"Онкогематология" 2011 № 2 в формате PDF

ISSN 1818-8346
ОНКО
Г Е М А ТО Л О Г И Я
Н А У Ч Н О - П Р А К Т И Ч Е С К И Й
Е Ж Е К В А Р Т А Л Ь Н Ы Й
Р Е Ц Е Н З И Р У Е М Ы Й
Ж У Р Н А Л
Возможности лечения
резистентного хронического
лимфолейкоза
Гонадотоксичность терапии
лимфомы Ходжкина
Материалы VII Российского
симпозиума «Биологические основы
терапии онкологических
и гематологических
заболеваний»
2
2011
Журнал включен в Перечень ведущих рецензируемых научных
журналов, в которых публикуются основные научные результаты
диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
проф., д.м.н. Е.В. Самочатова
Заместители главного редактора
д.м.н. В.В. Птушкин,
проф., д.м.н. Б.В. Афанасьев
Ответственный секретарь
к.м.н. Ю.В. Румянцева
РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ
проф., д.м.н. О.В. Алейникова (Минск)
проф., д.м.н. А.К. Голенков (Москва)
проф., д.м.н. А.И. Карачунский (Москва)
д.м.н. Е.Н. Паровичникова (Москва)
проф., д.м.н. Ю.А. Криволапов (С.-Петербург)
доц., д.м.н. М.Л. Минков (Австрия)
д.м.н. Н.В. Мякова (Москва)
к.м.н. Е.А. Никитин (Москва)
проф., д.м.н. О.А. Рукавицын (Москва)
проф., д.м.н. С.А. Румянцев (Москва)
д.м.н. Г.И. Сидорович (Москва)
к.м.н. Л.Г. Фечина (Екатеринбург)
д.м.н. А.Л. Усс (Минск)
РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ
проф., д.м.н. Е.А. Лукина (Москва)
чл.-корр. РАМН И.В. Поддубная (Москва)
чл.-корр. РАМН А.Г. Румянцев (Москва)
к.м.н. В.А. Россиев (Самара)
проф., д.м.н. А.Г. Талалаев (Москва)
Адрес редакции:
Москва, Каширское шоссе, д. 24,
стр. 15, НИИ канцерогенеза, 3-й этаж.
Тел./факс: +7 (499) 929-96-19
www.abvpress.ru
e-mail: abv@abvpress.ru
Заведующая редакцией Т.В. Клюковкина
Корректор В.В. Калинина
Дизайн Е.В. Степанова
Верстка А.Р. Комлев
Служба подписки и распространения
В.Ю. Тимохина, +7 (499) 929-96-19
e-mail: baza@abvpress.ru
Служба рекламы
В.А. Клюковкин, +7 (499) 929-96-19
e-mail: gm@abvpress.ru
Журнал зарегистрирован
в Федеральной службе по надзору
в сфере связи, информационных технологий
и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)
ПИ № ФС77-36928 от 21 июля 2009 г.
EDITOR-IN-CHIEF
Ye.V. Samochatova, MD, DMSci, Prof.
Deputy Editors
V.V. Ptushkin, MD, DMSci,
B.V. Afanasiev, MD, DMSci, Prof.
Executive Secretary
Yu.V. Rumyantseva, MD, CMSci
EDITORIAL BOARD
O.V. Aleynikova, MD, DMSci, Prof. (Minsk)
A.K. Golenkov, MD, DMSci, Prof. (Moscow)
A.I. Karachunskiy, MD, DMSci, Prof. (Moscow)
Ye.N. Parovichnikova, MD, DMSci (Moscow)
Yu.A. Krivolapov, MD, DMSci, Prof. (St.-Petersburg)
M.L. Minkov, MD, DMSci (Austria)
N.V. Myakova, MD, DMSci (Moscow)
Ye.A. Nikitin, MD, CMSci (Moscow)
O.A. Rukavitsyn, MD, DMSci, Prof. (Moscow)
S.A. Rumyantsev, MD, DMSci, Prof. (Moscow)
G.I. Sidorovich, MD, DMSci (Moscow)
L.G. Fechina, MD, CMSci (Yekaterinburg)
A.L. Uss, MD, DMSci (Minsk)
EDITORIAL COUNCIL
Ye.A. Lukina, MD, DMSci, Prof. (Moscow)
I.V. Poddubnaya, MD, DMSci, Prof., RAMSci Corr. Mem. (Moscow)
A.G. Rumyantsev, MD, DMSci, Prof., RAMSci Corr. Mem. (Moscow)
V.A. Rossiyev, MD, CMSci (Samara)
A.G. Talalayev, MD, DMSci, Prof. (Moscow)
При полной или частичной перепечатке
материалов ссылка на журнал
«Онкогематология» обязательна.
Редакция не несет ответственности
за содержание публикуемых
рекламных материалов.
В статьях представлена точка
зрения авторов, которая может
не совпадать с мнением редакции.
ISSN 1818-8346
Онкогематология. 2011. № 2. 1–60
© ООО «ИД «АБВ-пресс», 2011
Подписной индекс в каталоге
«Пресса России» — 42167
Отпечатано в типографии
ООО «Графика»
Тираж 3000 экз.
2
2011
СОДЕРЖАНИЕ
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
Е.В. Катаева, А.К. Голенков, Е.В. Трифонова, Г.А. Дудина, Т.А. Митина, Л.Л. Высоцкая,
Т.Д. Луцкая, И.В. Буравцова, Р.В. Горенков, Ю.Ю. Чуксина, В.В. Яздовский
Лечение резистентных больных хроническим лимфолейкозом программами,
включающими алемтузумаб в виде монотерапии или в сочетании с флударабином . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Р.А. Голубенко, Г.Б. Громов, В.И. Вишневский
Опыт применения ритуксимаба при рецидивах неходжкинских лимфом
у больных пожилого возраста в Орловской области . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
А.А. Винокуров, С.Р. Варфоломеева, Д.И. Тарусин
Гонадотоксичность терапии лимфомы Ходжкина у подростков и молодых мужчин:
актуальность проблемы и пути решения (обзор литературы) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Т.Т. Валиев, Л.А. Махонова, А.М. Ковригина, Е.Н. Шолохова,
Н.Н. Тупицын, И.Н. Серебрякова, Г.Л. Менткевич
Случай врожденного лангергансоклеточного гистиоцитоза у ребенка раннего возраста . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ
А.В. Шишкин, Н.Г. Овчинина, С.С. Бессмельцев
Новый подход к определению коэкспрессии антигенов клеток при проведении анализа
с использованием иммунологического биочипа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
Материалы VII Российского симпозиума «Биологические основы терапии онкологических
и гематологических заболеваний», Москва, 1–4 июня 2011 г. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
От редакции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
ПРЕСС-РЕЛИЗ
Знать и применять: возможности хелаторной терапии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
CONTENTS
HEMATOLOGIC MALIGNANCIES: DIAGNOSIS, TREATMENT, SUPPORTIVE CARE
E.V. Kataeva, A.K. Golenkov, E.V. Trifonova, G.A. Dudina, T.A. Mitina, L.L. Vysotskaya,
T.D. Lutskaya, I.V. Buravtsova, R.V. Gorenkov, Yu.Yu. Chuksina, V.V. Yazdovskiy
Treatment of patients with refractory chronic lymphocytic leukemia with alemtuzumab,
alone or in combination with fludarabine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
R.A. Golubenko, G.B. Gromov, V.I. Vishnevskiy
Experience of using rituximab for recurrent non-Hodgkin lymphoma in elderly patients of the Orel region . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
A.A. Vinokurov, S.R. Varfolomeeva, D.I. Tarusin
Gonadal toxicity of Hodgkin lymphoma treatment in adolescents and young males:
issue relevance and ways of solve (literature review) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
T.T. Valiev, L.A. Makhonova, A.M. Kovrigina, E.N. Sholokhova,
N.N. Tupitsyn, I.N. Serebryakova, G.L. Mentkevich
Case of congenital Langerhans cells histiocytosis in an infant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
BASIC RESEARCH
A.V. Shishkin, N.G. Ovchinina, S.S. Bessmeltsev
Novel approach for detection of cell antigen coexpression using immunological biochip . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
CONFERENCES, SYMPOSIUMS, MEETINGS
Proceedings of the VII Symposium «Biological bases for the therapy of oncological and hematological diseases»,
Moscow, June 1–4, 2011 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
From edition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
PRESS RELEASE
Know and use: chelation therapy possibilities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
2
’2011
4
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
Лечение резистентных больных хроническим
лимфолейкозом программами, включающими алемтузумаб
в виде монотерапии или в сочетании с флударабином
Е.В. Катаева, А.К. Голенков, Е.В. Трифонова, Г.А. Дудина, Т.А. Митина, Л.Л. Высоцкая,
Т.Д. Луцкая, И.В. Буравцова, Р.В. Горенков, Ю.Ю. Чуксина, В.В. Яздовский
ГУ Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского, Москва
Контакты: Елена Васильевна Катаева e.kataeva2010@yandex.ru
В настоящем исследовании изучены непосредственные и отдаленные результаты лечения 14 резистентных больных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) программами, включающими алемтузумаб в виде монотерапии и в сочетании с флударабином.
Ключевые слова: хронический лимфолейкоз, резистентные больные, алемтузумаб, флударабин
Treatment of patients with refractory chronic lymphocytic leukemia with alemtuzumab,
alone or in combination with fludarabine
E.V. Kataeva, A.K. Golenkov, E.V. Trifonova, G.A. Dudina, T.A. Mitina, L.L. Vysotskaya, T.D. Lutskaya, I.V. Buravtsova,
R.V. Gorenkov, Yu.Yu. Chuksina, V.V. Yazdovskiy
M.F. Vladimirsky Moscow Regional Research Clinical Institute, Moscow
In present study the immediate and long-term therapy results of 14 patients with refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL) are
analyzed. Treatment program included alemtuzumab alone or in combination with fludarabine.
Key words: chronic lymphocytic leukemia, resistant patients, alemtuzumab, fludarabine
Введение
Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) представляет
собой неуклонно прогрессирующее заболевание,
особенностью которого является накопление опухолевых лимфоцитов в костном мозге, крови и других
органах. Современные программы лечения ХЛЛ
включают в себя алкилирующие агенты, аналоги
пурина, моноклональные антитела и комбинированную химио- и иммунотерапию. Указанные типы лечения характеризуются различной клинической эффективностью. Так, флударабин (Ф), применяемый
в качестве первой линии терапии у больных ХЛЛ, дает 63 % объективных ответов (ОО), из них 20 % полных ремиссий (ПР). При сравнении его действия
с хлорамбуцилом (Хлб) выявлено, что Хлб дает 37 %
ОО и 4 % ПР [1]. Изучение эффективности Ф по сравнению с программами СНОР, САР также показало
лучший ответ при его использовании, но при этом не
было увеличения общей выживаемости больных [2].
Комбинация Ф и циклофосфамида (Ц) — ФЦ (FC)
оказалась эффективней монотерапии Ф, при ее использовании было достигнуто 38 % ПР против 15 %
[3]. Добавление ритуксимаба (Р) к комбинации ФЦ
в качестве первой линии терапии увеличило число
ПР с 23 % до 44 %, а число ОО — с 85 % до 92 % [4].
Использование алемтузумаба (А) — Кэмпаса, являющегося рекомбинантным гуманизированным анти-
телом против антигена CD52, в программах монотерапии первой линии ХЛЛ показало его высокую эффективность. По-видимому, это связано с тем, что CD52
в большом количестве (более 500 тыс. антигенов) представлены на поверхности опухолевых клеток ХЛЛ.
Полный ответ среди первичных больных ХЛЛ был достигнут у 24 %, а ОО — у 83% больных [5]. Результаты
клинических исследований показали, что в настоящее
время имеется широкий спектр противоопухолевых
препаратов, которые применяются для лечения ХЛЛ.
Очевидно, что классические алкилирующие препараты менее эффективны, чем аналоги пурина или моноклональные антитела. Более эффективной является
комбинация ФЦ. Усиление клинического эффекта
происходит при добавлении к этой комбинации ритуксимаба — ФЦР (FCR). Однако при выборе терапии
в конкретных клинических случаях следует учитывать
не только противоопухолевую эффективность препаратов, но и профиль их токсичности, особенности течения болезни, коморбидность и другие факторы.
В этих случаях оптимальными могут быть также программы на основе классических алкилирующих
препаратов. В одной из первых работ, касающихся клинического применения А при ХЛЛ, была показана его
эффективность в комбинации с Ф [6]. У рефрактерных
больных ХЛЛ комбинация АФ была эффективна в 83 %
случаев, среди которых ПР была достигнута в 30 % [7].
Материалы и методы
В данное исследование было включено 14 больных, резистентных к проводимой ранее химиотерапии (ХТ): 7 мужчин и 7 женщин. Стадию болезни
определяли по системе Rai. Диагноз подтвержден
цитологическим исследованием костного мозга.
При проведении иммунофенотипирования периферической крови с широкой панелью моноклональных антител выявлена экспрессия СD5+/CD23+/
CD19+/CD20+. Также оценивался уровень экспрессии прогностического антигена СD38+, повышение
этого показателя > 20 % считалось позитивным
и указывало на неблагоприятный прогноз.
Определение делеции короткого плеча 17-й хромосомы (del(17p)) проводилось FISH-методом у 9
больных. Для уточнения зон поражения лимфатических узлов применялись методы лучевой диагностики (рентгенография, ультразвуковое исследование,
компьютерная томография).
В монорежиме А получали 5 (35,7 %) больных после предварительной эскалации дозы 3–10–30 мг
п/к по 30 мг 3 раза в нед в течение 2–16 нед. Двум
больным терапия А продолжалась от 2 до 4 нед, затем
лечение было прекращено в связи с прогрессией заболевания. У 3 пациентов длительность иммунотерапии составила 10, 13 и 19 нед соответственно.
Курс АФ проведен 9 больным (64,3 %). После
предварительной эскалации дозы А назначали по 30
мг 3 дня п/к, Ф — по 25 мг/м2 3 дня внутрь. Шести пациентам было проведено 4 курса, 3 больным — от 5
до 8 курсов. Межкурсовой интервал составил 28
дней. Всем больным проводилось исследование сыворотки крови на цитомегаловирусную инфекцию
(ЦМВ) методом полимеразной цепной реакции
(ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА) до начала лечения и каждые 2 нед при монотерапии А,
перед каждым курсом АФ и при возникновении лихорадки. Также проводилась профилактика пневмоцистной пневмонии бисептолом 960 мг/сутки и ацикловиром 1200 мг/сутки.
Эффективность лечения оценивали по обновленным международным критериям 2008 г. [8] как
ПР, частичную ремиссию (ЧР), стабилизацию (СБ)
и прогрессирование заболевания (ПБ).
Расчет показателей общей выживаемости (ОВ)
проводился с помощью метода Каплана–Майера.
Результаты
Под нашим наблюдением находилось 14 больных
(табл. 1) в возрасте от 46 до 74 лет, средний возраст составил 60,6 года, из них 5 пациентов были старше 65
лет (35,7 %). У большей части больных — 9 (64,3 %) —
была II стадия заболевания, III стадия — у 1 (7 %), IV
стадия — у 4 (28,6 %) пациентов. Делеция 17р выявлена у 5 из 9 обследованных пациентов (56 %), а высокий уровень экспрессии CD38+ определялся у 8 из 12
(67 %) больных.
Характеристика предшествующей терапии резистентных больных представлена в табл. 2, из которой
видно, что 3 пациента получали Хлб, 1 больной —
преднизолон, монотерапия Ф проводилась 2 больным, курсы СОР — 3 больным, СНОР — 1, RFC — 2,
Таблица 1. Характеристика резистентных больных ХЛЛ (n = 14)
Возраст
n
М:Ж
Стадия по Rai
del(17р)
(n = 9)
CD38+ позитивные пациенты
(n = 12)
1:1
II стадия – 9 (64,3 %) больных
III стадия – 1 (7 %) больной
IV стадия – 4 (28,6 %) больных
5/9 (56 %)
8/12
(67 %)
46–74 (Ме 60,6) года
14
Из них > 65 – 35,7 %
Таблица 2. Предшествующая терапия резистентных больных ХЛЛ (n = 14)
Препараты
и комбинации
Число больных,
получивших данный вид ХТ
Хлорамбуцил
3
Преднизолон
1
СОР
3
СНОР
1
FC
12
F
2
RFC
2
R-CHOP
1
Время предлеченности
(мес)
Количество
курсов
Количество
линий ХТ
3–37 (11)
3–14 (7)
1–3 (1,93)
’2011
Таким образом, проведенный анализ показал,
что наибольшим клиническим эффектом при лечении ХЛЛ обладает комбинация ФЦР. Пока еще нет
достаточных оснований определить точное место А
среди других химиотерапевтических программ.
В связи с этим целью настоящей работы было изучение клинической эффективности А в монорежиме и в комбинации с Ф (АФ или FluCam) при резистентном и рецидивном ХЛЛ.
5
2
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
2
’2011
6
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
R-CHOP — 1 пациенту. Большей части больных — 12
(86 %) — на предыдущем этапе проводилась терапия
программой FC. Медиана (Ме) предлеченности составила 11 (3–37) мес. В среднем было проведено 7
(3–14) курсов. Количество предшествующих линий
ХТ составило от 1 до 3 (1,93).
Как видно из табл. 3, при суммарной оценке эффективности лечения программами, включающими
А в виде монотерапии и АФ, было установлено, что
общее число ответивших больных было 10 (71,4 %).
При этом 3 (21,4 %) больных достигли ПР, 7 больных
(50 %) — ЧР. В группе ПР 2 из 3 больных проведено
FISH-исследование, которое в обоих случаях выявило del(17p), а 1 больной из 3 был СD38-позитивный.
Одному больному проведена монотерапия Кэмпасом, двум другим было проведено 5 и 8 курсов АФ.
В группе ЧР из 7 пациентов 4 проведен FISH-анализ,
который выявил del(17p) у 2 больных, а 4 из 6 были
CD38-позитивны. Двум больным проводилась монотерапия А в течение 10 и 16 нед, 5 пациентам проведено по 5 курсов АФ.
Таблица 3. Эффективность терапии А и АФ у резистентных
больных ХЛЛ
Ответ на ХТ
ПР
ЧР
СБ
ПБ
n = 14
3/21,4 %
7/50 %
2/14,3 %
2/14,3 %
del(17p)
2/2
2/4
0/2
1/1
CD38+
1/3
4/6
2/2
1/1
Таким образом, среди ответивших на терапию
у 67 % (4/6) обследованных была выявлена del(17p)
и 56 % (5/9) были СD38-позитивны. У 2 (14,3 %)
больных наблюдалась СБ, ни у одного из обследованных методом FISH del(17p) не была определена,
оба были СD38-позитивны. У 2 (14,3 %) пациентов
быстро наступила прогрессия заболевания (через 2
и 4 нед монотерапии Кэмпасом). При этом FISHисследование, проведенное у 1 из 2 пациентов, выявило del(17p); уровень CD38+ был высоким у одного
из 2 обследованных.
Следует отметить, что лечение А и АФ сопровождалось выраженными нежелательными явлениями
(табл. 4). Гематологическая токсичность III и IV степени выявлена у 8 из 14 (57 %) больных. Развитие
нейтропении наблюдалось у 4 (28,6 %), тромбоцитопении у 2 (14,3 %), анемии у 2 (14,3%) пациентов.
Реактивация ЦМВ имела место у одного больного
и была купирована назначением ганцикловира,
аутоиммунная гемолитическая анемия (АИГА) наблюдалась у 2 (14,3 %) пациентов в середине лечения.
Иммунотерапия осложнилась пневмонией у 4 (28,6 %)
больных, у 1 (7 %) пациента — грибковой. Кожные
реакции наблюдались у 2 (14,3 %) больных и не потребовали никаких назначений. Выявленные у 1
Таблица 4. Развитие нежелательных явлений при лечении А и АФ
больных ХЛЛ (n=14)
Нежелательное явление
N (%)
Нейтропения*
4 (28,6)
Тромбоцитопения*
2 (14,3)
Анемия*
2 (14,3)
АИГА
2 (14,3)
Реактивация ЦМВ
1 (7)
Пневмония:
4 ( 28,6)
в том числе грибковая
1 (7)
Диспепсические явления
1 (7)
Кожные реакции
2 (14,3)
*Гематологическая токсичность III–IV степени.
(7 %) пациента диспепсические явления были купированы назначением ферментных препаратов и Н2гистаминоблокаторов.
При анализе данных общей выживаемости (рис.)
у резистентных больных ХЛЛ установлено, что Ме
составила 72 мес.
Обсуждение
Таким образом, проведенное исследование показало, что А в режиме монотерапии или в комбинации
с Ф — программа АФ — обладает высокой противоопухолевой активностью у больных с резистентными
и рецидивными формами ХЛЛ. Следует отметить,
что объективный противоопухолевый ответ (ПР
и ЧР) был получен у 71,4 % больных, включая ПР
в 21,4 % случаев. При изучении молекулярнобиологических и иммунофенотипических рисков
неблагоприятного прогноза установлено, что среди
больных с объективным противоопухолевым ответом del(17p) выявлена в 67 % случаев, а повышенная
экспрессия CD38+ определена у 56 % больных. Это
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
20
40
60
80
100
120
N = 14; Ме = 72 мес
Общая выживаемость больных ХЛЛ на терапии А и АФ (n = 14)
ными инфузиями человеческого иммуноглобулина.
Проведенное исследование делает оправданным назначение с профилактической целью в периоде лечения и в последующие 4 мес после его окончания ацикловира и бисептола.
Анализ отдаленных результатов оценивали по
ОВ. Среди наблюдавшихся 14 больных за 3-летний
период живы 8 человек, 6 больных погибло: 2 пациента, находясь в ремиссии ХЛЛ, погибли от второй
опухоли; 2 — от прогрессии заболевания; у 1 пациента развилась фатальная грибковая пневмония;
1 больная умерла от сердечной недостаточности. Ме
выживаемости составила 72 мес от начала лечения,
включая предшествующую терапию. Так как Ме
предлеченности была 11 мес, Ме ОВ на терапии А
и АФ составила 61 мес. Ме наблюдения за больными
равна 18 мес.
Полученные нами результаты являются существенным прогрессом в лечении резистентных форм
ХЛЛ с использованием программ, включающих
алемтузумаб в виде монотерапии или в сочетании
с флударабином.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Rai K.R., Peterson B.L., Appelbaum F.R.
et al. Fludarabine compared with chlorambucil
as primary therapy for chronic lymphocytic
leukemia. N Engl J Med 2000;343:1750–7.
2. Leporrior M., Chevret S., Cazin B. et al.
Randomized comparison of fludarabin, CAP
and CHOP in 938 previously untreatedstage B
and C chronic lymphocytic leukemia patients.
Blood 2001;98(23):2319–25.
3. Catovsky D., Richard S., Matutes E. et al.
Assesment of fludarabin plus cyclophosphamide
for patients with chronic lymphocytic leukemia.
Lancet 2007;270:230–9.
4. Hallek M., Fingerle-Rowson G., Fink A.M.
et al. Immunochemotherapy with
fludarabine (F), cyclophosphamide (C) and
rituximab (R) (FCR) versus fludarabine and
cyclophosphamide (FC) impruves responses
rates and progression-freesurvival (PFS) of
previously untreated patients with advanced
chronic lymphocytic leukemia. Blood
2008;112:325.
5. Hillmen P., Skotnicki A.B., Robak T. et al.
Alemtuzumab compared with chlorambucil
as fist-line therapy for chronic lymphocytic
leukemia. J Clin Oncol 2007;2:5616–23.
6. Kennedy B., Raustron A., Carter C. et al.
Campath-1H and fludarabine in combination
are highly active in refractory chronic
lymphocytic leukemia. Blood 2002;99:2245–7.
7. Elter T., Borchmann P., Schultz H.
et al. Fludarabine in combination with
alemtuzumab is effective and feasible
in patients with relapsed or refractory
B-cell chronic lymphocytic leukemia:
result of a phase II trial. J Clin Oncol
2005;23:7024–31.
8. Hallek M., Cheson B.D., Catovsky D.
et al. Guidelines for the diagnosis and
treatment of chronic lymphocytic leukemia:
a report from the Internaional Workshop
on Chronic Lymphocytic Leukemia
updating the National Cancer InstituteWorking Group 1996 guidelines. Blood
2008;111:5446–56.
’2011
свидетельствует о том, что программы монотерапии
А и АФ преодолевают резистентность, обусловленную этими серьезными негативными факторами
прогноза. Характеризуя резистентность у 14 представленных больных ХЛЛ, следует подчеркнуть, что
ее тяжесть определяется не только медико-биологическими и иммунофенотипическими характеристиками, но и отсутствием ответа на адекватную
предшествующую терапию, в основном ФЦ.
Проведенный анализ осложнений, возникших
в процессе лечения, показал, что АФ и А обладают серьезным токсическим воздействием на кроветворную
систему. Об этом свидетельствует высокий процент
(57 %) миелотоксических осложнений III–IV степени,
требующих в ряде случаев замещения компонентами
крови и введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Возникновение пневмоний у 28,6 %
больных в процессе лечения А и АФ свидетельствует
о выраженном иммуносупрессивном действии этих
программ. Лечение указанных осложнений потребовало применения комбинированной антибактериальной
и противогрибковой терапии в сочетании с внутривен-
7
2
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
2
’2011
8
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
Опыт применения ритуксимаба при рецидивах
неходжкинских лимфом у больных пожилого возраста
в Орловской области
Р.А. Голубенко1,2, Г.Б. Громов3, В.И. Вишневский1
1
Кафедра внутренних болезней медицинского института ГОУ ВПО Орловский государственный университет;
2
Орловская областная клиническая больница;
3
Кафедра хирургии медицинского института ГОУ ВПО Орловский государственный университет
Контакты: Рамиля Ахметовна Голубенко golubr@yandex.ru
В статье приведен анализ результатов лечения 10 больных (6 мужчин и 4 женщины), страдающих неходжкинской лимфомой.
Диагноз подтвержден в результате гистологического исследования с иммуногистохимией. Средний возраст пациентов составил 61,1 года.
Всем больным было проведено от 6 до 8 курсов полихимиотерапии и по 8 введений ритуксимаба, ни один больной не был снят
с лечения. Показано, что использование ритуксимаба в режиме с полихимиотерапией имело высокую результативность и было
успешным у 7 (70 %) из 10 больных. Основным ответом на терапию была высокая частота полных ремиссий — 40 %, незначительно превышающая частоту частичных ремиссий — 30 %. Ритуксимаб был успешно использован в лечении пожилых пациентов без дополнительной токсичности, что делает возможным применение препарата в амбулаторных условиях.
Ключевые слова: неходжкинская лимфома, рецидив, ритуксимаб, пожилой возраст, полихимиотерапия
Experience of using rituximab for recurrent non-Hodgkin lymphoma in elderly patients of the Orel region
R.A. Golubenko1,2, G.B. Gromov3, V.I. Vishnevskiy1
Internal medicine department, Medical Institute of Orel State University;
2
Orel regional hospital; 3Surgery department, Medical Institute of Orel State University
1
This article summarizes the results of 10 patients (6 men and 4 women) with recurrent non-Hodgkin lymphoma treating with using of
rituximab. The diagnosis was confirmed by histological examination with immunohistochemistry. The average patient age was 61.1 years.
All patients received from 6 to 8 chemotherapy courses and 8 rituximab injections, no one patient was withdrawn from therapy. Rituximab
treatment in combination with chemotherapy was successful in 7 (70 %) of 10 patients. The major therapy response was a high frequency
of CR — 40 %, slightly exceeding the rate of PR — 30 %. Rituximab has been used successfully in the treatment of elderly patients without
additional toxicity, which makes it possible to use the drug on an outpatient basis.
Key words: non-Hodgkin’s lymphoma, relapse, rituximab, elderly, chemotherapy
В настоящее время сохраняется тенденция к увеличению заболеваемости злокачественными новообразованиями. Не последнее место в структуре онкологической
заболеваемости занимают опухоли кроветворной системы, в их числе неходжкинские лимфомы (НХЛ). Ежегодно в России данной патологией заболевают более 10 тыс.
человек. Наиболее распространенной среди всех НХЛ является крупноклеточная лимфома (31 %), далее следует
фолликулярная лимфома (22 %), остальные типы лимфом встречаются с частотой менее 10 % [1].
НХЛ являются гетерогенной группой лимфопролиферативных заболеваний, отличающихся по
морфологическим вариантам, биологическим характеристикам (цитогенетике, экспрессии генов и онкопротеинов), иммунофенотипу, степени агрессивности и другим особенностям клинического течения.
Выбор тактики терапии зависит от иммунофенотипа
(В-клеточный или Т-клеточный), морфологического варианта, агрессивности течения (индолентные
и агрессивные НХЛ), степени распространенности
опухоли (стадия), наличия или отсутствия интоксикации (А и В симптомы), индивидуального прогноза, определяемого как степень риска по так называемому международному прогностическому индексу
(IPI). Для выбора тактики лечения определяющим
служит иммунофенотип, характер и течение НХЛ —
индолентное, агрессивное и высокоагрессивное. Современная классификация лимфом, принятая ВОЗ
[2], основывается не только на морфологических
критериях, но и учитывает, кроме иммунофенотипа,
молекулярно-биологические и клинические особенности НХЛ.
Эта используемая в настоящее время повсеместно классификация в подробностях приведена в руководствах и других материалах [3, 4]. Таким образом,
постановку диагноза опухоли лимфоидной ткани
следует основывать на гистологическом и иммуногистохимическом исследовании биоптата, полученно-
ванной ХТ с препаратами, обычно не используемыми в первой линии, — митоксантроном, флударабином, этопозидом, цитарабином и аспарагиназой.
Подобные схемы или высокодозная ХТ показаны
при повторных быстровозникающих рецидивах, для
которых характерно постоянное снижение частоты
и полноты ответа. В поздних случаях при удовлетворительных результатах — через 1 год и более после
окончания первичного лечения — можно повторить
использованную программу, как при индолентных,
так и при агрессивных лимфомах [6].
Рекомендации ESMO 2009 г. [7] предусматривают для больных с рецидивом В-крупноклеточной
лимфомы после антрациклинсодержащих программ
1-й линии проведение любого из химиотерапевтических режимов «спасения» [5] с последующей высокодозной ХТ и поддержкой кроветворения
стволовыми периферическими гемопоэтическими
клетками [2, 5].
Достижение лишь частичной ремиссии (ЧР)
в результате ХТ 1-й линии или отсутствие положительной динамики после первых курсов стандартной
терапии, в особенности при агрессивных НХЛ, высокочувствительных к цитостатикам, является признаком высокого риска резистентного течения
опухоли и указывает на необходимость изменения
программы — либо на адекватные для агрессивных
лимфом (при индолентных формах), либо на упомянутые выше альтернативные программы, в том числе
высокодозные (для агрессивных НХЛ). Первичная
резистентность к лечению, выражающаяся в прогрессировании процесса уже в период его проведения или в отсутствии ответа, требует перехода на альтернативные, в том числе высокодозные режимы ХТ,
конкретные методы которой, в том числе с трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток,
подробно и в самых разных аспектах рассматриваются в специальных руководствах [2]. Такая тактика
возможна у пациентов молодого возраста; у лиц пожилого и старческого возраста, ввиду значительно
большей выраженности у них токсических эффектов
стандартной ХТ и менее благоприятного прогноза,
вопросы терапии рецидивов остаются очень актуальными. В результате этого интерес к возможности использовать эффективную противоопухолевую терапию без увеличения токсичности у данной категории
пациентов чрезвычайно важен. Решение этой задачи
стало возможным благодаря внедрению в практику
принципиально новых препаратов таргетного действия. Для В-клеточных CD20-позитивных НХЛ
это — ритуксимаб. Ритуксимаб представляет собой
химерические анти-СD20 моноклональные антитела, обладающие способностью специфически связываться с трансмембранным антигеном CD20 нормальных и злокачественных В-лимфоцитов,
индуцируя антителозависимую и комплементзависимую цитотоксичность.
’2011
го при инцизионной биопсии лимфатического узла.
Иммуногистохимическое исследование опухолей
лимфоидной ткани является методом выбора при
необходимости дифференциальной диагностики
опухолей с выраженным сходством гистологического
строения [5]. Отмечено, что различные типы лимфом
имеют неодинаковое происхождение и значительно
отличаются по своему клиническому поведению
и прогнозу. На выбор лечения также влияет объем
опухолевых поражений (более 5–10 см по наибольшему диаметру и более 1/3 диаметра грудной клетки — для медиастинальных масс), а также фактически непредсказуемая до проведения начального этапа
лечения первичная или приобретенная рефрактерность к «стандартной» для данного варианта НХЛ
химио- (ХТ) или лучевой терапии.
На прогнозе и, соответственно, принципах выбора терапии сказываются также другие факторы риска, учитываемые в IPI, который был предложен
в 1993 г. [4]. На основании сочетания таких неблагоприятных факторов, как возраст > 60 лет, повышение
ЛДГ > нормы (обычно не менее чем в 2 раза), общий
статус > 1 (2–4) по шкале ECOG, стадия III/IV и число экстранодальных поражений > 1, устанавливаются
4 группы по категориям риска: низкого (0–1 признак), низкого промежуточного (2 признака), высокого промежуточного (3 признака) и высокого (4–5
признаков), определяющие частоту ответа на лечение, безрецидивную и общую 5-летнюю выживаемость [2]. Выбор лечения НХЛ требует многофакторной оценки в каждой отдельной клинической
ситуации, тем не менее составление на основании
накопленного опыта общего алгоритма лечения индолентных и агрессивных НХЛ возможно и должно
быть положено в основу терапевтических подходов.
