2006 ÖÈÒÎËÎÃÈß Ò î ì 48, ¹ 6 ÁÅËÎÊ ÒÅÏËÎÂÎÃÎ ØÎÊÀ ÏÐÅÑÍÎÂÎÄÍÛÕ ÏÐÎÑÒÅÉØÈÕ È ÅÃÎ Ó×ÀÑÒÈÅ Â ÀÄÀÏÒÀÖÈÈ Ê ÈÇÌÅÍÅÍÈÞ ÑÎËÅÍÎÑÒÈ ÑÐÅÄÛ ÎÁÈÒÀÍÈß © À. Þ. Ïëåõàíîâ,1 À. Î. Ñìóðîâ,2, 3 Þ. È. Ïîäëèïàåâà,4 Ë. Î. Èâàíîâà,3 À. Â. Ãóäêîâ3, 4 À. Þ. Ïëåõàíîâ, À. Î. Ñìóðîâ è äð. Áåëîê òåïëîâîãî øîêà ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ 1 Ñ.-Ïåòåðáóðãñêèé èíñòèòóò ÿäåðíîé ôèçèêè èì. Á. Ï. Êîíñòàíòèíîâà ÐÀÍ, Ãàò÷èíà, Ëåíèíãðàäñêàÿ îáë., 2 Çîîëîãè÷åñêèé èíñòèòóò ÐÀÍ, 3 Áèîëîãè÷åñêèé íàó÷íî-èññëåäîâàòåëüñêèé èíñòèòóò Ñ.-Ïåòåðáóðãñêîãî ãîñóäàðñòâåííîãî óíèâåðñèòåòà è 4 Èíñòèòóò öèòîëîãèè ÐÀÍ, Ñàíêò-Ïåòåðáóðã; ýëåêòðîííûé àäðåñ: pelgood@rambler.ru Èññëåäîâàëè èçìåíåíèå óðîâíÿ áåëêà òåïëîâîãî øîêà (ÁÒØ) â êëåòêàõ ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ — àìåáû Amoeba proteus è èíôóçîðèè Paramecium jenningsi — â îòâåò íà èçìåíåíèå ñîëåíîñòè ñðåäû. Ñòðåññîâûì âîçäåéñòâèåì íà êëåòêè ñ÷èòàëè ñìåíó îäíîé ñîëåíîñòè íà äðóãóþ. Ìåòîäîì èììóíîáëîòèíãà â òîòàëüíîì áåëêîâîì ýêñòðàêòå èíòàêòíûõ è ïîäâåðãíóòûõ ñîëåíîñòíîìó ñòðåññó êëåòîê àìåá è èíôóçîðèé áûë âûÿâëåí ïîëèïåïòèäíûé àíòèãåí, ïåðåêðåñòíî ðåàãèðóþùèé ñ àíòèòåëàìè ê ÁÒØ70 êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà. Òîò æå ïîëèïåïòèäíûé àíòèãåí âûÿâëÿåòñÿ â êëåòêàõ À. proteus, ïîäâåðãíóòûõ òåïëîâîìó øîêó; ýòî ïîçâîëÿåò ïðåäïîëàãàòü, ÷òî âûÿâëåííûé ïðè ñîëåíîñòíîì øîêå ïîëèïåïòèä ÿâëÿåòñÿ ÁÒØ, ðîäñòâåííûì ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ. Îáèòàíèå â ñðåäå ñ ñîëåíîñòüþ 2 O äëÿ ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ ìîæíî ðàññìàòðèâàòü êàê íåáëàãîïðèÿòíîå, ÷òî ìàðêèðóåòñÿ ïîâûøåííûì ñîäåðæàíèåì ÁÒØ ó ïðîñòåéøèõ, àêêëèìèðîâàííûõ ê ïîâûøåííîé ñîëåíîñòè. Òàêèå àêêëèìèðîâàííûå ïðîñòåéøèå ïðè ñòðåññîâîì âîçäåéñòâèè ïðåèìóùåñòâåííî ðàñõîäóþò íàêîïëåííûé ÁÒØ70. Cäåëàíî çàêëþ÷åíèå î òîì, ÷òî ïðåñíîâîäíûå ïðîñòåéøèå, îáèòàþùèå â óñëîâèÿõ ïîâûøåííîé ñîëåíîñòè, ïî-âèäèìîìó, ïðåàäàïòèðîâàíû ê èçìåíåíèþ ôàêòîðîâ ñðåäû. Ê ë þ ÷ å â û å ñ ë î â à: ñîëåíîñòíûå àäàïòàöèè, ïðåñíîâîäíûå ïðîñòåéøèå, Amoeba proteus, Paramecium jenningsi, áåëêè òåïëîâîãî øîêà. uthen, 1980; McMullin, Hallberg, 1987; La Terza et al., 2001; Hori, Fujishima, 2003), æãóòèêîíîñöåâ (Drzymalla et al., 1996; Barque et al., 2000) è àìåá (Kalinina et al., 1988; Podlipaeva, 2001). Ñëåäóåò îòìåòèòü, ÷òî â ïîäàâëÿþùåì áîëüøèíñòâå ñëó÷àåâ ôóíêöèè ÁÒØ70 ó ïðîñòåéøèõ èçó÷àþòñÿ â ñâÿçè ñ àäàïòàöèåé ýòèõ îðãàíèçìîâ ê èçìåíåíèÿì òåìïåðàòóðû îêðóæàþùåé ñðåäû. Îäíàêî ïîñêîëüêó ÁÒØ ÿâëÿþòñÿ óíèâåðñàëüíûìè öèòîïðîòåêòîðàìè, ëîãè÷íî ïðåäïîëàãàòü èõ ó÷àñòèå (â ÷àñòíîñòè, ó÷àñòèå ÁÒØ70) â àäàïòàöèè ê ðàçëè÷íûì èíûì íåáëàãîïðèÿòíûì âîçäåéñòâèÿì.  ÷àñòíîñòè, áîëüøîé èíòåðåñ â ýòîì îòíîøåíèè ïðåäñòàâëÿåò ïðèñïîñîáëåíèå ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ ê èçìåíåíèþ ñîëåíîñòè âîäíîé ñðåäû, â êîòîðîé îíè îáèòàþò. Ïîäîáíûå ðàáîòû â íàñòîÿùåå âðåìÿ ïðîâîäÿòñÿ ïî÷òè èñêëþ÷èòåëüíî íà ìíîãîêëåòî÷íûõ îðãàíèçìàõ, è àêòóàëüíîñòü íàñòîÿùåãî èññëåäîâàíèÿ îïðåäåëÿåòñÿ, â ÷àñòíîñòè, îñîáåííîñòüþ îðãàíèçàöèè ïðîñòåéøèõ, êîòîðûå ïðåäñòàâëÿþò ñîáîé îäíîâðåìåííî è êëåòêó, è ïîëíîöåííûé îðãàíèçì. Ñëåäîâàòåëüíî, ðåàêöèþ ïðîñòåéøèõ íà ñòðåññ ìîæíî ðàññìàòðèâàòü êàê ìîäåëü áîëåå ïðîñòóþ, ÷åì ìíîãîêëåòî÷íûé îðãàíèçì, è íå îïîñðåäîâàííóþ ñïåöèôèêîé ôóíêöèîíèðîâàíèÿ êëåòîê ðàçëè÷íûõ òêàíåé. Èçâåñòíî, ÷òî óðîâåíü ÁÒØ øîêà â êëåòêàõ ðàçíûõ òêàíåé îäíîãî îðãàíèçìà, ïîäâåðãíóòîãî Èçâåñòíî, ÷òî êëåòêè âñåõ æèâûõ îðãàíèçìîâ â îòâåò íà äåéñòâèå ñòðåññîâûõ ôàêòîðîâ ðåàãèðóþò ñèíòåçîì òàê íàçûâàåìûõ áåëêîâ òåïëîâîãî øîêà (ÁÒØ èëè HSP — heat shock proteins) (Feder, Hofmann, 1999; Maðãóëèñ, Ãóæîâà, 2000). Îñíîâíàÿ ôóíêöèÿ ÁÒØ — öèòîïðîòåêòîðíàÿ. Îíè ñïîñîáñòâóþò àäàïòàöèè îðãàíèçìîâ è èõ êëåòîê ê íåáëàãîïðèÿòíûì âîçäåéñòâèÿì. ÁÒØ ïðåäñòàâëåíû ðÿäîì ñåìåéñòâ, ðàçëè÷àþùèõñÿ ïî ìîëåêóëÿðíîé ìàññå, íóêëåîòèäíîé ïîñëåäîâàòåëüíîñòè ãåíîâ, êîòîðûìè îíè êîäèðóþòñÿ, è âûïîëíÿåìûì ôóíêöèÿì. Íàèáîëåå èçó÷åííûìè ÿâëÿþòñÿ ÁÒØ ñ ìîë. ìàññîé 70 êÄà — ýòî òàê íàçûâàåìûå ÁÒØ70 (HSP70), îáëàäàþùèå âåñüìà íèçêîé âèäîñïåöèôè÷íîñòüþ (Ìàðãóëèñ, Ãóæîâà, 2000). Ó îäíîêëåòî÷íûõ îðãàíèçìîâ ïî ñðàâíåíèþ ñ áàêòåðèÿìè è ìíîãîêëåòî÷íûìè æèâîòíûìè ÁÒØ70 èçó÷åíû åùå ìàëî, ïðè÷åì ýòè èññëåäîâàíèÿ êàñàþòñÿ ãëàâíûì îáðàçîì ðàçëè÷íûõ ïàðàçèòîâ, îáèòàþùèõ â òåëå òåïëîêðîâíûõ õîçÿåâ (Joshi et al., 1992; Requena et al., 1992; Wallace et al., 1992; Field et al., 2000; Perez-Serrano et al., 2000; Triana et al., 2000; Lloyd et al., 2002; Bakatselou et al., 2003; Varadharajan et al., 2004, è