материалы в сборнике
реклама
Формирование цитосфер и нейрональная дифференцировка в культуре клеток надпочечников новорожденных поросят О.С. Сидоренко, Г.А. Божок, Е.И. Легач, Т.П. Бондаренко Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков sidorenkoolga13@gmail.com Ключевые слова: культура клеток надпочечников, цитосферы, нейрональная дифференцировка, βIII-тубулин, трипсин, коллагеназа. Хромаффинные клетки мозгового вещества надпочечников являются одним из производных нервного гребня. В последнее время активно изучается возможность индукции нейрональной дифференцировки в культуре хромаффинных клеток, а также функциональные особенности полученных нейронов [3, 5, 6]. Эти исследования являются многообещающими и перспективными с точки зрения потенциальной возможности использования собственных клеток надпочечников пациента для получения нейронов in vitro и аутотрансплантации при лечении нейродегенеративных заболеваний. Коллагеназа и трипсин широко применяются для дезагрегации ткани и получения суспензии клеток для культивирования in vitro [2]. Однако, вследствие разной активности этих ферментов, степень повреждения ткани при воздействии на нее трипсином или коллагеназой при прочих равных условиях может существенно отличаться. Показано также, что степень повреждений, вызванных воздействием как трипсина, так и коллагеназы, зависит от типа клеток и может варьировать в широких пределах [4]. Целью работы было изучить влияние состава ферментативного раствора, применяемого для дезагрегации ткани надпочечников новорожденных поросят, на морфологические особенности полученных клеток при культивировании. Материалы и методы. Клетки получали из надпочечников новорожденных поросят ферментативным способом с использованием коллагеназы (1 мг/мл) и дезоксирибонуклеазы (0,1 мг/мл), либо трипсина (1 мг/мл) и дезоксирибонуклеазы (0,1 мг/мл). Клетки культивировали в пластиковых флаконах в среде 199 или DMEM/F12 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (ФТС), антибиотиков (100 ед/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина) и амфотерицина В (5 мкг/мл) при 37°С и 5% СО2. О.С. Сидоренко, Г.А. Божок, Е.И. Легач, Т.П. Бондаренко Жизнеспособность клеток оценивали по их способности исключать трипановый синий (0,4%). Для иммуноцитохимических исследований использовали первичные мышиные antiIII-tubulin (TU-20) моноклональные антитела (1:500, Abcam, UK) и вторичные козьи antimouse FITC-конъюгированные антитела (1:1000, Abcam). Для идентификации клеточных ядер к образцам добавляли пропидия йодид (2 мкг/мл). Исследование и фотосъемку образцов производили с помощью микроскопа Carl Zeiss Axio Observer Z1 и анализировали с использованием программ AxioVision Rel.4.7 и LSM Image Examiner (Carl Zeiss). Статистическую достоверность определяли, используя критерий Стьюдента. Результаты и обсуждение. На первом этапе исследования для дезагрегации ткани и получения клеток мы использовали ферментативный раствор, содержащий коллагеназу и дезоксирибонуклеазу (Кол/ДН). Жизнеспособность полученных клеток составляла 74,4 ± 15,5%. Поскольку в данной работе для культивирования использовалась общая суспензия клеток, полученных из надпочечников после ферментативной обработки, включая клетки коры, медуллы, соединительнотканные и эндотелиальные клетки, первичная культура была гетерогенна по клеточному составу. После 1-х суток культивирования к поверхности прикреплялось 71,7 ± 5,7% посаженных клеток, большая часть из них распластывалась. Клетки, не прикрепившиеся к поверхности за 1 сутки культивирования, в основном были представлены эритроцитами. После прикрепления и распластывания клеток культура была представлена в основном мультиполярными клетками фибробластоподобной морфологии, а также гормонопродуцирующими округлыми клетками с включениями. На более поздних сроках культивирования наблюдалось формирование упорядоченной структуры расположения фибробластоподобных клеток, при этом они тесно прилегали друг к другу, становились более вытянутыми и приобретали биполярную форму, формируя характерные потоки (рис. 1А). Такая параллельная организция клеточного монослоя характерна для клеток, переходящих из log-фазы на стадию плато [2]. Во второй серии экспериментов для получения клеток мы использовали ферментативный раствор, содержащий трипсин и дезоксирибонуклеазу (Тр/ДН). В