медицина - Белорусский государственный медицинский

“Young Scientist” . #4 (51) . April 2013
Medicine
627
МЕДИЦИНА
Субпопуляции нейроэндокринных клеток мозгового вещества тимуса человека
Беловешкин Андрей Геннадьевич, ассистент;
Стельмах И.А., кандидат медицинских наук, доцент;
Студеникина Т.М., кандидат медицинских наук, доцент
Белорусский государственный медицинский университет (Минск)
В составе телец Гассаля обнаружена экспрессия нейроэндокринных маркеров синаптофизина, хромогранина А, нейроспецифической енолазы, глиального фибриллярного кислого белка, на основании полученных
данных выделено два топографических паттерна распределения нейроэндокринных клеток в мозговом веществе тимуса человека.
Ключевые слова: тимус, тельца Гассаля, нейроэндокринные клетки.
В
ведение. Общепризнано, что клетки диффузной
нейроэндокринной системы, которые локализованы практически во всех органах, регулируют гомеостаз
через нейрокринные, эндокринные и паракринные механизмы [1]. Они секретируют биологически активные вещества, которые можно рассматривать как сигнальные
молекулы для локальной координации межклеточных взаимодействий. Таким образом, организм обладает многофункциональной и диффузной нейроиммунноэндокринной
системой, которая интегрирует нервную, эндокринную и
иммунную системы в единый комплекс [2]. Таким образом,
нейроэндокринные клетки могут выделять те же вещества, что и нейроны, но, в отличие от последних, они участвуют в паракринной регуляции органов и тканей.
Нейроэндокринные клетки являются важной популяцией нормального тимуса человека. В тимусе они координируют сложные процессы взаимодействия между
клетками микроокружения (дендритные клетки, эпителиальные клетки, миоидные клетки и т.п.) и развивающимися тимоцитами. В тимусе обнаружено большое число
самых различных пептидных и непептидных гормонов, характеризующихся преимущественной экспрессией в тех
или иных микроокружениях тимуса. Гормоны нейроэндокринной системы тимуса обладают выраженной имунорегуляторной активностью, непосредственно влияя на
такие процессы, как клеточная пролиферация, дифференцировка, миграция, секреция, апоптоз и продукция цитокинов [12].
Так, выявлена преимущественная локализация разных
нейроэндокринных маркеров в различных отделах тимуса (вещество PGP 9.5 в корковом веществе, нейронспецифическая енолаза, синаптофизин в эпителиальных
клетках мозгового вещества, субстанция P, бомбезин и
бета-эндорфин в субкапсулярных эпителиоцитах, окситоцин и вазопрессин в субкапсулярных и эпителиальных
клетках мозгового вещества [15, 16]. Локальная продукция гормонов и присутствие рецепторов к ним на иммунокомпетентных клетках играют существенную роль
в регуляции внутритимических процессов. Топографическая специфичность этих гормонов может указывать
их роль в регуляции процессов дифференцировки тимоцитов, происходящих в данных отделах тимуса [1], а изучение нейроэндокринной системы тимуса открывает
широкие возможности для понимания и влияния на внутритимусные процессы селекции и дифференцировки тимоцитов [12,13].
Тельца Гассаля являются важным компонентом мозгового вещества долек тимуса и играют значительную роль в
регуляции внутритимических процессов. Электронно-микроскопические исследования показывают высокую секреторную активность клеток телец Гассаля, также продемонстрирована тенденцию к концентрации некоторых
нейроэндокринных клеток возле телец Гассаля, однако
более точные данные по этому вопросу в современной
литературе отсутствуют. Данный вопрос является актуальным, так как в последнее время обнаружена важная
роль телец Гассаля как в ряде физиологических процессов (созревание Т-регуляторов, синтез хемокинов и
т.п.), так и в патогенезе ряда заболеваний (ревматоидный
артрит, сахарный диабет 1 типа и т.п. [4]). Учитывая функциональную роль телец Гассаля в процессах дифференцировки тимоцитов, мы считаем важным установление
особенностей локальной экспрессии основных нейроэндокринных маркеров в тельцах Гассаля.
