М И Н И СТ Е РСТ В О ... В О РО Н Е Ж СК И Й ...

реклама
М И Н И СТ Е РСТ В О О БРА ЗО В А Н И Я РО ССИ Й СК О Й Ф Е Д Е РА Ц И И
В О РО Н Е Ж СК И Й ГО СУ Д А РСТ В Е Н Н Ы Й У Н И В Е РСИ Т Е Т
ЛА БО РА Т О РН Ы Е РА БО Т Ы И ЗА Д А ЧИ ПО БИ О ХИ М И И
Практическоепособие
по специальностям « Биология» (011600), « Ф арм ация» (040500)
В оронеж
2003
У тв ерж дено
2
научно-м етодическим
сов етом
биолого-почв енного
ф акультета, протокол№ 10 от13.11.02
Состав ители: М атасов аЛ.В .,
Попов аТ .Н .,
Т екунов аН .А .,
Сем ених инаА .В .
Подготов лено на каф едре аналитической и м едицинской биох им ии и
м икробиологии
биолого-почв енного
ф акультета
В оронеж ского
государств енного унив ерситета.
Реком ендуется для студентов 3 курса в ечернего отделения биологопочв енного ф акультета и студентов 2 и 3 курса ф арм ацев тического
ф акультета.
3
С О Д ЕР Ж А Н И Е
СО Д Е РЖ А Н И Е .................................................................................................... 3
В В Е Д Е Н И Е .......................................................................................................... 3
Работа1. Ц в етны ереакции набелки .................................................................. 4
Работа2. О саж дениебелков ................................................................................ 5
Работа3. О пределениеиз оэлектрической точки белков ................................... 6
Задачи по тем е« А м инокислоты и белки» .......................................................... 7
Работа 4. В лияние тем пературы , актив аторов и ингибиторов на скорость
ф ерм ентатив ной биох им ической реакции. О пределение специф ичности
ам илаз ы слюны ..................................................................................................... 9
Работа 5. О пределение константы М их аэлиса и м аксим альной скорости
ф ерм ентатив ной реакции................................................................................... 10
Работа6. О пределениетипаи константы ингибиров ания............................... 12
Работа 7. Ф ерм енты подж елудочной ж елез ы . О пределение актив ности
ам илаз ы в сы в ороткекров и............................................................................... 13
Работа 8. М етаболиз м глюкоз ы в организ м е челов ека и его наруш ения.
О пределение концентрации глюкоз ы в сы в оротке кров и и м оче.
К ачеств енны ереакции накетонов ы етела........................................................ 17
Работа 9. О бм ен х олестерина в организ м е челов ека и его наруш ения.
О пределениеконцентрации х олестеринав сы в ороткекров и ......................... 22
Работа 10. М етоды
определения и классиф икация в итам инов .
К олорим етрический м етод определения аскорбинов ой кислоты в плаз м е.... 26
Задачи по тем е« В итам ины ».............................................................................. 28
Работа 11. К оличеств енное определение пиров иноградной кислоты в кров и
колорим етрическим м етодом (по У м брайту) ................................................... 31
Работа 12. Биологическое окисление. К оличеств енное определение А Т Ф и
креатинф осф атам ы ш ц....................................................................................... 32
Задачи по тем е« М етаболиз м » .......................................................................... 36
Работа 13. М инеральны й обм ен в организ м е челов ека. О пределение
концентрации кальция и х лоридов в сы в ороткекров и.................................... 39
Работа 14. А з отисты й обм ен. О пределение концентрации м очев ины в
сы в ороткекров и................................................................................................. 45
Работа 15. О пределение концентрации креатинина в сы в оротке кров и и в
м оче. Расчетклиренсакреатинина.................................................................... 48
Работа 16. М ех аниз м действ ия адреналина. О пределение адреналина в
сы в ороткекров и................................................................................................. 51
Заданиепо тем е« Перенос генетической инф орм ации» .................................. 53
ЛИ Т Е РА Т У РА .................................................................................................... 54
В В ЕД ЕН И Е
Б и охи м и я (греческоеbios - ж из нь) - это наукао м олекулярны х основ ах
ж из ни. О на из учает х им ический состав организ м ов , прев ращ ение в ещ еств и
4
энергии, котороеосущ еств ляется в процессеих ж из недеятельности. В опросы
и з адачи, представ ленны е в данном м етодическом пособии, приз в аны
акцентиров ать в ним ание студента на основ ны х в опросах учебной
програм м ы , в ы з в ать интерес к поз нанию этой ув лекательной области науки.
Лабораторны е работы дают в оз м ож ность в х оде их в ы полнения осв оить
основ ны е прием ы в ы деления и количеств енного определения биом олекули
научиться оценив атьинф орм атив ностьбиох им ических тестов при некоторы х
патологических состояниях
Р абота 1. Ц ветн ы е реакции н а белки
1. Биуретов ая реакция: обуслов лена наличием пептидны х св яз ей в
белках и полипептидах , благодаря которы м в щ елочной средес солям и м еди
образ уют Си— Nа-ком плексную соль полипептидов и белков синеф иолетов ого цв ета. К 1 м лраств ора белка добав ляют 1 м л10%-го раств ора
NaOH и 1-2 капли 1%-го раств ора CuSO4. Появ ляется ф иолетов ое
окраш ив ание.
2.
К сантопротеинов ая реакция основ ана на способности
присутств ующ их в м олекуле белка аром атических ам инокислот (тироз ина,
триптоф ана и ф енилаланина) образ ов ы в ать с концентриров анной аз отной
кислотой при подогрев ании ж елтоокраш енны е нитросоединения. К 1 м л
раств ора белка прилив ают 0,5 м л концентриров анной HNO3. В ы падает
осадок, которы й при подогрев ании частично раств оряется, при этом раств ор
приобретаетж елтую окраску. Е сли послеох лаж дения в пробирку добав ить1
м л концентриров анного раств ора ам м иака, то ж елтое окраш ив ание
перех одит в оранж ев ое в следств ие прев ращ ения нитропроиз в одны х
циклических ам инокислотв соли х иноидной структуры . Ф енилаланин лучш е
нитруется при добав лении см еси концентриров анны х Н NО 3 и H2SO4.
3. Реакция на триптоф ан. К 1 м л раств ора белка прилив ают 2 м л
концентриров анной Н Сl и нагрев ают, не дов одя до кипения, чтобы не
улетучился х лористы й в одород. О садок, в ы пав ш ий при добав лении кислоты ,
при подогрев ании раств оряется, и ж идкость окраш ив ается в ф иолетов ы й
цв ет. Э та реакция указ ы в ает на наличие в яичном белке не только
триптоф ана, но и углев одов : триптоф ан реагирует с оксим етилф урф уролом ,
образ ующ им ся из м оносах аридов , в рез ультате чего в оз никает ф иолетов окрасноесоединение.
5. Реакция с ацетатом св инца. Полож ительная реакция указ ы в ает на
наличие в белков ой м олекуле атом ов серы цистеина и цистина. К 1 м л
раств ора белка добав ляют 2 м л1%-го NaOH, перем еш ив ают, кипятят 2-3
м ин., з атем прибав ляют 1-2 капли 5%-го (CH3COO)2Pb и продолж ают
нагрев ать до в ы падения черного осадка PbS. Реакция идет по следующ ем у
урав нению:
R-SH+2NaOH → Na2S+R-OH+H2O
Na2S+(CH3COO)2Pb → РbS+2СН з СО ONa
5
6. Н ингидринов ая реакция указ ы в ает на присутств ие в ам инокислотах
α-ам иногрупп. При этом происх одит в ы деление СО 2. К 0,2-0,5 м лраств ора
ам инокислот прибав ляют 2-3 капли 0,1 %-го ацетонов ого раств ора
нингидрина, кипятят 2 м ин. Появ ляется сине-ф иолетов ое окраш енное
соединение в следств ие в з аим одейств ия дв ух м олекул нингидрина с
ам инокислотой.
Р абота 2. О сажден ие белков
Характерны м св ойств ом белков ы х в ещ еств яв ляется их способность
осаж даться из раств оров под в оз действ ием раз личны х ф акторов среды .
О саж дение белков нейтральны м и солям и (« в ы салив ание»), наприм ер
(NH4)2SO4, NaCL, Nа2SO4, наш ло ш ирокое прим енение в их очистке,
поскольку после удаления соли белки в осстанав лив ают св ои биологические
ф ункции. При нагрев ании белков , добав лении солей тяж елы х м еталлов ,
экстрем альны х з начениях рН и действ ии других ф акторов белки в ы падаютв
осадок в следств ие денатурации. При этом их ков алентная структура не
претерпев ает из м енений, но биологическая ф ункция у больш инств а белков
утрачив ается. Реакции осаж дения белков использ уют в биох им ической
практикедля удаления белков ы х в ещ еств и для определения их содерж ания в
биологическом м атериале.
1. О саж дениебелков кипячением . В пробирку налив ают1 м лраств ора
белкаи нагрев аютдо кипения. Происх одитденатурация белка. Болееполное
осаж дение белка достигается слабы м подкислением его уксусной кислотой
или добав лением других электролитов : в 1 м лраств орабелкадобав ляют1-2
капли 1 %-го раств ора уксусной кислоты и нагрев ают. В ы падает осадок
белка. Я в ление денатурации (потеря натив ны х св ойств ) в ы з ы в ается
глубоким и наруш ениям и структуры белка.
2. О саж дение белков солям и тяж елы х м еталлов . Белки при
в з аим одейств ии с солям и тяж елы х м еталлов адсорбируют их , образ уя
нераств орим ы есолеобраз ны еи ком плексны есоединения.
К 1 м л раств ора белка прилив ают по каплям 5%-й раств ор CuSO4.
Появ ляется осадок, раств оряющ ийся в из бы ткереактив а.
К 1 м л белка прилив ают по каплям 5%-й раств ор ацетата св инца.
Появ ляется осадок, раств оряющ ийся в из бы ткереактив а.
3. О саж дениебелков реактив ам и наалкалоиды . К группереактив ов на
алкалоиды
принадлеж ит таннин, пикринов ая кислота, ж елез истосинеродистая кислота, раств оры йодной ртути в йодистом калии и др.
Способность белков осаж даться тем и ж е реактив ам и, что и алкалоиды ,
объ ясняется образ ов анием нераств орим ы х солеобраз ны х соединений с
основ ны м и
аз отисты м и
группам и:
пиррольны м и,
индольны м и,
им идаз ольны м и. В этом соединении белок яв ляется катионом , поэтом у
реакция протекаетв кислой среде.
6
К 1 м л слегка подкисленного уксусной кислотой раств ора белка
прилив ают3-5 капельнасы щ енного раств орапикринов ой кислоты . В ы падает
осадок белка.
К 1 м лраств ора белка, подкисленного 1-2 каплям и раств ора уксусной
кислоты , прилив ают3-5 капельраств оратаннина. В ы падаетосадок белка.
4. О саж дение белка кислотам и. Проба Геллера. Реакция основ ана на
дегидратации и денатурации белкапри действ ии крепкой аз отной кислоты . К
1-2 м л концентриров анной HNO3 осторож но, по стенкам (в наклонном
полож ении пробирки) прилив ают пипеткой 0,5-1 м л раств ора белка. Н а
границе дв ух соприкасающ их ся ж идкостей образ уется белое кольцо
св ернув ш егося белка.
К 1 м лраств ора белка добав ляют несколько капель 20%-го раств ора
сульф осалицилов ой кислоты , перем еш ив ают. В ы падаетосадок белка.
К 1 м л раств ора белка прилив ают 1 м л 10%-го раств ора
трих лоруксусной кислоты . В ы падаетосадок белка.
5. О саж дение белков сульф атом ам м ония. К 2 м л раств ора белка
прилив ают 2 м лнасы щ енного раств ора сульф ата ам м ония и перем еш ив ают.
В ы падает осадок глобулинов в следств ие дегидратации и нейтрализ ации
з аряда белков . Через 5 м ин осадок отделяют центриф угиров анием и к
надосадочной ж идкости добав ляют растерты й в порош ок сульф ат ам м ония
до полного насы щ ения. В ы падает осадок альбум ина. Полноту осаж дения
белков пров еряют биуретов ой реакцией. Д ля того, чтобы пров ерить
обратим ость реакции осаж дения, к осадку белка прилив ают рав ны й
содерж им ом у пробирки объ ем дистиллиров анной в оды и перем еш ив ают.
Раств орение осадка св идетельств ует об обратим ости этого процесса и
сох ранении натив ной структуры белка.
6. О саж дение белков в ольф рам атом натрия. К 1-2 м лраств ора белка
прибав ляют 3-5 капель 5%-го раств ора в ольф рам ата натрия и 3-5 капель
0,4 н. раств орасерной кислоты . В ы падаетосадок белков . Полноту осаж дения
белков пров еряютбиуретов ой реакцией.
Р абота 3. О пределен ие изоэлектрической точки белков
В следств ие наличия способны х к иониз ации групп (концев ы х групп СО О Н и -NH2, а такж е боков ы х групп дикарбонов ы х и диам инокислот)
м олекулы белков обладают электрическим з арядом . В кислой среде белки
им еют сум м арны й полож ительны й з аряд, в щ елочной среде –
отрицательны й. При определенном з начении рН среды
в еличина
полож ительны х и отрицательны х з арядов станов ится одинаков ой. Значение
рН , при котором белок им еет м иним альны й электрический з аряд, наз ы в ают
из оэлектрической точкой (И Э Т ). В этом состоянии белки наим енее
устойчив ы в раств оре и в ы падают в осадок, им еют наим еньш ее з начение
в яз кости, раств орим ости, степени гидратации и электропров одности, не
передв игаются к электрическим полюсам . К аж ды й белок им еет св ое
з начениеИ Э Т . Сущ еств уетряд способов определения И Э Т белков .
7
Реактив ы : 0,2%-й раств ор каз еина или 0,5%-й раств ор ж елатина
(раств оряют0,2 г каз еина или 0,5 г ж елатина при подогрев ании в 10 м л1 н.
раств ораацетатанатрия и дов одятв одой до 100 м л).
Ход работы . В каж дую из 8 пронум еров анны х пробирок по
ниж еприв еденной сх ем е (табл.1) в носят соотв етств ующ ие раств оры . В
каж дую пробирку добав ляют 0,5 м л 96% этанола. В той пробирке, где
обнаруж ится м аксим альное пом утнение среды
(в из уально или
неф елом етрически), рН раств орабудетсоотв етств ов атьИ Э Т белка. О тм етьте
степеньпом утнения з накам и « », « +», « ++» или « ++» в таблице.
Т аблица1.
Реагенты , м л
Н 2О
0,01 н. СН 3СО О Н
0,1 н. СН 3СО О Н
Раств ор белка
pH
Степень
пом утнения
Приготов лениераств оров с з аданны м рН
Н ом ерапробирок
1
2
3
4
5
6
8,4
7,75 8,75 8,5
8,0
7,0
0,6
1,25 0,25 0,5
1,0
2,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
5,8
5,6
5,3
5,0
4,7
4,4
7
5,0
4,0
1,0
4,1
8
1,0
8,0
1,0
3,8
Задачи по теме «А мин окислоты и белки»
В ариан т № 1
а)
И з образ ите полную
структуру
следующ их
пептидов
(иониз иров анны егруппы из образ итев протониров анном состоянии): 1) MetGlu-Gly-His; 2) Phe-Asp-Phe-Thr.
б) Биологическая оценка белков как ком понентов пищ и. О снов ны м
критерием оценки белков в питании яв ляется наличие в них нез ам еним ы х
ам инокислот. Д айтебиологическую оценку следующ им гексапептидам :
1) Glu-Asp-Pro-Ala-Cys-Gly;
2) Glu-Asp-Pro-Ala-Val-Cys;
3) Glu-Val-Pro-Thr-Ala-Gly;
в ) Раств орим ость полипептидов з ав исит от степени полярности
группы , особенно от числа иониз ируем ы х групп: чем больш е иониз ируем ы х
групп, тем в ы ш е раств орим ость полипептида. К акой полипептид из каж дой
пары прив еденны х ниж еболеераств орим в данны х услов иях ?
1) (Gly)30 или (Glu)30 при рН 7;
2) (Lys-Ala)20 или (Ile-Met)20 при рН 3,0
г) Почем у подкисш еем олоко св ерты в ается при кипячении? Что нуж но
сделать, чтобы из беж атьэтого? Почем у несв ерты в ается св еж еем олоко?
8
В ариан т № 2
а)
И з образ ите полную
структуру
следующ их
пептидов
(иониз иров анны егруппы из образ итев протониров анном состоянии): 1) MetLeu-Val-Pro; 2) Phe-Ala-Trp-Tyr.
б) Биологическая оценка белков как ком понентов пищ и. О снов ны м
критерием оценки белков в питании яв ляется наличие в них нез ам еним ы х
ам инокислот. Д айтебиологическую оценку следующ им гексапептидам :
1) Glu-Asp-Pro-Ala-Cys-Gly;
2) Glu-Asp-Pro-Ala-Val-Cys;
3) Glu-Val-Pro-Thr-Ala-Gly;
в ) Э лектроф орез ам инокислотнабум аге. К аплю раств ора, содерж ащ его
см есь лейцина, аспарагинов ой кислоты , аргинина, нанесли на полоску
бум аги, предв арительно см оченную буф ером с рН 6, и к концам полоски
прилож или электрическое напряж ение. К акая ам инокислота будетдв игаться
к аноду? К акая к катоду? К акая останется настартов ой точкеили в близ и нее?
г) Ф ункции белков . При ум еньш ении концентрации общ его белка в
кров и у челов ека пов ы ш ается в осприим чив ость к инф екциям , появ ляются
отеки в тканях , наруш ается кислотно-основ ноесостояниеорганиз м аи обм ен
в ещ еств . О бъ яснитепричину этих яв лений.
В ариан т № 3
а)
И з образ ите полную
структуру
следующ их
пептидов
(иониз иров анны е группы из образ ите в протониров анном состоянии): 1) TyrCys-Val-Lis; 2) Thr-Asn-Met-Arg.
б) Биологическая оценка белков как ком понентов пищ и. О снов ны м
критерием оценки белков в питании яв ляется наличие в них нез ам еним ы х
ам инокислот. Д айтебиологическую оценку следующ им гексапептидам :
1) Gln-Cys-Pro-Thr-Ala-Ile;
2) Val-Pro-Lys-Thr-His-Phe;
в ) Пепсин ж елудочного сока (рН 1,5) им еет из оэлектрическую точку
И Э Т =1, т.е. нам ного ниж е, чем другиебелки. К акиеф ункциональны егруппы
долж ны бы тьв пепсинев относительно больш ом числе, чтобы этотф ерм ент
м ог им еть такую низ кую И Э Т ? К акие ам инокислоты им еют эту группу в
св оем состав е? Н апиш итеструктурны еф орм улы этих ам инокислот.
г) При х им ическом способез ав ив ки в началев осстанав лив ают, аз атем
окисляют тиолов ы е (-SH) группы белков , в х одящ их в состав в олос. И сх одя
из особенностей пространств енного строения белков в олос, объ ясните, какие
м огутпроисх одитьиз м енения в структуребелкапри этом ?
В ариан т № 4
а) Полипептиды наз ы в ают путем перечисления ам инокислот (от Nконца к C-концу), з ам еняя в случае больш инств а ам инокислот – ин (-ат)
суф ф иксом – ил. Н аз в ание последней ам инокислоты не из м еняется.
Н арисуйтеструктуру глициларгинилтреонилцистеинапри рН 7.
9
б) Биологическая оценка белков как ком понентов пищ и. О снов ны м
критерием оценки белков в питании яв ляется наличие в них нез ам еним ы х
ам инокислот. Д айтебиологическую оценку следующ им гексапептидам :
1) Glu-Val-Pro-Thr-Ala-Gly;
2) Val-Pro-Lys-Thr-Ala-Phe;
3) Val-Leu-Met-Thr-Trp-Lys.
в ) Раств орим ость полипептидов з ав исит от степени полярности
группы , особенно от числа иониз ируем ы х групп: чем больш е иониз ируем ы х
групп, тем в ы ш е раств орим ость полипептида. К акой полипептид более
раств орим в прив еденны х услов иях ?
