ОСОБЕННОСТИ CYP-ЗАВИСИМОГО МЕТАБОЛИЗМА СМЕСИ

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА
Том 150, кн. 2
Естественные науки
2008
УДК 577.29:615
ОСОБЕННОСТИ CYP-ЗАВИСИМОГО
МЕТАБОЛИЗМА СМЕСИ ПСИХОТРОПНЫХ ПРЕПАРАТОВ
В ПЕЧЕНИ И МОЗГЕ МЫШЕЙ
А.Н. Фаттахова, А.Г. Иксанова
Аннотация
Анализ концентрации цитохромов Р450 в микросомах мозга мышей, получавших
коктейль, содержащий различные дозы галоперидола и аминазина, показал, что содержание Р450 пропорционально возрастало с увеличением дозы галоперидола, но не зависело от дозы аминазина. В микросомах мозга мышей скорость С-гидроксилирования
аминазина снижалась, а скорость N-деметилирования аминазина возрастала при увеличении дозы галоперидола. Предполагается, что в присутствии галоперидола метаболизм аминазина сдвигается в сторону образования токсичных N-деметилированных
продуктов на фоне увеличения реальной дозы аминазина.
Ключевые слова: психотропные препараты, метаболизм, цитохромы Р450, мышь,
взаимодействие лекарств.
Введение
В популяциях, склонных к перегруженной медикаментозной терапии, все
актуальнее становится вопрос о взаимодействии лекарств в организме человека
в составе лекарственной смеси (ЛС). Поэтому к числу исследовательских приоритетов современной медицины и фармакологии относится направленная селекция нанопрепаратов, способных оказывать лечебное действие без побочных
токсических эффектов.
Фармакокинетические и фармакодинамические индексы каждого препарата изменяются в составе ЛС. Механизмы взаимодействия лекарств различны:
изменение усвояемости, изменение выведения препаратов, индукция-ингибирование ферментов детоксикации. Известно, что метаболизм аминазина и галоперидола в печени катализируют клинически важные цитохромы Р450, 3А4
и 2D6. В мозге такая активность показана для галоперидола. Метаболические
пути аминазина включают реакции С-гидроксилирования, N-деметилирования,
N-окисления, S-окисления [1]. Галоперидол в организме трансформируется
тремя путями: путем N-деметилирования, путем C-гидроксилирования и пиридин-зависимом путем [2].
Оценка клинически значимого взаимодействия становится все более необходимой в связи с использованием коктейлей лекарственных препаратов в лечении психических заболеваний. Воссоздание с помощью вивальной модели рутинной медикаментозной терапии пациентов с диагнозом F1-F9 «шизофрения»
246
А.Н. ФАТТАХОВА, А.Г. ИКСАНОВА
позволяет выявить влияние лекарственной смеси на метаболическую активность печени и мозга.
Таким образом, целью данной работы является характеристика особенностей метаболизма смеси психотропных препаратов в печени и мозге мышей в
зависимости от дозы каждого лекарства.
Методика
В эксперименте использовались белые беспородные мыши (весом 25 г, n =
= 24). Мыши содержались согласно «Правилам содержания животных» [3]
в пластиковых вентилируемых боксах, на подстилке из опилок, при постоянных температуры (25 °C) и влажности, в нормальном световом режиме и свободном доступе к пище и воде. Мышам предоставлялся зерновой корм, яблоки
и морковь. Все животные, за исключением группы, получавшей карбамазепин с
водой (группа D), пили водопроводную нефильтрованную воду. Препараты
вводили внутримышечно в виде водных растворов.
В опытах использовали аминазин [(2-хлор-10-(3-диметиламинопропил) –
фенотиазина гидрохлорид)] (ЗАО «Брынцалов-А»), галоперидол [(4-(пара-хлорфенил)-1-[3'-пара-фторбензоил)-пропил]-пиперидинон-4)] (5%-ный раствор, ЗАО
«Брынцалов-А»), карбамазепин [(5Н-дибенз [b,f] азепин-5-карбоксамид)] (ЗАО
«Алси Фарма»), NADH («SIGMA»), NADP («SIGMA»), D-глюкозо-6-фосфата
натриевая соль («SIGMA»), глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа («SIGMA»), реактив Нэша, содержащий 2.0 М ацетата аммония, 0.05 М уксусной кислоты,
0.02 М ацетилацетона («FLUKA»).
Дозы лекарственных препаратов рассчитывались на вес мыши в соответствии с клиническими дозами для человека. Контрольная группа получала плацебо (см. табл. 1).
Табл. 1
Схема острого опыта in vivo на мышах
Аминазин
Галоперидол
K
мкг/
мышь
–
–
А
мкг/
мышь
0.358
1.875
В
мкг/
мышь
0.179
3.75
C
мкг/
мышь
0.358
3.75
Карбамазепин
–
–
–
–
D
мкг/
мышь
0.358
3.75
4 мг/мл
питьевой
воды
E
мкг/
мышь
–
7.5
–
Микросомальные фракции печени и головного мозга получали, как указано
в [4]. С целью установления токсичности использованных субстратов в микросомах определяли содержание белка. Для количественного определения цитохромов Р450 применили метод Омуры и Сато (Omura, Sato) в модификации
Генгериха (Guengerich) [5].
