Инсулин ультрачувствительный (Mercodia Ultrasensitive Insulin
реклама
Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA, Mercodia AB 1 _____________________________________________________________________________________________________ Регистрационное удостоверение №ФСЗ 2010/06182 от 02.02.2010 года. Инсулин ультрачувствительный (Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA) Номер по каталогу: 10-1132-01 Набор рассчитан на 96 определений НАЗНАЧЕНИЕ Тест Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA предназначен для количественного определения инсулина в сыворотке и плазме крови. ВВЕДЕНИЕ Инсулин — основной гормон, контролирующим метаболизм глюкозы. Он синтезируется в β-клетках островков Лангерганса в виде предшественника, проинсулина, из которого при расщеплении образуется Спептид и инсулин. И тот и другой секретируются в эквимолярных количествах в портальный кровоток. Молекула инсулина состоит из двух полипептидных цепей - А-цепи и В-цепи (21 и 30 аминокислотных остатков, соответственно). Обе цепи связаны между собой двумя межцепочечными дисульфидными мостиками. Внутри А-цепи также имеется один дисульфидный мостик. Секреция инсулина контролируется в основном концентрацией глюкозы в плазме; гормон оказывает множество метаболических эффектов. Основная функция инсулина – регуляция поступления и утилизации глюкозы в периферических тканях, эта функция осуществляется с помощью специальных белковпереносчиков глюкозы. Этой и другим гипогликемическим активностям инсулина, таким как ингибирование глюконеогенеза и глюкогенолиза в печени, противодействуют эффекты гипергликемических гормонов, включая глюкагон, эпинефрин (адреналин), гормон роста и кортизол. Концентрация инсулина значительно снижена при инсулинзависимом сахарном диабете (IDDM) и при некоторых других состояниях, таких как гипопитуитаризм. Уровень инсулина возрастает при инсулиннезависимом сахарном диабете (NIDDM), ожирении, инсулиноме и некоторых эндокринных дисфункциях, таких как синдром Кушинга и акромегалия. ПРИНЦИП МЕТОДА Тест Ultrasensitive Insulin ELISA представляет собой твердофазный двухстадийный иммуноферментный анализ. В основе метода лежит прямой “сэндвич”-ИФА, в котором два вида моноклональных антител направлены на различные антигенные детерминанты молекулы инсулина. Во время инкубации присутствующий в образце инсулин реагирует с антителами к инсулину, конъюгированными с пероксидазой хрена, и одновременно - с антителами к инсулину, иммобилизированными в лунках микропланшета. Промывка удаляет не связавшиеся антитела, меченные ферментом. Детекцию связавшегося конъюгата осуществляют по его реакции с ферментным субстратом 3,3’,5,5’-тетраметилбензидином. Реакцию останавливают добавлением кислоты, чтобы получить колориметрическую конечную точку для измерения оптической плотности (ОП) на спектрофотометре. ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЯ • Набор предназначен для диагностического использования in vitro. • Не допускайте возможности контакта жвачных животных или свиней с содержимым данного набора, а также отходами от его использования. • Стоп-реагент содержит 0,5 М H2SO4. Соблюдайте необходимые меры предосторожности при использовании химически опасных реагентов. • Обращайтесь со всеми образцами пациентов как с возможными источниками инфицирования. Необходимое оборудование и материалы, не входящие в состав набора • Микропипетка со сменными наконечниками, рассчитанная на объем 25, 50, 100, 200 и 1000 мкл (для внесения ферментного конъюгата, субстрата ТМБ и стоп-реагента рекомендуется использовать многоканальные пипетки). • Лабораторная посуда для приготовления реагентов. • Бидистиллированная вода. • Планшетный спектрофотометр, снабженный фильтром на 450 нм. • Шейкер для планшетов (рекомендуемая скорость орбитального вращения 700-900 циклов в минуту). • Устройство для промывки микропланшетов. _____________________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA, Mercodia