Несмотря на все успехи и достижения многие вопросы при выборе тактики лечения НХЛ все еще далеки от разрешения. Терапия рецидивов остается
одной из самых сложных проблем, так как рецидивы
развиваются после достижения полной ремиссии
(ПР) в результате адекватного лечения (ХТ) разных
вариантов индолентных, агрессивных и высокоагрессивных НХЛ. При этом продолжительность
безрецидивного периода варьирует от нескольких
месяцев до нескольких лет в зависимости от степени
злокачественности НХЛ и наличия неблагоприятных прогностических факторов, в том числе показателей IPI. К ранним рецидивам, имеющим самое неблагоприятное
течение,
относят
рецидивы,
возникающие в течение 6 мес от окончания лечения.
Для ранних рецидивов при НХЛ низкой степени злокачественности тактика лечения включает как минимум
переход
на
стандартные
режимы,
используемые при агрессивных лимфомах (например, программы СОР или лейкерана, циклофосфана
и др. на СНОР или СНОР-подобные), а при отсутствии ответа — альтернативные курсы комбиниро-
9
2
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
2
’2011
10
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
Более 90 % В-клеточных НХЛ экспрессируют
СD20, который присутствует на нормальных и злокачественных pre-В и зрелых В-клетках, но не обнаружен на гемопоэтических стволовых клетках, proВ-клетках и нормальных плазматических клетках.
Основными и наиболее изученными показаниями
к использованию ритуксимаба являются НХЛ низкой степени злокачественности.
Интересны сведения об использовании ритуксимаба в сочетании с курсом CHOP — R-CHOP.
M. Czuczman показал реальный шанс повышения
эффективности до 100 % (HP — 63%, медиана HP —
20 мес) при использовании схемы R-CHOP в 1-й линии терапии фолликулярной НХЛ с неблагоприятными факторами прогноза [8]. Но еще более впечатляющими являются результаты исследования GELA,
наглядно демонстрирующие, что ритуксимаб перспективен и для агрессивных НХЛ; добавление мабтеры к схеме CHOP (в виде однократного введения
в стандартной дозе 375 мг/м2 при проведении каждого курса) достоверно увеличивало эффективность
лечения НХЛ высокой степени злокачественности
у пожилых больных: сравнение схемы CHOP
и R-CHOP у 328 больных (более половины в возрасте > 70 лет) показало увеличение общей выживаемости до 82 % по сравнению с 66 %, а частоты ПР — до
76 % против 60 %. Расширение терапевтических возможностей не сопровождалось увеличением летальности в группе R-CHOP (5 % по сравнению с 7 %) [8].
В Орловском онкологическом диспансере препарат ритуксимаб применяется с 2003 г. В данное исследование включена группа больных, у которых
развились рецидивы или имели место рефрактерные
формы НХЛ в период с 2008 по февраль 2010 г. В анализ вошли 10 больных (6 мужчин и 4 женщины).
Диагноз НХЛ во всех случаях устанавливали на
основании гистологического исследования биоптата
опухолевой ткани с иммуногистотипированием. Лечение проведено пациентам в возрасте от 51 до 71 года (средний возраст 61,1 года). Длительность заболевания колебалась от 13 мес до 10 лет; cреднее время
до лечения ритуксимабом составило 3 года 1 мес. За
этот период больные неоднократно получали различные виды ХТ в количестве от 1 до 8 (в среднем 3)
курсов. Таким образом, ритуксимаб был использован у больных, многократно леченных стандартной
ХТ (табл. 1). Большинство пациентов (90 %) были
в удовлетворительном состоянии и в соответствии
с IPI отнесены в группу низкого и низкого/промежуточного риска в связи с наличием одновременно не
более 2 неблагоприятных факторов прогноза.
У 9 пациентов на основании морфологических
данных и иммуногистотипирования подтвержден
диагноз фолликулярной лимфомы, у 1 больного была
В-крупноклеточная лимфома. К моменту начала терапии ритуксимабом у 8 из 10 больных процесс был
распространенным и соответствовал III–IV стадии.
Таблица 1. Характеристика больных
Признак
Число больных
Всего
10
Возраст:
младше 60 лет
старше 60 лет
5
5
Пол:
мужской
женский
6
4
IPI
низкий и промежуточный риск
высокий риск
9
1
Стадия
I–II
III–IV
2
8
Экстранодальные проявления
2
Первичная рефрактерность
1 (10 %)
Рецидивы:
ранние
поздние
4
6
Характеристика рецидивов представлена в табл. 2.
Две трети больных (70 %) получили ритуксимаб при
возникновении первого рецидива. По времени возникновения более половины (60 %) составили поздние рецидивы, которые констатированы спустя 6–12
мес (2 случая) или более 12 мес (4 наблюдения). Ранний рецидив был отмечен у 1 больного, в большинстве случаев это является показанием к интенсификации лечения, которая влечет за собой значительное
увеличение токсичности.
Лечение ритуксимабом осуществляли с использованием стандартной премедикации (парацетамол,
антигистаминные препараты). Ритуксимаб вводили
в дозировке 375 мг/м2 в первый день лечения каждого из 8 циклов ХТ (в 7 случаях — флударабин, в 2 —
режим CHOP и в 1 — DHAP). Лечение повторяли
каждые 3 нед. Больные, у которых отмечена IV степень нейтропении или фебрильная нейтропения после какого-либо цикла ХТ, получали гранулоцитарТаблица 2. Характеристика рецидивов
Рецидив
Число больных
Первый
7 (70 %)
Второй
1
Третий
1
Четвертый
1
Ранний – ремиссия < 6 мес
1
Поздний – ремиссия > 6–12 мес
6
Резистентный
2
Всего
10
Результаты
Всем больным было проведено от 6 до 8 курсов
полихимиотерапии и по 8 введений ритуксимаба, ни
один больной не был снят с лечения. Результаты оценены у всех 10 пациентов (табл. 3).
Использование ритуксимаба в режиме с полихимиотерапией имело высокую результативность и было успешным у 7 (70 %) из 10 больных. При этом
основным ответом на терапию была высокая частота
ПР — 40 %, незначительно превышающая частоту
ЧР — 30 % (табл. 3).
Следует акцентировать внимание на том, что достигнутый эффект был стойким: медиана продолжительности ПР составила 21,5 (13–40) мес, а ЧР —
больше года (13 (4–13) мес). Нам удалось достичь
полного эффекта в 1 случае при экстранодальной локализации опухоли (при обширном двустороннем
вовлечении легочной ткани). Наиболее чувствительными к терапии были лимфатические узлы независимо от их расположения.
Прогрессирование было выявлено также в процессе лечения у 2 (20 %) пациентов. Оно проявлялось
в виде продолжающегося роста пораженных лимфатических узлов.
Добавление ритуксимаба к стандартной ХТ не
увеличило ее токсичности. Переносимость препарата была удовлетворительной. Побочные реакции были отмечены у 8 (80 %) пациентов, они развились
Таблица 3. Эффективность лечения рецидивов —
полихимиотерапия + ритуксимаб
Эффективность
Частота, %
Общий эффект
70
ПР
40
ЧР
30
Стабилизация
10
Прогрессирование
20
Длительность ремиссии:
ПР
ЧР
1,5–40 мес + (медиана – 21,5 мес)
1,5–13 мес + (медиана – 13 мес)
у всех больных только в период первого введения
препарата, были преходящими, возникали чаще всего при быстром введении препарата — 100–150 мг/ч,
не требовали отмены лечения и легко купировались
при временном прекращении инфузий с введением
дексаметазона (8–12 мг) в/в, димедрола и анальгина,
что позволяло через 20–30 мин возобновить и закончить введение мабтеры. Инфузии ритуксимаба прекращали при повышении температуры тела, лихорадке, появлении отеков, понижении давления или
в любых других неблагоприятных случаях и возобновляли, когда симптомы были купированы.
Таким образом, лечение ритуксимабом было эффективно, безопасно, легко осуществимо. Считаем
возможным применять препарат в амбулаторной практике. Ритуксимаб эффективен при различных клинических проявлениях и разных морфологических вариантах зрелоклеточных НХЛ. Переносимость препарата
удовлетворительная. Ритуксимаб успешно использовался нами в лечении пожилых пациентов без дополнительной токсичности, что делает возможным использование препарата в амбулаторных условиях.
Препарат также входит в федеральную программу
«7 нозологий», что дополнительно гарантирует обеспеченность ритуксимабом всего курса лечения.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Хансон К.П. , Имянитов Е.Н. Эпидемиология и биология неходжкинских лимфом. Практическая онкология
2004;5(3):163–8.
2. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L.
et al. World Health Organization Classification
of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid
Tissues. Lyon: IARC, 2008.
3. Поддубная И.В. Неходжкинские лимфомы. В кн.: Клиническая гематология: руководство для врачей. Под ред. М.А. Волковой.
М: Медицина, 2001. С. 336–75.
4. Federico M., Bellei M., Marcheselli L. et al.
Follicular lymphoma international prognostic
index 2: a new prognostic index for follicular
lymphoma developed by the international
follicular lymphoma prognostic factor project.
J Clin Oncol 2009;27:4555–62.
5. Мазуров В.И. , Криволапов Ю.А. Классификация лимфом. Морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика
неходжкинских лимфом. Практическая
онкология 2004;5(3):169–75.
6. Cheson B.D., Pfistner B., Juweid M.E. et al.
Revised response criteria for malignant
lymphoma. J Clin Oncol 2007;25:1–8.
7. Клинические рекомендации ESMO по диагностике, лечению и наблюдению при первично диагностированной крупноклеточной неходжкинской лимфоме. В кн.: Минимальные клинические рекомендации Европейского общества медицинской онкологии (ESMO). Ред. русского перевода проф.
С.А. Тюляндин, проф. Н.И. Переводчикова,
к.м.н. Д.А. Носов. М.: РОНЦ
им. Н.Н. Блохина РАМН, 2009. С. 141–50.
8. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний. Под ред. Н.И. Переводчиковой. Москва, 2005.
’2011
ный колониестимулирующий фактор. Если нейтропения IV степени сохранялась на протяжении следующего цикла, дозы циклофосфамида и доксорубицина
сокращали на 50 %. Если перед началом запланированного цикла количество нейтрофилов было ниже
1,5  109/л или уровень тромбоцитов был ниже
100  109/л, цикл откладывали на срок до 2 нед. Дозы
ритуксимаба не снижали и не изменяли. Лечение
также прекращали в тех случаях, когда лимфома прогрессировала или пациент отказывался от продолжения лечения, а также из соображений безопасности,
когда предполагалось развитие побочных реакций.
11
2
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
2
’2011
12
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
Гонадотоксичность терапии лимфомы Ходжкина
у подростков и молодых мужчин: актуальность проблемы
и пути решения (обзор литературы)
А.А. Винокуров1, С.Р. Варфоломеева1, Д.И. Тарусин2
1
ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии
Минздравсоцразвития России, Москва;
2
Научно-практический центр детской и подростковой андрологии Департамента здравоохранения города Москвы
Контакты: Алексей Алексеевич Винокуров a_vinokurov@inbox.ru
В настоящее время лимфома Ходжкина (ЛХ) – одно из наиболее курабельных опухолевых заболеваний, при этом более половины заболевших являются лицами мужского пола в возрасте до 35 лет. Гонадотоксичность служит одним из наиболее частых
отдаленных последствий терапии ЛХ, что ассоциировано со значительным ухудшением качества жизни больных. В настоящей
статье обобщены данные о частоте встречаемости и факторах риска развития гонадотоксичности у лиц мужского пола с ЛХ.
Показано, что проведение химиотерапии с включением алкилирующих препаратов и лучевая терапия могут приводить к развитию гонадотоксичности у значительного числа больных. Рассмотрены современные возможности проведения криоконсервации спермы до начала противоопухолевой терапии.
Ключевые слова: лимфома Ходжкина, алкилирующие препараты, гонадотоксичность, криоконсервация спермы
Gonadal toxicity of Hodgkin lymphoma treatment in adolescents and young males: issue relevance and ways of solve
(literature review)
A.A. Vinokurov1, S.R. Varfolomeeva1, D.I. Tarusin2
Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology;
2
Scientific and Practical Center of Children and Adolescents Andrology Moscow Department of Public Health, Moscow
1
Hodgkin`s Lymphoma (HL) is one of the most curable cancer disease. A half of all patients are young males under 35 years old. Gonadal
toxicity is one of the most frequent late effects of HL therapy and associated with significant decrease in patient’s quality of life. In present
article frequency and risk factors of gonadal toxicity in males with HL were summarized. It was shown that chemotherapy with alkylating
agents and radiotherapy may lead to gonadal toxicity in significant number of patients. Current possibilities of semen cryopreservation before
start of the treatment are discussed.
Key words: Hodgkin lymphoma, alkylate drugs, gonadal toxicity, semen cryopreservation
Лимфома Ходжкина (ЛХ) является одним из наиболее часто возникающих злокачественных заболеваний лимфоидной ткани. В России ежегодно заболевает
около 3,2 тыс. молодых пациентов обоего пола [1].
В странах Европы и США показатель заболеваемости
составляет 4–6 и 2,8 на 100 тыс. населения соответственно [2, 3]. В настоящее время выделяют один возрастной пик заболеваемости ЛХ в возрасте 15–35 лет,
с максимумом показателя заболеваемости в 25 лет 2, 4.
ЛХ занимает особое место в истории онкологии
и гематологии. В 1940-х годах ХХ века общая 5-летняя выживаемость едва достигала 5 % [5]. Ситуация
кардинально изменилась в конце 70-х годов, когда
в клиническую практику стали внедряться новые
цитостатические препараты и ЛХ явилась первым
потенциально излечиваемым онкологическим заболеванием [6]. Создание и внедрение программного
подхода в детской онкологии за последние 20 лет существенно улучшило исходы лечения для детей
и подростков с ЛХ. Оптимизация и стандартизация
химиолучевого лечения, широкое использование
в клинической практике современных методов диагностики, таких как компьютерная томография (КТ)
и позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), позволили повысить 5-летнюю выживаемость у подростков и взрослых с ЛХ до 70–90 %, а также повысить 20-летнюю безрецидивную выживаемость до
60 % [2, 7–9]. Но, несмотря на это лечение, ЛХ продолжает оставаться токсичным и сопровождается
возникновением отсроченных побочных эффектов,
таких как вторые злокачественные новообразования
(ЗН) — лейкозы, неходжкинские лимфомы, солидные опухоли (рак щитовидной железы); дисфункция
половых желез (дисспермии, азооспермии, гипоандрогенемия); кардиотоксические проявления (бессимптомные перикардиты, миокардиты, инфаркты
миокарда); легочная токсичность (острые лучевые
пульмониты, хронические рестриктивные фиброзы); дисфункция щитовидной железы (гипотиреоидизм); нарушения иммунной системы и связанные
тез и секреция которых находятся под контролем гипоталамического гонадотропин-рилизинг гормона
(ГнРГ). Под влиянием ЛГ клетки Лейдига, расположенные между семенными канальцами, синтезируют
и секретируют тестостерон. Тестостерон стимулирует созревание зародышевых клеток в семенных канальцах. ФСГ непосредственно действует на семенные канальцы. В зародышевом эпителии рецепторы
тестостерона и ФСГ присутствуют только в клетках
Сертоли. Поэтому считается, что трофическое влияние тестостерона и ФСГ на сперматогенез осуществляется через соматические клетки Сертоли. Яички
и гипоталамо-гипофизарная система взаимодействуют с помощью стероидных и белковых гормонов. Тестостерон ингибирует секрецию ГнРГ и гонадотропинов (ЛГ и ФСГ). Ингибин В и фоллистатин
избирательно подавляют секрецию ФСГ гипофизом,
тогда как активин стимулирует этот процесс. Помимо влияния на сперматогенез тестостерон играет
важную роль в процессах роста волос, костного метаболизма, формирования мышечной массы и появления вторичных половых признаков, равно как и в деятельности мужских половых органов [15].
Чувствительность клеток Лейдига и клеток Сертоли
к токсическому воздействию различна, это определяется их митотической активностью. Клетки Сертоли активно пролиферируют, поэтому химиопрепараты, проникшие через гемато-тестикулярный барьер, способны
оказывать значительное влияние на клетки Сертоли,
а также на рост и развитие сперматогоний. Обменные
процессы в клетках Лейдига менее интенсивны, это
снижает их восприимчивость к токсическому воздействию и позволяет сохранять жизнеспособность продолжительное время. Принято считать, что клетки
Сертоли организуют процесс сперматогенеза пространственно и функционально, но последние данные указывают на роль зародышевых клеток в регуляции
функции клеток Сертоли. Разрыв межклеточных взаимодействий сперматогоний и клеток Сертоли,
вызванный проводимым лечением, способен приводить к необратимому нарушению сперматогенеза и возникновению стерильности пациента [16].
Гибель клеток герминативного эпителия или их
значительное повреждение проявляется изменением
уровней основных половых гормонов в плазме крови
и наиболее часто сопровождается снижением секреции
ингибина В клетками Сертоли и значительным увеличением секреции ФСГ [17]. Например, после окончания терапии ЛХ по схеме МОРР (мустарген в/в 6 мг/м2,
винкристин в/в 2 мг — вводятся в 1-й и 8-й дни; прокарбазин внутрь 100 мг/м2, преднизолон внутрь 40 мг/м2 —
вводятся с 1-х по 14-е сутки) или ChlVPP (хлорамбуцил
внутрь 6 мг/м2; прокарбазин внутрь 50 мг/м2; преднизолон внутрь 40 мг/м2 с 1-х по 14-е сутки; винбластин в/в
6 мг/м2 в 1-е и 8-е сутки) увеличение уровня ФСГ отмечалось у 89 % и ЛГ — у 24 % пациентов [18, 19]. После терапии по схеме ВЕАСОРР 14 (циклофосфан в/в
’2011
с этим инфекционные осложнения (опоясывающий
лишай, инвазивные бактериальные инфекции, пневмоцистная пневмония, токсоплазмоз) и пр. [2, 8,
10–14].
Одной из значимых проблем, заслуживающих особого внимания, является высокая токсичность лечения
для органов репродуктивной системы (гонадотоксичность). При этом следует отметить, что проблема гонадотоксичности у больных с ЛХ может развиваться как
у лиц женского, так и мужского пола.
Говоря о гонадотоксичности у лиц мужского пола
с ЛХ необходимо представлять основные этапы сперматогенеза, а также механизмы его регуляции.
Сперматогенез начинается с деления стволовых
клеток и заканчивается образованием зрелых сперматозоидов. В семенном канальце различные зародышевые
клетки группируются в соответствии со стадиями своего созревания (стадиями сперматогенеза). Весь процесс
сперматогенеза разделен на 3 фазы.
1. Митотическая пролиферация и дифференцировка зародышевых клеток (сперматогоний).
2. Мейотическое деление зародышевых клеток
(сперматоцитов).
3. Трансформация зародышевых клеток (сперматид) в зрелые сперматозоиды (спермиогенез).
Среди сперматогоний различают клетки Аи В-типа. Клетки А-типа разделяются на 2 вида: Ат
(темные сперматогонии) и Аб (бледные сперматогонии). Ат-клетки в нормальных условиях лишены пролиферативной активности и поэтому могут считаться
стволовыми клетками сперматогенеза. Но при резком
уменьшении общего количества сперматогоний, например вследствие облучения, в Ат-клетках начинаются митозы. В отличие от них, Аб-сперматогонии делятся, и каждый из них превращается в 2 В-сперматогонии.
Материнские и дочерние клетки сохраняют между собой тесный контакт с помощью межклеточных мостиков. Тетраплоидные зародышевые клетки (сперматоциты) проходят различные фазы мейоза и в результате
образуются гаплоидные зародышевые клетки — сперматиды. Сперматиды — круглые митотически
неактивные клетки, превращающиеся в результате
трансформации в дифференцированные удлиненные
сперматиды и сперматозоиды. Эти процессы включают конденсацию и структурное оформление клеточного
ядра, появление жгутика и освобождение от большей
части цитоплазмы. Выход сперматозоидов в просвет
канальца называют спермиацией. На процесс спермиации оказывают особое влияние гормоны, температура
и токсины. Общая продолжительность дифференцировки сперматогоний типа А в зрелые сперматозоиды
у человека составляет не менее 64 суток.
Продукция андрогенов и развитие сперматозоидов регулируются гипоталамусом и гипофизом по
механизму обратной связи. Ключевая роль в сперматогенезе принадлежит лютеинизирующему (ЛГ)
и фолликулостимулирующему гормону (ФСГ), син-
13
2
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
2
’2011
14
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
650 мг/м2, доксорубицин в/в 25 мг/м2 — вводятся в 1-й
день; вепезид в/в 100 мг/м2 вводится с 1-го по 3-й дни;
натулан внутрь 100 мг/м2 с 1-го по 7-й дни; преднизолон
внутрь 40 мг/м2 с 1-го по 14-й дни; винкристин в/в 2 мг,
блеомицин в/в 10 мг/м2 — вводятся на 8-й день) увеличение уровня ФСГ и ЛГ отмечено у 93 % и 21 % пациентов, снижение тестостерона у 57 % больных [20]. Стоит
отметить, что даже в подростковом возрасте снижение
тестостерона способно сопровождаться не только снижением минерализации костной ткани, уменьшением
мышечной массы, но и ослаблением либидо, а в случаях
значительной гипотестостеронемии эректильной дисфункцией. Поэтому существует мнение, что пациенты
с явлениями гипотестостеронемии на фоне увеличения
ЛГ нуждаются в проведении андрогензаместительной
терапии [21].
Как уже отмечалось выше, основными направлениями лечения пациентов с ЛХ служат полихимиотерапия (ХТ) и лучевая терапия (ЛТ). При этом каждый из указанных методов может оказывать влияние
на гонады. Алкилирующие препараты, в настоящее
время широко использующиеся в онкологии, относятся к базисным препаратам в терапии ЛХ и являются неотъемлемой частью практически всех тера-
певтических схем, известных или применяемых на
сегодняшний день (см. табл.). Механизм их действия
основан на возможности встраивания в структуру
молекулы ДНК и индукции множественных
разрывов, приводящих к прекращению синтеза и репликации наследственного материала [22, 23]. Неклассические алкилирующие препараты, такие как
дакарбазин и прокарбазин, превращаются из неактивного соединения в активное непосредственно
внутри клетки. Например, прокарбазин трансформируется в печени в активное соединение, и его последующее воздействие на быстро делящиеся клетки
реализуется образованием множественных однонитевых разрывов, фрагментацией ДНК, генотоксическим эффектом, накоплением нерепарируемых повреждений, что в конечном счете приводит к индукции
апоптоза [24, 25].
Наряду с высокой терапевтической эффективностью, алкилирующие препараты играют основную
роль в токсическом воздействии на гонады у лиц
мужского пола. В зависимости от кумулятивной дозы алкилирующего препарата выраженность гонадотоксичности может различаться. Так, циклофосфамид в кумулятивной дозе, не превышающей 400 мг/кг,
Схемы ХТ лимфомы Ходжкина 1-й линии [69]
Схемы
Препараты
Доза мг/м2
День введения
ABVD
Доксорубицин
25 в/в
1-й и 14-й
Блеомицин
10 в/в
1-й и 14-й
Винбластин
6 в/в
1-й и 14-й
Дакарбазин*
375 в/в
1-й и 14-й. Цикл возобновляют на 28-й день
Мустарген*
6 в/в
1-й и 8-й
Онковин (винкристин)
1,4 в/в (не более 2 мг)
1-й и 8-й
Прокарбазин*
100 внутрь
1–14-й ежедневно
Преднизолон
40 внутрь
1–14-й ежедневно. Цикл возобновляют на 28-й день
Циклофосфан*
650 в/в
1-й и 8-й
Онковин
6 в/в
1-й и 8-й
Прокарбазин*
100 в/в
1–14-й ежедневно
Преднизолон
40 внутрь
1–14-й ежедневно. Цикл возобновляют на 28-й день
Мустарген*
6 в/в
1-й и 8-й
Онковин (винкристин)
1,4 в/в (не более 2 мг)
1-й и 8-й
Прокарбазин*
100 внутрь
1–14-й ежедневно
Доксорубицин
25 в/в
1-й и 15-й
Блеомицин
10 в/в
1-й и 15-й
Винбластин
6 в/в
1-й и 15-й
Дакарбазин*
375 в/в
1-й и 15-й
Преднизолон
40 внутрь
1–14-й ежедневно. Цикл возобновляют на 28-й день
МОРР
COPP
МОРР/ABVD
ВЕАСОРР 14
Stanford V
ChlVPP
CVPP
VAPEC-B
Циклофосфан*
650 (1250)
1-й
Доксорубицин
25 (35) в/в
1-й
Этопозид
100 (200) внутрь
1–3-й
Прокарбазин*
100 внутрь
1–7-й
Преднизолон
40 внутрь
1–8-й
Онковин (винкристин)
1,4 в/в (не более 2 мг)
8-й
Блеомицин
10 в/в
8-й. Цикл возобновляют на 21-й день
Циклофосфан*
650 (1250)
1-й
Доксорубицин
25 (35) в/в
1-й
Этопозид
100 (200) внутрь
1–3-й
Прокарбазин*
100 внутрь
1–7-й
Преднизолон
40 внутрь
1–8-й
Онковин (винкристин)
1,4 в/в (не более 2 мг)
8-й
Блеомицин
10 в/в
8-й. Цикл возобновляют на 15-й день
Мустарген*
6 в/в
1, 29, 57-й
Доксорубицин
25 в/в
1, 15, 29, 43, 57, 71-й
Винбластин
6 в/в
1, 15, 29, 43, 57, 71-й
Онковин (винкристин)
1,4 в/в (не более 2 мг)
8, 22, 36, 50, 64, 78-й
Блеомицин
5 в/в
8, 22, 36, 50, 64, 78-й
Этопозид
60 в/в
22–23-й, 50–51-й, 71–72-й
Преднизолон
40 внутрь
1–84-й ежедневно
Колониестимулирующие
факторы
5 мкг/кг подкожно
3–13-й, 17–26-й, 31–41-й, 45–54-й, 59–69-й, 73–82-й
Хлорбутин*
6 в/в (не > 10)
1–14-й ежедневно
Винбластин
6 в/в
1-й и 8-й
Прокарбазин*
100 внутрь
1–14-й ежедневно
Преднизолон
40 внутрь
1–14-й ежедневно. Цикл возобновляют на 35-й день
Циклофосфан*
650 в/в
1-й и 8-й
Винбластин
6 в/в
1-й и 8-й
Прокарбазин*
100 внутрь
1–14-й ежедневно
Преднизолон
40 внутрь
1–14-й ежедневно. Цикл возобновляют на 28-й день
Онковин (винкристин)
1,4 в/в (не более 2 мг)
8-й, 22-й
Доксорубицин
35 в/в
1-й, 15-й
Преднизолон
40 внутрь
1–28-й ежедневно
Этопозид
100 внутрь
15-20-й ежедневно
Циклофосфан*
350 в/в
1-й
Блеомицин
10 в/в
8-й, 22-й
2
ВЕАСОРР
стандартный
(эскалированный – дозы
в скобках)
15
’2011
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
* — алкилирующие препараты.
2
’2011
16
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
вызывает дисфункцию гонад у 10 % пациентов, тогда
как в дозе, превышающей 400 мг/кг, препарат способен индуцировать значительные расстройства сперматогенеза у 30 % подростков в препубертатном периоде и у 68–95 % пациентов старшего возраста [26].
Эти данные подтверждаются множеством исследований, оценивающих гонадотоксичность различных
химиотерапевтических протоколов. Так, например,
после терапии по схеме МОРР у 26 из 47 обследованных пациентов азооспермия сохранялась через 12 лет
после окончания лечения. У большинства пациентов
лечение схемами ОРРА/СОРР также приводило
к стерильности [27]. Терапия 6–8 циклами ChlVPP
или СОРР стерилизует 99–100 % излеченных пациентов на длительный срок [18, 19, 28].
Особую роль в терапии ЛХ занимают высокодозные схемы лечения, используемые при распространенных стадиях заболевания. Так, например, после терапии
схемой ВЕАСОРР Base азооспермия отмечена у 93 %,
а после ВЕАСОРР Esc — у 87 % пациентов. Стоит отметить, что исследования, проводимые после лечения
с целью прогностической оценки вероятности азооспермии, не увенчались успехом и до сих пор однозначного ответа на этот вопрос не получено [20].
Интересным вопросом является длительность проявлений гонадотоксичности у больных, получивших
терапию ЛХ, а также возможность восстановления
сперматогенеза, описанная у ряда больных. В цитируемом выше исследовании у больных, которым проводилась терапия по схеме МОРР, в 14 % случаев признаки
восстановления сперматогенеза наблюдались в интервале от 1,5 до 5 лет, в других случаях частичное восстановление сперматогенеза определялось позднее 10 лет
от окончания терапии [29]. Терапия 6–8 циклами
ChlVPP или СОРР также приводит к длительным нарушениям сперматогенеза, даже спустя 10 лет после
окончания терапии признаки восстановления сперматогенеза наблюдаются не у всех пациентов [18, 19, 28].
После терапии по схеме ABVD у большинства пациентов восстановление с возвращением к исходным показателям сперматогенеза наблюдалось через 12–18 мес
[17, 30–33]. Предполагается, что способность к восстановлению сперматогенеза соотносится с возрастом
и количеством уцелевших стволовых клеток сперматогенеза [34].
Нарушения сперматогенеза могут возникать как
при направленном, так и при рассеянном облучении,
исходящем от затронутых основным патологическим
процессом тканей. Например, при ЛТ брюшной полости и малого таза рассеянная лучевая нагрузка на гонады может достигать 1–2 % от общей дозы [13, 35]. Морфологические нарушения и изменения концентрации
сперматозоидов выявляются при разовом облучении
гонад в дозах < 0,1 Гр, в интервале от 2 до 3 Гр отмечается значительное снижение количества сперматоцитов
и сперматид. Разовое лучевое воздействие в дозах от 4
до 6 Гр приводит к тотальной гибели сперматид, являясь
причиной необратимой азооспермии [36]. Отмечено,
что после разового облучения гонад в дозе < 1 Гр восстановление сперматогенеза с возвращением к исходным
показателям наблюдалось через 9–18 мес, после облучения в интервале 2–3 Гр — через 30 мес и при дозе облучения > 4 Гр — через 5 и более лет [37].
Фракционированное облучение (ФО) в дозах 1,4–
2,6 Гр индуцирует азооспермию в 100 % случаев без признаков восстановления сперматогенеза через 17–43
мес. В редких случаях после облучения гонад в дозе 1,2
Гр сперматогенез может восстанавливаться [38]. Малые
дозы ФО (< 0,2 Гр) вызывают повышение уровня ФСГ
в сочетании с падением показателей сперматогенеза.
В дозах от 0,2 до 0,7 Гр ФО стимулирует транзиторную
элевацию уровня ФСГ, сочетающуюся со снижением
концентрации сперматозоидов на 1–2 года [39].
Значительная распространенность и актуальность
проблемы возникновения бесплодия у излеченных от
ЗН мужчин отчасти нашла свое решение в возможности
криоконсервации спермы (КС) до начала ХТ. Указанная методика в настоящее время является единственным действенным методом сохранения фертильности
перед началом терапии [42, 43]. Вследствие своей высокой эффективности и надежности КС получила широкое распространение во всем мире [44–47]. Основой
технологии является использование криопротектора,
позволяющего сперматозоидам сохранить жизнеспособность после замораживания и оттаивания. Большинство используемых в настоящее время криопротекторов сочетают в себе комбинации глицерина,
яичного желтка и буферных растворов. Впервые защитные свойства глицерина были открыты в 1940 г.,
когда было установлено, что сперматозоиды животных, смешанные с глицерином и замороженные при
t = –79 °С, способны выживать после размораживания
[48–50]. Тогда же было выяснено, что криопротекторы
уменьшают образование кристаллического льда внутри клетки [51], а так как концентрация внутриклеточной воды в сперматозоиде равна приблизительно 50 %,
при замораживании не происходит полного разрушения клеточного содержимого. В дальнейшем использование жидкого азота для проведения КС дало начало
развитию этой технологии в разных странах, в том
числе и в коммерческих целях [44–47]. Но даже ступенчатое замораживание в жидком азоте не исключает
возникновения повреждений после оттаивания, проявляющихся гибелью как минимум 50 % сперматозоидов [48, 49]. Влияние КС на целостность хроматина
ядра сперматозоидов обсуждается [52, 53], но достоверно известно, что низкое качество хроматина сперматозоидов (фрагментация хроматина) после проведенной
ХТ снижает вероятность самостоятельного оплодотворения [54]. Однако восстановление сперматогенеза после терапии ЛХ не исключает наступления беременностей естественным путем [55–57].
В настоящее время исследуются альтернативные
способы КС (лиофилизация, витрификация) и их
Заключение
ЛХ — заболевание, наиболее часто возникающее
у пациентов репродуктивного возраста, среди которых
половина заболевших — мужчины до 35 лет. Несмотря
на достигнутые успехи в лечении, большинство использующихся схем ХТ по-прежнему включают препараты,
применение которых сопряжено с выраженной гонадотоксичностью (алкилирующие препараты). Курабельность ЛХ и возраст, в котором возникает заболевание,
делают особенно значимой возможность сохранения
фертильности среди пациентов этой группы. Однако
низкая информированность врачей и больных зачастую
исключает своевременное проведение КС. Следствием
этого являются серьезные нарушения или полная утрата сперматогенеза, что может негативно повлиять на
дальнейшую судьбу излеченных мужчин. С другой стороны, не меньшим препятствием служит длительное
хранение образцов спермы (особенно подростков), требующее финансовых затрат, непосильных для некоторых пациентов.
Как уже было упомянуто, в некоторых случаях возникшие после лечения расстройства эндокринной регуляции и функции органов репродуктивной системы
могут потребовать квалифицированной помощи врачаэндокринолога или андролога. Поэтому наблюдение
и своевременное решение вопроса о необходимости
коррекций нарушений должны стать неотъемлемой частью дальнейшего контроля здоровья пациентов. Подводя итог, хотелось бы отметить, что успех лечения ЛХ
складывается не только из достижений ХТ и ЛТ, но также и из показателей качества жизни излеченных пациентов, где одну из важнейших ролей играет сохранение
фертильности.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Семочкин С.В., Лория С.С., Румянцев А.Г.
