так же описано участие генов белков семейства NF-kB в патогенезе MЛСЗ [Steidl C., 2011]. 30 Характер генетических изменений и их частота при МЛСЗ и других Вклеточных лимфомах средостения из крупных клеток суммированы в таблице 1.4.1. Таблица 1.4.1. Частота и характер генетических перестроек при различных вариантах В-клеточных лимфом средостения из крупных клеток. NF-kB активация 50% SOCS1 mut JAK-STAT активация TNFAIP3 mut NFKBIA 33% ДВКЛ gain ПМВЛ cREL/ BCL11А ген МЛСЗ эффект ЛХ Ген. повреждение 75% 0 45% 45% ~0 NF-kB активация 40% 36% ~0 mut NF-kB активация 30% 0 ~0 JAK2 gain JAK-STAT активация 30% 63-75% ~0 JMJD2C gain JAK-STAT активация 63-75% ~0 PD-L1/2 gain Снижение активности 40% PD-1, способствующего иммуносупрессивному действию микроокружения 55% 63-75% CIITA t Модулирование иммуногенности посредством HLA II класса 15% 27% 38% STAT6 mut JAK-STAT активация ~30% Bcl2 t Угнетение апоптоза 55% 36% 0 amp Bcl6 t h/e Myc mut amp TP53 mut h/e 3-4% 20-30% ~40% Транскрипционная репрессия множества таргетных генов Регуляция активности генов 50% 27% 33-50% 30-50% <20% >10% ~7% Угнетение апоптоза <20% Бол-во 22% 40% 31 Gain – увеличение количества копий гена; mut - мутация; t транслокация; h/e – гиперэкспрессия (белка); amp -амплификация. Лимфомы серой зоны в основном имеют более агрессивное клиническое течение и худший прогноз чем любая: классический вариант лимфомы Ходжкина или ПМВЛ. Не достигнут консенсус в отношении оптимального лечения [Dunleavy K., 2012]. Считается, что этот вариант лимфомы не отвечает на терапию, используемую при ПМВЛ и лимфоме Ходжкина, хотя в некоторых работах терапия, использующаяся при агрессивных эффективная. применяемых В-крупноклеточных Другие при предлагают лимфоме лимфомах позиционируется использовать Ходжкина. По режимы данным по как типу проспективных исследований с DA-EPOCH-R результаты хуже чем у пациентов с ПМВЛ с аналогичными клиническими характеристиками (EFS и OS составили 62% и 74% соответственно, против 93% и 97% для ПМВЛ) [Dunleavy K., 2015]. Биологические основы таких различий остаются неясными. Так же остается открытым вопрос о перспективах использования лучевой терапии. Среди пациентов с классическим вариантом лимфомы Ходжкина выраженная экспрессия CD20 рассматривается как признак, позволяющий отнести такую лимфому к переходной, и является индикатором плохого прогноза [Evens A.M., 2015]. Однако, в других исследованиях получено множество противоположных заключений. Классическая лимфома Ходжкина (вариант с нодулярным склерозом), медиастинальная лимфома серой зоны, первичная медистинальная Вклеточная крупноклеточная лимфома и диффузная крупноклеточная Вклеточная лимфома представляют собой группу заболеваний с общими механизмами патогенеза и в части случаев со сходной морфологией и иммунофенотипом. При этом подходы к терапии каждой конкретной нозологической формы в пределах группы значительно разнятся. По последним данным, вероятно, переключение фенотипа происходит на 32 эпигенетическом уровне, за счет гипер- и гипометиллирования определенных участков генов, что открывает новые перспективы в использовании агентов влияющих на метиллирование ДНК. Однако, необходимо оптимизировать использование существующих и искать новые диагностические инструменты для точной дифференциальной диагностики заболеваний в пределах рассматриваемой группы, чтобы дифференцированно подходить к выбору терапии. Таким образом, до сих пор нет единого мнения в отношении оптимального подхода к терапии МЛСЗ, отчасти это обусловлено сложностями прецизионной диагностики, что в свою очередь определяется биологией этих опухолей. Дальнейшее изучение биологии данной опухоли необходимо не только для повышения эффективности ее диагностики, но и для поиска более эффективных методов и подходов к лечению, определения прогностического значения выделенных морфологических вариантов. 33 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 2.1 Характеристика больных. Исследование проводилось на текущем диагностическом и архивном материале патологоанатомического отделения с прозектурой ФГБУ НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова за период 2005-2014гг. и на материале патологоанатомического отделения ФГБУ МНИОИ им. П.А. Герцена за 2005-2013 гг. Материалом для исследования послужили консультативные (готовые гистологические и иммуногистохимические препараты, парафиновые блоки) случаи и биопсийный/операционный материал от 122 пациентов с В-клеточными крупноклеточными лимфомами средостения. Было изучено 67 случаев первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, из них 19 случаев – консультации материала, изготовленного в других лечебных учреждениях, 43 случая – биопсии (пункционные трансторакальные и полученные при медиастиноскопии) и 5 случаев операционного материала (тотальное или субтотальное удаление опухоли). Средний возраст пациентов составил 32 года (от 10 до 65). Среди них было 36 женщин и 31 мужчина (1,2:1). У 34 (23 женщины и 11 мужчин, средний возраст составил 33 года (от 19 до 64 лет)) из них были доступны клинические данные и проведена полихимиотерапия (ПХТ) в условиях отделения высокодозной химиотерапии ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена». Время до установления морфологического диагноза в среднем составило 4 месяца (от 1 до 23,5 мес) для данной группы пациентов. У троих образование средостения было тотально (у двоих) или частично (у одного) удалено до начала химиотерапевтического лечения. Основное лечение проводилось на базе МНИОИ им. П.А. Герцена, 4 пациентам до поступления в МНИОИ было проведено лечение по схеме CHOP или BEACOPP, но не более 1 курса. Количество пациентов страдавших классической лимфомой Ходжкина составило 30 человек, из них 7 случаев внешних консультаций, 12 34 – пункционных трансторакальных и трансбронхиальных биопсий, в 10 случаях материал был получен при медиастиноскопии и в одном выполнено субтотальное удаление опухолевого узла. Средний возраст пациентов составил 33 года (от 15 до 66 лет). Мужчин среди исследованных пациентов было 8, женщин – 22 (1:2,75). Кроме того изучено 11 случаев медиастинальной лимфомы серой зоны, из них 6 случаев консультации гистологического материала полученного в других лечебных учреждениях (из них 3 случая субтотального удаления опухоли, 2 – медистиноскопические биопсии и 1 – эксцизионная биопсия подключичного лимфоузла), в 5 случаях материал был получен при медиастиноскопии. Средний возраст пациентов составил 35 лет (от 25 до 42 лет), мужчин среди них было 7, женщин – 4 (1,75:1). Так же в качестве группы контроля исследовано 14 случаев диффузной крупноклеточной встречающейся В-клеточной неходжкинской преимущественным поражением лимфомы, наиболее лимфомы, с средостения. Из первичным них в 2 часто или случаях исследовался консультативный материал, в 6 случаях материал был получен при медиастиноскопии, и в 5 при трансторакальной или трансбронхиальной биопсии. Средний возраст пациентов составил 46,5 лет (от 27 до 68 лет), в исследованную группу вошли 2 мужчин и 11 женщин. Таким образом в 58% случаев гистологический материал был получен при медиастиноскопии с биопсией, в 31% - при трепан-биопсии и в 11% случаев при субтотальном или тотальном удалении опухоли. Во всех случаях медиастиноскопических биопсий определялись артефакты раздавливания. Характеристика пациентов по полу и возрасту отражена в табл. 2.1.1. и диаграмме 2.1.1. 35 Таблица 2.1.1. Характеристика исследованных больных по полу и возрасту. Диагноз Колво ПМВЛ ХЛ МЛСЗ ДВКЛ 67 30 11 13 средний возраст взрослых детей 33 13 (3) 34 16 (2) 35 46,5 мин макс возраст возраст м ж М:Ж 10 15 25 27 31 8 7 2 36 22 4 11 1:1,2 1:2,75 1,75:1 1:5,5 65 66 42 68 Характеристика групп по возрасту 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ПМВЛ МЛСЗ ХЛ ДВКЛ Рисунок 2.1.1. Характеристика исследованных групп по возрасту. 2.2 Обследование больных. 2.2.1 Гистологическое исследование. При исследовании консультативного материала (во всех случаях были доступны парафиновые блоки) повторно изготавливались микропрепараты: блоки перезаливались в парафин; на санном (Leica SM2000R) или роторном (Thermo Microm HM340E) микротоме делали срезы с парафиновых блоков толщиной 4-5 мкм, которые монтировали на предметные стекла (Menzel), затем окрашивали гематоксилином и эозином и заключали под покровное стекло с использованием автоматического гистостейнера Leica ST5020 и coversliper Leica CV 5030. Биопсийный материал фиксировался в 10% нейтральном забуференном формалине до 24 часов, затем проводился в процессоре 36 карусельного типа Leica TP 1020 в абсолютизированном изопропиловом спирте (в 10 последовательно сменяющихся емкостях, в каждой из которых материал находился в течение 1 часа), затем выдерживался последовательно в двух емкостях с расплавленным парафином при температуре 58-60˚С в течение 1 часа в каждой. Далее материал заливался в парафин с использованием заливочной станции Leica EG1150H, готовые блоки охлаждались на специальном столике Leica EG1150C. Далее на санном или ротоном микротоме изготавливались срезы толщиной 4-5 мкм, которые окрашивались гематоксилином и эозином в автоматическом гистостейнере. Операционный материал до фиксации описывался и измерялся, при необходимости производились продольные насечки для разделения большого узла на пластины толщиной 1-2 см, затем материал фиксировался в течение 10-12 часов в 10% забуференном нейтральном формалине. После предварительной фиксации производилась вырезка материала: забирались фрагменты ткани размерами 1,5х1,5х0,3 см, укладывались в гистологические кассеты, в которых дополнительно фиксировались в 10% забуференном нейтральном формалине в течение 24 часов. Далее материал проводился в процессоре карусельного типа Leica TP 1020 в 9 емкостях с абсолютизированным изопропиловым спиртом по 2,5 часа в каждой и в 3 емкостях с расплавленным парафином при температуре 58-60˚С в течение 2,5 часов в каждой. Далее материал заливался в парафин с использованием заливочной станции Leica EG1150H, блоки охлаждались на специальном столике Leica EG1150C. Далее с готовых парафиновых блоков изготавливались срезы толщиной 4-5 мкм на санном или роторном микротоме, которые окрашивались гематоксилином и эозином при помощи автоматического гистостейнера. Далее изготовленные срезы, окрашенные гематоксилином и эозином, изучались в светлом поле с использованием микроскопа Leica DM 1000 или Olympus BX46. 37 2.2.2 Иммуногистохимическое исследование. Во всех исследованных случаях том было иммуногистохимическое исследование в или Иммуногистохимическое исследование выполнялось выполнено ином по объеме. следующей методике: На санном или роторном микротоме изготавливались срезы толщиной 4-5 мкм, затем срезы высушивались в термостате при 37 °С. Высушенные срезы прогревали в термостате при температуре 60°С в течение 30 минут, затем подвергали депарафинизации в ксилоле (двукратно по 3 минуты) и дегидратации в абсолютизированном этиловом спирте (в четырех спиртах по 3 минуты). Ингибирование активности эндогенной пероксидазы осуществлялось в растворе 3% перекиси водорода в течение 5 минут. Затем срезы промывались в дистиллированной воде. Термическая демаскировка антигенов осуществлялась в PTLink DAKO (в зависимости от антитела (табл. 2.2.2.1.): в EDTA буфере с рН 9,0, в цитратном буфере с рН 6,0 или в буфере High pH с рН 10,0) при температуре 95-99°С в течение 20 минут. Затем срезы остужали при комнатной температуре 20 минут и быстро помещались в дистиллированную воду, затем в промывочный буфер (TBS), далее инкубировались с первичными антителами во влажной среде в течение 30 минут – 1 часа при 20 °С. После этого срезы промывались в промывочном буфере (TBS) трижды по 5 минут и инкубировались со вторичными антителами и стрептавидин-пероксидазным комплексом в составе соответствующей системы детекции в соответствии с инструкцией. Далее срезы промывались в буфере дважды по 5 минут и проявлялись при помощи раствора диаминобензидина (ДАБ) в субстратном буфере в течение 3-5 минут (при необходимости до 10 минут). Проводились по батарее из 4-х спиртов (2 этиловых 95°, 2 изопропиловых) и 2-х ксилолов (экспозиция 3 минуты) и заключались под покровное стекло при помощи аппарата coversliper Leica CV 5030. 38 Таблица 2.2.2.1. Характеристика использованных антител. Антитело/clone Время инкубации Разведение Система детекции Производитель буфер LCA/CD45/2B11+PD7/26 CD20/L26 CD3/F7.2.38 CD10/NCL-L-CD10-270 CD15/Carb CD23/SP23 CD30/Ber-H2 EMA/E29 PCK/NCL-L-CK5/6/8/18 ALK/CD246 PAX-5/bcl24 BOB.1/TG14 OCT-2/oct-207 Mum1/mum1p Ki67/MIB1 MAL/ab15418 p65/ab16502 30’ 1:500 EnVision Dako TRS6.0 30’ 1:200 Real Dako TRS6.0 30’ 1:100 Real Dako TRS6.0 30’ 1:100 Real Leica TRS9.0 30’ 1:150 Real Dako TRS9.0 30’ 1:50 Novolink Thermo TRS9.0 30’ 1:50 Real Dako TRS6.0 30’ 1:100 Real BioGenex TRS9.0 30’ 1:100 Real Leica TRS9.0 30’ 1:50 Real Dako TRS9.0 30’ 1:100 Real LabVision TRS9.0 30’ 1:100 Real Leica TRS9.0 30’ 1:100 Real Leica TRS6.0 30’ 1:100 Real Dako TRS9.0 30’ 1:75 Real Dako TRS9.0 30’ 1:100 Real AbCam TRS9.0 30’ 1:200 Real AbCam TRS9.0 Результаты иммуногистохимического исследования (окрашивания) оценивались в светлом поле с использованием микроскопа Leica DM 1000 или Olympus BX46. Индекс Ki67 оценивался как доля окрашенных клеток (ядер) на 2000 опухолевых клеток, в процентах. Мембранное или мембранно- цитоплазматическое окрашивание более 30% опухолевых клеток считалось положительным для следующих маркеров: LCA, CD20, CD23; окрашивание более 10% опухолевых клеток считалось положительным для маркеров: CD15, CD30, CD10 и MAL (рис. 2.2.2.1-2). Для антител с ядерной экспрессией пороговое значение в 30% было выбрано для PAX-5, ВОВ.1 и ОСТ-2; в 10% для р65 (рис. 2.2.2.3). 39 Рисунок 2.2.2.1. Мембранно-цитоплазматическая экспрессия белка MAL в клетках ПМВЛ. х100. Рисунок 2.2.2.2. Интенсивная цитоплазматическая экспрессия белка MAL группой опухолевых клеток при ПМВЛ. х200. 40 Рисунок 2.2.2.3. Ядерная экспрессия белка REL/p65 в клетках ПМВЛ. х200. Ядерная экспрессия mum1 оценивалась полуколичественно: 0-10% - 0; 10-30% - 1+; 30-70% - 2+ и более 70% - 3+ (рис. 2.2.2.4-5) [de Mello CA, 2011]. Рисунок 2.2.2.4. Экспрессия mum1 в клетках ПМВЛ, 1+. х200. 41 Рисунок 2.2.2.5. Экспрессия mum1 в клетках ПМВЛ, 3+. х200. 