628
Медицина
Для изучения нейроэндокринных клеток, преимущественно локализованных в мозговом веществе тимуса, мы
исследовали четыре нейроэндокринных молекулы. Синаптофизин (SYN), как маркер мелких везикул с нейротрансмиттерами (SLMV) [9, 10, 11], хромогранин А [8] (CGA),
как маркер плотных эндокринных гранул (LDCV). Отметим, что данные гранулы отличаются по ультраструктуре
и содержат различные биологически активные вещества,
так в SLMV обнаруживаются классические нейротрансмиттеры, такие как, например, ацетилхолин, а в LDCV –
пептиды и катехоламины. Дополнительно изучалось распределение GFAP и NSE-положительных клеток [16].
Материалы и методы
В исследовании использовали фрагменты тимусов (30
случаев), удаленных в Минском детском кардиохирургическом центре при вмешательствах по поводу минимальных сердечно-сосудистых пороков у детей в возрасте
1–4 месяца, в анамнезе которых отсутствовали инфекционные заболевания, иммунодефицитные состояния,
прием стероидных гормонов, иммунодепрессантов. Забирались фрагменты тимусов, удаленных только по хирургическим показаниям (кровотечение, разможжение и др.) с
учетом существующих этических и юридических норм.
Образцы тимуса (30 случаев) фиксировали в нейтральном формалине, заливали в парафин, готовили серийные срезы толщиной 7 мкм. Окраска препаратов проводилась гематоксилин-эозином (обзорная гистология).
Проводилось иммуногистохимическое исследование с антителами к синаптофизину (SYN), хромогранину А (СGA),
нейроспецифической енолазе, глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP) (Производство Daco, USA).
Ядра клеток докрашивались гематоксилином. Подсчитывалось количество иммуноположительных клеток в мозговом веществе на квадратный миллиметр.
Съемка проводилась с использованием цифровой камеры-окуляра UMD-300 («Gsmserver», Тайвань), установленной на микроскопе Zeiss Axiolab («Carl Zeiss AG»,
Германия). Микроскопическое исследование проводилось
с помощью компьютерного анализатора изображения на
базе цифровой камеры UMD-300 («Gsmserver», Тайвань) и микроскопа Zeiss Axiolab («Carl Zeiss AG», Германия).
Результаты и их обсуждение
В результате исследования нами были выявлены два
различных типа распределения иммунореактивности
нейроэндокринных маркеров в мозговом веществе тимуса. Первый тип включает маркеры SYN и NSE-положительные клетки, которые проявляют отчетливую тенденцию к концентрации около телец Гассаля. Второй тип,
представленный GFAP и CGA-положительными клетками, демонстрирует равномерное распределение клеток
в мозговом веществе тимуса.
«Молодой учёный» . № 4 (51) . Апрель, 2013 г.
Синаптофизин – это маркер мелких везикул с нейротрансмиттерами (SLMV), который представляет собой
пептид, входящий в состав стенки везикул секреторных
и нервных клеток [9,11,14]. Синаптофизин является основным структурным пептидом секреторных везикул. Так
как он участвует в процессах экзоцитоза, то может играть
роль в процессах секреции тимических гормонов и других
биологически активных веществ.
SYN-положительные клетки самые распространенные
нейроэндокринные клетки тимуса, расположены преимущественно в мозговом веществе, где их плотность составляет 35 на кв. мм. SYN-положительные клетки на
кортико-медуллярной границе часто представлены кластерами клеток. Большая часть клеток мозгового вещества ассоциирована с тельцами Гассаля или непосредственно входит в состав стенки тельца. 90 % клеток имеют
круглую форму с центрально расположенным ядром, а
остальные клетки имеют отростчатую (часто с однимдвумя длинными отростками) или полигональную форму.
В наших наблюдениях 80 % SYN-положительных клеток
ассоциированы с тельцами Гассаля, что подтверждает
данные ряда авторов [10,11] о преимущественной локализации SYN-положительных клеток в тельцах. Клетки
часто образуют кластеры из 3–7 клеток. Характер иммуногистохимической реакции – цитоплазматическая, диффузная, интенсивность варьирует от умеренной до интенсивной.