и соавт. Лечение лимфомы Ходжкина у
подростков и молодых взрослых. Онкогематология 2008;1–2:18–26.
2. De Vita V.T., Hellman S., Rosenberg S.A.,
eds. Cancer: Principles and Practice
of Oncology. Volume 2–6. Chapter 45.
Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers,
2001, p. 917.
3. Ries L.A.G., Miller B.A., Hankey B.F.,
National Cancer Institute. NIH Publication
Number 94, 1994, p. 2789.
4. Bleyer W.A., O’Learly M., Barr R. &
Ries L.A., eds. (2006). Cancer Epidemiology
in Older Adolescents and Young Adults 15–29
Years of Age, Including SEER Incidence and
Survival, 1975–2000. Oncologist;11:590–601.
5. Двойрин В.В., Аксель Е.М.,
Трапезников Н.Н. Статистика злокачественных новообразований в России и некоторых других странах СНГ в 1994 г.
(в 2 ч.). М., 1995.
6. Armitage J.O. Early-stage Hodgkin’s
lymphoma. N Engl J Med 2010 Aug
12;363(7):653–62.
7. Hewitt M., Weiner S.L., Simone J.V.
Childhood Cancer survivorship: improving
care and quality of life: institute of Medicine.
Washington DC: The National Academy
Press;2003:20–36.
8. Bailliere’s Clinical Haematology. Int
Pract and Res. Hodgkin’s Disease/ V. Diehl.
London-Philadelphia-Sydney: Bailliere Tindal,
1996, p. 232.
9. Donaldson S.S., Link M.P. Combined modality
treatment with low-dose radiation and MOPP
chemotherapy for children with Hodgkin disease.
J Clin Oncology 1987;5:742–9.
10. Armitage J.O. Long-term toxicity of the
treatment of Hodgkin’s disease. Ann Oncol
1998;9(Suppl 5):133–6.
11. Swerdlov A.J., Barber J.A., Hudson G.V.
et al. J Clin Oncol 2000;18(3):498–508.
12. Meistrich M.L., Vassilopoulou-Sellin R.,
Lipshultz L.I. Adverse effects of treatment:
gonadal dysfunction. In: De Vita V.T.,
Hellman S., Rosenberg S.A., eds. Cancer:
principles and practice of oncology. ed. 7.
Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins,
2005, p. 2560–74.
13. Schrader M., Muller M., Straub B.,
Miller K. The impact of chemotherapy on
male fertility: a survey of the biologic basis and
clinical aspects. Reprod Toxicol 2001;15:611–7.
14. Myrehaug S., Pintilie M. et al.
A population-based study of cardiac morbidity
among Hodgkin lymphoma patients with
preexisting heart disease. Blood 2010 Sep
30;116(13):2237–40. Epub 2010 Jul 1.
15. Нишлаг Э., Бере Г. и др. Андрология.
М.: МИА, 2005. Стр. 35–39.
16. Нишлаг Э., Бере Г. и др. Андрология.
М.: МИА, 2005. Стр. 48–49.
17. Muller H.L., Klinkhammer-Schalkie M.
et al. Gonadal function of young adults after
therapy of malignancies during childhood or
adolescence. Eur J Pediatr 1996;155(9):763–9.
18. Thomson A.B., Critchley H.O.,
Kelnar C.J., Wallace W.H. (2002). Late
reproductive sequelae following treatment
of childhood cancer and options for fertility
preservation. Best Pract Res Clin Endocrinol
Metab 16:311–34.
19. Brougham M.F., Kelnar C.J., Sharpe
R.M., Wallace W.H. Male fertility following
childhood cancer: current concepts and future
therapies. Asian J Androl 2003 Dec;5(4):325–37.
20. Sieniawski M., Reineke T., Nogova L.,
’2011
возможности до конца не изучены [50, 51]. Оптимизация технологии КС будет способствовать снижению степени повреждений структур сперматозоидов
и наследственного материала, что позитивно скажется на количестве жизнеспособных клеток после
оттаивания и позволит увеличить вероятность наступления беременности [58].
Подготовка к КС требует 2–4 дня, что может повлечь за собой незначительную отсрочку в начале терапии. Как правило, это связано с необходимостью повторного сбора материала при его изначально низком
качестве [59]. Также стоит отметить, что дозревающие
сперматозоиды имеют низкую митотическую активность, что в исключительных случаях дает возможность
провести КС сразу после или через непродолжительное
время от начала ХТ.
Заготовленные образцы эякулята могут находиться в криобанке длительный период времени. Часто возникает вопрос о безопасности воздействия
низких температур на генетический материал и возможность его последующего использования. Проведенные исследования показали, что даже продолжительное хранение (до 30 лет) [60, 61] не сказывается
на возможности зачатия [62–64].
Нельзя отрицать, что терапия ЗН может стать для
пациента травмирующим психологическим фактором, тогда как своевременно проведенная КС дает
положительный психологический эффект, предоставляя ему в дальнейшем возможность появления
потомства [65]. Кроме этого, проведенные опросы
показали, что более половины всех пациентов после
окончания лечения ЗН планируют рождение первого или второго ребенка [66–68].
17
2
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
2
’2011
18
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
Josting A., Pfistner A., Diehl V., Engert A.
Fertility in male patients with advanced
HL treated with BEACOPP. Blood 2008
Jan 1;111(1):71–6.
21. Schwartz C.L., Hobbie W.L. et al. Survivors
of Childhood And Adolescent Cancer, ed 2.
Chapter 3, p. 17–34.
22. Vogel E.W., Nivard M.J. International
Commission for Protection Against
Environmental Mutagens and Carcinogens.
The subtlety of alkylating agents in reactions
with biological macromolecules. Mutat Res
1994 Feb 1;305(1):13–32.
23. Vogel E.W., Barbin A., Nivard M.J.,
Bartsch H. Nucleophilic selectivity of
alkylating agents and their hypermutability
in Drosophila as predictors of carcinogenic
potency in rodents. Carcinogenesis 1990
Dec;11(12):2211–7.
24. Ehrenberg L. Covalent binding of genotoxic
agents to proteins and nucleic acids. IARC Sci
Pub 1984;(59):107–14.
25. Angerer J., Ewers U., Wilhelm M. Human
biomonitoring: state of the art. Int J Hyg
Environ Health 2007 May;210(3–4):201–28.
26. Puscheck E., Philip P.A., Jeyendran R.S.
Male fertility preservation and cancer
treatment. Cancer Treat Rev 2004
Apr;30(2):173–80.
27. Hamilton V.M., Norris C., Bunin N.,
Goldwein J.W., Bunin G.R., Lange B.,
Meadows A.T. Cyclophosphamide-based,
seven-drug hybrid and low-dose involved field
radiation for the treatment of childhood and
adolescent Hodgkin disease. J Pediatr Hematol
Oncol 2001;23(2):84–8.
28. Thomson A.B., Critchley H.O.,
Kelnar C.J., Wallace W.H. Late reproductive
sequelae following treatment of childhood
cancer and options for fertility preservation.
Best Pract Res Clin Endocrinol Metab
2002;16:311–34.
29. Marmor D., Duyck F. Male reproductive
potential after MOPP therapy for Hodgkin’s
Disease. Andrologia 1995;27:99–106.
30. Viviani S., Ragini G., Santoro A. et al.
Testicular disfunction in Hodgkin’s disease
before and after treatment. Eur J Cancer
1991;27:1389–92.
31. Bonadonna G., Santoro A., Vivani S.,
Lombardi G., Ragini G. Gonadal Damage in
Hodgkin’s disease for cancer chemotherapeutic
regimens. Arch Toxicol 1984;1:140–5.
32. Tal R., Botchan A., Hauser R., Yogev L.,
Paz G., Yavevetz H. Follow-up sperm
concentration and motility in patients
with lymphoma. Hum Reprod 2000
Sep;15(9):1985–8.
33. Donaldson S.S., Hudson M.M.,
Lamborn K.R., Link M.P., Kun L.,
Billett A.L., Marcus K.C., Hurwitz C.A.,
Young J.A., Tarbell N.J., Weinstein H.J. VAMP
and low-dose, involved-field radiation for
children and adolescents with favorable, earlystage Hodgkin’s disease: results of a prospective
clinical trial. J Clin Oncol 2002;20:3081–7.
34. Hansen P.V., Trykker H. et al. Long-term
recovery of spermatogenesis after radiotherapy
in patients with testicular cancer. Radiother
Oncol 1990;18:117–25.
35. Lee S.J., Schover L.R., Partridge A.H.
et al. American Society of Clinical Oncology
recommendations on fertility preservation in
cancer patients. J Clin Oncol 2006;24:2917–31.
36. Kinsella T.J., Trivette G. et al. Long-term
follow-up of testicular function following
radiation therapy for early-stage Hodgkin’s
disease. J Clin Oncol 1989;7:718–24.
37. Howell S.J., Shalett S.M.
Spermatogenesis After Cancer Treatment:
Damage and Recovery. J Natl Cancer Inst
Monogr 2005;34:12–7.
38. Hahn E.W., Feingold S.M., Nisce L.
Aspermia and recovery of spermatogenesis in
cancer patients following incidental gonadal
irradiation during treatment: a progress report.
Radiology 1976;119:223–5.
39. Kinsella T.J., Trivette G., Rowland J.,
Sorace R., Miller R., Fraass B. et al. Longterm follow-up of testicular function following
radiation therapy for early-stage Hodgkin’s
disease. J Clin Oncol 1989;7:718–24.
40. Anserini P.C.S., Spinelli S., Costa M.,
Conte N., Copello F., Bacigalupo A.Т. Semen
analysis following allogeneic bone marrow
transplantation. Additional data for evidencebased counselling. Bone Marrow Transplant
2002;30:447–51.
41. Socie G., Salooja N. et al. Nonmalignant
late effects aftеr allogenetic stem cell
transplantation. Blood 2003;101:3373–85.
42. Res U., Res P., Kastelic D., Stanovnik M.,
Kmetec A., Merlo A. Birth after treatment of
a male with seminoma and azoospermia with
cryopreserved-thawed testicular tissue. Hum
Reprod 2000 Apr;15(4):861–4.
43. Dohle G.R., Colpi G.M., Hargreave T.B.
et al. Guidelines on male infertility. Eur Urol
2005;48:703–11.
44. Perloff W.H. et al. Conception with human
spermatozoa frozen by nitrogen vapor technic.
Fertility and Sterility 1964;15:501–4.
45. David G. et al. The success of A.I.D. and
semen characteristics: study of 1489 cycles
and 192 ejaculates. International Journal of
Andrology1980;3:613–9.
46. Clarke G.N. et al. Artificial insemination
and in-vitro fertilization using donor
spermatozoa: a report on 15 years of
experience. Human Reproduction
1997;12:722–6.
47. Leibo S.P. et al. Cryopreservation of
human spermatozoa. In: Vayena E. et al.,
eds. Current practices and controversies in
assisted reproduction. Geneva, World Health
Organization, 2002, p. 152–65.
48. Keel B.A., Webster B.W. Semen
cryopreservation methodology and results.
In: Barratt C.L.R., Cooke I.D. (eds). Donor
insemination. Cambridge University Press.
Cambridge, 1993, p.71–96.
49. Watson P.F. Recent developments
and concepts in the cryopreservation of
spermatozoa and the assessment of their postthawing function. Reproduction Fertility and
Development 1995;7:871–91.
50. Bagchi A., Woods E.J., Critser J.K.
Cryopreservation and vitrification: recent
advances in fertility preservation technologies.
Expert Rev Med Devices 2008 May;5(3):359–70.
51. Sherman J.K. Cryopreservation of human
semen. In: Keel B.A., Webster B.W., eds.
CRC handbook of the laboratory diagnosis
and treatment of infertility. Boca Raton, CRC
Press: 229–259.
52. Vutyavanich T., Piromlertamorn
W., Nunta S. Rapid freezing versus slow
programmable freezing of human spermatozoa.
Vol. 93, issue 6, p. 1921–8.
53. Zribi N., Feki Chakroun N., El Euch H.
et al. Effects of cryopreservation on human
sperm deoxyribonucleic acid integrity. Fertil
Steril 2010 Jan;93(1):159–66.
54. O’Flaherty C., Hales B.F. Impact of
chemotherapeutics and advanced testicular
cancer or Hodgkin lymphoma on sperm
deoxyribonucleic acid integrity. Fertility and
Sterility, vol. 94, issue 4, p. 1374–9.
55. Van der Kaaij M.A., Heutte N. et al.
Sperm quality before treatment in patients
with early stage Hodgkin’s lymphoma enrolled
in EORTC-GELA Lymphoma Group trials.
Haematologica 2009 Dec;94(12):1691–7.
56. Kulkarni S.S., Sastry P.S. et al. Gonadal
function following ABVD therapy for
Hodgkin’s disease. Am J Clin Oncol 1997
Aug;20(4):354–7. Hum Reprod 2004
Nov;19(11):2680.
57. Horne G., Atkinson A.D., Pease E.H. et al.
Live birth with sperm cryopreserved for 21 years
prior to cancer treatment: case report. Hum
Reprod 2004 Jun;19(6):1448–9.
58. Woods E.J. et al. Fundamental cryobiology
of reproductive cells and tissues. Cryobiology
2004;48:146–56.
59. Shin D., Lo K.C., Lipshultz L.I. Treatment
options for the infertile male with cancer.
J Natl Cancer Inst Monogr 2005;34:48–50.
60. Feldschuh J. et al. Successful sperm
storage for 28 years. Fertility and Sterility
2005;84:1017.
61. Horne G., Atkinson A.D., Pease E.H.,
Logue J.P., Brison D.R., Lieberman B.A. Live
birth with sperm cryopreserved for 21 years
prior to cancer treatment: case report. Hum
Reprod 2004 Jun;19(6):1448–9.
62. Clarke G.N. et al. Recovery of human
sperm motility and ability to interact with
the human zona pellucida after more than 28
years of storage in liquid nitrogen. Fertility and
Sterility 2006;86:721–2.
63. Agarwal A., Ranganathan P., Kattal
N., Pasqualotto F., Hallak J., Khayal S.,
Mascha E. Fertility after cancer: a prospective
review of assisted reproductive outcome with
banked semen specimens. Fertil Steril 2004
Feb;81(2):342–8.
64. Saito K., Suzuki K., Iwasaki A., Yumura Y.,
Kubota Y. Sperm cryopreservation before
cancer chemotherapy helps in the emotional
battle against cancer. Cancer 2005;104:521–4.
65. Schover L.R., Brey K., Lichtin A.
Knowledge and experience regarding cancer,
infertility, and sperm banking in younger male
survivors. J Clin Oncol 2002;20:1880–9.
66. Reinmuth S., Liebeskind A.K.,
Wickmann L., Bockelbrink A., Keil T., Henze
G., Borgmann A. Having children after
surviving cancer in childhood or adolescence —
results of a Berlin survey. Klin Paediatr 2008
May–Jun;220(3):159–65.
67. Schover L.R., Rybicki L.A., Martin B.A.
Having children after cancer: a pilot survey of
survivors’ attitudes and experiences. Cancer
1999;86:697–709.
68. Волкова М.А. Клиническая онкогематология: руководство для врачей. М.: Медицина, 2007. С. 1120.
2
Случай врожденного лангергансоклеточного гистиоцитоза
у ребенка раннего возраста
19
’2011
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
Т.Т. Валиев1, Л.А. Махонова1, А.М. Ковригина2, Е.Н. Шолохова2, Н.Н. Тупицын2,
И.Н. Серебрякова1, Г.Л. Менткевич1
1
НИИ детской онкологии и гематологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН;
2
НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контакты: Тимур Теймуразович Валиев timurvaliev@mail.ru
В настоящей статье приведено детальное описание редкого случая моносистемной формы врожденного лангергансоклеточного
гистиоцитоза (ЛКГ) у девочки 3-недельного возраста. Впервые приводится описание локального поражения слизистой оболочки полости рта при ЛКГ у новорожденного. Авторы характеризуют морфологические, иммунологические, клинические особенности данной редкой патологии и делают вывод о важности своевременной диагностики для назначения риск-адаптированной
терапии при ЛКГ у детей.
Ключевые слова: лангергансоклеточный гистиоцитоз, новорожденные, диагностика, лечение
Case of congenital Langerhans cells histiocytosis in an infant
T.T. Valiev1, L.A. Makhonova1, A.M. Kovrigina2, E.N. Sholokhova2, N.N. Tupitsyn2, I.N. Serebryakova1, G.L. Mentkevich1
Institute of Pediatric Oncology and Hematology, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences;
2
Institute of Clinical Oncology, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
1
In this article a rare case of monosystem form of congenital Langerhans cells histiocytosis (LCH) in 3 weeks of age girl was described. Local
lesion of oral mucosa of the infant with LCH was first described. Morphological, immunological and clinical features of this rare disease
have been characterized. Authors concluded that timely diagnostics is very important to risk-adapted therapy at children with LCH.
Key words: Langerhans cell histiocytosis, newborns, diagnosis, therapy
История изучения лангергансоклеточного гистиоцитоза (ЛКГ) насчитывает более 100 лет. За это
время взгляды на патогенетические основы этого заболевания претерпели серьезные изменения. Благодаря появлению методов электронной микроскопии,
иммуногистохимии, расширению панели диагностических антител была установлена опухолевая
природа ЛКГ [1], в основе которой лежит инфильтрация различных органов и тканей злокачественной
популяцией активированных клеток Лангерганса, что
ведет к морфологическим и функциональным нарушениям. Иммунологическим субстратом ЛКГ являются CD1а+, S100+ и Langerin-позитивные дендритные
клетки [2]. Свое происхождение клетки ЛКГ ведут от
стволовой (CD34+) клетки, которая благодаря микроокружению дает начало двум популяциям клеток
моноцитарно-макрофагальной системы: CD14позитивные клетки (предшественники тканевых макрофагов) и СD14-негативные клетки (предшественники клеток Лангерганса) [3].
ЛКГ представляет собой редкое заболевание.
Сложности дифференциальной диагностики ведут
к тому, что данные о заболеваемости колеблются
в достаточно широких пределах и составляют, по
данным разных авторов, от 0,5 до 6 случаев на 1 млн
детского населения. Несколько чаще болеют маль-
чики в возрасте от 0 до 4 лет [4, 5]. Клиническая картина ЛКГ разнообразна и характеризуется поражением костей скелета, кожи, печени, легких,
селезенки, лимфатических узлов, костного мозга,
центральной нервной системы, развитием дисфункции эндокринной системы [6]. Поражения кожи при
ЛКГ могут быть представлены эритематозными везикулопапулезными элементами, часто покрытыми
корками. При локализации ЛКГ в паренхиматозных
органах, по данным методов инструментальной визуализации, определяются очаговоподобные уплотнения. В случаях поражения костной системы при
проведении рентгенологических методов исследования выявляются очаги костной деструкции. Ранее
варианты ЛКГ с сочетанными висцеральными поражениями назывались болезнью Абта–Леттерера–
Сиве, а генерализованные поражения костной системы — болезнью Хенда–Шюллера–Крисчена.
Степень выраженности поражений органов и их
прогностическое влияние различны. Выделяют органы риска (печень, селезенка, костный мозг и легкие), поражение которых является неблагоприятным прогностическим фактором при терапии ЛКГ.
Кроме того, при поражении ЦНС, костей лицевого
скелета, передней или средней черепной ямки повышается риск рецидива заболевания. Прогноз зависит
2
’2011
20
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
от возраста на момент установления диагноза, распространенности процесса и степени повреждения
жизненно важных органов. Ранняя диагностика
улучшает ответ на терапию при ЛКГ у детей. У детей
до года течение ЛКГ крайне агрессивное, с быстрой
диссеминацией, поражением нескольких органов
и нарушением их функции [7, 8].
Целью терапии ЛКГ является подавление активности и пролиферации гистиоцитов, лимфоцитов
и макрофагов. В зависимости от распространенности опухолевого процесса, стратификации больных
по группам риска строятся современные программы
терапии ЛКГ, которые включают преднизолон, винбластин, 6-меркаптопурин, метотрексат (группа
среднего риска) [9], тогда как в программу лечения
больных из группы высокого риска входит метотрексат 500 мг/м2. В последние годы в терапию рецидивов и рефрактерных форм ЛКГ включают препарат
2-хлордезоксиаденозин, эффективность которого
у детей активно изучается [10, 11].
Современные представления о клинико-морфоиммунологических особенностях ЛКГ основываются на обобщении отдельными клиниками своего небольшого опыта в диагностике и лечении этой
редкой патологии, а также описании отдельных клинических случаев [12]. Каждый новый случай ЛКГ,
обследованный на современном уровне, вносит
большой вклад в расширение нашего понимания
этой редкой патологии детского возраста.
Больная В.А. родилась 23.10.2009 от доношенной
I беременности, которая протекала без осложнений.
Вес при рождении 3530 г, рост 51 см. С рождения родители отмечали у девочки в полости рта сероватое опухолевое образование, и когда ребенку исполнилось 3 недели, обратились к стоматологу, который на основании пункции данного образования заподозрил ЛКГ.
При осмотре в НИИ детской онкологии и гематологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 01.12.2009 на
твердом небе слева определялось опухолевое образование грязно-серого цвета, выступающее в полость рта,
размером около 2,5 см, с ровными и четкими краями,
при контакте не кровоточило. Окружающие ткани
слизистой оболочки не были изменены (рис. 1). Температура тела 36,8 ºС. Кожные покровы — физиологических
свойств, при пальпации периферические лимфатические узлы не были увеличены, размеры печени и селезенки соответствовали возрасту ребенка.
При цитологическом исследовании пунктата опухоли (08.12.2009) обращали на себя внимание крупные
клетки со складчатыми и дольчатыми ядрами, вокруг
которых в обильной эозинофильной цитоплазме определялись мелкие гранулы. Нуклеолы были едва заметными
(рис. 2).
10.12.2009 была выполнена биопсия опухолевого образования полости рта. Морфологическая картина характеризовалась скоплениями крупных клеток с наличием
ядерных борозд и широкой эозинофильной цитоплазмой
(рис. 3). Среди инфильтрата присутствовали нейтрофильные и эозинофильные гранулоциты.
Иммуногистохимически опухолевые клетки мономорфно экспрессировали CD1a, S-100, HLA-DR,
Langerin, многоядерные гистиоидные клетки — CD68
(рис. 4–7). Иммунофенотипирование опухолевого образования методом непрямой реакции иммунофлюоресценции на криостатных срезах проводилось с использованием панели моноклональных антител CD7, CD79a,
Рис. 1. Опухоль слизистой оболочки полости рта больной В.
до начала терапии
Рис. 2. Цитологическая картина пунктата опухоли
ротовой полости
a
б
Рис. 3. Лангергансоклеточный гистиоцитоз. Окраска гематоксилинэозином: а — фрагмент слизистой оболочки, покрытой многослойным
плоским эпителием, субэпителиально — инфильтрат из крупных
клеток с округло-овальными и складчатыми/бобовидными ядрами,
широкой слабо эозинофильной цитоплазмой; б — среди инфильтрата
видны нейтрофильные и эозинофильные гранулоциты, присутствуют
отдельные гигантские многоядерные гистиоидные клетки.
21
2
’2011
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
Рис. 4. Клетки инфильтрата экспрессируют Langerin (CD207) —
перинуклеарная, гранулярная реакция. Иммуноферментный метод
Рис. 5. Клетки инфильтрата экспрессируют CD1a (мембранная
реакция). Иммуноферментный метод
Рис. 6. Клетки инфильтрата экспрессируют S-100 (ядерноцитоплазматическая реакция). Иммуноферментный метод
CD68 и CD1a. Опухолевые клетки в 100 % экспрессировали антиген СD1a, на части опухолевых клеток отмечена экспрессия антигена СD68. В опухолевой ткани
присутствовали единичные T- и B-лимфоциты.
В связи с ранним возрастом ребенка радиоизотопные исследования с Ga-67 и Tc-99 на предмет
Рис. 7. Среди субстрата присутствуют отдельные многоядерные
гистиоидные клетки, экспрессирующие CD68, клетки инфильтрата
CD68 — негативны. Иммуноферментный метод
поражения костной системы не проводились, поскольку в ряде работ была показана крайне низкая чувствительность и специфичность данного метода [13, 14].
По данным ультразвукового исследования (УЗИ)
и рентгеновской компьютерной томографии (РКТ) черепа и покровных костей лицевого скелета костнодеструктивные изменения в исследованных отделах
скелета не выявлены.
В общем и биохимическом анализах крови патологических изменений обнаружено не было. По данным
коагулограммы — нормокоагуляция.
Таким образом, на основании клинико-лабораторных
и инструментальных методов исследования был установлен диагноз: ЛКГ, монофокальная форма с поражением
слизистой твердого и мягкого неба слева.
С 14.12.2009 была начата терапия по протоколу
LCH-III для детей с локальным опухолевым процессом.
Данный протокол позволил получить высокие показатели
выживаемости и включает в себя интенсивную фазу I
(преднизолон 40 мг/м2/сут 1–28-й день, отмена к 42-му
дню per os; винбластин 6 мг/м2 введение в 1, 7, 14, 21, 28,
35-й дни в/в струйно), интенсивную фазу II (преднизолон
40 мг/м2/сут 1–3, 7–9, 14–16, 21–23, 28–30, 35–37-й
дни per os; винбластин 6 мг/м2 введение в 1, 7, 14, 21, 28,
35-й дни в/в струйно) и поддерживающую фазу, продолжающуюся 42 дня (преднизолон 40 мг/м2/сут 1–5-й дни
каждого цикла per os; винбластин 6 мг/м2 введение в 1-й
день каждого цикла в/в струйно; 6-меркаптопурин
50 мг/м2/сут ежедневно per os; метотрексат 20 мг/м2
введение в 1-й день каждого цикла per os) [15].
Лечение девочка переносила удовлетворительно
и по окончании интенсивной фазы I и II отмечено
уменьшение размеров опухоли до 2 см, отсутствие промененции в ротовую полость.
По данным РКТ, проведенной в феврале 2010 г., деструктивных изменений в костях черепа выявлено не
было, отмечено неравномерное утолщение мягких тканей левой половины полости рта по ходу твердого
и мягкого неба.
2
’2011
22
ГЕМОБЛАСТОЗЫ: ДИАГНОСТИКА, ЛЕЧЕНИЕ, СОПРОВОДИТЕЛЬНАЯ ТЕРАПИЯ
При проведении УЗИ в феврале 2010 г. данных за
опухолевое поражение других органов и систем не получено.
В ходе динамического наблюдения (март – декабрь
2010 г.) остаточная опухоль ротовой полости составляла
около 1,5 см. При РКТ (июль 2010 г.) поражений костей
черепа не выявлено, отмечалось утолщение мягких тканей левой половины твердого неба. При биопсии места
бывшего опухолевого образования и цитологическом исследовании опухолевые клетки не были обнаружены.
В настоящее время ребенок получает поддерживающую фазу терапии. При осмотре на месте первичной
локализации опухоли определяется пятно, цвет которого приближается к цвету окружающих тканей
(рис. 8).
Таким образом, приведенный клинический случай является крайне редкой врожденной формой
ЛКГ, диагностированной на этапе локального процесса. Изолированное поражение слизистой оболочки
твердого неба при ЛКГ у новорожденных не описано, поэтому наше наблюдение расширяет современные представления о спектре клинических проявлений данного заболевания.
У детей раннего возраста ЛКГ характеризуется
мультисистемным поражением с быстрой диссеминацией и вовлечением печени, легких, костного мозга.
Большая опухолевая масса, мультиорганный характер
поражения и нарушение функций жизненно важных
органов объясняют крайне неудовлетворительные результаты терапии таких больных, что диктует необходимость привлечения внимания педиатров и врачей
Рис. 8. Состояние слизистой оболочки ротовой полости больной В.
после окончания основного курса терапии
других специальностей к данной редкой патологии.
Наша клиника располагает данными диагностики и лечения более 600 детей с впервые установленным диагнозом ЛКГ [16, 17], но ни в одном случае не наблюдалось
изолированного поражения слизистой оболочки ротовой полости у новорожденного. В нашем случае диагностический этап удалось свести к минимуму, поскольку при обращении к стоматологу была выполнена
пункционная биопсия опухолевого образования и заподозрен ЛКГ. Девочка была направлена в специализированное отделение, где на основании клиникоморфоиммунологических характеристик опухоли был
установлен правильный диагноз и проведена терапия
по программе LCH-III с хорошим эффектом.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Махонова Л.А., Дурнов Л.А. Гистиоцитарные заболевания у детей. М.: МИА,
2004. С. 93.
2. Новичкова Г.А., Минков М.,
Масчан М.А. и др. Гистиоцитозы. В кн.:
Клиническая онкогематология. Под ред.
М.А. Волковой. М.: Медицина, 2007.
С. 891–911.
3. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L.
et al. WHO Classification of Tumours of
Haematopoietic and Lymphoid Tissues. 4th
Ed. International Agency for Research on
Cancer. Lyon, 2008. P. 439.
4. Волкова Е.Н., Бронин Г.О., Высоцкая Т.А.
и др. Результаты ретроспективного моноцентрового исследования гистиоцитоза
из клеток Лангерганса у детей. Педиатрия
2009;87(3):33–40.
5. Buchman L., Emani A., Wei J.L. Primary
head and neck Langerhans cell histiocytosis
in children. Otolaryngol Head Neck
Surg;135:312–7.
6. Лукина Е.А. Гистиоцитоз из клеток Лангерганса. В рук. по гематологии под ред.
акад. А.И. Воробьева. М.: Ньюдиамед,
2003. С. 36–39.
7. Krstovski N., Janic D., Docmanovic L.
et al. Clinical characteristics and survival of
children with Langerhans cell histiocytosis.
Spr Arh Celok Lek 2008;136(9–10):514–8.
8. Mosterd K., van Marion A., van
Steensel M.A. Neonatal Langerhans
cell histiocytosis: a rare and potentially
life-threatening disease. Int J Dermatol
2008;47(1):10–2.
9. Солопова Г.Г., Байдильдина Д.Д.,
Жарикова Л.И. и др. Применение 2-хлордезоксиаденозина в терапии гистиоцитоза
из клеток Лангерганса у детей. Онкогематология 2010;3:8–15.
10. Imamura T., Sato T., Shiota Y. et al.
Outcome of pediatric patients with
Langerhans cell histiocytosis treated with 2
chlorodeoxyadenosine: a nationwide survey in
Japan. Int J Hematol 2010 May;91(4):646–51.
11. Weitzman S., Braier J., Donadieu J. et al.
2'-Chlorodeoxyadenosine (2-CdA) as salvage
therapy for Langerhans cell histiocytosis
(LCH). Results of the LCH-S-98 protocol of
the Histiocyte Society. Pediatr Blood Cancer
2009 Dec 15;53(7):1271–6.
12. Stein S.L., Paller A.S., Haut P.R. et al.
Langerhans Cell Histiocytosis Presenting in
the Neonatal Period. Arch Pediatr Adolesc
Med;155:778–83.
13. Connolly L.P., Treves S.T. Assessing the
limping child with skeletal scintigraphy. J Nucl
Med 1998 Jun;39(6):1056–61.
14. Freeman S.J., Sonoda L.I., Seshadri N.
et al. What is the significance of solitary bony
abnormalities on bone scintigrams of children
with malignancy? Pediatr Hematol Oncol 2010
Aug;27(5):380–6.
15. Allen C.E., McClain K.L. Langerhans
cell histiocytosis: a review of past, current and
future therapies. Drugs Today (Barc) 2007
Sep;43(9):627–43.
16. Махонова Л.А. Гистиоцитозы у детей.
В рук. по детской онкологии под ред. акад.
Л.А. Дурнова. М.: Миклош, 2003. С. 316–24.
17. Пичугина Л.Ю. Клиническое течение
и лечение диссеминированных форм лангергансоклеточного гистиоцитоза у детей.
Дис. … канд. мед. наук. М., 1999. С. 163.
А.В. Шишкин1, Н.Г. Овчинина1, С.С. Бессмельцев2
1
ГОУ ВПО Ижевская государственная медицинская академия;
2
ФГУ Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России, Санкт-Петербург
Контакты: Александр Валентинович Шишкин Shishkin_lab@mail.ru
В данной работе предложен новый подход, позволяющий определять большое число вариантов коэкспрессии антигенов клеток
при проведении анализа с использованием иммунологического биочипа. Рассматривается новая конструкция тест-системы для
исследования клеток, содержащей биочип с тестовыми участками, выполненными в виде линий, а также специальное приспособление для проведения анализа. Приводятся примеры исследования клеток. При этом осуществляется сравнение полученных
результатов с результатами исследования, выполненного с использованием биочипов ранее известной конструкции.
Ключевые слова: иммунологический биочип, определение поверхностных антигенов клеток, определение коэкспрессии антигенов
Novel approach for detection of cell antigen coexpression using immunological biochip
A.V. Shishkin1, N.G. Ovchinina1, S.S. Bessmeltsev2
Izhevsk State Medical Academy; 2Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology, St.-Petersburg
1
New approach for detection of large number of different variants of cell antigen coexpression using the immunological biochip is suggested in
this work. Novel construction of immunological biochip for cell investigation with test zones as strips and new special device for incubation
are considered. Examples of cell analysis are given. Results are compared with data of investigation where previously known patterns of
biochips were used.
Key words: immunological biochips, cell surface antigens, coexpression
Введение
Весьма перспективным направлением иммунодиагностики является исследование антигенов клеток с использованием иммунологических биочипов.
Данный подход был реализован в ряде зарубежных
и отечественных работ [1–12]. Биочипы, описанные
в большинстве этих работ, имели сходную конструкцию (рис. 1). Они представляли собой подложки, на
которых в строго определенных тестовых участках
(«пятнах») были иммобилизованы антитела, специфичные к поверхностным антигенам клеток.