äð.). Çíà÷èòåëüíî ìåíüøå âíèìàíèÿ óäåëÿåòñÿ ÁÒØ70 ñâîáîäíîæèâóùèõ ïðîñòåéøèõ. Ê íàñòîÿùåìó âðåìåíè èìååòñÿ ëèøü íåáîëüøîå ÷èñëî ïóáëèêàöèé, ïîñâÿùåííûõ ÁÒØ70 ó îòäåëüíûõ âèäîâ ñâîáîäíîæèâóùèõ èíôóçîðèé (Fink, Ze530 Áåëîê òåïëîâîãî øîêà ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ ñîëåíîñòíîìó ñòðåññó, ìîæåò áûòü ðàçëè÷íûì (Deane, Wool, 2004). Öåëüþ íàñòîÿùåãî èññëåäîâàíèÿ áûëî ïîëó÷åíèå äàííûõ îá èçìåíåíèè êîíöåíòðàöèè áåëêà, èììóíîëîãè÷åñêè ðîäñòâåííîãî ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ æèâîòíûõ, â êëåòêàõ ñâîáîäíîæèâóùèõ ïðåñíîâîäíûõ àìåá è èíôóçîðèé ïðè èçìåíåíèè ñîëåíîñòè ñðåäû èõ îáèòàíèÿ. Ìàòåðèàë è ìåòîäèêà  ðàáîòå áûëè èñïîëüçîâàíû ñâîáîäíîæèâóùèå ïðåñíîâîäíûå âèäû ïðîñòåéøèõ: ëîáîçíûå àìåáû Amoeba proteus (øòàìì Val èç êîëëåêöèè Ëàáîðàòîðèè öèòîëîãèè îäíîêëåòî÷íûõ îðãàíèçìîâ Èíñòèòóòà öèòîëîãèè ÐÀÍ) è èíôóçîðèè Paramecium jenningsi (øòàìì SR1-10 èç êîëëåêöèè êóëüòóð Ëàáîðàòîðèè çîîëîãèè áåñïîçâîíî÷íûõ ÁèÍÈÈ ÑÏáÃÓ). Êóëüòèâèðîâàíèå ïðîñòåéøèõ îñóùåñòâëÿëè ïî ñòàíäàðòíûì ìåòîäèêàì: èíôóçîðèé — íà ñàëàòíîé ñðåäå, èíîêóëèðîâàííîé Klebsiella aerogenes (Sonneborn, 1970), àìåá — íà ìîäèôèöèðîâàííîì ìèíåðàëüíîì ðàñòâîðå Ïðåñêîòòà è Êýððèåðà (Prescott, Carrier, 1964). Àìåá êîðìèëè èíôóçîðèÿìè Tetrahymena pyriformis (øòàìì GL èç êîëëåêöèè Ëàáîðàòîðèè öèòîëîãèè îäíîêëåòî÷íûõ îðãàíèçìîâ Èíñòèòóòà öèòîëîãèè ÐÀÍ). Äëÿ ïðîâåäåíèÿ îïûòîâ ÷àñòü èíôóçîðèé è àìåá, â íîðìå ñîäåðæàâøèõñÿ â ïðåñíîé âîäå, áûëà àêêëèìèðîâàíà ê 2 O. Íåîáõîäèìóþ ñîëåíîñòü ñðåäû ñîçäàâàëè äîáàâëåíèåì â êóëüòóðàëüíóþ ñðåäó ðàñòâîðà èñêóññòâåííîé ìîðñêîé ñîëè, ïðèãîòîâëåííîé ïî ïðîïèñè Øóáðàâîãî (1983). Ñðîê àêêëèìàöèè îðãàíèçìîâ ñîñòàâëÿë íå ìåíåå 2 ìåñ ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå (18—20 °Ñ). Äëÿ îáîèõ âèäîâ ïðîñòåéøèõ îïðåäåëÿëè âåëè÷èíó òîëåðàíòíîãî äèàïàçîíà. Áûë ñîñòàâëåí ðÿä òåñòîâûõ ñîëåíîñòåé îò ïðåñíîé âîäû (0 O ) äî ñðåäû ñîëåíîñòüþ 10 O ñ èíòåðâàëîì 0.5 O. Ìàêñèìàëüíóþ ñîëåíîñòü, ïðè êîòîðîé àìåáû èëè èíôóçîðèè ìîãëè ïîääåðæèâàòüñÿ â êóëüòóðå íåîãðàíè÷åííî äîëãî, ïðèíèìàëè çà çíà÷åíèå òîëåðàíòíîé ãðàíèöû (Smurov, Fokin, 1998).  