ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ ферментализаты дрожжей рода Candida,
реклама
ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ рий и посеве на нее биоматериала от зараженных разными штаммами возбудителя туберкулеза показано, что первичный рост культур появляется на 5–10 сутки раньше и в 2–2,5 раза интенсивнее, чем на обычной среде (таблица 1). К 30 суткам культивирования во всех пробирках на среде Левенштейна-Йенсена с лизатом галобактерий и ГМДП был обильный, равномерный сплошной рост культуры, в то время как на этой среде без добавок стимуляторов сплошной рост был через 60 суток. Добавление лизата галобактерий, бактериородопсина и ГМДП в жидкую питательную среду Сотона позволяет увеличить выход бактериальной массы микобактерий (таблица 2). Так, выход бактериальной массы М. bovis-8 возрастал в зависимости от объема стимулятора: лизат галобактерий на 5,09– 15,92 г, с бактериородопсином на 21,93– 28,51, и с ГМДП на 23,59–31,40 г выше по сравнению с контролем. Замена Л-аспарагина в среде Сотона на ферментализаты дрожжей рода Candida, выращенных на Н-парафине, повышает ее эффективность (таблица 3). Выход бактериальной массы М.bovisБЦЖ, М. bovis-8 и М. bovis-ЦВ-1был выше на 3,8–3,9 г на среде Сотона с ферментолизатом № 1 и на 4,3–4,8 г на этой же среде с ферментолизатом № 2 по сравнению со средой Сотона с Л-аспарагином. При замене в среде Левенштейна-Йенсена Л-аспарагина на гликокол и посеве на нее взвеси культур микобактерий туберкулеза были получены идентичные результаты роста колоний, как и на среде, приготовленной с Л-аспарагином Заключение. Применение стимуляторов роста ускоряет выделение на питательных средах возбудителя туберкулеза и увеличивает выход бактериальной массы микобактерий в 2–3 раза. Используемый гликокол позволяет полностью заменить дорогостоящий импортный реактив Л-аспарагин в плотных средах, а ферментолизаты дрожжей рода Candida в жидкой среде Сотона и повысить их эффективность. УДК 619:616.98.579.873 Ю.И. Смолянинов, Н.С. Боганец, А.Д. Панкратова (ВНИИБТЖ) МЕТОД УСКОРЕННОЙ ПОСТАНОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЫ НА МОРСКИХ СВИНКАХ В ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ В 1881 году Роберт Кох (а в дальнейшем и его последователи) обнаружил, что большие дозы туберкулина могут убить больных туберкулезом морских свинок. Это явление стало трактоваться как анафилактическая чувствительность к туберкулину. Имеются данные об экспериментальном воспроизведении на основе феномена Коха анафилактического туберкулинового шока у морских свинок, зараженных возбудителем туберкулеза человеческого вида. Мы предприняли попытку использования феномена Коха в совершенствовании постановки биологической пробы на морских свинках для сокращения срока постановки диагноза на туберкулез. В качестве рабочей гипотезы приняли то обстоятельство, что морская свинка, больная туберкулезом, погибает лишь на определенной стадии развития инфекционного процесса. Вместе с тем, срок гибеВетеринарная патология. № 1–2. 2004 ли лабораторных животных можно ускорить, используя феномен Коха, в частности — воспроизвести анафилактический туберкулиновый шок. Однако для решения вопроса требовалось провести ряд экспериментов. Целью исследований явилась разработка ускоренного метода постановки биопробы на морских свинках в диагностике туберкулеза животных. Первоначально определили летальную дозу ППД-туберкулина для млекопитающих на здоровых морских свинках. Решение этой задачи было связано с обоснованием дальнейших исследований о принципиальной возможности использования феномена Коха для получения анафилактического туберкулинового шока и гибели зараженных возбудителем туберкулеза морских свинок. В опыт взяли 21 свинку, которым последовательно (по 3 гол.) до наступления 115 ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ гибели внутрибрюшинно вводили нарастающие дозы туберкулина. При введении 1 и 2 мл туберкулина состояние организма животных было удовлетворительным, температура тела в пределах нормы. При введения 5 и 10 мл в течение первых часов наблюдали несколько угнетенное состояние свинок и повышение температуры тела до 38–39° С, тремор мышц. Через 3–6 часов после введения туберкулина состояние лабораторных животных приходило в норму. При введении 15 мл туберкулина указанные клинические признаки проявлялись резче и длительнее — до 8–9 часов. Одна свинка пала на восьмом часу с признаками асфиксии, состояние двух нормализовалось через 10–12 часов. При введении 20 мл туберкулина с на- растающими признаками асфиксии пали все три свинки через 5, 7 и 8 часов. Контрольные животные остались