Отличия заключались главным образом в количестве
тестовых участков и специфичности иммобилизованных антител, а также в использовании подложек
из разных материалов.
Анализ основан на связывании клеток, имеющих
определяемые антигены, в области участков биочипа, содержащих иммобилизованные антитела,
специфичные к данным антигенам. Методика проведения анализа включает инкубацию биочипа
с клеточной суспензией, отмывку биочипа от не связавшихся с антителами клеток, считывание результата и определение плотности связывания клеток в области пятен биочипа. Исходя из величины плотности
связывания клеток в области каждого из пятен биочипа, может быть выполнена оценка содержания
в исследуемом образце клеток, имеющих соответствующие антигены.
С помощью биочипа подобной конструкции можно определить множество различных поверхностных
антигенов на разных клетках. Но на одной отдельно
взятой клетке по факту ее связывания в том или ином
пятне с иммобилизованными антителами может быть
определен только один антиген. В то же время во многих случаях очень важна информация о наличии или
отсутствии на каждой отдельно взятой клетке несколь-
Рис. 1. Устройство биочипа 1-го типа, использованного в данной работе:
1 — подложка;
2 — рабочая область биочипа; 3 — тестовые
участки (пятна) с иммобилизованными антителами;
4 — фоновые участки подложки, не содержащие иммобилизованных антител
’2011
Новый подход к определению коэкспрессии антигенов
клеток при проведении анализа с использованием
иммунологического биочипа
23
2
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ
2
’2011
24
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ
ких антигенов. В некоторых работах зарубежных авторов [2, 7, 10], а также в ранее проведенных собственных
исследованиях [12] данная задача решалась за счет дополнительной обработки клеток антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой. При этом на
отдельно взятой клетке один антиген определялся по
факту связывания клетки в том или ином пятне биочипа, а второй антиген определялся по окрашиванию
клетки флуоресцентной меткой. Таким образом, для
определения на отдельно взятой клетке двух антигенов
достаточно было использовать меченые антитела одного типа. На подложке биочипа было иммобилизовано
много видов антител с различной специфичностью.
Поэтому при дополнительной обработке мечеными
антителами, специфичными к одному антигену, на разных клетках определялась коэкспрессия этого антигена в паре с другими антигенами, определяемыми с помощью биочипа. Обработка биочипа со связанными
клетками смесью нескольких антител, имеющих различную специфичность и меченных разными метками, позволила бы определять большее число вариантов
коэкспрессии антигенов.
Вместе с тем такой подход имеет ряд серьезных недостатков. Во-первых, количество определяемых вариантов коэкспрессии недостаточно велико. Во-вторых,
в контакт с раствором меченых антител необходимо
приводить всю поверхность биочипа, которая содержит не только участки с иммобилизованными антителами, но и фоновые участки, не содержащие иммобилизованных антител. Этим обусловлен высокий расход
дорогостоящих меченых антител. В результате, определение коэкспрессии антигенов значительно повышает
стоимость проведения анализа.
Задачей данной работы является достижение
возможности одновременного определения большего количества вариантов коэкспрессии антигенов
при меньшем расходе меченых антител во время проведения анализа с использованием иммунологического биочипа.
Материалы и методы
В процессе проведения данной работы использовались биочипы 2 типов.
1. Биочипы базовой конструкции (рис. 1), аналогичные биочипам, использованным в наших предыдущих исследованиях [11, 12].
2. Биочипы, предназначенные для одновременного определения большого количества вариантов
коэкспрессии антигенов. Данные биочипы использовались в комбинации со специальным устройством.
Проведение исследований с использованием биочипов
1-го типа
Конструкция биочипа 1-го типа
Биочип 1-го типа (рис. 1) представляет собой
твердую подложку, на которой в строго определен-
ных местах (тестовых участках, «пятнах») иммобилизованы молекулы антител. В каждом из тестовых
участков иммобилизованы антитела, специфичные
к одному поверхностному антигену клеток. Но разные тестовые участки отличаются друг от друга
специфичностью иммобилизованных в них антител.
Тестовые участки отделены друг от друга фоновыми
участками, не содержащими иммобилизованных антител.
В данном случае для изготовления биочипов были
использованы прозрачные пластиковые подложки.
В тестовых участках подложки были адсорбированы
мышиные моноклональные антитела (IgG), специфичные к следующим поверхностным антигенам лейкоцитов человека: CD3, CD4, CD5, CD8, CD16,
СD19, CD20, CD23, CD45 (АО «Сорбент ЛТД»,
Россия). Размеры подложки составляли 8  8 мм.
Необходимо отметить, что в своих предыдущих
исследованиях [11, 12] мы применяли биочипы аналогичной конструкции, содержащие значительно
большее число видов иммобилизованных антител.
Изготовление биочипов 1-го типа
При изготовлении биочипов 1-го типа капли
растворов антител объемом 0,25 мкл наносили на
подложки в заранее отмеченные участки. Далее подложки помещали в камеру со 100 % влажностью
и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего высушивали на воздухе и замораживали при –26 ºС в герметичных контейнерах.
При таком хранении биочипы не теряли своих
свойств по меньшей мере в течение 12 месяцев.
Получение клеточной суспензии
Лейкоциты были выделены из периферической
крови путем центрифугирования в растворе фиколла
и урографина с плотностью 1,077 г/мл и трижды отмыты PBS. Полученные клетки ресуспензировали
в растворе, содержащем 20 % (по объему) инактивированной нагреванием человеческой сыворотки
и 1,5мМ ЭДТА в PBS.
Проведение анализа с использованием биочипа 1-го
типа
После разморозки биочип закрепляли в кювете,
ополаскивали 1 % раствором BSA в буфере PBS, затем проводили 3-кратную отмывку 0,05 % раствором
детергента Tween-20 на шейкере. После этого биочип
инкубировали с 1 % раствором BSA в PBS при комнатной температуре в течение 1 часа при перемешивании на шейкере. Затем вновь проводили 3-кратную отмывку 0,05 % раствором детергента Tween-20
и ополаскивали биочип буфером для удаления следов детергента.
В кювету с биочипом вносили клеточную суспензию и инкубировали в течение 60 минут без
какого-либо перемешивания. Концентрация клеток
Проведение исследований с использованием биочипов
2-го типа
Устройство биочипа 2-го типа
Биочип был изготовлен на подложке из прозрачного пластика размерами 22  22 мм. На подложке
биочипа были иммобилизованы мышиные моноклональные антитела (IgG), специфичные к антигенам
CD4, CD5, CD8, CD16, CD19, CD23, CD45 (АО
«Сорбент ЛТД», Россия). Иммобилизация антител
осуществлялась за счет адсорбции. Тестовые участки
биочипа были нанесены на подложку в виде параллельных полос (рис. 2).
Приспособление, предназначенное для проведения
анализа с использованием биочипа 2-го типа
Для проведения анализа с использованием данного биочипа было разработано специальное приспособление, конструкция которого представлена на
рис. 3.
Рис. 2. Схема биочипа 2-го типа, использованного при проведении
данного исследования. Указана специфичность антител, иммобилизованных в тестовых участках: 1 — подложка; 2 — рабочая область;
3 — края подложки; 4 — тестовые участки с иммобилизованными
антителами, нанесенные в виде полос; 5 — фоновые участки, не содержащие иммобилизованных антител
Приспособление имеет корпус, представляющий
собой пластину, в которой выполнено отверстие, соответствующее форме и размерам биочипа. К корпусу
крепится съемное дно, выполненное из прозрачного
материала и имеющее прозрачное клейкое покрытие. При креплении дна к корпусу образуется емкость, форма и размеры горизонтального сечения
которой соответствуют форме и размерам биочипа.
К съемному дну крепится биочип за счет приклеивания к клейкому покрытию. Жесткость фиксации
съемного дна к корпусу обеспечивает прижимающая
рама.
Приспособление снабжено съемной рамкой,
представляющей собой пластину, в которой выполнены сквозные отверстия (прорези) вытянутой формы, расположенные параллельно друг другу. Рамка
устанавливается на поверхность биочипа. Она разделяет емкость, в которой размещен биочип, на несколько каналов, имеющих меньшие размеры. При
этом прорези имеют на концах расширения, предназначенные для введения растворов меченых антител
с помощью шприца Гамильтона. Рамка устанавливается таким образом, что ее прорези располагаются
перпендикулярно тестовым участкам биочипа. При
этом каждый канал пересекает все тестовые участки
’2011
и объем суспензии подбирались таким образом, чтобы при оседании клеток происходило полное покрытие ими поверхности биочипа. После завершения
инкубации для устранения клеток, не связавшихся
в участках с иммобилизованными антителами, биочипы несколько раз ополаскивали PBS. Качество отмывки оценивали при помощи стереомикроскопа
МБС-1. Отмывка считалась выполненной качественно, если клетки отсутствовали в участках подложки, не содержащих иммобилизованных антител.
Далее в течение 12 минут осуществляли фиксацию
связанных клеток метанолом, после чего биочип высушивали на воздухе.
Затем биочип осторожно отделяли от дна кюветы
и размещали его на предметном стекле. Каждое пятно биочипа фотографировали с помощью цифрового
фотоаппарата через микроскоп на малом увеличении. В каждом из пятен биочипа определяли плотность связывания клеток (отношение количества
клеток, к площади поверхности участка, на котором
они связаны). Для этого на микрофотографии каждого пятна выбирали участки, соответствующие
участку подложки размерами 100  100 мкм и проводили определение количества связанных клеток не
менее чем в 3–4 таких участках. Полученные значения усредняли.
Для удобства использования полученных результатов значения плотности заполнения поверхности
пятен связавшимися клетками выражали в процентах. За 100 % принималась средняя плотность связывания клеток в области пятен с антителами антиCD45. Исходя из этого осуществлялся пересчет
в проценты плотности связывания клеток в области
других пятен. Ранее было показано [11, 12], что при
проведении инкубации биочипа с клеточной суспензией без перемешивания получаемые значения плотности связывания клеток в области тестовых
участков биочипа оказываются пропорциональны
фактическому содержанию в исследуемом образце
клеток, имеющих соответствующие антигены. При
этом плотность связывания клеток в пятне биочипа,
выраженная в процентах, численно совпадает с процентным содержанием в исследуемом образце клеток, имеющих определяемый антиген.
25
2
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ
2
’2011
26
а
г
б
д
в
е
Рис. 3. Конструкция приспособления для проведения анализа с использованием биочипа 2-го типа: а — общий вид устройства сверху с установленной рамкой; б — продольный разрез устройства с установленной рамкой; в — поперечный разрез с установленной рамкой; г — вид устройства
сверху с установленными биочипом и съемной прозрачной крышкой и снятой рамкой; д — поперечный разрез устройства с установленными биочипом и съемной прозрачной крышкой и снятой рамкой; е — биочип; 1 — корпус; 2 — отверстие, соответствующее размерам биочипа;
3 — съемное дно; 4 — емкость для размещения биочипа; 5 — биочип; 6 — прижимающая рама; 7 — прозрачная вставка; 8 — съемная рамка;
9 — каналы; 10 — корпус съемной рамки (8); 11 — герметизирующее покрытие; 12 — прорези съемной рамки (8); 13 — расширения прорезей (12)
съемной рамки (8); 14 — прижимающая пластина; 15 — пазы для крепления прижимающей пластины; 16 — отверстие прижимающей пластины; 17 — съемная крышка I; 18 — съемная крышка II; 19 — подложка биочипа; 20 — рабочая область биочипа; 21 — края биочипа; 22 — тестовые участки биочипа; 23 — фоновые участки биочипа
(полосы) биочипа. Таким образом, на дне каждого
канала располагаются фрагменты всех тестовых
участков.
Рамка фиксируется к поверхности биочипа с помощью прижимающей пластины, которая подвижно крепится в пазах, выполненных в прижимающей раме.
Приспособление снабжено двумя съемными
крышками, предназначенными для уменьшения испарения воды. Крышки несколько отличаются друг
от друга по форме. Одна из них используется при
установленной рамке с прорезями, а вторая — при
снятой рамке.
Проведение анализа с использованием биочипа 2-го
типа
Биочип закрепляли в емкости приспособления,
ополаскивали 1 % раствором BSA в буфере PBS, затем проводили 3-кратную отмывку 0,05 % раствором
детергента Tween-20 на шейкере. После этого биочип
инкубировали с 1 % раствором BSA в PBS при комнатной температуре в течение 1 часа при перемешивании на шейкере. Затем вновь проводили 3-кратную отмывку 0,05 % раствором детергента Tween-20
и ополаскивали биочип буфером для удаления следов детергента. В емкость приспособления вносили
клеточную суспензию и инкубировали в течение 60
минут без какого-либо перемешивания. Подготовка
исследуемой клеточной суспензии осуществлялась
точно так же, как и при работе с биочипами 1-го ти-
па. Концентрация клеток и объем суспензии подбирались так, чтобы при оседании клеток происходило
максимальное заполнение ими поверхности биочипа. После завершения инкубации для устранения
клеток, не связавшихся в участках с иммобилизованными антителами, биочип несколько раз ополаскивали PBS. Для этого емкость приспособления заполняли буфером, который сразу же сливали. Качество
отмывки оценивали при помощи стереомикроскопа
МБС-1. Отмывка считалась выполненной качественно, если клетки отсутствовали в участках подложки, не содержащих иммобилизованных антител.
Затем биочип в течение 10 минут инкубировали с питательной средой RPMI-1640. Это повышало прочность связывания с подложкой клеток, оставшихся
связанными с поверхностью биочипа после проведения отмывки. Затем проводили 3-кратное ополаскивание биочипа PBS. Биочип обрабатывали 1 % раствором параформальдегида в PBS, а затем трижды
ополаскивали PBS. Буферный раствор сливали, а его
капли аккуратно удаляли со стенок емкости фильтровальной бумагой.
На поверхность биочипа устанавливали съемную
рамку таким образом, чтобы ее сквозные прорези
располагались поперек тестовых участков биочипа.
В результате каждый из образующихся каналов перекрывал все тестовые участки биочипа. С помощью
шприца Гамильтона в каналы вносили растворы флуоресцентно меченых антител. При этом находящиеся
a
б
Рис. 4. Микрофотографии поверхности биочипа в области пересечения тестовых участков и каналов, в которые в процессе анализа
вносили растворы FITC-меченых антител. Рамка приспособления
снята. Микрофотографии выполнены при ультрафиолетовом освещении: а — увеличение в 50 раз; б — увеличение в 100 раз
Ранее было показано [12], что выраженные
в процентах значения плотности связывания клеток
в области тестовых участков биочипов численно
практически равны фактическому процентному содержанию в образце клеток, имеющих соответствующие антигены. Поэтому полученные значения интерпретировали как содержание клеток.
Проведение контрольного исследования методом
проточной цитофлуориметрии
Для проверки результатов исследования, выполненного с использованием биочипов 1-го и 2-го
типов, был проведен дополнительный анализ с использованием
проточной
цитофлуориметрии.
Данное исследование выполнялось на проточном
цитофлуориметре FACSCanto II (Becton Dickinson,
США) с использованием антител, специфичных
к антигенам CD3, CD4, CD5, CD8, CD16, CD19,
CD20, CD23, CD45 (Daco, США).
Результаты
С помощью разработанного приспособления
и биочипов 2-го типа были исследованы клетки здорового человека и клетки больной Ф. 52 лет, страдающей хроническим B-клеточным лимфоцитарным
лейкозом (B-ХЛЛ).
Полученные результаты представлены в табл. 1
и 2, где указано содержание клеток, имеющих поверхностные антигены, определяемые по связыванию с биочипом, а также содержание клеток, окрасившихся мечеными антителами с указанной специфичностью.
Таким образом, на клетках здорового человека
определялась коэкспрессия антигенов CD3/CD4,
CD3/CD5, CD3/CD8, CD4/CD5, CD5/CD8, CD19/
CD20, CD3/CD45, CD4/CD45, CD5/CD45, CD8/
CD45, CD16/CD45, CD19/CD45, CD20/CD45, что
соответствует норме. CD23+ клетки не были обнаружены, что также является нормой.
При исследовании клеток больной, страдающей
В-ХЛЛ, определялись все вышеуказанные варианты
коэкспрессии. Но содержание СD3+, CD4+, CD8+,
CD16+ клеток было значительно меньше, чем у здорового человека. Вместе с тем было велико содержание CD19+, CD20+ и CD23+ клеток. При этом большинство из них коэкспрессировало антиген CD5+.
Наличие коэкспрессии CD5/CD19, CD5/CD23,
CD19/CD23 характерно для клеток В-ХЛЛ.
Необходимо отметить, что на подложке биочипа были иммобилизованы антитела, специфичные
к антигенам CD5, CD16, CD19, специфичные
к этим же антигенам флуоресцентно меченые антитела также вносились в каналы устройства. Это
было необходимо для того, чтобы проверить возможное наличие перекрестной реактивности антител. В данном случае перекрестная реактивность
не была обнаружена.
’2011
в разных каналах растворы антител не могли смешиваться друг с другом. Были использованы антитела,
специфичные к антигенам CD3, CD5, CD16, CD19,
CD20, CD45 (АО «Сорбент ЛТД», Россия). Антитела
каждого вида были конъюгированы с FITC.
Инкубация с растворами антител осуществлялась
в течение 60 минут. При этом для предотвращения
испарения воды из каналов устройство помещали
в атмосферу с повышенной влажностью воздуха или
устанавливали крышку на рамку с прорезями. После
завершения инкубации удаляли жидкость из каналов, прикладывая к рамке с прорезями фильтровальную бумагу, сложенную в несколько слоев. Далее
биочип ополаскивали 1 % раствором BSA в PBS, а затем еще дважды ополаскивали только PBS. Рамку
и бортик снимали. На поверхность биочипа наносили каплю жидкости, накрывали биочип покровным
стеклом и проводили исследование его поверхности
с помощью люминесцентного микроскопа. С помощью установленной на микроскопе цифровой фотокамеры выполняли фотографирование тех участков
его поверхности, где пересекались тестовые участки
и каналы. При наличии коэкспрессии в местах пересечения отмечалась флуоресценция связанных
с биочипом клеток (рис. 4).
При изучении микрофотографий, выполненных
при обычном и ультрафиолетовом освещении, определяли общее количество клеток, связанных на
участках определенной площади (плотность связывания клеток), а также количество флуоресцирующих клеток на тех же участках. Определение общего
числа клеток и флуоресцирующих клеток осуществляли не менее чем в 3–4 участках (площадью 10 000
мкм2 каждый) в области каждого пересечения тестового участка и канала. Полученные значения усредняли. Для более удобной обработки и интерпретации
результатов полученные значения выражали в процентах. При этом за 100 % принималась средняя общая плотность связывания клеток в области тестового участка с антителами, специфичными к антигену
CD45, который присутствует на поверхности всех
типов лейкоцитов.
27
2
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ
2
’2011
28
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ
Таблица 1. Результат исследования клеток здорового человека с помощью биочипа 2-го типа
№ прорези рамки
Тестовые участки
биочипа
1
2
3
4
5
6
Дополнительно добавленные меченые антитела
№
Иммобилизованные
антитела
Анти-CD3
FITC
Анти-CD5
FITC
Анти-CD16
FITC
Анти-CD19
FITC
Анти-CD20
FITC
Анти-CD45
FITC
1
Анти-CD4
65 ± 7/65 ± 7
67 ± 5/67 ± 5
63 ± 7/0
65 ± 5/0
62 ± 5/0
68 ± 6/68 ± 6
2
Анти-CD5
74 ± 6/70 ± 3
72 ± 5/72 ± 5
70 ± 7/0
73 ± 5/0
76 ± 5/0
71 ± 5/71 ± 5
3
Анти-CD8
28 ± 5/28 ± 5
30 ± 6/29 ± 6
27 ± 6/0
29 + 4/0
26 ± 5/0
27 ± 7/27 ± 7
4
Анти-CD16
12 ± 3/0
12 ± 5/0
13 ± 4/13 ± 4
14 ± 4/0
11 ± 4/0
13 ± 5/13 ± 5
5
Анти-CD19
15 ± 4/0
16 ± 5/0
14 ± 5/0
15 ± 6/15 ± 6
14 + 4/14 ± 4
13 ± 4/13 ± 4
6
Анти-CD23
0/0
0/0
0/0
0/0
0/0
0/0
7
Анти-CD45
100/73 ± 3
100/76 ± 5
100/13 ± 5
100/16 ± 6
100/15 ± 3
100/100
Примечание (здесь и в табл. 2): выделение цветом — наличие флуоресцирующих клеток; …/… — общее содержание клеток, имеющих
антиген (%) / содержание клеток, имеющих флуоресценцию (%). Приводятся ошибки среднего.
Таблица 2. Результат исследования клеток больной В-ХЛЛ с помощью биочипа 2-го типа
№ прорези рамки
Тестовые участки
биочипа
1
2
3
4
5
6
Дополнительно добавленные меченые антитела
№
Иммобилизованные
антитела
Анти-CD3
FITC
Анти-CD5
FITC
Анти-CD16
FITC
Анти-CD19
FITC
Анти-CD20
FITC
Анти-CD45
FITC
1
Анти-CD4
10 ± 3/10 ± 3
8 ± 3/7 ± 3
9 ± 4/0
10 ± 4/0
11 ± 4/0
8 ± 4/8 ± 4
2
Анти-CD5
74 ± 4/9 ± 4
75 ± 4/75 ± 4
76 ± 3/0
72 ± 4/60 ± 7
75 ± 5/62 ± 6
71 ± 6/71 ± 6
3
Анти-CD8
10 ± 3/10 ± 3
8 ± 3/8 ± 3
9 ± 3/0
11 ± 4/0
10 ± 4/0
12 ± 4/12 ± 4
4
Анти-CD16
0/0
1,4 ± 1/0
2 ± 1/2 ± 1
1 ± 1/0
0/0
2 ± 1/2 ± 1
5
Анти-CD19
92 ± 6/0
92 ± 7/63 + 7
90 ± 5/0
91 ± 6/91 ± 6
87 ± 7/83 ± 7
89 ± 5/89 ± 5
6
Анти-CD23
74 ± 6/0
68 ± 7/65 ± 5
70 ± 5/0
72 ± 4/72 ± 4
71 ± 6/71 ± 6
72 ± 3/72 ± 3
7
Анти-CD45
100/10 ± 4
100/76 ± 6
100/2 ± 1
100/88 ± 4
100/87 ± 5
100/100
Результаты определения содержания клеток,
имеющих каждый из указанных антигенов, были сопоставлены с данными, полученными при использовании биочипов 1-го типа, и данными, полученными
методом проточной цитофлуориметрии (рис. 5, 6).
Результаты, полученные с помощью биочипов
обеих конструкций, хорошо соответствовали друг
другу. Результаты, полученные с помощью проточной цитофлуориметрии, также были близкими, несмотря на использование антител другого производителя.
При проведении исследования клеток больной
В-ХЛЛ методом проточной цитофлуориметрии
определялось высокое содержание клеток, имеющих
коэкспрессию CD5/CD19 (71 %), CD5/CD23 (70 %)
и CD19/CD23 (65 %).
Обсуждение
Представленные результаты демонстрируют возможность определения нескольких вариантов коэкспрессии при использовании антител, конъюгированных с флуорохромной меткой одного и того же
типа. В области пересечения каждого канала с тестовым участком биочипа 2-го типа на связанных клетках может быть определено наличие или отсутствие
коэкспрессии 2 антигенов при заполнении канала
раствором одного вида антител. Каждый канал пересекает все тестовые участки биочипа, поэтому сразу
определяется наличие или отсутствие коэкспрессии
нескольких пар антигенов.
Возможно заполнение одного и того же канала
раствором, содержащим несколько видов антител
с разной специфичностью, меченных разными метками. Также могут быть значительно увеличены ко-
а
CD3
CD4
CD5
CD8
CD16
CD19
CD20
CD23
CD45
Содержание клеток (%)
Антиген
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
б
CD3
CD4
CD5
CD8
CD16
CD19
CD20
CD23
CD45
Антиген
Содержание клеток (%)
Рис. 5. Результаты исследования клеток здорового человека, полученные: а – при использовании биочипа 1-го типа; б – методом проточной цитофлуориметрии
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
а
CD3
CD4
CD5
CD8
CD16
CD19
CD20
CD23
CD45
Содержание клеток (%)
Антиген
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
б
CD3
CD4
CD5
CD8
CD16
CD19
CD20
CD23
CD45
Антиген
Рис. 6. Результаты исследования клеток больной В-ХЛЛ, полученные: а — при использовании биочипа 1-го типа; б — методом проточной цитофлуориметрии
личество каналов рамки и количество тестовых
участков (полос) биочипа 2-го типа. Таким образом,
при использовании данного подхода в дальнейшем
можно будет одновременно определять наличие или
отсутствие коэкспрессии нескольких антигенов на
каждой отдельно взятой клетке и десятки или сотни
различных вариантов коэкспрессии антигенов на
разных клетках.
При использовании существующего экспериментального образца приспособления в каждый канал требовалось вносить не менее 5 мкл раствора меченых антител. Это достаточно много, но данный
объем можно будет значительно уменьшить при изменении конструкции некоторых элементов приспособления. Безусловно, проведение анализа описанным
способом является достаточно трудоемким. Но в дальнейшем возможна его полная или частичная автоматизация. Поэтому представленное здесь приспособление, предназначенное для работы с биочипом
2-го типа, необходимо рассматривать как прототип
для последующего создания более совершенных
конструкций.
Необходимо отметить, что достаточно похожая
с технической точки зрения идея используется в технологии, известной как метод микропроточных сетей
(microfluidic network — μFN). Но ее применение сводится к технологии изготовления биочипов и способу
приведения их поверхности в контакт с исследуемой
жидкостью. О работах, в которых подобный подход
использовался бы для определения коэкспрессии антигенов клеток, нам ничего не известно.
Необходимо отметить, что идея определения
множества вариантов коэкспрессии антигенов на
одном биочипе может быть реализована не только
при использовании описанного выше технического
решения, когда применяется комбинация биочипа
(одноразового использования), представленного на
рис. 2, и инкубационно-отмывочного приспособления (многоразового использования), представленного на рис. 3. Возможно также применение биочипа
(патент на полезную модель RU 92964) одноразового
использования, содержащего в своей конструкции
все основные элементы описанного выше приспособления. Экономически более оправдано применение
одноразового биочипа и многоразового инкубационно-отмывочного устройства, которые описаны в этой
статье. Но после каждого использования будет необходима стерилизация данного устройства. Поэтому
выбор того или иного из вариантов должен быть обусловлен практической целесообразностью и соображениями безопасности при проведении конкретного
исследования.
При возможности определения даже несколько
большего количества антигенов на разных клетках
(по факту связывания клеток в тестовых участках)
биочип 1-го типа имел значительно меньшие размеры. Поэтому для проведения исследования требовалось меньшее количество клеточной суспензии. Но
использование биочипов 2-го типа давало преимущества, описанные выше. Поэтому выбор конструкции используемых биочипов должен зависеть от
условий, необходимых для решения тех или иных
диагностических или исследовательских задач.
’2011
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
29
2
Содержание клеток (%)
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ
2
’2011
30
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ПРАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ
Описанный способ проведения анализа намного
превосходит по своим возможностям общепринятые
методы иммунофлуоресцентного исследования клеток [13, 14]. Но по сравнению с проточной цитофлуориметрией он требует большего расхода клеточной суспензии. Кроме того, данный способ будет заведомо
проигрывать ей в точности при определении содержания очень малых иммунологических субпопуляций клеток. Поэтому в существующем виде и при использовании описанной методики данная разработка
не может быть использована для решения, например, таких задач, как выявление минимальной остаточной болезни или определение концентрации
в крови стволовых клеток.
Однако ее применение позволяет проводить анализ без дорогостоящего проточного цитофлуориметра с использованием гораздо более дешевого люминесцентного микроскопа. При этом возможно одновременное определение большего числа вариантов
коэкспрессии антигенов при использовании такого
же набора меченых антител.
Помимо определения коэкспрессии антигенов
подобный подход в дальнейшем может быть использован и для выполнения других типов комбинированных исследований связавшихся клеток, требующих приведения различных участков поверхности
биочипа в контакт с малыми объемами растворов
различных реагентов или красителей без их смешивания друг с другом. Поэтому дальнейшее развитие
данного направления представляется нам перспективным.
Выводы
1. Биочип 2-го типа в сочетании с разработанным приспособлением позволяет проводить определение нескольких вариантов коэкспрессии с использованием антител, конъюгированных с одинаковой
флуоресцентной меткой.
2. Результаты анализа, выполненного с применением биочипов 1-го и 2-го типа, сопоставимы друг
с другом и результатами проточной цитофлуориметрии.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Chang T.W. Binding of cells of distinct
antibodies coated on solid surface. Journal Of
Immunological Methods 1983;65:217–23.
2. Belov L., de la Vega O., dos Remedios C.G.,
Mulligan S.P., Christopherson R.I.
Immunophenotyping of leukemias using a
cluster of differentiation antibody microarray.
Cancer research 2001;61:4483–9.
3. Belov L., Huang P., Barber N.,
Mulligan S.P., Christopherson R.I.
Identification of repertoires of surface antigens
on leukemias using an antibody microarray.
Proteomics 2003;3:2147–54.
4. Belov L., Huang P., Chrisp J.S.,
Mulligan S.P., Christopherson R.I. Screening
microarrays of novel monoclonal antibodies
for binding to T-, B- and myeloid leukaemia
cells B. Journal of Immunological Methods
2005;305:10–9.
5. White S.L., Belov L., Barber N.,
Hodgkin P.D., Christopherson R.I.,
Immunophenotypic changes induced on
human HL60 leukaemia cells by la,25-
dihydroxyvitamin D3 and 12-O-tetradecanoyl
phorbol-13-acetate. Leukemia Research
2005;29:1141–51.
6. Campbell C.J., O'Looney N., Chong
Kwan M., Robb J.S., Ross A.J., Beattie J.S.,
Petrik J. & Ghazal P. A cell interaction
microarray for blood phenotyping. Anal Chem
2006;78:1930–8.
7. Ellmark P., Belov L., Huang P.,
Soon Lee С., Solomon M.J., Morgan D.K.,
Christopherson R.I. Multiplex detection
of surface molecules on colorectal cancers.
Proteomics 2006;6:1791–802.
8. Woolfson A., Stebbing J., Tom B.,
Stoner D.M., Gilks W.R., Kreil D.P.,
Mulligan S.P., Belov L., Chrisp J.S.,
Errington W., Wildfire A., Erber W.N.,
Bower M., Gazzard B., Christopherson R.I.,
Scott M.A. Conservation of unique cellsurface CD antigen mosaics in HIV-1-infected
individuals. Blood 2005;106(3):1003–7.
9. Liu A.Y. Differential Expression of Cell
Surface Molecules in Prostate Cancer Cells.
Cancer Research 2000;60:3429–34.
10. Ko I.K., Kato K. & Iwata H. Antibody
microarray for correlating cell phenotype with
surface marker. Biomaterials 2005;26:687–96.
11. Шишкин А.В., Шмырев И.И.,
Кузнецова С.А., Овчинина Н.Г., Бутылин
А.А., Атауллаханов Ф.И., Воробьев А.И.
Иммунологические биочипы для параллельного определения поверхностных антигенов
и морфологического исследования клеток.
Биологические мембраны 2008;4:277–84.
12. Шишкин А.В. Иммунологические биочипы для исследования клеток. Собственный опыт разработки. Некоторые новые подходы к проведению анализа. LAP
Lambert Academic Publishing & Co. KG-2010.
158 с. ISBN 978-3-8433-0053-7.
13. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Под редакцией С. Херингтона
и Дж. Макги. М.: Мир, 1999.
14. Саркисов Д.С., Петров Д.С. Микроскопическая техника. М.: Медицина, 1996.
544 с.
31
2
’2011
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
Материалы
VII Российского симпозиума
«Биологические основы терапии онкологических
и гематологических заболеваний»
Москва, 1–4 июня 2011 г.
2
’2011
32
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
ОТ РЕДАКЦИИ / FROM EDITION
Уважаемые читатели!
Редакция журнала «Онкогематология» выражает благодарность всем авторам тезисов, присланных участниками Российского симпозиума «Биологические основы терапии онкологических и гематологических заболеваний», которые посвящены широкому кругу теоретических и практических проблем современной медицинской науки. Мы были рады предоставить страницы журнала
молодым исследователям и маститым ученым, так как, на наш взгляд, эта информация отражает
большие потенциальные возможности научного сообщества из многих регионов и позволяет надеяться на дальнейшее развитие исследовательских программ, появление новых имен и серьезных научных достижений.
Экспертная комиссия провела обсуждение присланных в редакцию материалов и сочла возможным отклонить ряд работ, в основном по причине их вторичности.
Считаем, что возможность представить результаты своих исследований на суд широкой профессиональной аудитории дает молодым ученым стимул к дальнейшему развитию и заставляет строже
оценивать значимость и качество своего труда.
Желаем успехов участникам симпозиума.
Редакция журнала «Онкогематология»
Ю.В. Аверьянова1, Е.В. Райкина2, В.О. Бобрынина2,
А.Э. Степанов1, Г.И. Волкова1, Ю.Н. Иванова1,
С.П. Макаров1
1
ФГУ Российская детская клиническая больница
Минздравсоцразвития России;
2
ФГУ Федеральный научно-клинический центр
детской гематологии, онкологии и иммунологии
Минздравсоцразвития России, Москва
Этиология и патогенез билиарной атрезии (БА)
до конца не изучены. В настоящее время наиболее
убедительной кажется теория генетически детерминированного и вирус-ассоциированного пускового
механизма иммуноопосредованной фиброоблитерации желчных протоков.
Цель работы. Исследование группы больных
с БА на наличие гепатотропных герпесвирусов и анализ распространенности вирусной инфекции.