ðåçóëüòàòå ïðîâåäåííûõ èññëåäîâàíèé áûëè îïðåäåëåíû ñîëåíîñòíûå òîëåðàíòíûå ãðàíèöû äëÿ P. jenningsi è A. proteus, àêêëèìèðîâàííûõ ê ïðåñíîé ñðåäå, êîòîðûå ñîñòàâëÿëè 3.25 è 2.5 O ñîîòâåòñòâåííî. Äëÿ êëåòîê, àêêëèìèðîâàííûõ ê 2 O, ñîëåíîñòíûå òîëåðàíòíûå ãðàíèöû ñîñòàâëÿëè: äëÿ P. jenningsi — 6 O, äëÿ A. proteus — 3.5 O. Còðåññîâûì ñîëåíîñòíûì âîçäåéñòâèåì ñ÷èòàëñÿ ïåðåíîñ êëåòîê èç îäíîé ñîëåíîñòè â äðóãóþ: èç 0 â 2 O, è íàîáîðîò. Ðàçíèöó â 2 O ìîæíî ñ÷èòàòü äëÿ ïðîñòåéøèõ îáîèõ âèäîâ øîêîâîé, òàê êàê, ñ îäíîé ñòîðîíû, îíà íå ÿâëÿåòñÿ äëÿ íèõ ëåòàëüíîé, íàõîäÿñü âíóòðè èõ èñõîäíîãî ñîëåíîñòíîãî òîëåðàíòíîãî äèàïàçîíà, à ñ äðóãîé — âûçûâàåò ôèçèîëîãè÷åñêóþ ïåðåñòðîéêó îðãàíèçìà, êîòîðóþ ìîæíî òåñòèðîâàòü ïî ðàñøèðåíèþ òîëåðàíòíîãî äèàïàçîíà ïðîñòåéøèõ ïîñëå îêîí÷àíèÿ èõ àêêëèìàöèè. Äëÿ îñóùåñòâëåíèÿ ñîëåíîñòíîãî øîêà â êóëüòóðå àìåá, âûðàùåííîé ïðè 0 O, èçìåíÿëè ñîëåíîñòü ñðåäû äî âåëè÷èíû 2 O è âûäåðæèâàëè ïðè èçìåíåííîé ñîëåíîñòè â òå÷åíèå 2 ÷. Íàïðîòèâ, â êóëüòóðå àìåá, àêêëèìèðîâàííûõ ê ñîëåíîñòè 2 O, ñðåäó çàìåíÿëè íà ïðåñíóþ è òàêæå âûäåðæèâàëè â òå÷åíèå 2 ÷.  êà÷åñòâå êîíòðîëÿ èñïîëüçîâàëè êóëüòóðû àìåá, ðàâíûå ïî ïëîòíîñòè îïûòíûì êóëüòóðàì. Äëÿ îñóùåñòâëåíèÿ ñîëåíîñòíîãî øîêà ó èíôóçîðèé äâå àëèêâîòû êóëüòóðû èíôóçîðèé, âûðàùåííûõ â ïðå- 531 ñíîé ñðåäå, ïîäâåðãàëè öåíòðèôóãèðîâàíèþ â òå÷åíèå 10 ìèí ïðè 400 g äëÿ îñàæäåíèÿ êëåòîê. Ê îñàæäåííûì êëåòêàì äîáàâëÿëè âîäó ñ ñîëåíîñòüþ 2 O (îïûò) èëè ñíîâà ïðåñíóþ âîäó (êîíòðîëü).  òàêîì ñîñòîÿíèè èíôóçîðèé âûäåðæèâàëè â òå÷åíèå 1 ÷. Àíàëîãè÷íî ïîñòóïàëè ñ èíôóçîðèÿìè, àêêëèìèðîâàííûìè ê ñîëåíîñòè 2 O. Äëÿ ïîäòâåðæäåíèÿ ïðèíàäëåæíîñòè âûÿâëÿåìûõ ïîñëå ñîëåâûõ øîêîâ ïîëèïåïòèäîâ ê ÁÒØ êóëüòóðû àìåá, âûðàùåííûå êàê â ïðåñíîé ñðåäå, òàê è ïðè ñîëåíîñòè 2 O, ïîäâåðãàëè òåïëîâîìó øîêó (37 °Ñ, 1 ÷). Ïî îêîí÷àíèè ýêñïåðèìåíòà êëåòêè ïðîñòåéøèõ îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 400 g â òå÷åíèå 10 ìèí è îáðàáàòûâàëè àöåòîíîì ñ öåëüþ ïðåêðàùåíèÿ æèçíåäåÿòåëüíîñòè, ïðåöèïèòàöèè áåëêîâ è ïåðìåàáèëèçàöèè ìåìáðàí. Ïðîìûòûé àöåòîíîì ìàòåðèàë îñàæäàëè öåíòðèôóãèðîâàíèåì ïðè 3000 g â òå÷åíèå 10 ìèí è ïîäñóøèâàëè äî èñ÷åçíîâåíèÿ çàïàõà àöåòîíà. Çàòåì ê ïðîáàì äîáàâëÿëè áóôåð äëÿ ðàçâåäåíèÿ ïðîá ïî Ëýììëè (Laemmli, 1970) è ïðîãðåâàëè èõ íà êèïÿùåé âîäÿíîé áàíå â òå÷åíèå 2 ìèí. Ïîäãîòîâëåííûå òàêèì îáðàçîì ïðîáû ïîäâåðãàëè ýëåêòðîôîðåçó â 13%-íîì ïîëèàêðèëàìèäíîì