Хромогранин A (CGA) является маркером больших секреторных гранул с электронно-плотной сердцевиной [5]
(плотные эндокринные гранулы (LDCV). В результате
процессинга молекулы CGA возникают небольшие пептиды, обладающие регуляторными функциями (вазостатины, хромостатин, катестатин и парастатин). Отметим,
что накопление гистамина и серотонина происходит в
именно в LDCV гранулах [3,8]. Нами выявлено, что СGAположительные клетки расположены диффузно в мозговом веществе тимуса, причем наблюдается тенденция к
их концентрации на кортикомедуллярной границе и в составе телец Гассаля. Плотность клеток составляет 4,71 на
кв. мм. Процент клеток, входящих в состав телец Гассаля,
составляет около 30 %. Часть клеток представлена небольшими кластерами, состоящими из 3–4 клеток. Иммуногистохимическая реакция характеризуется цитоплазматической, гранулярной реактивностью. Основными
морфологическими типами являются округлые клетки с
умеренно развитой цитоплазмой и отросчатые клетки с
2–3 отростками.
Нейронспецифическая енолаза – это цитоплазматический гликолитический фермент, присутствующий в
клетках нейроэктодермального происхождения, нейронах
головного мозга и периферической нервной ткани [16].
NSE-положительные клетки встречаются намного реже
SYN, CGA-положительных, их плотность составляет
1,1–1,3 на кв. мм., что сопоставимо с данными литературы [6]. Морфологически данная субпопуляция представлена крупными овальными клетками с большим
“Young Scientist” . #4 (51) . April 2013
Medicine
629
Рис. 1. SYN-положительные клетки в тимусе человека. Иммуногистохимическая реакция на синаптофизин.
Обозначения: 1 – корковое вещество, 2 – мозговое вещество, 3 – тельце Гассаля, 4 – кластер клеток.
Увеличение: А – 200, Б, В, Г – 1000.
Рис. 2. СGA-положительные клетки в тимусе. Иммуногистохимическая реакция на хромогранин А.
Обозначения: 1 – корковое вещество, 2 – мозговое вещество, 3 – тельце Гассаля. Увеличение: А – 200, Б,В – 1000.
630
Медицина
ядром и малым количеством цитоплазы. 70–80 % NSEположительных клеток связаны с тельцами Гассаля. Изредка клетки образуют группы из 2–3 клеток. Иммуногистохимическая реакция цитоплазматическая, диффузная,
интенсивность варьирует от умеренной до слабой.
Глиальный фибриллярный кислый белок образует
промежуточные филаменты в астроглии, в клетках глиального происхождения и является маркером нейроэндокринных клеток [5]. В тимусе человека GFAP-положительные клетки встречаются в мозговом веществе редко,
их плотность составляет 3,7 клетки на кв. мм.. GFAPположительные клетки представлена крупными клетками неправильной, часто отростчатой формы с большим
ядром, имеющим неправильную форму, и небольшим
ободком цитоплазы. Около трети GFAP-положительных
клеток связаны с тельцами Гассаля. Склонность к образованию кластеров отсутствует. Иммуногистохимическая
реакция цитоплазматическая, диффузная, ее интенсивность варьирует от умеренной до слабой. В доступной литературе мы не обнаружили данных об экспрессии GFAPположительные клетки в тимусе человека. Отметим, что
ряд авторов [5] ее не обнаружило, однако у мышей и крыс
данные нейроэндокринные клетки в тимусе описаны.
Таким образом, нами выявлены различные типы распределения нейроэндокринных клеток в мозговом веществе тимуса. Первый тип включает маркеры SYN и NSEположительные клетки и характеризуется специфической
морфологией и топографией: клетки достоверно проявляют отчетливую тенденцию к концентрации около телец
Гассаля и характеризуются преимущественно округлой
формой и склонностью к образованию кластеров.
Иная картина характерна для второго типа, представленного маркерами GFAP и CGA: клетки распределены в
мозговом веществе равномерно, без склонности к образованию кластеров. Морфологически они имеют неправильную, полигональную форму часто с длинными отростками Мы полагаем, что обнаруженные различия связаны
с наличием в мозговом определенных микроокружений
для дифференцировки развивающихся тимоцитов. Высокая локальная концентрация нейроэндокринных клеток
свидетельствует о топической специфической секреции
«Молодой учёный» . № 4 (51) . Апрель, 2013 г.