Материалы и методы исследования. С 2004 по
2009 г. было обследовано 52 ребенка с БА в возрасте
от 3 недель до 4,5 месяцев. ДНК цитомегаловируса
(CMV), вируса Эпштейна–Барр (EBV) и вируса простого герпеса 6-го типа (HHV-6) определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Выделение ДНК, качественное
и количественное определение вирусов проводили
коммерческими наборами реагентов фирмы ИнтерЛабСервис, Россия. Для амплификации и определения продуктов ПЦР использовали приборы «RotorGene 6000», Corbett Research, Австралия.
Материалом исследования служили кровь, слюна, моча, биоптат печени пациентов, а с 2007 г. —
грудное молоко матерей детей с БА, находящихся на
грудном вскармливании. Количественный мониторинг CMV и EBV проводили только в образцах крови
и грудном молоке. Положительным результатом считали наличие более 500 копий вируса в 1 мл биологической жидкости.
Результаты. При анализе полученных результатов обнаружено, что EBV и HHV-6 в крови выявлены
только у 3,8 % (2) и 1,9 % (1) больных соответственно.
В биоптате печени EBV и HHV-6 определены у 1,9 %
(1) больных. ДНК CMV присутствовала во всех биологических образцах у 54 % (28) детей.
В 73 % (38) случаев выявлена CMV-инфекция
в стадии репликации с титром от 500 до 30 000 копий
вируса в 1 мл крови. Из них у 58 % (22) ДНК CMV
также обнаружена и в биоптате печени.
Выводы. Наше исследование показало, что в половине случаев у пациентов с БА во всех биологических образцах выявляли CMV. При большом титре
CMV в грудном молоке вопрос о прекращении грудного вскармливания решался индивидуально. На
этапе эмбриогенеза CMV может служить основным
фактором, приводящим к запуску цепи патологических реакций и формированию врожденных дефектов, связанных с данным заболеванием.
По нашим данным, клинически значимым является определение CMV в крови и биоптате печени,
что позволяет своевременно провести специфическую терапию. Эрадикация вируса и адекватное
лечение CMV-гепатита у больных с БА оказывают
существенное влияние на благоприятный исход заболевания. Выявление CMV в образцах слюны и мочи у пациентов с БА клинически не оправданно, поскольку латентное течение CMV-инфекции не имеет
прогностического значения и не требует какоголибо лечения.
Пространственный рост фибринового
сгустка как новый метод диагностики
кровоточивости и тромбозов
Ф.И. Атауллаханов1,2, А.Н. Баландина1,2,
М.А. Пантелеев1,2, В.М. Емельяненко1, Г.М. Галстян1,
К.Г. Копылов1, М.А. Кумскова1, С.С. Карамзин1,
О.А. Фадеева1, Н.С. Сошитова2, Е.Н. Липец1,
И.Д. Тарандовский2, И.А. Щербина1
1
ФГБУ Гематологический научный центр
Минздравсоцразвития России;
2
Центр теоретических проблем физико-химической
фармакологии РАН, Москва
Введение. Болезни системы кровообращения — ведущая причина смертности населения в России. Часто
непосредственной причиной смерти при этом является
нарушение в работе системы свертывания — кровотечение и тромбоз. Поэтому своевременная диагностика
и мониторинг состояния пациентов с риском таких нарушений представляют собой одну из актуальных задач
современной медицины. Важным аспектом свертывания крови в организме служит его пространственная
неоднородность. Свертывание активируется в месте
повреждения от экспрессирующих тканевый фактор
клеток. Далее сгусток распространяется от места активации вглубь сосуда, образуя объемную структуру, закрывающую место повреждения. Однако до сих пор
применяемые в клинической практике тесты для оценки статуса системы свертывания предполагают полное
перемешивание образца крови/плазмы с активатором
свертывания. Такие тесты не в состоянии корректно
оценить работу системы гемостаза.
Цель данной работы — исследовать возможности
метода регистрации пространственного роста сгустка в клинической практике и оценить его предсказательную силу.
Материалы и методы. В исследовании участвовали
пациенты с различными нарушениями свертывания,
включая патологии как с риском тромбоза (сепсис, онкогематологические заболевания, сердечно-сосудис-
’2011
Распространенность CMV-инфекции
у детей с билиарной атрезией
33
2
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
2
’2011
34
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
тые заболевания), так и с риском кровотечения (гемофилии А и Б). Свертывание крови оценивали стандартными методами (активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновый индекс,
Д-димеры, тромбоэластография) и с помощью прибора Тромбоимиджер, который позволяет регистрировать формирование и рост фибринового сгустка от поверхности с иммобилизованным тканевым фактором
в тонком неперемешиваемом слое свободной от тромбоцитов плазмы. Регистрация производится оптическим методом, по сигналу светорассеяния. Основным
параметром данного анализа является скорость распространения сгустка от активирующей поверхности.
Результаты. У части пациентов с рисками тромбоза
образование сгустка от активирующей поверхности сопровождается сгустками, формирующимися вдали от
места активации в виде спонтанных центров роста. На
примере пациентов с сепсисом (N = 18), химиотерапией при онкогематологических заболеваниях (N = 36)
и сердечно-сосудистыми заболеваниями (N = 90) показано, что степень спонтанного свертывания коррелирует с тяжестью заболевания и риском тромботических
осложнений. Так, появление гиперкоагуляции на одни
сутки предшествует увеличению уровня Д-димеров
в 80 % случаев (N = 6), при этом не было случая, чтобы
пространственный рост сгустка не показал гиперкоагуляцию при увеличении уровня Д-димеров. Это свидетельствует о хорошей предсказательной силе метода
пространственного роста сгустка. В 2 случаях переход
системы свертывания в состояние гиперкоагуляции
сопровождался тромбозом и тромбоэмболией. Во всех
вариантах гиперкоагуляции и риска тромбоза стандартные коагулологические тесты показывают существенно меньшую чувствительность к тромботическим
осложнениям, а в некоторых случаях показывают нормокоагуляцию. Скорость роста сгустка у пациентов
с гемофилией существенно снижена и коррелирует
с тяжестью заболевания и частотой кровотечений
(N = 9). При этом уровень фактора VIII не отражает тяжести течения гемофилии и эффективность терапии
у данных пациентов. Также метод пространственного
роста сгустка имеет высокую чувствительность к корректирующей плазменный гемостаз терапии.
Выводы. Данные проведенного исследования демонстрируют, что учет пространственной неоднородности при формировании сгустка представляет
перспективный метод оценки гемостаза у пациентов
с широким спектром заболеваний, связанных с патологиями системы свертывания.
Работа была частично поддержана грантом Президента РФ для молодых кандидатов наук MK155.2010.4 и грантами РФФИ 09-04-00232, 09-0400357, 09-04-92427, 09-02-00018.
Определение клинически значимых
параметров цитомегаловирусной
инфекции у реципиентов
гемопоэтических стволовых клеток
И.М. Бархатов, В.Н. Вавилов, А.В. Акимова,
И.С. Соломонова, Л.С. Зубаровская, Б.В. Афанасьев
Институт детской гематологии и трансплантологии
им. Р.М. Горбачевой ГОУ ВПО Санкт-Петербургский
государственный медицинский университет
им. акад. И.П. Павлова
Среди патогенов, вызывающих инфекционные
осложнения у пациентов после трансплантации
гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), одно из
важнейших мест в структуре посттрансплантационной заболеваемости и смертности занимают осложнения, обусловленные цитомегаловирусом (ЦМВ).
В то же время, в силу широкого спектра побочных
действий противовирусных препаратов является актуальным подбор адекватной стратегии терапии как
в зависимости от вирусной нагрузки, так и от серологического статуса донора и реципиента, что может
быть достигнуто на основе мониторинга ЦМВинфекции (ЦМВИ) методом ПЦР.
Целью нашего исследования — определение клинически значимых параметров ЦМВИ с помощью
измерения уровней и динамики вирусной нагрузки
(ВН) методом количественной ПЦР в реальном времени для выбора оптимальных схем противовирусного лечения и профилактики.
Материалы и методы. В ходе работы были проанализированы образцы крови и костного мозга 96 пациентов, перенесших аллогенную ТГСК (59 HLAсовместимых неродственных, 32 родственных и 7 от гаплоидентичных
доноров).
Немиелоаблативные
режимы кондиционирования применялись в 61, миелоаблативные — в 35 случаях. Все пациенты, трансплантированные от неродственного или гаплоидентичного донора, получали антитимоцитарный
глобулин (АТГ). Проводилось определение ВН в ликворе и плазме крови (с определением количества копий вируса на 1 мл материала), а также в образцах костного мозга (с нормализацией копий ДНК ЦМВ на 106
ядросодержащих клеток) с использованием тестсистем АмплиСенс CMV-монитор или АмплиСенс
CMV-скрин-титр (ИнтерЛабСервис, Россия).
Результаты. Реактивация ЦМВИ наблюдалась у пациентов в 85 % случаев в раннем и в 15 % случаев —
в позднем посттрансплантационном периоде. Реактивация не зависела от интенсивности режимов кондиционирования, но была существенно выше
у пациентов, перенесших неродственную аллогенную
трансплантацию по сравнению с трансплантацией от
родственного донора (75 % и 40 % соответственно).
Профилактика реакции «трансплантат против хозяи-
Опыт определения доли мутантного
аллеля JAK2V617F
в клинической практике
О.В. Бердюгина
ГУЗ Свердловская областная клиническая больница № 1,
Екатеринбург
Связь уровня аллельной нагрузки с неблагоприятным течением хронических миелопролиферативных заболеваний — хМПЗ (истинной полицитемии,
идиопатической тромбоцитемии и идиопатического
миелофиброза) была обнаружена разными авторами
и в настоящее время является общепризнанным
фактом. В научной литературе встречаются единичные упоминания о наличии мутации JAK2V617F
у больных с острым мегакариобластным лейкозом,
хроническим
миеломоноцитарным
лейкозом,
острым и хроническим миелолейкозом, миелодиспластическим синдромом, а также в единичных случаях при B-клеточном остром лейкозе с болезнью
Дауна.
Цель данной работы — определение диагностического значения выявления мутации JAK2V617F
у больных с признаками поражения миелоидного
ростка кроветворения.
Лабораторное исследование проведено у 43 пациентов: 46,5 % от общего числа (20 человек) составляли
мужчины, средний возраст которых был 58 ± 18 лет
(среднее ± среднее квадратичное отклонение); 53,5 %
от числа обследованных составляли женщины (23
больных) со средним возрастом 65 ± 12 лет. Кровь из
периферической вены забирали в пробирку с антикоагулянтом (ЭДТА). Наличие точечного полиморфизма
определяли методом полимеразной цепной реакции
в TaqMan-варианте с детекцией в режиме реального
времени (амплификатор Rotor Gene, Cobbett Research)
с использованием реагентов MutaQuant, Ipsogen,
Франция. Количественное определение мутантного
аллеля V617F в гене JAK2 выражалось в процентах по
отношению к дикому типу.
Использование аллель-специфических праймеров,
способных различить мутантные варианты исследованного полиморфизма в гене JAK2, позволило установить следующее. У мужчин распределение аллельной
нагрузки было следующим: при МПЗ JAK2V617F встречался у 12,5 % больных мужчин, при хМПЗ — у 57 %;
у женщин при МПЗ — в 42,8 %, при хМПЗ — у 75 %.
Выявлено по одному случаю наличия JAK2V617F
у мужчин и у женщин при хроническом миелолейкозе.
Определение точечной мутации JAK2V617F при лимфоме показало величину аллельной нагрузки 0,001 %,
что подтверждает ранее опубликованные данные. Единичные параллельные исследования на наличие мутации JAK2V617F в периферической крови и костном
мозге показали их согласованность. Разница в величине аллельной нагрузки составила менее 1,5 %. Изучение аллельной нагрузки в контрольной группе (здоровые доноры) показало, что в норме данная величина
варьирует в пределах 0,7 ± 0,2 %.
Таким образом, использование методов молекулярной диагностики точечной мутации JAK2V617F
позволяет верно определять даже незначительное
увеличение аллельной нагрузки у пациента, что может быть использовано для определения минимальной остаточной болезни.
Индукция иммунной толерантности
у детей с ингибиторной формой
гемофилии А
В.В. Вдовин1, П.В. Свирин1,2, Е.Э. Шиллер1,
Э.В. Агеенкова1, Е.К. Донюш1, Л.Е. Ларина1,
Е.Н. Лучинкина1, О.В. Малкова1, В.Ю. Петров1,
Г.И. Сосков1, Е.А. Яценко1
1
Измайловская детская городская клиническая
больница № 3; 2ФГУ Федеральный научно-клинический центр
детской гематологии, онкологии и иммунологии
Минздравсоцразвития России, Москва
По современным данным, наиболее эффективным
способом лечения ингибиторной формы гемофилии A является индукция иммунной толерантности
(ИИТ) по Боннскому протоколу с использованием
’2011
на» с использованием АТГ ассоциировалась с увеличенным риском реактивации — 70 % с АТГ по сравнению с 34 % без АТГ. Частота реактивации ЦМВИ в серонегативных парах была существенно ниже (18 %) по
сравнению с трансплантациями, где донор или реципиент имели специфические антитела. Копийность
ЦМВ в плазме находилась в прямой корреляционной
зависимости от количества копий вирусной ДНК, нормализованной на 106 клеток костного мозга (p < 0,01).
Только у 2 пациентов определялся низкий титр ДНК
ЦМВ (до 103) в костном мозге на фоне неопределяемой
ВН в плазме.
Результаты исследований позволили сформулировать следующие выводы:
1. Анализ плазмы не менее информативен по
сравнению с исследованием костного мозга и показан при мониторинге инфекции в период цитопении.
2. Поздняя реактивация ЦМВИ происходит значительно реже, чем ранняя.
3. Высокий уровень ВН чаще всего отмечается
после неродственной ТГСК, миелоаблативного режима кондиционирования, при комбинации серологического статуса реципиент/донор +/–.
4. Мониторинг развития инфекции позволяет
оптимально подбирать схемы противовирусного лечения.
35
2
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
2
’2011
36
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
концентратов фактора VIII, содержащих фактор
Виллебранда.
Мы наблюдали 25 детей из Москвы и Московской
области с ингибиторной формой гемофилии A. Из них
на ИИТ по Боннскому протоколу были взяты 17 пациентов. К настоящему моменту курс ИИТ закончен у 8
больных с высокореагирующим ингибитором: 2 пациента прекратили терапию в связи с отсутствием
эффекта, 1 пациент после получения хорошего ответа
прекратил лечение в связи с несоблюдением режима
терапии. У этого пациента сохраняется значительно
сокращенное время полувыведения и снижен тест восстановления, однако имеется хороший клинический
эффект на фоне получаемой им профилактической терапии. У 5 пациентов ИИТ была полностью успешна,
и они переведены на высокодозную профилактику.
Медиана времени от начала ИИТ до того момента, когда ингибитор перестал определяться прямым методом,
у этих пациентов составила 78 дней (14–194). Медиана
длительности ИИТ составила 1075 дней (1009–1299).
На курс лечения пациентам понадобилось 144362,6 ±
24040,7 МЕ/кг.
Выявление поражения костного мозга
у больных нейробластомой
с использованием молекулярных
маркеров
А.Е. Друй1,2, Г.А. Цаур1,2, А.М. Попов 1,2,
Е.В. Шориков1,2, Л.И. Савельев3, Л.Г. Фечина1,2
1
Областная детская клиническая больница № 1;
Институт медицинских клеточных технологий;
3
ГОУ ВПО Уральская государственная медицинская
академия, Екатеринбург
2
Цель исследования — оценка возможности использования экспрессии генов TH, GD2 и ELAVL4
для оценки поражения костного мозга (КМ) у пациентов с нейробластомой в сравнении с геном
PHOX2B.
Методы. Мы проанализировали экспрессию молекулярных маркеров методом ПЦР в реальном
времени в 331 образце КМ от 57 больных нейробластомой и 26 образцах КМ пациентов без злокачественных опухолей.
Результаты. Экспрессия PHOX2B и TH в нормальном КМ не была выявлена, экспрессия ELAVL4
определялась в 20, а GD2 — в 15 из 26 образцов КМ
пациентов без злокачественных новообразований.
Как истинно позитивные на основании обнаружения опухолевых клеток в цитологических препаратах
КМ или экспрессии гена PHOX2B были расценены
107 образцов КМ больных нейробластомой. Из этого
числа ген PHOX2B был экспрессирован в 105 образцах, TH — в 96, ELAVL4 и GD2 — в 107 образцах. Экс-
прессия гена TH была выявлена в 5 из 224 негативных образцов, ELAVL4 — в 209, GD2 — в 197. Экспрессия ТН в позитивных образцах была выше, чем
в негативных, а экспрессия GD2 и ELAVL4 в позитивных образцах была достоверно выше экспрессии
этих маркеров как в негативных, так и в контрольных образцах. Экспрессия РНОХ2В, ТН и GD2 оставалась стабильной во время терапии нейробластомы,
а экспрессия ELAVL4 — снижалась. С помощью
ROC-анализа выявлена сходная диагностическая
информативность PHOX2B и TH. Определение экспрессии генов PHOX2B и TH характеризовалось высокими значениями прогностической ценности положительного (1,000 и 0,950) и отрицательного (0,991
и 0,952) результатов, а также диагностической эффективности теста (ДЭТ, 0,994 и 0,952 соответственно). Сочетанное применение PHOX2B и TH не имело
преимуществ перед использованием только PHOX2B
(ДЭТ = 0,985). Значения ДЭТ генов GD2 и ELAVL4
были относительно низкими (0,828 и 0,767) в силу
невысоких значений диагностической чувствительности (0,589 и 0,467). Конвергентность между данными цитологического исследования и определения
экспрессии PHOX2B составила 80,1 %, TH — 80,3 %.
Экспрессия данных генов была выявлена в 4 случаях
локализованной нейробластомы: у 2 пациентов
с I стадией, и 2 — с III. В силу малого количества наблюдений не удалось выявить прогностического значения PHOX2B и TH в случаях нейробластомы, в которых по данным цитологии опухолевые клетки
в КМ не выявлялись.
Использование экспрессии генов NKX2,
STEAP1 и CCND1 для оценки поражения
костного мозга у пациентов
с опухолями семейства саркомы
Юинга
А.Е. Друй1,2, Г.А. Цаур1,2, А.М. Попов1,2,
Е.В. Шориков1,2, Л.И. Савельев3, Л.Г. Фечина1,2
1
Областная детская клиническая больница № 1;
2
Институт медицинских клеточных технологий;
3
ГОУ ВПО Уральская государственная медицинская
академия, Екатеринбург
Опухоли семейства саркомы Юинга у детей характеризуются агрессивным течением и ранним появлением отдаленных метастазов. Наиболее частыми
объектами метастазирования являются легкие, кости
скелета, костный мозг (КМ).
Цель исследования — оценка возможности использования экспрессии генов NKX2, STEAP1
и CCND1 для оценки поражения КМ у пациентов
с саркомой Юинга и примитивными нейроэктодермальными опухолями.
Цитотоксическая активность
водорастворимых порфирин-фуллеренов и аминоспиртов в отношении
лейкемических клеток in vitro
М.В. Ефименко, Н.А. Хрипкова, Е.Ю. Осипова,
С.А. Румянцев
ФГУ Федеральный научно-клинический центр
детской гематологии, онкологии и иммунологии
Минздравсоцразвития России, Москва
Совершенствование химиотерапии идет по пути
повышения эффективности и снижения токсичности
химиопрепаратов. Препараты на основе водорастворимых порфирин-фуллеренов (ВПФ) обладают способностью селективно связываться с мембраной лейкемических клеток (ЛК) и таким образом могут проявлять
селективную противолейкемическую активность. Препараты на основе аминоспиртов (АС) способны проявлять прямое цитотоксическое действие на раковые
клетки in vitro.
Цель работы. Оценить чувствительность ЛК
и нормальных клеток крови и костного мозга (КМ)
к препаратам на основе ВПФ и АС in vitro.
Материалы и методы. В исследовании были использованы ЛК, выделенные из образцов КМ пациентов в возрасте от 10 мес до 16 лет с впервые диагностированными нелечеными ОЛЛ — 25 образцов.
В качестве контрольной группы использовались мононуклеарные клетки, выделенные из крови здоровых доноров в возрасте от 20 до 25 лет (n = 7). Объектом исследования являлись 3 химиопрепарата на
основе ВПФ (PMC16 в комплексе с ионами Co, 24Mg
и 25Mg) и 2 производных АС (In445 и In449). Чувствительность клеток оценивалась с помощью МТТтеста. Определяли полулетальные концентрации
препаратов (LC50) и сравнивали цитотоксическую
активность на ЛК КМ и мононуклеарные клетки
крови здоровых доноров.
Результаты. Были получены статистически достоверные различия между чувствительностью ЛК КМ
и нормальных лимфоцитов крови к препаратам
PMC16(Co), PMC16(25Mg) и к препаратам In445
и In449; медианы LC50 составляют 0,44 мг/мл; 33,43
мг/мл; 52,9 мкг/мл и 57,9 мкг/мл соответственно.
Препарат PMC16(24Mg) также проявляет цитотоксическую активность в отношении ЛК (медиана LC50 —
3,79 мг/мл). Однако не было получено статистически
значимых различий LC50 этого препарата для ЛК
и нормальных клеток крови. Наибольшей цитотоксической активностью из группы ВПФ обладает препарат PMC16(Co). Производные АС обладают примерно одинаковой цитотоксичностью на ЛК КМ.
Выводы. Препараты ВПФ и АС проявляют селективную цитотоксическую активность в отношении
’2011
Методы. Нами была проанализирована экспрессия молекулярных маркеров методом ПЦР в реальном времени в 59 образцах КМ больных и 8 образцах
КМ здоровых пациентов без злокачественных опухолей.
Результаты. Экспрессия NKX2 в нормальном
КМ не была выявлена, а экспрессия STEAP1
и CCND1 определялась в 8 образцах КМ пациентов
без злокачественных новообразований. Как истинно позитивные на основании обнаружения опухолевых клеток в цитологических препаратах КМ или
химерного транскрипта (EWS1-FLI или EWS1ERG) методом гнездной ПЦР были расценены 17
образцов КМ больных. Из этого числа ген NKX2
был экспрессирован в 16 образцах, STEAP1
и CCND1 — в 17 образцах. В 2 негативных образцах
определялась мРНК гена NKX2, а экспрессия
STEAP1 и CCND1 была выявлена во всех 42 негативных образцах. С помощью ROC-анализа выявлена
наибольшая диагностическая информативность
определения экспрессии NKX2. Были получены высокие значения прогностической ценности положительного (0,889), отрицательного (0,976) результатов, диагностической чувствительности (0,941),
специфичности (0,952), а также диагностической
эффективности теста (ДЭТ = 0,949). Значения ДЭТ
генов STEAP1 и CCND1 были низкими (0,695
и 0,763), при этом диагностическая чувствительность составила 0,824 и 0,588, а специфичность —
0,643 и 0,833 соответственно. Единственный позитивный образец КМ, в котором отсутствовала экспрессия гена NKX2, был получен в момент первичной диагностики. Опухолевые клетки в нем не были
выявлены цитологически, но обнаруживался химерный транскрипт EWS1-FLI. При этом в одновременно взятых образцах КМ из двух других локализаций определялась экспрессия и NKX2,
и EWS1-FLI, а цитологически они были негативны.
Таким образом, NKX2 имеет наилучшие диагностические характеристики при выявлении поражения
КМ у пациентов с опухолями семейства саркомы
Юинга, как на момент диагностики, так и в ходе терапии. STEAP1 и CCND1 имеют достоверно более
низкие диагностические характеристики и их применение для оценки поражения КМ нецелесообразно.
37
2
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
лейкемических клеток in vitro и являются перспективными для дальнейшего изучения в качестве противолейкемических средств.
2
’2011
38
Применение рекомбинантного
человеческого эритропоэтина
для лечения анемии при туберкулезе
легких (пилотное исследование)
Н.В. Инякова1, В.Г. Демихов1, Е.Н. Долженко2,
Т.А. Кокунова2, Т.Ю. Мисюрева2, Е.Ф. Морщакова1
1
Рязанский филиал ФГУ Федеральный научноклинический центр детской гематологии, онкологии
и иммунологии Минздравсоцразвития России;
2
Рязанский областной клинический
противотуберкулезный диспансер
Цель исследования — оценить эффективность терапии анемий у пациентов с туберкулезом легких
(ТБ) рекомбинантным человеческим эритропоэтином (рч-ЭПО).
Материалы и методы. В исследование вошли 13
взрослых пациентов с ТБ легких и анемией (9 мужчин и 4 женщины), в возрасте 22–78 (40,46 ± 4,45)
лет. Средний уровень Hb до начала лечения составил
83,23 ± 2,30 г/л. Для коррекции анемии мы использовали рч-ЭПО (эпоэтин-альфа). Путь введения рчЭПО у 8 пациентов был подкожный и у 5 пациентов
внутривенный. Подкожно рч-ЭПО вводили 3 раза
в неделю в течение 3–6 недель в стартовой разовой
дозе 200 МЕ/кг. При отсутствии полного терапевтического ответа через 2 недели лечения, определяемого как повышение уровня гемоглобина (Hb) на
5–7 г/л от исходного, отсутствии трансфузий эритроцитарной массы, разовая доза препарата увеличивалась до 300 МЕ/кг. Внутривенно рч-ЭПО вводили 1 раз в неделю в дозе 600 МЕ/кг. При достижении
целевого уровня Hb 115–120 г/л введение препарата
прекращали. Дополнительно всем пациентам назначали 200 мг сульфата железа (Fe2+) в сутки перорально (Сорбифер дурулес). При неэффективности
терапии в течение 2 недель в группе с внутривенным
введением рч-ЭПО и наличием у пациента анемии,
определяемой как ЖДА, пероральный препарат железа заменялся на железа (III)-гидроксид сахарозный комплекс (Венофер).
Результаты. У 10 (76,9 %) из 13 больных ТБ на
фоне лечения рч-ЭПО было отмечено достоверное
повышение уровня Hb. В группе пациентов с подкожным введением рч-ЭПО 6 (75 %) из 8 человек ответили на терапию. В группе больных с внутривенным
введением рч-ЭПО у 4 (80 %) из 5 пациентов отмечалась положительная динамика. У пациентов, ответивших на терапию, средний недельный прирост Hb
составил 6,62 ± 0,88 г/л. Максимальный средний
уровень ретикулоцитов составил 2,91 ± 0,42 % и от-
мечался на 2-й неделе рч-ЭПО-терапии. У 3 пациентов повышение уровня Hb на фоне лечения рч-ЭПО
не отмечалось, однако увеличение количества ретикулоцитов на 2-й неделе терапии (ретикулоцитарный криз) наблюдалось у всех пациентов. Побочных
эффектов на фоне лечения выявлено не было.
Выводы. Отмеченное повышение уровня Hb у 10 из
13 пациентов с ТБ свидетельствует о высокой эффективности рч-ЭПО в терапии анемий у пациентов с ТБ.
Эффективность высокодозной
терапии с аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых
клеток у детей с саркомой Юинга / PNET
И.В. Казанцев1, Т.В. Юхта2, А.Ю. Зинченко1,
А.Г. Геворгян1, Е.В. Морозова1, С.А. Сафонова2,
Л.С. Зубаровская1, Ю.А. Пунанов2, Б.В. Афанасьев1
1
Институт детской гематологии
и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой ГОУ ВПО
Санкт-Петербургский государственный медицинский
университет им. акад. И.П. Павлова;
2
ФГУ Научно-исследовательский институт онкологии
им. Н.Н. Петрова Минздравсоцразвития России,
Санкт-Петербург
Введение. Клиническое течение саркомы
Юинга / PNET у детей и подростков характеризуется
быстрым ростом опухолевой массы и ранним метастазированием, что обуславливает неблагоприятный
прогноз у значительной части пациентов. Современные программы, совмещающие полихимиотерапию
(ПХТ) с хирургическим лечением и лучевой терапией, позволяют достичь 70–80 % 5-летней безрецидивной выживаемости у детей с локализованной
формой заболевания, но в группе неблагоприятного
прогноза 5-летняя бессобытийная выживаемость не
превышает 20–30 %. Согласно данным отдельных
исследований возможно улучшение прогноза для
данной группы пациентов за счет использования высокодозной ПХТ (ВДПХТ) с аутологичной трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток
(ауто-ТГСК).
Материалы и методы. С февраля 2003 по март
2010 г. на базе НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова получили терапию 23 ребенка и подростка с саркомой
Юинга / PNET: 16 пациентов мужского и 7 женского
пола (соотношение М:Ж — 2,8:1), средний возраст
на момент постановки диагноза составил 12,6 (3–18)
года. Во всех случаях диагноз был подтвержден
гистологически. У 17 были выявлены отдаленные
метастазы и у 6 больных диагностирована локализованная форма заболевания. У всех пациентов с локализованной формой объем исходной опухоли превышал 200 см3. Программа лечения включала в себя 6
курсов ПХТ (ифосфамид, винкристин, доксоруби-
Актуальность определения
B- и T-лимфоцитарной клональности
при верификации диагноза лимфомы
Н.А. Казило1, Е.С. Захарова1, Д.Н. Стефанов2,
М.Н. Синицына2, А.М. Ковригина2
1
Институт биологии гена РАН;
2
Российский онкологический научный центр
им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Лимфомы — опухоли, происходящие из лимфоидных клеток иммунной системы. Своевременная
диагностика лимфопролиферативных заболеваний
актуальна в свете появления новых терапевтических
препаратов, нацеленных на определенные мишени
в опухолевой клетке. Одной из задач диагностики Bи T-клеточных лимфом является применение
молекулярно-генетических методов верификации
диагноза, в частности метода определения клональности в популяции лимфоцитов. Определение Ви Т-лимфоцитарной клональности часто играет значительную роль при верификации диагноза
в сложных и спорных случаях лимфопролиферативных заболеваний, когда другие методы исследования
не могут однозначно отличить лимфому от реактивных состояний.
В норме в тканях присутствует поликлональная
популяция В- и/или Т-лимфоцитов с разными вариантами генов иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов. При злокачественной трансформации
одна из клеток с одной конкретной конфигурацией
генов начинает размножаться, образуя моноклональную популяцию.
Цель данной работы — исследование на лимфоцитарную клональность образцов тканей пациентов
в сложных случаях установки и верификации диагноза.
В исследование был включен 41 пациент с лимфопролиферативными заболеваниями различной
природы (28 пациентов с В-клеточными лимфомами,
13 — с Т-клеточными). Было исследовано 43 образца
биоптата различных тканей пациентов, заключенных в парафиновые блоки. Для определения клональности лимфоцитов использовали ПЦР-метод
исследований реаранжировок генетических локусов
тяжелых цепей иммуноглобулина (IGH) и -цепи
Т-клеточного рецептора (TCR). Результаты определялись методом капиллярного гель-электрофореза
с использованием автоматического генетического
анализатора.
В результате проведенного исследования моноклональные перестановки гена тяжелой цепи иммуноглобулина были выявлены в 70 % случаев (21/30),
используя 2 мишени Fr3 (12/30, 40 %) и Fr2 (17/30,
57 %). Моноклональность по двум мишеням выявлялась в 69 % лимфом постгерминального и постфол-
’2011
цин и этопозид), хирургическое удаление или локальное облучение первичной опухоли (48–56 Гр).
Восемь пациентов, достигшие полной ремиссии, получили 8 курсов поддерживающей ПХТ (винкристин, дактиномицин, ифосфамид). ВДПХТ с аутоТГСК проведена 15 пациентам. Применены
следующие режимы кондиционирования: бусульфан
16 мг/кг и мелфалан 140 мг/м2 (у 13 пациентов), мелфалан 140–200 мг/м2 (у 2 пациентов). Использованы
различные источники гемопоэтических стволовых
клеток: костный мозг (КМ) — у 7, стволовые клетки
периферической крови (СКПК) — у 3, КМ и СКПК —
у 4 пациентов. Средняя доза CD34+-клеток в трансплантате составила 3,15 106 (1,0–8,9 106).
Результаты. В группе пациентов, получавших поддерживающую терапию (n = 8), у 5 больных произошел
рецидив с обширным метастатическим поражением,
все они умерли от прогрессии основного заболевания через 19–36 мес с момента первичного заболевания. У 3 пациентов выявлен локальный рецидив (12
и 32 мес), они получили терапию 2-й линии (одному
проведена ВДПХТ с ауто-ТГСК), 1 из пациентов
умер от инфекционных осложнений терапии.
В группе пациентов, получивших ВДПХТ с аутоТГСК (n = 15), 12 живы (7–43 мес после ВДПХТ), у 6
сохраняется полная ремиссия. Рецидив зафиксирован у всех пациентов, не достигших ремиссии к моменту проведения ВДПХТ. Из пациентов, находившихся на момент проведения ВДПХТ в полной ремиссии (n = 10), поздние рецидивы выявлены у 4,
1 умер от прогрессии заболевания. Использованные
режимы ВДПХТ характеризовались приемлемой токсичностью: у всех больных развился мукозит II–III
степени, у 12 пациентов — фебрильная нейтропения,
у 3 наблюдался токсический гепатит.
При сравнении групп пациентов, получавших
поддерживающую терапию, и пациентов, которым
была выполнена ВДПХТ с ауто-ТГСК, не выявлено
достоверных различий в общей выживаемости (0,78
и 0,22; p = 0,7) и безрецидивной выживаемости (0,32
и 0,0; p = 0,9). Тем не менее, следует отметить разницу в прогнозе между группами реципиентов ТГСК,
находившихся на момент ВДПХТ в полной и частичной ремиссии (0,6 и 0,18; p = 0,17). Также наблюдается
достоверная разница в безрецидивной выживаемости между пациентами, достигшими полной ремиссии после индукционной терапии, которые в дальнейшем получали поддерживающую и интенсивную
ПХТ (0,6 и 0,0; p=0,3).