ãåëå â ñèñòåìå ñ äîäåöèëñóëüôàòîì íàòðèÿ (ÄÄÑ-Na) ïî Ëýììëè (Laemmli, 1970). Ïî çàâåðøåíèè ýëåêòðîôîðåçà ðàçäåëåííûå áåëêè ïåðåíîñèëè èç ãåëÿ íà íèòðîöåëëþëîçíóþ ìåìáðàíó (Synpor èëè Amersham ECL) ìåòîäîì ýëåêòðîáëîòèíãà (Towbin et al., 1979) èëè îñóùåñòâëÿëè ïîâåðõíîñòíûé áëîòèíã (Plekhanov, 1996). Ðåïåðû ìîëåêóëÿðíîé ìàññû îêðàøèâàëè íà ìåìáðàíå 0.5%-íûì ðàñòâîðîì àìèäî÷åðíîãî 10 â 10%-íîé óêñóñíîé êèñëîòå, ïðèãîòîâëåííîé íà 40%-íîì ýòàíîëå, è äèôôåðåíöèðîâàëè â 5%-íîé óêñóñíîé êèñëîòå ñ äîáàâëåíèåì àíèîíîîáìåííîé ñìîëû Ñôåðîí-ÄÝÀÝ (Skl*arny Kavaier, Âîòèöå, ×åõèÿ).  êà÷åñòâå ðåïåðîâ ìîëåêóëÿðíîé ìàññû èñïîëüçîâàëè ôîñôîðèëàçó  (94 êÄà), áû÷èé ñûâîðîòî÷íûé àëüáóìèí (66 êÄà), ÿè÷íûé àëüáóìèí (45 êÄà) è êàðáîàíãèäðàçó (30 àÄà); âñå — ïðîèçâîäñòâà Sigma (ÑØÀ). Çàâèñèìîñòü äëèíû ïðîáåãà ðåïåðà îò åãî ìîëåêóëÿðíîé ìàññû àïïðîêñèìèðîâàëè ê ëèíåéíîé ìåòîäîì íàèìåíüøèõ êâàäðàòîâ è ïîëó÷åííîå ëèíåéíîå óðàâíåíèå èñïîëüçîâàëè äëÿ îïðåäåëåíèÿ îòíîñèòåëüíîé ìîëåêóëÿðíîé ìàññû ÁÒØ ïðîñòåéøèõ. Áåëêè, èììóíîëîãè÷åñêè ðîäñòâåííûå ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ, âûÿâëÿëè èììóíîõèìè÷åñêè. Äëÿ ýòîãî ïîñëå ñîðáöèè áåëêîâ îñòàòî÷íóþ ñîðáöèîííóþ ñïîñîáíîñòü íèòðîöåëëþëîçíîé ìåìáðàíû èñ÷åðïûâàëè èíêóáàöèåé åå â ìîëîêå («Ïåòìîë», æèðíîñòü 0.5 %), çàòåì ìåìáðàíó âûäåðæèâàëè â ðàñòâîðå àíòèòåë ïðîòèâ ÁÒØ70 èç ìûøö áûêà (àíòèòåëà ïðåäîñòàâëåíû Á. À. Ìàðãóëèñîì, Èíñòèòóò öèòîëîãèè ÐÀÍ), ïðèãîòîâëåííîì â ðàçâåäåíèè 1 : 150 íà ôèçèîëîãè÷åñêîì ôîñôàòíî-áóôåðíîì ðàñòâîðå (PBS) â òå÷åíèå íî÷è ïðè êîìíàòíîé òåìïåðàòóðå. Äàëåå ìåìáðàíó ïðîìûâàëè â PBS è âûäåðæèâàëè â ðàñòâîðå áåëêà À çîëîòèñòîãî ñòàôèëîêîêêà, ìå÷åííîãî ïåðîêñèäàçîé õðåíà (â êà÷åñòâå âòîðè÷íûõ àíòèòåë) (ÍÈÈÝÌ èì. Ïàñòåðà, ðàçâåäåíèå 1 : 2), ïðèãîòîâëåííîì íà ÔÁÐ, â òå÷åíèå 1 ÷ ïðè 37 °Ñ. Ïî îêîí÷àíèè èíêóáàöèè ìåìáðàíó ïðîìûâàëè â ÐBS 3 ðàçà ïî 10 ìèí, îïîëàñêèâàëè âîäîé, ïîñëå ÷åãî âûÿâëÿëè ïåðîêñèäàçíóþ àêòèâíîñòü áåíçèäèíîì èëè ìåòîäîì óñèëåííîé õåìèëþìèíåñöåíöèè (ECL), êîòîðûé îáëàäàåò áîëüøåé ÷óâñòâèòåëüíîñòüþ.  