1) (Ala-Asp-Gly)5 или (Asn-Ser-Arg)5 при рН 10,0;
2) (Ala-Asp-Gly)5 или (Asn-Ser-Arg)5 при рН 3,0.
г) И з см еси белков необх одим о в ы делить белок с из оэлектрической
точкой 9,0. О стальны е белки им еют из оэлектрическую точку около 6,0.
О пиш итеспособ получения этого белка.
Р абота 4. В лиян ие температуры , активаторов и ин гибиторов н а
скорость фермен тативн ой биохимической реакции. О пределен ие
специфичн ости амилазы слюн ы .
В лиян ие температуры н а скорость фермен тативн ой реакции
В терм олабильности ф ерм ентов м ож но убедиться наприм ередейств ия
ам илаз ы слюны . Ф ерм ент ам илаз а осущ еств ляет гидролиз крах м ала через
пром еж уточны е продукты
распада (декстрины )
до
м альтоз ы .
Н ерасщ епленны й крах м алс йодом дает синее окраш ив ание, а декстрины в
з ав исим ости от в еличины св оих частиц дают с йодом ф иолетов ую, краснобурую, оранж ев ую окраску или в ообщ е не окраш ив аются. М альтоз а,
конечны й продукт распада крах м ала, не окраш ив ается раств ором йода.
Т аким образ ом , по окраскераств орайодам ож но судитьо степени гидролиз а
крах м ала.
Ход работы . В центриф уж ную пробирку собирают 1 м л слюны и
дов одят дистиллиров анной в одой до 10 м л. Затем берут 4 пробирки: в
каж дую пом ещ ают по 1 м л1 %-го раств ора крах м ала и по 1 м лраз в еденной
слюны . Пробирки пом ещ аютна 15 м инут: перв ую - в терм остат(при 37° С);
в торую – в ледяную баню (при 4° С); третью – на кипящ ую в одяную баню
(при 100° С); четв ертую остав ляют при ком натной тем пературе (+20° С).
Через 15 м инут пробирки ох лаж дают и в каж дую пробирку добав ляют по 2
капли йода. По интенсив ности и цв ету в оз никающ его окраш ив ания судят о
скорости и глубинепротекания ф ерм ентатив ной реакции гидролиз акрах м ала
ам илаз ной слюны . Д елают в ы в од о в лиянии тем пературы на скорость
ф ерм ентатив ной биох им ической реакции.
С пецифичн ость действия фермен тов
По специф ичности действ ия ф ерм енты делят на дв е группы :
обладающ ие абсолютной
специф ичностью
и
с относительной
специф ичностью. О тносительная специф ичность наблюдается, когда
ф ерм ент катализ ирует реакции одного типа с более чем одним
10
структуроподобны м субстратом . А бсолютная специф ичность прояв ляется
тогда, когда ф ерм ент действ ует лиш ь на единств енное в ещ еств о и
катализ ируетлиш ьопределенноепрев ращ ениеданного в ещ еств а. Н априм ер,
ф ерм ент уреаз а катализ ирует гидролиз м очев ины ; сах араз а катализ ирует
ф ерм ент
прев ращ ение только сах ароз ы . Стереоспециф ичность –
катализ ирует прев ращ ение только одного из в оз м ож ны х стереоиз ом еров
субстрата.
Ход работы . В дв е пробирки налив ают по 1 м л раств ора ам илаз ы
(раз в еденной слюны ) и в перв ую добав ляют 1 м лраств ора крах м ала, а в о
в торую – 1 м лраств орасах ароз ы . Пробы в ы держ ив аютв терм остате15 м ин.
при 37º С. Затем с перв ой пробой (субстрат+ крах м ал) проделы в ают дв е
реакции: пробу Т ром м ера и реакцию с раств ором йода (к 5 каплям
инкубационной см еси добав ляют1-2 капли раств орайода). Со в торой пробой
проделы в аютреакцию Т ром м ера.
Реакция Т ром м ера: в пробирку добав ляют0,5 м лр-расульф атам еди и
прибав ляют по каплям (до появ ления осадка) раств ор гидроксида натрия.
Д алее пробирку с содерж им ы м нагрев ают и наблюдают з а появ лением
окраски. Н аличиекирпично-красного окраш ив ания указ ы в аетнаприсутств ие
глюкоз ы . Сах ароз анеим еетсв ободной альдегидной группы , поэтом у недает
реакции Т ром м ера. Реакция Т ром м ера м ож ет бы ть полож ительной только в
том случае, если сах ароз а расщ епиться насв ои состав ны ечасти – глюкоз у и
ф руктоз у.
Д елают в ы в од о специф ичности ам илаз ы – гидролиз ует ли ам илаз а
сах ароз у, или только крах м ал?
В лиян ие активаторов и ин гибиторов н а активн ость амилазы слюн ы
Ход работы 1. В одну пробирку в носят 1 м лH2O, в о в торую – 0,8 м л
в оды и 0,2 м л1 %-го раств ораNaCl, в третью – 0,8 м лв оды и 0,2 м лраств ора
сульф ата м еди (II). 2. В каж дую пробирку добав ляют по 2 м лраз в еденной
(1:10) слюны , содерж им ое пробирки перем еш ив ают, добав ляют по 0,5 м лрра крах м ала и остав ляют стоять при ком натной тем пературе. 3. В это в рем я
готов ят три пробирки с в одой (по 1 м лв каж дой), подкраш енной каплей
раств ора йода, и добав ляютв них по 2-3 капли содерж им ого опы тны х проб.
Н аблюдают окраш ив ание в з ав исим ости от степени расщ епления крах м ала
ам илаз ой. В перв ой пробирке появ ляется ф иолетов ая или красно-бурая
окраска, в о в торой пробирке, где ионы х лора играют роль актив атора,
появ ляется ж елтая окраска, в третьей пробирке, где ионы м еди торм оз ят
действ ие ам илаз ы , окраска остаeтся синей. Е сли описанной картины не
наблюдается, то опы тпов торяютчерез 10 м ин.
Записы в ают в тетрадь полученны е наблюдения. Д елают в ы в оды о
х арактерев лияния х лориданатрия и сульф атам еди наактив ностьам илаз ы .
Р абота 5. О пределен ие кон стан ты М ихаэлиса и максимальн ой
скорости фермен тативн ой реакции
При постоянной концентрации ф ерм ентакрив ая з ав исим ости скорости
катализ ируем ой им
реакции от концентрации субстрата им еет
11
гиперболическую ф орм у. В перв ы е теоретические основ ы
кинетики
ф ерм ентатив ного катализ а бы ли раз работаны Л.М их аэлисом и М .М ентен.
О ни предлож или м атем атическое урав нение, в ы раж ающ ее з ав исим ость
скорости ф ерм ентатив ной реакции v отконцентрации субстратаS:
v=
Vmax [S]
K S + [S]
гдеv – скоростьф ерм ентатив ной реакции; S – концентрация субстрата,
Vmax – м аксим альная скоростьреакции, KM – константаМ их аэлиса.
К онстанта М их аэлиса яв ляется м ерой сродств а ф ерм ента к субстрату.
О на численно рав на концентрации субстрата, при которой скорость
ф ерм ентатив ной реакции рав наполов инем аксим альной скорости.
И з граф ика М их аэлиса – М ентен трудно точно определить К м и Vmax, в
св яз и с чем им еются раз личны е м атем атические преобраз ов ания указ анного
урав нения. В частности, Лайнуив ер и Берк предлож или строить граф ик в
дв ойны х обратны х координатах . Т огдаурав нениеприм етв ид:
1 KМ
1
1
=
⋅
+ ,
v
V [S] V
Э то урав нение прям ой y=ax+b (рис. 1), где a=KМ /V - тангенс угла
наклонапрям ой; b=1/V, y=1/v, x=1/[S].
1/v
Н ак лон = К М /V
1/V
-1/К М
1/[S]
Рис. 1. Граф ик Лайнуив ера-Берка
Ход работы . Ф ерм ентглутам атдегидрогеназ акатализ ируетреакцию:
глутам ат+ NAD+ → 2-оксоглутарат+ NADH+ + H+ + NH3
Скоростьреакции из м еряли по ув еличению экстинкции среды при 340
нм в единицу в рем ени, которое происх одило в следств ие в осстанов ления
NAD+. При из м ерении скорости данной реакции при раз личны х
концентрациях субстрата и постоянной концентрации NAD+ бы ли получены
данны е, представ ленны е в табл. 2. О пределите граф ически KM и
м аксим альную скоростьф ерм ентатив ной реакции.
12
Т аблица2
Э ксперим ентальны еданны ез ав исим ости скорости
глутам атдегидрогеназ ной реакции отконцентрации глутам ата
К онцентрация глутам ата,
Н ачальная скоростьреакции,
м м оль/л
∆E340/м ин
1,68
0,172
3,33
0,250
5,00
0,286
6,67
0,303
10,00
0,334
20,00
0,384
Р абота 6. О пределен ие типа и кон стан ты ин гибирован ия
Процесс ингибиров ания м ож ет бы ть обратим ы м и необратим ы м .
О братим ы е ингибиторы
бы в ают конкурентного, неконкурентного,
бесконкурентного и см еш анного действ ия. Н екоторы е ф ерм енты
ингибируются из бы тком субстрата.
К онкурентное ингибиров ание в оз никает тогда, когда ингибитор
в з аим одейств ует с ф ункциональны м и группам и актив ного центра ф ерм ента.
К онкурентное ингибиров ание м ож ет бы ть ослаблено или устранено
ув еличением концентрации субстрата. В больш инств е случаев ингибиторы
конкурентного типа представ ляют собой структурны е аналоги субстратов .
При конкурентном ингибиров ании происх одит каж ущ ееся ув еличение К м ,
Vmax остается неиз м енной.
Н еконкурентноеингибиров аниенез ав иситотконцентрации субстрата.
Н еконкурентны й ингибитор подав ляет каталитическое прев ращ ение
субстрата в продукты реакции. В идим о, при неконкурентном торм ож ении
ингибитор св яз ы в ается с ф ерм ентом на участке, отличающ ем ся от центра
св яз ы в ания субстрата; однако при этом деф орм ирует этот центр, подав ляя
его каталитическую ф ункцию. К огда в реакционной среде нах одятся и
субстрат и ингибитор, они присоединяются к ф ерм енту однов рем енно. В
присутств ии неконкурентного ингибитора Kм не из м еняется, а Vmax
ум еньш ается.
Бесконкурентное ингибиров ание наблюдается в том случае, когда
ингибитор неспособен присоединяться к ф ерм енту, но он м ож етсв яз ы в аться
с ком плексом ES, перев одя его в неактив ную ф орм у. Бесконкурентны й
ингибитор в одинаков ой м ере ум еньш ает К м и м аксим альную скорость
реакции.
При см еш анном ингибиров ании ингибитор действ ует как на участок
св яз ы в ания, так и накаталитический центр ф ерм ента, причем нез ав исим о от
того, перекры в аются они или нет. И нгибитор см еш анного типа действ ия
тож еиз м еняети Kм , и Vmax, но в отличиеотбесконкурентного ингибиров ания
каж ущ аяся Kм м ож ет или ув еличив аться, или ум еньш аться, а в еличина Vmax
в сегдасниж ается.
13
Ход работы . При из м ерении кинетики ф ерм ентатив ной реакции в
з ав исим ости от концентрации субстрата в присутств ие и отсутств ии
ингибиторабы ли получены данны е, представ ленны ев таблице3. О пределите
граф ически К м и Vmax в отсутств ие ингибитора и в присутств ии его.
О пределитетип ингибиров ания.
Т аблица3.
Скоростьф ерм ентатив ной реакции в отсутств иеи в присутств ии
ингибитора
К онцентрация
Скоростьреакции, м км оль/м ин
субстрата, м км оль/л
Без ингибитора
С ингибитором
3
10,4
4,1
5
14,5
6,4
10
22,5
11,3
30
33,8
22,6
90
40,5
33,8
Р абота 7. Ф ермен ты поджелудочн ой железы . О пределен ие
активн ости амилазы в сы воротке крови
Ф ункции подж елудочной ж елез ы . Подж елудочная ж елез а яв ляется
эндокринной ж елез ой (в ней образ уются и секретируются в кров ь горм оны
инсулин и глюкагон) и экз окринной (в ней образ уются и секретируются в
тонкий киш ечник рад пищ ев арительны х ф ерм ентов и бикарбонат).
Бикарбонатнейтрализ ауетHCl ж елудочного сока в поступив ш ей из ж елудка
порции пищ и. В тонком киш ечнике продолж ается перев арив ание белков ,
начав ш ееся в ж елудке.
Поступление
ам инокислот
в
Перев арив ание
белков .
дв енадцатиперстную
киш ку
в ы з ы в ает
осв обож дение
горм она
х олецистокинина, которы й стим улирует секрецию нескольких ф ерм ентов
подж елудочной ж елез ы . Э то трипсин, х им отрипсин, карбоксипептидаз а и
эластаз а. О ни в ы рабаты в аются экз окринны м и клеткам и подж елудочной
ж елез ы в в иде ф ерм ентатив но неактив ны х предш еств енников (з им огенов ) трипсиногена, х им отрипсиногена, прокарбокси-пептидаз ы и проэластаз ы .
Благодаря этом у подж елудочная ж елез а не раз руш ается ф ерм ентам и.
Зим огены актив ируются в тонком киш ечнике путем ограниченного
протеолиз а. Т рипсиноген прев ращ ается в актив ную ф орм у под действ ием
энтерокиназ ы , протеолитического ф ерм ента, секретируем ого клеткам и
киш ечного эпителия. О браз ов ание трипсина обуслов лено отщ еплением
гексапептида от N-конца полипептидной цепи трипсиногена. Т рипсин по
м ере св оего образ ов ания такж е участв ует в прев ращ ении трипсиногена в
трипсин. Т рипсин гидролиз ует пептидны е св яз и, образ ов анны е
карбоксильны м и группам и лиз инаи аргинина.
Хим отрипсиноген, как и проэластаз а и прокарбоксипептидаз а,
прев ращ ается в актив ны й ф ерм ент под действ ием трипсина. М олекула
х им отрипсиногена представ ляет собой одну полипептидную цепь с
14
нескольким и в нутрицепочечны м и дисульф идны м и св яз ям и. Хим отрипсин
гидролиз ует пептидны е св яз и, образ ов анны е остаткам и ф енилаланина,
тироз ина и триптоф ана. Э ластаз а гидролиз ует пептидны е св яз и,
образ ов анны епролином . К арбоксипептидаз аотщ епляетам инокислоты отСконцаполипептидов .
Д еградация коротких пептидов в тонком киш ечнике осущ еств ляется
другим и пептидаз ам и. В рез ультате белки прев ращ аются в см есь св ободны х
ам инокислот, которы е транспортируются через эпителиальны е клетки,
в ы стилающ иетонкиекиш ки, и переносятся кров ью в печень.
Перев арив ание углев одов . К рах м ал и гликоген расщ епляются
ф ерм ентам и до D-глюкоз ы . Э тот процесс начинается в о рту в о в рем я
переж ев ы в ания пищ и благодаря действ ию ф ерм ента ам илаз ы , в ы деляем ого
слюнны м и ж елез ам и. А м илаз а гидролиз ует α-(1-4)-гликоз идны е св яз и в
крах м але и в гликогене. При этом образ уется см есь м альтоз ы , глюкоз ы и
олигосах аридов . Перев арив ание углев одов продолж ается и з ав ерш ается в
тонком киш ечникепод действ ием ам илаз ы подж елудочной ж елез ы .
Перев арив аниетриацилглицеролов (нейтральны х ж иров , состоящ их из
глицерина и ж ирны х кислот) начинается в тонком киш ечнике, куда из
подж елудочной ж елез ы
поступает з им оген пролипаз а. Пролипаз а
прев ращ ается в актив ную липаз у в присутств ии ж елчны х кислот и белка
колипаз ы . К ом плекс липаз ы , ж елчны х кислот и колипаз ы присоединяется к
капелькам триацилглицеролов и катализ ирует гидролитическое отщ епление
одного или обоих крайних остатков ж ирны х кислот с образ ов анием см еси
св ободны х ж ирны х кислот в в иде их Na+ или K+-солей (м ы л) и 2м оноацилглицеролов .
О браз ов ав ш иеся
м ы ла и
нерасщ епленны е
ацилглицеролы эм ульгируются в в иде м елких капелек под действ ием
перистальтики (перем еш ив ание дв иж ением киш ечника), а такж е под
в лиянием солей ж елчны х кислот, м оноацилглицеролов и ф осф олипидов ,
которы е яв ляются
ам ф ипатическим и
соединениям и
и
потом у
ф ункционируют как детергенты . Д етергенты располагаются на границе
раз дела ф аз ж ир-в ода и стабилиз ируют эм ульсию. Ж ирны е кислоты и
м оноацилглицеролы из этих капелек поглощ аются киш ечны м и клеткам и.
К ром е
перечисленны х
пищ ев арительны х
ф ерм ентов ,
сок
подж елудочной ж елез ы содерж итряд других : карбоксиэстераз ы (отщ епляют
глицерин отм оноацилглицерола), ф осф олипаз ы (расщ епляютф осф олипиды ),
х олестеролэстераз а (расщ епляет эф иры
х олестерина),
рибои
дез оксирибонуклеаз ы (раз руш аютнуклеинов ы екислоты ).
О стры й панкреатит – неинф екционное в оспаление подж елудочной
ж елез ы , которое наступает в рез ультате действ ия любы х причин,
в ы з ы в ающ их :
- пов ы ш енную секрецию панкреатического сока и з атруднение его
оттока с пов ы ш ением дав ления в панкреатических протоках . При этом
происх одитнаруш ением етаболиз м аклеток и в ы х од ф ерм ентов из лиз осом в
цитоплаз м у. Лиз осом альны еф ерм енты м огутактив иров атьз им огены ;
15
- з аброс в протоки пов реж дающ их клетки и актив ирующ их
панкреатическиеф ерм енты в ещ еств ;
- прям ое пов реж дение панкреацитов (з аболев ания ж елчев ы в одящ их
путей или дв енадцатиперстной киш ки, из бы точное питание ж ирной и
ж ареной пищ ей, прием алкоголя, наруш ения кров ообращ ения в организ м е и
в ж елез е, трав м ы
подж елудочной ж елез ы , отрав ления, в ирусны е
з аболев ания).
К ом бинация нескольких пусков ы х ф акторов з аболев ания станов ится
толчком для актив ации протеолитических ф ерм ентов в нутри протоков и
сам оперев арив ания подж елудочной ж елез ы . А ктив ны е панкреатические
ф ерм енты не только действ уют м естно, но и поступают з а пределы
подж елудочной ж елез ы – в окруж ающ ие ткани, в полость брюш ины , по
портальной систем е в печень, по лим ф атической систем е в кров ь. Э то
перв ичны еф акторы агрессии.
В торичны е ф акторы агрессии – кинины (брадикинин, серотонин,
гистам ин – горм оноподобны е в ещ еств а м естного действ ия), образ ов ание
которы х актив ируется под действ ием трипсина. О ни пов ы ш ают сосудистую
проницаем ость с ф орм иров анием отека ж елез ы . Ф осф олипаз а стим улирует
в ы работку простагландинов (ещ е одна группа горм оноподобны х в ещ еств
липидной природы ), которы е усилив ают секреторную актив ность
подж елудочной ж елез ы и проницаем ость м ем бран. О тм ечается такж е
усиление пероксидного окисления липидов , сниж ение антиоксидантной
з ащ иты клеток подж елудочной ж елез ы и накоплениев них ионов Са2+.
Ф акторы агрессии третьего порядка – иш ем ические токсины
панкреатического происх ож дения, наприм ер, ф актор депрессии м иокарда,
в ы з ы в ающ ий наруш ения сердечной деятельности.
Перв ы м и органам и-м иш еням и ф ерм ентной и токсической агрессии
оказ ы в аются печень и легкие, з атем сердце и центральная нерв ная систем а,
з атем почки. Раз в ив аются м оторны е наруш ения ж елудочно-киш ечного
тракта. Под в лиянием лечения и м ех аниз м ов тканев ой з ащ иты м ож ет
произ ойти частичное в осстанов ление структуры и ф ункций подж елудочной
ж елез ы и других пов реж денны х органов . М ож ет раз в иться х ронический
панкреатит, при котором в стадии обострения клетки подж елудочной ж елез ы
погибают, а в стадии з атух ания обострения на их м есте раз в ив ается
соединительная ткань.