2.2.3 FISH-исследование. Во всех случаях МЛСЗ (11), в 10 случаях ПМВЛ и в 3 случаях ЛХ было выполнено FISH (fluorescence in situ hybridization)-исследование с зондом CIITA (Break Apart FISH probe, Empire Genomix, spectrum Green-Red) (рис.2.2.3.1-2). FISH-исследование выполнялось по следующей методике: 1) Стекла со срезами толщиной 4-6 микрон прогревались в термостате при температуре 60ºС в течение 30 минут 2) Срезы деперафинизировались в батарее из 2 смен ксилола, по 5 минут в каждой, затем помещались в этиловый спирт 96% на 2 минуты двукратно, и в этиловый спирт 70% двукратно на 2мин 3) Срезы отмывались с использованием Wash Buffer (K 5799) DAKO – по 2 мин, в двух сменах буфера 4) Для демаскировки искомых структур срезы помещались в водяную баню (98ºС) на Treatment Solution 15 мин, с использованием раствора Pre- (K5799) DAKO. А затем охлаждались при комнатной температуре в течение 15 минут 5) Отмывка от предыдущего раствора в Wash Buffer по 2 минуты в двух сменах буфера 6) Обработка срезов пепсином (К5731) – 10мин 42 7) Отмывка срезов в Wash Buffer по 2 минуты, в 2 сменах буфера 8) Дегидратация срезов в спиртах восходящей концентрации: этиловый спирт 70% - 2 минуты, этиловый спирт 85% - 2 минуты, и этиловый спирт 96% - 2 мин, затем срезы высушивались при комнатной температуре в течение 30 минут 9) На срезы наносился зонд и они запечатывались под покровное стекло 10) Гибридизация осуществлялась в приборе Hybridizer DAKO (режим: денатурация 73ºС - 5 мин и гибридизация 37ºС – 20 часов) 11) Срезы отмывались от излишков зонда с использованием водяной бани (65ºС) и STRINGENT WASH BUFFER (K5799) DAKO в течение 10мин 12) Срезы отмывались от предыдущего раствора в Wash Buffer в течение 2мин, в 2сменах буфера 13) Дегидратация срезов осуществлялась в спиртах восходящей концентрации: этиловый спирт 70% - 2 мин, этиловый спирт 85% -2 мин, этиловый спирт 96% - 2 минуты, затем срезы высушивались при комнатной температуре (в темноте) 14) На срезы наносился Fluorescence mounting medium (K 5799) DAKO 10 мкл, затем они запечатывались под покровное стекло и высушивались Через 2 часа был возможен просмотр приготовленных препаратов. Для просмотра и анализа изображений использовался микроскоп Zeiss Axio Imager с программным обеспечением для FISH анализа Metasystems. 43 Рисунок 2.2.3.1. Схема организации зонда CIITA. Рисунок 2.2.3.2. Результаты FISH-исследования с зондом CIITA при ПМВЛ, выявлена перестройка в зоне исследуемого гена (отдельно расположенные красные и зеленые сигналы). х1000. 2.2.4 Клиническое обследование. Все пациенты, получавшие лечение в отделении высокодозной химиотерапии МНИОИ им. П.А. Герцена до его начала были комплексно обследованы в соответствии с протоколом, применяемым при лимфопролиферативных заболеваниях [Поддубная И.В., 2013]. Клиническое обследование включало в себя сбор анамнеза, физикальный осмотр, пальпацию всех доступных групп периферических лимфоузлов, печени, селезенки, осмотр миндалин и полости рта; определение наличия или отсутствия В-симптомов; определение статуса по ECOG (табл. 2.2.4.1). 44 Таблица 2.2.4.1. Шкала ECOG. 0 Полностью активен, способен переносить нагрузки в том же объеме, что и до начала заболевания. Ограничен в выполнении интенсивных физических нагрузок, но 1 свободно передвигается и может выполнять легкую или сидячую работу – легкую работу по дому, работу в офисе. Свободно передвигается и в состоянии себя обслуживать, но не 2 может выполнять какую-либо работу. Проводит в постели менее ½ светлого времени суток. 3 4 Возможность себя обслуживать ограничена. Проводит в постели большую часть светлого времени суток. Не в состоянии себя обслуживать. При кован к постели или креслу. Лабораторные методы исследования включали развернутый клинический анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови (лактатдегидрогеназа, мочевая кислота, мочевина, креатинин, общий белок, альбумин, биллирубин, АСТ, АЛТ, щелочная фосфатаза, электролиты), коагулограмму, определение группы крови и резус фактора, выявление маркеров вирусных гепатитов В и С, ВИЧ-инфекции. Методы лучевой диагностики включали рентгенографическое исследование органов грудной клетки, компьютерную томографию, ультразвуковое исследование, ПЭТ-КТ. Компьютерная томография грудной и брюшной полостей, малого таза выполнялась на мультиспиральном компьютерном томографе «Aquilion LB» фирмы Toshiba с использованием контрастного препарата «Ультравист». Данный компьютерный томограф имеет три режима спирального сканирования с генерацией от 16 до 32 срезов толщиной от 0,5 до 2 мм, время ротации 0,5 с. Ультразвуковое исследование всех групп периферических лимфоузлов, средостения, малого таза, брюшной полости и забрюшинного 45 пространства выполнялось с использованием аппарата фирмы HITACHI «HI VISION 900» c использованием линейного датчика частотой 13 МГц. При поражении носоглоточного кольца Вальдейера-Пирогова и мягких тканей, выполнялась магнитно-резонансная томография соответствующих областей. Для оценки эффективности терапии и решения вопроса о проведении дополнительного лечения (лучевой терапии или дополнительно химиотерапии, в том числе высокодозных курсов) выполнялась позитронная эмиссионная томография интегрированная с компьютерной томографией с 2-дезокси-2-фтор-18-D-глюкозой (18FDG-PET/KT). Использовалась 5-бальная визуальная шкала Deauville для оценки результатов ПЭТ, которая основана на сравнении интенсивности накопления глюкозы в резидуальных массах с фоновым накоплением в средостении и печени [Cheson B.D., 2014]. 1 балл Нет накопления препарата в резидуальных массах. 2 балла Накопление препарата в резидуальных массах ниже, чем в средостении. 3балла Накопление препарата в резидуальных массах выше, чем в средостении, но ниже чем в правой доле печени. 4 балла Накопление препарата в резидуальных массах умеренно выше, чем в правой доле печени. 5 баллов Накопление препарата в резидуальных массах значительно выше, чем в печени, и/или определяется появление новых очагов гиперфиксации. Всем этим пациентам была выполнена билатеральная терпанобиопсия костного мозга с последующим гистологическим исследованием. Трепанобиопсия выполнялась иглой Jamshidi из задне-верхней ости подвздошной кости справа и слева, забирались столбики ткани длинной 2-3 см. Биоптат незамедлительно помещался в 10% забуференный формалин. 46 Декальцинация выполнялась в ЭДТА или декальцинирующем растворе «Трилон В», далее материал проводился по биопсийной программе, окрашивался гематоксилином и эозином, азуром и эозином, и серебром. Всем пациентам выполнялась электрокардиограмма (ЭКГ), а также эндоскопическое исследование желудка. В ряде случаев, по показаниям, использовались дополнительные методы обследования: у 3 пациентов с гидротораксом выполнены односторонняя или двусторонняя пункция плевральных полостей с последующим цитологическим исследованием полученной жидкости; двоим пациентам с гидроперикардом выполнено УЗИ сердца. Стадия заболевания устанавливалась в соответствии с классификацией Ann Arbor [Armitage JO, 2005; Поддубная И.В., 2013] (табл. 2.2.4.2). Таблица 2.2.4.2. Классификация Ann Arbor. Стадия I Стадия II Стадия III Стадия IV характеристика Поражение одной лимфатической зоны/структуры/группы лимфоузлов (I), или локализованное поражение одного экстралимфатического органа или ткани в пределах одного сегмента (IЕ) Поражение двух или более лимфатических областей по одну сторону диафрагмы (II), или локализованное поражение в пределах одного сегмента одного экстралимфатического органа или ткани и их регионарных лимфатических узлов(а) с или без поражения других лимфатических областей по ту же сторону диафрагмы (IIE) Поражение лимфатических узлов/структур по обе стороны диафрагмы (III), или поражение одного экстралимфатического органа или ткани и их регионарных лимфоузлов, локализованное в пределах одного сегмента, с поражением других лимфатических областей/структур по обе стороны диарагмы Диссеминированное (многофокусное) поражение одного или нескольких экстралимфатических органов, с или без поражения лимфатических узлов или изолированное поражение экстралимфатического органа с поражением отдаленных (не регионарных) лимфатических узлов; поражение печени и/или костного мозга Каждая стадия должна быть разделена на А и В в зависимости от отсутствия (А) или наличия (В) общих симптомов. Среди них: 1. Необъяснимая потеря массы тела более чем на 10% за 6 последних месяцев до обращения к врачу 47 2. Необъяснимые подъемы температуры выше 38°С не менее 3 дней подряд без признаков воспаления 3. Ночные профузные поты Примечание. Наличие одного только зуда недостаточно для установления группы В, как и кратковременные лихорадочные состояния, связанные с неизвестной инфекцией. Кроме того имеются следующие приставки: Е S Х Локализованное экстранодальное поражение (при I-III стадиях) Поражение селезенки (при I-III стадиях) Массивное (bulky) опухолевое поражение средостения – очаг более 10 см или медиастинально-торакальный индекс более 1/3 2.3.1 Лечение. 34 из 67 пациентов с ПМВЛ был проведен курс химиотерапии по схеме MACOP-B, у 24 из них (70,6%) в сочетании с ритуксимабом [Zinzani PL, 2002]. Таблица 2.3.1.1 Схема химиотерапии MACOP-B. неделя препарат Доксорубицин, 50 мг/м2 Циклофосфан, 350мг/м2 Метортексат, 400 мг/м2 Лейковорин Винкристин, 2 мг Блеомицин, 10 мг/м2 Преднизолон, 75мг/день Ритуксимаб, 375 мг/м2 1 2 + + 3 + + + + + + + 4 5 6 7 + + + + + + + + + + 8 9 + + + + 11 12 + + + + + + + + 10 + + + + + + 14 из 34 пациентов после индукционной терапии получили химиотерапию по схеме 2-й линии: DHAP (цисплатин, цитарабин, дексаметазон), ESHAP (этопозид, цисплатин, цитарабин, метилпреднизолон) или mini-BEAM (кармустин, этопозид, цитарабин, алкеран). Таблица 2.3.1.2 Схема химиотерапии DHAP дни препарат Дексаметазон, 40 мг, в/в Цисплатин, 100 мг/м2, в/в кап. в теч. 24 ч Цитарабин, 2 г/м2, в/в кап. х2 раза 1 2 3 4 + + + + + + 48 Таблица 2.3.1.3 Схема полихимиотерапии ESHAP. дни препарат Этопозид, 40 мг/м2, в/в кап. Метилпреднизолон, 500 мг, в/в кап. Цисплатин, 25 мг/м2, в/в непрерывно Цитарабин, 2 г/м2, в/в кап. 1 2 3 4 5 + + + + + + + + + + + + + + Таблица 2.3.1.4 Схема полихимиотерапии mini-BEAM. дни препарат Кармустин, 60 мг/м2, в/в кап. Этопозид, 75 мг/м2, в/в кап. Цитарабин, 100 мг/м2, в/в кап. х2 раза Мелфалан, 30 мг/м2, в/в 1 2 3 4 5 + + + + + + + + 6 + + В качестве терапии спасения и в качестве консолидирующей терапии, 14 пациентам была проведена высокодозная химиотерапия с последующей аутотрансплантацией гемопоэтических стволовых клеток: у троих непосредственно после индукционного курса MACOP-B±R; и у 11 после 2-й линии химиотерапии. Кондиционирование перед трансплантацией производилось с использованием схемы BEAM [Zinzani PL, 2011]. Таблица 2.3.1.5 Схема полихимиотерапии BEAM. дни препарат Ломустин, 100 мг/м2, внутрь Цитарабин, 100 мг/м2, в/в кап. х 2 раза Этопозид, 100 мг/м2, в/в кап. Преднизолон, 40 мг/м2, внутрь 1 2 3 4 5 + + + + + + + + + + + + + + На завершающем этапе химиотерапии, с целью консолидации полученного эффекта, 25 пациентам была проведена дистанционная лучевая терапия на зону первичного поражения, в том числе при наличии резидуальных остаточных масс, в суммарной очаговой дозе 30-36 Гр. Схемы химиотерапии, которые также применялись для терапии лимфомы Ходжкина, ДВКЛ и ПМВЛ: 49 Таблица 2.3.1.6 Схема полихимиотерапии ABVD. дни 1 препарат Доксорубицин, 25 мг/м2, в/в Блеомицин, 10 мг/м2, в/в Винбластин, 6 мг/м2 (суммарно не более 10 мг), в/в Дакарбазин, 375 мг/м2, в/в Лечение возобновляется на 29-й день 15 + + + + + + + + Таблица 2.3.1.7 Схема полихимиотерапии BEACOPP-эскалированный дни препарат Этопозид, 200 мг/м2, в/в Доксорубицин, 35 мг/м2, в/в Циклофосфамид, 1250 мг/м2, в/в Винкристин, 1,4 мг/м2 (суммарно не более 2 мг), в/в Блеомицин, 10 мг/м2, в/в Прокарбазин, 100 мг/м2, внутрь Преднизолон, 40 мг/м2, внутрь Г-КСФ, п/к Лечение возобновляется на 22 день 1 2 3 + + + + + 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Таблица 2.3.1.8 Схема полихимиотерапии R-CHOP. дни препарат Ритускимаб, 375 мг/м2, в/в кап. Доксорубицин, 50 мг/м2, в/в кап. Циклофосфамид, 750 мг/м2, в/в кап. Винкристин, 1,4 мг/м2 (не более 2 мг), в/в Преднизолон, 100 мг, внутрь Лечение возобновляется на 22 день 1 2 3 4 5 + + + + + + + + + Таблица 2.3.1.9 Схема полихимиотерапии DA-EPOCH-R. дни препарат Ритуксимаб, 375 мг/м2, в/в Этопозид, 50 мг/м2/сут, в/в (непрерывная 96часовая инфузия) Доксорубицин, 10мг/м2/сут, в/в (непрерывная 96-часовая инфузия) Винкристин, 0,4 мг/м2/сут, в/в (непрерывная 96-часовая инфузия) Циклофосфан, 750 мг/м2, в/в Преднизолон, 60 мг/м2 х 2 раза, внутрь 0 1 2 3 4 + + + + + + + + + + + + 5 + + + + + + + 50 2.3.2 Оценка рекомендации по эффекта терапии. диагностике и [Российские лечению клинические лимфопролиферативных заболеваний, 2013]. Полная Полное исчезновение всех проявлений заболевания. В том ремиссия (ПР) числе выявляемых при помощи лабораторных и лучевых методов диагностики, а также клинических симптомов, если они имели место до начала лечения. Размеры лимфоузлов: - менее 1,5 см в наибольшем измерении, если до начала лечения они были более 1,5 см; - менее 1,0 см в наибольшем измерении, если до начала лечения они были от 1,5 до 1,1 см. Печень, селезенка, если были увеличены до начала лечения, не пальпируются, по данным лучевых методов исследования объемные образования в них не выявляются. Костный мозг без признаков опухолевого поражения. Если результат морфологического исследования костного мозга неоднозначный, наличие или отсутствие поражения должно определяться иммуногистохимически. Полная ремиссия считается подтвержденной, если достигнутый эффект сохраняется не менее 2 недель или констатируется дальнейшее улучшение. Неуверенная Остаточные изменения, выявляемые только при помощи полная лучевых методов исследования (особенно остаточные ремиссия (ПРн) объемные образования в местах массивного опухолевого поражения, чаще всего в средостении), в случае сокращения опухоли более чем на 75% от исходных размеров по сумме двух наибольших ее диаметров. Эти остаточные изменения не должны увеличиваться в течение 51 3 месяцев и более. Соответствие ПР по другим показателям. Частичная Уменьшение суммы диаметров всех измеряемых очагов ресмиссия (лимфоузлов и/или очагов экстранодального поражения) не менее чем на 50%. Если размеры пораженных очагов менее 3 см в наибольшем измерении, то 2 наибольших очага должны уменьшится не менее, чем на 50% по наибольшему диаметру. При наличии более 6 очагов поражения, размерами более 3 см, достаточна оценка 6 самых больших очагов, доступных четкому измерению в двух перпендикулярных направлениях. При наличии медиастинальных и/или ретроперитонеальных очагов поражения они обязательно должны учитываться при измерении. Отсутствие новых очагов признаков увеличения поражения, какого-либо отсутствие из ранее диагностированных очагов поражения. В случае исходного поражения костного мозга, статус костного мозга для установления ЧР незначим. Однако, при сохранении поражения костного мозга в процессе и/или после завершения лечения обязательно уточнение характеристики опухолевых клеток. Больные с исходным поражением костного мозга, у которых после завершения лечения клинически диагностируется ПР, но при этом сохраняется поражение костного мозга или костный мозг не может быть оценен, относятся к ЧР. 52 Стабилизация Показатели опухоли не соответствуют критериям ПР, ЧР и (Ст) прогрессирования. Рецидив (после Появление новых очагов (увеличение лимфоузлов или ПР) или объемных образований экстранодальных локализаций) Прогрессирова- более 1,5 см в наибольшем измерении в процессе или ние (после ЧР после завершения лечения, вне зависимости от изменения или Ст) размеров других очагов поражения. Увеличение как минимум одного уже известного очага более чем на 25% от минимального. Для очагов менее 1,0 см в наибольшем измерении – увеличение до 1,5 см и более. Под первичной резистентностью понимали отсутствие частичной ремиссии и/или прогрессирование на фоне противоопухолевой химиотерапии или в течение 3 месяцев после ее завершения. Для оценки отдаленных результатов использовали показатели: Общая выживаемость (ОВ/OS) время от начала лечения до смерти пациента от любых причин, либо до момента последнего контакта с больным. Безрецидивная выживаемость промежуток времени от начала (БРВ/PFS) лечения до рецидива заболевания или смерти от других причин, или до последнего контакта с пациентом, но только для пациентов, достигших полной или частичной ремиссии. Бессобытийная выживаемость время между началом лечения и (БСВ/EFS) любым неблагоприятным событием (недостижение ремиссии, рецидив или смерть от любых причин). 