Мутационная изменчивость Геномные мутации Методы учета мутаций

Мутационная
изменчивость
Геномные мутации
Методы учета мутаций
Мутации геномного типа
 Геномные мутации – изменения количества
хромосом в геноме, кратное или некратное
их гаплоидному числу.
 Причинами геномных мутаций являются
нерасхождения хромосом в мейозе, утрата
одной из хромосом в результате анафазного
отставания, нарушения в митотическом
цикле.
Геномные мутации
(классификация)
Геномные
мутации
Анеуплоидия
Трисомия
Полиплоидия
Моносомия
Гаплоидия
Автополиплоидия Аллополиплоидия
Анеуплоидия
Анеуплоидию подразделяют на 2 основных
типа:
 Трисомия (2n+1); (2n+2) – тетрасомия; (2n+2) –
пентасомия и т.д.
 Моносомия (2n-1); (2n-2) - нуллисомия
Т.о. анеуплоидия возникает вследствие
изменения числа хромосом некратное
гаплоидному набору вследствие
нерасхождения хромосом в мейозе или
митозе.
Нерасхождение хромосом как
причина анеуплоидии
Анеуплоидия
 Впервые явление анеуплоидии было
открыто К.Бриджесом у дрозофилы (1916г)
при помощи формально-генетического
анализа; позднее эти результаты были
подтверждены цитогенетически.
 Трисомии и моносомии имеют
самостоятельное фенотипическое
проявление, т.к. в каждом случае
происходит либо утрата, либо приобретение
дозы генов, характерных для конкретной
хромосомы.
Анеуплоидия
 Интенсивность фенотипического
проявления анеуплоидии зависит в первую
очередь от информационной емкости той
хромосомы, по которой происходит
изменение.
Фенотипическое проявление трисомий у
дурмана (Datura stramonium)
 Так, еще в 20-х годах
XX века А.Блексли и
Дж.Беллинг показали,
что искусственное
создание трисомиков
по каждой из 12
хромосом у дурмана
приводит к появлению
характерного фенотипа
растения, непохожего
на все прочие.
(из Д.Ф. Петров, 1976)
Примеры анеуплоидий у человека
Синдром Дауна
 (трисомия хромосомы №21).
Для больных характерно:
округлой формы голова с
уплощенным затылком, узкий
лоб, широкое, плоское лицо,
эпикант, запавшая спинка
носа, косой (монголоидный)
разрез глазных щелей, толстые
губы, утолщенный язык с
глубокими бороздами,
выступающий изо рта. Из
пороков внутренних органов
наиболее типичны пороки
сердца (дефекты
межжелудочковой или
межпредсердной перегородок)
и органов пищеварения
(атрезия двенадцатиперстной
кишки).
Кариотип мальчика с трисомией
хромосомы №21
Рисунок с сайта bio miami edu
Синдром Дауна
 Среди больных с синдромом Дауна с более
высокой частотой, чем в популяции, встречаются
случаи лейкемии и гипотиреоза. У маленьких
детей резко выражена мышечная гипотония, а у
детей старшего возраста часто обнаруживается
катаракта. С самого раннего возраста отмечается
отставание в умственном развитии. Среднее
значение IQ составляет 50, но чаще встречается
умеренная задержка умственного развития.
Средняя продолжительность жизни при синдроме
Дауна значительно ниже (36 лет), чем в
популяции.
Синдром Дауна
 СД - самая частая форма хромосомной патологии у
человека (1:750). Цитогенетически синдром Дауна
представлен простой трисомией (94% случаев),
транслокационной формой (4%) или мозаицизмом
(2% случаев). У мальчиков и девочек патология
встречается одинаково часто.
 Достоверно установлено, что дети с синдромом
Дауна чаще рождаются у пожилых родителей. Если
возраст матери 35-46 лет, то вероятность рождения
больного ребенка возрастает до 4,1%.
Синдром Патау

(трисомия хромосомы №13).
Наблюдается с частотой 1 на 6000
родов. У новорождённых средняя
масса тела. Умственная отсталость
тяжёлая, многие дети страдают
глухотой. Нередко обнаруживается
умеренная микроцефалия с
нависающим лбом, большие
анатомические дефекты мозга,
незаращение нёба и верхней губы.