Выводы. ВДПХТ с ауто-ТГСК для группы высокого риска пациентов с саркомой Юинга / PNET обладает приемлемой токсичностью и позволяет значительно снизить частоту рецидивов у пациентов,
достигших полной ремиссии на момент выполнения
ВДПХТ. Применение ВДПХТ в качестве терапии
«спасения» при резистентных формах заболевания
неэффективно.
39
2
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
2
’2011
40
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
ликулярного происхождения, которые представляют
особую сложность при установлении точной нозологической формы заболевания. Данные заболевания
характеризуются большим количеством соматических гипермутаций, что может приводить к нарушению сайтов связывания праймеров.
Моноклональные перестановки были обнаружены для гена -цепи T-клеточного рецептора в 46 %
случаев (6/13 образцов). В частности, лимфоцитарная клональность, выявленная в тканях пациентов,
страдающих грибовидным микозом, составляла
29 %, и в этих случаях подтверждался диагноз злокачественной лимфомы по целому спектру диагностических признаков. Грибовидный микоз, особенно на
ранних стадиях заболевания, часто схож по проявлениям с многочисленными доброкачественными
кожными заболеваниями. Метод выявления лимфоцитарной клональности при данном заболевании
позволяет на ранних стадиях дифференцировать
грибовидный микоз от многочисленных кожных нозологий. Рассмотренный метод исследования клональности В- и Т-лимфоцитов помогает установить
правильный диагноз в сложных клинических ситуациях, составляющих примерно 10 % от всех лимфоидных пролифераций.
Изоформы лиганда WNT11
и их функциональные свойства
А.В. Кибардин, А.В. Посвятенко, К.В. Куликова,
Н.В. Гнучев, Г.П. Георгиев, С.С. Ларин
Институт биологии гена РАН, Москва
Сигнальный путь Wnt является мощным сигнальным каскадом, играющим важную роль как
в раннем эмбриональном развитии, так и при развитии онкологических заболеваний. «Каноническим»
называют сигнальный путь, регулирующий активность транскрипционных факторов семейства TCF/
Lef, ключевой молекулой которого является бетакатенин. В отсутствие активации бета-катенин фосфорилируется в результате связывания с дестабилизирующим комплексом белков, состоящим из APC,
Axin, GSK3b и CK1a, что приводит к его протеосомной деградации. Активация «канонического» сигнального пути происходит при связывании лигандов
семейства Wnt с трансмембранными рецепторами
Frizzled и ко-рецепторами LRP5/6, что приводит
к опосредованному Dishevelled разрушению дестабилизирующего комплекса. В результате происходит
накопление бета-катенина и его транслокация в клеточное ядро, где он может регулировать транскрипционную активность факторов семейства TCF. Молекулярные механизмы, в которых задействованы
компоненты сигнального пути Wnt, также могут оказывать влияние на реорганизацию клеточного цитоскелета, клеточную подвижность и клеточную поля-
ризацию независимо от транскрипционной активности TCF/Lef. Такие процессы относят к «неканоническому» сигнальному пути Wnt. Считается, что
«неканонический» сигнальный путь может вызывать
активацию малых ГТФ-аз Rac и Rho, кроме того,
описана возможность его влияния на уровень внутриклеточного кальция.
Выбор конкретного пути передачи сигнала зависит от набора клеточных рецепторов, и в случае «неканонического» сигнального пути ко-рецепторами
для семейства Frizzeled вместо LRP5/6 служат
ROR1/2 или Ryk. Способность лиганда вызывать
взаимодействие рецептора и ко-рецептора определяет выбор между «каноническим» и «неканоническим» путем передачи сигнала, и возможна
комбинация рецепторов, при которой «неканонический» лиганд может активировать «канонический»
сигнальный путь.
Wnt11 является лигандом, способным активировать «неканонический» сигнальный путь Wnt. В данной работе нами была изучена возможная роль лиганда Wnt11 в процессах, оказывающих влияние на
формирование опухолевого фенотипа. Также был
обнаружен механизм регуляции функциональной
активности лиганда Wnt11, основанный на альтернативном сплайсинге.
Содержание D-димера в периферической крови как один из критериев
физиологического течения беременности и раннего послеродового
периода
П.А. Кирющенков, М.А. Тамбовцева, Е.В. Андамова
ФГУ Научный центр акушерства,
гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова
Минздравсоцразвития России, Москва
Во время беременности происходят адаптационные изменения в системе гемостаза, выражающиеся
в повышении общего коагуляционного потенциала
крови, снижении содержания естественных ингибиторов свертывания, угнетении фибринолиза, сопровождающиеся повышением содержания конечных
продуктов этого процесса.
Среди различных маркеров внутрисосудистого
тромбообразования наибольший научно-практический
интерес представляет определение D-димера, поскольку его концентрация в периферической крови достаточно высока, а период циркуляции в кровотоке составляет до 8 часов.
Цель исследования — оценка гемостазиологических показателей при физиологической беременности и в раннем послеродовом периоде и динамический контроль содержания D-димера как одного из
сутки после родов оно достигало максимальных значений — 1884,0 ± 65,5 мкг/л. Подобные особенности вне
беременности можно было бы охарактеризовать как
хроническую форму ДВС-синдрома.
Выводы:
1. Важным преимуществом определения уровня
D-димера является отсутствие значительных технических сложностей при выполнении методики, возможность динамического мониторинга, что крайне
необходимо в акушерской практике.
2. Превышение содержания D-димера в периферической крови по сравнению с гестационными
нормативами и параметрами в раннем послеродовом
периоде является маркером патологического тромбообразования и может рассматриваться как предиктор различных акушерских осложнений, таких как
преэклампсия, плацентарная недостаточность, преждевременная отслойка плаценты, а также тромботических осложнений в послеродовом периоде.
Akt/mTOR-зависимое ингибирование
супрессора опухолевого роста Pdcd4
в клетках рака легкого
и его молекулярные механизмы
И.В. Коробко, П.Н. Вихрева, М.В. Шепелев,
Е.В. Коробко
Институт биологии гена РАН, Москва
Экспрессия супрессора опухолевого роста Pdcd4
часто снижена или потеряна в опухолевых клетках
различного происхождения. Снижение экспрессии
Pdcd4 коррелирует с прогрессией опухоли и может
сопровождаться резистентностью опухолевых клеток к действию ряда химиотерапевтических препаратов. В различных экспериментальных моделях восстановление экспрессии Pdcd4 в опухолевых клетках
приводило к ряду позитивных с клинической точки
зрения эффектов: снижению пролиферативной активности, увеличению чувствительности к химиотерапевтическим препаратам, индукции апоптоза. Это
определяет интерес к Pdcd4 как к диагностическому
и прогностическому маркеру, а также как к мишени
для противоопухолевой терапии. Считается, что центральную роль в супрессии Pdcd4 играют 2 механизма: микроРНК miR-21-зависимая деградация транскрипта Pdcd4 и ингибирование трансляции с него,
а также Akt/mTOR/S6K1-зависимая протеолитическая деградация белка Pdcd4. Однако существенность этих молекулярных механизмов в клетках рака
легкого остается неясной. В то же время именно для
опухолей легкого снижение уровня транскрипта
Pdcd4 является значимым прогностическим фактором, и подобные опухоли рассматриваются как одна
из первоочередных мишеней для генной терапии
’2011
основных маркеров внутрисосудистого свертывания.
Материалы и методы. Ретроспективное исследование. Критерии включения: здоровые беременные и роженицы в раннем послеродовом периоде. Критерии
исключения: отягощенный тромбогеморрагический
семейный анамнез, врожденные и приобретенные
тромбогеморрагические состояния, тяжелые соматические заболевания, осложненное течение предыдущих беременностей.
Взятие образцов крови производилось в сроки
6–8 недель, 23–25 недель, 32–34 недели и на третьи
сутки после родоразрешения, что соответствовало
так называемым «критическим» срокам беременности и послеродового периода.
Исследование системы гемостаза включало:
определение концентрации фибриногена, АЧТВ,
АВР, тромбоэластографию, определение уровня
РКМФ, оценку функциональной активности тромбоцитов
с
использованием
стимуляторов
АДФ 1·10-3 М, коллагена 0,04 мг/мл.
Определение D-димера производилось на коммерческой тест-системе D-Dimer Innovance (Siemens,
Германия), которая основана на так называемом методе микролатексной агглютинации (иммунотурбидинеметрический метод).
Результаты. Проведенный ретроспективный анализ показал отсутствие существенных отклонений
в течении беременности и раннего послеродового
периода у обследованных женщин (56 наблюдений).
Средний возраст обследованных составлял 25,3 ± 1,3
года, первородящих было 39 женщин, повторнородящих — 17.
Динамическое гемостазиологическое исследование выявило адаптационные изменения в системе
гемостаза во время беременности, проявляющиеся
со II триместра. Это характеризовалось увеличением
концентрации фибриногена с 3,5 ± 0,4 г/л до 5,7 ±
0,5 г/л (р < 0,05). По данным тромбоэластографии
хронометрические показатели (r + k) уменьшились
с 20,8 ± 0,2 мм до 16,6 ± 0,2 мм (р < 0,05), показатели
структурной коагуляции (И.Т.П.) увеличились
с 10,1 ± 0,5 у. е. до 14,2 ± 0,3 у. е. (р < 0,05). По мере
прогрессирования беременности отмечалась тенденция к повышению функциональной активности
тромбоцитов. Об активности образования тромбина
свидетельствовало увеличение частоты встречаемости положительных проб на РКМФ. На третьи сутки
после родоразрешения отмечалась даже тенденция
к нарастанию тромбофилии.
Наибольший интерес представляют данные
о динамике содержания D-димера как маркера внутрисосудистого свертывания. Если в I триместре его содержание практически не отличалось от уровня у небеременных женщин и составляло 341,4 ± 22,6 мкг/л, то во
II триместре увеличилось до 1085,4 ± 65,4 мкг/л (р <
0,05), в III триместре — 1705,2 ± 88,5 мкг/л, а на третьи
41
2
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
2
’2011
42
с использованием Pdcd4. Нами продемонстрировано, что Akt-сигнальный путь действительно играет
существенную роль в супрессии Pdcd4 в клетках рака
легкого. Однако в отличие от ранее описанных механизмов активация Akt-сигнального пути не вызывает выраженной протеолитической деградации Pdcd4.
В то же время нами впервые обнаружено, что ингибирование Akt-сигнального пути приводит к увеличению уровня транскрипта Pdcd4, вероятно, влияя
непосредственно на транскрипцию Pdcd4, а не будучи опосредованным изменением стабильности
транскрипта. Таким образом, нами выявлена существенная роль Akt/mTOR-сигнального пути в супрессии Pdcd4 в клетках рака легкого и описан
новый молекулярный механизм Akt-зависимой супрессии Pdcd4. С практической точки зрения, установленная значимость Akt-зависимой супрессии
Pdcd4 в клетках рака легкого в совокупности с противоопухолевыми эффектами от восстановления
экспрессии Pdcd4 еще раз подчеркивают значимость
Akt-сигнального пути как одной из мишеней в лечении рака легкого.
Частоты аллелей генов главного
комплекса гистосовместимости
у детей с онкогематологическими
заболеваниями и их родственников
в Российской Федерации
В.В. Красавина1, О.А. Шрагина2, В.О. Бобрынина1
ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской
гематологии, онкологии и иммунологии
Минздравсоцразвития России;
2
ФГУ Российская детская клиническая больница
Минздравсоцразвития России, Москва
1
Система HLA (Human Leukocyte Antigen) — комплекс генов главного комплекса гистосовместимости человека — обеспечивает регуляцию иммунного
ответа, осуществляет такие важнейшие физиологические функции, как взаимодействие иммунокомпетентных клеток организма, распознавание своих,
в том числе измененных, и чужеродных клеток, запуск и реализация иммунного ответа и, в целом, обеспечивает выживание человека как вида в условиях
экзогенной и эндогенной агрессии. Комплекс генов
HLA компактно расположен на коротком плече 6-й
хромосомы, занимает 3500 kb (тысяч пар оснований)
и содержит более 220 генов. Областью практического применения знаний о системе HLA в настоящее
время в первую очередь является трансплантация органов и тканей, где совместимость по антигенам
HLA важна при подборе доноров.
Цели работы. Определение HLA-генотипов реципиентов для поиска родственного или нерод-
ственного донора костного мозга, а также донорских
гемопоэтических клеток пуповинной крови при помощи технологии PCR-SSP (Polymerase Chain
Reaction with Sequence-Specific Primers) — аллельспецифическая амплификация с последующей детекцией методом электрофореза.
Типирование проводилось как в низком, так
и в высоком разрешении по 17 группам аллелей локуса HLA-A, по 28 группам аллелей локуса HLA-В,
по 15 группам аллелей локуса HLA-Сw, по 13 группам аллелей локуса HLA-DRB1 и по 5 группам аллелей локуса HLA-DQB1.
Результаты. За период 05.2009–04.2011 в лаборатории молекулярной биологии ФГУ ФНКЦ ДГОИ
проведено определение HLA-антигенов 608 реципиентов и возможных доноров. Для поиска неродственного донора 168 пациентам было проведено типирование высокого разрешения по 5 локусам. Для
поиска донорских гемопоэтических клеток пуповинной крови 23 пациента были типированы в низком разрешении по 5 локусам и в высоком разрешении — по локусу DRB1.
Были обследованы 150 пациентов и их сиблинги
для поиска родственного HLA-совместимого донора
костного мозга. Все пациенты и сиблинги были типированы в низком разрешении по II классу HLAантигенов (HLA-DRB1 и HLA-DQB1), а при совпадении полученных результатов и по I классу (HLA-A,
HLA-B и HLA-Cw). По данным исследования полностью идентичными HLA-фенотипами обладали 40
пар сиблингов (24 % от общего числа обследованных
групп), что полностью соотносится с законом расщепления признаков при условии наследования
генов главного комплекса гистосовместимости как
гаплотипов. В одной семье была выявлена двойная
рекомбинация, произошедшая у матери, в результате
чего гены HLA-B, HLA-C и DRB4 были перемещены
с одной хромосомы на другую.
Частоты аллелей генов HLA-системы представлены в таблице. Для определения полного спектра
аллелей генов главного комплекса гистосовместимости представителей российской популяции потребуется дальнейшее типирование.
Ошибки в диагностике острых
лейкозов на догоспитальном этапе
у детей в Москве и Московской
области
Я.А. Круглова, Т.А. Астрелина, М.В. Яковлева,
Е.В. Клеина, Н.В. Евдачева
ГУЗ Банк стволовых клеток
Департамента здравоохранения города Москвы
Одну из главных ролей в своевременной диагностике острых лейкозов играет онкологическая насто-
%
01
10,65
02
26,75
03
14,98
11
6,44
23
1,33
24
11,65
25
4,66
26
5,66
29
1,22
30
2
31
3,22
32
2,66
33
1,66
43
66
0,22
0,44
68
6,33
69
B*
0,11
%
07
9,66
08
13
14
5,88
7,1
1,89
15
7,88
18
5,77
27
5,88
35
9,43
37
38
1,11
4,22
39
1,89
40
6,44
A*
0101
0103
0201
0205
0206
0301
0302
0368
1101
1166
2301
2402
2403
2404
2430
2501
2601
2608
2902
3001
3002
3004
3101
3106
3108
3201
3301
3303
%
9 ,7 9
0,3
24,33
2 ,0 8
1,19
11,28
1,19
0 ,3
4 ,1 5
0 ,3
0,59
13,35
0,3
0 ,5 9
0,3
6,23
5,64
0 ,3
1,19
1 ,4 8
0,59
0,59
2 ,9 7
0,59
0 ,3
1,19
1 ,4 8
0,89
6601
6801
6802
6824
6901
B*
0702
0705
0801
1302
1402
1501
1505
1511
1801
2702
2703
2705
2714
3501
3502
3503
3701
3801
3901
3906
4001
4002
0,89
2 ,9 7
1,19
1,19
0 ,3
%
7 ,0 1
0 ,3
6 ,7 1
6,4
2 ,7 4
4,57
0 ,6 1
0 ,6 1
8,23
0 ,6 1
0,3
2 ,4 4
0 ,3
4 ,8 8
2 ,4 4
3,35
2,13
4,27
0,61
0,61
2,74
4,27
B*
%
41
2
44
8,44
45
46
47
48
49
50
0,33
0 ,5 5
0,44
0,33
1,55
2
51
6,22
52
53
55
56
3,55
0,33
1,44
0,67
57
3,33
58
73
Cw*
1,44
0 ,2 2
%
01
4,64
02
5,59
03
14,05
04
11,05
05
4,23
06
12,82
07
23,33
08
2,05
11
0 ,2 7
12
12,41
14
1,36
15
3
16
2,86
17
2,05
18
0,27
B*
4101
4 10 2
4402
4403
4 4 05
4411
4427
4501
46 0 1
%
1 , 22
1,52
5 ,7 9
1 , 22
0 ,3
0,3
0 ,6 1
0 ,6 1
0,61
DRB1*
%
01
11,41
03
8 ,9 5
04
15,02
4901
5001
5101
5 10 5
5201
5301
5501
5601
5701
5702
5801
73 0 1
Cw*
0102
0103
0202
0 20 8
0302
0303
0304
0316
0401
0501
0 520
0602
0701
0702
0704
0802
0 825
1104
1202
1203
1402
1403
1502
1504
1505
1506
1513
1601
1602
1604
1 7 01
1703
1802
1,83
1 ,8 3
6,4
0 ,3
3,05
0,91
0 ,6 1
0 ,9 1
3 , 35
0,3
1,83
0 ,3
%
4,79
0,19
4 ,4 1
0,19
1 , 53
4 ,0 2
6 , 51
0 ,3 8
11,49
4 ,2 1
0 ,3 8
13 , 6
10,3 4
10,7 3
1,53
1 ,3 4
0 ,3 8
0 ,3 8
3 ,4 5
10 , 7 3
0 ,7 7
0,38
1 , 34
0 ,1 9
1 , 15
0 , 19
0,19
0 ,7 7
0 ,9 6
0 ,7 7
0,57
1,72
0,38
07
14,7
08
3,12
09
2,13
10
1,07
11
12,89
12
1,89
13
10,43
14
3,45
15
12,07
16
2 ,8 7
02
20,32
03
38,05
04
2,16
05
18,4
06
21,07
DRB1*
0101
0102
0103
0 3 01
0401
0402
0403
0404
0405
040 7
0408
0701
0801
0803
0901
0906
1001
1101
1102
1103
11 0 4
1116
1201
1206
1301
1302
1303
14 0 1
1403
1435
1454
1501
1502
1 60 1
0201
0202
0204
030 1
0302
0303
0304
0306
030 8
0313
0319
0401
0402
0501
0502
0503
0504
0601
0602
0603
0604
0609
%
9 ,6 7
2,54
0,51
8 ,1 4
4,33
1 ,7 8
1 ,5 3
2,54
1 ,0 2
1,27
0,25
15,01
2,8
0,51
1,27
0,25
3,05
5 ,6
0 ,2 5
0 ,5 1
5 ,0 9
0,25
2 , 54
0,25
6 ,3 6
3,56
1,27
0,51
0 ,76
0,25
1,02
9 ,6 7
2,8
2,8
7,39
10,84
0,25
2 0 ,9 4
1 0 ,5 9
6,16
0, 25
0 ,49
0,25
0,25
0,25
0,49
2,22
14 , 2 9
1 ,9 7
1 ,7 2
0,99
3,45
1 0 ,3 4
4 ,6 8
1,97
0,25
’2011
A*
43
2
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
2
’2011
44
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
роженность врачей первичного звена. Крайне необходимо знание начальных клинических проявлений
заболевания, «масок» острого лейкоза и показателей
периферической крови при данной патологии.
Цель исследования — проанализировать возможные ошибки, связанные с интерпретацией гемограмм и начальными клиническими проявлениями,
в диагностике острых лейкозов у детей.
Материалы и методы. Были проанализированы
данные анамнеза заболевания 220 детей МДКБ № 1
(Москва) и МООД (Балашиха) за период с 01.10.2008
по 31.05.2010. Выполнен анализ количества дней от
начала клинических проявлений до госпитализации
детей больных острым лейкозом (ОЛ) в специализированные гематологические отделения.
Результаты. Интервал времени от начала проявления клинической симптоматики до госпитализации
ребенка в специализированное гематологическое отделение составил от 3 дней до 4 месяцев, в зависимости от клинической картины и тяжести состояния
больного. Основной причиной диагностических ошибок было несвоевременное назначение исследования
общего анализа периферической крови (ОАК). У 9
(4,09 %) пациентов диагноз ОЛ был выявлен при диспансерном плановом обследовании и при плановом
патронаже педиатра. Самый короткий период постановки диагноза у 16 (7,27 %) детей с геморрагическим
и острым абдоминальным синдромами составил 3–4
дня. В хирургическое отделение с подозрением на
острый аппендицит были госпитализированы 7
(3,18 %) пациентов с острым абдоминальным синдромом, одному (0,35 %) из них провели аппендэктомию.
Самый длительный период до госпитализации в стационар у 21 (9,55 %) пациента с артралгическим и оссалгическим синдромами составил 3–4 мес. У 124
(56,36 %) пациентов с вирусной инфекцией (ОРВИ,
пневмония, бронхит, рецидивирующий отит, ларинготрахеит, лимфоаденопатия) период госпитализации
составил от 2 до 6 недель. У 4 (1,81 %) пациентов ОЛ
дебютировал с экзофтальма, обследование проходило
в МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца. У 3
(1,36 %) пациентов заболевание начиналось с инфекции мочеполовых путей. Неврологическая симптоматика наблюдалась у 3 (1,36 %) пациентов и период до
госпитализации составил в среднем 4–6 недель. Родители 3 (1,36 %) детей самостоятельно обратились к гематологу в связи с нарастающей бледностью ребенка.
Пять пациентов (2,27 %) лечились амбулаторно по месту жительства с диагнозом анемия в течение 4–8 недель. Одному больному (0,45 %) через месяц от начала
заболевания был установлен диагноз менингококцемия с последующей госпитализацией в инфекционное отделение, где был поставлен диагноз ОЛ. Практически во всех случаях ОАК назначали не ранее чем
через 3–5 недель от начала клинических проявлений
или первично уже в стационаре. Очень часто дети поступали в специализированный стационар пролечен-
ные гормональной терапией, что значительно затрудняло окончательную диагностику с верификацией варианта по FAB-классификации и отягощало течение
заболевания с ухудшением прогноза. При проведении
ОАК в диагностических лабораториях диагностика
ОЛ была затруднена в связи с использованием гематологических автоматических анализаторов без подсчета
количества бластных клеток в ПК. Выявлять бластные клетки можно только при банальной иммерсионной микроскопии, которая в клинической диагностической лаборатории делается выборочно.
Заключение. Основной причиной ошибок несвоевременной диагностики ОЛ является недостаточное обследование детей (ОАК), отсутствие индивидуального подхода к лабораторным исследованиям
и отсутствие онкологической настороженности
у врачей первичного звена. Необходимо помнить,
что: «нет такого заболевания, маску которого не принял бы острый лейкоз» (И.А. Кассирский).
Выявление роли лигандов WNT
в формировании агрессивного
опухолевого фенотипа
линий меланомы человека
К.В. Куликова, А.В. Кибардин, А.В. Посвятенко,
Н.В. Гнучев, Г.П. Георгиев, С.С. Ларин
Институт биологии гена РАН, Москва
Несмотря на то, что меланома составляет лишь
небольшую часть всех кожных новообразований, она
является основной причиной смерти среди пациентов с заболеваниями кожи. Высокая смертность больных меланомой связана с агрессивным характером
опухолей данного вида. Разрушение межклеточных
контактов, перестройка цитоскелета, увеличение
подвижности клеток и устойчивость к апоптозу дают
возможность трансформированным клеткам распространиться по всему организму. На молекулярном
уровне эти процессы сопровождаются ингибированием экспрессии маркеров эпителиальных клеток
и супрессора метастазирования KISS-1, усилением
продукции маркеров, ассоциированных с клеточной
подвижностью, и протеаз, деградирующих внеклеточный матрикс, а также изменениями в экспрессии
генов WNT. Считается, что сигнальный путь, активируемый белками семейства WNT, принимает участие
в формировании и развитии меланом. В процессе эмбрионального развития сигнальный путь WNT задействован в регуляции межклеточных взаимодействий,
кроме того, существуют данные, описывающие его
роль в контроле подвижности клеток. Известно, что
при меланоме экспрессия лигандов сигнального пути
WNT часто повышена. Изучение экспрессии маркеров, ассоциированных с изменениями клеточной
подвижности, может дать ценные знания для пред-
Тромболизат как альтернатива
фетальной бычьей сыворотке
при экспансии стромальных клеток
костного мозга in vitro
К.В. Лепик, О.В. Бурданова, И.М. Бархатов,
Б.В. Афанасьев
Институт детской гематологии и трансплантологии
им. Р.М. Горбачевой ГОУ ВПО Санкт-Петербургский
государственный медицинский университет
им. акад. И.П. Павлова
В настоящее время в большинстве протоколов
для экспансии мезенхимальных стволовых клеток
(МСК) костного мозга используются питательные
среды с добавлением фетальной телячьей сыворотки
(ФТС), которая может являться источником ксеногенных антигенов и инфекционных агентов.
В качестве альтернативы ФТС можно рассматривать
тромболизат (ТЛ), получаемый из обогащенной
тромбоцитами плазмы человека.
Цель работы. Отработка методики получения ТЛ,
оценка его биологической активности и возможности использования в качестве альтернативы ФТС.
Материалы и методы. Изучалась пролиферативная активность МСК; оценивался иммунофенотип,
экспрессия ряда генов, способность к дифференцировке и поддержке гемопоэза при использовании
ФТС в качестве суплемента, ТЛ, а также бессывороточной среды.
Результаты. При оценке колониеобразования
в первичной культуре МСК было выявлено, что при
использовании ТЛ количество колониеобразующих
единиц фибробластов было выше по сравнению
с ФТС. При долговременном культивировании различий в пролиферативной активности МСК не на-
блюдалось. На фоне культивирования в среде с ТЛ
по сравнению с ФТС отмечалось снижение доли
CD14+-клеток, а также снижение экспрессии генов
NGF, osteopontin, ITGA7, NTF3. Способность к дифференцировке в остеобласты у МСК после экспансии с использованием ТЛ была выше по сравнению
с ФТС.
Выводы. При экспансии с использованием ТЛ
отмечается изменение дифференцировочного потенциала МСК, сопровождаемого снижением экспрессии ряда генов на фоне сопоставимых с ФТС
пролиферативных характеристик.
Анализ динамики плавления продуктов
полимеразной цепной реакции
для поиска гистосовместимого
родственного донора
В.В. Мустяца1, В.О. Бобрынина2
Физический факультет Московского государственного
университета им. М.В. Ломоносова;
2
ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской
гематологии, онкологии и иммунологии
Минздравсоцразвития России, Москва
1
Цель исследования. Разработать условия применения метода анализа динамики плавления в высоком разрешении (HRM) для поиска гистосовместимого родственного донора.
Материалы и методы. В ходе исследования были
проанализированы образцы ДНК 57 человек из 20
семей. Для каждого образца были проведены 3 независимые полимеразные цепные реакции (ПЦР)
в присутствии интеркалирующего флуоресцентного
красителя EvaGreen для амплификации вторых экзонов генов DRB1 и DQB1 II класса главного комплекса гистосовместимости (HLA): одна ПЦР для DRB1
и две — для DQB1. После ПЦР полученные фрагменты плавились в диапазоне 75–95 °С. ПЦР и плавление в высоком разрешении (HRM) проводились на
приборе Rotor Gene 6000 производства Corbett
Research (Австралия). Анализ динамики плавления
продуктов ПЦР осуществлялся при помощи стандартного программного обеспечения прибора.
Результаты. Анализ динамики плавления ПЦРпродуктов проводился внутри каждой семьи, были
определены сибсы, имеющие такие же кривые плавления в трех ПЦР, как и пациенты. В дальнейшем эти
данные были сопоставлены с результатами сиквенсспецифической ПЦР (PCR-SSP) генов DRB1 и DQB1,
полученных с использованием реактивов для HLAтипирования производства Invitrogen. При совпадении кривых плавления совпадали и аллели, определенные методом PCR-SSP, а при различии
в динамике плавления результаты HLA-типирования
также различались. Таким образом, результаты груп-
’2011
сказания степени прогрессии заболевания, а также
для оценки шансов на выживание пациентов.
В рамках данной работы набор клеточных линий
меланомы человека был охарактеризован на основании наличия и уровня экспрессии маркеров, ассоциированных с регуляцией клеточной подвижности,
а также по наличию и уровню экспрессии различных
лигандов сигнального пути WNT. Было обнаружено,
что, несмотря на то, что характер экспрессии изученных генов значительно варьирует в исследованных
клеточных линиях, экспрессия некоторых маркеров,
ассоциированных с повышенной клеточной подвижностью, коррелирует с экспрессией лигандов
сигнального пути WNT. Полученные данные говорят
как о возможном существовании различных механизмов формирования агрессивного опухолевого
фенотипа меланом, так и о характере участия белков
семейства WNT в формировании агрессивного фенотипа клеточных линий меланомы человека.
45
2
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
2
’2011
46
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
пировки, полученные методом HRM, полностью совпали с группировкой по результатам сиквенсспецифической ПЦР.
Выводы. Полученные данные свидетельствуют,
что метод HRM позволяет устанавливать совпадение
или несовпадение аллелей генов DRB1 и DQB1 HLA
II класса у пациентов и их родственников.
Данный метод имеет следующие преимущества
перед стандартным HLA-типированием:
• возможность одновременного тестирования
большого количества образцов;
• отсутствие необходимости проведения фореза;
• снижение вероятности контаминации лаборатории ПЦР-продуктом;
• снижение фактической стоимости данного
этапа исследования.
Получаемый методом HRM качественный результат позволяет быстро выявить возможного родственного донора. Применение данного метода не
исключает необходимости дальнейшего типирования всех генов главного комплекса гистосовместимости, но дает возможность проводить это исследование только для гистосовместимых родственников
пациента.
Значение теста генерации тромбина
в клинической практике
Ю.А. Наместников, О.Г. Головина, Л.П. Папаян
ФГУ Российский научно-исследовательский
институт гематологии и трансфузиологии
ФМБА России, Санкт-Петербург
Значимость лабораторной оценки состояния системы свертывания крови в современной клинической практике сложно переоценить. Сегодня на 1-е
место среди причин смертности выступают заболевания, в патогенезе которых большую роль играет
повышенная способность крови к образованию
тромбов — состояние гиперкоагуляции. Поэтому
особенно важным представляется выявление именно гиперкоагуляционных проявлений при различных заболеваниях.
Для широкой клинической практики важными
представляются данные так называемых супрамолекулярных методов исследования гемостаза — таких
тестов, которые оценивают систему в целом, во взаимодействии, и дают функциональную характеристику ее состояния. Одним из таких методов является
тест генерации тромбина (ТГТ). В этом исследовании оценивается динамика образования и инактивации ключевого энзима гемостаза — тромбина. Показатели этого процесса отражают функциональное
состояние, возникающее при взаимодействии между
собой как про-, так и антикоагулянтных факторов.
Показатели коагулограммы могут находиться в пределах нормы, в то время как в функциональном ТГТ
выявляется повышение параметров, что свидетельствует о наличии гиперкоагуляции.
Обратную ситуацию можно наблюдать в случае,
когда изменения отдельных показателей коагулограммы не сопровождаются изменением ТГТ. Так, например, у пациента могут быть повышены фактор VIII,
фактор Виллебранда и уровень D-димера, на основании чего клиницист может предположить наличие гиперкоагуляции и назначить антикоагулянтную терапию
для профилактики тромбоза. Но увеличение активности отдельных прокоагулянтных факторов может быть
нивелировано повышением активности антикоагулянтных факторов. Показатели ТГТ в таком случае будут в пределах нормы. Следовательно, руководствуясь
данными коагулограммы, можно получить ложноположительное представление о наличии у пациента гиперкоагуляции при ее реальном отсутствии.
Другая клиническая проблема связана с мониторингом антикоагулянтной терапии. Например, у пациентов, получающих варфарин, руководствуются
правилом достижения целевого значения МНО, при
котором терапия считается адекватной. Но как объяснить, что у пациентов с одинаковыми значениями
МНО показатели ТГТ могут значительно отличаться? Равнозначен ли эффект при достижении одного
и того же целевого значения МНО у 2 пациентов.
Можно ли считать терапию у них одинаково эффективной?
Существует мнение, что мониторинг терапии
низкомолекулярными гепаринами (НМГ) не обязателен по причине линейной зависимости их влияния
на активный фактор Х. В случае необходимости
предлагается проводить мониторинг по исследованию изменения анти-Ха активности. Об изменении
свойств системы гемостаза предлагается судить по
изменению активности только одного фактора. Как
показали Al Dieri et al. (2006), при назначении одинаковых доз фраксипарина даже здоровым лицам недостаточная доза наблюдалась в 13 %, а передозировка —
в 11 % случаев. Эта работа демонстрирует необходимость лабораторного контроля за эффектом от введения НМГ с помощью глобальных тестов, а также
неправомерность суждения о гемостазе в целом по
изменению всего лишь одного показателя — антиХа-активности.