53 2.4 Статистические методы. Результаты анализа морфологических иммуногистохимических параметров пациентов с характеристик и крупноклеточными В- клеточными лимфомами средостения, были введены в созданную в пакете Microsoft Office Excel базу данных и анализировались с применением пакета прикладных программ для статистического анализа STATISTICA v. 10 и встроенных функций пакета Microsoft Office Excel. Большинство изучаемых показателей являлось качественными, измеренными по номинальной или порядковой шкалам. Для таких переменных проводилась точечная и интервальная оценка распределения частот, при этом в качестве интервальной оценки строился 95% доверительный интервал, который вычислялся с помощью углового преобразования Фишера. В качестве статистического критерия для проверки гипотезы о значимости различий частот в независимых группах использовался критерий χ2. При анализе многопольных таблиц его применение считалось корректным, если в таблице ожидаемых частот доля ячеек с частотами, меньшими 5, не превышала 25%, в противном случае проводились попарные сравнения частот критерием χ 2 (при необходимости – с поправкой Йетса), или с помощью точного критерия Фишера. Количественные переменные, измеренные по непрерывной шкале, представлены в виде среднего арифметического (М) и стандартного отклонения () – при отсутствии значимых отличий от нормального закона (критерий Шапиро–Уилка); медианой, нижним (Q1) и верхним (Q3) квартилями – в противном случае; соответственно, статистические сравнения выполнялись с помощью критерия Стьюдента или Манна–Уитни. Для анализа выживаемости больных использовался метод КапланаМейера. При проведении статистического анализа критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы принимался равным 0,05. 54 ГЛАВА 3. Медиастинальная лимфома серой зоны. При гистологическом исследовании изученные опухоли демонстрировали широкий спектр морфологических изменений, как в пределах группы, так и в пределах одной опухоли. Сложности при оценке морфологических изменений были обусловлены в большей части случаев (материал, полученный при медиастиноскопии) малыми размерами и деформацией фрагментов ткани. Клеточный состав был представлен крупными лимфоидными клетками со светлыми ядрами, содержащими одно или несколько ядрышек, напоминающих клетки Ходжкина, либо содержащими грубый комковатый хроматин. Степень клеточного полиморфизма существенно варьировала, как и изменения гистоархитектоники ткани, степень фиброза. В одном случае микроскопическая картина была характерна для классической лимфомы Ходжкина: широкие кольцевидные фиброзные прослойки, нодулярные скопления крупных Ходжкино-подобных клеток и двуядерных клеток, напоминающих клетки Рид-Штернберга. Крупные клетки располагались на фоне умеренно выраженного смешанноклеточного лимфоидного инфильтрата иммуногистохимическом (рис. исследования 3.1-3.). была Однако, выявлена при интенсивная диффузная экспрессия крупными клетками CD20, интенсивная ядерная экспрессия PAX-5 и ОСТ-2 (рис. 3.4-5.). Кроме того, при повторной биопсии, выполненной на фоне прогрессирования опухоли у данного больного, клеточный состав был более мономорфным, фоновый инфильтрат скудным, фиброз минимальным, отмечалась интенсивная экспрессия пан-В-клеточных маркеров (CD20, PAX-5, OCT2, BOB.1). 55 Рисунок 3.1. Медиастинальная лимфома серой зоны. Ходжкиноподобный вариант. Гематоксиллин и эозин. х40. Рисунок 3.2. Медиастинальная лимфома серой зоны. Ходжкиноподобный вариант. Гематоксиллин и эозин. х100. 56 Рисунок 3.3. Медиастинальная лимфома серой зоны. Ходжкиноподобный вариант. Крупные клетки по типу клеток Ходжкина и РидШтернберга, формирующие солидные поля. Гематоксилин и эозин. х400. Рисунок 3.4. Медиастинальная лимфома серой зоны. Ходжкиноподобный вариант. Экспрессия CD20 в клетках опухоли. х200. 57 Рисунок 3.5. Медиастинальная лимфома серой зоны. Ходжкиноподобный вариант. Экспрессия РАХ-5 в клетках опухоли. х200. Так же среди исследованных случаев в одном биоптате опухоль была представлена крупными умеренно полиморфными центробластоподобными клетками, фиброз стромы слабо выражен, альвеолярного характера, т.е. морфологическая картина напоминала ПМВЛ (рис. 3.6.), однако, при иммунофенотипировании выявлена потеря экспрессии CD20 и РАХ-5, низкая интенсивность экспрессии общего лейкоцитарного антигена (LCA). Реакция с CD30 и OCT-2 была позитивна, CD15 – отрицателен. Рисунок. 3.6. Медиастинальная лимфома серой зоны. ПМВЛподобный варианта. х200. 58 Чаще всего встречались случаи (4 случая) когда участки, напоминающие по клеточному составу и гистоархитектонике ПМВЛ и лимфому Ходжкина, были перемешаны (рис. 3.7-8.). Иммунофенотип в таких случаях так же был транзиторным: в 3 случаях все клетки, в том числе Ходжкино-подобные, экспрессировали В-линейные антигены и транскрипционные факторы В-клеток (рис. 3.9.); в одном – часть клеток с соответствующей морфологией сохраняла соответствующий фенотип, но определялись клетки с переходной морфологией и фенотипом. Рисунок 3.7. Медиастинальная лимфома серой зоны. Смешанный вариант. Клетки с морфологией клеток Ходжкина и Рид-Штернберга расположены среди монотонных опухолевых клеток среднего размера. Гематоксилин и эозин. х200. Рисунок 3.8. Медиастинальная лимфома серой зоны. Смешанный вариант. Клетки с морфологией клеток Ходжкина и Рид-Штернберга 59 расположены среди монотонных опухолевых клеток среднего размера. Гематоксилин и эозин. х200. Рисунок 3.9. Медиастинальная лимфома серой зоны. Смешанный вариант. Клетки с морфологией клеток Ходжкина и Рид-Штернберга и монотонные опухолевые клетки среднего размера интенсивно экспрессируют РАХ-5. х200. В 3 случаях опухоли имели композитное двухкомпонентное строение: отдельные участки различного строения и иммунофенотипа. Морфологические изменения при различных вариантах МЛСЗ сведены в таблицу 3.1., варианты иммунофенотипа в таблицу 3.2. 60 Таблица 3.1. Морфологические находки при различных вариантах ПМВЛ-подобный Ходжкино-подобный Вариант МЛСЗ. Стромальные Клеточный состав Фоновый изменения Диагностические клетки Грубый фиброз в Крупные одно-, дву- и виде дуг и колец с многоядерные клетки со светлыми формированием округлыми или дольчатыми нодулярных ядрами, крупными, часто структур. эозинофильными, ядрышками, Выраженный широкой светлой цитоплазмой, интерстициальный напоминающие клетки Ходжкина фиброз. и Рид-Штернберга Деликатный или Крупные монотонные клетки с умеренно округлыми или угловатыми Скудный. выраженный ядрами, зернистым хроматином, Преимущественно интерстициальный одним или несколькими мелкими малые лимфоциты, фиброз стромы трудноразличимыми единичные Фиброз базофильными ядрышками. эозинофилы, альвеолярного Небольшое или умеренное лейкоциты, характера с количество светлой или оптически гистиоциты, формированием пустой цитоплазмы. плазматические компаркментов из Могут напоминать центробласты и клетки опухолевых клеток иммунобласты. инфильтрат Разной степени выраженности. Смешанный клеточный состав (эозинофилы, гистиоциты, лимфоциты, лейкоциты, плазмациты) Смешанный Смешанный, смесь из клеток с Интерстициальный монотонными округлыми или Разной степени фиброз разной угловатыми гиперхромными выраженности, степени ядрами с малозаметным чаще умеренно выраженности, ядрышком и крупных и выражен. местами грубый с гигантских Ходжкино-подобных Смешанный формированием дуг клеток, которые могут клеточный состав. формировать скопления. 61 Двухкомпонентный (композитный) Достаточно четко Участки с разной разделенные участки гистоархитектоникой имеют разного строения: разный клеточный состав: - участки с грубым - узелки, состоящие из HRS-like фиброзом в виде дуг клеток Разной степени и колец выраженности и - участки с - солидные поля, состоящие из состава в разных деликатным диффузно расположенных участках. интерстициальным монотонных клеток по типу склерозом центробластов и иммунобластов альвеолярного характера Таблица 3.2. Результаты иммуногистохимического исследования при различных варинтах МЛСЗ. Ходжкиноподбный ПМВЛподобный - + (слабо) Часть клеток + + - + - - - - - - dim - - + + + + - + + + + + + + + Mum1 MAL + + - + p65n - - + -/+ (в 2 случаях) - LCA CD20 CD3 CD10 CD15 CD23 CD30 EMA PCK ALK PAX-5 BOB.1 OCT-2 Смешанный Композитный + - в HRS-like + - в HRS-like + в HRS-like -/+(в 1 случае) + + + - в HRS-like + - в HRS-like + -/+ (в 1 случае) - 62 dim – гранулярное цитоплазматическое окрашивание в зоне аппарата Гольджи. У 2 пациентов зафиксировано метахронное возникновение МЛСЗ: заболевание дебютировало как классическая лимфома Ходжкина, нодулярный склероз, с поражением внутригрудных лимфоузлов. Опухоль имела первично резистентное течение и при повторной биопсии на фоне прогрессирования выявлено изменение морфологии и иммунофенотипа: в одном случае выявлялось смешение участков характерных для лимфомы Ходжкина и ПМВЛ, в другом – морфология и иммунофенотип были характерны для ПМВЛ. Общие результаты иммуногистохимического исследования приведены в табл. 3.3. Таблица 3.3. Сравнительная иммуногистохимических маркеров. характеристика Антитело (доля позитивных ДВКЛ, % ПМВЛ, % МЛСЗ, % случаев) LCA 100 100 100 CD20 100 98,5 82 CD3 0 0 0 CD10 43 3 0 CD15 0 1,5 18 CD23 14 69 18 CD30 7 82 91 EMA 0 0 0 PCK 0 0 0 ALK 0 0 0 PAX-5 100 100 36 BOB.1 100 100 55 OCT-2 100 100 45 Mum1(>30%) 50 81 55 Ki67/MIB1 (индекс, %) 61 76 70 MAL 0 70 36 p65 (ядерная экспрессия) 0 50 0 экспрессии кЛХ, % 3 13 0 0 87 0 100 0 0 0 100 11 15 100 80 14 0 63 По данным литературы клетки опухоли при МЛСЗ демонстрируют иммунофенотип промежуточный между нодулярным склерозом лимфомы Ходжкина и ПМВЛ. Обычно экспрессируют CD45, что подтверждается нашими данными, хотя доля позитивных клеток и интенсивность окрашивания может варьировать. В противоположность лимфоме Ходжкина В-клеточная программа часто сохранена, но аберрантно экспрессируется в сочетании с маркерами характерными для лимфогранулематоза, такими как CD30 и CD15. CD20 часто положителен и может стойко выявляться в большинстве опухолевых клеток. CD30 – позитивен в большинстве случаев, а CD15, в исследованной группе, выявляется только в 1/5 случаев. Транскрипционные факторы PAX5, OCT-2 и ВОВ.1 обычно экспрессируются. CD10 и ALK отрицательны во всех изученных случаях. Фоновые лимфоциты преимущественно представлены CD3-, CD4- позитивными клетками как при классическом варианте лимфомы Ходжкина. MAL, как маркер ассоциированный с ПМВЛ, экспрессируется в небольшой части случаев (36%). Как правило, реакция была ограничена субпопуляцией опухолевых клеток, напоминающих по морфологии ПМВЛ. Ядерной экспрессии белка REL/p65, часто выявляемой при ПМВЛ, в тестированных случаях лимфом серой зоны не обнаружено. Пролиферативная активность была высокая, более 40% позитивных клеток, в среднем – 70%. При FISH исследовании перестройка в гене CIITA была выявлена в 3 из 11 случаев МЛСЗ, во всех из них преобладали морфологические изменения более характерные для ПМВЛ. Кроме того в контрольной группе выявлена перестройка в 4 из 10 случаев ПМВЛ и в 1 из 3 лимфом Ходжкина. Часто встречающиеся при МЛСЗ генетические нарушения отражены в таблице 3.2. 64 Таблица 3.2. Часто выявляемые при МЛСЗ генетические перестройки. Ген XPO1 IGH TNFAIP3 B2M CIITA Протеин E571K IGH-CIITA fusion Q110 S14fs CIITA-IGH fusion Клинические (большинство материала). данные, случаев У всех – доступные внешние пациентов Тип перестройки Миссенс-мутация Слияние Нонсенс-мутация Сдвиг рамки считывания Слияние анализу, консультации имело место были ограничены гистологического массивное поражение средостения, у 5 – кроме того были поражены под- и/или надключичные лимфоузлы. В случаях, где была выполнена трепанобиопсия костного мозга (3 случая) специфических изменений не было выявлено. В случаях субтотального удаления опухоли (3 случая) пациенты не получали предоперационного лечения, т.к. образование расценивалось как тимома. В 3 случаях изначально был установлен диагноз классической лимфомы Ходжкина, в связи с чем пациенты получали соответствующую терапию, но заболевание было резистентно к ней. В двух случаях пациенты получили интенсифицированные режимы химиотерапии, но так же эффект был неудовлетворительным. 65 ГЛАВА 4. Первичная медиастинальная В-клеточная крупноклеточная лимфома. 