живы. Таким образом, организм здоровых морских свинок индифферентен к ППД– туберкулину для млекопитающих при внутрибрюшинном введении в дозах 5 мл. Летальная доза аллергена для них составляет 15–20 мл. Все это позволило сделать заключение о возможности проведения дальнейших исследований по отработке регламента применения туберкулина в ускоренной постановке биологической пробы. В опыте по отработке летальной дозы ППД–туберкулина для млекопитающих на 30 зараженных культурой M. bovis морских свинках получены следующие результаты. Все свинки при внутрибрюшинном введении 0,2 мл туберкулина через 30 дней Сравнительная характеристика ускоренного и традиционного методов постановки биологической пробы в диагностике туберкулеза на морских свинках Ускоренный метод Хозяйство Красный Октябрь пало че- пало че- пало в друрез 30 рез 60 гие сродней гол. дней гол. ки, дни Традиционный метод срок биопробы, дни пала 1-я свинка, день пала 2-я свинка, день Сокращение срока постановки биопробы, дни 44 1 - 57 30 74 80 Пышкетское - 1 42 42 69 75 27 Харламово 1 1 - 30 58 60 28 Харламово - 1 40 40 45 46 5 Харламово 2 - - 30 54 58 24 Первотаровское - 1 46 46 70 73 24 Родина 1 - 58 30 55 61 25 Родина - 1 49 49 72 80 23 Родина 1 1 - 30 77 78 47 Родина - - 46/84* 46 61 84 25 Родина 1 - 78 30 75 84 45 Им. Мичурина 1 1 - 30 80 82 40 Им. Мичурина - 1 42 30 42 54 12 Им. Мичурина - 1 33 33 65/65* - 32 Гигант 2 - - 30 63 65 33 Еланское 1 - 35 30 52 53 22 Еланское - 2 - 60 87 89 37 Крутогорское 1 1 - 30 64 67 34 Милоградовское 2 - - 30 72 81 42 Россия 1 - 51 30 50 56 31 ВСЕГО: 15 12 13 706 1350 1326 580 50,8±3,5 35,3 ±2,0 64,3 ±2,6 68,7±4,5 29,0 ±2,2 M±m Примечание: * – числитель – срок гибели 1–й свинки; знаменатель – 2–й. 116 Ветеринарная патология. № 1–2. 2004 ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ после заражения остались живы. При введении 0,5 мл пала одна; 0,8 мл — 3, и 1 мл — все пять свинок в среднем через 22 часа. Из зараженных свинок пятой контрольной группы, которым не вводили внутрибрюшинно туберкулин, через 29 суток пала одна, а среди незараженных шестой контрольной, которым вводили 1 мл туберкулина, падежа не было. У всех павших и убитых зараженных свинок 1–4 опытных и 5 контрольной групп при патологоанатомическом исследовании во внутренних органах отмечали различной степени поражения, характерные для туберкулеза. Следовательно, характер и тяжесть поражений у убитых свинок были недостаточными для летального исхода в указанный срок без введения туберкулина в разрешающей дозе — 1 мл. У незараженных свинок шестой контрольной группы при убое характерных для туберкулеза поражений не нашли. Клиническим наблюдением установлено, что в заключительной стадии анафилактического туберкулинового шока свинка резко слабеет, падает на бок, делает несколько конвульсивных движений с последующей остановкой дыхания. Гибель свинки наступает от асфиксии, так как сразу после гибели сердце продолжает биться в течение 2–3 минут. Таким образом, абсолютно летальная доза ППД-туберкулина для млекопитающих, введенного морским свинкам внутрибрюшинно через 30 дней после заражения M. bovis, составляет 1 мл, или 50000 международных туберкулиновых единиц. Аналогичные результаты мы получили и в предварительном опыте с заражением свинок культурой M. tuberculosis штамм H37Rv. В опыте по определению оптимального срока внутрибрюшинного введения туберкулина, при котором воспроизводится анафилактический шок и гибель морских свинок, установлено следующее. При введении туберкулина через 15 и 20 дней после заражения свинки в течение суток не погибают. Гибель их наблюдали примерно в те же сроки, что и зараженных первой контрольной группы, туберкулин которым не вводили. Из трех свинок 3 опытной группы, которым туберкулин введен через 25 дней после заражения, пала одна, а из 4 и 5 групп при введении туберкулина через 30 и 35 дней погибли все через 17–24 часа. Контрольные, не зараженные свинки, которым также вводили туберкулин, остались живы во все сроки наблюдения. Таким образом, оптимальный срок внутрибрюшинного введения туберкулина, при котором наступает анафилактичесВетеринарная патология. № 1–2. 