Часто наблюдаются поперечная
ладонная складка, полидактилия и
узкие выпуклые ногти на пальцах
рук. Более чем в 80% случаев
регистрируются врождённые
пороки сердца. Большинство
больных (70%) настолько серьезно
поражены, что погибают в
возрасте до 6 месяцев, только 20%
доживает до года
(из С.И.Козлова и др., 1996)
Синдром Эдвардса

(трисомия по 18 хромосоме).
Дополнительная 18 хромосома
обнаруживается у 1 из 7000
новорождённых. Часто
проявляется микроцефалия, низко
посаженные уродливые уши и
расщелина губы или нёба.
Достаточно часто наблюдается
отсутствие складки на мизинце,
особый характер расположения
кожных гребней на кончиках
пальцев. Нередко наблюдается
укорочение или даже отсутствие
большого пальца на ногах,
косолапость, синдактилия. Могут
иметь место пороки сердца и
крупных сосудов, врождённые
аномалии лёгких, диафрагмы,
почек и мочеточников, грыжи,
складки на шее. Больные живут
несколько месяцев, а у тех, кто всё
же выживает, выявляется тяжелая
умственная отсталость.
Трипло-Х-женщины
 Частота встречаемости 1:1000. Кариотип 47,ХХХ. В
настоящее время имеются описания тетра- и
пентосомий X. Женский организм с мужеподобным
телосложением. Могут быть недоразвиты
первичные и вторичные половые признаки. В 75%
случаев у больных наблюдается умеренная степень
умственной отсталости. У некоторых из них
нарушена функция яичников. Иногда такие
женщины могут иметь детей. Повышен риск
заболевания шизофренией. С увеличением числа
дополнительных Х-хромосом нарастает степень
отклонения от нормы.
Синдром Клайнфельтера
 Кариотип 47,XXY, фенотип
мужской. Частота - 1:1500
новорожденных мальчиков.
Больных отличают следующие
признаки: высокий рост,
непропорционально длинные
конечности, женский тип
телосложения, гинекомастия,
крипторхизм. Слабо развит
волосяной покров, снижен
интеллект. Бесплодие в
результате недоразвития
семенников. Инфантильность
и поведенческие проблемы
создают трудности в
социальной адаптации.
(из С.И.Козлова и др., 1996)
ХУУ - синдром
 характеризуется кариотипом 47, XYY. Он впервые
описан в 1960 г. Частота синдрома составляет среди
новорожденных мальчиков около 1:1000. Наиболее
частым признаком является высокий рост,
который у взрослых больных составляет в среднем
186 см. У части больных отмечаются нерезко
выраженные евнухоидные черты телосложения и
диспластические признаки. Наличие добавочной Yхромосомы может и не сопровождаться
клинической патологией, но, несомненно, оно
коррелирует как с интеллектуальным
недоразвитием, так и с эмоционально-волевыми
нарушениями.
Синдром Шерешевского- Тернера
 моносомия X-хромосомы.
Частота встречаемости 1:20001:3000. Кариотип 45,Х0.
Отмечаются признаки
дисплазии: короткая шея с
избытком кожи и
крыловидными складками,
лимфатический отек стоп,
голеней, кистей рук и
предплечий, множественные
пигментные пятна,
низкорослость(рост взрослых
135-145см). Характерно
недоразвитие первичных и
вторичных половых
признаков, дисгенезия гонад,
сопровождающаяся первичной
аменореей - бесплодие.
(из С.И.Козлова и др., 1996)
В - хромосомы
 Наряду с избытком или недостатком отдельных хромосом,
характерных для данного вида иногда присутствуют т.н.
добавочные или В-хромосомы. В-хромосомы встречаются
примерно у 2% видов млекопитающих. Наибольшее число (до
38) таких хромосом обнаружено у копытного лемминга
Dicrostonyx torquatus, обитающего на Чукотке. В отличие от Ахромосом, они необязательны и обнаруживают межтканевую,
межиндивидуальную и межпопуляционную изменчивость по
числу и морфологии. Как правило, добавочные хромосомы
состоят из структурного гетерохроматина и не содержат
функционирующих генов. Функции В-хромосом к
настоящему времени остаются невыясненными, однако
имеются предположения о том, что они участвуют в
генетическом контроле роста и развития. Есть также точка
зрения, что В-хромосомы играют определенную роль в
эволюции генома и в микроэволюционных процессах.