4.1 Морфлогические изменения. Случаи ПМВЛ также демонстрировали широкий спектр цито- и гистоархитектурных изменений в пределах исследуемой группы и в пределах одного опухолевого узла. Так же в большой части случаев, где материал был получен при медиастиноскопии, малое количество и деформация материала затрудняли морфологический анализ. В двух случаях (3%) строма была выражена минимально, без фиброзных изменений, картина напоминала диффузную крупноклеточную Вклеточную лимфому. В остальных случаях (65 случаев – 97%) определялся диффузный интерстициальный фиброз стромы альвеолярного характера разной степени выраженности, варьировал от тонких деликатных фиброзных прослоек, до широких фиброзных тяжей, в том числе в виде дуг (рис. 4.1.12.). Рисунок 4.1.1. ПМВЛ. Умеренно выраженный фиброз стромы, высокая плотность опухолевых клеток. Фоновый инфильтрат с многочисленными эозинофилами. Гематоксилин и эозин. х200. 66 Рисунок 4.1.2. ПМВЛ. Выраженный фиброз стромы, низкая плотность опухолевых клеток. Фоновый инфильтрат с многочисленными эозинофилами. Гематоксилин и эозин. х200. Опухолевые клетки крупные (размером более 3 ядер малого лимфоцита) с округлыми ядрами или угловатыми контурами ядер, с грубым комковатым ядерным хроматином, неразличимыми или мелкими базофильными ядрышками встречались в 17 случаях (25%) (рис. 4.1.3). Крупные клетки с везикулярными ядрами, 1-2 крупными ядрышками выявлены в 26 случаях (39%) (рис. 4.1.4). В остальных (24 случая – 36%) случаях клеточный состав был смешанным, встречались клетки с различными ядерными характеристиками. Клетки с дольчатыми ядрами, различными характеристиками ядерного хроматина, встречались редко, как правило, составляли небольшую часть клеточной популяции. Цитоплазма опухолевых клеток умеренно выраженная или скудная, в 41 случае (61%) светлая (оптически пустая), в остальных случаях светло-эозинофильная или амфофильная (рис. 4.1.3). 67 Рисунок 4.1.3. ПМВЛ. Отчетливый альвеолярный фиброз стромы. Оптически пустая цитоплазма опухолевых клеток. Гиперхромные ядра с конденсированным хроматином, неразличимыми ядрышками. Рисунок 4.1.4. ПМВЛ. Солидные поля крупных опухолевых клеток, напоминающих иммунобласты, со светлыми ядрами, 1-2 крупными ядрышками, светло-эозинофильной цитоплазмой. Фоновый инфильтрат из малых лимфоцитов с немногочисленными эозинофильными лейкоцитами. Гематоксилин и эозин. х200. В 45 случаях (67%) встречались клетки, напоминающие по морфологии клетки Ходжкина, а так же двуядерные клетки по типу клеток Рид-Штернберга (рис. 4.1.5-6). Количество их существенно варьировало, но не превышало 25% от популяции опухолевых клеток. 68 Рисунок 4.1.5. ПМВЛ. Отдельные клетки по типу клеток Ходжкина (стрелка) и Рид-Штернберга (стрелка) с «мумификацией». Гематоксилин и эозин. х400. Рисунок 4.1.6. ПМВЛ. Отдельные клетки по типу клеток Ходжкина (стрелка) и Рид-Штернберга (стрелка) с «мумификацией». Гематоксилин и эозин. х400. В 34% (23 случая) выявлялись участки некроза от микрофокусов до обширных полей (рис. 4.1.7). 69 Рисунок 4.1.7. ПМВЛ. Альвеолярный фиброз стромы. Очаги некроза. Гематоксилин и эозин. х100. 4.2 Результаты иммуногистохимического исследования. Во всех случаях опухолевые клетки экспрессировали общий лейкоцитарный антиген (LCA) и пан-В-клеточные линейные маркеры (CD20, PAX-5, BOB.1, OCT-2) (рис. 4.2.1-2). Доля клеток окрашенных CD20 варьировала от 25% до 100%, в среднем составляла 88% клеток. CD23 был позитивен в 69% (20/29) случаев, доля окрашенных клеток варьировала от 10% до 100%, экспрессия часто была очаговой или фокальной и разной степени интенсивности, в среднем были позитивны 43% клеток. 70 Рисунок 4.2.1. ПМВЛ. Ядерная экспрессия транскрипционных факторов: OCT-2 в клетках опухоли. х200. Рисунок 4.2.2. ПМВЛ. Ядерная экспрессия транскрипционных факторов: ВОВ.1 в клетках опухоли. х200. Экспрессия CD30 выявлялась в 82% случаев (55/67), была гетерогенной, реакция мембранно-цитоплазматическая, как правило, без акцента в зоне аппарата Гольджи, позитивны 30-70% опухолевых клеток (рис. 4.2.3-4). CD15 был позитивен в 1 случае, окрашивалось менее 10% клеток опухоли, реакция цитоплазматическая. 71 Рисунок 4.2.3. ПМВЛ. Варианты экспрессии CD30 в клетках опухоли: диффузное окрашивание, позитивна большая часть клеток опухоли. х100. Рисунок 4.2.4. ПМВЛ. Варианты экспрессии CD30 в клетках опухоли: фокальная реакция в отдельных опухолевых клетках. х100. Позитивная реакция с CD10 определялась в 2 случаях (3%), ограничивалась небольшой субпопуляцией опухолевых клеток, 5-10%. Ядерная экспрессия белка REL/p65 была выявлена в 50% случаев (17/34), окрашивалась так же и цитоплазма опухолевых клеток. Реакция, ограниченная цитоплазмой была выявлена еще в 41% (14/34) случаев, однако, она не несет дифференциально диагностического значения, т.к. выявлялась и в случаях других нозологических единиц. 72 Мембранно-ассоциированный белок MAL был позитивен в 70% случаев (23/33), реакция мембранно-цитоплазматическая и цитоплазматическая. Пролиферативная активность, выявленная при помощи Ki67, была высокая, доля позитивных клеток варьировала от 40% до 95%, в среднем составила 76%. Результаты иммуногистохимического исследования случаев ПМВЛ с различными маркерами представлены в таблице 4.2.1. Таблица 4.2.1. Результаты иммуногистохимического исследования случаев ПМВЛ. Кол-во позитивных случаев LCA CD20 CD10 CD15 CD23 CD30 EMA ALK PAX-5 BOB.1 OCT-2 Mum1 (2+,3+) MAL p65n Экспрессия Кол-во окрашенных случаев 65 66 2 1 20 55 0 0 67 64 65 47 23 17 mum1 65 67 67 67 29 67 67 17 67 64 65 58 33 34 оценивалась Доля позитивных случаев, % 100 98,5 3 1,5 69 82 0 0 100 100 100 81 70 50 полуколичественно, результаты представлены в таблице 4.2.2. Таблица 4.2.2. Экспрессия mum1 в ПМВЛ. 0 1+ 2+ 3+ ≤10% 10-30% 30-70% >70% 7% (4/58) 12% (7/58) 28% (16/58) 53% (31/58) 73 4.3 Клиническая часть. Среди исследованных пациентов 34 получили химиотерапию по схеме MACOP-B±R. У 11 (32,4%) из них заболевание было выявлено на I стадии, у 17 (50%) – на II, у остальных – на III-IV стадии. При этом опухолевый процесс у всех имел значительную местную распространенность. Так у 32 пациентов (94%) – образование средостения было более 7,5 см (“bulky”); у 26 пациентов определялась инвазия в паренхиму легких; у 27 – в перикард; 29 – специфическое поражение магистральных сосудов и у 28 – париетальной плевры. У 16 пациентов зафиксировано распространение опухоли на мягкие ткани грудной стенки, у 22 – гидроторакс (односторонний или двусторонний), у 16 – гидроперикард. Кроме того, у 18 пациентов отмечался тромбоз верхней полой вены и/или ее притоков с соответствующей клиникой синдрома сдавления верхней полой вены разной степени выраженности, что определяло тяжесть состояния у значительной доли пациентов (у 23 (67,6%) человек состояние расценивалось как средней тяжести на момент поступления). В 15 случаях у пациентов были признаки опухолевой интоксикации, у 18 – определялось повышение уровня лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Международный прогностический индекс (IPI) у 29 из 34 пациентов (85,3%) имел значения, позволявшие отнести их к группе низкого и промежуточного/низкого риска, что было связано в первую очередь, с возрастом этой группы больных и локализованным поражением средостения (низкая стадия заболевания), даже при значительном местном распространении. У 80% пациентов, получавших химиотерапию по схеме MACOP-B был достигнут объективный ответ: у 2 – полная ремиссия (у одного было выполнено тотальное хирургическое удаление образования средостения до начала лечения) и у 6 – частичная ремиссия. У двоих пациентов течение заболевания было расценено как первично-резистентное. 74 MACOP-B CR PR resist Рисунок 4.3.1. Эффективность терапии по схеме MACOP-B. MACOP-B+R CR PR resist Рисунок 4.3.2. Эффективность терапии по схеме MACOP-B+R. После химиотерапии по схеме MACOP-B с добавление ритуксимаба из 24 пациентов эффект был достигнут у 20 человек (83,3%): у 5 – полная ремиссия (у одного из них была выполнена резекция образования средостения до начала химиотерапии), у 15 – частичная. В 4 случаях опухоль была не чувствительная к проводимому лечению. Суммарный позитивный 75 эффект химиотерапии MACOP-B±R составил 82,4%: полный или частичный ответ был получен у 28 из 34 пациентов. MACOP-B±R CR PR resist Рисунок 4.3.3. Эффективность терапии по схеме MACOP-B+R. Из 28 человек с позитивными результатами терапии (полная или частичная ремиссия) 15 в последующем получили дистанционную лучевую терапию на зону остаточной опухоли/резидуальных масс, и 2 не получили никакого дополнительного лечения. У 7 пациентов получивших лучевую терапию удалось перевести частичную ремиссию в полную. Одна пациентка в процессе ЛТ погибла. У 8 пациентов (3 – получали MACOP-B, 5 – MACOP-B в сочетании с ритуксимабом) эффект индукционной химиотерапии был расценен как недостаточный, в связи с наличием резидуальных медиастинальных масс большого размера. В связи с чем, всем этим пациентам, а так же тем, у которых выявлено первично-резистентное течение заболевания, всего 14, была проведена 2-я линия химиотерапии по схеме DHAP, ESHAP или miniBEAM, от 1 до 3 курсов, в зависимости от ответа. После 2-й линии у одного пациента было выявлено резистентное течение болезни и он погиб на фоне прогрессирования заболевания; одному пациенту было проведено лечение 3-й линии, что не привело к значимому 76 сокращению медиастинального произведено хирургическое образования. удаление Этому резидуальных пациенту масс и было при гистологическом исследовании констатирован полный лечебный патоморфоз (IV степени). У 12 пациентов (4 с первично-резистентным течением и 8 с частичной ремиссией) определялся значительный положительный эффект 2-й линии провоопухолевой терапии. Была достигнута ремиссия у всех пациентов с резистентным течением заболевания: у 1 – полная, что было подтверждено данными ПЭТ-исследования и у 3 – частичная. У 11 пациентов после достижения частичной или полной ремиссии по завершении 2-й линии химиотерапии и у 3 после завершения курса MACOPB ± ритуксимаб, в качестве консалидирующей терапии была проведена высокодозная химиотерапия (ВДХТ) с аутологичной трансплантацией стволовых кроветворных клеток (ауто-ТСКК). Из 14 пациентов у 4 с частичной ремиссией после курса BEAM была достигнута полная ремиссия, у 9 сохранялась частичная ремиссия, и у одного из пациентов с первичнорезистентной опухолью полная ремиссия была достигнута до начала ВДХТ. На завершающем этапе 10 пациентам (из 14) после ауто-ТСКК так же была проведена лучевая терапия на зону резидуальной опухоли. Т.е. суммарно 25 человек (15 непосредственно после завершения курса MACOPB±R) получили лучевое лечение на область средостения, СОД составила 3035 Гр. После завершения всех этапов лечебной программы ремиссия была достигнута у 33 (97%) из 34 пациентов: полная ремиссия – 27 (79%) человек: частичная ремиссия – 6 (18%) человек. Один из пациентов погиб на фоне прогрессирования опухоли, резистентной к проводимой терапии. У троих пациентов (9%) зафиксировано развитие рецидива опухоли. Двум из них была проведена противорецидивная химиотерапия (R-ICE, блоковая ХТ), что позволило достичь частичного ответа, который сохранялся до момента анализа. 77 Трехлетняя БРВ – 93%, БСВ составила 75%, а ОВ – 90%. Пятилетняя выживаемость составила: ОВ - 90; БРВ - 84; БСВ – 69 . При анализе выживаемость среди пациентов получивших ритуксимаб в составе индукционной ХТ и не получивших его, различий выявлено не было, что, вероятнее всего, связано с малой величиной выборки. При анализе пациентов, у которых развились рецидивы заболевания, было выявлено, что они входили в группу, не получавшую ритуксимаб, при этом рецидивы возникали даже на фоне комплексного химиолучевого лечения и ВДХТ. Кроме того все пациенты с первично-резистентным течением заболевания и с рецидивом имели высокий уровень экспрессии IRF/mum1 (3+), у троих (из 3 исследованных) – выявлена перестройка в гене CIITA при помощи FISH-исследования. 78 ГЛАВА 5. 5.1 Классическая лимфома Ходжкина. Из 30 случаев классической лимфомы Ходжкина с поражением лимфоузлов средостения, изученных в качестве контрольной группы, в 28 установлен гистологический вариант с нодулярным склерозом и в 2 – предположен смешанноклеточный вариант (ограниченное количество и фрагментация материала не позволяли высказаться категорично). Морфологические изменения характеризовались наличием кольцевидного фиброза во всех случаях нодулярного склероза, степень выраженности которого варьировала. В 2/3 случаев фиброзные тяжи были широкими, сочетались с утолщением капсулы лимфоузла, если она была представлена, интерстициальным фиброзом. Спектр цитологических изменений так же был широк: в 67% случаев диагностические клетки (HRS-клетки) имели классический вид: крупные светлые, иногда дольчатые, ядра с одним или несколькими крупными, центрально расположенными эозинофильными ядрышками, широкой светлой цитоплазмой. В 4 случаях (13%) клетки были меньшего размера, более монотонные с менее выраженными ядрышками. В 6 случаях (20%) клетки были малочисленны, представленный фрагментирован и/или деформирован. материал был резко В 60% случаев определялись лакунарные и мумифицированные варианты HRS-клеток, как правило, единичные. Диагностические клетки располагались на фоне смешанноклеточного лимфоидного инфильтрата, состоявшего из малых лимфоцитов, гистиоцитов, эозинофильных и нейтрофильных лейкоцитов, плазматических клеток. Доля различных компонентов инфильтрата существенно варьировала от случая к случаю. В 7/28 (25%) случаях нодулярного склероза установлен grade II, т.к. диагностические клетки формировали солидные поля и синцитиальные структуры, часто с центрально расположенными фокусами некроза, либо 79 более чем в 25% фолликулов определялось истощение фонового инфильтрата и/или высокий уровень клеточного полиморфизма среди HRS-клеток. При иммуногистохимическом исследовании CD30 был позитивен во всех исследованных случаях, окрашивалось 80-100% диагностических клеток, реакция мембранно-цитоплазматическая с акцентуацией в зоне аппарата Гольджи. CD15 выявлялся в 26/30 (87%) случаев, позитивны 30-100% HRSклеток, интенсивность экспрессии существенно ниже по сравнению с фоновыми гранулоцитами, реакция мембранно-цитоплазматическая в 42% позитивных случаев, в остальных – экспрессия ограничена цитоплазмой, в том числе зоной аппарата Гольджи. Все исследованные случаи экспрессировали транскрипционный фактор В-клеток PAX-5, интенсивность окрашивания ядер была умеренно или значительно ниже по сравнению с реакцией в фоновых В-лимфоцитах. Остальные транскрипционные факторы выявлялись в единичных случаях: OCT-2 – 3/20 (15%); ВОВ.1 – 2/18 (11%). Однако, коэкспрессии ОСТ-2 и ВОВ.1 не было выявлено ни в одном случае. Позитивная реакция с антителами к CD20 отмечалась в 4 случаях (13%), была фокальной, доля окрашенных клеток варьировала от 5 до 15%, в одном из случаев, так же выявлена экспрессия LCA в CD20-позитивных диагностических клетках. Кроме того, HRS-клетки давали цитоплазматическую экспрессия р65 в 5 случаях из 7 окрашенных и цитоплазматическую экспрессию MAL в одном из них. Результаты иммуногистохимического исследования случаев лимфомы Ходжкина суммированы в таблице 5.1.1. 