ряда гормонов в тельцах Гассаля, что указывает на их активное участие во внутритимусных процессах селекции и
дифференцировки.
Также мы считаем важным обсудить некоторые гипотезы, касающиеся нейроэндокринных клеток. Широкий
спектр нейральных маркеров, обнаруженных в эпителиальных клетках тимуса, позволил ряду авторов предположить их происхождение из нервного гребня [5]. Однако
в последнее время было убедительно показано [7], что
все эпителиальные клетки тимуса происходят из единого
предшественника, экспрессирующего маркер MTS 24+.
В свете этих данных, можно предположить, что нейроэндокринные клетки происходят из общих эпителиальных
клеток-предшественников.
В литературе также высказывается мнение, что экспрессия широкого спектра нейроэндокринных маркеров
является проявлением синтеза тканеспецифических аутоантигенов [6,15]. Однако топографический паттерн
экспрессии аутоантигенов отличается от паттернов экспрессии нейроэндокринных маркеров, не обнаруживаются они и в полости телец Гассаля, поэтому данное
мнение, на наш взгляд, не убедительно.
Заключение. В составе телец Гассаля обнаружена
экспрессия всех четырех изучаемых нейроэндокринных
маркеров. На основании полученных данных выделено
два топографических паттерна распределения нейроэндокринных клеток в мозговом веществе тимуса человека.
Показано, что SYN и NSE-положительные клетки преимущественно связаны с тельцами Гассаля, а GFAP и
CGA-положительные клетки равномерно распределены
в мозговом веществе тимуса. Обнаружены также морфологические особенности клеток, относящихся к различным паттернам: SYN и NSE-положительные клетки
характеризуются преимущественно округлой формой и
склонностью к образованию кластеров, а GFAP и CGAположительные клетки имеют выражено отросчатую
морфологию без тенденции к образованию кластеров.
Данное наблюдение свидетельствует о локальной специфической секреции ряда гормонов в тельцах Гассаля,
что указывает на их активное участие во внутритимусных
процессах.
Литература:
1.
2.
3.
4.
5.
Акмаев И.Г. Взаимодействие основных регуляторных систем (нервной, эндокринной и иммунной) и клиническая манифестация их нарушений // Клинич. медиц. –1997. – № 11. – с. 8–13.
Райхлин Н.Т. АПУД-система (диффузная эндокринная система): основные представления, эндокринноклеточные
опухоли (апудомы), иммуногистохимическая диагностика./ В кн.: Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Ред. С.В. Петрова, Н.Т. Рахайлин. 2-е изд. – Казань–2000. – Гл.12 – с. 222–237.
Bai M., Karatzias G. Immunohistochemical Expression Patterns of Neural and Neuroendocrine Markers, the Neural
Growth Factor Receptors and the Tubulin II and IV Isotypes in Human Thymus // Anticancer reseach – 2008. –
V.28: – P. 295–304.
Bodey B., Siegel S.E. Immunological aspects of neoplasia. The role of the thymus// Springer Science. – 2004. – P.
567.
Botham C., Jones G., Kendall M. Immuno-characterisation of neuroendocrine of the rat thymus gland in vitro and in
vivo // Cell Tissue Res (2001) V. 303 – P. 381–389.
“Young Scientist” . #4 (51) . April 2013
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Medicine
631
Brelińska R., Ostalska D. Zabel M Subtypes of thymic epithelial cells defined by neuroendocrine markers //
Histochemistry and Cell Biology – 2000 – V. 114 – N. 3 – P. 239–244.
Gill J., Malin M., Holländer G. Generation of a complete thymic microenvironment by MTS24 (+) thymic epithelial
cells // Nat Immunol. – 2002 – V. 3 (7) – P. 635–42.
Ginda WJ, Gratzl M Chromogranin A immunoreactivity in epithelial cells of the thymus // Folia Histochem
Cytobiol. –1996.– V.34 (2) P. 91–3.