Активность N-деметилирования аминазина определяли в реакционных смесях (РС) объемом 1.0 мл, содержащих 0.45 мкМ NADP, 5 мкМ глюкозо-6-фосфата, 0.5 ед. глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 50 мМ фосфатного буфера pH 7.0,
ОСОБЕННОСТИ CYP-ЗАВИСИМОГО МЕТАБОЛИЗМА…
247
20 мкл микросомальной фракции, согласно методике [4, с. 21–22]. Реакцию начинали добавлением 10 мкM субстрата. Реакционные смеси инкубировали
10 мин при 37 °С, после чего определяли количество формальдегида. Для этого к
1.5 мл РС добавляли 1 мл реактива Нэша и измеряли поглощение при 412 нм.
Количество формальдегида рассчитывали, используя коэффициент экстинкции
Е = 8000 М–1 см–1. Активность выражали в нМ формальдегида/нМ Р450 в мин.
Активность С-гидроксилирования аминазина определяли в РС объемом 3 мл,
содержащих 0.3 мкМ NADH, 50 мМ фосфатного буфера рН 7.0, 10 мкл микросомальной фракции, 0.5 мкМ аминазина. Реакцию начинали NADH, измеряя
поглощение при 340 нм в течение 1 мин. Количество NADH рассчитывали, используя коэффициент экстинкции Е = 6.22·106 М–1 см–1. Активность выражали в
нМ NADH/ нМ Р450 в мин.
Результаты
Анализ концентраций белка в микросомальных фракциях мышей из опытных и контрольной групп показал, что значимых различий между исследуемыми группами по критерию Крускала – Уоллиса нет. Согласно критерию Данна,
по уровню содержания белка в мозге значимо (p < 0.05) отличалась группа А
по сравнению с контрольной группой, в печени группа Е.
Статистически значимых различий (p < 0.05) по уровню содержания цитохромов Р450 в микросомах печени в соответствии с критериями Крускала –
Уоллиса и Данна не обнаружилось. В микросомах мозга все варианты опыта
статистически достоверно отличались от контрольной группы (p < 0.05).
Анализ содержания Р450 в микросомах мозга мышей в зависимости от доз
галоперидола и аминазина выявил тот факт, что содержание цитохромов пропорционально возрастало с увеличением дозы галоперидола (рис. 1, а) но не
зависело от дозы аминазина (рис. 1, б). Можно предположить, что при совместном введении галоперидола и аминазина скорость метаболизма галоперидола
будет определять судьбу аминазина.
Для характеристики метаболизма аминазина определяли скорость NADHзависимого С-гидроксилирования аминазина в микросомах печени и мозга мышей в группах К–Е. Методы Крускала – Уоллиса и Данна не выявили статистически значимых различий в активности С-гидроксилирования аминазина в микросомах печени между группами опыта и контрольной группы, что, возможно,
объясняется тем фактом, что аминазин и галоперидол являются субстратами
ферментов мозга [6–8]. В микросомах мозга все варианты опыта достоверно
отличались от контрольной группы (p < 0.05). Снижение активности гидроксилирования аминазина в группах по сравнению с контролем, возможно, объясняется действием галоперидола как специфического ингибитора группы изоферментов семейства CYP2D (2D1-2D5) [9]. В присутствии галоперидола гидроксилирование аминазина снижалось, что привело, вероятно, к его повышенной концентрации в плазме опытных животных. Повышением дозы аминазина
можно объяснить наблюдаемые анатомические и физиологические аномалии
животных – увеличение объема тонкого кишечника и парез. В ходе анализа
полученных результатов мы выявили обратную зависимость между активностью окисления аминазина в мозге и дозой галоперидола (рис. 2).
А.Н. ФАТТАХОВА, А.Г. ИКСАНОВА
5
4
3
2
1
0
K
A
BCD
нмоль/мг белка
0,35
3
нмоль/ мг белка
6
0,4
3,5
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0,3
2,5
Г, мкг/ мышь
нмоль/ мг белка
7
0,25
2
0,2
1,5
0,15
1
0,1
0,5
0,05
0
0
E
K
A
BCD
нмоль/ мг
Г, мкг/кг
Ам, мкг/мышь
б)
а)
аминазин
галоперидол
карбамазепин
Ам, мкг/ мышь
248
К
–
–
–
А
++
+
–
В
+
++
–
С
++
++
–
D
++
++
+
E
–
+
–
6
5
5
4
4
3
3
2
1
2
0
0
1
K
A
BCD
E
Г, мкг/мышь
нмоль NADH/ нмоль Р450*мин
0,4
7
0,35
6
0,3
5
0,25
4
0,2
3
0,15
2
0,1
1
0,05
0
0
-1
K
A
B
Ам, мкг/ мышь
нмоль NADH/ нмоль Р450*мин
а)
аминазин
галоперидол
карбамазепин
нмоль NADH/ нмоль Р450*мин
7
7
6
Ам, мкг/ мышь
доза Г, мкг/ мышь
8
нмоль NADH/нмоль Р450* мин
Рис. 1. Концентрация Р450 в микросомах мозга в зависимости от дозы галоперидола (а)
и аминазина (б); «++» – максимальная доза, «+» – минимальная доза
б)
К
–
–
–
А
++
+
–
В
+
++
–
С
++
++
–
D
++
++
+
E
–
+
–
Рис. 2. NADH-зависимое окисление аминазина в микросомах мозга в зависимости от дозы галоперидола (а) и аминазина (б); «++» – максимальная доза, «+» – минимальная доза
При увеличении дозы галоперидола активность С-гидроксилирования аминазина снижалась. Напротив, скорость N-деметилирования аминазина при увеличении дозы галоперидола возрастала по сравнению с контролем. Критерий
Данна выявил статистически достоверные различия группы В в сравнении с
контрольной (p < 0.05) (рис. 3).