К линическая лабораторная диагностика панкреатитов . Сущ еств ует
около 80 биох им ических и тех нических м етодов диагностики панкреатитов .
При из учении в неш несекреторной ф ункции подж елудочной ж елез ы чащ е
в сего определяют актив ность ф ерм ентов (ам илаз ы , липаз ы и трипсина) в
кров и; актив ность ам илаз ы в м оче; из оф ерм ентны й спектр ам илаз ы в кров и;
из м енения актив ности ам илаз ы , липаз ы и трипсина в кров и после
стим уляции подж елудочной ж елез ы секретином и х олецистокинином ;
уров ень эластаз ы и х им отрипсина в кале; исследуют ф ункции околоуш ной
ж елез ы , в которой при х роническом панкреатите м огут происх одить те ж е
16
из м енения, что и в подж елудочной ж елез е; исследуют кална содерж ание
триацилглицеролов и м ы ш ечны х в олокон; исследуютпанкреатический сок и
т.д. При исследов ании в нутрисекреторной ф ункции подж елудочной ж елез ы
прим еняют те ж е тесты , что и при диагностике сах арного диабета:
определение глюкоз ы в кров и; тест толерантности к глюкоз е; определение
концентрации инсулинаи глюкагонав кров и.
О пределен ие каталитической активн ости α-амилазы в сы воротке крови
α-ам илаз а (К Ф 3.2.1.1) катализ ирует гидролиз крах м ала, гликогена и
родств енны х поли- и олигосах аридов с образ ов анием
м альтоз ы ,
короткоцепочечны х декстринов и некоторого количеств а глюкоз ы . Ф ерм ент
секретируется подж елудочной и слюнны м и ж елез ам и, в ы яв лен такж е в
печени, легких , почках , киш ках .
Принцип м етода: α-ам илаз а катализ ирует гидролиз нераств орим ого
цв етного крах м ального субстрата с образ ов анием раств орим ого синего
красителя пропорционально каталитической актив ности ф ерм ента.
К онцентрацию красителя определяютф отом етрически при 590 нм .
Реактив ы : 1. Ц в етной крах м альны й субстрат (36 г/л) в ф осф атном
буф ере (60 м м оль/л) рН 7,0, содерж ащ ем натрий х лористы й 9 м м оль/л. 2.
О саж дающ ий раств ор: м агний сернокислы й 1,85 м оль/л, кислота
сульф осалицилов ая 2 м м оль/л, х елатон 3 - 1,3 м м оль/л.
Ход работы представ лен в таблице4.
Т аблица4.
Ход определения ам илаз ы в сы в ороткекров и
Реагенты , м л
Проба
К онтроль
Субстрат(№ 1)
1,0
1,0
0
Подогрев ают5 м ин при 37 С
Сы в оротка
0,1
Д истиллиров анная в ода
0,1
И нкубируютточно 15 м ин при 370С
О саж дающ ий реактив (№ 2)
2,0
2,0
Перем еш ив ают. Через 15 м ин центриф угируют 5 м ин. при 3000
об/м ин. или ф ильтруют. И з м еряют оптическую плотность надосадочной
ж идкости пробы (А ) против надосадочной ж идкости контроля. Д лина
в олны 590 нм .
Расчет. К аталитическую концентрацию α-ам илаз ы нах одят по
прилож енной калибров очной таблице, исх одя из полученной оптической
плотности (А ).
Н орм альны ев еличины : 2,3-5,8 м ккат/л.
Прим ечания. Пробы с экстрем ально в ы сокой концентрацией раз в одят
ф из иологическим раств ором NaCl, рез ультат ум нож ают на раз в едение.
Посуда не долж на содерж ать детергенты . Рез ультаты м огут бы ть искаж ены
следам и слюны и пота. Следуетф ильтров атьчерез бум аж ную в ату.
17
Д иагностическое з начение теста: А ктив ность ам илаз ы в сы в оротке
кров и пов ы ш ается при остром панкреатите, паротите, х роническом
рецидив ирующ ем панкреатите (но только в перв ы е 2-3 дня от начала
болев ого приступа), при кистеподж елудочной ж елез ы , стом атите, нев ралгии
лицев ого нерв а, паркинсониз м е, атакж ез асчетреабсорбции при перитоните,
непрох одим ости тонкого киш ечника, перф орации яз в ы , раз ры в е м аточной
трубы . Сниж ение актив ности ф ерм ента наблюдается при депрессии,
аутоим м унном з аболев ании слюнны х ж елез , панкреонекроз е, отрав лении
м ы ш ьяком , барбитуратам и.
Р абота 8. М етаболизм глюкозы в орган изме человека и его
н аруш ен ия. О пределен ие кон цен трации глюкозы в сы воротке крови и
моче. К ачествен н ы е реакции н а кетон овы е тела
М етаболиз м глюкоз ы в клетках организ м а челов ека. В клетки тканей
организ м а глюкоз а м ож ет поступать как экз огенная из пищ и, так и
образ ов анная эндогенно из гликогена (в процессе гликогенолиз а) или из
других субстратов (из лактата, глицерата, ам инокислот в рез ультате
глюконеогенез а). За перенос глюкоз ы в клетки отв ечают транспортны е
белки. Д ля поступления глюкоз ы в клетки больш инств а тканей организ м а
нуж ен инсулин. И нсулин – это горм он пептидной природы , которы й
в ы рабаты в ается β-клеткам и остров ков ого аппарата подж елудочной ж елез ы .
И нсулин оказ ы в аетсв оедейств иечерез рецепторы напов ерх ности клеток. В
клетки некоторы х тканей глюкоз а проникает и в отсутств ие инсулина – это
инсулиннез ав исим ы е ткани – слиз истая киш ечника, нерв ная ткань,
эритроциты и сем енники.
В
клетках глюкоз а ф осф орилируется с пом ощ ью ф ерм ента
гексокиназ ы , образ уя глюкоз о-6-ф осф ат. Глюкоз о-6-ф осф ат яв ляется
субстратом нескольких путей м етаболиз м а.
Т ипы регуляции углев одного обм ена. С уб с т рат ная регул я ц и я .
О снов ны м ф актором , определяющ им м етаболиз м глюкоз ы , яв ляется ее
концентрация в кров и (гликем ия). При уров не гликем ии м еньш ем 5,5-5,8
м м оль/л, печеньпостав ляетглюкоз у в кров ь, при больш ем уров не, наоборот,
преобладаетсинтез гликогенав печени и м ы ш цах .
В клетках слиз истой киш ечника, почках и печени содерж ится ф ерм ент
глюкоз о-6-ф осф атаз а. Э тот ф ерм ент отщ епляет ф осф атную группу от
глюкоз о-6-ф осф атас образ ов анием глюкоз ы . Св ободная глюкоз апоступаетв
кров ь. Т аким образ ом , в ы ш еперечисленны е ткани участв уют в регуляции
концентрации глюкоз ы в кров и.
Нервная регул я ц и я . В оз буж дение сим патических нерв ны х в олокон
прив одит к осв обож дению адреналина из надпочечников . А дреналин
стим улирует расщ епление гликогена и пов ы ш ение концентрации глюкоз ы в
кров и. Раз драж ение парасим патических нерв ны х в олокон сопров ож дается
усилением в ы деления инсулина подж елудочной ж елез ой, поступлением
глюкоз ы в клетку и сниж ением ееуров ня в кров и.
18
П очечная регул я ц и я . В клубочках почек глюкоз а ф ильтруется, з атем в
проксим альны х канальцах реабсорбируется. При прев ы ш ении в сы в оротке
уров ня 8,8-9,9 м м оль/л (почечны й порог) глюкоз а в ы деляется с м очой
(глюкоз урия). Почечны й порог м ож етбы тьсниж ен при з аболев аниях почек с
наруш ением реабсорбции.
Горм онал ьная регул я ц и я . Н ауров еньглюкоз ы в кров и в лияетш ирокий
спектр горм онов , но только инсулин в ы з ы в ает сниж ение уров ня глюкоз ы в
кров и – гипогликем ию. И нсулин синтез ируется в в иде неактив ного
проинсулина, в этом в иде он накаплив ается в β-клетках остров ков
Лангерганса подж елудочной ж елез ы . В рез ультате частичного протеолиз а
проинсулина образ уется актив ны й инсулин и С-пептид. И нсулин не
проникает в клетки; на пов ерх ности клеток сущ еств уют рецепторы к
инсулину. И нсулин усилив ает поступление в клетки глюкоз ы , К + и
ам инокислот, актив ирует м ногие в нутриклеточны е ф ерм енты . И нсулин
усилив ает синтез белков (протеогенез ), липидов (липогенез ) и гликогена.
И нсулин подав ляетраспад белков (протеолиз ), липидов (липолиз ), гликогена
(гликогенолиз ) и синтез глюкоз ы (глюконеогенез ). Глюкагон оказ ы в ает
эф ф екты , против ополож ны едейств ию инсулина.
Сах арны й диабет. Сах арны й диабет – это группа обм енны х
з аболев аний, х арактериз ующ их ся гипергликем ией, которая яв ляется
рез ультатом сниж ения синтез а или эф ф ектив ности действ ия инсулина.
В ы деляютдв атипадиабета.
Д иабета 1 типа (инсулиноз ав исим ы й диабет) х арактериз уется
абсолютны м деф ицитом секреции инсулина. Чащ е в оз никает в м олодом
в оз расте. Лица с в ы соким риском раз в ития этого типа диабета м огут бы ть
идентиф ициров аны по наличию в кров и антителк клеткам панкреатических
остров ков и по генетическим м аркерам . Причина этого типа диабета –
раз руш ение клеток
остров ков
подж елудочной
ж елез ы ,
обы чно
аутоим м унное. Ф акторы риска - в ирусны е инф екции, в оз действ ие
х им ических в ещ еств , трав м ы , в оспаление (панкреатит) или удаление
подж елудочной ж елез ы .
х арактериз уется
Д иабет2 типа(инсулинонез ав исим ы й диабет)
относитель-ны м деф ицитом секреции инсулина. Н ачинается обы чно у
в з рослы х .
О тм ечается сниж ение чув ств ительности к
инсулину
(рез истентность) у клеток инсулин-з ав исим ы х тканей. Рез истентностьм ож ет
прояв ляться на рецепторном и пострецепторном уров не. В кров и м огут
обнаруж ив аться антитела к клеточны м рецепторам инсулина. В больш ей
степени наследуется, чем диабет 1 типа. Ф акторы риска – ож ирение,
гипертоническая болез нь, атеросклероз .
Н аруш ения м етаболиз м а при сах арном диабете. У м еньш ение или
прекращ ение поступления глюкоз ы
в инсулин-з ав исим ы е клетки
сопров ож дается пов ы ш ением ее уров ня в кров и. При этом пов ы ш ается
поступлениеглюкоз ы в инсулин-нез ав исим ы еклетки. И з бы точная глюкоз ав
клетках прев ращ ается в сорбитол, которы й яв ляется осм отически актив ны м
19
в ещ еств ом и прив одит к поступлению в оды в клетки. В частности, с
накоплением сорбитола св яз ано в оз никнов ение катаракты у больны х
диабетом .
Гипергликем ия прив одит к пов ы ш енном у гликоз илиров анию белков –
образ ов анию ком плексов м еж ду глюкоз ой или ф руктоз ой и ам иногруппам и
белков и других аз отсодерж ащ их м олекул. О браз ующ иеся ком плексы
наз ы в аются ф руктоз ам ины .
Ф ункции
гликоз илиров анны х
белков
наруш аются; так, гликоз илиров анны й гем оглобин прочнее св яз ы в ает
кислород и х уж е отдает его тканям . В оз никают иш ем ия тканей, неф ропатия
(патология почек), ретинопатия (патология сетчатки глаз а), ангиопатия
(пов реж дениесосудов ) и другиепатологическиесостояния.
Гипергликем ия прив одитк глюкоз урии – в ы делению глюкоз ы с м очой.
Т ак как глюкоз а осм отически актив на, происх одит ув еличение объ ем а
в ы деляем ой м очи (пов ы ш ениедиурез а) и усилениеж аж ды .
У силение распада липидов прив одит к образ ов анию больш ого
количеств аацетил-коф ерм ентаА . И з бы ток ацетил-К оА , которы й неуспев ает
окисляться в цикле трикарбонов ы х кислот, в печени прев ращ ается в
кетонов ы е тела – ацетоуксусную, β-гидроксим асляную кислоты и в ацетон.
К етонов ы е тела поступают в кров ь и достав ляются в другие органы , где
м огут бы ть окислены с в ы делением энергии. Пов ы ш ение концентрации
кетонов ы х телв кров и м ож ет прив ести к кетоацидоз у, опасном у состоянию,
при котором сниж ен рН кров и.
У силенны й распад белков прив одитк сниж ению в есаи им м унитета. И з
ам инокислот путем глюконеогенез а образ уется глюкоз а, при этом
пов ы ш ается уров ень м очев ины в кров и, которая образ уется из ам иногрупп
ам инокислот.
Биох им ическиеанализ ы при сах арном диабете.
Ди агнос т и ка с ахарного ди аб ет а. В диагностике сах арного диабета
использ уют определение концентрации глюкоз ы в кров и (норм а – 3,33-5,55
м м оль/л) и глюкоз ы в м оче (в норм е нет). Т ест толерантности к глюкоз е
в ключает определение скорости в оз в рата концентрации глюкоз ы в кров и к
норм альном у уров ню послеприем аили в нутрив енного в в едения глюкоз ы . У
з доров ы х людей через дв а часа после в в едения глюкоз ы ее уров ень в кров и
в оз в ращ ается к норм е.
Ди агнос т и ка
ком пенс ац и и
с ахарного ди аб ет а.
О пределяют
концентрации кетонов ы х тел в кров и и в м оче, лактата в кров и (для
установ ления степени иш ем ии), ф руктоз ам инов и гликоз илиров анного
гем оглобина в кров и (прогноз раз в ития ослож нений), инсулина и глюкагона
в кров и.
О пределен ие глюкозы в сы воротке крови. Г люкозооксидазн ы й метод
Принцип м етода. При окислении β-D-глюкоз ы кислородом в оз дух апри
каталитическом действ ии глюкоз ооксидаз ы образ уется экв им олярное
количеств о пероксида в одорода. Под действ ием пероксидаз ы H2O2 окисляет
4-ам ино-антипирин в присутств ии ф енолов в окраш енное соединение.
20
И нтенсив ность окраски пропорциональна концентрации глюкоз ы
в
анализ ируем ом образ цеи из м еряется ф отом етрически при длинев олны 490540 нм .
Реактив ы . 1. Рабочий реагент, содерж ащ ий калий-ф осф атны й буф ер 0,1
м м оль/л, рН 7,4; 12,5 ед/м л глюкоз ооксидаз ы , 2,5 ед/м л пероксидаз ы , 8оксих инолин 0,75 м м оль/л, 4-ам иноантипирин 50 м м оль/л. 2. Стандартны й
раств ор глюкоз ы 10,0 м м оль/лв 0,15% раств оребенз ойной кислоты .
Ход работы . В нести в пробирки сы в оротку кров и и образ цы согласно
таблице 5. Пробы тщ ательно перем еш ать и инкубиров ать в течение 15 м ин.
при тем пературе 37°С. После окончания инкубации из м ерить в еличину
оптической плотности опы тной и калибров очной проб против контрольной
пробы при длине в олны 490-540 нм . О краска проб стабильна в течение 2 ч.
после инкубации при услов ии предох ранения от прям ого в оз действ ия
солнечны х лучей.
Т аблица5.
Ход определения глюкоз ы
Реактив ы
О пы тная
К алибров очная К онтрольная
проба, м л
проба, м л
проба, м л
Рабочий реагент
2,0
2,0
2,0
Сы в ороткакров и
0,02
Стандартны й раств ор
0,02
H2O
0,02
Расчет. Расчет концентрации глюкоз ы в анализ ируем ы х пробах
пров ести по ф орм уле:
С=
Е
Е
опы т
⋅ 10 ,
станд
где С - концентрация глюкоз ы , м м оль/л; Е опы т – оптическая плотность
опы тной пробы ; Е станд – оптическая плотность калибров очной пробы ; 10 –
концентрация глюкоз ы в стандартном раств оре, м м оль/л
Д иагностическое з начение теста. Глюкоз а - основ ной ком понент
энергетического обм ена в организ м е. Н орм альное содерж ание в кров и
состав ляет3,33 – 5,55 м м оль/л, в сы в ороткеи плаз м е- 3,8 – 6,2 м м оль/л.
Гипергликем ия (пов ы ш ение концентрации глюкоз ы в кров и) м ож ет
наблюдаться в ф из иологических услов иях : послеобильной углев одной пищ и,
ф из ических нагруз ок, сильны х эм оций.
Гипергликем ия м ож ет наблюдаться при м ногих патологических
состояниях : сах арном диабете, остром панкреатите, трав м ах , сотрясениях и
з аболев аниях голов ного м оз га, токсикоз ах и отрав лениях , псих ическом
в оз буж дении, пов ы ш енной горм ональной актив ности коры надпочечников и
передней доли гипоф из аи некоторы х других патологиях .
Гипогликем ия (сниж ение концентрации глюкоз ы в сы в оротке кров и)
бы в ает при передоз иров ке инсулина, з аболев аниях подж елудочной ж елез ы ,
21
з локачеств енны х опух олях , некоторы х пораж ениях печени, эндокринны х
з аболев аниях , в рож денной недостаточности ф ерм ентов (галактоз ем ия).
О пределен ие глюкозы мочи качествен н ы м методом
Принцип м етода. Глюкоз а в осстанав лив ает соли м еди (II), им еющ ие
голубую окраску, в соли м еди (I), в ы падающ ие из раств ора в в иде красного
осадка.
Реактив ы . Реактив Гайнеса, содерж ащ ий 13,3 г CuSO4·5H2O, 50 г NaOH
и 15 г глицеринав 1 лH2O.
Ход определения. К 4 м л реактив а Гайнеса прилив ают 1 м л м очи.
Став ятв кипящ ую баню на2 - 3 м инуты . В присутств ии глюкоз ы появ ляется
ж елтая или красная окраска ж идкости и осадок. При отсутств ии глюкоз ы
цв етж идкости нем еняется (остается синим ).
О ценка качеств а: полож ительная; слабо полож ительная; слабо
отрицательная; отрицательная.
К оличествен н ы й метод (А льтгаузен а) определен ия глюкозы мочи
Принцип м етода. Глюкоз а при нагрев ании с NaOH образ ует
окраш енноесоединение.
Реактив ы : 10%-й раств ор NaOH.
Ход определения: К 4 м л исследуем ой м очи прилить 1 м л 10%-го
NaOH и кипятить 1 - 3 м ин. в кипящ ей в одяной бане. О х ладить. Через 10
м ин. срав нитьсо ш калой контрольны х раств оров .
Приготов ление контрольны х раств оров . В з ять 1 г сух ой глюкоз ы и
раств орить в 25 м л без белков ой, без глюкоз ной м очи. И з этого 4%-го
раств ораготов ятраз в едения:
1. 3 м лраств ора+ 1 м лм очи = 3%-й раств ор
2. 2 м лраств ора+ 2 м лм очи = 2%-й раств ор
3. 1 м лраств ора+ 3 м лм очи = 1%-й раств ор
4. 0,5 м лраств ора+ 3,5 м лм очи = 0,5%-й раств ор.
К онтрольны е раств оры обрабаты в ают так ж е, как опы тную пробу.
Хранятоколо 2 недель.
Д иагностическоез начение. Глюкоз ав м очепояв ляется при пов ы ш ении
ее концентрации в кров и в ы ш е почечного порога реабсорбции (около 9
м м оль/л). Н аличиеглюкоз ы в м очем ож етбы тьприз наком сах арного диабета
или з аболев ания почек со сниж ением порогареабсорбции для глюкоз ы
К ачествен н ы е реакции н а кетон овы е тела в моче.