Большое значение в клинической практике сегодня придается выявлению у пациентов врожденной тромбофилии. Но всегда ли их присутствие сопровождается развитием гиперкоагуляции? Какие
результаты можно получить при функциональном
исследовании гемостаза, например у гетерозиготных
носителей мутации фактора V Лейден, которая на сегодняшний день признана клинически значимой
в развитии гиперкоагуляционного состояния. Известен следующий факт: у одного из сибсов, у которых
выявлена данная мутация, развиваются тромбоэмболические осложнения, а у другого нет. Как показыва-
Иммуногенная эффективность
вакцинопрофилактики вирусного
гепатита B среди детей
с онкогематологическими
заболеваниями: cравнительная оценка
двух режимов
Н.В. Опалева1, Е.В. Полевиченко2, К.С. Асланян1,
Е.В. Васильева1, Л.Д. Орешкина1, А.Х. Хаспекян1,
И.В. Яценко1, О.В. Салмашова2, Л.В. Гончарова1,
Н.В. Краснянская1
1
Областная детская больница;
2
ГОУ ВПО Ростовский государственный
медицинский университет, Ростов-на-Дону
Высокое медико-социальное значение вирусного гепатита B (ВГB), вакциноуправляемый характер
данной инфекции и отсутствие единых национальных рекомендаций по вакцинопрофилактике для детей с онкогематологическими заболеваниями (ОГЗ)
определяют поиск оптимальных протоколов специфической иммунопрофилактики ВГВ в комплексе
сопроводительной терапии.
Цель исследования. Сравнительное изучение иммуногенной эффективности 2 режимов вакцинопрофилактики (ВП) ВГВ: 1) рутинной ВП ВГВ, проведенной в анамнезе больных ОГЗ на первом году
жизни; 2) ВП ВГВ, выполненной по эпидпоказаниям у ранее не привитых пациентов на фоне программной ПХТ гемобластозов и солидных опухолей.
Материалы и методы. Проведено динамическое
ИФА-исследование диагностической панели серологических маркеров ВГВ (HBsAg, HBeAg, anti-HBs,
anti-HBe, anti-HB-corAgIgG, anti-HB-cor-AGIgM)
и количественная оценка уровня anti-HBs (мМЕ/мл)
в 2 группах больных: 1-я группа — дети с ОГЗ (n = 192),
без ВП в анамнезе, привитые по схеме 0–1–2–6–12
месяцев удвоенной дозой рекомбинантной вакцины
для профилактики ВГВ с первых дней программной
ПХТ; 2-я группа — дети с ОГЗ (n = 47), ранее рутинно
вакцинированные по схеме 0–3–6 месяцев.
Результаты. При оценке иммуногенной эффективности ВП ВГВ через 3 месяца после ее завершения у детей с ОГЗ в 1-й группе уровень серопротек-
ции (> 10 мМЕ/мл) составил 58,0 % при среднем показателе anti-HBs — 54,3 ± 9,8 мМЕ/мл, что свидетельствовало о достаточной эффективности ВП. Во
2-й группе уровень серопротекции составил 42,6 %,
а средние значения anti-HBs — 57,8 ± 12,2 мМЕ/мл
на сроке после завершения ВП ВГВ, равном 36,8 ±
5,7 мес. Отмечена умеренная отрицательная корреляция по Пирсону (p < 0,05) между уровнем anti-HBs,
количеством CD3+-лимфоцитов ( 109/л) и IgG (г/л)
у детей 2-й группы. Таким образом, в дебюте ОГЗ отмечен относительно невысокий уровень серопротекции против ВГВ у детей с завершенной в анамнезе
ВП ВГВ, проведенной в рамках Национального календаря, хотя средние значения anti-HBs в данной
группе достоверно превышают протективный уровень, принятый у здоровых лиц (10 мМЕ/мл). Можно предположить, что оптимальное сочетание двух
режимов вакцинации в дебюте ОГЗ у детей, не имеющих серопротективного уровня защиты против ВГВ
(т. е. их ревакцинация по эпидпоказаниям), успешно
модифицировало бы стандартный подход к иммунопрофилактике ВГВ для данной категории иммуносупрессированных лиц.
–подобная ДНК-полимераза
клеток HL-60
А.П. Орлов1, Д.А. Кузнецов1, В.П. Чехонин1,
И.С. Берсенев2, Л.Дж. Немер-Гергели3, Ш. Удварди3
1
Кафедра медицинских нанобиотехнологий, Российский государственный медицинский университет
им. Н.И. Пирогова, Москва;
2
Институт белка РАН, Пущино;
3
Биологический исследовательский центр Венгерской
академии наук, Сегед, Венгрия
Несмотря на серьезное внимание, уделяемое роли ДНК-полимераз семейства «Бета» в процессах
канцерогенеза, ни один из ферментов этой группы
не был до сих пор выделен и охарактеризован в случае широко используемой линии клеток миелоидного лейкоза человека HL-60.
В настоящей работе эта задача впервые решена
благодаря оригинальной методике фракционирования хроматина, включающей ряд этапов его нуклеазной и химической обработки (нуклеаза S/рибонуклеаза А; 0,5 М NaCl/фенол-хлороформная экстракция;
ацетон-преципитация; +37 ºС/80 КГц/60 мин; ступенчатый 30–70 % градиент насыщения сульфатом
аммония; диализ; лиофилизация), завершающихся
гель-хроматографией на колонке TOYOPEARL HW-55F
1,6  70 cм. В результате был выделен высокоочищенный SDS–PAGE-гомогенный белок-мономер (66.5
кДа, pI = 8.35), обладающий высокой ДНК-полимеразной каталитической активностью.
При этом для данного фермента характерны такие идентификационные параметры, специфиче-
’2011
ет ТГТ, у одного из них имеет место гиперкоагуляция
и APC-резистентность, в то время как у другого показатели ТГТ в норме. Это позволяет объяснить различную реализацию одного и того же генетического
дефекта компенсаторными механизмами.
Таким образом, использование метода глобальной
оценки системы гемостаза, в данном случае ТГТ, позволяет получить представление о состоянии гемостаза
в целом, выявить гиперкоагуляцию, а также оценить
эффективность антитромботической терапии.
47
2
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
2
’2011
48
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
ские для представителей семейства «Бета» (К.Ф.
2.7.7.7.), как:
— отсутствие 3’,5’-экзонуклеазной активности
мономера;
— гиперактивация в присутствии 200 mM KCl;
— устойчивость к Амфидиколину (5,0 мкг/мл)
и N-этилмалеимиду (0,5 mM);
— низкий уровень процессирования при ограничении размеров формируемых фрагментов ДНК до 300 n.
Степень очистки фермента по отношению к общему белку клеток составила 1:122 000.
Реакция системы крови на различные
варианты воспаления
М.В. Пешикова, Е.В. Жуковская, И.И. Долгушин
ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская
академия Федерального агентства по здравоохранению
и социальному развитию
Цель. Изучить пролиферативный потенциал
CD34+-клеток у людей на фоне различных воспалительных процессов с учетом типа (острый или хронический) и распространенности (локальный или
генерализованный) воспалительного ответа.
Материалы и методы. В ретроспективное исследование вошли 933 женщины от 16 до 85 лет (средний
возраст 38,9 ± 0,5 года) и 767 мужчин от 17 до 88 лет
(средний возраст 37,5 ± 0,5 года) с различными воспалительными заболеваниями (острые инфекционные заболевания, хронические неспецифические
гнойно-воспалительные заболевания в стадии ремиссии, хронические аллергические заболевания
в стадии ремиссии). Группу контроля составили 63
здоровые женщины от 16 до 50 лет (средний возраст
19,8 ± 0,4 года) и 63 здоровых мужчины от 17 до 67 лет
(средний возраст 28,2 ± 1,8 года). Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводилось методом флюоресцентной микроскопии с помощью реакции прямой иммунофлюоресценции
в модификации С.В. Сибиряка и соавт. (1997).
Результаты. Анализ особенностей мобилизации
CD34+-клеток у людей на фоне различных воспалительных процессов выявил следующие тенденции:
1. Достоверное повышение процентного числа
CD34-лимфоцитов в периферической крови пациентов на фоне острых тяжелых вирусных инфекций.
2. У пациентов на фоне различных хронических
заболеваний в периоде ремиссии процентное число
CD34-лимфоцитов в кровотоке не отличается от показателей здоровых людей.
3. Не отмечено значительных колебаний в процентном соотношении циркулирующих CD34лимфоцитов у исследуемого контингента в зависимости от возрастных параметров человека.
4. У пациентов на фоне ареактивных состояний,
как и у здоровых лиц, существуют различия в соот-
ношении данной популяции лимфоцитов в зависимости от пола, а именно: у женщин процентное число циркулирующих CD34+-клеток выше, чем у мужчин.
Заключение. Соответствие между содержанием
CD34+-клеток в периферической крови и особенностью воспалительного ответа формирует предпосылки для использования кинетики клеточного пула
стволовых кроветворных клеток для биомониторирования тяжести воспаления.
Определение минимальной остаточной
болезни методом проточной
цитометрии и выявления химерного
транскрипта в ходе ПЦР у детей
с острым лимфобластным лейкозом
из В-линейных предшественников:
результаты сравнения методов
А.М. Попов1,2, Г.А. Цаур1,2, Т.Ю. Вержбицкая1,2,
Е.В. Шориков1,2, Л.И. Савельев3, Л.Г. Фечина1,2
1
Областная детская клиническая больница № 1;
2
Институт медицинских клеточных технологий;
3
ГОУ ВПО Уральская государственная
медицинская академия, Екатеринбург
Цель исследования — оценить сопоставимость
результатов определения минимальной остаточной
болезни (МОБ) при остром лимфобластном лейкозе
из В-линейных предшественников (ВП-ОЛЛ) у детей методами многоцветной проточной цитометрии
и ПЦР с выявлением химерных транскриптов (ХТр).
Материалы и методы. Было исследовано 229 образцов костного мозга, взятых на разных стадиях
программной терапии, а также непрограммного лечения у 56 пациентов. МОБ определяли одновременно методом проточной цитометрии, ПЦР с обратной
транскрипцией (ОТ-ПЦР) и ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ).
Результаты. При использовании всех методов МОБпозитивны были 130 образцов, а МОБ-негативны —
77. В 20 образцах МОБ была выявлена только методом
ПЦР, в 2 — только методом проточной цитометрии.
Качественная сходимость результатов проточной цитометрии и ОТ-ПЦР составила 90,4 %. Детальный анализ результатов показал, что сходимость результатов
определения МОБ не зависела от типа определяемой
молекулярной перестройки, иммунофенотипа опухолевых клеток и наличия в образце нормальных
В-линейных предшественников. Однако во время индукционной терапии сопоставимость результатов оказалась достоверно ниже, чем на более поздних этапах
лечения (83,8 % и 93,9 % соответственно, р = 0,024).
В образцах, в которых МОБ была выявлена только ме-
ется секретируемым белком. Использование двойного люциферазного теста (репортерный ген под контролем TCF/LEF промотора и отрицательный контроль с мутантной областью связывания TCF/LEF)
продемонстрировало, что сплайс-вариант теряет способность ингибировать канонический сигнальный
путь, присущий Wnt11 дикого типа.
Эти данные дают возможность предположить существование нового механизма взаимного влияния
различных ветвей сигнального пути Wnt в процессе
формирования и прогрессии опухоли. В то же время
возникают новые вопросы, касающиеся причин
и последствий альтернативного сплайсинга в опухолевых клетках.
Экспрессия сплайс-вариантов WNT11
в клетках линии колоректального рака
(HT29)
Е.В. Ройтман
Научное общество «Клиническая гемостазиология»,
ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской
гематологии, онкологии и иммунологии
Минздравсоцразвития России, Москва
А.В. Посвятенко, К.В. Куликова, А.В. Кибардин,
Г.П. Георгиев, Н.В. Гнучев, С.С. Ларин
Институт биологии гена РАН, Москва
Аномальная активация сигнального пути Wnt
показана при различных онкологических заболеваниях, включая 90 % случаев колоректального рака.
Аберрантная активация канонического сигнального
каскада в большинстве случаев происходит в результате мутаций генов APC, CTNNB1 или Axin. Показано, что при колоректальном раке также активирован
путь планарной клеточной полярности (Caldwell
et al., 2008). Установлено, что в клетках линий опухолей прямой и ободочной кишки экспрессируются
различные лиганды семейства Wnt, включая Wnt11
(Suzuki et al., 2004). Белок Wnt11 считается лигандом,
активирующим путь планарной клеточной полярности, определяющим поляризацию клеток и их миграцию в процессе гаструляции.
Наша работа посвящена изучению особенностей
экспрессии Wnt11 в клетках линии колоректального
рака.
ОТ-ПЦР анализ экспрессии Wnt11 в клетках линии колоректального рака (HT29) выявил, что использование разных пар праймеров приводит к амплификации разных вариантов кДНК. Секвенирование
последовательности обнаруженных кДНК показало,
что они являются результатом альтернативного
сплайсинга. Используя экспрессионные конструкции с полученными сплайс-вариантами, мы установили, что белок дикого типа и сплайс-варианты обладают разными свойствами. Новый сплайс-вариант
Wnt11 не детектируется в кондиционированной среде, благодаря чему мы предполагаем, что он не явля-
Клиническая гемостазиология.
Рекомендации, регистры, экономика
Актуальность проблем патологии свертывания
крови при различных заболеваниях и состояниях
в дополнительной аргументации не нуждается. Прошедшие 10 лет показали интенсивное развитие гемостазиологии в РФ, позволившее свести к минимуму
отставание от развитых стран по доступности для
применения современных средств диагностики
и коррекции патологии гемостаза. Патология гемостаза не является специфичной для какой-то одной
области медицины. Всеобщее внимание к данной
проблеме обусловливает интенсивное развитие ее
доказательной базы, которая становится основой
для международных и российских Рекомендаций.
Также все шире в рутинную практику внедряется
и другой подход — Регистры, декларирующие индивидуализацию оценки. Данные подходы (на основе
Рекомендаций и на основе Регистров) не противоположны, не взаимоисключают друг друга. Оба подхода обладают своими достоинствами и своими недостатками, но оптимальный для пациента результат
достигается именно при их совместном применении.
Другое дело, что специалист, ежедневно сталкивающийся с нарушениями свертывания крови у своих
больных, должен разбираться в обоих подходах и научиться адекватно их применять. Постепенно эти
подходы внедряются и в нашей стране, о чем свидетельствует разработка российских Рекомендаций
и формирование отечественных Регистров (например, по тромбозам и тромбофилиям).
Клиническая гемостазиология во многом
основана на неразрывной связи между «клиникой»
и «лабораторией», предполагающей тесное взаимодействие лечащих врачей и специалистов по лабора-
’2011
тодом ПЦР, уровень МОБ был достоверно ниже, чем
в конкордатных образцах (p < 0,001). Несмотря на то,
что прямое количественное сопоставление результатов
определения МОБ методами проточной цитометрии
и ПЦР-РВ невозможно, кинетика величины МОБ во
время терапии была сходна. Вследствие этого одновременное применение данных методов может с успехом
использоваться у пациентов, у которых определяется
ХТр. У таких больных, с нашей точки зрения, во время
индукционной терапии и в начале консолидации/интенсификации, когда необходимо количественное
определение МОБ, предпочтительнее использовать
данные проточной цитометрии. В то же время в последующих точках наблюдения, когда достаточно качественного определения МОБ, предпочтительнее использовать результаты определения ХТр в ходе ПЦР
вследствие более высокой чувствительности метода.
49
2
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
2
’2011
50
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
торной диагностике. Такой комплекс определяет потребность в одинаковой подготовке и тех, и других
по вопросам патологии гемостаза. Приятно, что
в нашей стране отмечается положительная динамика
в направлении подобной кооперации.
Применение нового доплерографического временного показателя для
выявления начальных проявлений
диастолической дисфункции левого
желудочка у детей с острым
лимфобластным лейкозом
А.А. Сависько, Н.Ю. Неласов, Е.Д. Теплякова,
С.П. Пармон, Н.Е. Тарасова, А.В. Шестопалов
ГОУ ВПО Ростовский государственный медицинский
университет, Ростов-на-Дону
Одним из серьезных неблагоприятных действий
полихимиотерапии (ПХТ) и токсико-инфекционных
процессов у детей с острыми лейкозами является
развитие сердечно-сосудистых осложнений, которые возникают на разных этапах терапии и в тяжелых
случаях могут приводить к развитию прогрессирующей дисфункции миокарда и сердечной недостаточности. Своевременная диагностика появляющейся
минимальной дисфункции миокарда левого желудочка дает возможность начать профилактическую
терапию и предупредить появление угрожающих
жизни осложнений.
Материалы и методы. Обследовано 94 ребенка
в возрасте от 3 до 17 лет (средний возраст 10,4 года)
с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ). Пациенты с ОЛЛ относились к группе стандартного риска и получали ПХТ по протоколам ALL-MB-2002,
ALL-MB-2008. Все пациенты обследовались трехкратно: до начала ПХТ, после проведения индукции
ремиссии, после окончания интенсивной ПХТ.
Контрольную группу составили 47 здоровых детей.
Обследованные были сопоставимы по возрасту
и полу. Всем детям была проведена доплерэхокардиография (ДЭхоКГ). Измерены следующие
стандартные ДЭхоКГ-показатели: фракции выброса
(ФВ) и фракции укорочения (ФУ) левого желудочка
(ЛЖ), конечный систолический (КСР) и диастолический размеры (КДР) ЛЖ, минутный объем (МО),
ударный объем (УО). Диастолическую функцию
(ДФ) миокарда оценивали с помощью отношения
трансмитрального кровотока Е/А (общепринятый
оптимальный положительный критерий < 1,0),
и В(Е-Еа) (временной интервал E-Ea от начала периода раннего диастолического наполнения ЛЖ по
трансмитральному кровотоку до начала пика Ea высокоамплитудных отраженных сигналов движения
(ВОСД)).
Результаты. Данные средних значений традиционных ДЭхоКГ-показателей, характеризующих систолическую функцию миокарда, у здоровых детей мало чем
отличались от этих показателей у детей, больных ОЛЛ.
Среднее значение ФУ у здоровых обследуемых и детей
с ОЛЛ было не меньше 28 %, а значение ФВ — не ниже
50 % (р > 0,05). При анализе КДР и КСР ЛЖ установлено, что они находились в зоне возрастной нормы. Это
объясняет и отсутствие достоверных различий в показателях МО (здоровые — 5,0 ± 1,4 л/мин; больные — 4,8 ±
1,7 л/мин; р = 0,63), УО (здоровые — 62,7 ± 18,2 мл;
больные — 58,21 ± 17,7; р = 0,17) в изучаемых группах.
При анализе ДФ установлено, что при использовании
показателя трансмитрального кровотока Е/А ее нарушение у детей с ОЛЛ удалось выявить всего в 4,3 % случаев, а при использовании показателя В(Е-Еа) —
в 74,5 % (р < 0,00001) случаев. При этом установлено,
что среднее значение В(Е-Еа) у детей в контрольной
группе составило 20,4 ± 8,5 мс, в 1-й группе (пациенты
до начала химиотерапии) — 19,1 ± 11,2 мс, во 2-й группе (конец индукции ремиссии) — 24,0 ± 15,8 мс,
а у больных после окончания полихимиотерапии — уже
32,3 ± 14,4 мс. Достоверные различия между группой
здоровых детей и 1-й и 2-й группой пациентов с ОЛЛ
отсутствуют (р > 0,05). Но наблюдается явное различие
показателей в этих группах с группой детей после проведения полихимиотерапии (p < 0,001). Полученные
данные позволяют прийти к заключению, что доплерографический параметр В(E-Ea) дает возможность уловить начальные кардиотоксические эффекты у детей
с ОЛЛ, проявляющиеся в изменении ДФ ЛЖ.
Спектр мутаций глобиновых генов
у детей в Российской Федерации
И.О. Саделов1, М.В. Красильникова1,2,
В.О. Бобрынина1, Н.С. Сметанина1,2
1
ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской
гематологии, онкологии и иммунологии
Минздравсоцразвития России;
2
ФГУ Российская детская клиническая больница
Минздравсоцразвития России, Москва
Гемоглобинопатии — это гетерогенная группа заболеваний, которые характеризуются качественным
(аномальные Hb) или количественным (талассемии)
нарушением синтеза гемоглобина. Они являются
наиболее распространенными моногенными заболеваниями, создающими главную проблему здравоохранения во многих странах мира.
Цель работы. Анализ спектра мутаций в и -глобиновых локусах у детей РФ, обратившихся
в поликлинику РДКБ.
Материалы и методы. С мая 2009 по февраль 2011 г.
были обследованы 142 пациента поликлиники РДКБ
с подозрением на гемоглобинопатию, а также члены их
семей. Общее число обследованных составило 198 че-
Мутация
% выявленных
мутаций
вения мутаций, что вызвано гетерогенностью группы
обследованных. В связи с выраженной национальной гетерогенностью популяции РФ необходимо
продолжить определение всех наиболее часто встречаемых делеционных мутаций -глобиновых генов
и проводить секвенирование всей последовательности гена -глобина, в которых зарегистрированы мутации, имеющие клиническое значение.
Нарушение гемостаза у детей
при кардиохирургических операциях
Н.Н. Самсонова
Научный центр сердечно-сосудистой хирургии
им. А.Н. Бакулева РАМН, Москва
Сложность выполняемых операций при врожденных пороках сердца, малый объем циркулирующей
крови, несовершенство физиологических и защитных
механизмов у младенцев требуют четкого представления о системе гемостаза и реологии крови в периоперационном периоде для прогнозирования возможных
осложнений и выбора мер их профилактики и коррекции. Необходимо учитывать, что новорожденные и дети первых месяцев жизни имеют особенности
клеточного и плазменного звеньев системы гемостаза.
Диффузные микрососудистые кровотечения остаются
одной из основных проблем, возникающих после кардиохирургических операций с искусственным кровообращением. Являясь многофакторными коагулопатиями, кровотечения влияют на развитие полиорганной
недостаточности и, в конечном счете, на выживаемость пациента. Основные причины кровотечений —
хирургические, связанные с гемодилюцией, с избыточной антикоагуляцией гепарином, тромбоцитопенией
и тромбоцитопатией, фибринолизом, синдромом диссеминированного внутрисосудистого свертывания.
Для дифференциальной диагностики кровотечений
Частоты мутаций в популяциях по данным HbVar
Русские
Турки
Итальянцы
Тайцы
Cap +20
3,2
–
–
–
–
CD6 GAG GTG
3,2
–
?
?
–
CD8 -AA
29,0
38,71
6,6
0,05
–
CD 8/9 +G
8,1
–
1,55
–
0,12
СD15 TGG TGA
4,8
6,45
–
–
–
IVS-1-1 G A
6,5
10,59
4,4
3,99
0,24
IVS-1-110 G A
6,5
6,45
42,29
11,21
–
IVS-2-1 G A
12,9
4,84
7,41
1,48
–
’2011
ловек, анализ их национальной принадлежности не
проводился. В 127 случаях анализировались -глобиновый локус и ген -глобина, а в 15 случаях исследовался только ген -глобина. Методом ПЦР
с последующим анализом полученных фрагментов методом электрофореза в 1 % агарозном геле в -глобиновом локусе определялись 7 наиболее распространенных делеций (3.7, 4.2, 20.5, MED, SEA, THAI, FIL),
а методом прямого секвенирования исследовались мутации в гене -глобина (HBB).
Результаты. В 16 семьях (12,6 %) были выявлены
делеции в локусе -глобиновых генов: 3.7 в 13 семьях (10,2 %), 20.5 в 5 семьях (3,9 %) и 4.2 в 2 семьях (1,6 %). В 62 семьях (43,7 %) были обнаружены
мутации в гене HBB, из них 54 (42,5%) описаны в литературе как приводящие к -талассемии, а 8 (5,6 %)
связаны с экспрессией аномального гемоглобина
(Hb). В таблице приведены мутации, выявленные
у обследованных, и их доля от числа всех обнаруженных мутаций в гене НВВ; частоты этих мутаций в некоторых популяциях по данным HbVar: A database of
Human Hemoglobin Variants and Thalassemias (http://
globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html).
Однократно были зарегистрированы следующие
мутации: CD5 –CT, CD6 –A, CD16 –C, CD24 –G,
CD26 GAGAAG, CD28 CTGCCG, CD29
GGCGGT, CD30 AGGAGT, IVS-1-6 TC, IVS
1-130 GC, CD30 AGGAGT, CD36 CCTTCT, CD
36/37 –T, CD39 CAGTAG, CD63 CATTAT, TermCD
+96 TC. Следует отметить, что в 2 семьях были одновременно выявлены делеции в -глобиновом локусе
и мутации в гене НВВ, в 4 семьях одновременно обнаружены делеции 3.7 и 20.5, и в 6 семьях были зарегистрированы 2 разные мутации в гене НВВ.
Выводы. У детей, обратившихся в поликлинику
РДКБ, из 7 исследованных делеций были выявлены
только 3: 3.7, 20.5 и 4.2. В гене HBB не было выявлено областей с повышенной частотой возникно-
51
2
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
2
’2011
52
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
нами используется алгоритм, включающий оценку
плазменного и клеточного звена гемостаза, выявляющий
избыток гепарина в крови, активизацию фибринолиза.
В сложных ситуациях дополнительно используется
тромбоэластография. В соответствии с результатами
лабораторного и клинического исследования рекомендуется дополнительная нейтрализация гепарина,
трансфузионная терапия компонентами крови, направленное использование препаратов крови, фармакотерапия или реторакотомия. Высоким является риск
тромботических осложнений в послеоперационном
периоде у детей при хирургической коррекции, связанной с наложением анастомозов, протезированием клапанов сердца.
Наследственные тромбофилии
у беременных
А.В. Соловьева, В.Е. Радзинский
Кафедра акушерства и гинекологии с курсом
перинатологии Российского университета
дружбы народов, Москва
Беременность сопровождается повышением свертывающего потенциала, снижением антикоагулянтной активности и фибринолиза. Тромботический потенциал беременности усугубляют венозный застой
в нижних конечностях за счет сжатия увеличенной
маткой нижней полой и тазовых вен, гормонопосредованное увеличение венозной емкости, резистентность к инсулину и гиперлипидемия. Венозная
тромбоэмболия осложняет беременность с частотой
примерно 1 случай на 1600 рождений и приводит к материнской заболеваемости и смертности.
Существует тесная связь между наследственными тромбофилиями и венозной тромбоэмболией,
что делает обнаружение этих мутаций логической
мишенью для стратегий профилактики. Однако вызывает сомнение, существует ли связь между наследственными тромбофилиями и неблагоприятными
исходами беременности.
В то время как метаанализ и ретроспективные
когортные исследования выявили ассоциацию между наследственными тромбофилиями и потерями в I
триместре беременности, проспективные когортные
исследования не обнаружили связи между наследственными тромбофилиями и гибелью плода (Rey E.
et al., 2003; Dudding T.E., Attia J., 2004; LissaldeLavigne G. et al., 2005).
В некоторых клинических исследованиях сообщалось о связи между содержанием фактора
V Лейдена и преэклампсией, тяжелой преэклампсией и преэклампсией до 37 недель беременности
(Kupferminc M.J. et. al., 1999; Nurk E. et al., 2006). Однако несколько других исследований «контрольслучай» не смогли доказать связь между фактором V
мутации Лейдена и преэклампсией (Currie L. et al.,
2002; Dizon-Townson D. et al., 2005; Kahn S.R. et al.,
2009). Многочисленные исследования также не
смогли установить связь между мутацией протромбина G20210A и преэклампсией или тяжелой преэклампсией (Livingston J.C., 2001; Morrison E.R. et al.,
2002; Lin J., August P., 2005). В нескольких метаанализах обнаружена связь между дефицитом протеинов С/S и преэклампсией, однако эти выводы основаны на небольшом числе исследований, которые
содержат малое число участников (Alfirevic Z. et al.,
2002).
Исследования «случай-контроль», когортные
и систематические обзоры не обнаружили значительной связи между фактором V Лейдена и ограничением роста плода (D’Elia A.V. et al., 2002; Howley H.E.
et al., 2005). Отсутствие связи было отмечено между
мутациями гена G20210A протромбина и ЗВУР
[Franchi F. et al., 2004; Verspyck E. et al., 2004].
Существует достаточно доказательств, устанавливающих связь между тромбофилией и отслойкой плаценты. Метаанализ исследований «случай-контроль»
выявил связь между отслойкой плаценты и гомозиготностью и гетерозиготностью для мутации фактора V
Лейдена и связь между гетерозиготностью при мутации
гена протромбина G20210A и отслойкой плаценты
(Alfirevic Z. et al., 2002). Обнаружена связь между плацентарной отслойкой и гипергомоцистеинемией более
15 мкмоль/л (Vollset S.E. et al., 2000), но минимальная
связь между гомозиготностью для MTHFR C677Tполиморфизма и отслойкой плаценты (Nurk E. et al.,
2004).
Таким образом, увеличение частоты скрининга
тромбофилий у беременных не привело к оптимизации исходов беременности.
Влияние аллогенных мезенхимальных
стволовых клеток на способность
лейкемических клеток к спонтанному
и индуцированному апоптозу
и чувствительность к противолейкемическим препаратам in vitro
О.С. Татаринова1, Е.Ю. Осипова1, Т.В. Шаманская1,
С.А. Плясунова1, В.В. Калинина1, З.М. Дышлевая2,
Е.В. Скоробогатова2, С.А. Румянцев1
1
ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской
гематологии, онкологии и иммунологии
Минздравсоцразвития России;
2
ФГУ Российская детская клиническая больница
Минздравсоцразвития России, Москва
Введение. В последние годы метод трансплантации мезенхимальных стволовых клеток (МСК), как
аутологичных, так и аллогенных, все чаще используется в клинической практике в целях ускорения при-
культур МСК с помощью СВА показало, что МСК
продуцируют широкий спектр цитокинов и растворимых молекул адгезии, которые могут опосредовать влияние МСК на жизнеспособность кроветворных предшественников и лейкемических клеток. Концентрации
цитокинов и растворимых молекул адгезии в кондиционной среде монослойных культур МСК на 6-е сутки
после пассирования составили: IL-2 — 38,7 нг/мл;
IL-4 — 53,6 нг/мл; IL-6 — 145,2 нг/мл; IL-10 — 145,2
нг/мл; sVCAM — 8,73 нг/мл; ICAM — 13,7 нг/мл;
sPECAM — 10,3 нг/мл.
Заключение. В ходе проведенного исследования
показано, что МСК костного мозга доноров могут
оказывать влияние на чувствительность лейкемических клеток пациентов к противолейкемическим
препаратам in vitro: статистически значимо снижают
чувствительность лейкемических клеток миелоидного ряда к даунорубицину и способствуют выживаемости всех групп лейкемических клеток. Широкое
применение трансплантации мезенхимальных клеток в клинической практике, особенно у онкогематологических пациентов, диктует необходимость
проведения широкомасштабных исследований для
изучения механизмов влияния МСК на лейкемические клетки.
Стандартизация молекулярного
мониторинга хронического миелолейкоза, основанного на количественном
определении маркера BCR-ABL (P210)
методом ПЦР в реальном времени
О.Б. Трофимова1, Д.А. Куевда1, А.Ю. Зарицкий2,
А.С. Улитина2, Т.Е. Хомякова3
1
ФГУН Центральный научно-исследовательский
институт эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва;
2
ФГУ Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии
им. В.А. Алмазова, Санкт-Петербург;
3
ООО «Новартис Фарма», Москва
«Лейкоз Квант M-bcr-FRT» — набор реагентов,
позволяющий оценивать количество мРНК транскрипта химерного гена BCR-ABL по отношению
к количеству транскрипта неизмененного гена ABL.
Набор был разработан с учетом правил и требований
European Leukemia Net (ELN), однако европейский
опыт показал, что даже при использовании одинаковых реагентов разные условия работы в лабораториях
приводят к возникновению различий в получаемых
результатах. Критерии оценки ответа на терапию были определены в ходе широкомасштабных исследований для значений отношения BCR-ABL/ABL, выраженных в единой международной шкале. В связи
с этим точность и сопоставимость получаемых лабораторией результатов со значением по международ-
’2011
живления гемопоэтических предшественников и для
коррекции реакции «трансплантат против хозяина»
(РТПХ) при онкогематологических заболеваниях.
Это заставляет задуматься, какое влияние МСК могут оказывать на лейкемические клетки, присутствующие в костном мозге в форме минимальной резидуальной болезни.
Цель работы. Определение влияния аллогенных
мезенхимальных стволовых клеток костного мозга
доноров на пролиферативную активность нормальных гранулоцитарно-макрофагальных (ГМ) предшественников, чувствительность лейкемических клеток при острых лейкозах к противолейкемическим
препаратам in vitro и способность лейкемических
клеток пациентов к спонтанному и индуцированному цитарабином апоптозу.
Материалы и методы. Лейкемические клетки,
выделенные из костного мозга пациентов (6 месяцев — 17 лет) с впервые диагностированными нелечеными острыми лейкозами: B-ОЛЛ — 15, T-ОЛЛ —
4, ОМЛ — 9. МСК (от 23 здоровых доноров) культивировали в среде ДМЕМ с 20 % ЭТС до 3–5-го
пассажа по стандартной методике. Клоногенное исследование ГМ-предшественников костного мозга
проводили в полутвердой агаровой среде. Чувствительность бластных клеток к цитотоксическим препаратам исследовали в MTT-тесте. Для определения
уровней спонтанного и индуцированного апоптоза
в лейкемических клетках использовали Apoptosis
Detection Kit II (BD). Количественное содержание
цитокинов и ростовых факторов в культурах МСК
определяли на проточном цитофлюориметре с использованием реагентов Cytometric Bead Array (СВА)
BD. Статистическая компьютерная обработка полученного материала проводилась при помощи пакета
программ Microsoft Excel и Statistica 8.0.
Результаты. Использование подслоя из МСК стимулирует пролиферацию ГМ-предшественников костного мозга более эффективно, чем добавление такого
стандартного источника колониестимулирующих факторов, как кондиционированная среда от ФГАстимулированных лейкоцитов. Эффективность клонирования составляла 27,9 и 22,9 соответственно. При
культивировании лейкемических клеток на подслое из
МСК в течение 4 суток доля жизнеспособных клеток
была выше на 47,2 % при ОЛЛ и на 63,1 % при ОМЛ по
сравнению с контрольными культурами. Инкубация
лейкемических клеток в присутствии МСК приводила
к снижению чувствительности к цитозару в 2 раза при
В-ОЛЛ. Под влиянием МСК чувствительность к даунорубицину снижалась во всех группах лейкемических
клеток. МСК увеличивали чувствительность бластных
клеток при ОЛЛ к метилпреднизолону. При определении уровней спонтанного и индуцированного апоптоза отмечалось снижение доли апоптотических клеток
под действием МСК в сравнении с группами, инкубированными без подложки из МСК. Исследование
53
2
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
2
’2011
54
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
ной шкале крайне важны для коррекции терапии
и прогноза течения заболевания.