80 Таблица 5.1.1. Экспрессия иммуногистохимических маркеров в изученных случаях лимфомы Ходжкина. Кол-во Кол-во Доля позитивных окрашенных позитивных случаев случаев случаев, % LCA 1 30 3 CD20 4 30 13 CD10 0 23 0 CD15 26 30 87 CD23 0 27 0 CD30 30 30 100 EMA 0 30 0 ALK 0 14 0 PAX-5 30 30 100 BOB.1 2 18 11 OCT-2 3 20 15 Mum1 (3+) 28 28 100 MAL 1 7 14 p65n 0 7 0 В отдельных случаях (биопсиях небольшого объема, чаще пункционных) возникали существенные диагностические сложности, связанные небольшим количеством диагностических клеток с и особенностями их морфологии, не всегда позволяющими выявить их природу без дополнительных методов исследования. В подобных случаях стромальные изменения и характеристики фонового инфильтрата позволяли предположить лимфому Ходжкина (рис. 5.1.1-6). 81 Рисунок 5.1.1. Классическая лимфома Ходжкина. Трепанобиоптат. Выраженный интерстициальный фиброз стромы без отчетливых нодулярных структур. Гематоксилин и эозин. х100. Рисунок 5.1.2. Классическая лимфома Ходжкина. Трепанобиоптат. Выраженный интерстициальный фиброз стромы. Единичные клетки, напоминающие клетки Ходжкина и Рид-Штернберга (стрелка). Фоновый инфильтрат, состоящий из малых лимфоцитов, гистиоцитов и эозинофилов. Гематоксилин и эозин. х400. 82 Рисунок 5.1.3. Классическая лимфома Ходжкина. Трепанобиоптат. Фоновый инфильтрат представлен большим количеством CD3-позитивных Т-клеток. х100. Рисунок 5.1.4. Классическая лимфома Ходжкина. Трепанобиоптат. Фоновый инфильтрат представлен немногочисленными В-лимфоцитами (CD20+). Диагностические клетки не экспрессируют CD20. х100. 83 Рисунок 5.1.5. Классическая лимфома Ходжкина. Трепанобиоптат. Диагностические клетки дают интенсивную мембранно-цитоплазматическую реакцию с CD30. х100. Рисунок 5.1.6. Классическая лимфома Ходжкина. Трепанобиоптат. Диагностические клетки дают интенсивную мембранно-цитоплазматическую реакцию с CD15. х100. При сравнении результатов иммуногистохимического исследования, полученных в случаях классической ЛХ и ПМВЛ, выявлены статистически значимы различия в частоте экспрессии LCA, CD20, CD15, CD23, а так же транскрипционных факторов В-клеток BOB.1 и ОСТ-2, мембранноассоциированного белка MAL и р65 (табл. 5.1.2.). 84 Таблица 5.1.2. Сравнительная характеристика частоты использованных антител в изученных случаях ЛХ и ПМВЛ. экспрессии ЛХ ПМВЛ р LCA 3% (1/30) 100% (65/65) <0.05 CD20 13% (4/30) 98,5 (66/67) <0.05 CD10 0% (0/23) 3% (2/67) >0.05 CD15 87% (26/30) 1,5% (1/67) <0.05 CD23 0% (0/27) 69% (20/29) <0.05 CD30 100% (30/30) 82% (55/67) >0.05 PAX-5 100% (30/30) 100% (67/67) >0.05 BOB.1 11% (2/18) 100% (64/64) <0.05 OCT-2 15% (3/20) 100% (65/65) <0.05 100% (28/28) 81% (47/58) >0.05 MAL 14% (1/7) 70% (23/33) <0.05 p65n 0% (0/7) 50% (17/34) <0.05 Mum1 (3+) Чувствительность, специфичность и диагностическая значимость этих маркеров для дифференциальной диагностики между классической лимфомой Ходжкина и ПМВЛ отражены в таблице 5.1.3. Таблица 5.1.3. Показатели чувствительности, специфичности и диагностической точности ряда иммуногистохимических маркеров при дифференциальной диагностике ЛХ и ПМВЛ. Se, % Sp, % Ac, % LCA 100 97 99 CD20 98,5 87 95 CD15 87 98,5 95 CD23 69 100 78 BOB.1 100 89 98 OCT-2 100 85 97 MAL 70 94 78 p65n 50 100 67 85 5.2 Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома. Так же в качестве контрольной группы было изучено 14 случаев диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы с первичным или преимущественным поражением лимфоузлов средостения, в том числе с распространением на стенку трахеи в одном случае. У всех пациентов пораженные группы лимфоузлов располагались выше диафрагмы, у 9 была установлена стадия II по Ann Arbor, у остальных – III-IV. Поражения костного мозга выявлено не было (у 6 пациентов выполнялась трепанобиопсия костного мозга). При гистологическом исследовании только в 2 случаях (14%) выявлялся интерстициальный фиброз стромы в виде тонких деликатных фиброзных тяжей, в остальных случаях опухоль была представлена солидными полями клеток. По клеточной морфологии преобладали опухоли, состоящие преимущественно из клеток по типу центробластов (5 случаев – 36%) и иммунобластов (8 случаев – 57%), в одном случае опухоль состояла из крупных, полиморфных анаплазированных клеток (анапластический вариант) (рис. 5.2.1). Рисунок 5.2.1. Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома. Анапластический цитологический вариант. Гематоксилин и эозин. х400. При иммуногистохимическом исследовании во всех случаях были позитивны LCA и В-линейные маркеры (CD20, PAX-5, OCT-2, BOB.1). Доля 86 CD20-позитивных клеток колебалась от 65% до 100%, в среднем составила 80% позитивных клеток. CD10 был позитивен в 6 случаях (43%), экспрессия mum1 более чем в 30% клеток выявлена в 7 случаях (50%); в 7 же случаях установлен GCBподтип ДВКЛ (один из CD10-негативных случаев экспрессировал bcl6, при доле mum1-позитивных клеток менее 30%). В одном случае (7%) выявлена очаговая экспрессия CD30 (позитивны менее 30% опухолевых клеток), CD15 – отрицателен во всех случаях. В двух случаях (14%) определялась очаговая экспрессия CD23 в 1030% клеток опухоли. Цитоплазматическая экспрессия р65 выявлена в 57% (8/14) случаев, ограничена субпопуляцией опухолевых клеток (10-30%), ядерной экспрессии р65 и окрашивания MAL не выявлено. Результаты иммуногистохимического исследования при ДВКЛ суммированы в таблице 5.2.1. Таблица 5.2.1. Экспрессия иммуногистохимических маркеров в изученных случаях ДВКЛ. Кол-во позитивных случаев LCA CD20 CD10 CD15 CD23 CD30 EMA ALK PAX-5 BOB.1 OCT-2 Mum1 (3+) MAL p65n 14 14 6 0 2 1 0 0 14 14 14 7 0 0 Кол-во окрашенных случаев 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 14 Доля позитивных случаев, % 100 100 43 0 14 7 0 0 100 100 100 50 0 0 87 При сравнении иммунофенотипа ДВКЛ и ПМВЛ выявлены статистически значимые различия частоты экспрессии следующих маркеров: CD10, CD23, CD30, MAL и р65, при оценке ядерной его экспрессии. Результаты приведены в таблице 5.2.2.. Чувствительность, специфичность и диагностическая значимость данных маркеров для дифференциальной диагностики ДВКЛ и ПМВЛ приведены в таблице 5.2.3.. Таблица 5.2.2. Сравнительная характеристика частоты использованных антител в изученных случаях ДВКЛ и ПМВЛ. LCA CD20 CD10 CD15 CD23 CD30 PAX-5 BOB.1 OCT-2 Mum1 (3+) MAL p65n экспрессии ДВКЛ ПМВЛ р 100% (14/14) 100% (14/14) 43% (6/14) 0% (0/14) 14% (2/14) 7% (1/14) 100% (14/14) 100% (14/14) 100% (14/14) 50% (7/14) 0% (0/14) 0% (0/14) 100% (65/65) 98,5 (66/67) 3% (2/67) 1,5% (1/67) 69% (20/29) 82% (55/67) 100% (67/67) 100% (64/64) 100% (65/65) 81% (47/58) 70% (23/33) 50% (17/34) >0.05 >0.05 <0.05 >0.05 <0.05 <0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 <0.05 <0.05 Таблица 5.2.3. Показатели чувствительности, специфичности и диагностической значимости CD10, CD23, MAL и ядерной экспрессии р65 при ДВКЛ и ПМВЛ. Se, % Sp, % Ac, % 43 99 89 CD10 69 93 73 CD23 70 100 79 MAL 50 100 65 p65n Пациенты ДВКЛ группы высокого риска требуют интенсификации лечения, что сопряжено с выраженной миелоабляцией и сопровождается гематологической токсичностью высоких степеней, высокой частотой геморрагических и инфекционных осложнений. Для того чтобы 88 нивелировать неблагоприятные эффекты интенсивных режимов терапии используют инфузии стволовых кроветворных клеток (трансплантацию), что и было выполнено в одном из исследованных случаев. Клинический пример. Пациентка 29 лет обратилась в НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова с жалобами на одышку в покое, кашель, кровохарканье, увеличение лимфоузлов шеи и надключичных областей с обеих сторон. После дообследования установлена клиническая стадия IV AX (поражение лимфоузлов средостения, шейных, надключичных, ретропекторальных, вовлечение паренхимы почек и легких; гидроторакс слева, гидроперикард), IPI=3. Была выполнена биопсия надключичного лимфоузла справа, лимфоидная ткань субтотально замещена крупными центробластоподобными клетками, которые диффузно интенсивно экспрессировали пан-В-клеточные маркеры (CD20, PAX-5, OCT-2), в части клеток (10-15%) выявлялось окрашивание CD30. Гистологическая картина и иммунофенотип представлены на рис. 5.2.2-7. Рисунок 5.2.2. Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома. Солидные поля крупных лимфоидных клеток. Гематоксилин и эозин. х200. 89 Рисунок 5.2.3. Диффузная Крупноклеточная В-клеточная лимфома. Опухолевые клетки со светлыми ядрами, крупным ядрышком, напоминают иммунобласты. Гематоксилин и эозин. х400. Рисунок 5.2.4. Диффузная крупноклеточная В-клеточная Диффузная экспрессия CD20 в клетках опухоли. х200. лимфома. 90 Рисунок 5.2.5. Диффузная крупноклеточная В-клеточная Экспрессия CD30 в клетках опухоли (около 10-15%). х200. лимфома. Рисунок 5.2.6. Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома. Экспрессия в клетках опухоли транскрипционного фактора РАХ-5. х200. 91 Рисунок 5.2.7. Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома. Экспрессия в клетках опухоли транскрипционного фактора ОСТ-2. х200. Установлен гистологический диагноз – диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома. ICD-O код 9680/3. По данным компьютерной томографии «средостение расширено за счет крупного конгломерата увеличенных внутригрудных лимфоузлов (переднего и верхнего средостения, паратрахеальные, трахеобронхиальные, парастернальные слева), расположенного преимущественно слева от средней линии. Прилежащая легочная ткань верхней доли левого легкого значительно неоднородно уплотнена, по периферии выраженные интерстициальные изменения – переход процесса по контакту? гиповентиляционные изменения? Наружный контур конгломерата лимфоузлов сливается с уплотненной тканью легкого. Точные размеры конгломерата на этом фоне оценить затруднительно ~ 109 х 69 х 74 мм» (рис. 5.2.8). 92 Рисунок 5.2.8. Компьютерная томография. До лечения. Объемное образование переднего средостения с распространением на ткань левого легкого. Кроме того у пациентки была выявлена аневризма внутренней сонной артерии слева размерами 30х28х38 мм (рис. 5.2.9). 93 Рисунок 5.2.9. КТ-ангиография с 3D-реконструкцией. Аневризма внутренней сонной артерии слева больших размеров. При билатеральной трепанобиопсии костного мозга и по данным миелограммы специфического поражения костного мозга лимфомой не выявлено. Пациентке была проведена химиотерапия по схеме CHOP-R, 6 курсов, в результате чего достигнута редукция медиастинального образования (на 75%) и полный ответ по остальным очагам (по данным ПЭТ 1-2 по шкале Deauville). После 5 курса развилась пневмоцистная пневмония, которая была успешно купирована. Пациентка относилась к группе высокого риска развития рецидива опухоли (IPI - 3), т.е. неблагоприятного прогноза, что является показанием для проведения ВДХТ с ауто-ТСКК. В качестве мобилизирующего агента использовался новый препарат – селективный антагонист рецептора CXCR4 – плериксафор и Г-КСФ продленного действия – пэгфилграстим. При аферезе стволовых кроветворных клеток из периферической крови собрано 14,5х106/кг CD34-позитивных клеток. Далее больной был проведен курс высокодозной ПХТ по схеме BEAM, после которой последовала трансплантация заготовленных аутологичных стволовых кроветворных клеток в дозе 14,5х106/кг CD34+ клеток, пациентка получала лейкостим в дозе 300 мкг в сутки подкожно с 1 по 13 день. После курса ВДХТ с последующей ауто-ТСКК восстановление клеточного состава крови произошло на 10 день: уровень лейкоцитов 94 составил более 1х109/л, на 12 день уровень тромбоцитов достиг более 50х109/л. В качестве первичной профилактики инфекционных осложнений использовались ципрофлоксацин, вифенд, ацикловир. Режим и дозы применения препаратов указаны в табл. 5.2.1. Бисептол в дозе 480 мг в сутки с первого по 15 дни применяли для вторичной профилактики осложнений. Таблица 5.2.1. Первичная профилактика инфекционных осложнений после курса ВДХТ с последующей ауто-ТСКК. Ципрофлоксацин 500 мг ВВ х2 Д1-Д15 Вифенд 200 мг ВВ х1 Д1-Д15 Ацикловир 200 мг ВВ х2 Д1-Д15 В процессе лечения возникли следующие осложнения: - токсический агранулоцитоз с 5 по 10 сутки; - анемия средней степени тяжести (гемоглобин не ниже 72 г/л); - мукозит: диарея – жидкий стул с 5 по 15 день после ауто-ТСКК в связи с чем, получала метронидозол в дозе 500 мг 3 раза в день внутривенно; - тромбоцитопения с 5 по 12 сутки, по поводу чего четырежды выполнялись трансфузии тромбоцитарного концентрата. После восстановления клеточного состава крови пациентке было выполнено успешное эндоваскулярное сосудистое вмешательство по поводу аневризмы внутренней сонной артерии слева. На сегодняшний день пациентка находится в ремиссии 10 месяцев. 95 ГЛАВА 6. Обсуждение полученных результатов. В-клеточные лимфомы средостения из крупных клеток являются одной из частых опухолей средостения и поражают преимущественно людей активного трудоспособного возраста, 3-4-й десяток. Статистически значимых различий по возрасту и полу между исследованными группами пациентов выявлено не было (диаграмма 2.1.1.), что, вероятно, обусловлено небольшим количеством пациентов в части групп. Это гетерогенная группа новообразований, которые имеют ряд сходных эпидемиологических вариабельностью характеристик, морфологических обладают проявлений, значительной как в плане гистоархитектоники (степень выраженности и характер стромы, степень выраженности и состав фонового инфильтрата, распределение опухолевых клеток), так и набора цитологических изменений. При этом каждый из членов этой группы требует индивидуального подхода к терапии. Так для ЛХ стандартом на сегодняшний день является схема ABVD для локализованных стадий, и интесифицированный курс BEACOPP esc., при наличии факторов риска [Engert A, 2010]. Для ПМВЛ показала свою эффективность ранняя интенсификация противоопухолевой терапии в первой линии (front-line) с использованием таких режимов как MACOP-B±R, DA-EPOCH-R; но остается множество нерешенных проблем, в том числе открыт вопрос о необходимости дистанционной лучевой терапии с целью консалидации достигнутой ремиссии или повышения эффекта ПХТ; роль ВДХТ с ауто-ТСКК [Вернюк М.