П роба Л ибен а
Реакция основ ана на св ойств е ацетона прев ращ аться в йодоф орм в
присутств ии йода в щ елочной среде. К 1 м лисследуем ой м очи добав ляют
несколько капель раств ора люголя (йод в раств оре йодистого калия) и
несколько капель 10%-го раств ора гидроксида натрия. При наличии ацетона
в м оче появ ляется пом утнение з а счет образ ов ания йодоф орм а, им еющ его
х арактерны й з апах :
22
CH3
C=O + 3I2 + 4NAOH
CH3
ацетон
CHI 3
+ CH3COONA + 3NAI + 3H2O
О садок йодоф орм а
(ж елты й, кристаллический)
П роба Л егаля
Реакция основ ана на том , что ацетон и ацетоуксусная кислота в
щ елочной среде образ уют с нитропруссидом натрия ком плексны е анионы
оранж ев о-красного цв ета, перех одящ его в в иш нев о-красны й при
подкислении концентриров анной уксусной кислотой. К 1 м лм очи добав ляют
несколько кристаллов нитропруссида натрия и 3-4 капли 10%-го раств ора
гидроксида натрия. При кетонурии появ ляется оранж ев ое окраш ив ание,
которое прев ращ ается в в иш нев ое при добав лении 5-8 капель
концентриров анной уксусной кислоты .
П роба Г ерхардта
Е нольная ф орм а ацетоуксусной кислоты , в з аим одейств уя с х лорны м
ж елез ом , образ ует ком плексное соединениев иш нев о-красного цв ета. К 1 м л
м очи добав ляют несколько капель х лорного ж елез а. При наличии в м оче
ацетоацетатапояв ляется в иш нев о-красноеокраш ив ание.
CH3
CH3
C=O
C-OH
CH2
CH
COOH
ацетоуксусная
кислота(кетоф орм а)
COOH
ацетоуксусная кислота
(енольная ф орм а)
Р абота 9. О бмен холестерин а в орган изме человека и его
н аруш ен ия. О пределен ие кон цен трации холестерин а в сы воротке крови
Холестерин (х олестерол) яв ляется соединением , типичны м для
м етаболиз м а ж ив отны х , и содерж ится в з начительны х количеств ах в
продуктах ж ив отного происх ож дения - в яичном ж елтке, м ясе, печени и
м оз ге. Холестерин представ ляет собой ам ф ипатический липид и яв ляется
нез ам еним ы м структурны м ком понентом м ем бран. Холестерин содерж ится в
состав е липопротеинов либо в св ободной ф орм е, либо в в иде эф иров с
длинноцепочечны м и ж ирны м и кислотам и. Липопротеины транспортируют
х олестерин в кров отоке, где легко устанав лив ается рав нов есие с
х олестерином , в х одящ им в состав других липопротеинов и м ем бран.
23
Липопротеины плаз м ы кров и. Н ераств орим ость ж иров в в оде
обуслов лив ает необх одим ость сущ еств ов ания специальны х транспортны х
ф орм для переноса их кров ью. О снов ны е из этих ф орм : х илом икроны ,
липопротеины очень низ кой плотности (ЛПО Н П, пре-β-липопротеины ),
липопротеины низ кой плотности (ЛПН П, β-липопротеины ), липопротеины
в ы сокой плотности (ЛПВ П, α-липопротеины ). Липопротеины представ ляют
собой м елкие (до 1 м км диам етром ) глобулярны е образ ов ания, в которы х
м олекулы ф осф олипидов , х олестерина и белков располож ены радиально
гидроф ильной частью к пов ерх ности, гидроф обной частью к центру.
Ц ентральная часть глобулы з анята триацилглицеролам и и эф ирам и
х олестерина. Плотностьлипопротеинов прям о пропорциональнасодерж анию
белкаи обратно пропорциональнасодерж анию триацилглицеролов .
О бм ен х олестерина. Холестерин синтез ируется в о м ногих тканях из
ацетил-К оА . Приблиз ительно полов ина х олестерина, им еющ егося в
организ м е, образ уется путем биосинтез а (около 500 м г/сутки), а другая
полов ина поступает с пищ ей. Холестерин синтез ируется глав ны м образ ом в
печени (до 80%), киш ечникеи кож е. Холестерин яв ляется предш еств енником
других стероидов , а им енно кортикостероидов (горм онов надпочечников ),
полов ы х горм онов , ж елчны х кислот и в итам ина Д . И з организ м а челов ека
еж еднев но в ы в одится около 1 г х олестерина. Прим ерно полов ина этого
количеств а экскретируется с ф екалиям и после прев ращ ения в ж елчны е
кислоты . О став ш аяся часть в ы в одится в в иде нейтральны х стероидов .
Ж елчны е кислоты образ уются из х олестерина в печени. О ни способств уют
эм ульгиров анию ж иров в процессе пищ ев арения и в сасы в анию ж иров в
киш ечнике. Значительная доля солей ж елчны х кислот, поступающ их с
ж елчью в киш ечник, в сасы в ается в киш ечнике и через в оротную в ену
в оз в ращ ается в печень (киш ечно-печеночная циркуляция ж елчны х кислот).
Д ля в осполнения потерьж елчны х кислотв печени постоянно осущ еств ляется
синтез ж елчны х кислот из х олестерина в количеств ах , экв ив алентны х
в ы в одим ом у.
Н аруш ения обм ена х олестерина. В се состояния и з аболев ания, при
которы х из м еняется содерж ание х олестерина в организ м е, кров и или
отдельны х тканях , м ож но раз бить на три группы : перв ая х арактериз уется
из м енением содерж ания х олестерина в плаз м е и тканях ; в торая объ единяет
в се в иды гипер- и гипох олестеринем ий; к третьей относятся болез ни
локального накопления в раз личны х клетках и тканях х олестерина и его
произ в одны х .
Холестерин яв ляется основ ны м ком понентом ж елчны х кам ней, однако
его глав ная роль в патологии состоит в том , что он служ ит ф актором ,
в ы з ы в ающ им атеросклероз ж из ненно в аж ны х артерий голов ного м оз га,
сердечной м ы ш цы и других органов .
А теросклероз
–
патология,
х арактериз ующ аяся отлож ением
х олестерина в стенках сосудов . Глав ная причина отлож ений –
гиперх олестеринем ия на ф оне пов реж дений эндотелия, в ы з в анны х
24
гипертонией, в оспалительны м и процессам и, пов ы ш енной св ерты в аем остью
кров и, в оз действ ием токсических в ещ еств (наприм ер, ком понентов
табачного ды м а). В пов реж денны х участках сосудистой стенки эндотелий
оказ ы в ается проницаем ы м для ряда в ещ еств . В стенку сосуда м огут
проникать в се липопротеины , кром е х илом икронов . О днако атерогенны м и
яв ляются ЛПО Н П и ЛПН П, содерж ащ ием ного х олестерина. Липопротеины ,
проникш ие в сосудистую стенку, поглощ аются ф агоцитам и и в се их
состав ны е части, кром е х олестерина, раз руш аются ф ерм ентам и. Холестерин
этериф ицируется, эф иры х олестеринанакаплив аются в клетках и раз руш ают
их . В округ образ ующ их ся липидны х бляш ек раз в ив ается соединительная
ткань, наступает кальциф икация пораж енного участка сосуда. Сосуды
станов ятся плотны м и, неэластичны м и, ух удш ается кров оснабж ение тканей,
нам естебляш ек м огутв оз никатьтром бы .
Гиперх олестеринем ия – рез ультат наруш ения в одном из з в еньев
слож ной биох им ической систем ы , в ключающ ей синтез х олестерола, его
обм ен, транспорт и в ы в едение, ф орм иров ание липопротеинов , их
катаболиз м , рецепцию липопротеинов клеткам и. Т ак, з начительны й из бы ток
х олестерина в питании, х отя и в едет к з ам едлению его биосинтез а, м ож ет
яв иться причиной гиперх олестеринем ии. При сниж ении количеств а
клеточны х рецепторов к х олестерину клетки теряютспособность поглощ ать
х олестерин из кров и, что такж ев едетк раз в итию гиперх олестеринем ии.
В настоящ ее в рем я м етоды предупреж дения и лечения атеросклероз а
направ лены на то, чтобы ум еньш ить его поступление в организ м (диеты ),
усилить обратны й отток из тканей путем сниж ения х олестеринем ии з а счет
подав ления синтез а, прям ого удаления из организ м а (гем осорбции), путем
ограничения в сасы в ания или ув еличения экскреции (преры в ание киш ечнопеченочной циркуляции ж елчны х кислот). О тм ечено, что содерж аниев пищ е
полиненасы щ енны х ж ирны х кислот яв ляется ф актором , сниж ающ им
содерж аниех олестеринав кров и.
Лабораторная диагностика наруш ений
обм ена х олестерина.
О пределяютконцентрацию общ его х олестеринав сы в оротке(плаз м е) кров и.
Пов ы ш ение показ ателя в ы ш е 6,5 м м оль/л - указ ание на в оз м ож ность
раз в ития атеросклероз а. Т акж е определяют концентрацию х олестерина в о
ф ракции ЛПВ П: сниж ение этого показ ателя ниж е 0,9 м м оль/луказ ы в ает на
в оз м ож ность раз в ития атеросклероз а. В ероятность раз в ития атеросклероз а
прогноз ируется оптим ально так наз ы в аем ы м индексом атерогенности –
отнош ением сум м арного содерж ания х олестерина в ЛПН П и ЛПО Н П к его
содерж анию в ЛПВ П. Э то отнош ениев 20-30 летот2 до 2,8; старш е30 – до
3,5, ау больны х атеросклероз ом – в ы ш е4,0. Д иагностическоез начениеим еет
и содерж аниесум м арного содерж ания х олестеринак сум м еф осф олипидов : в
норм еоколо 1,0, при атеросклероз е1,5 и в ы ш е.
О пределен ие кон цен трации общ его холестерин а в сы воротке крови
Принцип м етода. При гидролиз е эф иров х олестерина ф ерм ентом
х олестеролэстераз ой образ уется св ободны й х олестерин. О браз ов ав ш ийся и
25
им еющ ийся в пробе х олестерин окисляется кислородом в оз дух а под
действ ием х олестеролоксидаз ы с образ ов анием экв им олярного количеств а
перекиси в одорода. Под действ ием пероксидаз ы перекисьв одородаокисляет
х ром огенны е субстраты
с образ ов анием
окраш енного продукта.
И нтенсив ность окраски пропорциональна концентрации х олестерина в
пробе.
Реактив ы . 1. Рабочий реагент: 0,1 м оль/л ф осф атны й буф ер,
содерж ащ ий 20 м м оль/л ф енол, детергенты , актив аторы и стабилиз аторы
ф ерм ентов , х ром огены , 200 U/л х олестеролэстераз ы , 250 U/л
х олестеролоксидаз ы , 500 U/л пероксидаз ы . 2. Стандартны й раств ор
х олестеринасодерж ит5,17 м м оль/лх олестерина.
Ход работы . В трех пробирках – опы тной, калибров очной и
контрольной – см еш ив аютреактив ы согласно таблице6.
Содерж им ое пробирок тщ ательно перем еш ив ают и инкубируют не
м енее 5 м ин. при тем пературе 37°С. И з м еряют оптическую плотность
опы тной и калибров очной проб против контрольной пробы при длинев олны
490-500 нм . О краска стабильна в течение 2 часов при предох ранении от
прям ого солнечного св ета.
Т аблица6.
Ход определения х олестерина
Реактив ы , м л
О пы тная проба К алибров очная К онтрольная
проба
проба
Сы в оротка
0,02
В ода
0,02
дистиллиров анная
Рабочий реагент
2,0
2,0
2,0
Стандартны й раств ор
0,02
х олестерина
Расчет. Расчетконцентрации х олестеринапров одятпо ф орм уле:
С = (Е 0/Eст)х 5,17 м м оль/л,
гдеЕ 0 – оптическая плотностьопы тной пробы ;
Eст – оптическая плотностькалибров очной пробы ,
из м еренны еотносительно контрольной пробы .
Содерж аниех олестерина: идеальноесодерж ание < 5,2 м м оль/л;
допустим оесодерж ание– 5,2 – 6,5 м м оль/л;
патологическоесодерж ание> 6,5 м м оль/л.
Д иагностическое з начение теста. У в еличение концентрации
х олестерина в кров и – гиперх олестеринем ия – яв ляется достов ерны м
ф актором рискараз в ития атеросклероз а.
26
Р абота 10. М етоды определен ия и классификация витамин ов.
К олориметрический метод определен ия аскорбин овой кислоты в плазме
М етоды определения в итам инов в биологических объ ектах делят на
ф из ико-х им ические и биологические. Н екоторы е в итам ины обладают
способностью поглощ атьоптическоеиз лучениеопределенной части спектра.
В частности, в итам ин А им еетспециф ичную полосу поглощ ения при 328-330
нм . Е го концентрацию определяют спектроф отом етрически. При
в з аим одейств ии в итам инов с рядом х им ических соединений наблюдаются
х арактерны е цв етны е реакции. Поэтом у в итам ины м ож но определить
ф отоколорим етрически, наприм ер, в итам ин B1 - при пом ощ и диаз ореактив аи
т.д. Д ля определения в итам инов B1, В 2 и других прим еняют
ф люором етрические м етоды . И спольз уют и титрим етрические м етоды ,
наприм ер, при определении в итам ина С прим еняют титров ание pacтв ором
2,6-дих лорф енолиндоф енола.
Э ти м етоды
поз в оляют судить о
количеств енном содерж ании в итам инов в исследуем ом пищ ев ом продукте
или органах и тканях ж ив отны х и челов ека.
Д ля в ы яснения обеспеченности организ м а челов ека каким -либо
в итам ином часто количеств енно определяют соотв етств ующ ий в итам ин или
продукт его обм ена в сы в оротке кров и, м оче или биопсийном м атериале.
Э кскрецию в итам инов рассчиты в ают на 1 г креатинина. О бъ ектив ную
инф орм ацию об обеспеченности организ м а в итам ином такж е дает
определение актив ности ф ерм ентов , использ ующ их в х оде катализ а
коф ерм ентную ф орм у данного в итам ина. Н априм ер, определение степени
актив ации транскетолаз ы эритроцитов последобав ления тиам инпироф осф ата
яв ляется чув ств ительны м тестом оценки обеспеченности организ м а
в итам ином B1.
Биологические м етоды основ аны на определении того м иним ального
количеств а в итам ина, которое при добав лении к искусств енной диете,
лиш енной данного в итам ина, предох раняет ж ив отное от раз в ития
ав итам иноз аили из лечив аетего отуж ераз в ив ш ейся болез ни. Э то количеств о
в итам ина приним ают з а единицу (в литературе из в естны « голубины е»,
« кры сины е» единицы ). Больш ое м есто в количеств енном определении ряда
в итам инов : ф олиев ой кислоты , в итам ина В 12 и др. в биологических
ж идкостях , в частности, в кров и, з аним ают м икробиологические м етоды ,
основ анны е на из м ерении скорости роста бактерий; последняя
пропорциональна концентрации в итам ина в исследуем ом объ екте.
К оличеств о в итам инов принято в ы раж ать, кром е того, в м иллиграм м ах ,
м икрограм м ах , м еж дународны х единицах (ME или IU).
К лассификация витамин ов
Сов рем енная классиф икация в итам инов неяв ляется сов ерш енной. О на
основ ананаф из ико-х им ических св ойств ах (в частности, раств орим ости) или
на х им ической природе, но до сих пор сох раняются и букв енны е
обоз начения. В з ав исим ости от раств орим ости в неполярны х органических
раств орителях или в в одной среде раз личают ж ирораств орим ы е и
27
в одораств орим ы е в итам ины . В прив одим ой классиф икации в итам инов ,
пом им о букв енного обоз начения, в скобках указ ан основ ной биологический
эф ф ект, иногда с пристав кой « анти», указ ы в ающ ей на способность данного
в итам ина предотв ращ ать или устранять раз в итие соотв етств ующ его
з аболев ания; далее прив одится ном енклатурное х им ическое наз в ание
каж дого в итам ина.
В итам ины , раств орим ы ев ж ирах :
1. В итам ин А (антиксероф тальм ический); ретинол;
2. В итам ин D (антирах итический); кальциф еролы ;
3. В итам ин Е (антистерильны й, в итам ин раз м нож ения); токоф еролы ;
4. В итам ин К (антигем оррагический); наф тох иноны .
В итам ины , раств орим ы ев в оде:
1. В итам ин B1 (антинев ритны й); тиам ин;
2. В итам ин В 2 (в итам ин роста); рибоф лав ин;
3. В итам ин В 6 (антидерм атитны й, адерм ин); пиридоксин;
4. В итам ин В 12 (антианем ический); цианкобалам ин; кобалам ин;
5. В итам ин РР (антипеллагрический, ниацин); никотинам ид;
6. В итам ин В с (антианем ический); ф олиев ая кислота;
7. В итам ин В 3 (антидерм атитны й); пантотенов ая кислота;
8. В итам ин Н (антисеборейны й, ф актор ростабактерий, дрож ж ей и грибков );
биотин;
9. В итам ин С (антискорбутны й); аскорбинов ая кислота;
10. В итам ин Р (капилляроукрепляющ ий, в итам ин проницаем ости);
биоф лав оноиды .
Пом им о этих дв ух глав ны х групп в итам инов , в ы деляют группу
раз нообраз ны х х им ических в ещ еств , из которы х часть синтез ируется в
организ м е, но обладает в итам инны м и св ойств ам и. Д ля челов ека и ряда
ж ив отны х эти в ещ еств апринято объ единятьв группу в итам иноподобны х .
К олориметрический метод определен ия аскорбин овой кислоты в
плазме крови
Принцип м етода. М етод основ ан на учете интенсив ности окраски
продукта, образ ов анного в рез ультатев з аим одейств ия аскорбинов ой кислоты
и ф осф орно-в ольф рам ов ой кислоты .
Реактив ы . 1. Раств ор ф осф орно-в ольф рам ов ой кислоты (в 30 м лв оды
при нагрев ании на в одяной бане раств оряют 20 г NaWО 4•2Н 20 и 10 г
Nа2HPО 4•2Н 2О ; в 15 м лв оды раств оряют 5 м лконцентриров анной H2SO4,
з атем в торой раств ор м едленно в лив ают в теплы й раств ор в ольф рам ата и
см есь кипятят с обратны м х олодильником в течение 2 ч.). 2. Стандартны й
раств ор аскорбинов ой кислоты (2 м г/м л) в 0,5%-м раств оре щ ав елев ой
кислоты .
Ход работы . В центриф уж ную пробирку в носят 2 м лплаз м ы , з атем
м едленно прибав ляют 2 м л раств ора ф осф орно-в ольф рам ов ой кислоты ,
перем еш ив ают, остав ляют на 30 м ин. и центриф угируют 15 м ин. при 3000
28
об/м ин. О птическую плотностьсупернатантаиз м еряютпротив контроля при
700 нм .
Расчет. К онцентрацию аскорбинов ой кислоты рассчиты в ают по
калибров очном у
граф ику,
построенном у
с
использ ов анием
св еж еприготов ленного стандартного раств ора аскорбинов ой кислоты
согласно таблице7. Граф ик линеен в интерв алеконцентраций аскорбинов ой
кислоты от0,5 до 2 м г в 100 м л.
Т аблица7.
Приготов лениекалибров очны х раств оров аскорбинов ой кислоты
Н ом ера
Содерж аниеаскорбинов ой
Реактив ы , м л
пробирок Э талонны й раств ор
кислоты , м г/м л
Н 2О
1
1
4
0,4
2
2
3
0,8
3
3
2
1,2
4
4
1
1,6
5
5
0
2,0
Задачи по теме «В итамин ы »
В ариан т № 1
1. Суточная потребность в з рослого челов ека в никотинов ой кислоте
ум еньш ается, если в пищ е содерж ится больш ое количеств о ам инокислоты
триптоф ана. Что м ож но сказ ать о в з аим осв яз и м еж ду никотинов ой кислотой
и триптоф аном наоснов еэтого наблюдения?
2. В лев ой части страницы перепиш ите столбиком обоз начения
в итам инов (см . ниж е). Против каж дого справ а укаж ите его биологическую
роль.
В итам ины : B2 (пантотенов ая кислота), B5 (PP), B6, B12, Bс (ф олиев ая
кислота), А , E, К .