Полиплоидия
(от греч. polyploos - многократный и éidos - вид)
 Полиплоидией называют кратные
изменения гаплоидного набора хромосом с
локализованым в них генами.
 Т.О. полиплоидия является показателем
степени повторений одного генома в составе
комплексов более высокого порядка.
 Принято различать автополиплоидию и
аллополиплоидию.
Причины возникновения
полиплоидии
 Неравное расхождение хромосом к
полюсам в анафазе.
 Деление ядра без деления клетки.
 Удвоение хромосом без их разделения в
силу того, что центромеры утрачивают
свойство взаимного отталкивания.
Автополиплоидия
 При автополиплоидии (эуплоидии)
происходит кратное увеличении всего
набора хромосом: если принять гаплоидный
набор хромосом за n, то диплоидный набор,
характерный для большинства организмов
обозначается 2n, а полиплоиды будут иметь
тройной набор хромосом (3n - триплоид),
четверной набор хромосом (4n - тетраплоид)
и т.д. Приставки три-, тетра-, пентапоказывают, во сколько раз увеличивается
гаплоидный набор хромосом.
Распространенность полиплоидии
 Полиплоидия широко распространена в
природе. Известны полиплоидные грибы и
водоросли, многие цветковые растения (за
исключением голосеменных) являются
полиплоидами.
 К настоящему времени установлено, что 1/3
всех покрытосеменных растений являются
полиплоидами.
Полиплоидия у животных
 У животных полиплоидия
всего организма (зиготическая
П.) наблюдается крайне редко
и в основном проявляется в
виде патологического
развития за исключением
видов, способных
размножаться
партеногенетически
(некоторые черви и амфибии).
 На рисунке представлен
триплоидный хромосомный
набор человека. Триплоидия
отмечается в 17% случаев
спонтанных выкидышей и в
3% случаев мертворождений.
(из R.Lewis, 1994)
Полиплоидия у животных
 Однако у животных широко
распространено явление эндополиплоидии
(соматическая П.). Например, у
млекопитающих много полиплоидных
клеток находят в печени, сердце, среди
пигментных клеток.
Полиплоидные ряды у растений
 Группа родственных видов, у которых
наборы хромосом составляют ряд
возрастающего кратного увеличения числа
хромосом, называется полиплоидным
рядом.
Полиплоидные ряды у
покрытосеменных растений
Род
Основное гаплоидное число
хромосом.
Число
хромосом
данного рода.
Пшеница
7
14, 28, 42
Пырей
7
14, 28, 42, 56, 70
Овес
7
14, 28, 42
Роза
7
14, 21, 28, 35, 42, 56, 70
Земляника
7
14, 28, 42, 56, 70, 84, 98
Люцерна
8
16, 32, 48
Сахарный тростник
8
48, 56, 64, 72, 80, 96, 112, 120
Свекла
9
18, 36, 54, 72
Хризантема
9
18, 27, 36, 45, 54, 63, 72, 81, 90
Щавель
10
20, 40, 60, 80, 100, 120, 200
Хлопчатник
13
26, 52
(из Гершензон, 1991)
у
видов
Репродукция полиплоидов
 В зависимости от четности или нечетности числа гаплоидных
наборов выделяют сбалансированные и несбалансированные
полиплоиды.
 Триплоиды, обычно, полностью бесплодны, так как при
мейозе три хромосомы одной пары не могут поделиться
поровну между двумя дочерними клетками. Плодовитость
тетраплоидов понижена, так как при мейозе конъюгируют
четыре хромосомы одной пары, что повышает возможность
ошибки при расхождении, в результате которой получаются
нежизнеспособные гаметы.
 Проблема стерильности или пониженной фертильности
полиплоидов снимается путем бесполого (вегетативного)
размножения.
Адаптивное значение
полиплоидии
 Было замечено, что автополиплоидные
растения более морозоустойчивы и
жизнеспособны, поэтому большая часть
растений в условиях сурового климата
являются полиплоидными: в северных
странах - Исландии, Финляндии, Швеции,
Норвегии - половины всех растений
полиплоидны, на острове Шпицберген их
удельный вес составляет до 80%, а в
альпийской флоре Памира 85%
полиплоидов.