ОСОБЕННОСТИ CYP-ЗАВИСИМОГО МЕТАБОЛИЗМА…
249
4
350
3.5
300
3
250
2.5
200
2
150
1.5
100
1
50
0.5
0
0
K
A
Г, мкг/мышь
Ам, мкг/мышь
аминазин
галоперидол
карбамазепин
К
–
–
–
B
нмоль HCOOH/нмоль Р450
А
++
+
–
В
+
++
–
Рис. 3. Активность N-деметилирования аминазина в микросомах мозга (ось справа) в
зависимости от дозы галоперидола и аминазина (ось слева); «++» – максимальная доза,
«+» – минимальная доза
Таким образом, в присутствии галоперидола метаболизм аминазина сдвигается в сторону образования токсичных N-деметилированных продуктов на
фоне увеличения реальной дозы аминазина.
Summary
A.N. Fattakhova, A.G. Iksanova. CYP-Dependent Metabolism of Neuroleptics Cocktail
in Mouse Brain and Liver.
The cytochrome P450 concentrations in brain microsomes of mouse treated with coctail
containing different doses of haloperidole and chlorpromazine were shown to proportionally
increase with haloperidole dose enhancing, but did not depend on chlorpromazine dose increasing. In mouse brain microsomes, the chlorpromazine C-hydroxylation rate decreased and
N-demetylation rate increased by haloperidole dose increasing in coctail. We proposed that
by presence of haloperidole, the chlorpromazine was metabolised predominantly via N-demetylation to form the toxic metabolites with chlorpromazine real dose increasing.
Key words: neuroleptics, metabolism, cytochrome Р450, mouse, drug interaction.
Литература
1.
2.
3.
Kazuyoshi Y., Kobayashi K., Tsumuji M. et al. Identification of human cytochrome P450
isoforms involved in the 7-hydroxylation of chlorpromazine by human liver microsomes //
Life Sci. – 2000. – V. 67, No 2. – P. 175–184.
Boehme C.L., Strobel H.W. High-performance liquid chromatographic methods for the
analysis of haloperidol and chlorpromazine metabolism in vitro by purified cytochrome
P450 isoforms // J. Chromatogr. B. – 1998. – V. 718, No 3. – P. 259–266.
Питомник лабораторных животных «Пущино». – Пущино: ФИБХ РАН, 2006. – 5 с.
250
4.
5.
6.
7.
8.
9.
А.Н. ФАТТАХОВА, А.Г. ИКСАНОВА
Фаттахова А.Н. Методы молекулярной фармакологии. – Казань: Изд-во Казан. унта, 2003. – 30 с.
Guengerich F.Р. Analysis and characterization of enzymes // Hayes A.W. (еd.) Principles and Methods of Toxicology. – N. Y.: Raven Press, 1998. – P. 777–814.
Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств: Ежегод. сб. / Гл.
ред. Г.Л. Вышковский. – М.: ООО «РЛС-2004», 2004. – 1503 с.
Abdulla D, Renton W. Adrenergic receptor modulation of the LPS-mediateddepression in
CYP1A activity in astrocytes // Biochem. Pharmacol. – 2005. – V. 69, No 8. – P. 741–
750.
Kalow W., Tyndale R.F. Debrisoquine/sparteine monooxygenase and other P450s in
brain // Kalow W. (ed.) Pharmacogenetics of Drug Metabolism. – N. Y.: Pergamon
Press, 1992. – P. 649–656.
Daniel W.A., Haduch A., Wójcikowski J. Inhibition of cytochrome P450 enzymes participating in p-nitrophenol hydroxylation by drugs known as CYP2E1 inhibitors // ChemicoBiological Interactions. – 2004. – V. 147, No 4. – P. 331–340.
Поступила в редакцию
10.10.07
Фаттахова Альфия Нурлимановна – кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии Казанского государственного университета.
E-mail: afattakh@rambler.ru
Иксанова Альфия Габдулахатовна – студент кафедры биохимии Казанского государственного университета.