AB 2 _____________________________________________________________________________________________________ МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ Каждый набор Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA (10-1132-01) содержит реагенты в достаточном количестве для параллельного анализа в 96 лунках 42 образцов и построения одной калибровочной кривой (в дубликатах). Для большой серии определений можно объединять реагенты из нескольких наборов с одним и тем же номером лота. Срок годности всего набора указан на наружной этикетке. Рекомендуемая температура хранения +2-8 °С. 1 планшет 96 лунок Готов к использованию Калибраторы 1, 2, 3, 4, 5, желтого цвета, концентрация указана на этикетках флаконов (рекомбинантный инсулин человека) 5 флаконов по 1,0 мл Готовы к использованию Нулевой калибратор (желтого цвета) 1 флакон 5 мл Готов к использованию Концентрат ферментного конъюгата 11Х (мышиные моноклональные антитела к инсулину, конъюгированные с пероксидазой) 1 флакон 1,2 мл Приготовление см. ниже Буфер для ферментного конъюгата (синего цвета) 1 флакон 12 мл Готов к использованию Концентрат промывочного буфера 21Х 1 бутылка 50 мл Для приготовления промывочного буфера добавьте 1000 мл бидистиллированной воды. После разведения хранить при +2-8 °С в течение 8 недель. Субстрат ТМБ Бесцветный раствор Внимание! Чувствителен к свету! 1 флакон 22 мл Готов к использованию Стоп-реагент 0,5 М H2SO4 1 флакон 7 мл Готов к использованию Микропланшет с 8-луночными стрипами, покрытыми мышиными моноклональными антителами к инсулину Неиспользованные стрипы поместить в запечатывающийся пакет. Хранить при температуре 2 – 8 оС в течение 8 недель Приготовление ферментного конъюгата Приготовьте необходимое количество ферментного конъюгата путем разведения концентрированного раствора ферментного конъюгата в буфере для ферментного конъюгата (1+10) согласно приведенной ниже таблице. Перемешивайте осторожно. Используйте раствор в течение одного рабочего дня. Число стрипов 4 стрипа 6 стрипов 8 стрипов 12 стрипов Концентрированный раствор конъюгата 350мкл 500 мкл 700 мкл 1 флакон Буфер для конъюгата 3,5 мл 5,0 мл 7,0 мл 1 флакон ВЗЯТИЕ И ХРАНЕНИЕ ОБРАЗЦОВ Сыворотка Соберите кровь методом венепункции, дайте образоваться сгустку, отделите сыворотку центрифугированием. Образцы сыворотки можно хранить при 2-8 °С до 24 часов. Более длительное хранение осуществляйте при минус 20 °С. Избегайте повторного замораживания и оттаивания образцов _____________________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA, Mercodia AB 3 _____________________________________________________________________________________________________ Плазма Соберите кровь методом венопункции в пробирки, содержащие антикоагулянт гепарин или ЭДТА, и отделите фракцию плазмы. Образцы плазмы можно хранить при 2-8 °С до 24 часов. Более длительное хранение осуществляйте при -20 °С. Избегайте повторного замораживания и оттаивания образцов. ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ Разводить образцы обычно не требуется, однако при содержании инсулина > 20 мЕд/л их следует разбавить 1/10 (по объему) нулевым калибратором (0 мЕд/л). ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ Перед использованием все реагенты и образцы должны быть прогреты до комнатной температуры. Калибровочную кривую строят при каждом проведении анализа. Каждое определение калибраторов и исследуемых образцов выполняют в дубликатах. 1. Подготовьте необходимое количество ферментного конъюгата и промывающего буфера. 2. Подготовьте необходимое количество лунок согласно количеству исследуемых образцов и калибраторов в дубликатах. 3. Внесите по 25 мкл образцов и калибраторов в соответствующие лунки. 4. Добавьте по 100 мкл готового раствора ферментного конъюгата в каждую лунку. 5. Инкубируйте на шейкере (700-900 об/мин) в течение 1 часа при комнатной температуре (18-25оС). 