Адаптивное значение
полиплоидии
 Т.о можно рассматривать автополиплоидию
у растений в качестве своеобразного
адаптивного механизма изменения
наследственного материала на геномном
уровне.
Мощность растительных
полиплоидов
 Полиплоиды у растений
отличаются большей
относительной мощностью
(большая масса
вегетативных органов,
более крупные плоды и
семена) по сравнению с
диплоидами.
 На рисунке представлены
экземпляры растения
черный паслен (Solanum
nigrum) с: I (36), II (72), III
(108), IV (144) –
хромосомами.
(из Д.Ф. Петров, 1976)
Искусственное получение
полиплоидов
 Все факторы, влияющие на митоз и мейоз, могут
вызвать полиплоидию: изменение температуры,
влияние радиации, механические воздействия –
пасынкование, декапитация (удаление точки роста
стебля у растений), химические воздействия.
 Особенно популярным является колхицин –
алкалоид, выделяемый из растения безвременника
осеннего – Colchicum autumnale. Колхицином
обрабатывают точки роста растений или
инъецируют его животным в водном растворе.
Колхицин парализует механизм расхождения
хромосом к полюсам, но не препятствует их
репродукции.
Аллополиплоидия
(от греч. allos - другой и polyploos – многократный)
 Представляет собой гибридизацию наборов
хромосом от разных видов или родов с
последующей автополиплоидизацией
объединенных геномов.
 Широко распространена в природе т.к.
большинство природных полиплоидных
форм растений изначально возникли в
результате объединения разных геномов
путем гибридизации.
 Т.о. аллополиплоидия – важный механизм
видообразования у растений.
Капустно-редечный гибрид
 Классическим
примером
искусственного
получения
аллотетраплоида (а по
сути – создания нового
вида) являются опыты
отечественного
генетика Г.Д.
Карпеченко (1924г.).
(из Н.Н.Гришко, Н.Л.Делоне, 1938)
Значение полиплоидии в селекции растений и
сельском хозяйстве
 Значение полиплоидов в сельском хозяйстве
велико, так как большое количество
культурных растений полиплоидны: из
простой одноядерной пшеницы (2n, 14
хромосом) получили тетраплоидную
твердую пшеницу (4n, 28 хромосом,
применяется при изготовлении макарон) и
гексаплоидную пшеницу (6n, 42 хромосомы,
применяется для изготовления хлеба);
тетраплоидный картофель и хлопчатник
тоже приобрели широкое распространение.
Значение полиплоидии в селекции
растений и сельском хозяйстве

Полиплоидные формы винограда
выявлены у сортов Португизер,
Рислинг, Кишмиш черный,
Кишмиш белый овальный, Мускат
александрийский, среди
крупноягодных японских,
французских и других сортов
винограда. Наибольшая
практическая ценность таких
полиплоидов состоит в том, что
они могут служить исходными
(родительскими) формами при
гибридизации с различными
диплоидными сортами, а это
позволит создать богатый
полиплоидный гибридный фонд, в
рамках которого станет возможной
селекция на триплоидном уровне в
самых разных направлениях
(бессемянность, крупноягодность,
раннеспелость и т.д.).
http://vine.com.ua/
Гаплоидия
 Для большинства высших
организмов гаплоидия
является аномальным
состоянием генома.
 Проявляется в меньших
размерах, увеличении
депрессивных показателей
за счет проявления
рецессивных генов,
аномалиях мейоза и, как
следствие, нарушениях
репродукции.
 Имеет значение для
селекции.
Растения томатов: I – гаплоидное; II –
диплоидное (из Д.Ф. Петров, 1976)
Методы учета мутаций
Изучение мутационных процессов в природных популяциях и в
искусственно создаваемых условиях преследует конкретные
теоретические и практические цели:
познание процессов изменчивости генетического материала
1.
является важной теоретической проблемой, так как
отражает уровень наших представлений об интимных
механизмах функционирования живых систем;
С практической стороны знание мутационных процессов
2.
является важным для оптимального получения мутантных
форм полезных для человека с хозяйственной точки зрения;
знание частот и динамика мутационных процессов в
3.
природных популяциях служит индикатором,
свидетельствующим об эколого-генетической обстановке в
окружающей среде, о степени генетической опасности
различных мутагенных средовых факторов.