Биологическая роль: а – участв уетв реакции образ ов ания ф орм ильной
группы из серина; б – в х одит в состав дегидрогеназ ; в – стим улирует обм ен
ам инокислот; г – участв ует в синтез е 2-го ф актора св ерты в ания кров и; д – в
состав м олекулы в х одит ам идная группа; е – ослабляет цепны е
св ободнорадикальны е процессы ; ж – при ав итам иноз е раз в ив ается анем ия; з
– при ав итам иноз ев оз никаетусиленноеорогов ениеэпителия.
3. О бъ ясните, почем у работа в горячих цех ах з начительно пов ы ш ает
потребностьв в итам инах .
В ариан т № 2
1. П ол и неври т у гол уб ей. В став ш их классическим и эксперим ентах
голуби, содерж ащ иеся на эксперим ентальной диете, утрачив али
координацию дв иж ений и способность удерж ив ать тело в рав нов есии.
У ров ень пирув ата в кров и и м оз гу этих птиц з начительно прев ы ш ал
норм альны й. Т акое состояние прох одило, если голубям дав али м ясо.
О бъ яснитеэти наблюдения.
29
2. В лев ой части страницы перепиш ите столбиком обоз начения
в итам инов (см . ниж е). Против каж дого справ а укаж ите его биологическую
роль.
В итам ины : B2, B3 (пантотенов ая кислота), B5 (PP), Bс (ф олиев ая
кислота), С, А , Д , К .
Биологическая роль: а – участв ует в переносе ацильны х групп; б –
в х одит в состав ф лав опротеинов ; в – необх одим для образ ов ания
гидроксилиз ина и гидроксипролина в состав е коллагена; г – в состав
м олекулы в х одятглутам инов ая и параам инобенз ойная кислоты ; д – в х одитв
состав ф оточув ств ительны х элем ентов глаз а; е – образ уется в кож е под
в лиянием ультраф иолетов ы х лучей; ж – участв ует в образ ов ании γкарбоксиглутам инов ой кислоты ; з – в х одитв состав Н А Д + и Н А Д Ф +.
3. О бъ ясните, почем у в детском в оз расте потребность в в итам инах
в ы ш е, чем у в з рослы х .
В ариан т № 3
1. Lactobacillus casei – представ ители сем ейств а бактерий,
использ уем ы х для получения таких продуктов брож ения, как йогурт,
кв аш еная капуста, соленья, не способны синтез иров ать рибоф лав ин.
Характерное св ойств о этих бактерий з аключается в том , что они получают
энергию з асчетрасщ епления глюкоз ы до м олочной кислоты (рК 3,5). К акой
м етод количеств енного определения рибоф лав инав ы предлож или бы , исх одя
из этой инф орм ации?
2. В лев ой части страницы перепиш ите столбиком обоз начения
в итам инов (см . ниж е). Против каж дого справ а укаж ите его биологическую
роль.
В итам ины : Bс (ф олиев ая кислота), С, B5 (PP), B12, H (биотин), А , Д , Е .
Биологическая роль: а– ав итам иноз м ож етв оз никнутьпри наруш ении
секреторной ф ункции добав очны х клеток ж елудка; б – яв ляется
антиоксидантом ; в – при гипов итам иноз е наруш ается структура
соединительной ткани; г – св яз ы в аетСО 2; д – в х одитв состав родопсина; еучаств ует в переносе одноуглеродны х ф рагм ентов (м етильной группы ); ж стим улирует отлож ение кальция и ф осф ора в костях ; з – в х одит в состав
НАД Ф Н.
3. При перех оде на рацион с в ы соким содерж анием белка организ м
начинает испы ты в ать пов ы ш енную потребность в в итам ине B6. О бъ ясните
м ех аниз м этого яв ления.
В ариан т № 4
1. Бактерии Lactobacillus casei растутнапростой культуральной среде,
содерж ащ ей рибоф лав ин, пиридоксин и четы ре ам инокислоты . Е сли в
культуральную среду добав итьполны й набор ам инокислоти рибоф лав ин, то
количеств о пиридоксина, необх одим ого для оптим ального роста бактерий,
сократиться на90%. О бъ ясните, почем у так происх одит.
30
2. В лев ой части страницы перепиш ите столбиком обоз начения
в итам инов (см . ниж е). Против каж дого справ а укаж ите его биологическую
роль.
В итам ины : B1, B2, B3 (пантотенов ая кислота), B5 (PP), H (биотин), Д , E,
К.
Биологическая роль: а – им еет стероидную структуру; б – в х одит в
состав коф ерм ента А ; в – участв ует в окислении сукцината; г – участв ует в
окислительном декарбоксилиров ании пиров иноградной и 2-оксоглутаров ой
кислот; д – стим улятор биосинтез а протром бина; е – ослабляет цепны е
св ободнорадикальны е процессы ;
ж
–
участв ует в
реакциях
карбоксилиров ания; з – в х одитв состав Н А Д Ф Н .
3. При расследов ании дорож но-транспортного происш еств ия бы ло
установ лено, что в одитель страдает гипов итам иноз ом . Э то послуж ило
причиной столкнов ения дв ух ав том обилей в ночное в рем я. Н едостаток
какого в итам инаприв елк трагедии?
В ариан т № 5
1. Бактерии Streptococcus faecalis, обитающ ие в толстом киш ечнике,
нуж даются в в итам ине ф олиев ой кислоте. Е сли в питательной среде
содерж атся аденин и тим ин, то бактерии м огутх орош о расти и в отсутств ии
ф олиев ой кислоты . Почем у бактерии нуж даются в ф олиев ой кислоте?
Почем у потребность в ф олиев ой кислоте исчез ает при добав лении в
культуральную среду аденинаи тим ина?
2. В лев ой части страницы перепиш ите столбиком обоз начения
в итам инов (см . ниж е). Против каж дого справ а укаж ите его биологическую
роль.
В итам ины : B1, B2, B3 (пантотенов ая кислота), B6, С, А , Д , К .
Биологическая роль: a - стим улирует синтез коллагена в
соединительной ткани; б – переноситостаток уксусной кислоты ; в – яв ляется
коф ерм ентом сукцинатдегидрогеназ ы ; г - при гиперв итам иноз енаблюдается
кальциф икация тканей организ м а; д – в х одит в состав слож ного белка
родопсина; е- участв уетв прев ращ ении одних ам инокислотв другие; ж - при
недостатке в итам ина ув еличив ается в рем я св ерты в ания кров и; з - при
гипов итам иноз еув еличив ается содерж аниепиров иноградной кислоты .
3. О бъ ясните целесообраз ность прием а в итам ина Е и его аналогов
специалистам и, работающ им и в з онепов ы ш енной радиации.
В ариан т № 6
1. В итам ины А и D м ож но прим енять сраз у з а один прием в
количеств е, которое достаточно для поддерж ания их норм ального уров ня в
течение нескольких недель; в итам ины ж е группы В необх одим о приним ать
з начительно чащ е. Почем у?
31
2. В лев ой части страницы перепиш ите столбиком обоз начения
в итам инов (см . ниж е). Против каж дого справ а укаж ите его биологическую
роль.
В итам ины : B1, B3 (пантотенов ая кислота), B5 (PP), B6, С, Bс (ф олиев ая
кислота), Д , К .
Биологическая роль: а– пов ы ш аетэластичностьсосудов и капилляров ;
б – источником в итам инаяв ляется х олестерин; в – в состав в итам инав х одит
2,4-диокси-3,3-дим етилм асляная кислота и β-аланин; г – участв ует в
окислении спиртов , альдегидов , ам инокислот, органических кислот; д –
участв уетв переносеодноуглеродны х остатков ; е– необх одим для окисления
пиров иноградной кислоты до уксусной; ж – участв ует в образ ов ании γкарбоксиглутам инов ой кислоты в состав е протром бина; з – в х одит в состав
ам инотрансф ераз .
3. И з в естно, что ж елчны е кислоты актив но в лияют на в сасы в ание
ж иров в киш ечнике. О пиш ите картину гипов итам иноз а у больны х людей с
наруш ением поступления ж елчи в киш ечник.
Р абота 11. К оличествен н ое определен ие пировин оградн ой кислоты
в крови колориметрическим методом (по У мбрайту)
Пиров иноградная кислота (пирув ат) яв ляется одним из центральны х
м етаболитов углев одного обм ена. О на образ уется в процессе распада
глюкоз ы и гликогена в тканях , при окислении м олочной кислоты , а такж е в
рез ультате прев ращ ений ряда ам инокислот. При окислительном
декарбоксилиров ании пирув ата образ уется ацетил-К оА , которы й в ступает в
цикл К ребса. Пиров иноградная кислота - один из основ ны х субстратов
глюконеогенез а.
Принцип м етода. Пирув ат при в з аим одейств ии с 2,4-динитроф енилгидраз ином
в
кислой среде образ ует 2,4-динитроф енилгидраз он
пиров иноградной кислоты . Э то соединение в щ елочной среде приобретает
коричнев о-красную окраску, интенсив ностькоторой прям о пропорциональна
содерж анию пирув ата.
Реактив ы . 1. 10 %-й раств ор трих лоруксусной кислоты (Т ХУ ). 2. 3%-й
раств ор NaOH. 3. 0,1 %-й раств ор 2,4-динитроф енилгидраз ина(2,4-Д Н Ф Г). 4.
Э талонны й раств ор, содерж ащ ий 2 м г пирув атанатрия в 100 м лH2O.
Ход работы . В центриф уж ную пробирку отм еряют 2 м л Т ХУ ,
добав ляют 0,5 м л кров и, в з балты в ают и остав ляют стоять 10 м ин. для
осаж дения белков ; з атем центриф угируют 5 м ин. при 3000 g. Д алее берут 2
пробирки — в перв ую в носят 0,5 м л центриф угата (опы тная проба), в о
в торую 0,5 м л H2O. В обе пробирки добав ляют по 0,5 м л 3%-го NaOH,
в ы держ ив ают5 м ин. при ком натной тем пературе, добав ляют0,15 м л0,1%-го
2,4-Д Н Ф Г, перем еш ив ают и пом ещ ают в терм остат при 37˚С на 15 м ин.
Затем добав ляют 3,5 м л 3%-го NaOH и через 5 м ин. опы тную пробу
ф отоколорим етрируютпри 440 нм в кюв етах с толщ иной слоя 0,5 см , против
контроля.
32
Расчет. Содерж ание пирув ата в пробе определяют по калибров очном у
граф ику, построенном у по стандартны м раств орам пирув ата.
Построениекалибров очного граф ика. И з эталонного раств орапирув ата
приготав лив аюткалибров очны ераств оры согласно таблице8.
Т аблица8.
Приготов лениекалибров очны х раств оров пирув ата
Н ом ера
Реактив ы , м л
Содерж аниепирув ата
пробирок Э талонны й раств ор
Н 2О
м г%
м км оль/л
1
1
4
0,4
36
2
2
3
0,8
72
3
3
2
1,2
109
4
4
1
1,8
163
5
5
0
2
181
И з каж дой пробирки отбирают по 0,5 м лкалибров очны х раств оров и
обрабаты в ают так ж е, как опы тную пробу. По рез ультатам из м ерений
построить граф ик з ав исим ости оптической плотности раств оров от
концентрации пирув ата.
К линическое з начение определения пирув ата. Содерж ание пирув ата в
кров и з доров ого челов екаколеблется от0,4 до 1,2 м г в децилитрекров и (34102 м км оль/л), ав м оче- от10 до 25 м г в суточном диурез е.
Н аиболее рез кое пов ы ш ение концентрации пирув ата отм ечается при
м ы ш ечной работе и В 1-в итам инной недостаточности. При больш их
ф из ических нагруз ках концентрация пирув атам ож етпов ы ш аться до 5 м г/100
м л. К ром е того, пов ы ш ение содерж ания пирув ата в кров и отм ечается при
парех им атоз ны х з аболев аниях печени, сах арном диабете, сердечной
деком пенсации, токсикоз ах . В спинном оз гов ой ж идкости концентрация
пирув атаз начительно пов ы ш ается послетрав м ы черепа, при в оспалительны х
процессах - м енингите, абсцессе м оз га. Пов ы ш енное содерж ание пирув ата
токсично для организ м а.
Р абота 12. Б иологическое окислен ие. К оличествен н ое определен ие
А Т Ф и креатин фосфата мы ш ц
Роль кислорода в м етаболиз м е. О рганиз м челов ека ф ункционирует в
аэробны х услов иях : 90% энергии он получает при участии кислорода.
К ислород в ы полняет дв е в аж нейш ие ф ункции в м етаболиз м е в процессе
ж из недеятельности:
1) яв ляется конечны м акцептором электронов и протонов при
биологическом окислении (оксидаз ны й путьиспольз ов ания кислорода);
2) в ы полняет пластическую ф ункцию: кислород в страив ается в
процессе м икросом ального окисления в гидроф обны е соединения, перев одя
их в гидроф ильны е(оксигеназ ны й путьиспольз ов ания кислорода).
И з в естно около 200 ф ерм ентов , использ ующ их м олекулярны й
кислород в качеств е одного из субстратов . В се они делятся на дв а класса в
33
з ав исим ости от того, в ключается кислород или нетв другой субстратв х оде
такой реакции:
1) оксидаз ы : кислород не в ключается в субстрат, а использ уется как
акцептор электронов . Сущ еств ует дв а типа оксидаз , одни образ уют в
качеств еодного из продуктов в оду, адругие— перекисьв одорода:
SH2 + 1/2 O2 → S + H2O
SH2 + O2 → S + H2O2
2) оксигеназ ы — кислород в ключается в субстрат. Сущ еств ует такж е
дв атипаоксигеназ :
а) м онооксигеназ ы (или гидроксилаз ы ) — в ключаюттолько один атом
кислорода:
SH2 + 1/2 O2 → H-S-OH
б) диоксигеназ а— в ключаютдв акислородав субстрат:
SH2 + O2 → HO-S-OH
кислорода м огут
Т оксичность кислорода. А ктив ны е ф орм ы
образ ов ы в аться при переносе электронов от окисляем ы х субстратов на
кислород или неф ерм ентатив но. К актив ны м ф орм ам кислорода относятся:
супероксид-ион, гидроксильны й радикал, пероксид-ион, синглетны й
кислород. Д анны ечастицы представ ляютсобой опасность для ж из ни клеток
в следств ие пов реж дений, которы е они способны причинять в сем классам
биом олекул, особенно белкам и липидам , в ы з ы в ая пероксидное окисление
ненасы щ енны х ж ирны х кислот.
В ж ив ой клетке происх одит детоксикация пероксида в одорода и
супероксид-иона при участии природны х антиоксидантов (аскорбинов ой
кислоты , в итам ина Е , глутатиона) и ф ерм ентов (супероксиддисм утаз ы ,
каталаз ы , глутатионпероксидаз ы ).
М акроэргические м олекулы . А Т Ф . К м акроэргическим относятся
соединения, при гидролиз е которы х в ы деляется энергия не м енее 7
ккал/м оль. Н аиболее распространенны м и м акроэргическим и соединениям и
яв ляются нуклеоз идтриф осф аты , которы е м огут передав ать св ою концев ую
в ы сокоэнергетическую ф осф атную группу любой из м ногочисленны х
органических м олекул-акцепторов . В ы сокоэнергетические нуклеотиды
в ы ступают в качеств е унив ерсального источника энергии для больш ого
числа энергоз ав исим ы х реакций. Ц ентральную роль в энергетике клетки
играетА Т Ф .
А Д Ф м ож етбы ть реф осф орилиров ан в А Т Ф в рез ультатеды х ательной
актив ности или з а счет другого в ы сокоэнергетического соединения,
наприм ер, креатинф осф ата, присутств ующ его в м ы ш ечны х клетках . Е сли
в есь А Д Ф м ы ш ечной ткани прев ращ ается в А Т Ф , то ф осф ат от А Т Ф
переносится на креатин с образ ов анием креатинф осф ата. При этом в нов ь
появ ляется некоторое количеств о А Д Ф , которы й м ож ет, присоединив
ф осф ат, образ ов атьА Т Ф . При пониж ении уров ня А Т Ф происх одитобратны й
процесс: ф осф ат переносится от креатинф осф ата на А Д Ф , и з апасы А Т Ф
в осстанав лив аются.
34
Т аким образ ом , А Т Ф действ уеткак св яз ующ ее клеточное з в ено м еж ду
ды х анием и процессам и, требующ им и з атраты энергии. При этом его
в ы сокоэнергетические ф осф атны е группы непреры в но отщ епляются и
з ам ещ аются нов ы м и.
Д ругием акроэргическиесоединения. А ргининф осф ати креатинф осф ат
в ы полняют рольсв оеобраз ны х аккум уляторов х им ической энергии, которы е
использ уются для бы строго ф осф орилиров ания А Т Ф в о в рем я энергичного
м ы ш ечного сокращ ения. И х наз ы в аютф осф агенам и.
А цилф осф аты — м акроэргическиесоединения с ангидридной св яз ью, в
которы х карбонильны й атом углерода ацильной группы особенно легко
участв уетв реакции с нуклеоф илам и. Значение∆G = — 12,8 ккал/м оль.
Н априм ер, глицерол-1,3-бисф осф ат+ Н О Н → глицерол-3-ф осф ат+
Н 3РО 4.
Т иоэф иры играют очень в аж ную роль в м етаболиз м е в качеств е
м етаболически актив ной ф орм ы ацильной группы . В природе основ ны м и
тиолсодерж ащ им и соединениям и яв ляются: коф ерм ентА , липоев ая кислота,
белки с – SН -группой:
ацетил-К оА + Н О Н → ацетат+ HS-KoA; ∆G = — 7,37 ккал/м оль.
К оличествен н ое определен ие макроэргических соедин ен ий мы ш ц
(А Т Ф и креатин фосфата)
В м ы ш ечной ткани содерж ится дв а м акроэргических соединения –
А Т Ф и креатинф осф ат, которы е обеспечив ают по м ере надобности м ы ш цу
больш им количеств ом энергии. К реатинф осф ат образ уется в м ы ш це при
участии А Т Ф в состоянии покоя и служ ит рез ерв ом в ы сокоэнергетического
ф осф атадля синтез аА Т Ф из А Д Ф при актив ной м ы ш ечной работе.
Принцип м етода. М етод основ ан на том , что дв а последних остатка
ф осф орной кислоты в А Т Ф , так ж е как и ф осф атны й остаток в
креатинф осф ате, легко отщ епляются при непродолж ительном гидролиз е в
кислой среде. Э то так наз ы в аем ы й лабильно св яз анны й ф осф ор. Срав нение
содерж ания неорганического ф осф ора в пробах до гидролиз а и после дает
представ ление о количеств е лабильно св яз анного ф осф ора, которое
прих одится на долю м акроэргических соединений м ы ш ечной ткани.
К оличеств о ф осф ораопределяютпо цв етной реакции с м олибдатом ам м ония
в присутств ии аскорбинов ой кислоты .
Реактив ы . 1. 10%-й раств ор трих лоруксусной кислоты (Т ХУ ). 2. 1
м оль/лHCl. 3. 1 м оль/лNaOH. 4. 2,5%-й раств ор м олибдатаам м ония. 5. 1%-й
раств ор аскорбинов ой кислоты . 6. Э талонны й раств ор, содерж ащ ий 5
м м оль/лф осф ора.
Ход работы
1. 0,5 г м ы ш ечной каш ицы пом ещ ают в пробирку, стоящ ую в ледяной
бане, и добав ляют в нее 5 м л ох лаж денного 10%-го раств ора Т ХУ .
Содерж им ое пробирки перем еш ив ают стеклянной палочкой для
экстрагиров ания А Т Ф и креатинф осф ата в течение 5 м ин. Э кстракт
35
ф ильтруютв м ерную пробирку, стоящ ую в ледяной бане. О статок м ы ш ечной
каш ицы в пробиркез алив ают5 м лH2O и продолж аютэкстракцию 5 м ин. на
х олоде. Полученны й экстракт ф ильтруют в ту ж е м ерную пробирку и
дов одятобщ ий объ ем до 10 м лдистиллиров анной в одой.