2004 кий шок и гибель всех морских свинок, зараженных M. bovis, составляет не менее 30 дней. В дальнейшем на 15 морских свинках провели сравнительный опыт при естественном течении туберкулеза и, параллельно, с воспроизведением анафилактического туберкулинового шока. Семи опытным свинкам через 15–45 дней (каждые 5 дней) после заражения внутрибрюшинно вводили туберкулин в дозе 1 мл., 8 контрольных свинок убивали в эти же сроки. Результаты опыта Первые две опытные и две контрольные свинки через 15 и 20 дней после заражения остались живы, а при убое характерных для туберкулеза изменений у них не обнаружили. Третья свинка после введения туберкулина через 25 дней после заражения также не пала в течение суток, однако у нее наблюдали резкое угнетение, отсутствие аппетита, одышку и повышение температуры тела до 39,1° С. При убое и вскрытии у нее отметили некоторое увеличение и гиЗаражение двух морских свинок суспензией из биоматериала от животных Внутрибрюшинное введение туберкулина обеим морским свинкам через 60 дней после заражения в дозе 1 мл Гибель одной или обеих свинок в течение суток Патологоанатомические исследования Туберкулез установлен, исследования прекращают Отсутствие гибели обеих свинок Внутрибрюшинное введение ППД–туберкулина для млекопитающих обеим свинкам через 30 дней после заражения в дозе 1 мл Отсутствие гибели Убой свинок через 3 месяца после заражения, патологоанатомические исследования Рисунок. Схема ускоренной постановки биологической пробы на туберкулез 117 ÄÈÀÃÍÎÑÒÈÊÀ È ÏÐÎÔÈËÀÊÒÈÊÀ ÒÓÁÅÐÊÓËÅÇÀ ÆÈÂÎÒÍÛÕ перплазию печени, селезенки и почек, однако видимых поражений, характерных для туберкулеза, не нашли. Гибель опытных свинок наступала через 30 дней и в последующие сроки, а контрольные оставались живы, хотя у всех у них при вскрытии находили туберкулезные поражения. Таким образом, еще раз подтвердилась возможность использования туберкулина для ускорения гибели больных туберкулезом морских свинок. В опыте на 23 морских свинках, зараженных интратестикулярно M. bovis в дозах 10, 100, 1000 и 10000 микробных клеток мы установили, что с повышением этой дозы возрастает и количество павших животных. Повторное введение туберкулина через два месяца после заражения дополнительно вызывает анафилактический шок и гибель 25–100% лабораторных животных. Учитывая результаты опытов по воспроизведению анафилактического туберкулинового шока у морских свинок, разработали методику ускоренной постановки биопробы в диагностике туберкулеза. Схематично она представлена на рисунке. Суть методики состоит в том, что через 30 дней после заражения суспензией биоматериала от животных, морским свинкам вводят внутрибрюшинно ППД-туберкулин для млекопитающих в дозе 1 мл. При гибели одной или обеих свинок в течение суток и обнаружение на вскрытии поражений ставится диагноз на туберкулез. Если свинки не пали, им повторно через 60 дней после заражения вводят туберкулин и ставят диагноз по той же методике. Сравнительное изучение ускоренного и традиционного методов постановки биопроб на биоматериале из 11 неблагополучных по туберкулезу хозяйств выявило их следующие характеристики. С учетом первичного срока гибели свинок разработанным методом, средняя продолжительность постановки диагноза на туберкулез составила 35,3 дня (таблица). В параллельных (контрольных) биологических пробах срок гибели первой морской свинки колебался от 45 до 87 дней и составил в среднем 64,3 дня. Таким образом, срок постановки диагноза предлагаемым методом сокращается на 29 дней, или в 1,8 раза. Экономическая эффективность ускоренного метода постановки биопробы на туберкулез выражается в экономии затрат корма за счет ускорения гибели морских свинок и снижения затрат на их содержание и составляет 101,7 рублей на одну экспертизу. УДК 619:616.98:579.873.2 А.Х. Найманов, О.А. Верховский, О.А. Савицкая (Всероссийский НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, г. Москва) ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ВНУТРИКОЖНОЙ ТУБЕРКУЛИНОВОЙ ПРОБЫ И γ-ИФН ИФА ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА На современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота, этиологическим агентом которого является Mycobacterium bovis, основой профилактических и оздоровительных мероприятий была и остается диагностика этой болезни. При этом, несмотря на наличие методов, направленных на выделение и идентификацию возбудителя (выделение культур микобактерий на питательных средах, выявление M. bovis методом ПЦР и др.), при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота большое значение имеют имму118 нодиагностические методы, направленные на оценку функциональной активности Тлимфоцитов. Это положение обусловлено тем, что при инфицировании млекопитающих M. bovis доминирующим является клеточный иммунный ответ, в который вовлечены Т-клетки, макрофаги и цитокины. В настоящее время основными диагностическими методами оценки Т-клеточного иммунного ответа при туберкулезе являются внутрикожная туберкулиновая проба (ВТП), реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) и иммуноферментВетеринарная патология. № 1–2. 2004