Определение частот мутаций проводится экспериментальными
методами; при этом исследователи руководствуются некоторыми
общими правилами, сформулированными еще в 1934 году Н.В.
Тимофеевым-Ресовским:





Работа возможна лишь с генетически чистым
материалом, то есть с чистыми линиями (или с
особями гомозиготными по исследуемым генам).
Выборки и в контроле и в опытных группах
должны быть достаточно большими.
Для регистрации мутаций следует применять
удобные методы генетического анализа.
Следует анализировать любые полученные
изменения с целью дифференцировки их по
признакам (наследственные – ненаследственные,
ядерные – неядерные, генные - хромосомные).
Необходимо знание способа действия мутагена, с
помощью которого проводится
экспериментальная индукция мутаций.
Индуцированные мутации изучают, сравнивая их частоту после
воздействия определенного мутагенного агента с частотой
спонтанного мутирования у этого же объекта.
 В частности, такой анализ можно проводить
у микроорганизмов, причем относительно
легко, так как каждая гаплоидная клетка
бактерии на плотной питательной среде
образует колонию (клон), и все эти клоны
можно дифференцировать по
интересующим признакам.
 Некоторые мутации у микроорганизмов,
дающие селективное преимущество, можно
выявить методом реплик или отпечатков,
предложенным американскими генетиками Дж.
и Э. Ледербергами. Метод реплик позволил
доказать, что мутации возникают у бактерий
независимо от условий культивирования, и,
кроме того, значительно упростил приёмы
отбора вариантов микроорганизмов с
желаемыми свойствами.
Метод реплик
изучение мутаций устойчивости к фагу Т1 у E. colli (Ton R)

В этом случае опыт начинают с
рассева клеток клона кишечной
палочки, чувствительного к
действию фага Т1, на чашки
Петри, содержащие питательный
субстрат, но не содержащие фаг Т1.
После инкубации на каждой чашке
образуется примерно 1000
колоний. Далее образцы колоний
при помощи печатки переносятся
на другую чашку Петри, в которой
помимо питательного субстрата
присутствует бактериофаг.
Естественно, что в этих условиях
смогут существовать лишь
мутантные бактериальные клетки,
устойчивые к воздействию фага.
Зная исходную частоту
немутантных клеток и подсчитав
число образующихся из этого
количества устойчивых мутагенов,
можно вычислить уровень
индуцированного мутирования.
(из И.Ф.Жимулева, 2003)
Оценка частоты спонтанных
мутаций
 Частоты спонтанного мутирования у
микроорганизмов изучать сложнее, так как
число мутантов обнаруживаемых в
контрольном варианте обычно не отражает
частоту спонтанного мутирования, а лишь
показывает концентрацию мутантов
некогда возникших и размножившихся в
данной культуре.
Оценка частоты спонтанных
мутаций у микробов
 В 1943 году С.Э. Лурия
и М. Дельбрюк
разработали принцип,
позволяющий
определять частоту
спонтанных мутаций у
микроорганизмов.
Модификации этого
подхода используются
и современными
исследователями.
САЛЬВАДОР ЭДВАРД
ЛУРИЯ
МАКС ЛЮДВИГ
ДЕЛЬБРЮК
Метод упорядоченного рассева
клеточных культур
 Рассмотрим конкретный пример использования этого метода
для исследования спонтанных мутаций типа AdeAde+ у
дрожжей-сахаромицет. Колонии, образуемые исходной
культурой (Ade-) красные по цвету и ауксотрофны по
аминокислоте – гистидин. Мутанты (Ade+) белые по цвету и
прототрофны.
 Для того, чтобы узнать распределение спонтанных мутантов
(Ade+) среди клонов исходного типа используют
упорядоченный посев дрожжей на минимальной среде. Капли
суспензии изучаемой культуры равного объема наносят на
плотную питательную среду специальным репликатором,
обеспечивающим равномерное распределение колоний по
чашке Петри.
Метод упорядоченного рассева
клеточных культур
 После прекращения роста колоний дрожжей
исходного типа, на некоторых из них
появляются колонии вторичного роста
мутантов (Ade+) белого цвета.
 Тогда частоту спонтанных мутаций (m) в
пересчете на 1 кл. за 1 деление можно
высчитать по формуле: m = (x ∙ ln2) / N, где x
– среднее число колоний вторичного роста
мутантов, N – среднее число клеток в
колонии.