ñëó÷àå ïðèìåíåíèÿ ìåòîäà óñèëåííîé õåìèëþìèíåñöåíöèè ìåìáðàíó âûäåðæèâàëè â òå÷åíèå 1 ìèí â 532 À. Þ. Ïëåõàíîâ, À. Î. Ñìóðîâ è äð. êîììåð÷åñêîé ñìåñè ðåàêòèâîâ ECL (Amersham) è íàêëàäûâàëè íà ëèñòîâóþ ôîòîïëåíêó (Amersham ) ÷åðåç òîíêóþ ïîëèýòèëåíîâóþ ïëåíêó. Âðåìÿ ýêñïîçèöèè ïîäáèðàëè â èíòåðâàëå îò 15 ñ äî 15 ìèí. Ôîòîïëåíêó ïðîÿâëÿëè â ñòàíäàðòíîì ïðîÿâèòåëå äëÿ ÷åðíî-áåëûõ ôîòîáóìàã è ôèêñèðîâàëè â 20%-íîì Na2S2O3. Ïîñëå îñóùåñòâëåíèÿ ECL áëîò äâàæäû îïîëàñêèâàëè âîäîé è äîïîëíèòåëüíî ïðîÿâëÿëè áåíçèäèíîì. Äëÿ ïðîÿâëåíèÿ áåíçèäèíîì ìåìáðàíó ñ ñîðáèðîâàííûì íà íåé èììóíîïåðîêñèäàçíûì êîìïëåêñîì âûäåðæèâàëè â ðàñòâîðå, ñîäåðæàùåì 0.05 % áåíçèäèíà, 0.03 % H2O2, 0.002 M ëèìîííîé êèñëîòû è 0.004 Ì Na2HPO4 (pH 5) (Plekhanov, 1996). Áåíçèäèí äîáàâëÿëè, èñïîëüçóÿ 5%-íûé ñïèðòîâîé ðàñòâîð ñ íàãðåâàíèåì åãî äî ïðîçðà÷íîñòè è ïîñëåäóþùèì îõëàæäåíèåì äî êîìíàòíîé òåìïåðàòóðû. Ïîñëå ïðîÿâëåíèÿ çîí ìåìáðàíó ïðîìûâàëè ãîðÿ÷åé äèñòèëëèðîâàííîé âîäîé äëÿ îñòàíîâêè ïðîÿâëåíèÿ.  ñëó÷àå èíôóçîðèé P. jenningsi äëÿ âûÿâëåíèÿ áåëêîâ, èììóíîëîãè÷åñêè ðîäñòâåííûõ ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ, âìåñòî ýëåêòðîôîðåçà ïðèìåíÿëè òåõíèêó äîò-áëîòèíãà. Ñ ýòîé öåëüþ îñàæäåííûõ öåíòðèôóãèðîâàíèåì è ïðîìûòûõ àöåòîíîì ïðîñòåéøèõ ðàñòâîðÿëè â ìèíèìàëüíîì îáúåìå 1%-íîãî ÄÄÑ-Na, ñîäåðæàùåãî 1 ìÌ ÝÄÒÀ è 1 ìÌ ÔÌÑÔ; çàòåì 1—2 ìêë ïîëó÷åííîãî ýêñòðàêòà íàíîñèëè â òî÷êó íà íèòðîöåëëþëîçíóþ ìåìáðàíó. Ìåìáðàíó âûñóøèâàëè è èñêîìûé àíòèãåí âûÿâëÿëè èììóíîõèìè÷åñêè, êàê îïèñàíî âûøå. Ðåçóëüòàòû è îáñóæäåíèå Ìåòîäîì èììóíîáëîòèíãà â òîòàëüíîì áåëêîâîì ýêñòðàêòå àìåá À. proteus âûÿâëÿåòñÿ ïîëèïåïòèäíûé àíòèãåí ñ ìîë. ìàññîé îêîëî 84 êÄà, ïåðåêðåñòíî ðåàãèðóþùèé ñ àíòèòåëàìè ê ÁÒØ70 êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà (ðèñ. 1; 2, á).  òîòàëüíîì áåëêîâîì ýêñòðàêòå èíôóçîðèè P. jenningsi âûÿâëÿåòñÿ ïîëèïåïòèäíûé àíòèãåí ñ òîé æå ìîëåêóëÿðíîé ìàññîé, ÷òî è ó A. proteus, êîòîðûé òàêæå ïåðåêðåñòíî ðåàãèðóåò ñ àíòèòåëàìè ê ÁÒØ70 êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà (ðèñ. 2, â; 3). Êðîìå òîãî, â êëåòêàõ P. jenningsi ïðè ïîìîùè âûñîêî÷óâñòâèòåëüíîãî ìåòîäà ECL îáíàðóæèâàþòñÿ äîïîëíèòåëüíûå ìèíîðíûå ïîëèïåïòèäû ñ ìîë. ìàññàìè îêîëî 95 è 60 êÄà, êîòîðûå òàêæå ïåðåêðåñòíî ðåàãèðóþò ñ àíòèòåëàìè ïðîòèâ ÁÒØ70 (ðèñ. 2, â). ßâëÿþòñÿ ëè ýòè ìèíîðíûå ïîëèïåïòèäû íàòèâíûìè èëè àðòåôàêòíûìè, ïîêàæóò äàëüíåéøèå èññëåäîâàíèÿ. Ðàíåå (Podlipaeva, 2001) óæå ñîîáùàëîñü î íàëè÷èè ó àìåáû A. proteus (øòàìì Da èç êîëëåêöèè Ëàáîðàòîðèè öèòîëîãèè îäíîêëåòî÷íûõ îðãàíèçìîâ Èíñòèòóòà öèòîëîãèè ÐÀÍ) ïîëèïåïòèäíîãî àíòèãåíà, ïåðåêðåñòíî ðåàãèðóþùåãî ñ ïîëèêëîíàëüíûìè íåêîììåð÷åñêèìè êðîëè÷üèìè àíòèòåëàìè, òàêæå ïîëó÷åííûìè îò Á. À. Ìàðãóëèñà (Ëàáîðàòîðèÿ çàùèòíûõ ìåõàíèçìîâ êëåòêè Èíñòèòóòà öèòîëîãèè ÐÀÍ) è âûðàáîòàííûìè ïðîòèâ ÁÒØ70 êðóïíîãî ðîãàòîãî ñêîòà. Ïîçèöèÿ, çàíèìàåìàÿ âûÿâëåííûì ïîëèïåïòèäîì íà áëîòå îòíîñèòåëüíî ìîëåêóëÿðíîãî ìàðêåðà 66 êÄà, ïîçâîëèëà ñäåëàòü âûâîä î òîì, ÷òî äàííûé áåëîê ïðèíàäëåæèò ê ñåìåéñòâó ÁÒØ70 è ÿâëÿåòñÿ áåëêîì òåïëîâîãî øîêà íà îñíîâàíèè åãî ñðîäñòâà ê íóêëåîòèäàì ïî ðåçóëüòàòàì àôôèííîé õðîìàòîãðàôèè, îäíàêî òî÷íîãî îïðåäåëåíèÿ è ðàñ÷åòà åãî ìîëåêóëÿðíîé ìàññû íå ïðîâîäèëè (Podlipaeva, 2001). Ðèñ. 1. ÁÒØ â êëåòêàõ àìåá Amoeba proteus øòàììà Val, êóëüòèâèðóåìûõ â ñðåäå ñ ðàçíîé ñîëåíîñòüþ, ïîäâåðãíóòûõ ñîëåíîñòíîìó è òåïëîâîìó øîêàì. Èììóíîáëîòèíã ïîñëå ýëåêòðîôîðåçà â 13%-íîì ÏÀÀÃ. à — ìàðêåðû ìîëåêóëÿðíîé ìàññû; á — êîíòðîëüíàÿ êóëüòóðà àìåá, 0 O; â — àìåáû èç ïðåñíîé ñðåäû, ïîäâåðãíóòûå òåïëîâîìó øîêó (37 °Ñ, 1 ÷), ÷åðåç 3 ÷ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ; ã — àìåáû èç ïðåñíîé ñðåäû, ïîäâåðãíóòûå ñîëåíîñòíîìó øîêó (2 O, 2 ÷), ÷åðåç 3 ÷ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ; ä — êóëüòóðà àìåá, àêêëèìèðîâàííûõ ê 2 O, íå ïîäâåðãàâøàÿñÿ øîêîâûì âîçäåéñòâèÿì; å — êóëüòóðà àìåá, àêêëèìèðîâàííûõ ê 2 O, ïîäâåðãíóòàÿ òåïëîâîìó øîêó (37 °Ñ, 1 ÷), ñðàçó ïîñëå âîçäåéñòâèÿ; æ — êóëüòóðà àìåá, àêêëèìèðîâàííûõ ê 2 O, ïîäâåðãíóòàÿ òåïëîâîìó øîêó (37 °Ñ, 1 ÷), ÷åðåç 3 ÷ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ; ç — êóëüòóðà àìåá, àêêëèìèðîâàííûõ ê 2 O, ïîäâåðãíóòàÿ ñîëåíîñòíîìó øîêó (0 O, 2 ÷), ÷åðåç 3 ÷ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ. Îòìåòèì òàêæå, ÷òî ó ïðåñíîâîäíûõ èíôóçîðèé Tetrahymena áûë îáíàðóæåí áåëîê, íàçâàííûé ÁÒØ90 (HSP90), îáëàäàþùèé ìîë. ìàññîé 82—85 êÄà è ÿâëÿþùèéñÿ áåëêîì òåïëîâîãî øîêà (Frankel et al., 2001).  