Gould V, Lee I, Wiedenmann B, Moll R, Chejfec G, Synaptophysin: a novel marker for neurons, certain neuroendocrine
cells, and their neoplasms. // Hum Pathol. – 1986. – V.17 – P. 979–983.
Leimer U., Grund C. Sorting of synaptophysin into special vesicles in nonneuroendocrine epithelial cells // J. Cell
Biol. – 1994. – V.127 – P. 1589–1601.
Maggiano N., Lauriola L., Fabio G. Detection of Synaptophysin-producing Cells in Human Thymus by
Immunohistochemistry and Nonradioactive In Situ Hybridization // The Journal of Histochemistry & Cytochemistry –
1999. – V.47 (2) – P. 237–243.
Moll U., Lane B., Geenen V. The neuroendocrine thymus. Abundant occurrence of oxytocin-, vasopressin-, and
neurophysin-like peptides in epithelial cells // Histochemistry – 1988. – V.89 – P. 385–390.
Reichlin S. Neuroendocrine-immune interactions // New Engl. J. Medic. – 1993. – V.329. – P.1246.
Stridsberg M., Johansson U., Grimelius J. Colocalisation of synaptophysin with different neuroendocrine hormones
// Histochem. Cell Biol. – 1999. – V.111 (1) – P. 49–54.
Saltez M. Immune cells express endocrine markers. // Neuroendосrinol. Lett. – 2002. – V.23. – № 3. – P.8–9.
Wilson S., Mireille D. Neuroendocrine Control of Thymus Physiology // Endocrine Reviews – 2000. – V.21 (4) –
P. 412–443.
К вопросу о классификации телец Гассаля тимуса человека
Беловешкин Андрей Геннадьевич, ассистент
Белорусский государственный медицинский университет (Минск)
В данной публикации рассматривается вопрос о классификации телец Гассаля тимуса человека, выявляются слабые стороны существующих классификаций. На основании полученных результатов предложена
классификация, в основе которой лежат простые морфологические критерии, позволяющие идентифицировать тип телец Гассаля на любых гистологических препаратах.
Ключевые слова: классификация, тимус, тельца Гассаля.
В
ведение. В мозговом веществе одной дольки тимуса
одновременно находятся тельца Гассаля различных
размеров и форм. Еще со времен Гаммара известно, что
это разнообразие обусловлено тем, что тельца находятся
на разных стадиях развития. Поэтому, последовательно
сгруппировав тельца по определенным морфологическим
признакам, можно выстроить непрерывную последовательность их морфологических изменений в процессе развития. Анализ существующих классификаций телец Гассаля выявляет наиболее слабые их стороны. Одной из них
является отсутствие точных определений стадий развития.
Их количество варьирует от 3 [1,2] и до 12 [3], причем авторы не приводят морфологических критериев для выделения типов телец [4], либо неоправданно их усложняют [ссылка]. Большинство исследователей выделяло
прогрессивную стадию (укрупнение светлой эпителиальной клетки, гипертрофию соседних клеток), стадию
зрелости (формирование «луковицы») и регрессивную
стадию (кальцификация или разрыв стенки тельца и фагоцитоз его остатков). J. Miller [6] выделял фазы воз-
никновения, некроза и резорбции. Кроме того, ни одна
из классификаций телец Гассаля не получила широкого
признания. Неопределенность усугубляется добавлением различных терминов для обозначений одной стадии
и попытками учета разных морфологических признаков
телец [7]. Значительная путаница в названиях телец Гассаля и их компонентов отражает существующую неопределенность в понимании процесса их развития. Так, содержимое полости определяется различными авторами как
«чешуйчатые сферические включения» [1], «ядерный детрит», «распад набухших ретикулярных клеток» [4], «гиалиноз и обезыствление клеточного детрита» [2]. Уточнение подобных вопросов требует тщательного изучения
развития эпителиальных клеток телец Гассаля.
Материалы и методы. В соответствии поставленными
с целью и задачами исследования в работе использовались гистологические, иммуногистохимические, электронно-микроскопический методы. В исследовании использовали фрагменты тимусов (30 случаев), удаленных в
Минском детском кардиохирургическом центре при вме-