Частоты спонтанных мутаций
 В целом частоты спонтанных мутаций у
разных организмов носят популяционный
характер и варьируют в пределах 10-5 – 1010 на геном за 1 поколение.
Частота возникновения спонтанных мутаций в ряде
локусов у нескольких организмов
( из В.Грант, 1991)
Организм и ген
Частота мутаций
Homo sapiens
Альбинизм
3 ·10-5
Гемофилия А
1.3·10-5
Гемофилия В
5.5·10-7
Хорея Гентингтона
2 ·10-6
Drosophila melanogaster
Желтая окраска тела
12·10-5
Окраска глаз
4·10-5
Чёрная окраска тела
2·10-5
Esxherichia coli
Сбраживание лактозы
2·10-7
Потребность в гистидине
4·10-8
Устойчивость к фагу Т1
2·10-8
Чувствительность к стрептомицину
10-8—10-9
Учет мутаций у высших организмов
- связан с большими трудностями по
сравнению с микроорганизмами:
 Ограниченное число особей, которое может
быть исследовано;
 Рецессивные мутации не проявляются в
гетерозиготном состоянии.
Учет мутаций у высших организмов
 Наиболее удобные методы учета мутаций у
эукариот были разработаны учениками
Т.Моргана, в частности Г.Меллером
Учет рецессивных летальных мутаций у дрозофилы
(Метод ClB)
 Название определяется
тем, что в
эксперименте
используется линия,
особи которой несут Ххромосому с инверсией
(С), проявляющей
летальный эффект (l) в
гомозиготном
состоянии, и
доминантным геноммаркером Bar - отсюда
аббревиатура ClB.
(из И.Ф.Жимулева, 2003)
Учет рецессивных летальных мутаций у
дрозофилы
(метод Мёллер-5)
 В качестве линии-анализатора
используются гомозиготные самки, несущие
в Х-хромосомах по две не связанные с
летальным действием инверсии,
подавляющие кроссинговер и,
следовательно, сохраняющих комплекс
маркерных генов: доминантный ген
полосковидных глаз Bar (B) и рецессивный
ген абрикосовых глаз (wa).
Учет рецессивных летальных мутаций у
дрозофилы
(метод Мёллер-5)
 Если Х-хромосома самца
свободна от летальных
мутаций, то в F2 от его
скрещивания с самкой M-5
будут наблюдаться по 2
фенотипических класса среди
самок и самцов при общем
соотношении этих классов 1:1.
Если Х-хромосома
исследуемого самца несет
летальную мутацию, все самки
в потомстве от его
скрещивания с самкой М-5
будут гетерозиготны по этой
мутации, а в F2 будут самцы
только одного фенотипа (с
абрикосовыми
полосковидными глазами),
поскольку самцы,
гемизиготные по мутантной Ххромосоме, не выживают.
Учет аутосомных летальных мутаций у
дрозофилы
(метод сбалансированных леталей)
 Используют линию-
анализатор, гетерозиготную
по 2-й хромосоме. Один
гомолог несет маркерные
доминантные гены: Cy –
загнутые крылья и L –
лопастные глаза. Второй
гомолог содержит
доминантный ген Pm –
коричневые глаза. Оба
гомолога также содержат
инверсии, препятствующие
перекресту.
(из И.Ф.Жимулева, 2003)
Учет аутосомных летальных мутаций у
дрозофилы
(метод сбалансированных леталей)
 Все эти три маркерных
гена дают в гомозиготе
летальный эффект,
поэтому в линиианализаторе
выживают только
гетерозиготы по 2-й
хромосоме. Это и есть
система
сбалансированных
леталей.
(из И.Ф.Жимулева, 2003)
Учет аутосомных летальных мутаций у
дрозофилы
(метод сбалансированных леталей)
 Анализируемого самца
скрещивают с самкой –
анализатором; в F1 отбирают
самцов CyL/Pm+ и
скрещивают их с самками
исходной линии. В F2
отбирают самцов и самок CyL,
у которых гомологичная
хромосома является
испытуемой. Анализ наличия
или отсутствия летальной
мутации проводят в третьем
поколении. Если в испытуемой
хромосоме произошла
летальная мутация, то в
потомстве будут
присутствовать только мухи
CyL
(из И.Ф.Жимулева, 2003)