данном случае жизнеспособность полученных клеток была выше, чем при обработке ферментативным раствором Кол/ДН, и составляла 87,3 ± 3,2%. Однако, оценивая эффективность режима ферментативной обработки, целесообразно учитывать не только жизнеспособность полученных клеток, но и их общее количество. При обработке фрагментов ткани коллагеназой из одного надпочечника было получено в среднем 6,50 ± 68 Формирование цитосфер и нейрональная дифференцировка в культуре клеток надпочечников новорожденных поросят 3,57 млн. клеток, обработка фрагментов трипсином позволяла получить всего 1,08 ± 0,86 млн. клеток. В совокупности данные о количестве полученных клеток и целостности их мембран свидетельствуют о том, что трипсин оказывает более сильное повреждающее влияние на клеточную мембрану, в результате чего она полностью разрушается и клетка не учитывается при подсчете. Этим можно объяснить высокую жизнеспособность клеток при их низком количестве при обработке ткани трипсином (рис. 2). Культуры клеток, полученных путем ферментативной обработки Тр/ДН, в целом были похожи на культуры клеток, полученных с использованием Кол/ДН: в них наблюдались клетки фибробластоподобной морфологии, округлые клетки с включениями. Однако в культурах клеток, полученных с применением Тр/ДН, отдельные участки монослоя были сформированы группами тесно упакованных клеток (рис. 1Б). Данные группы клеток образовывали округлые области и имели четко очерченную границу, отделяющую их от монослоя, сформированного фибробластоподобными клетками. Тенденция формировать подобные «островки» характерна для эпителиоидных клеток [2], однако природа подобных клеточных «островков», наблюдаемых в наших экспериментах, остается невыясненной. Подобных участков «эпителиоидных» клеток не наблюдалось в культурах, полученных с использованием Кол/ДН, что, вероятно, связано с различной ферментативной активностью трипсина и коллагеназы и их влиянием на сохранность клеток различных типов, присутствующих в суспензии. Наличие клеток, формирующих эпителиоподобные «островки» в культуре, полученной с использованием трипсина, но не коллагеназы, может свидетельствовать о том, что ферментативная обработка ткани коллагеназой, применяемая в нашей работе, оказывает на них губительное воздействие. Возможно, некоторые модификации режима ферментативной обработки или изменения концентрации коллагеназы позволят сохранить данную популяцию клеток. Однако, из литературных данных известно, что воздействие коллагеназы на клетки при ферментативной обработке, наоборот, сопровождается меньшим повреждающим эффектом по сравнению с трипсином. В то же время, разные типы клеток обладают разной устойчивостью к действию как трипсина, так и коллагеназы [4]. Возможно, что в наших экспериментах клетки эпителиоидной морфологии оказались менее чувствительными к ферментативной обработке, чем фибробластоподобные, формирующие большую часть конфлюентного монослоя. В данном случае можно предположить, что в культуре клеток, полученных путем обработки ткани Тр/ДН, на фоне общего снижения количества полученных клеток наблюдается относительное увеличение эпителиоидных клеток, которые получают возможность пролиферировать и формировать 69 О.С. Сидоренко, Г.А. Божок, Е.И. Легач, Т.П. Бондаренко характерные области в первичной культуре. В то же время в культурах клеток, полученных путем ферментации ткани раствором Ко/ДН, сохраняется значительная часть фибробластоподобных клеток, а также клеток других популяций, подавляющих рост эпителиоидных клеток в силу более высокой пролиферативной активности. После достижения 80% конфлюентности (3–5 сутки) в культурах клеток, полученных путем обработки ткани как Кол/ДН, так и Тр/ДН на монослое формировались сферические кластеры (цитосферы), состоящие из нескольких клеток (рис. 3А). При дальнейшем культивировании цитосферы увеличивались в размерах, достигая 300 мкм в диаметре, и уплотнялись. Вероятно, это связано с тем, что клетки в составе цитосфер синтезировали элементы внеклеточного матрикса, создавая необходимое микроокружение. Следует отметить, что в области прикрепления цитосфер на более поздних сроках культивирования наблюдалась неравномерность монослоя с участками его разрежения либо уплотнения. В некоторых экспериментах цитосферы открепляли механически пипетированием и пересевали, используя питательную среду