2. В дв епробирки отбираютпо 0,5 м лбез белков ого ф ильтрата. Перв ая
пробирка — контрольная, в торая — опы тная. В опы тную пробирку
добав ляют 1 м л1 м оль/лHCl, з акры в ают ф ольгой, пом ещ ают в кипящ ую
в одяную баню на 10 м ин. для гидролиз а ф осф орны х св яз ей. Затем раств ор
ох лаж дают и добав ляют 1 м л1 м оль/лNaOH. В контрольную пробирку (без
предв арительного кипячения) добав ляют 1 м л1 м оль/лHCl и 1 м л1 м оль/л
NaOH. В опы тную и контрольную пробирки добав ляютиз бюретки по 7,5 м л
H2O до получения объ ем а10 м л.
3. И з обеих пробирок отбирают по 5 м лж идкости, переносят в дв е
другиепробирки и добав ляютв каж дую из них по 0,5 м л2,5%-го м олибдата
ам м ония, 0,5 м л 1%-го раств ора аскорбинов ой кислоты и по 2 м л H2O.
Перем еш ив аюти остав ляютстоятьпри ком натной тем пературе10 м ин.
4. К онтрольную и опы тную пробы ф отоколорим етрируют с красны м
св етоф ильтром (длина в олны 670 нм ) против в оды . В опы тной пробе (после
гидролиз а) определяем ы й неорганический ф осф ор представ ляетсобой сум м у
лабильно св яз анного ф осф ораи ф осф атны х солей, присутств ующ их в тканях .
В контрольной пробе— только ф осф атны есоли.
5. В ы читаютиз оптической плотности, найденной для опы тной пробы ,
оптическую плотность, полученную для контрольной пробы . К онцентрацию
лабильно св яз анного неорганического ф осф ора в пробе нах одят по
калибров очном у граф ику.
Расчет. Рассчиты в ают количеств о лабильно св яз анного ф осф ора в м г
на100 г сы рой ткани, учиты в ая раз в едениепо ф орм уле:
х = А 3,3400 100;
где х — содерж ание м акроэргических соединений в пересчете на 1 м г
А Т Ф в 100 г сы рой ткани (м г/100 г); А — содерж ание А Т Ф в пробе, м г;
3,3400 — коэф ф ициент пересчета на 1 г ткани с учетом раз в едения
раств оров .
Построениекалибров очного граф ика.
И з эталонного раств ора ф осф ора приготав лив ают калибров очны е
раств оры согласно таблице9.
Т аблица9.
Приготов лениекалибров очны х раств оров ф осф ора
Н ом ера
Реактив ы , м л
Содерж аниеф осф ора
пробирок
м м оль/л
Э талонны й раств ор
Н 2О
1
1
4
1
2
2
3
2
3
3
2
3
4
4
1
4
5
5
0
5
36
В каж дую пробирку добав ляютпо 0,5 м л2,5%-го м олибдата ам м ония,
0,5 м л 1%-го раств ора аскорбинов ой кислоты и по 2 м л H2O. Бы стро
перем еш ив аюти остав ляютстоятьпри ком натной тем пературеточно 10 м ин.
К алибров очны е раств оры
колорим етрируют на Ф Э К е с красны м
св етоф ильтром (длина в олны 670 нм ) против в оды . По рез ультатам
из м ерений строят граф ик з ав исим ости оптической плотности раств оров от
концентрации ф осф ора.
Задачи по теме «М етаболизм»
В ариан т № 1
1. У каж ите реакцию цикла К ребса, в которой происх одит
в осстанов ление Ф А Д . К аков в ы х од А Т Ф при окислении 1 м олекулы Ф А Д Н 2
через ды х ательную цепь?
2. В цикле лим онной кислоты для расщ епления ацетил-К оА
использ уется в осем ь ф ерм ентов . У каж ите для каж дого из них тип
катализ ируем ой реакции:
конденсация (образ ов аниеуглерод-углеродной св яз и);
дегидратация (отщ еплениев оды );
гидратация (присоединениев оды );
декарбоксилиров ание(отщ еплениеСО 2);
окисление-в осстанов ление;
ф осф орилиров аниенауров несубстрата;
из ом ериз ация.
К акой коф актор или коф акторы необх одим ы для каж дой из этих
реакций?
3. Препарат ф торцитрата прим еняется как средств о борьбы с
гры з унам и. Проникнув в клетку, он прев ращ ается в о ф торацетил-К оА . Д ля
из учения токсического действ ия ф торацетата бы лпров еден эксперим ент на
интактном из олиров анном сердце кры сы . После перф уз ии сердца 0,22
м м оль/л ф торацетатом ум еньш алось поглощ ение глюкоз ы и сниж алась
скорость гликолиз а,
а глюкоз о-6-ф осф ат и
ф руктоз о-6-ф осф ат
накаплив ались. К онцентрации в сех пром еж уточны х продуктов цикла
лим онной кислоты бы ли при этом ниж е норм ы , и только концентрация
цитрата прев ы ш ала норм у в 10 раз . В какой точке блокируется цикл
лим онной кислоты ? Почем у цитрат накаплив ается, а з апас других
пром еж уточны х
продуктов
цикла истощ ается?
Ф торацетил-К оА
подв ергается ф ерм ентатив ны м прев ращ ениям в цикле лим онной кислоты .
К аков а структура конечного продукта обм ена ф торацетата? Почем у он
блокирует цикллим онной кислоты ? К ак м ож но снять это ингибиров ание?
Почем у после перф уз ии сердца ф торацетатом ум еньш ается поглощ ение
глюкоз ы и сниж ается скорость гликолиз а? В чем причина накопления
м оноф осф атов ? Почем у отрав лениеф торцитратом см ертельно?
37
В ариан т № 2
1. У каж ите реакции гликолиз а и цикла К ребса, в которы х происх одит
в осстанов ление Н А Д +. К аков в ы х од А Т Ф при окислении 1 в осстанов ленной
м олекулы Н А Д Н через ды х ательную цепь?
2. В структурном и х им ическом отнош ении арсенатсх оден с ф осф атом ,
поэтом у м ногие ф ерм енты , нуж дающ иеся в ф осф ате, использ уют и арсенат.
О днако органические произ в одны е м ы ш ьяков ой кислоты м енее стабильны ,
чем соотв етств ующ ие произ в одны е ф осф орной кислоты . Н априм ер,
ациларсенаты легко раз лагаются без участия катализ аторов . К аков ы
последств ия з ам ены ф осф ата арсенатом ? Д ля больш инств а организ м ов
арсенаттоксичен. Чем это объ ясняется?
3. Е сли в суспенз ию анаэробны х клеток, потребляющ их глюкоз у с
больш ой скоростью, в нести кислород, то клетки начнут его поглощ ать и
уров ень потребления глюкоз ы рез ко пониз иться. О днов рем енно с этим
прекратится накопление лактата. Э тот эф ф ект, х арактерны й для клеток,
способны х и к аэробном у, и к анаэробном у потреблению глюкоз ы , в перв ы е
наблюдал Луи Пастер в 60-гг. XIX в ., поэтом у он бы л наз в ан эф ф ектом
Пастера. Почем у при в в едении в клеточную суспенз ию кислорода
прекращ ается накопление лактата? Почем у в присутств ии кислорода
сниж ается скоростьпотребления глюкоз ы ?
В ариан т № 3
1. Сколько м олекул А Т Ф образ уется при полном распаде одной
м олекулы глюкоз ы ? Зав иситли в ы х од А Т Ф в электронтранспортной цепи от
использ ов ания раз личны х челночны х м ех аниз м ов переносаН А Д Н ?
2. При напряж енной работе м ы ш ечная ткань потребляет гораз до
больш еА Т Ф , чем в состоянии покоя. В белы х скелетны х м ы ш цах , наприм ер
в м ы ш цах ног у кролика или м ы ш цах кры ла индейки, почти в есь этот А Т Ф
образ уется в процессе анаэробного гликолиз а. Представ им себе, что в
скелетной м ы ш цеотсутств уетлактатдегидрогеназ а. М оглабы м ы ш цав этом
случае напряж енно работать, то есть с больш ой скоростью генериров ать
А Т Ф путем гликолиз а?
3. Гликогенф осф орилаз аиз скелетны х м ы ш ц х арактериз уется гораз до более
в ы сокой в еличиной К м , чем тот ж е ф ерм ент из ткани печени. К акую
ф из иологическую ф ункцию в ы полняетгликогенф осф орилаз ав скелетны х
м ы ш ах и в ткани печени? Почем у в еличинаК м для м ы ш ечного ф ерм ента
долж набы тьбольш е, чем для ф ерм ентаиз печени?
4.
В ариан т № 4
1.
Сколько м олекул А Т Ф образ уется при полном распаде 1
м олекулы пирув ата? Зав иситли в ы х од А Т Ф в электронтранспортной цепи от
использ ов ания раз личны х челночны х м ех аниз м ов переносаН А Д Н ?
2.
В начале 30-х годов А льберт Сент-Д ьердьи сообщ ил об
интересном наблюдении. О н добав лялк ды ш ащ им суспенз иям из м ельченной
38
грудной м ы ш цы голубя оксалоацетат или м алат и обнаруж ил, что
потребление кислорода при этом усилив ается. О бъ ясните, почем у это
происх одит?
3. 2,4-динитроф енол – раз общ итель ды х ания и окислительного
ф осф орилиров ания – пы тались одно в рем я использ ов ать как средств о для
борьбы с ож ирением . Н ачем в принципем ож етбы тьоснов ано подобноеего
действ ие? Т акого рода раз общ ающ ие агенты не прим еняются в качеств е
лекарств енны х средств , поскольку из в естны случаи, когда их прим енение
прив одило к летальном у исх оду. Почем у прием раз общ ающ их агентов м ож ет
в ы з в атьсм ерть?
В ариан т № 5.
1.
В о в нутренней
м итох ондриальной
м ем бране им еется
дикарбоксилатная транспортная систем а, которая обеспечив аетперенос через
м ем брану м алатаи 2-оксоглутарата. Э татранспортная систем аингибируется
n-бутилм алонатом . Предполож им , что n-бутилм алонатдобав лен к суспенз ии
аэробны х почечны х клеток, использ ующ их в качеств е топлив а одну только
глюкоз у. К ак долж ен подейств ов ать n-бутилм алонат на а) гликолиз ; б)
потреблениекислорода; в ) образ ов аниелактата; в ) синтез А Т Ф ?
2. Срав ните сум м арны е в ы х оды
А Т Ф (число м олей А Т Ф ,
образ ов ав ш их ся на1 м оль субстрата) при полном окислении (до СО 2 и Н 2О )
лактата и аланина, учтя в этом расчете расх од А Т Ф на в ы в едение аз ота в
ф орм ем очев ины (реакция, катализ ируем ая лактатдегидрогеназ ой, обратим а).
3. В оз м ож ен ли реальны й синтез глюкоз ы из пирув ата в услов иях ,
когда цикл трикарбонов ы х кислот и окислительное ф осф орилиров ание
полностью ингибиров аны ?
В ариан т № 6.
1. Ротенон (токсин из растения) ингибируетм итох ондриальную Н А Д Н дегидрогеназ у. А нтим ицин А (токсичны й антибиотик) ингибируетокисление
убих инона. Почем у ротенон оказ ы в ается см ертельны м ядом для некоторы х
насеком ы х и ры б? Почем у антим ицин А действ ует как яд в ж ив отны х
тканях ? 3. Д опустим , что эти в ещ еств аблокируютсоотв етств ующ иеучастки
ды х ательной цепи с рав ной эф ф ектив ностью. К акое из них будет более
сильны м ядом ? Почем у?
2. К ош кам , не получав ш им пищ и накануне в ечером , дали утром
натощ ак ам инокислотную см есь, содерж ащ ую в есь набор ам инокислот, з а
исключением аргинина. Через 2 часасодерж аниеам м иакав кров и ж ив отны х
в оз росло до 140 м кг/л (при норм е 18 м кг/л) и появ ились клинические
сим птом ы ам м иачного отрав ления. О дна кош ка погибла через 4,5 часа. В
группе, получав ш ей см есь, в которой аргинин бы л з ам енен орнитином ,
никаких необы чны х сим птом ов обнаруж ено не бы ло. К акую роль играло в
этом эксперим енте предв арительное голодание? В чем причина пов ы ш ения
уров ня ам м иака в кров и? Почем у отсутств ие аргинина в рационе прив одило
к ам м иачном у отрав лению? Я в ляется ли аргинин для кош ек нез ам еним ой
ам инокислотой? Почем у аргинин м ож етбы тьз ам енен орнитином ?
39
3. Н апиш ите ряд последов ательны х реакций и сум м арную реакцию,
которы е поз в олят определить число м олекул А Т Ф , расх одуем ы х на
прев ращ ение цитоплаз м атического глюкоз о-6-ф осф ата в гликоген и
гликогена обратно в глюкоз о-6-ф осф ат. К акую часть это число состав ит
от м аксим ального числа м олекул А Т Ф , образ ующ егося при полном
расщ еплении глюкоз о-6-ф осф ата?
Р абота 13. М ин еральн ы й обмен в орган изме человека.
О пределен ие кон цен трации кальция и хлоридов в сы воротке крови
М инеральны й обм ен —
сов окупность процессов в сасы в ания,
распределения, усв оения и в ы деления м инеральны х в ещ еств , нах одящ их ся в
организ м е преим ущ еств енно в в иде неорганических соединений.
М инеральны е в ещ еств а играют в аж ную роль в поддерж ании кислотнооснов ного рав нов есия, осм отического дав ления, систем есв ерты в ания кров и,
регуляции м ногочисленны х ф ерм ентны х систем и др., т.е. им еютреш ающ ее
з начение в соз дании и поддерж ании постоянств а в нутренней среды
организ м а. По количеств енном у содерж анию в организ м е элем енты делятся
на м акро- (калий, кальций, натрий, м агний, ф осф ор, х лор) и м икроэлем енты
(цинк, х ром , м едь, ж елез о, кобальт).
О снов ную часть м инеральны х в ещ еств организ м а состав ляют
х лористы е, ф осф орнокислы е и углекислы е соли натрия, кальция, калия,
м агния. Соли в ж идкостях организ м а челов ека нах одятся в частично или
полностью диссоцииров анном в иде. В состав м инерального ком понента
кости и х рящ ев ой ткани м инеральны ев ещ еств ав х одятв в иденераств орим ы х
соединений. В кости и х рящ ев ой ткани (сум м арно) содерж ится более 95%
в сего кальция, 87% ф осф ора, 50% м агния. М инеральны е в ещ еств а
присутств уют в организ м е такж е в в иде соединений с белкам и,
нуклеинов ы м и кислотам и и др.
М инеральны ев ещ еств аиз ж елудочно-киш ечного трактав сасы в аются в
кров ь и лим ф у, где св яз ы в аются со специф ическим и транспортны м и
белкам и. Н екоторы е м инеральны е в ещ еств а соединяются с таким и белкам и
уж е в эпителии слиз истой оболочки киш ечника (кальций). О снов ное
количеств о в ы в одим ы х из организ м а м инеральны х в ещ еств обнаруж ив аютв
м оче, кале, поте. Через почки в ы в одятся ионы натрия, калия, х лора, йода,
кальция (30%) и м агния (30%); через киш ечник — ионы кальция (70%),
ж елез а, м агния (70%) и др.
Н атрий — основ ной в неклеточны й катион. У челов ека до 55% натрия
нах одится в костях , до 43% — в о в неклеточной ж идкости, около 2% — в
клетках . К онцентрация ионов натрия в плаз м есостав ляет135-150 м м оль/л; в
эритроцитах — 16-36 м м оль/л. Падениеконцентрации ионов натрия в плаз м е
кров и ниж е135 м м оль/лгипонатриплаз м ия (в сы в оротке— гипонатрием ия),
пов ы ш ение более 150 м м оль/л — гипернатриплаз м ия (в сы в оротке —
гипернатрием ия).
40
В течение суток с пищ ев ы м и продуктам и в организ м поступает 4-6 г
натрия, суточная потребность состав ляет 1 г. Ф из иологическая роль: 1)
участв ует в в оз никнов ении и поддерж ании электрох им ического потенциала
на плаз м атических м ем бранах клеток; 2) регулирует состояние в односолев ого обм ена; 3) регулирует кислотно-основ ное состояние: натрий
обм енив ается на ионы в одорода. При недостатке ионов натрия в организ м е
в ы в едение кислы х продуктов из организ м а наруш ается и в оз никает
в оз м ож ностьраз в ития ацидоз а.
О снов ной путь в ы деления натрия — почечны й: с м очой з а сутки
в ы деляется 160 - 260 м м оль, с потом - 0,8, с калом - 7 - 8 м м оль.
К алий — в нутриклеточны й катион (98%). Глав ны й рез ерв уар калия —
м ы ш цы и печень. Содерж ание K+ в плаз м е кров и — от 3,8 до 5,1 м м оль/л,
сниж ение концентрации K+ в плаз м е кров и ниж е 3,8 — гипокалиплаз м ия,
пов ы ш ение в ы ш е 5,1 м м оль/л — гиперкалиплаз м ия. В течение суток
поступает с пищ ей до 6 г K+. Суточная потребность — 2,5 - 5,0 г.
Ф из иологическое з начение: необх одим для синтез а протеинов (на 1 г
синтез иров анного протеинатребуется 20 м г K+), А Т Ф , гликогена; приним ает
участие в ф орм иров ании потенциала покоя, действ ия, в ы з ы в ает
конф орм ационны е перестройки протеинов , способств уя актив ации
ф ерм ентов . И оны калия участв уют в регуляции ф ункции сердца, нерв ной
систем ы , скелетной и гладкой м ускулатуры . И оны калия пов ы ш ают тонус и
силу сокращ ений скелетны х и гладких м ы ш ц. В в ы соких концентрациях
угнетают нерв но-м ы ш ечную пров одим ость. Препараты калия обладают
диуретическим действ ием . В регуляции обм ена ионов калия приним ает
участие альдостерон, усилив ающ ий их в ы деление с м очой, инсулин
способств уетперех оду K+ в клетки.
Содерж аниев организ м ев з рослого м агния состав ляет20 г. Содерж ится
в костях (50%), м ягких тканях , м ы ш цах (49%) и в о в неклеточной ж идкости
(1%). В торой по з начим ости послеK+ в нутриклеточны й катион, в плаз м еего
концентрация колеблется от0,8 до 1,5 м м оль/л. О браз уетком плексы с А Т Ф ,
цитратом , протеинам и. Среднесуточное поступление с пищ ей состав ляет
300-400 м г. Д о 30% в ы деляется с м очой. В х одит в состав почти 300
ф ерм ентны х ком плексов , образ ует х елаты с нуклеинов ы м и кислотам и,
способств ует синтез у протеинов , ком плексы м агния с ф осф олипидам и в
клеточны х м ем бранах ф иксируют их , сним ают текучесть, ум еньш ая их
проницаем ость. Глав ны м органом регуляции концентрации м агния яв ляются
почки.
М едь в х одит в состав м ногих ф ерм ентов и биологически актив ны х
м еталлопротеинов . В кров и содерж ание м еди - 15,7-16 м км оль/л(98% в сей
м еди нах одится в состав е церулоплаз м ина). При деф иците м еди в пищ е у
челов ека
наруш аются
антиоксидантная
з ащ ита,
окислительнов осстанов ительны е процессы , пигм ентны й обм ен, обм ен ж елез а(сниж аются
его в сасы в ание и утилиз ация), ф осф олипидов (происх одит дем иелиниз ация
нерв ны х ств олов ), актив ность остеобластов , образ ов ание эластичной ткани
41
кров еносны х сосудов , так как м едь необх одим а для синтез а коллагена и
эластина.
М арганец актив ирует м ногие ф ерм ентатив ны е систем ы , он необх одим
для биосинтез а антител, для эритропоэз а и образ ов ания гем оглобина.
Стим улирует синтез х олестерина и ж ирны х кислот, прояв ляя липотропное
действ ие.
Ц инк в качеств е простетической группы в х одитв состав м олекулряда
ф ерм ентов , он обнаруж ен в инсулине. О бладает липотропны м действ ием ,
норм ализ ует ж иров ой обм ен, предотв ращ ает ж иров ую инф ильтрацию
печени. Н аибольш ееколичеств о цинкасодерж ится в печени, подж елудочной
ж елез е, полов ы х ж елез ах .