А, 2013; Тюрина Н.Г., 2014; Dunleavy K, 2015]. Для ДВКЛ сегодня стандартом является CHOP-R, но в ряде случаев, при наличии факторов риска, пациентам показана ВДХТ, особенно людям молодого возраста [Tilly H, 2010; Моталкина М.С. с соавт., 2015]. МЛСЗ редкая нозологическая единица, среди изученных случаев составила 9%, данных о частоте ее встречаемости в литературе нет, что 96 связано с тем, что еще мало времени прошло с тех пор, как эту лимфому выделили в отдельную классификационную единицу. Этим же объясняется отсутствие систематических данных в отношении этой опухоли, большинство литературных источников представлены описанием отдельных клинических случаев. Для МЛСЗ на сегодняшний день нет определенных рекомендаций по выбору терапии, что обусловлено редкостью данной нозологической формы и небольшим периодом времени, прошедшим после ее выделения. По имеющимся данным единичных проспективных исследований с DA-EPOCH-R результаты хуже, чем у пациентов с ПМВЛ, имеющих аналогичные клинические характеристики (БСВ и ОВ составили 62% и 74% соответственно, против 93% и 97% для ПМВЛ) [Dunleavy K, 2015]. Сходства и различия между ДВКЛ, ПМВЛ, МЛСЗ и ЛХ обусловлены особенностями биологии этих опухолей, множеством общих генетических изменений (табл. 1.4.1.) [Steidl C, 2011; Артемьева А.С. с соавт., 2015]. Общие генетические изменения характерные для группы В-клеточных лимфом средостения из крупных клеток (ПМВЛ, МЛСЗ и ЛХ) отражают повреждения в трех основных биологических процессах: - JAK-STAT – сигнальный путь: Повышение активности генов JAK2, STAT6 Снижение активности генов SCOS1, PTPN1 - Иммунные регуляторные гены: Повышение активности PD-L1, PD-L2 Снижение активности CIITA, HLADR, B2M - NFkB – сигнальный путь: Повышение активности REL Снижение активности TNPAIP3 97 Специфических генетических изменений, ассоциированных с трансформацией лимфомы или ее компонентов в ту или иную (классическую лимфому Ходжкина или ПМВЛ) не обнаружено [Eberle FC, 2011]. Так как морфологические и фенотипические изменения обратимы, более вероятны эпигенетические, чем генетические повреждения, которые и ответственны за изменение морфологии и иммунофенотипа. Близкая взаимосвязь между нодулярным склерозом лимфомы Ходжкина и ПМВЛ продемонстрирована при изучении профилей экспрессии генов. При изучении эпигентического профиля ПМВЛ, MЛСЗ и классической лимфомы Ходжкина, варианта с нодулярным склерозом, было выявлено, что профиль MЛСЗ имеет отличительные черты при общем сходстве профилей всех этих заболеваний [Grant C, 2011; Steidl C, 2011]. Метилирование ДНК – лучший адоптированный эпигенетический маркер. Изучение метилирования ДНК помогает лучше определить факторы, влияющие на поведение опухоли, и может быть полезно не только для клинической диагностики, но и для подбора противоопухолевой терапии. Возможности получить положительные результаты в терапии гематологических опухолей и лимфопролиферативных заболеваний связаны с деацетилазой гистоновых белков и ингибиторами ДНК-метилтрансферазы. Уточнение эпигенетических характеристик лимфом может помочь обосновать применение новых терапевтических подходов с использованием деметилирующих агентов, особенно в случаях MЛСЗ, и других лимфом, плохо отвечающих на полихимиотерапию. Гипометилирование в зоне гена НОАХ5, обнаруживаемое при MЛСЗ, может свидетельствовать об уникальной роли данного гена в туморогенезе данной лимфомы. НОАХ5 ген описан как промотор лейкемической трансформации в сочетании с хромосомной транслокацией [Eberle FC, 2011]. Вовлечение в патогенезе крупноклеточных В-клеточных лимфом средостения иммунных регуляторных генов может позволить получить положительный эффект от применения иммунотерапии [Dunleavy K, 2015]. 98 Так в 3 из 11 исследованных случаев МЛСЗ была выявлена перестройка в гене CIITA при помощи FISH-исследования, а так же в 4 из 10 окрашенных ПМВЛ и в одном из 3 случаев ЛХ. Кроме того, по данным Roberts R.A. с соавт. (2006) подобные генетические нарушения ассоциированы со снижением показателей выживаемости для ПМВЛ, могут служить фактором неблагоприятного прогноза. Это подтверждается нашими данными: среди пациентов, получивших лечение на базе МНИОИ им. П.А. Герцена, троим (2 с первично-резистентным течением и 1 с рецидивом заболевания) было выполнено FISH-исследование с зондом CIITA и у всех троих выявлена перестройка в зоне этого гена. Именно общность биологических процессов, механизмов, задействованных в процессе туморогенеза, в ряде случаев обуславливают сложности, возникающие при дифференциальной диагностике в пределах изучаемой группы (схема 6.1) [Кременецкая А.М. с соавт., 2002; Артемьева А.С. с соавт., 2015; Steidl C, 2011; Dunleavy K, 2015]. 99 Рисунок 6.1. Тесные взаимоотношения между В-клеточными лимфопролиферативными заболеваниями различных групп, существование переходных форм. КЛХ – классическая лимфома Ходжкина. МЛСЗ – медиастинальная лимфома серой зоны. ПМВЛ – первичная медиастинальная крупноклеточная В-клеточная лимфома. ДВКЛ – диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома. НТЛПЛХ – нодулярный тип лимфоидного преобладания лимфомы Ходжкина. T/Г БКЛ – Диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома с большим количеством Тлимфоцитов и гистиоцитов. ЭБВ ЛПЗ – лимфопролиферативные заболевания, ассоциированные с вирусом Эпштейна-Барр Так, возникает необходимость дифференцировать ПМВЛ и ДВКЛ с первичным или преимущественным поражением средостения, т.к. ПМВЛ требует ранней интенсификации химиотерапии (в первой линии) даже при I100 II стадиях заболевания, как правило, требует лучевой терапии на зоны поражения для консолидации ремиссии. Морфологические изменения при этих двух заболеваниях могут быть аналогичны, хотя фиброз стромы при ДВКЛ встречается значительно реже. Необходимо использовать иммуногистохимический метод во всех случаях [Jaffe ES, 2009; Gualco G, 2010; Votavova H, 2010]. CD23 имеет существенное дифференциально-диагностическое значение в подобной ситуации: экпрессировался в 69% ПМВЛ и только в 1 из исследованных случаев ДВКЛ (7%). Чувствительность данного маркера составила 69%, специфичность – 93%, диагностическая значимость – 73%. Экспрессия CD10 была выявлена в 2 из 67 исследованных случаев ПМВЛ (3%), была ограничена небольшой частью опухолевых клеток, при ДВКЛ же позитивны были 43% случаев, причем экспрессия, как правило, была диффузной в большинстве клеток опухоли. Чувствительность CD10 для этих двух групп – 43%, специфичность – 99%, диагностическая значимость – 89%. Позитивная реакция с CD30 определялась только в 8% случаев ДВКЛ и в 82% при ПМВЛ (р<0,05). Антитела к мембранно-ассоциированному белку MAL показали высокую специфичность – 100%, однако чувствительность составила – 70%, а диагностическая значимость 79%. Так же полезно использовать антитела к REL/p65, ядерная экспрессия этого белка выявлялась только при ПМВЛ, в 50% случаев (чувствительность – 50%, специфичность – 100%, точность – 65%). Однако интерпретация результатов окрашивания в ряде случаев затруднена, что связано с выраженной цитоплазматической реакцией в клетках опухолей разных нозологических форм (в пределах исследованной группы). Окрашивание цитоплазмы над ядром может симулировать ядерную экспрессию данного маркера, особенно в случаях деформации материала (механической или термической при его получении). Таким образом, для 101 дифференциальной диагностики между этими двумя нозологическими единицами мы можем предложить следующий алгоритм (рис. 6.2): МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ КАРТИНА Слабо/умеренно выраженный интерстициальный фиброз, опухолевые клетки по типу центро/иммунобластов, единичные HRS-like клетки, скудный фоновый инфильтрат LCA, CD20, CD3, CD30, CD15, PAX-5 CD10, CD23 CD30 (+++) CD20 (+++), PAX-5 (+++) CD10 (+) и/или CD15 (-), CD30 (++/-), CD23(-) CD20/LCA (-/+) LCA (+++) CD10 (-) mum1 bcl2 bcl6 CD5 c-myc ДВК Л CD23 (+/-) CD15 (-/+) OCT-2 OCT-2 (++) MAL MAL (-) BOB.1 BOB.1 (++) REL/p65 p65n (-) OCT-2 (var) BOB.1 (var) MAL (+) p65n (+) HISTOLOGY!!! ПМВ Л МЛСЗ Рисунок 6.2. Алгоритм для дифференциальной диагностики между ПМВЛ и ДВКЛ. 102 При наличии морфологических изменений, характерных для крупноклеточной лимфомы с диффузным типом роста: слабо или умеренно выраженного фиброза стромы, опухолевыми клетками с характеристиками центро- и/или или иммунобластов, формирующими солидные поля, единичными более крупными клетками, напоминающими клетки Ходжкина и/или Рид-Штернберга, скудным или умеренно выраженным фоновым инфильтратом; в качестве первичной иммуногистохимической панели мы рекомендуем использовать: LCA, CD20, CD3, CD30, CD15, PAX-5, а так же CD10 и CD23, которые показали свою значимость в подобной ситуации. При интенсивной экспрессии В-линейных маркеров (CD20, PAX-5) и общего лейкоцитарного антигена (LCA), очаговой/гетерогенной экспрессии CD30 опухолевыми клетками и отсутствии реакции с CD15, именно наличие диффузной реакции с позволит CD10 в большинстве случаев классифицировать заболевание как ДВКЛ. Для уточнения подтипа (GCB- или АВС-) и биологических факторов неблагоприятного прогноза в таком случае целесообразно дополнительно исследовать такие маркеры как: mum1, bcl2, bcl6, CD5 и c-myc [Snuderl M, 2010]. При наличии же позитивной реакции с CD23, даже в единичных Ходжкино-подобных клетках, для подтверждения или исключения ПМВЛ, рекомендуется расширить панель за счет антител к белкам MAL и р65. Мембранно-цитоплазматическая или цитоплазматическая экспрессия MAL в 10% опухолевых клеток и более, и/или ядерная экспрессия белка REL/p65 характерны для ПМВЛ. При выявлении диффузной интенсивной экспрессии CD30, и/или потери экспрессии CD20/LCA в клетках опухоли, целесообразно дополнительно исследовать транскрипционные факторы В-клеток (OCT-2, BOB.1). Интенсивная диффузная экспрессия всех транскрипционных факторов: PAX-5, OCT-2 и ВОВ.1, свидетельствуют в пользу ПМВЛ. Однако во всех подобных морфологические ситуациях находки с необходимо результатами тщательно сопоставлять иммуногистохимического 103 исследования. Если полученные данные не позволяют отнести с уверенность опухоль к той или иной нозологической единице (ДВКЛ, ПМВЛ или ЛХ), при вариабельной экспрессии В-линейных маркеров, CD30 и CD15, наличии групп клеток с разной морфологией и фенотипом, высока вероятность медиастинальной лимфомы серой зоны. В ряде случаев, возникали сложности при дифференциальной диагностике ПМВЛ и классической лимфомы Ходжкина, что обычно было связано с ограниченным количеством доступного материала и/или его деформацией. В подобной ситуации иммуногистохимическое исследование оказывается очень полезно, т.к. не только позволяет различить эти две нозологические единицы, требующие различных схем химиотерапии, но и заподозрить лимфому серой зоны. Экспрессия CD30, CD15 и РАХ-5 (низкой интенсивности при сопоставлении с фоновыми В-клетками) в клетках с морфологией клеток Ходжкина и Рид-Штернберга, при отсутствии или фокальной экспрессии CD20, позволяет установить диагноз классической лимфомы Ходжкина. Интенсивное гетерогенной диффузное экспрессии окрашивание CD30 и CD20 отсутствии и CD15 PAX-5 при позволяет диагностировать ПМВЛ. Частота экспрессии CD20 и CD15 статистически достоверно различается в этих группах, р составил 0,012 и 0,019 соответственно. Транскрипционные факторы В-клеток (ОСТ-2 и ВОВ.1) интенсивно диффузно экспрессируются при ПМВЛ (100% в исследованных случаях) и выявляются только в единичных случаях ЛХ (ОСТ-2 – 15%, ВОВ.1 – 11%), коэкспрессии OCT-2 и ВОВ.1 не было выявлено ни в одном случае лимфомы Ходжкина [McCune RC, 2006]. Чувствительность транскрипционных факторов составила 100%, специфичность – 85 и 89%, а диагностическая значимость 98 и 97% для OCT-2 и BOB.1 соответственно. 104 CD23 не давал окрашивания в исследованных случаях ЛХ (р=0,017) (чувствительность – 69%, специфичность 100%, точность – 78%), а экспрессии CD15 не было выявлено в случаях ПМВЛ (р=0,019). МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ КАРТИНА Кольцевидный фиброз/ выраженный интерстициальный фиброз, HRS-клетки, смешанный фоновый инфильтрат LCA, CD20, CD3, CD30, CD15, PAX-5 CD30 (+++), CD15 (+++), PAX-5 (+) CD20/LCA (++ более 30% клеток) LCA (-) PAX-5 (+++) CD20 (-/+ менее 30% клеток) CD30 (-/+), CD15 (-) OCT-2 (-) ХЛ OCT-2, BOB.1, mum1 BOB.1 (-) mum 1 (+++) OCT-2 (++) BOB.1 (++) OCT-2 (+/-) mum1 (var) BOB.1 (+/-) МЛСЗ mum1 (var) HISTOLOGY!!! ПМВ Л Рисунок 6.3. Дифференциально-диагностический алгоритм для ПМВЛ и ЛХ. 105 Экспрессия мембранно-ассоциированного белка MAL обнаружена только в одном случае ЛХ (чувствительность 70%, специфичность – 94%, точность 78%), а ядерной экспрессии белка р65 среди исследованных случаев не было выявлено вовсе, по сравнению с его экспрессией в 50% случаев ПМВЛ (чувствительность- 50%, специфичность -100%, точность – 67%). Таким образом, для дифференциальной диагностики между этими двумя нозологическими единицами мы можем предложить следующий алгоритм (схема 6.3). При наличии цитологических) морфологических изменений характерных (гистоархитектурных для лимфомы и Ходжкина: выраженный интерстициальный или кольцевидный фиброз, нодулярные или нодулярно-диффузные скопления крупных одно- и/или двуядерных клеток по типу клеток смешанноклеточный Ходжкина и воспалительный Рид-Штернберга инфильтрат (HRS-клеток), разной степени выраженности; в качестве исходной иммуногистохимической панели мы рекомендуем использовать следующий набор антител: LCA, CD20, CD3, CD30, CD15, PAX-5. При интенсивной мембранно-цитоплазматической экспрессии в диагностических клетках CD30 и CD15, ядерной экспрессии РАХ-5 (низкой интенсивности по сравнению с фоновыми В-клетками), и отсутствии или фокальной/очаговой экспрессией CD20 (менее 30% клеток) низкой интенсивности, может быть установлен диагноз лимфомы Ходжкина. Если же CD20 позитивен в 30% диагностических клеток и более, окрашивание интенсивное, кроме того выявляется позитивная реакция LCA, и/или ядерная экспрессия РАХ-5, по интенсивности сопоставимая с фоновыми В-лимфоцитами, либо экспрессия CD30 слабая и/или фокальная, а CD15 отрицателен, необходимо дополнительно использовать OCT-2, BOB.1 и mum1. Mum1 не имеет определяющего дифференциально- диагностического значения, однако, по литературным данным и в исследованной нами группе интенсивно экспрессируется (3+) во всех случаях 106 лимфомы Ходжкина, при других лимфомах его экспрессия вариабельна, а при ПМВЛ может иметь определенное прогностическое значение (экспрессия 3+ была выявлена во всех случаях первично-резистентного течения заболевания и рецидивах в группе больных получавших ПХТ по схеме MACOP-B±R на базе МНИОИ им. П.