6. Промойте планшет на автоматическом вошере 6 раз, внося по 700 мкл в каждую лунку (режим «overflowwash»). Не включайте в процедуру промывки стадию замачивания с промывающим буфером. Или промойте планшет вручную, удалив из лунок все содержимое и добавив в лунки по 350 мкл промывочного буфера; затем полностью удалите жидкость из лунок и повторите описанную процедуру промывки еще 5 раз. Закончив промывку, удалите из лунок остатки жидкости, энергично постукивая перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге. Избегайте продолжительного замачивания в процессе промывки. 7. Внесите по 200 мкл субстрата ТМБ в каждую лунку. 8. Инкубируйте 30 минут при комнатной температуре (18-25оС). 9. Внесите по 50 мкл стоп-реагента в каждую лунку. Поместите планшет на шейкер примерно на 5 секунд для лучшего перемешивания. 10.Измерьте оптическую плотность при 450 нм и оцените результаты. Измерения проводят в течение 30 минут после внесения стоп-реагента. Внимание! Во избежание контаминации между конъюгатом и субстратом рекомендуется вносить их различными микропипетками. ВНУТРЕННИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА Для внутреннего контроля качества в рутинной работе должны использоваться коммерческие контроли (например, контроль маркеров диабета фирмы Mercodia, кат № 10-1134-01/10-1164-01) и/или внутренние контрольные сыворотки с низкой, средней и высокой концентрацией инсулина. Контрольные материалы должны анализироваться как неизвестные образцы. Результаты исследования, а также номера лотов, даты приготовления растворов, ОП бланков, калибраторов и контролей необходимо документировать. РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ Компьютерный способ обработки данных Для расчета концентрации инсулина можно использовать компьютерную обработку полученных значений ОП калибраторов, за исключением нулевого калибратора, относительно их концентраций, используя кубическую регрессию (сплайн). Расчет вручную 1. Постройте на линейно-логарифмической бумаге график зависимости полученных значений ОП для калибраторов, за исключением нулевого калибратора, от концентрации инсулина. 2. Используя полученную калибровочную кривую, и измеренную величину ОП для каждого образца, определите по кривой концентрацию инсулина в образце. _____________________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA, Mercodia AB 4 _____________________________________________________________________________________________________ Пример рабочего протокола Лунки 1A-B 1C-D 1E-F 1G-H 2A-B 2C-D 2E-F 2G-H 3A-B Содержимое лунок ОП450 Нулевой калибратор Калибратор 1* Калибратор 2* Калибратор 3* Калибратор 4* Калибратор 5* Неизвестный образец 1 Неизвестный образец 2 Неизвестный образец 3 0,071/0,073 0,087/0,088 0,186/0,188 0,405/0,424 1,172/1,241 2,262/2,290 0,466/0,470 1,987/1,926 0,327/0,317 Среднее значение концентрации инсулина, мЕд/л 3,5 17,0 2,2 * Концентрации указаны на этикетке флаконов (как правило, диапазон следующий: 0; 0.15; 1; 3; 10; 20 мЕд/л) Калибровочная кривая Здесь показана типичная калибровочная кривая. Не используйте эту кривую для расчета полученных вами результатов. .ОП450 2,5 – 2– 1,5 – 1– 0,5 – 0– 0,1 1 Инсулин (мЕд/л) 10 ФАКТОР ПЕРЕСЧЁТА 1мкг/л=29 мЕд/л; 1 мЕд/л=6,0 пмоль/л ОГРАНИЧЕНИЯ Как для всех диагностических тестов, окончательный клинический диагноз не может быть поставлен по результатам единичного теста, но должен делаться врачом после оценки всех имеющихся результатов клинических исследований. Применение теста к исследованию пациентов, находящихся на лечении, осложнено тем фактом, что такая терапия обычно приводит к образованию анти-инсулиновых антител, которые могут влиять на результаты анализа. _____________________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA, Mercodia AB 5 _____________________________________________________________________________________________________ Проведению анализа не мешает использование образцов с признаками выраженной липемии, гемолиза или иктерических образцов. ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ В соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики (GLP), каждой лаборатории рекомендуется самостоятельно определять диапазон ожидаемых значений. Приводим ориентировочные результаты, которыми лаборатория может руководствоваться до накопления достаточного количества данных для выработки собственных норм. У 137 здоровых индивидов в образцах, взятых натощак, среднее арифметическое значение концентрации инсулина равнялось 9,2 мЕд/л, медиана – 6,9 мЕд/л, диапазон значений для центральных 95% выборки обследованных: 2 – 25 мЕд/л. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Чувствительность Минимально определяемая концентрация составляет 0,07 мЕд/л. Рассчитана на основании значения оптической плотности нулевого калибратора плюс удвоенное среднее квадратичное отклонение. Открытие При добавлении известного количества инсулина в пробу измеряемое увеличение концентрации составляет 97-107 % от ожидаемого (в среднем 102 %). Прозонный эффект Образцы с концентрацией инсулина вплоть до 800000 мЕд/л могут быть измерены без ложного занижения результата. Точность Каждый образец анализировали по 6 параллельным определениям в шести различных экспериментах. Образец 1 2 3 Среднее, мЕд/л 5,7 8,2 15,5 в пределах постановки, % 5,3 4,2 5,1 Коэффициент вариации между постановками, % 2,7 3,9 1,8 в целом, % 6,0 5,8 5,4 Специфичность Были обнаружены следующие перекрестные реакции: С-пептид <0,01 % Проинсулин <0,01 % Проинсулин des (31-32) <0,5 % Проинсулин split (32-33) <0,5 % Проинсулин des (64-65) 98 % Проинсулин split (65-66) 56 % Инсулин ЛизПро (Humalog®, Eli Lilly) <0,006 % Инсулин аспарт <0,006 % Инсулиноподобный фактор роста IGF-I <0,02 % Инсулиноподобный фактор роста IGF-II <0,02 % Инсулин крысиный 0,07 % Инсулин мышиный 0,03 % Инсулин свиной 37,4 % Инсулин овечий 48 % Инсулин бычий 31 % КАЛИБРОВКА Набор фирмы Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA откалиброван против 1-го Международного референсного препарата 66/304. ГАРАНТИИ Приведенные аналитические характеристики набора были получены при использовании указанной процедуры анализа. Любые изменения или модификации процедуры, не рекомендованные фирмой Mercodia АВ, могут повлиять на результаты; в этом случае фирма Mercodia АВ отказывается от предоставления гарантий выраженных явно, подразумеваемых или установленных законом, включая предполагаемую гарантию на пригодность набора к продаже и к использованию. _____________________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA, Mercodia AB 6 _____________________________________________________________________________________________________ При этом фирма Mercodia АВ и ее уполномоченные дистрибьюторы не будут нести материальную ответственность за непрямые убытки или убытки, произошедшие вследствие неправильного использования набора. _____________________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA, Mercodia AB 7 _____________________________________________________________________________________________________ КРАТКАЯ СХЕМА ПРОТОКОЛА АНАЛИЗА Mercodia Ultrasensitive Insulin ELISA Внесите калибраторы и образцы 25 мкл Внесите ферментный конъюгат 100 мкл 1 час при 18-25 °С на шейкере Инкубируйте Промойте 6 раз Внесите субстрат ТМБ 200 мкл Инкубируйте 30 минут Внесите стоп-реагент 50 мкл Встряхивайте 5 секунд для перемешивания Измерьте ОП450 Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см. внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо руководствуйтесь оригиналом инструкции. 10-1132-01_Mercodia Ultrasensitive Insulin.doc 01.11.2010 9:30 Оригинал 31-3117 Version: 7.0 _____________________________________________________________________________________________________ © Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2010 тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