аналогичного состава. После пересева цитосферы прикреплялись к подложке, после чего наблюдалось выселение из них клеток двух морфологических типов: фибробластоподобных, а также сравнительно небольших нейроноподобных клеток с отростками, формирующими сеть (рис. 3Б). Иммуноцитохимическое окрашивание выявило экспрессию β-III-тубулина в соме и отростках нейроноподобных клеток, выселяющихся из цитосфер (рис. 3В). Фибробластоподобные клетки монослоя не экспрессировали β-III-тубулин, о чем свидетельствует отсутствие зеленого свечения (рис. 3Г). Опираясь на литературные данные о свойствах различных стволовых/прогениторных клеток формировать в культуре сферические клеточные колонии [1], а также учитывая тот факт, что в наших экспериментах на ранних этапах культивирования клеток нейроноподобной морфологии в культуре не наблюдалось, мы предположили, что формирование цитосфер в нашей работе может быть связано именно с пролиферативной активностью слабо дифференцированных прогениторных клеток, а появление нейроноподобных клеток является результатом их дифференцировки. Таким образом, в зависимости от состава ферментативного раствора, применяемого для дезагрегации ткани надпочечников новорожденных поросят, изменяется количественный и качественный состав клеточной суспензии. При культивировании полученных клеток наблюдается формирование сферических клеточных кластеров – цитосфер, а также дифференцировка клеток в нейрональном направлении. Запуск процесса дифференцировки в данном случае не определялся составом среды, поскольку и формирование цитосфер, и появление нейроноподобных клеток в культуре наблюдалось при культивировании в среде с 70 Формирование цитосфер и нейрональная дифференцировка в культуре клеток надпочечников новорожденных поросят одинаковыми биохимическими параметрами без использования каких-либо специфических факторов роста. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Список использованной литературы Сукач А.Н., Иванов Э.Н. Образование сферических колоний как свойство стволовых клеток // Цитология. – 2007. – Т.49, №11. – С. 916-922. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток: практическое руководство / Р.Я. Фрешни; пер. 5-го англ. изд. – Москва: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. – 691 с. Chung K. F., Sicard F., Vukicevic V. et al. Isolation of neural crest derived chromaffin progenitors from adult adrenal medulla // Stem cells. – 2009. – V.27, N10. – P. 2602 - 2613. Danhier P. et al. Influence of cell detachment on the respiration rate of tumor and endothelial cells // PLoS One. – 2013. – V.8, N1. Published online 2013 January 30. doi: 10.1371/journal.pone.0053324 Ehrhart-Bornstein M. et al. Chromaffin progenitor cells from the adrenal medulla // Cell Mol Neurobiol. – 2010. – V.30, N8. – P. 1417-1423. Santana M.M. et al. Isolation, characterization and differentiation of progenitor cells from human adult adrenal medulla // Stem Cells Transl Med. – 2012. – V.1, N11. – P. 783-791. 71 О.С. Сидоренко, Г.А. Божок, Е.И. Легач, Т.П. Бондаренко Рис. 1. Культура клеток надпочечников новорожденных поросят, полученных путем дезагрегации ткани ферментативным раствором Кол/ДН (А) и Тр/ДН (Б). Количество клеток, *10 6 12 10 8 * # 6 4 2 0 Кол/ДН Общ ее количество клеток Тр/ДН Количество живых клеток Рис. 2. Количество клеток, полученных из одного надпочечника при ферментативной обработке ткани растворами Кол/ДН и Тр/ДН. * – отличие достоверно по отношению к общему количеству клеток, полученных с использованием Тр/ДН, p < 0,05; # – отличие достоверно по отношению к количеству живых клеток, полученных с использованием Тр/ДН, p < 0,05. 72 Формирование цитосфер и нейрональная дифференцировка в культуре клеток надпочечников новорожденных поросят Рис. 3. А – формирование цитосфер в культуре клеток надпочечников новорожденных поросят (13-е сутки культивирования); Б – выселение клеток нейроноподобной морфологии из цитосфер (5-е сутки после пересева); В – β-III-тубулин в соме и отростках нейроноподобных клеток, выселяющихся из цитосфер на 7-е сутки после пересева цитосфер (флуоресцентная микроскопия: ядра окрашены пропидия йодидом); Г – отсутствие положительного окрашивания β-III-тубулина в культуре, представленной монослоем из фибробластоподобных клеток (флуоресцентная микроскопия: ядра окрашены пропидия йодидом). 73