Хлор. Д о 65% в сего х лора нах одится в о в неклеточной ж идкости,
глав ны м анионом которой яв ляется Сl-. Д о 17% св яз ано соединительной
тканью и х рящ ам и; 12,4% нах одится в нутри клеток. О бм ен х лора тесно
св яз ан с обм еном натрия, но в канальцах почек они м огут в ы деляться и
реабсорбиров аться нез ав исим о друг отдруга.
Ф осф аты . В цельной кров и больш ая часть ф осф ора нах одится в
эритроцитах в в иде органического ф осф ата, в плаз м е кров и присутств уют
липидны й ф осф ор, следы эф иров ф осф орной кислоты и неорганический
ф осф ат. 50% общ его ф осф оранах одится в костях , до 20% - в о в неклеточной
ж идкости. Ф осф аты играют в аж ную роль в обм енны х процессах : в х одят в
состав коф ерм ентов , нуклеинов ы х кислот, ф осф опротеинов , ф осф олипидов .
И з них образ уются: 2,3-бисф осф оглицерат, играющ ий в аж ную роль в
регуляции транспорта кислорода, ф осф аты — обяз ательны й ком понент
клеточны х м ем бран, состав ная часть А Т Ф , креатинф осф ата, в ы полняющ их
в аж ную роль в переносе и сох ранении энергии. В м есте с кальцием ф осф аты
образ уют апатиты — основ у костной ткани. Регуляция обм ена ф осф ора
аналогичнаобм ену кальция с тем раз личием , что паратгорм он, пов ы ш ающ ий
содерж аниекальция в плаз м екров и, сниж аетсодерж аниеф осф атов , пов ы ш ая
их экскрецию почкам и.
К альций. В организ м есодерж ится 1-1,5 кг кальция. В неклеточны й ион.
Содерж ание в плаз м е - 2,29 - 2,99 м м оль/л, в эритроцитах - следы . 90%
нах одится в костях , 1% - в о в неклеточной ж идкости. М еньш е полов ины
кальция в плаз м е кров и нах одится в иониз иров анном в иде и яв ляется
ф из иологически актив ны м , больш ая часть — св яз ана с белкам и или
представ ленасолям и: ф осф атом , цитратом , сульф атом кальция. Н аибольш ей
кальцийсв яз ы в ающ ей способностью обладаютальбум ины и β-глобулины .
И оны кальция, участв уя в о м ногих процессах ж из недеятельности,
работают на уров не клетки и на уров не в неклеточны х систем . Е го
биологическая роль:
- необх одим для секреторной актив ности практически в сех эндо- и
экз окринны х ж елез исты х клеток;
- участв уетв св ерты в ании кров и;
42
- яв ляется в торичны м посредником при м ем бранной передаче
сигнала, актив ируя 40 ф ерм ентов ;
- в ы полняет опорную ф ункцию, яв ляясь основ ны м ком понентом
костного скелета;
- обеспечив ает целостность м ем бран (в лияет на проницаем ость), так
как способств ует плотной упаков ке белков , стабилиз ируя клеточны е
м ем браны ;
- участв ует в нерв но-м ы ш ечном в оз буж дении и сокращ ении.
К альций приним ает участие в соз дании потенциала покоя (70 - 90 м В ),
ум еньш ая скорость проникнов ения полож ительно з аряж енны х ионов в
клетку;
- стим улирует в ы работку гастрина, обуслов лив ая в ы работку
пищ ев арительны х соков ;
- в м есте с инсулином облегчает поступление глюкоз ы в клетки.
М ногообраз ны е ф ункции ионов кальция на пов ерх ности и в нутри клетки
обуслов лены его способностью соединяться с нем ем бранны м и ком плексам и
—
А Т Ф , ф осф атам и, белкам и. О снов ны е биологические процессы :
раз м нож ение, пролиф ерация, гибельклетки, — осущ еств ляются при участии
кальция.
Содерж ание ионов кальция в плаз м е кров и определяют следующ ие
ф акторы .
1. Состояниекостной ткани — в сеф акторы , ускоряющ иерассасы в ание
костей, ув еличив ают содерж ание кальция и ф осф атов в кров и з а счет
дем инерализ ации скелета (рез орбции, м обилиз ации из кости). В се ф акторы ,
способств ующ ие образ ов анию костной ткани, ум еньш ают его з а счет
м инерализ ации.
2. В итам ин D3 и его аналоги способств уют в сасы в анию кальция и
ф осф атов в киш ечникеи препятств уютих в ы в едению с м очой.
3. Паратгорм он стим улирует м обилиз ацию кальция и ф осф атов из
костей, на уров не почек усилив ает реабсорбцию кальция и ум еньш ает
реабсорбцию ф осф атов , пов ы ш аетсодерж аниеионов кальция в плаз м е.
4. К альцитонин способств ует м инерализ ации костей, ув еличив ает
экскрецию ф осф атов с м очой, сниж аетсодерж аниеионов кальция в плаз м е.
5. А цидоз прив одит к рассасы в анию костей (содерж ание кальция
в оз растает), а алкалоз — к их м инерализ ации (ум еньш ается концентрация
ионов кальция в плаз м е). Регуляцию обм енов ф осф ора и кальция
осущ еств ляют паращ итов идны е, щ итов идны е ж елез ы через секретируем ы е
им и горм оны : кальцитонин, паратгорм он, атакж ев итам ин D3 и кальцитриол.
Паратгорм он. Горм он-полипептид, состоящ ий из 84 ам инокислотны х
остатков . Секретируется клеткам и паращ итов идной ж елез ы в отв ет на
ум еньш ение концентрации ионов кальция в кров и. О снов ны м и клеткам им иш еням и для паратгорм она яв ляются клетки костей, почек, тонкой киш ки
(действ ует опосредов анно через усиление биосинтез а кальцитриола).
Паратгорм он действ уетнаклетки-м иш ени через ц-А М Ф и протеинкиназ ы .
43
Паратгорм он стим улирует рез орбцию костной ткани с осв обож дением
кальция з а счет актив ации ф ерм ентов остеокластов , раз руш ающ их
пром еж уточное в ещ еств о кости. В почках , в клетках дистальны х канальцев ,
паратгорм он стим улирует реабсорбцию ионов кальция из перв ичной м очи,
но ингибируетреабсорбцию ф осф атов , и они в ы в одятся из организ м а. Т аким
образ ом паратгорм он ув еличив ает концентрацию кальция (это актив ирует
секрецию кальцитонина) и ум еньш аетуров еньф осф атов в кров и.
К альцитриол.
Хим ическая
природа
произ в одное
циклопентанпергидро-ф енантрена. К леткам и-м иш еням и яв ляются клетки
почек, костей, киш ечника. В ы рабаты в ается при ум еньш ении концентрации
кальция в кров и и усилении секреции паратгорм она. Е го предш еств енником
яв ляется в итам ин D3, которы й гидроксилируется в печени (ф ерм ент 25гидроксилаз а), з атем в почках (l-гидроксилаз а). С м естасинтез а(в почках ) он
транспортируется кров ью в киш ечник, где в клетках слиз истой стим улирует
синтез кальций-св яз ы в ающ его белка, которы й располагается напов ерх ности
клеток слиз исты х и, благодаря св оей в ы сокой способности св яз ы в ать
кальций, облегчает его в сасы в ание. И з клетки кальций попадает в кров оток
пoсредств ом Са2+/Na+-А Т Ф -аз ы .
Н а костную ткань кальцитриол действ ует аналогично паратгом ону:
актив ируя ф ерм ентную систем у остеокластов , в ы з ы в ает дем инерализ ацию
кости и ув еличив ает концентрацию кальция и ф осф атов в кров и. В клетках
почек он усилив аетреабсорбцию кальция и ф осф атов . Рез ультатом действ ия
кальцитриола яв ляется: ув еличение концентрации кальция и ф осф атов в
кров и, ингибиров аниесекреции паратгорм она.
К альцитонин - антагонистпаратгорм онаи кальпептид, состоящ ий из 32
остатков ам инокислот. В ы рабаты в ается С-клеткам и щ итов идной и
паращ итов идной ж елез . Синтез ируется сраз у в актив ной ф орм е. К оличеств о
кальцитонина в кров отоке регулируется концентрацией ионов кальция в
кроyв еличениe стим улирует в ы брос кальцитонина в кров ь, а ум еньш ение подав ляет. К ром екальция, секрецию кальцитонинастим улируютадреналин,
глюкагон, гастрин. О рганам и, содерж ащ им и клетки-м иш ени, яв ляются кости,
почки,
печень.
М ех аниз м
действ ия кальцитонина м ем браннов нутриклеточны й: актив ирует ф осф одиэстераз у, ум еньш ает содерж ание цАМ Ф .
Д ейств уя на костную ткань, кальцитонин ингибирует ф ерм енты
остеокластов , что способств ует сниж ению концентрации кальция в кров и. В
клетках почечны х канальцев кальцитонин в ы з ы в ает пов ы ш енное в ы в едение
кальция и ф осф атов с м очой. Т аким образ ом кальцитонин в ы з ы в ает
ум еньш ение концентрации кальция и ф осф атов в кров и. Сов м естное
действ ие паратгорм она, в итам ина D, кальцитонина и кальцитриола
поддерж ив аетсодерж аниекальция и ф осф орав кров и напостоянном уров не.
44
О пределен ие кальция в сы воротке крови
Принцип м етода. К альций образ ует с глиоксаль-бис-(2-оксианилом ) в
щ елочной среде ком плекс красного цв ета. И нтенсив ность окраски
из м еряется ф отом етрически при длинев олны 520-550 нм .
Реактив ы . 1. Стандартны й раств ор CaCO3 2,5 м м оль/л. 2. Раств ор
NaOH 0,4 м оль/л. 3. Раств ор глиоксаль-бис-(2-оксианила) 2,4 м м оль/л в
м етаноле.
Ход работы . См еш ать в пробирках реактив ы и сы в оротку кров и
согласно таблице10.
Прим ечание: лабораторная посудадолж наслуж итьисключительно для
определения кальция и бы тьабсолютно чистой.
Т аблица10.
Ход определения кальция
Реактив ы
О пы тная
К алибров очная К онтрольная
проба, м л
проба, м л
проба, м л
В одадистиллиров анная 1,00
1,00
1,00
Сы в ороткакров и
0,02
Раств ор 1
0,02
(стандартны й раств ор)
Раств ор 2 (NaOH)
0,50
0,50
0,50
Перем еш ив аюти инкубируют10 м инут
Раств ор 3
2,00
2,00
2,00
(раств ор глиоксаль-бис2-оксианила)
Пробы тщ ательно перем еш ать и инкубиров ать в течение 5 м инут. Н е
поз ж е чем через 10 м инут после окончания инкубации из м ерить в еличину
оптической плотности опы тной и калибров очной проб против контрольной
пробы при длинев олны 520-550 нм .
Расчет. Расчет концентрации кальция в анализ ируем ы х пробах
пров ести по ф орм уле:
С=
Е
Е
опы т
⋅ 2,5
станд
гдеС - концентрация кальция, м м оль/л;
Е опы т – оптическая плотностьопы тной пробы ;
Е станд – оптическая плотностькалибров очной пробы ;
2,5 – концентрация кальция в стандартном раств оре, м м оль/л
Д иагностическое з начение теста. К альций – основ ной ком понент
костной ткани. О коло 40% кальция сы в оротки кров и св яз ано с белкам и,
св ы ш е 50% нах одится в иониз иров анном (ф из иологически актив ном
состоянии). В норм ев сы в ороткесодерж ится 2,25 - 2,75 м м оль/лкальция.
Гиперкальцием ия наблюдается при гиперв итам иноз е Д , пов ы ш енной
ф ункции паращ итов идны х ж елез , острой атроф ии костной ткани, м иелом ной
45
болез ни, некоторы х эндокринны х патологиях , сердечной недостаточности. У
больны х бронх опнев м онией ув еличение концентрации кальция в кров и
соотв етств ует тяж ести з аболев ания. Ф из иологическая гиперкальцием ия
м ож етнаблюдаться при определенной диетеи у нов орож денны х детей.
Гипокальцием ия наблюдается при недостаточности в итам ина Д ,
сниж енной ф ункции паращ итов идны х ж елез , при х ронических з аболев аниях
почек, гипонатрием ии, остром панкреатите, цирроз е печени, алкоголиз м е,
старческом остеопороз е.
О пределен ие кон цен трации хлоридов в сы воротке и плазме крови
титриметрическим методом
Принцип м етода. И сследуем ая биологическая ж идкость титруется
раств ором аз отнокислой ртути в присутств ии индикаторадиф енилкарбаз она.
К огда в се х лорид-ионы св яз аны , из бы ток ионов х лора образ ует с
индикатором ком плекс сине-лилов ого цв ета, что служ ит приз наком конца
титров ания.
Реактив ы . 1. Раств ор нитратартути. 2. 1 Н раств ор аз отной кислоты . 3.
Раств ор диф енилкарбаз онав 96% этилов ом спирте.
Ход работы . В м аленький стаканчик налить1,8 м лдистиллиров анной
в оды , в нести 0,2 м лисследуем ой биологической ж идкости, добав ить0,1 м л
раств орадиф енилкарбаз онаи 1 каплю аз отной кислоты и титров атьрабочим
раств ором при постоянном перем еш ив ании до появ ления окраски.
Расчет.
[Хлориды ], м м оль/л= К х а, где
К =93,3 (коэф ф ициент пересчета, полученны й при титров ании
калибров очны х раств оров с из в естной концентрацией х лоридов );
а - количеств о м иллилитров раств ора нитрата ртути, уш едш ее на
титров аниеисследуем ой биологической ж идкости.
Н орм альны ев еличины . 95-100 м м оль/лх лоридов в сы в ороткеи плаз м е
кров и.
Д иагностическое з начение теста. Пов ы ш енное содерж ание х лоридов в
кров и м ож ет наблюдаться при обез в ож ив ании организ м а, острой почечной
недостаточности,
несах арном
диабете,
некоторы х
эндокринны х
з аболев аниях .
Пониж ение показ ателя м ож ет бы ть при потере солей в следств ие
из бы точного потоотделения, рв оты и т.д.; ув еличении объ ем а в неклеточной
ж идкости при в одной нагруз ке; и некоторы х других состояниях .
Р абота 14. А зотисты й обмен . О пределен ие кон цен трации мочевин ы
в сы воротке крови
О бм ен ам м иака в организ м е. В рез ультате обм ена белков в организ м е
в о в сех тканях постоянно образ уется ам м иак. И сточники ам м иака в
организ м е: реакции окисления и дез ам иниров ания ам инокислот; распад
пуринов ы х и пирим идинов ы х нуклеотидов ; распад биогенны х ам инов .
46
А м м иак яв ляется токсичны м в ещ еств ом для организ м а, особенно для
центральной нерв ной систем ы . О снов ной путь обез в реж ив ания ам м иака в
организ м е– биосинтез м очев ины в печени (орнитинов ы й цикл).
Ц икл м очев ины . В печень ам м иак достав ляется из тканей в в иде
глутам ина; из м ы ш ц и киш ечника – в состав е аланина. Глутам ин
расщ епляется глутам иназ ой на ам м иак и глутам инов ую кислоту. Биосинтез
м очев ины осущ еств ляется в 5 этапов : перв ы й и в торой прох одят в
м итох ондриях печени, третий, четв ерты й и пяты й – в цитоз оле печени.
Ф ерм енты
биосинтез а м очев ины :
карбам оилф осф атсинтетаз а 1;
орнитинкарбам оилтрансф ераз а;
аргининосукцинат-синтетаз а;
аргининосукцинатлиаз а; аргиназ а.
Биологическое з начение орнитинов ого цикла: 1) обез в реж ив ание
ам м иака; 2) регуляция аз отистого баланса в организ м е – при поступлении в
организ м больш ого количеств абелкаскоростьциклав оз растает; 3) постав ка
ф ум арата в цикл трикарбонов ы х кислот, оксалоацетата для биосинтез а
глюкоз ы и ам инокислот.
И сточники аз ота, углерода и кислорода в м очев ине. Перв ая
ам иногруппа – из ам м иака, образ ов ав ш егося при окислительном
дез ам иниров ании глутам ата. В торая ам иногруппа постав ляется аспартатом ,
образ ов ав ш ем ся при трансам иниров ании оксалоацетата с ам инокислотам и.
У глерод – из СО 2, образ ов ав ш егося в м итох ондриях при ды х ании. К ислород
– из м олекулы в оды .
Д иагностическое з начение определения ам м иака. В норм е в кров и
содерж ится м енее 65 м км оль/л ам м иака. Гиперам м онием ия – пов ы ш ение
концентрации ам м иака в кров и – наблюдается при 1) в рож денной
недостаточности х отя бы одного их пяти ф ерм ентов биосинтез ам очев ины ; 2)
печеночной недостаточности; 3) из бы точном потреблении белков ; 4)
киш ечны х кров отечениях .
С м очой в сутки в ы деляется 0,5 г ам м иака. К оличеств о ам м иакав м оче
пов ы ш ается при респираторном и м етаболическом ацидоз е, гиперф ункции
коры надпочечников , лих орадочны х состояниях , бактериальном раз лож ении
м очи и некоторы х других з аболев аниях .
О статочны й аз откров и – это аз отнебелков ы х ком понентов сы в оротки
кров и. Глав ны м образ ом это аз от м очев ины – 85%, креатинина, м очев ой
кислоты , индикана, ам инокислот, солей ам м ония – 15%. Т ак как преобладает
аз от м очев ины , при из учении аз отистого обм ена определяют количеств о
м очев ины в кров и.
О пределен ие мочевин ы
Принцип м етода: м очев инаобраз уетс диацетилм онооксим ом в сильно
кислой среде в присутств ии тиосем икарбаз ида и ионов трех в алентного
ж елез акрасны й ком плекс.
Реактив ы . 1. Стандартны й раств ор м очев ины 16,65 м м оль/л. 2. Раств ор,
содерж ащ ий диацетилм онооксим 5 м м оль/л, тиосем икарбаз ид 0,9 м м оль/л,
сольж елез атрех в алентного 25 м км оль/л, серную кислоту 0,9 м оль/л.
47
Ход работы . В трех тонкостенны х пробирках см еш ив ают реактив ы
согласно таблице11.
Т аблица11.
Ход определения м очев ины с тиосем икарбаз идом
Реактив ы (м л)
Проба
Стандарт
К онтроль
Сы в оротка,
раз в еденная м оча
0,01
Реактив 1
0,01
Д ист. в ода
0,01
Раств ор 2
2,00
2,00
2,00
О тв ерстие пробирок з акры в ают алюм иниев ой ф ольгой и пробирку
пом ещ ают точно на 10 м ин. на кипящ ую в одяную баню. Потом содерж им ое
пробирок бы стро ох лаж дают проточной в одой и из м еряют оптическую
плотность пробы (А 1) и стандарта (А 2) против контрольного раств ора.
И з м ерение следует пров ести до 15 м инут после ох лаж дения. М очу перед
анализ ом раз в одят дистиллиров анной в одой от 1÷50 до 1÷100 (рез ультат
ум нож аютнараз в едение).
Расчет:
М очев ина(м м оль/л)=16,65·А 1/А 2
О пределен ие мочевин ы в сы воротке крови уреазн ы м методом по
реакции сфен ол-гипохлоритом
Принцип м етода. М очев ина под действ ием ф ерм ента уреаз ы
раз лагается на углекислы й газ и ам м иак. А м м иак определяют
колорим етрически по образ ов анию продуктов синего цв ета (индоф енолов ) с
гипох лоритом натрия и ф енолом . Реакция катализ ируется нитропруссидом
натрия. И нтенсив ностьокраски пропорциональнасодерж анию м очев ины .
Реактив ы . 1. Раств ор уреаз ы в Э Д Т А -буф ере. 2. Ц в етной реактив –
ф енол0,11 м оль/л, нитропруссид натрия 0,18 м оль/л. 3. 0,011 м оль/лраств ор
гипох лорита натрия в 0,13 м оль/лраств оре NaOH. 4. Стандартны й раств ор
м очев ины 0,5 м м оль/л. 5. И з отонический 154 м м оль/лраств ор NaCl.