А. Герцена) [DeMello C.A., 2011]. Интенсивная экспрессия mum1 (3+) была выявлена в 53% исследованных случаев ПМВЛ, но не все из них отличались более агрессивным течением, хотя во многих случаях данные катамнеза были недоступны (возможно развитие рецидива), т.е. прогностическая значимость этого маркера требует дополнительного изучения. Таким образом, при отсутствии экспрессии OCT-2 и BOB.1, или позитивной реакции только с одним из маркеров, и интенсивной экспрессии mum1 (3+), более вероятен диагноз лимфомы Ходжкина. Если же оба маркера диффузно и интенсивно окрашивают диагностические клетки, а экспрессия mum1 вариабельна, более вероятен диагноз ПМВЛ (в такой ситуации для повышения достоверности диагноза так же дополнительно может быть исследованы антитела к MAL и/или р65). Однако, по данным Hsi E.D. с соавт. (2005), экспрессия белка MAL может выявляться при ЛХ до 18% случаев, является косвенным индикатором плохого прогноза. При вариабельной экспрессии OCT-2, BOB.1 и mum1, наличии синцитиальных структур и солидных полей опухолевых клеток, в том числе более монотонных и меньшего размера, чем классические HRS-клетки, выраженная экспрессия CD20, и любые другие характеристики, не позволяющие отнести опухоль к определенной нозологической форме (ПМВЛ или ЛХ), свидетельствуют о высокой вероятности медиастинальной лимфомы серой зоны, высокой вероятности неблагоприятного клинического течения. В целом в результате проведенной научно-исследовательской работы на большом клиническом материале достигнута цель исследования и 107 выполнены поставленные задачи, на основе полученных результатов сформулированы следующие выводы. ВЫВОДЫ 1. Выделено 5 морфо-фенотипических вариантов медиастинальной лимфомы серой зоны: Ходжкино-подобный вариант; вариант, напоминающий первичную медиастинальную крупноклеточную В-клеточную лимфому (ПМВЛ-подобный); смешанный вариант; двухкомпонентный (композитный) вариант; метахронный. 2. Сложность прецизионной диагностики медиастинальной лимфомы серой зоны обусловлена высокой частотой композитного строения (наличие зон с морфологическими признаками лимфомы Ходжкина и первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомы в разных участках опухолевого узла) в 27% случаев, которая и диктует необходимость исследования разных участков образования. В 2% случаев объем материала, получаемый при трепан-биопсии, не позволил в полной мере оценить гистоархитектонику опухоли. Адекватный для диагноза материал был получен при инцизионной биопсии, субтотальном или тотальном удалении опухоли. 3. При дифференциальной диагностике первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомы и диффузной крупноклеточной Вклеточной лимфомы эффективно использование комбинации антител к CD10 и CD23 (чувствительность комбинации – 72%, специфичность 93%, точность – 77%), антител к мембранно-ассоциированному белку MAL (чувствительность 70%, специфичность 94-100%, диагностическая точность 78-79%) и выявление ядерной экспрессии белка REL/p65 (чувствительность – 50%, специфичность 100%, точность – 67%). 4. Применение транскрипционных факторов В-клеток (BOB.1, OCT-2) облегчает дифференциальную диагностику между первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомой и лимфомой Ходжкина (чувствительность – 100%, специфичность 85-89%, точность – 9798%). 5. Использование интенсифицированного режима индукционной химиотерапии по схеме MACOP-B+R при первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфоме позволяет улучшить долгосрочные 108 результаты (3-летняя БСВ составила 75%, ОВ - 90%; 5-летняя БСВ составила 69%, ОВ – 90%). 6. Алгоритм дифференциальной диагностики лимфом средостения должен быть многоступенчатым и включать в себя рутинное гистологическое исследование, основную панель на первом этапе и затем - расширенную панель для уточнения нозологической формы. Разработанный диагностический алгоритм позволяет определить оптимальную схему химиотерапии. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. При дифференциальной диагностике первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомы крупноклеточной В-клеточной лимфомы и диффузной исходная панель антител должна включать: LCA, CD20, CD3, СD30, PAX-5, CD10, Ki67 и CD23. 2. При дифференциальной диагностике первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомы и лимфомы Ходжкина исходная иммуногистохимическая панель должна включать: LCA, CD20, CD3, CD30, CD15, PAX-5. 3. Во всех неоднозначных случаях панель должна быть расширена за счет транскрипционных факторов В-клеток (OCT-2, BOB.1), CD10, CD23, MAL, p65, mum1, в зависимость от исходно использованного набора антител. 4. Для подтверждения диагноза первичной медиастинальной крупноклеточной В-клеточной лимфомы целесообразно использовать антитела к белкам MAL и р65. 5. При установлении диагноза диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы иммуногистохимическая панель должна быть расширена: CD5, bcl2, bcl6, mum1 и c-myc, для уточнения подтипа (в соответствии с Hans-algorithm) и определения факторов прогноза. 109 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ (к)ЛХ – (классическая) лимфома Ходжкина ABC (ДВКЛ) – activated B-cells – вариант ДВКЛ из активированных клеток BCR – B-cell receptor – В-клеточный рецептор EBV – Epstein-Barr virus – вирус Эпштейна-Барр EDTA – этилен-диамин-тетраацетат буфер с высоким значением pH (9,0) FISH – fluorescence in situ hybridization – in situ гибридизация с флуоресцентной меткой GCB (ДВКЛ) – germinal B-cells – герминальноклеточный вариант ДВКЛ HRS/RS – Hodgkin-Reed-Sternberg / Reed-Sternberg – Ходжкина-РидШтернберга (клетки) IPI / aaIPI – international prognostic index / age adopted IPI – международный прогностический индекс / возраст-адоптированный LP – клетки лимфоидного преобладания диагностические клетки при NLPHL LRcHL – классическая лимфома Ходжкина с большим количеством лимфоцитов MCcHL – смешанноклеточный вариант классической лимфомы Ходжкина NLPHL – нодулярный тип лимфоидного преобладания лимфомы Ходжкина NScHL – нодулярный склероз классической лимфомы Ходжкина REAL – The Revised European Americal Lymphoma classification – классификация опухолей лимфоидной ткани TBS – tris-buffered saline – промывочный солевой буфер Ауто-ТСКК – аутологичная трансплантация стволовых кроветворных клеток БРВ (PFS) – безрецидивная выживаемость (progression free survival) БСВ (EFS) – бессобытийная выживаемость (event free survival) 110 ДВКЛ – диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома МЛСЗ – медиастинальная лимфома серой зоны ОВ (OS) – общая выживаемость (overall survival) ПМВЛ – первичная медиастинальная крупноклеточная В-клеточная лимфома Список литературы: 1. В-клеточные лимфомы средостения из крупных клеток / Артемьева А.С., Семиглазова Т.Ю., Франк Г.А. // Вопр. онкологии. - 2015. – Т.61, №2. – С. 280-8. 2. Возможности диагностики и лечения тромботических осложнений В-клеточной медиастинальной лимфосаркомы / Франк Г.А., Шулутко Е.М., Васильев С.А. и др. // Терархив. – 2004. - №7. – С. 50-54. 3. Гигантоклеточные лимфосаркомы или вариантные формы лимфогранулематоза? / Кременецкая А.М., Воробьев И.А., Каразишвили Д.В. и др. // Терархив. – 2002. - №7. – С. 48-52. 4. Клинико-иммунологические особенности лимфом с первичным поражением средостения / Мазурок Л.А. // Автореферат канд. диссертации. 2006. 5. Лечение больных первичной медиастинальной В-клеточной лимфосаркомой со склерозом программами первой линии / Джумабаева Б.Т., Пивник А.В., Капланская И.Б. и др.// Гематология и трансфузиология. – 2001. - №6. – С. 10-14. 6. Лечение больных первичной медиастинальной В-клеточной лимфосаркомой со склерозом программами первой линии / Кременецкая А.М., Пивник А.В., Куликов С.М. и др. // Гематология и трансфузиология. – 2001. - №6. – С. 10-14. 7. Морфологические, морфометрические и иммунофенотипические характеристики первичной медиастинальной В-клеточной лимфосаркомы / Джумабаева Б.Т., Воробьев И.А., Капланская И.Б. и др. // Терархив. - 2003. №7. – С. 34-38. 111 8. Опыт лечения первичной медиастинальной В-крупноклеточной лимфомы / Вернюк М.А., Тюрина Н.Г., Павлова О.А., Червонцева А.М., Жуков Н.В. // Онкогематология. – 2013. - №4. – С. 18-23. 9. Первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома / Мазурок Л.А., Коломейцев О.А., Тумян Г.С. и др. // Онкогематология. – 2007. - №2. – С. 16-23. 10. Первичная медиастинальная В-крупноклеточная диагностика, клиническая картина и лечение / лимфома: Г.С., Ковригина А.М., Кичигина М.Ю. и др. // Онкогематология. – 2008. – Т.10, №3. – С. 26-29. 11. Подходы к лечению первичной медиастинальной В- крупноклеточной лимфомы / Тюрина Н.Г., Вернюк М.А., Павлова О.А. // Гематол. и транфузиол. – 2014. - Т. 59, №2. – С. 50-56. 12. Пример успешной мобилизации стволовых кроветворных клеток периферической крови с помощью плериксафора и пэгфилграстима у пациентки с неходжкинской лимфомой / Моталкина М.С., Кулева С.А., Алексеев С.М., Зюзгин И.С., Филатова Л.В., Жабина А.С., Зверькова А.А., Ишматова И.В., Рязанкина А.А., Артемьева А.С., Семиглазова Т.Ю. // Современная онкология. – 2015. – Т.17, №2: - С. 16-19. 13. Российские клинические рекомендации по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний / Поддубная И.В., Савченко В.Г. // Современная онкология. - М.: Медиа Медика, 2013. – 104 с. 14. Сочетание первичной медиастинальной В-клеточной лимфосаркомы с врожденной аномалией сосудов средостения / Кременецкая А.М., Готман Л.И., Джумабаева Б.Т. // Гематология и трансфузиология. – 2007. - №5. – С. 55-56. 15. Сравнительный анализ эффективности терапии первичной медиастинальной В-клеточной лимфосаркомы программами 1,2 и 3-й генерации / Франк Г.А., Кременецкая А.М., Пивник А.В. и др. // Гематол. и трансфузиол. - 2003. - №4. – С. 11-13. 112 16. Эффективность различных программ химиотерапии, показания для хирургического и лучевого лечения при первичной медиастинальной Вклеточной лимфосаркоме / Джумабаева Б.Т., Кременцкая А.М., Готман Л.И. и др. // Терархив. – 2005. – Т.77, №8. – С. 78-81. 17. Эффективность различных программ химиотерапии, показания к хирургическому лечению и лучевой терапии при первичной медиастинальной В-клеточной лимфосаркоме / Франк Г.А., Кременецкая А.М., Гемджян Э.Г. и др. // Терархив. – 2005. - №8. – С. 78-81. 18. A new immunostain algorithm classifies diffuse large B-cell lymphoma into molecular subtypes with high accuracy / Choi WW, Weisenburger DD, Greiner TC et al. // Clin Cancer Res. – 2009. –Vol 15(17). – P. 5494-502. 19. A revised European-American classification of lymphoid neoplasms: a proposal from the International Lymphoma Study Group / Harris NL, Jaffe ES, Stein H, et al. // Blood.- 1994. – Vol. 84. P. 1361–1392. 20. Advances in biology, diagnostics and treatment of Hodgkin’s disease / Kuppers R, Yahalom J, Josting A. // Biol Blood Marrow Transplant. – 2006. – Vol. 12 (suppl 1). – P. 66-76. 21. B-cell lymphomas with concurrent IGH-BCL2 and MYC rearrangements are aggressive neoplasms with clinical and pathologic features distinct from Burkitt lymphoma and diffuse large B-cell lymphoma / Snuderl M, Kolman OK, Chen YB, et al. // Am J Surg Pathol. – 2010. – Vol. 34(3). – P. 32740. 22. B-cell lymphomas with features intermediate between distinct pathologic entities: from pathogenesis to pathology / Carbone A, Gloghini A, Aiello A, et al. // Hum Pathol. – 2010. - Vol 41(5). – P. 621-31. 23. Biallelic mutation of SOCS-1 impairs JAK2 degradation and sustains phospho-JAK2 action in the MedB-1 mediastinal lymphoma line / Melzner I, Bucur AJ, Bruderlein S, et al. // Blood. – 2005. – Vol. 105. – P. 2535–2542. 113 24. Biology of Hofgkin’s lymphoma / Kuppers R, Schwering I, Rajewsky K, Hansmann ML. // Ann Oncol. – 2002. – Vol. 13(suppl 1). – P. 11-8. 25. Chromosomal breakpoints affecting immunoglobulin loci are recurrent in Hodgkin and Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma / Martin-Subero JI, Klapper W, Sotnikova A, Frank GA, et al. // Cancer Res. – 2006. – Vol. 66(21). – P. 10332-8. 26. Clinical, pathological and genetic features of primary mediastinal large B-cell lymphomas and mediastinal gray zone lymphomas in children / Oschlies I, Burkhardt B, Rosenwald A et al. // Haematologica. – 2011. – Vol. 96(2). – P. 262-8. 27. Composite lymphoma in the anterior mediastinum: a case report and review of the literature / Guahua Yu, Lingling Kong, Guimei Qu et al. // Diagn Pathol. – 2011. – Vol. 6. – P. 60-69 28. Constitutive STAT6 activation in primary mediastinal large B-cell lymphoma / Guiter C, Dusanter-Fourt I, Copie-Bergman C, et al. // Blood. – 2004. – Vol. 104. – P. 543–549. 29. Diagnostic and prognostic significance of gene expression profiling in lymphomas / Leich E, Hartmann ME, Burek C, et al. // APMIS. – 2007. – Vol. 115. – P. 1135-1146. 30. Distinguishing of primary mediastinal B-cell lymphoma and diffuse large B-cell lymphoma using real-time quantitative polymerase chain reaction / Votavova H, Forsterova K, Campr V et al. // Neoplasma. – 2010. – Vol. 57(5). – P. 449-54. 31. Emerging biological insights and novel treatment strategies in primary mediastinal large B-cell lymphoma / Dunleavy K, Steidl C. // Semin Hematol. – 2015. – Vol. 52(2). – P. 119-25. 32. Epidemiology of Hodgkin’s disease: a review / Cartwright RA, Watkins G. // Hematol Oncol. – 2004. – Vol. 22(1). – P. 11-26. 33. Expression profiling of transcription factors Pax-5, Oct-1, Oct-2, BOB.1, and PU.1 in Hodgkin’s and non-Hodgkin’s lymphomas: a comparative 114 study using high throughput tissue microarrays / RC, Syrbu SI, Vasef MA. // Mod Pathol. – 2006. – Vol. 19(7). – P. 1010-8. 34. Favorable outcome of primary mediastinal large B-cell lymphoma in a single institution: the British Columbia experience / Savage KJ, Al-Rajhi N, Voss N, et al. // Ann Oncol. – 2006. – Vol. 17. – P. 123–130. 35. Frequent expression of B-cell-specific activator protein in Reed- Sternberg cells of classical Hodgkin’s disease provide further evidence for its Bcell origin / Foss HD, Reusch R, Demel G, et al. // Blood. – 1999. –Vol. 94(9). – P. 1308-13. 