Цель и задачи. Для применения эффективных
принципов терапии, разработанных в Европе, необходима стандартизация российской лабораторной
сети диагностики хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ): сопоставление и международное шкалирование результатов, получаемых в России по сравнению с референс-лабораторией ELN. В рамках
стандартизации
исследований
предусмотрено
2 основных этапа: 1-й — вычисление конверсионного фактора между значениями BCR-ABL/ABL, получаемыми в России и получаемыми в Европе, и 2-й —
получение коэффициентов пересчета между всеми
лабораториями России.
Материалы и методы. Для выполнения первой задачи в ФГУ ФЦСКиЭ им. В.А. Алмазова собраны 30
образцов от пациентов с ХМЛ с разным процентным
содержанием BCR-ABL к ABL, далее они были дважды
измерены в ФГУ ФЦСКиЭ им. В.А. Алмазова, а также
в ЦНИИЭ по принятому стандартному протоколу.
Порции этих образцов отправлены в лабораторию, аккредитованную ELN, в Германии. По результатам двустороннего тестирования 30 образцов будет вычислен
поправочный коэффициент между российскими и европейскими исследованиями. Для выполнения второй
задачи в ЦНИИЭ разработаны контрольные панели,
приготовленные из крови здорового донора и крови
пациента с ХМЛ, смешанной в разных пропорциях для
получения образцов с отношением BCR-ABL/ABL порядка 10 %, 1 %, 0,1 % и 0,01 %. Данные панели разосланы в 15 лабораторий на территории РФ. К настоящему
моменту 12 лабораторий успешно измерили контрольные образцы. Также в рамках второй задачи все 15 российских лабораторий в настоящий момент коллекционируют образцы крови пациентов с соотношением
BCR-ABL/ABL порядка 10 %, 1 %, 0,1 % и 0,01 %. Эти образцы будут измерены в каждой лаборатории дважды,
порции тех же образцов будут измерены в ЦНИИЭ.
Результаты и выводы. По результатам тестирования 30 образцов в России и Европе, а также по результатам тестирования образцов контрольной панели и 5 образцов пациентов в каждой из российских
лабораторий будет вычислен индивидуальный конверсионный фактор пересчета результатов, который
обеспечит сопоставимость всех результатов, получаемых в РФ, а также позволит корректировать терапевтические мероприятия, ориентируясь на рекомендации, определенные для значений в рамках единой
международной шкалы результатов.
Прогностическое значение
определения минимальной остаточной
болезни выявлением химерных
транскриптов у детей первого года
жизни, получавших терапию
по протоколу MLL-Baby
Г.А. Цаур1,3, А.М. Попов1,3, Т.В. Наседкина2,
О.В. Каленник2, А.М. Кустанович4, О.В. Алейникова4,
Т.О. Ригер1,3, Е.В. Шориков1,3, Л.И. Савельев5,
Л.Г. Фечина1,3
1
Областная детская клиническая больница № 1,
Екатеринбург; 2Институт молекулярной биологии
им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва; 3Институт
медицинских клеточных технологий, Екатеринбург;
4
Республиканский научно-практический центр
детской онкологии и гематологии, Минск; 5ГОУ ВПО
Уральская государственная медицинская академия,
Екатеринбург
Цель работы — оценка прогностического значения минимальной остаточной болезни (МОБ), выявляемой методом обратно-транскриптазной ПЦР
(ОТ-ПЦР) с определением различных химерных
транскриптов (ХТр) гена MLL у детей, включенных
в протокол MLL-Baby.
Методы. Наличие перестроек гена MLL выявлялось методами гнездной ОТ-ПЦР, FISH и подтверждалось длинной инвентированной ПЦР. Выявление
ХТр проводилось одновременно методами качественной гнездной ОТ-ПЦР и количественной ПЦР
в реальном времени по ранее описанным протоколам. Под МОБ-негативностью понимали отсутствие
ХТр в обоих исследованиях с чувствительностью не
ниже 1  10–4. В исследование включены 23 пациента, у которых образцы костного мозга были взяты не
менее чем в 4 точках наблюдения (ТН). Медиана наблюдения составила 30 (7–90) мес.
Результаты. В исследуемой группе было 13 пациентов с наличием ХТр MLL-AF4, 3 — с MLL-EPS15,
по 2 — с MLL-MLLT10 и MLL-MLLT1 и 1 — с MLLMLLT3. Образцы костного мозга были взяты на момент диагностики, на 15-й (ТН1) и 36-й (ТН2) дни
индукционной терапии и далее после каждого курса
полностью транс-ретиноевой кислоты. Производился расчет бессобытийной выживаемости (БСВ). Исходя из качественных результатов определения
МОБ, пациенты подразделялись на МОБпозитивных и МОБ-негативных. Самой ранней ТН,
для которой были получены статистически значимые различия в БСВ МОБ-позитивных и МОБнегативных пациентов, являлась ТН3. В зависимости от наличия МОБ в ТН3 и ТН4 пациенты были
разделены на 3 группы. Группа стандартного риска,
выделенная по результатам определения МОБ,
Результаты цитогенетической
и молекулярно-генетической
диагностики острых лейкозов у детей
первого года жизни
Г.А. Цаур1,2, Е.В. Флейшман3, А.М. Попов1,2,4,
О.И. Сокова3, О.В. Алейникова5, Э.Г. Бойченко6,
Е.В. Волочник5, А.С. Иванова1,2, О.В. Каленник7,
Н.П. Кирсанова5, К.Л. Кондратчик8,
А.М. Кустанович5, Е.C. Лапотентова5, Д.В. Литвинов9,
И.С. Мартынкевич10, Н.В. Мякова9, Т.В. Наседкина7,
В.А. Овсепян11, Ю.В. Ольшанская9, О.М. Плеханова1,
А.В. Попа3, Т.О. Ригер1,2, Л.И. Савельев1,2,4,
О.В. Стренева1,2, М.В. Стригалева1, И.В. Шмунк12,
Е.В. Шориков1,2, Л.Г. Фечина1,2
1
Областная детская клиническая больница № 1,
Екатеринбург; 2Институт медицинских клеточных
технологий, Екатеринбург; 3Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва;
4
ГОУ ВПО Уральская государственная медицинская
академия, Екатеринбург; 5Республиканский научнопрактический центр детской онкологии и гематологии,
Минск; 6Детская городская больница № 1,
Санкт-Петербург; 7Институт молекулярной биологии
им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва; 8Морозовская
детская городская клиническая больница, Москва;
9
ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской
гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития России, Москва; 10Российский научноисследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России, Санкт-Петербург; 11ФГУ
Кировский научно-исследовательский институт
гематологии и переливания крови ФМБА России;
12
Челябинская областная станция переливания крови
В исследуемую группу вошло 155 детей в возрасте
от 1 дня до 12 мес (медиана — 6,5 мес), включая 117
пациентов с ОЛЛ, 31 — с ОМЛ и 7 — с другими типами острого лейкоза. Среди выявленных генетических
аберраций наиболее часто обнаруживали транслокации с участием района 11q23/MLL. Они доминировали как при ОЛЛ — 63,2 %, так и при ОМЛ — 48,4 %.
Частота отдельных специфических транслокаций
с участием 11q23/MLL различалась при ОЛЛ и ОМЛ.
Среди группы с наличием транслокаций 11q23/MLL
преобладала t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4 — 63,5 % случаев, реже встречались t(11;19)(q23;p13)/MLLMLLT1 — 18,9 % случаев, t(10;11)(p12;q23)/MLLMLLT10 и t(1;11)(p32;q23)/MLL-EPS15 — по 6,8 %.
В возрасте младше 6 мес транслокации 11q23/MLL
были выявлены в 84,0 % случаев, что достоверно чаще, чем возрасте 6–12 мес — 47,8 % случаев (р < 0,001).
Структура химерного транскрипта определена у 26
пациентов с ОЛЛ. В 14 из 26 (53,8 %) случаев точка
слияния располагалась в 11 экзоне гена MLL. Самой
частой перестройкой при ОМЛ была t(10;11)(p12;q23)/
MLL-MLLT10, которая обнаружена у 6 (19,4 %) пациентов. В 5 случаях ОМЛ выявлена t(1;22)(p13;q13).
Сложный кариотип — 3 или более числовых и/или
структурных аномалии, в том числе перестройки
11q23 с отсутствием маркеров благоприятного прогноза — обнаружен у 4 пациентов с ОМЛ. В 6 случаях
у пациентов с нормальным кариотипом использование ОТ-ПЦР и FISH помогло выявить наличие критических вариантов транслокаций района 11q23. Цитогенетические и молекулярно-генетические изменения,
прогностически важные при острых лейкозах у детей
более старших возрастных групп, у детей первого года
жизни наблюдались чрезвычайно редко: выявлено по
1 случаю t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL и t(1;19)(q23;p13)/
TCF3-PBX, 2 случая inv(16)(p13q22), 2 случая высокой
гипердиплоидии, 1 случай гиподиплоидии.
Особенности энергетического
обмена у детей с онкологическими
заболеваниями
Г.Я. Цейтлин1, М.В. Коновалова1, А.Ю. Вашура1,
Е.В. Скоробогатова2, Д.В. Литвинов1
1
ФГУ Федеральный научно-клинический центр детской
гематологии, онкологии и иммунологии
Минздравсоцразвития России;
2
ФГУ Российская детская клиническая больница
Минздравсоцразвития России, Москва
Питание — важный фактор, влияющий на состояние здоровья и эффективность адаптации организма к неблагоприятным условиям. Рационы питания,
разработанные для детских ЛПУ, нельзя считать соответствующими потребностям конкретного пациента онкопедиатрической клиники в энергии и пищевых ингредиентах, поскольку их расчет базируется
на усредненных значениях и в минимальной степени
позволяет учитывать индивидуальные показатели
состояния питания и нарушения метаболизма у кон-
’2011
включала 8 пациентов, которые были МОБнегативными в обеих ТН. Пять пациентов, оставшихся МОБ-позитивными в ТН4, были отнесены
в группу высокого риска. Группа промежуточного
риска состояла из 10 пациентов, которые были МОБпозитивны в ТН3, но стали МОБ-негативными
в ТН4. Исходы терапии в этих группах были различны. БСВ в 1-й группе составила 1,00; во 2-й — 0,70 ±
0,14 и в 3-й — 0,20 ± 0,17 (p = 0,002). Таким образом,
мониторинг МОБ путем определения ХТр имеет
важное прогностическое значение для пациентов
первого года жизни с ОЛЛ и наличием перестроек
гена MLL, получавших терапию по протоколу MLLBaby. Результаты определения МОБ позволили разделить пациентов на 3 группы с различными исходами терапии.
55
2
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
2
’2011
56
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
кретного ребенка. По данным разных авторов, нутритивная недостаточность (НН) отмечается у 20–
50 % детей со злокачественными новообразованиями уже при первичном поступлении в клинику,
а в процессе химиотерапии эти нарушения имеют
место практически у 100 % пациентов. В специальных исследованиях установлена существенная связь
НН с повышенным риском развития осложнений
полихимиотерапии (ПХТ), плохим заживлением
операционных ран, нарушениями иммунного статуса и т. д.
Цель работы. Оценить величину энергопотребности покоя (Еп) у детей с онкологическими заболеваниями в процессе химиотерапии и в посттрансплантационном периоде.
Материалы и методы. Еп измерялась в динамике
у 37 детей в возрасте от 5 до 17 лет (медиана — 11,7
лет), получавших ПХТ (5 человек) или находившихся в посттрансплантационном периоде (32 ребенка);
всего произведено 102 измерения. Еп оценивали методом непрямой калориметрии с использованием
метаболографа Ultima CCM (Medgraphics, USA).
Результаты и обсуждение. В 63,7 % наблюдений
отмечено существенное снижение Еп по сравнению
с расчетным, причем в 25,5 % случаев снижение носило выраженный характер — от 30 до 50 %; в 4,9 %
случаев Еп была увеличена на 10–20 %; только
в 31,4 % наблюдений значение Еп практически не
отличалось от расчетного. Следовательно, оценка Еп
детей, получающих ПХТ и/или находящихся в посттрансплантационном периоде, с использованием
расчетных формул может приводить к серьезным
ошибкам, что нужно учитывать при проведении нутритивной поддержки этих пациентов.
Заключение. Полученные данные обосновывают
необходимость постоянного мониторинга энергопотребности детей с онкологическими заболеваниями
в процессе специального лечения для выработки индивидуальной программы нутритивной поддержки.
развития и прогрессии опухолей. Действительно, исследование панели опухолей немелкоклеточного рака
легкого выявило частое (в 76 % случаев) увеличение
экспрессии Chp в ткани опухолей по сравнению с прилегающей нормальной тканью легкого. Таким образом,
экспрессия Chp может быть ассоциирована с опухолевыми клетками, что предполагает участие Сhp в канцерогенезе. Исследуя молекулярные механизмы действия
Chp, нами было установлено, что экспрессия Chp
вызывает образование филоподий, что вместе с ранее
описанным Chp-зависимым формированием ламеллиподий и фокальных контактов предполагает участие
Chp, сходно с другими Rho ГТФазами, в контроле миграционных и инвазивных свойств клеток. Исследуя
молекулярные механизмы, лежащие в основе участия
Chp в контроле динамики цитоскелета, нами было установлено, что Chp взаимодействует с белком IRSp53, который в зависимости от молекулярного контекста
может вызывать формирование как филоподий, так
и ламеллиподий. Кроме того, нами было выявлено взаимодействие Chp с тубулином и микротрубочками, что
является механистической основой для возможной
роли Chp как координатора актинового и микротрубочкового цитоскелетов клеток. Наконец, нами было продемонстрировано, что Chp обладает способностью активировать JNK-сигнальный каскад, играющий важную роль в прогрессии опухолей. Суммируя результаты
наших исследований, мы впервые выявили увеличенную экспрессию ГТФазы Chp при раке легкого, что позволяет рассматривать Chp как новый молекулярный
маркер опухолей легкого. Полученные нами данные
предполагают участие Chp как в контроле миграционных и инвазивных свойств клеток, так и в регуляции
внутриклеточных сигнальных путей, гиперактивация
которых наблюдается в опухолевых клетках. Полученные результаты служат основанием для дальнейшего
исследования роли Chp в процессах возникновения
и прогрессии опухолей и как потенциально новой мишени в противоопухолевой терапии.
Атипичная Rho ГТФаза Chp/RhoV:
новый участник канцерогенеза?
Фенотип пациентов
с миелопролиферацией,
имеющих мутацию V617F гена JAK2
М.В. Шепелев, И.В. Коробко
Институт биологии гена РАН, Москва
Белки семейства Rho ГТФаз участвуют в регуляции
многих клеточных процессов, включая перестройку актинового цитоскелета, установление полярности клеток, прогрессию клеточного цикла и др., а также играют
существенную роль в прогрессии опухолей. Chp/RhoV
является малоизученной атипичной Rho ГТФазой.
К настоящему времени было выявлено, что экспрессия
Chp индуцирует формирование ламеллиподий и фокальных контактов, а также активирует про-онкогенную
протеинкиназу Pak1. Это предполагает, что экспрессия
Chp может вносить существенный вклад в процессы
И.В. Шмунк1, Е.П. Конева1, Т.А. Суслова1,
М.Н. Русаков2, В.Э. Ботвиновский2,
С.Н. Андриевских3, О.В. Коробицына4, А.В. Коробкин4
1
ОГУП Челябинская областная станция переливания
крови; 2Городская клиническая больница № 1,
Челябинск; 3Городская клиническая больница № 8,
Челябинск; 4Челябинская областная клиническая
больница
Введение. Определение мутации V617F гена JAK2
включено в перечень диагностических критериев
WHO для миелопролиферативных заболеваний
тов с PV: m(tr PV) = 567  109/л (450–1325  109/л), что
ниже уровня тромбоцитов у пациентов с ET:
m(tr ET) = 734  109/л (480–3000  109/л) р = 0,038.
Также повышенное количество тромбоцитов имели
62 % пациентов с недифференцированной миелопролиферацией (MPN): m(tr MPN) = 653  109/л
(450–3420  109/л), достоверные различия с ET отсутствуют. Повышенный уровень лейкоцитов ПК отмечен в группе с MPN: m(L MPN) = 16,7  109/л (4,7–
74,0 109/л) против m(L PV) = 10,0  109/л (4,9–36,5 
109/л), p = 0,011; m(L ET) = 11,5  109/л (4,8–22,7 
109/л), p = 0,001. Спленомегалия отмечена в 22 % случаев PMF, в 10 % случаев MPN и у 3,8 % пациентов
с PV + ET. Соотношение мутантного аллеля и аллеля
дикого типа различается в группах с разными типами
MPN: более 50 % мутантного аллеля присутствует
у 54 % пациентов с PV (m( Ct) = 0,9 (–8 – +23))
и 60 % MPN (m(Ct) = 0,25 (–13 – +23)). Преобладание аллеля дикого типа над мутантным имело место
в группе ET (m( Ct) = –1,5 (–14 – +3)) и PMF
(m(Ct) = –1,7 (–10 – +1,5)) — у 76,7 % и 77,8 % пациентов соответственно. Различия достоверны для
ET с PV (p = 0,001) и с MPN (р = 0,001).
Вывод. Мутация V617F гена JAK2 определяется
у пациентов с различным клиническим фенотипом
BCR/ABL-негативной миелопролиферации. Более
низкая аллельная нагрузка характерна для пациентов с эссенциальной тромбоцитемией.
’2011
(MPN): истинной полицитемии (PV), эссенциальной тромбоцитемии (ET), первичного миелофиброза (PMF). Эта мутация не является специфичной для
определенного типа MPN, но подтверждает клональную природу пролиферации.
Материалы и методы. V617F определяли в геномной ДНК методом ПЦР в режиме реального времени
с использованием реактивов ООО НПФ Синтол
(Москва) и Ipsogen (France). Минимальное определяемое количество мутантного аллеля составляет
2 %. Соотношение мутантного аллеля и аллеля дикого типа оценивали по  Ct=Ct(G)-Ct(T). Для оценки
статистической значимости различий использовали
t-тест Стьюдента и точный критерий Фишера.
Результаты. На наличие мутации обследовано
645 пациентов с подозрением на миелопролиферацию. Выявлено 167 пациентов с мутацией V617F:
35 — с диагнозом PV (15 мужчин / 20 женщин); 43 —
с ET (16 мужчин / 27 женщин); 9 — с PMF (2 мужчины / 7 женщин) и 80 (37 мужчин / 43 женщины) — не
были верифицированы по конкретному типу MPN.
Медиана (m) возраста пациентов с мутацией составила 60 (19–84) лет. Пациентов в возрасте до 40 лет
в группе с ET было 14 % (только женщины), в группе
с PV — 5,7 %, в группе с MPN — 8,8 %. Уровень гемоглобина у пациентов с PV составил m(Hb) = 179
(165–216) г/л. Повышенное количество тромбоцитов периферической крови (ПК) имели 60 % пациен-
57
2
КОНФЕРЕНЦИИ, СИМПОЗИУМЫ, СОВЕЩАНИЯ
58
’2011
П Р Е С С - Р Е Л И З
2
Знать и применять: возможности хелаторной терапии
Вопросы эффективной помощи пациентам с редкими гематологическими заболеваниями были подняты в рамках научной конференции «Хелаторная терапия: вчера, сегодня, завтра». Речь шла о современных технологиях
и средствах лечения больных, страдающих от вторичной перегрузки железом в результате переливаний эритроцитной массы, которая как у детей, так и у взрослых ведет к тяжелым последствиям. Однако сегодня уже широко доступен препарат, способный эффективно выводить избыток железа из организма, предотвращая и купируя осложнения
перегрузки железом, — пероральный хелатор железа Эксиджад.
Одна из причин образования избыточного количества
железа — неоднократные переливания эритроцитов (гемотрансфузии). По оценкам, вторичная перегрузка железом
вследствие регулярной заместительной терапии трансфузиями эритроцитной массы может развиваться у 500 больных детей и 2000 взрослых в России. Заменить гемотрансфузию
зачастую нечем — пациенты с различными формами наследственных, врожденных и вторичных анемий, как правило,
находятся в стойкой зависимости от постоянных переливаний компонентов крови. К числу подобных заболеваний
можно отнести редкие, но все же встречающиеся в РФ талассемии и другие гемоглобинопатии, врожденные и вторичные
апластические анемии, сидеробластную анемию и миелодиспластические синдромы (МДС). Все эти заболевания признаны Orphanet* редкими (орфанными**).
Диагноз врожденных и наследственных анемий, как
правило, устанавливается вскоре после рождения, и уже
к двум годам пациенты не могут обходиться без регулярных гемотрансфузий. Перегрузка организма железом приводит к ранней инвалидизации детей и их ранней гибели —
уже к 10 годам. Причинами смерти часто становятся
осложнения лечения основного заболевания, связанные
с перегрузкой железом, — сердечная недостаточность
и кардиомиопатии (60 % всех летальных исходов), цирроз
печени, печеночная недостаточность, сахарный диабет.
Однако при правильном, адекватном и своевременном лечении продолжительность жизни пациента увеличивается до 50–60 лет. Единственная возможность, дающая шанс если не излечить, но стабилизировать основное
заболевание, — активное удаление избытка железа из организма. Своевременное назначение лечения, направленного
на элиминацию избыточного железа (хелаторная терапия)
позволяет предотвращать или уменьшать его накопление
в тканях и органах. Тот же способ — удаление избытка железа из организма — высоко эффективен в лечении друго-
го редкого заболевания — наследственного гемохроматоза, как правило, выявляемого у взрослых.
Настоящим прорывом в лечении посттрансфузионной перегрузки железом стало создание и внедрение
в практику в 2005 г. первого перорального хелатора железа
для однократного суточного приема — препарата Эксиджад (деферазирокс).
«Эксиджад относится к группе лекарств-комплексонов, — пояснил д.м.н., член-корреспондент РАМН директор
Федерального научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии А.Г. Румянцев. — Он
связывает и выводит из организма избыточное железо, позволяя серьезно улучшить выживаемость пациента,
который нуждается в постоянных гемотрансфузиях — переливаниях компонентов крови, и по разным причинам
накапливает железо в организме».
Эксиджад позволяет проводить лечение в течение длительного времени, в том числе и амбулаторно. Препарат
выпускается в форме растворимых в жидкости таблеток,
и потому обладает существенными преимуществами за
счет удобства применения (особенно для детей).
«Только благодаря тому, что сегодня на рынок выведена пероральная форма, удобная для приема, гематологическая общественность стала медленно, но уверенно
двигаться к решению проблемы гемотрансфузионной перегрузки железом», — объяснил д.м.н., главный научный
сотрудник Российского НИИ гематологии и трансфузиологии (Санкт-Петербург) С.В. Грицаев.
Успешный опыт применения хелатора железа позволяет утверждать, что своевременная и правильная терапия
продляет и делает полноценной жизнь пациентов, страдающих талассемией и врожденными наследственными анемиями. Больные, получающие препарат амб улаторно, могут полноценно участвовать в жизни общества, учиться,
работать.
*
Orphanet — информационный портал о редких заболеваниях, необходимых для их лечения «лекарствах-сиротах» и редко применяемых
медицинских технологиях.
**
Орфанные заболевания — заболевания, которые считаются редкими, если имеют распространенность не более 5 случаев на 100 тыс.
населения. Лечение таких болезней осуществляется за счет государственного бюджета, государство также обеспечивает заболевших
лекарствами. Орфанные препараты — фармацевтические средства, разработанные для лечения редких заболеваний.
59
2
’2011
П Р Е С С - Р Е Л И З
В состав президиума конференции вошли ученые — ведущие специалисты в области онкогематологии
Эксиджаду присвоен орфанный статус на территории
европейских стран, США, Австралии и Турции — это означает, что больные обеспечиваются препаратом бесплатно
на протяжении всей жизни за счет государства. В 2007 г.
Эксиджад был зарегистрирован на территории РФ для
применения при хронической посттрансфузионной перегрузке железом у взрослых и детей в возрасте от 2 лет.
Однако до сих пор одно из наиболее неблагоприятных
осложнений гемотрансфузионной терапии не имеет официально принятого в России стандарта лечения — в отличие от большинства зарубежных стран, — отметили
участники конференции. В настоящее время идет работа
над обновленными стандартами медицинской помощи
при гематологических заболеваниях, которые приблизят
возможности лечения наших пациентов к международным
рекомендациям; создается регистр трансфузионнозависимых анемий.
В ходе скрининговой диагностической программы
в России выявлено более 2000 пациентов, страдающих
гематологическими заболеваниями и регулярно получающих заместительные гемотрансфузии, и определено количество пациентов, нуждающихся в хелаторной терапии.
Учитывая тот факт, что в 2011 г. Эксиджад внесен в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных
препаратов (ЖНВЛП), полученные данные позволят органам здравоохранения выяснить, какое количество средств
необходимо для пациентов, нуждающихся в лечении,
и сделать помощь государства адресной.
Какие же проблемы остаются нерешенными? Прежде
всего, необходимо обеспечить хелаторной терапией всех
без исключения нуждающихся пациентов: до сих пор таких больных гораздо больше, чем тех, кто получает
препарат. Насущной является необходимость включения
в перечень орфанных (редких) заболеваний талассемии,
апластической и гемолитической анемий, МДС для обеспечения пациентов жизнеспасающей хелаторной терапией. Проблема заключается и в неопределенности группы
орфанных заболеваний в новой редакции закона «О лекарственных средствах».
Повсеместная доступность диагностики перегрузки
железом и выработка четких показаний к хелаторной терапии (особенно у пациентов с МДС и пациентов, нуждающихся в трансплантации костного мозга) — также в числе
самых актуальных проблем помощи гематологическим
больным. По мере решения этих вопросов разница между
числом нуждающихся в терапии Эксиджадом и числом пациентов, получающих хелаторную терапию, будет уменьшаться. А это означает, что врачи получат уверенность
в своих возможностях, и, соответственно, в хорошем прогнозе для своих пациентов — достойной жизни при любом
заболевании, даже если оно редкое.
«Компания «Новартис» видит свою социальную ответственность в том, что производит редкий препарат,
способный помочь только ограниченной группе пациентов. Но, с другой стороны, это значит, что медицина становится персонализированной — мы можем предлагать
конкретному пациенту предназначенные только для него
лечебные препараты, и это огромный прогресс», — уверена Н.В. Лободенко, генеральный менеджер департамента
онкологических препаратов ООО «Новартис Фарма».
Информация для авторов
2
’2011
60
При оформлении статей, направляемых в журнал «Онкогематология», следует руководствоваться следующими правилами:
• Ссылки на таблицы, рисунки и другие иллюстративные материалы приводятся в надлежащих местах по тексту статьи в круглых скобках, а их
расположение указывается автором в виде квадрата на полях статьи
слева.
1. Статья должна быть представлена в электронном виде (компактдиск или дискета) с распечаткой на бумаге формата А4 в двух экземплярах (таблицы, графики, рисунки, подписи к рисункам, список литературы,
резюме — на отдельных листах).
Шрифт — Times New Roman, 14 пунктов, через 1,5 интервала. Все
страницы должны быть пронумерованы.
5. Единицы измерений даются в СИ.
Все сокращения (аббревиатуры) в тексте статьи должны быть полностью расшифрованы при первом употреблении. Использование необщепринятых сокращений не допускается.
Название генов пишется курсивом, название белков — обычным
шрифтом.
2. На первой странице должно быть указано: название статьи, инициалы и фамилии всех авторов, полное название учреждения (учреждений), в котором (которых) выполнена работа, город.
Обязательно указывается, в каком учреждении работает каждый из
авторов.
Статья должна быть подписана всеми авторами. В конце статьи
должны быть обязательно указаны контактные телефоны, рабочий
адрес с указанием индекса, факс, адрес электронной почты и фамилия, имя, отчество полностью, занимаемая должность, ученая степень, ученое звание автора (авторов), с которым редакция
будет вести переписку.
6. К статье должен быть приложен список цитируемой литературы,
оформленный следующим образом:
• Список ссылок приводится в порядке цитирования. Все источники
должны быть пронумерованы, а их нумерация — строго соответствовать
нумерации в тексте статьи. Ссылки на неопубликованные работы не допускаются.
• Для каждого источника необходимо указать: фамилии и инициалы авторов (если авторов более 4, указываются первые 3 автора, затем ставится
«и др.» в русском или «et al.» – в английском тексте).
• При ссылке на статьи из журналов указывают также название статьи; название журнала, год, том, номер выпуска, страницы.
• При ссылке на монографии указывают также полное название книги,
место издания, название издательства, год издания.
• При ссылке на авторефераты диссертаций указывают также полное
название работы, докторская или кандидатская, год и место издания.
• При ссылке на данные, полученные из Интернета, указывают электронный адрес цитируемого источника.
• Все ссылки на литературные источники печатаются арабскими цифрами
в квадратных скобках (например, [5]).
• Количество цитируемых работ: в оригинальных статьях желательно не
более 20—25 источников, в обзорах литературы — не более 60.
Уважаемые коллеги!
3. Объем статей: оригинальная статья — не более 12 страниц; описание отдельных наблюдений, заметки из практики — не более 5 страниц; обзор литературы — не более 20 страниц; краткие сообщения
и письма в редакцию — 3 страницы.
Структура оригинальной статьи: введение, материалы и методы, результаты исследования и их обсуждение, заключение (выводы).
К статьям должно быть приложено резюме на русском языке, отражающее содержание работы, с названием статьи, фамилиями и инициалами авторов, названием учреждений. Объем резюме — не более 1/3
машинописной страницы с указанием ключевых слов.
4. Иллюстративный материал:
• Фотографии должны быть контрастными; рисунки, графики и диаграммы — четкими.
• Фотографии представляются в оригинале или в электронном виде в формате TIFF, JPG, CMYK с разрешением не менее 300 dpi (точек на дюйм).
• Графики, схемы и рисунки должны быть представлены в формате EPS
Adobe Illustrator 7.0—10.0. При невозможности представления файлов
в данном формате необходимо связаться с редакцией.
• Все рисунки должны быть пронумерованы и снабжены подрисуночными подписями. Подписи к рисункам даются на отдельном листе. На рисунке указываются «верх» и «низ»; фрагменты рисунка обозначаются
строчными буквами русского алфавита — «а», «б» и т. д. Все сокращения
и обозначения, использованные на рисунке, должны быть расшифрованы в подрисуночной подписи.
• Все таблицы должны быть пронумерованы, иметь название. Все сокращения расшифровываются в примечании к таблице.
7. Представление в редакцию ранее опубликованных статей не допускается.
8. Все статьи, в том числе подготовленные аспирантами и соискателями ученой степени кандидата наук по результатам собственных исследований, принимаются к печати бесплатно.
Статьи, не соответствующие данным требованиям,
к рассмотрению не принимаются.
Все поступающие статьи рецензируются.
Присланные материалы обратно не возвращаются.
Редакция оставляет за собой право на редактирование статей, представленных к публикации.
Авторы могут присылать свои материалы по адресу: 115478,
Москва, Каширское шоссе, д. 24, стр. 15 либо по электронной
почте на адрес редакции: redactor@abvpress.ru с обязательным указанием названия журнала.
ТЕРАПИЯ ВЫСОКИХ ДОСТИЖЕНИЙ
Показания. Неходжкинская лимфома Рецидивирующая или химиоустойчивая В-клеточная, СD20-положительная неходжкинская лимфома низкой степени злокачественности или фолликулярная. Фолликулярная лимфома III-IV стадии в комбинации с
химиотерапией у ранее нелеченных пациентов. Фолликулярная лимфома в качестве поддерживающей терапии после ответа на индукционную терапию. СD20-положительная диффузная В-крупноклеточная неходжкинская лимфома в комбинации
с химиотерапией по схеме CHOP. Хронический лимфолейкоз в комбинации с химиотерапией у пациентов, ранее не получавших стандартную терапию. Рецидивирующий или химиоустойчивый хронический лимфолейкоз в комбинации с химиотерапией.
Ревматоидный артрит (активная форма) у взрослых в комбинации с метотрексатом при непереносимости или неадекватном ответе на текущие режимы терапии, включающие один или более ингибиторов фактора некроза опухолей (ФНО-а). Безопасность и эффективность препарата у детей не установлены. Противопоказания. Гиперчувствительность к ритуксимабу, любому компоненту препарата или к белкам мыши, острые инфекционные заболевания, выраженный первичный или вторичный
иммунодефицит. Правила приготовления и хранения раствора. Необходимое количество препарата набирают в асептических условиях и разводят до расчетной концентрации (1-4 мг/мл) в инфузионном флаконе (пакете) с 0.9% раствором натрия
хлорида для инфузий или 5% раствором декстрозы (растворы должны быть стерильными и апирогенными). Приготовленный инфузионный раствор Мабтеры физически и химически стабилен в течение 12 ч при комнатной температуре или в течение
не более 24 ч при температуре от 2 до 8 °С. Мабтеру вводят внутривенно, инфузионно (медленно), через отдельный катетер. Нельзя вводить в/в болюсно или в виде в/в инъекций. Дополнительная информация в инструкции по применению.
ЗАО «Рош-Москва»
Официальный дистрибьютор
«Ф. Хоффманн - Ля Рош Лтд.» (Швейцария)
Россия, 107031 Москва
Трубная площадь, дом 2
Бизнес-центр «Неглинная Плаза»
Тел.: + 7 (495) 229-29-99
Факс: + 7 (495) 229-79-99
www.roche.ru