Ход определения. В пробирку в носят0,1 м лрабочего раств ора уреаз ы
и добав ляют 0,02 м л сы в оротки кров и, раз в еденной из отоническим
раств ором NaCl в соотнош ении 1:9. Закры в ают пробирку пробкой,
перем еш ив ают, инкубируют 15 м ин. при 37° С. Затем добав ляют 0,3 м л
цв етного реактив а и 0,3 м л рабочего раств ора гипох лорита Na. Пробы
перем еш ив ают, инкубируют при 37° С и ф отом етрируют при длине в олны
500-560 нм (з елены й св етоф ильтр) в кюв етес длиной оптического пути 1 см
против контрольной пробы . К онтрольную и стандартную пробы
обрабаты в аютаналогично опы тной, но в м есто исследуем ой сы в оротки кров и
в носят соотв етств енно 0,02 м лиз отонического раств ора NaCl (контрольная
проба) или 0,02 м лстандартного раств орам очев ины .
Расчетпров одятпо ф орм уле:
48
C м очев ины =
Е
Е
оп.
⋅ 0,5 ⋅ 10 ,
ст.
где См очев ины – концентрация м очев ины в пробе, м м оль/л; Е оп. – экстинкция
опы тной пробы ; Е ст. – экстинкция стандартной пробы ; 0,5 – концентрация
м очев ины в стандартном раств оре, м м оль/л; 10 – коэф ф ициентраз в едения.
Н орм альны е в еличины – 2,50 – 8,33 м м оль/л. У лиц старш е 60 лет
уров еньм очев ины м ож етслегкапрев ы ш атьнорм у.
Д иагностическое з начение теста. М очев ина синтез ируется в печени
при обез в реж ив ании ам м иака, которы й интенсив но образ уется в реакциях
окисления и дез ам иниров ания ам инокислот, пуринов ы х и пирим идинов ы х
нуклеотидов , и в ы в одится с м очой. Т аким образ ом , содерж ание м очев ины в
кров и з ав иситотсоотнош ения процессов м очев инообраз ов ания в печени и ее
в ы в едения почкам и. При ух удш ении ф ункции почек им енно пов ы ш ение
м очев ины в кров и яв ляется наиболее ранним диагностическим тестом . И з
ф ракций остаточного аз ота в наибольш ей степени в кров и пов ы ш ается
м очев ина, которая м ож етсостав лять до 90% ф ракции остаточного аз отапри
патологии (в норм е– 50%).
Раз личаюттри группы причин, прив одящ их к ув еличению содерж ания
м очев ины в кров и: надпочечную аз отем ию, почечную и подпочечную.
Н адпочечная аз отем ия обуслов лена пов ы ш ением уров ня м очев ины в кров и,
наступающ им в следств ие сниж енного поступления кров и к почкам
(циркулярная недостаточность в
клубочках ,
ш ок,
кров опотеря,
дегидратация). А з отем ия почечного происх ож дения бы в аетсв яз анас острой
или х ронической почечной недостаточностью в следств иеглом ерулонеф рита,
пиелонеф рита, артериосклероз а, некроз а кортикального слоя почек.
Подпочечная аз отем ия бы в аетсв яз анас облитерацией м очев ы в одящ их путей
(м очекам енная болез нь, опух оли м очев ы в одящ их путей, предстательной
ж елез ы и т. д.).
При почечной гипертонии уров ень м очев ины в кров и пов ы ш ен, а при
эссенциальной гипертонии содерж анием очев ины бы в аетв пределах норм ы .
Пов ы ш ение уров ня м очев ины в кров и м ож ет бы ть и при усиленном
распаде белков (синдром сдав лив ания, ож оги, лих орадка, перитонит), при
обез в ож ив ании организ м а.
Сниж ениеуров ня м очев ины бы в аетсв яз ано с отрицательны м балансом
аз ота в рез ультате плох ого питания, с печеночной недостаточностью или с
гипергидратацией организ м а. Сниж ение концентрации м очев ины
в
сы в оротке кров и наблюдается такж е при берем енности, в ирусном гепатите,
острой дистроф ии печени, отрав лении ф осф ором , м ы ш ьяком и др. ядам и.
Р абота 15. О пределен ие кон цен трации креатин ин а в сы воротке
крови и в моче. Р асчет клирен са креатин ин а.
К реатинин – продукт неф ерм ентатив ного гидролиз а креатинф осф ата –
в ещ еств а, которое в м ы ш цах служ ит источником в ы сокоэнергетических
49
ф осф атны х групп для А Т Ф .
О пределен ие креатин ин а в сы воротке крови
Принцип м етода: в щ елочной среде пикринов ая кислота
в з аим одейств ует с креатинином с образ ов анием оранж ев о-красной окраски,
которую из м еряют ф отом етрически при длине в олны 500-510 нм (м етод
Я ф ф ера). О пределение пров одят после депротеиниров ания (удаления
белков ). О пределение не сов сем специф ично – интерф ерируют в ещ еств а с
актив ной м етиленов ой группой и некоторы е в осстанав лив ающ ие в ещ еств а,
наприм ер, глюкоз а.
Реактив ы . 1. Стандартны й раств ор креатинина177 м км оль/лв раств оре
альбум ина 12 г/л. 2. Д епротеинирующ ий раств ор – кислотатрих лоруксусная
1,22 м оль/л(Т ХУ ). 3. Пикринов ая кислота 0,04 м оль/л. 4. Н атрий гидроксид
0,75 м оль/л.
Ход работы . В трех центриф уж ны х пробирках см еш ив ают реактив ы
согласно таблице12.
Т аблица12.
Ход определения креатининав сы в ороткекров и
Реагенты , м л
Проба
К онтроль
Стандарт
Сы в ороткакров и
0,5
Н 2О
1,0
1,5
1,0
Стандартны й раств ор
0,5
креатинина
Т ХУ
0,5
0,5
0,5
Перем еш ив аюти центриф угируют5 м ин. при 3000 g. Затем из каж дой
пробирки отбирают 0,5 м л надосадочной ж идкости и переносят в другие
пробирки. В каж дую пробирку добав ляют по 0,5 м лпикринов ой кислоты и
по 0,5 м л NaOH. Перем еш ив ают и через 20 м ин. из м еряют оптическую
плотность пробы (А 1) и стандартного раств ора (А 2) против контрольного
раств орапри длинев олны 500-510 нм .
Расчет: [креатинин] = 177 А 1/А 2
Н орм а: м уж чины 61-715 м км оль/л
ж енщ ины 53-97 м км оль/л.
О пределен ие креатин ин а в моче
При определении концентрации креатинина в м оче предв арительно
раз бав ляютм очу в 100 раз , рез ультатум нож аютна50. См еш ив аютреактив ы
согласно таблице 13. Перем еш ив ают и через 20 м ин. из м еряют оптическую
плотность пробы (Е оп.) и стандартного раств ора (Е ст.) против контроля при
длинев олны 500-510 нм .
Т аблица13.
Ход определения креатининав м оче
Реагенты , м л
Проба
К онтроль
Стандарт
М оча
0,50
-
50
0,25
-
Н 2О
0,75
Стандартны й раств ор
креатинина
Т ХУ
0,25
0,25
Пикринов ая кислота
0,50
0,50
NaOH
0,50
0,50
Расчетсуточной экскреции креатининапроиз в одятпо ф орм
K=
0,50
0,25
0,25
0,50
0,50
уле:
E оп. ⋅ С с т . ⋅ V ⋅ 50
, где
Ес т . ⋅ v
К – содерж ание креатинина в суточной м оче, м км оль/л; Е оп.–
экстинкция опы тной пробы , Е ст. – экстинкция стандартной пробы ; Сст. –
содерж ание креатинина в стандартной пробе, 177 м км оль/л; V – суточное
количеств о м очи, м л; v – количеств о м очи, в з ятоедля анализ а, м л.
Засутки с м очой в ы в одится 4,4 – 17,7 м м ольили 0,5-2,0 г креатинина.
Прим ечание. При сборе суточной м очи в качеств е консерв анта
реком ендуется использ ов атьтим ол. Пробы х ранитьдо 7 дней при 2-8ºС.
Д иагностическое з начение теста. Пов ы ш ение уров ня креатинина в
сы в оротке кров и яв ляется инф орм атив ны м
показ ателем
почечной
недостаточности или м ы ш ечной дистроф ии. У стойчив ое пов ы ш ение уров ня
креатинина в кров и указ ы в ает на наруш ение работы почечного ф ильтра при
далеко з аш едш их патологических процессах , однако для ранней диагностики
з аболев аний почек тест на пов ы ш енное содерж ание креатинина в кров и не
дает полож ительного рез ультата. Пов ы ш ение уров ня креатинина в кров и
отм ечается такж е при обструкции м очев ы в одящ их путей, киш ечной
непрох одим ости, тяж елом диабете, некроз е м ы ш ц, синдром е длительного
сдав лив ания, ож огах .
Р асчет клирен са креатин ин а
Н а основ е определения креатинина в м оче и в плаз м е (сы в оротке)
кров и
рассчиты в ается клиренс
креатинина,
которы й
яв ляется
х арактеристикой
клубочков ой
ф ильтрации.
К лиренс
креатинина
(коэф ф ициенточищ ения) показ ы в ает, какой объ ем плаз м ы кров и полностью
очищ ается отданного в ещ еств аз а1 м ин., и рассчиты в ается по ф орм уле:
С= К И ⋅ V ⋅
1,73
,
S
где К И – концентрационны й индекс; V – м инутны й диурез ; 1,73 –
стандартная пов ерх ностьтела; S – истинная пов ерх ностьтела
К онцентрационны й
индекс
показ ы в ает,
во
сколько
раз
концентрируется данноев ещ еств о почкам и.
К И = [креатинин] в м оче
[креатинин] в кров и
V = Д /t,
гдеД – объ ем м очи з ав рем я t, м л; t – в рем я в м ин.
S – 0,0167 рост, см ⋅ в ес, к г .
51
Н орм апоказ ателя клиренса- 90-130 м л/м ин.
К лиренс определяют, когдакреатинин в норм е, в следующ их случаях :
- у потенциальны х доноров почек;
- при м иним альны х пораж ениях почек (клиренс сниж ается раньш е,
чем пов ы ш ается количеств о креатинина и м очев ины в кров и, т.е. яв ляется
сам ы м ранним диагностическим приз наком пораж ения почек);
- при определении доз иров ки токсического соединения;
- оценке ф ункции каж дой почки (рез ультат срав нив ают с полов иной
клиренса)
Реабсорбцию рассчиты в аютпо ф орм уле:
K −1
R=
⋅ 100% .
K
В еличинареабсорбции в норм есостав ляет97-99%.
Р абота 16. М ехан изм действия адрен алин а. О пределен ие
адрен алин а в сы воротке крови
А дреналин – горм он м оз гов ого слоя надпочечников , синтез ируется в
отв ет на состояние ф из ического или нерв ного стресса. Секреция его не
з ав исит от концентрации глюкоз ы в кров и. Биосинтез адреналина идет по
сх ем е: тироз ин → диоксиф енилаланин (Д О Ф А ) → доф ам ин → норадреналин
→ адреналин.
А дреналин и норадреналин наз ы в ают катех олам инам и, но
горм ональной актив ностью обладает адреналин, а норадреналин яв ляется
нейром едиатором . К леткам и-м иш еням и для адреналина яв ляются клетки
скелетны х м ы ш ц, печени, сердца, сердечно-сосудистой систем ы и ж иров ой
ткани. Ф ункционирует адреналин в течение 1 м ин. М ех аниз м действ ия м ем бранно-в нутриклеточны й.
Биологическоедейств иеадреналина.
I. Вл и я ни е на угл еводный об м ен (преж де вс его в с кел ет ныхм ышц ах, а
зат ем впечени ):
- усилив ает распад глюкоз ы в процессе гликолиз а, актив ируя
ф осф оф руктокиназ у;
- усилив ает глюконеогенез в печени з а счет актив ации 4 ф ерм ентов ;
пирув аткарбоксилаз ы , ф осф оенолпирув аткарбоксикиназ ы , ф руктов о-1,6бисф осф атаз ы и глюкоз о-6-ф осф атаз ы ;
- усилив аетраспад гликогена, актив ируя каскадны м м ех аниз м ом , через
аденилатциклаз ную систем у, гликогенф осф орилаз у;
- ингибирует биосинтез гликогена, так как через аденилатциклаз ную
систем у инактив ируетгликогенсинтаз у;
В рез ультатеадреналин пов ы ш аег содерж аниеглюкоз ы в кров и.
П . В лиян ие н а о б м е н липидо в:
- усилив ает распад триацилглицеролов , актив ируя каскадны м
м ех аниз м ом триацилглицерол-липаз у.
- усилив аетраспад ж ирны х кислотв процессеβ-окисления.
52
- пов ы ш ает содерж ание ж ирны х
кислот, х олестерина и
ф осф оглицеридов в кров и.
А дреналин подав ляет секрецию инсулина, пов ы ш ает секрецию
глюкагона.
К атаболиз м адреналина протекаетв гепатоцитах печени под в лиянием
ф ерм ентов
м оноам инооксидаз ы
и
катех ол-0-м етилтрансф ераз ы
с
образ ов анием 80% в анилил-м индальной кислоты , 15% - м етадреналина,
которы е в ы деляются почкам и с м очой, лиш ь 5% адреналина в ы деляются с
м очой неиз м ененны м и.
Горм ональны ем ех аниз м ы реализ ации стресса. Состояниеф из ического
и эм оционального стрессов в осприним ают клетки центральной нерв ной
систем ы и посы лаютнерв ны еим пульсы в м оз гов ой слой надпочечников и в
гипоталам ус. В м оз гов ом слоенадпочечников идетсекреция адреналина, ав
гипоталам усе синтез ируется кортиколиберин (кортикотропин-рилиз инггорм он), под в лиянием которого в гипоф из е происх одит в ы работка
адренокортикотропного горм она (А К Т Г), в оз действ ующ его на корков ы й
слой надпочечников . Д лительное в ы деление адреналина прив одит к
раз растанию (утолщ ению) корков ого слоя надпочечников и з начительном у
ув еличению в ы деления кортикостероидны х горм онов . Следов ательно,
горм ональны еиз м енения м етаболиз м апри стрессеобуслов лены в ы делением
больш ого количеств а адреналина и кортикостероидны х горм онов .
Патология: ф еох ром оцитом а(опух ольм оз гов ого слоя надпочечников ).
К оличествен н ое определен ие адрен алин а колориметрическим методом
Принцип м етода. М етод основ ан на колорим етрическом определении
интенсив ности синего окраш ив ания, в оз никающ его при в з аим одейств ии
адреналина с реактив ом Ф олина. Реактив Ф олина содерж итсоли ф осф орнов ольф рам ов ой
и
ф осф орно-м олибденов ой
кислот,
которы е
в осстанав лив аются адреналином с образ ов анием более низ ких оксидов
м еталлов , ком плексы которы х окраш ены в синий цв ет.
Реактив ы : 0,01%-й раств ор адреналина в ам пулах ; реактив Ф олина;
10%-й раств ор углекислого натрия.
Ход работы . В дв екалибров анны ена10 м лпробирки в носят: в перв ую
— 1 м лстандартного раств ора адреналина, в о в торую — 1 м лисследуем ого
раств ора. Д алее в каж дую пробирку добав ляют по 4 м л 10 %-го
св еж еприготов ленного раств ора карбоната натрия и по 0,5 м л реактив а
Ф олина, в стрях ив ают. Ж идкость постепенно окраш ив ается в синий цв ет,
достигающ ий наибольш ей интенсив ности через 5 м ин. Д алее объ ем
ж идкости дов одят до м етки 10%-м раств ором карбоната натрия,
перем еш ив ают и окраску исследуем ого раств ора срав нив ают с окраской
стандартного раств ора адреналина на ф отоколорим етре, св етоф ильтр
красны й, кюв етас толщ иной слоя 5 м м .
Расчет:
К онцентрация адреналина, м г =(Cст·Е оп)/Е ст,
53
где Cст - концентрация адреналина в стандартном раств оре в м г, Е ст экстинкция стандартного раств ора, Eоп - экстинкция испы туем ого раств ора.
Задан ие по теме «П ерен осген етической ин формации»
1. Н апиш ите нуклеотидную последов ательность участка Д Н К ,
синтез ируем ого Д Н К -полим ераз ой, если м атрицей для него бы ла
последов ательность
а) (5′) - AТ GА А ATTAСGТ GСACGACGCТ GA - (3′)
б) (5′) - AТ GТ Т AGСATATСGТ GGGCCGТ AG - (3′)
в ) (5′) - А TGAТ TА А AСGТ GСATTTAATTAA- (3′)
г) (5′) - AТ GТ TTСGТ GСAAAAGCGCTTTGA - (3′).
2. Н апиш ите нуклеотидную последов ательность РН К , синтез ируем ой
Д Н К -з ав исим ой РН К -полим ераз ой, если м атрицей для нее яв ляется
синтез иров анны й участок, полученны й в п. 1.
3. Н апиш ите ам инокислотную последов ательность пептида, если в
качеств ем атрицы для его синтез абудетРН К , полученная в п.2 (см . табл. 13).
4. М олекулаД Н К содерж ит15 ты с. пар основ аний. Рассчитайте длину
м олекулы . (Расстояние м еж ду центрам и основ аний, леж ащ их друг над
другом , рав но 0,34 нм . Н а каж ды й полны й в иток дв ойной спирали
прих одится 10 нуклеотидны х пар.)
5. Согласно данны м электронной м икроскопии длина х ром осом ы E.
coli рав на1,2 м км . Сколько пар ком плем ентарны х основ аний присутств уетв
х ром осом е?
54
Т аблица13.
Генетический код (последов ательностьоснов аний в триплетах м РН К ,
кодирующ их ам инокислоты ).
Перв ое
В тороеполож ение
Т ретье
полож ение
полож ение
U
C
A
G
(5’-конец)
(3’-конец)
↓
↓
Phe
Ser
Tyr
Cys
U
U
Phe
Ser
Tyr
Cys
C
Leu
Ser
Стоп
Стоп
A
Leu
Ser
Стоп
Trp
G
C
Leu
Pro
His
Arg
U
Leu
Pro
His
Arg
C
Leu
Pro
Gln
Arg
A
Leu
Pro
Gln
Arg
G
A
Ile
Thr
Asn
Ser
U
Ile
Thr
Asn
Ser
C
Ile
Thr
Lys
Arg
A
Met
Thr
Lys
Arg
G
G
Val
Ala
Asp
Gly
U
Val
Ala
Asp
Gly
C
Val
Ala
Glu
Gly
A
Val
Ala
Glu
Gly
G
О С Н О В Н А Я Л И Т ЕР А Т У Р А
Биологическая х им ия. Руков одств о к лабораторны м з анятиям . - СПб.,
1998. – 68 с.
М едицинскиелабораторны етех нологии: Справ очник: В 2 т. / Под ред.
А .И .К арпищ енко. - СПб: И нтерм едика, 1999. - Т .2. - 115 с.
Пустов алов а Л.М . Практикум по биох им ии / Л.М . Пустов алов а. –
Ростов -н/Д : Ф еникс, 1999. – 544 с.
Д О П О Л Н И Т ЕЛ Ь Н А Я Л И Т ЕР А Т У Р А
А лабов ский В .В . Задания к практическим з анятиям по биох им ии / В .В .
А лабов ский. – В оронеж , 1994. – 116 с.
Лиф ш иц В .М . Биох им ическиеанализ ы в клинике. / В .М . Лиф ш иц, В .И .
Сидельников а. - В оронеж : И з д-в о В оронеж . ун-та, 1995. - 222 с.
Э нциклопедия клинических лабораторны х тестов / Под ред. Н . Т ица. М .: Лабинф орм , 1997. - 942 с.
Лениндж ер А . О снов ы биох им ии: В 3 т. / А . Лениндж ер. - М .: М ир,
1985. – Т . 1-3.
55
Состав ители: Попов аТ атьянаН иколаев на,
М атасов аЛарисаВ ладим иров на,
Т екунов аН инаА лексеев на
Сем ених инаА настасия В ладим иров на
Редактор
Т их ом иров аО .А .
Похожие документы
Скачать