36. Frequent occurrence of deletions in primary mediastinal B-cell lymphoma / Kimm LR, deLeeuw RJ, Savage KJ, et al. // Genes Chromosomes Cancer. – 2007. – Vol. 46. – P. 1090–1097. 37. Gain of chromosome arm 9p is characteristic of primary mediastinal B-cell lymphoma (MBL): comprehensive molecular cytogenetic analysis and presentation of a novel MBL cell line / Bentz M, Barth TF, Bruderlein S, et al. // Genes Chromosomes Cancer. – 2001. – Vol. 30. –P. 393–401. 38. Gains of the proto-oncogene BCL11A and nuclear accumulation of BCL11A(XL) protein are frequent in primary mediastinal B-cell lymphoma / Weniger MA, Pulford K, Gesk S, et al. // Leukemia. – 2006. – Vol. 20. – P. 1880– 1882. 39. Gene expression profiling of diffuse large B-cell lymphoma / Rosenwald A, Staudt LM. // LeukLymphoma. – 2003. – Vol. 44. – P. 41-47. 40. Genomic alterations underlying immune privilege in malignant lymphomas / Mottok A, Steidl C. // Curr Opin Hematol. – 2015. – Vol. 22(40). P. 343-54. 41. Genomic profiling using array comparative genomic hybridization define distinct subtypes of diffuse large B-cell lymphoma: a review of the literature / Tirado CA, Chen W, Garcia R, et al. // J Hematol Oncol. – 2012. – Vol. 5. – P. 54. 115 42. Gray zone lymphoma with features intermediate between classical Hodgkin lymphoma and diffuse large B-cell lymphoma: characteristics, outcomes and prognostication among a large multicenter cohort / Evens AM, Kanakry JA, Sehn LH et al. // Am J Hematol. – 2015. - Jun 4. 43. Gray zone lymphoma: chromosomal aberrations with immunophenotypic and clinical correlations / Eberle FC, Salaverria I, Steidl C et al. // Mod Pathol. – 2011. – Vol. 24(12). – P. 1586-97. 44. Gray zone lymphoma: better treated like Hodgkin lymphoma or mediastinal large B-cell lymphoma? / Dunleavy K, Grant C, Eberle FC, et al. // Curr Hematol Maliq Rep. – 2012. – Vol. 7(3). – P. 241-7. 45. Gray zone, synchronous, and metachronous lymphomas: disease in the interface of non-Hodgkin’s lymphomas and Hodgkin’s lymphoma. In: Mauch PM, Armitage JO, Coiffier B, et al. editors. Non-Hodgkin’s lymphoma / Jaffe ES, Wilson WH. // Philadelphia, PA: Lippincott, Williams, and Wilkins. - 2004. – P. 69-80. 46. Hodgkin lymphoma: an update on its biology with newer insights into classification / Mani H, Jaffe E.S. // Clin Lymphoma Myeloma. – 2009. – Vol. 9(3). – P. 206-216. 47. Hodgkin lymphoma: pathology, pathogenesis, and a plethora of potential prognostic predictors / King RL, Howard MT, Bagg A. // Adv Anat Pathol. – 2014. – Vol. 21. – P. 12-25. 48. Increased risk of venous thromboembolism in patients with primary mediastinal large B-cell lymphoma / Lekovic D, Miliic P, Mihalievic B. // TrombRes. – 2010. – Vol. 126(6). – P. 477-80. 49. Induction chemotherapy strategies for primary mediastinal large B- cell lymphoma with sclerosis: a retrospective multinational study on 426 previously untreated patients / Zinzani PL, Martelli M, Bertini M, et al. // Haematologica. – 2002. – Vol. 87. – P. 1258–1264. 50. Integrative analysis reveals selective 9p24.1 amplification, increased PD-1 ligand expression, and further induction via JAK2 in nodular sclerosing 116 Hodgkinlymphoma and primary mediastinal large B-cell lymphoma / Green MR, Monty S, Rodiq SJ et al. // Blood. – 2010. – Vol. 116(17). – P. 3268-77. 51. Interleukin 4-induced gene 1 is activated in primary mediastinal large B-cell lymphoma / Copie-Bergman C, Boulland ML, Dehoulle C, et al. // Blood. – 2003. – Vol. 101. – P. 2756–2761. 52. Introduction of combined CHOP plus rituximab therapy dramatically improved outcome of diffuse large B-cell lymphoma in British Columbia / Sehn LH, Donaldson J, Chhanabhai M, et al. // J Clin Oncol. – 2005. – Vol. 23. – P. 5027–5033. 53. Jaffe ES / Hematopathology / Jaffe ES, Harris NL, Vardiman JW, et al. editors. - 2011. 54. Jaffe ES. The 2008 WHO classification of lymphomas: implications for clinical practice and translational research. // Hematology Am Soc Hematol Educ Program. – 2009. – P. 523-31. 55. Large cell lymphoma of the mediastinum: a B-cell tumour of probable thymic origin / Addis BJ, Isaacson PG. // Histopathology. – 1986. – Vol. 10. – P. 379–390. 56. Loss of major histocompatibility class II gene and protein expression in primary mediastinal large B-cell lymphoma is highly coordinated and related to poor patient survival / Roberts RA, Wright G, Rosenwald AR, et al. // Blood. – 2006. – Vol. 108. – P. 311–318. 57. MAL expression in lymphoid cells: further evidence for MAL as a distinct molecular marker of primary mediastinal large B-cell lymphomas / CopieBergman C, Plonquet A, Alonso MA, et al. // Mod Pathol. – 2002. – Vol. 15. – P. 1172–1180. 58. MAL is expressed in a subset of Hodgkin lymphoma and identifies a population of patients with poor prognosis / Hsi ED, Sup SJ, Alemany C, et al. // Am J Clin Pathol. – 2005. – Vol. 125(5). – P. 776-82. 59. Mediastinal gray zone lymphoma: the missing link between classic Hodgkin’s lymphoma and mediastinal large B-cell lymphoma / Traverse-Glehen 117 A, Pittaluga S, Gaulard P et al. // Am J Surg Pathol. – 2005. – Vol. 29. – P. 14111421. 60. Mediastinal large B-cell lymphoma: new evidence in support of its distinctive identity / Chan John K.C. // Advances in Anatomic Pathology. – 2000. Vol 7(4). – P. 201-209. 61. Mediastinal large-cell lymphoma of B-type, with sclerosis: histopathological and immunohistochemical study of eight cases / Menestrina F, Chilosi M, Bonetti F, et al. // Histopathology. – 1986. – Vol. 10. – P. 589–600. 62. Methylation profiling of mediastinal gray zone lymphoma reveals a distinctive signature with elements shared by classical Hodgkin’s lymphoma and primary mediastinal large B-cell lymphoma / Eberle F.C., Jamine RodriguezCanales, Lai Wei et al. // Haematologica. – 2011. – Vol. 96(4). – P. 558-566. 63. Molecular classification, pathway addiction, and therapeutic targeting in diffuse large B-cell lymphoma / Puvvada S, Kendrick S, Rimsza L. // Cancer Genetics. – 2013. – Vol. 206. – P. 257-265. 64. Molecular diagnosis of primary mediastinal B cell lymphoma identifies a clinically favorable subgroup of diffuse large B cell lymphoma related to Hodgkin lymphoma / Rosenwald A, Wright G, Leroy K, et al. // J Exp Med. – 2003. – Vol. 198. – P. 851–862. 65. NFkappaB activity, function, and target-gene signatures in primary mediastinal large B-cell lymphoma and diffuse large B-cell lymphoma subtypes / Feuerhake F, Kutok JL, Monti S, et al. // Blood. – 2005. – Vol. 106. – P. 1392– 1399. 66. Pathobiology of classical Hodgkin lymphoma / Tzankov A, Dirnhofer S. // Pathobiology. – 2006. – Vol. 73(3). – P. 107-25. 67. Primary madiastinal large B-cell lymphoma: immunohistochemical features and differential diagnostics / Artemyeva A, Frank G. // Virchov Archiv. – 2013. Vol. 463. – P. 136. 68. Primary Mediastinal (Thymic) large B-Cell lymphoma: a short review with brief discussion of mediastinal gray zone lymphoma / Charles Blake 118 Hutchinson and Endi Wang. // Archives of Pathology & Laboratory Medicine. – 2011. - Vol. 135 (3). – P. 394-398. 69. Primary mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma: a short review with brief discussion of mediastinal gray zone lymphoma / Hutchinson CB, Wang E. // Archives of pathology & laboratory medicine. – 2011. – Vol. 135(3). – P. 394-398. 70. Primary mediastinal B-cell lymphoma / Maurizio Matrtelli, Andres J.M. Ferreri, Peter Johonson. // Haematology. – 2008. – Vol. 68(3). – P. 256-63. 71. Primary mediastinal B-cell lymphoma / Peter W.M. Johnson and Andrew J. Davies. // Haematology Am Soc Hematol Program. – 2008. – P. 349-58. 72. Primary mediastinal B-cell lymphoma and mediastinal gray zone lymphoma: do they require a unique therapeutic approach? / Dunleavy K., Wilson W.H. // Blood. – 2015. - Vol. 125, №1. – P. 33-39. 73. Primary mediastinal B-cell lymphoma treated CHOP-like chemotherapy with or without rituximab: results of the Mabthera international trial group study / Rieger M, Osterborg A, Pettengell R et al. // Ann Oncol. – 2011. – Vol. 22(3). – P. 664-70. 74. Primary mediastinal B-cell lymphoma: a review of pathology and management / van Besien K, Kelta M, Bahaguna P. // J Clin Oncol. – 2001. – Vol. 19. – P. 1855–1864. 75. Primary mediastinal B-cell lymphoma: high frequency of BCL-6 mutations and consistent expression of the transcription factors OCT-2, BOB.1, and PU.1 in the absence of immunoglobulins / Pileri SA, Gaidano G, Zinzani PL, et al. // Am J Pathol. – 2003. – Vol. 162. – P. 243–253. 76. Primary mediastinal DLBCL: evolving biologic understanding and therapeutic strategies / Zinzani PL, Piccaluga PP. // Curr Oncol Rep. – 2011. – Vol. 13(5). – P. 407-15. 77. Primary mediastinal large B-cell lymphoma / Savage K.J. // Oncologist. – 2006. – Vol. 11(5). – P. 488-95. 119 78. Primary mediastinal large B-cell lymphoma in (PMLBCL) in Chinese patients: clinical characteristics and prognostic factors / Zhu YJ, Huang JJ, Xia Y et al. // Int J Hematol. – 2011. – Vol. 94(2). – P. 178-84. 79. Primary mediastinal large B-cell lymphoma with sclerosis: a clinical study of 89 patients treated with MACOP-B chemotherapy and radiation therapy / Zinzani PL, Martelli M, Bendandi M, et al. // Haematologica. – 2001. – Vol. 86. – P. 187–191. 80. Primary mediastinal large B-cell lymphoma, classic Hodgkin lymphoma presenting in the mediastinum, and mediastinal gray zone lymphoma: what is the oncologist to do? / Grant C, Dunleavy K, Eberle FC et al. // Curr Hematol Malig Rep. – 2011. – Vol. 6(3). – P. 157-63. 81. Primary mediastinal large B-cell lymphoma: a clinicopathologic study of 43 patients from the Nebraska Lymphoma Study Group / Abou-Elella AA, Weisenburger DD, Vose JM, et al. // J Clin Oncol. – 1999. –Vol.17. – Р. 784–790. 82. Primary mediastinal large B-cell lymphoma: optimal therapy and prognostic factors in 41 consecutive Asian patients / Tai WM, Quah D, Yap SP et al. // Leuk lymphoma. – 2011. – Vol. 52(4). – P. 604-12. 83. Primary mediastinal large B-cell lymphoma: the need for prospective controlled clinical trials / Bieri S, Roggero E, Zucca E et al. // Leuk Lymphoma. – 1999. – Vol. 35(5-6). - P. 537-44. 84. Primary mediastinal lymphoma in adults / Lichtenstein AK, Levine A, Taylor SR, et al. // Am J Med. – 1980. – Vol. 68(4). – P. 509-14. 85. Primary mediastinal lymphoma: diagnosis and treatment options / Martelli M, Di Rocco A, Russo E et al. // Expert Rev Hematol. – 2015. – Vol. 8(2). – P. 173-86. 86. Prognostic impact of MUM1 expression by immunohistochemistry on primary mediastinal large B-cell lymphoma / De Mello CA, De Andrade VP, De Lima VC et al. // Leuk Lymphoma. – 2011. – Vol. 52(8). – P. 1495-503. 87. Recommendations for initial evaluation, staging, and response assessment of Hodgkin and non-Hodgkin lymphoma: the Lugano classification / 120 Cheson BD, Fisher RJ, Barringtori SF et al. // J. Clin Oncol. – 2014. – Vol. 32. – P. 3059-67. 88. Reprogramming of the tumour B-cell phenotype in Hodgkin lymphoma / Kuppers R, Brauninger A. // Trends in Immunology. – 2006. – Vol. 27(5). – P. 203-5. 89. Staging non-Hodgkin lymphoma / Armitage J.O. // CA Cancer J Clin. – 2005. – Vol. 55. – P. 368-376. 90. Standard CHOP immune-chemotherapy for primary mediastinal lymphomas / Schneider T, Tóth E, Lovey J et al. // Ory Hetil. – 2011. – Vol. 152(19). – P. 735-42. 91. T-cell leukemia 1 expression in nodal Epstein-Barr virus-negative diffuse large B-cell lymphoma and primary mediastinal B-cell lymphoma / Gualco G, Weiss LM, Barber GN, Bacchi CE. // Hum Pathol. – 2010. – Vol. 41(9). – P. 1238-44. 92. The B-cell transcription factors BSAP, Oct-2 and BOB.1, and the pan- B-cell markers CD20, CD22, and CD79a are useful in the differential diagnosis of classic Hodgkin lymphoma / Browne P, Petrosyan K, Hermandez A, Chan JA. // Am J Clin Pathol. – 2003. – Vol 120(5). – P. 767-77. 93. The histological classification of diffuse large B-cell lymphomas / Xia Y, Pittaluga S, Jaffe ES. // Semin Hematol. – 2015. – Vol. 52(2). – P. 57-66. 94. The interrelationship of Hodgkin’s disease and non-Hodgkin’s lymphpomas – lessons learned from composite and sequential malignancies / Jaffe ES, Zarate OA, Medeiros LJ. // Semin Diagn Pathol. – 1992. – Vol. 9(4). – P. 297303. 95. The MAL gene is expressed in primary mediastinal large B-cell lymphoma / Copie-Bergman C, Gaulard P, Maouche-Chretien L, et al. // Blood. – 1999. – Vol. 94. – P. 3567-75. 96. The molecular pathogenesis of primary mediastinal large B-cell lymphoma / Steidl C, Gascoyne RD. // Blood. – 2011. – Vol. 118(10). – P. 265969. 121 97. The molecular signature of mediastinal large B-cell lymphoma differs from that of other diffuse large B-cell lymphomas and shares features with classical Hodgkin lymphoma / Savage KJ, Monti S, Kutok JL, et al. // Blood. – 2003. – Vol. 102. – P. 3871–3879. 98. Transcription factor B-cell-specific activator protein (BSAP) is differentially expressed in B cells and in subsets of B-cell lymphomas / Krenacs L, Himmelmann AW, Quintanilla-Martinez L, et al. // Blood. – 1998. – Vol. 92(4). – P. 1308-16. 99. Two cases of mediastinal gray zone lymphoma / Jiro Minami, Nobuaki Dobashi, Osamu Asai et al. // J Clin Exp Hematopathol. – 2010. - Vol. 50,№2. – P. 143-149. 100. Two cases of mediastinal gray zone lymphoma / Minami J., Dobashi N., Asai O., et al. // Clin Exp Hematopathol. – 2010. - Vol. 50, №2. – P. 143-149. 101. World Health Organization Classification of Tumors of Haematopoietic and Lymphoid Tissues / Swerdlow S.H., Elias Campo, Nancy Lee Harris, Jaffe E.S. (eds). // International Agency for Research on Cancer. – Lyon. – 2008. 102. World Health Organization Classification of Tumors. Pathology and Genetics of Tumors of the Lung, Pleura, Thymus and Heart / Travis W.D., Elizabeth Brambilla, Muller-Hermelink H.K. and Harris C.C. // Lyon. - IARC Press. - 2004. 103. World health organization classification of tumours: pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues / Jaffe ES, Harris NL, Stein H. // IARC Press. – Lyon. – 2001. 104. Клинические рекомендации ESMO по диагностике, лечению и наблюдению при лимфоме Ходжкина / Engert A., Eichenauer D.A., Dreyling M. // Москва. - 2010. 105. Клинические рекомендации ESMO по диагностике, лечению и наблюдению при первично диагностированных и рецидивных диффузных Вкрупноклеточных лимфомах / Tilly H., Dreyling M. // Москва. – 2010. 122 123