ïåðâè÷íîé ñòðóêòóðå ýòîãî áåëêà íå áûëî îáíàðóæåíî ñêîëüêî-íèáóäü âûñîêîé ãîìîëîãèè ñ ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ, â òî âðåìÿ êàê â íàñòîÿùåé ðàáîòå ðå÷ü èäåò î áåëêå, èìåþùåì îáùèå àíòèãåííûå äåòåðìèíàíòû ñ ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ, ÷òî ìîæåò óêàçûâàòü íà íàëè÷èå ñóùåñòâåííîé ãîìîëîãèè â ïåðâè÷íîé ñòðóêòóðå ïîñëåäíèõ. Ïî-âèäèìîìó, ÁÒØ90 è ÁÒØ70 ïðîñòåéøèõ ÿâëÿþòñÿ ðàçëè÷íûìè ïîëèïåïòèäàìè. Ïðè ïîâûøåíèè ñîëåíîñòè ñðåäû îò 0 äî 2 O êîíöåíòðàöèÿ îáíàðóæåííîãî íàìè àíòèãåíà ñïóñòÿ 3 ÷ ïîñëå âîçäåéñòâèÿ ó àìåá çàìåòíî âîçðàñòàëà (ðèñ. 1, ã). Î÷åâèäíî, ÷òî ðå÷ü, êàê è â ñëó÷àå ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ, èäåò î ïðîäóêòå «ðàííåãî» ãåíà, ýêñïðåññèÿ êîòîðîãî òåìïîðàëüíî (è, ïî-âèäèìîìó, ôóíêöèîíàëüíî) ïðåäøåñòâóåò îñíîâíûì èçìåíåíèÿì â ñèíòåçå áåëêîâ, ÷òî â ñâîþ î÷åðåäü ñîñòàâëÿåò îñíîâó ÿâëåíèÿ ôèçèîëîãè÷åñêîé àäàïòàöèè (àêêëèìàöèè) ê èçìåíèâøèìñÿ óñëîâèÿì ñðåäû. Ïðè òåïëîâîì øîêå ó àìåá, âûðàùåííûõ â ïðåñíîé ñðåäå, ïîâûøàåòñÿ óðîâåíü òîãî æå ñàìîãî àíòèãåíà, ÷òî è ïðè ñîëåíîñòíîì øîêå (ðèñ. 1, â). Òàêèì îáðàçîì, îáíàðóæåííûé íàìè àíòèãåí ìîæåò áûòü îõàðàêòåðèçîâàí êàê ðàííèé áåëîê ñòðåññà, èììóíîëîãè÷åñêè ðîäñòâåííûé ÁÒØ70 ïîçâîíî÷íûõ è, ïî âñåé âèäèìîñòè, ÿâëÿþùèéñÿ åãî àíàëîãîì. Àìåáû, àêêëèìèðîâàííûå ê ñîëåíîñòè 2 O, äåìîíñòðèðóþò âûñîêèé êîíñòèòóòèâíûé óðîâåíü îáíàðóæåííîãî íàìè àíòèãåíà (ðèñ. 1, ä ). Ïîâûøåííîå ñîäåðæàíèå ÁÒØ â ñîëåíîñòè, áëèçêîé ê ãðàíèöå òîëåðàíòíîãî äèàïàçîíà äàííîãî øòàììà (2.5 O), ñ îäíîé ñòîðîíû, ïîäòâåðæäàåò ïîâðåæäàþùèé õàðàêòåð ýòèõ óñëîâèé ñðåäû, Áåëîê òåïëîâîãî øîêà ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ 533 Ðàíåå â õîäå èññëåäîâàíèé òåìïåðàòóðíûõ àäàïòàöèé ó àìåá A. proteus óæå áûëî âûÿâëåíî, ÷òî ýòè ïðîñòåéøèå îáëàäàþò çàìåòíûì êîíñòèòóòèâíûì óðîâíåì ÁÒØ70 (Podlipaeva, 2001), è àâòîð ïðåäëàãàåò ðàññìàòðèâàòü ýòî êàê ïðåàäàïòàöèþ ê èçìåíåíèþ òåìïåðàòóðû ñðåäû îáèòàíèÿ. Òàêèì îáðàçîì, ïðåàäàïòàöèÿ ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ, àêêëèìèðîâàííûõ â ñðåäå ñ ïîâûøåííîé ñîëåíîñòüþ ê âîçìîæíûì èçìåíåíèÿì ôàêòîðîâ ñðåäû, ïî-âèäèìîìó, ÿâëÿåòñÿ îáùèì ïðàâèëîì. Äàëüíåéøèå èññëåäîâàíèÿ ñ ïðèâëå÷åíèåì ïðåñíîâîäíûõ ïðîñòåéøèõ èç äðóãèõ òàêñîíîìè÷åñêèõ ãðóïï ïîçâîëÿò ïðîâåðèòü ñïðàâåäëèâîñòü ýòîé ãèïîòåçû. Àâòîðû âûðàæàþò ãëóáîêóþ ïðèçíàòåëüíîñòü Á. À. Ìàðãóëèñó çà ïðåäîñòàâëåíèå àíòèòåë ïðîòèâ ÁÒØ70. Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ôèíàíñîâîé ïîääåðæêå Ðîññèéñêîãî ôîíäà ôóíäàìåíòàëüíûõ èññëåäîâàíèé (ïðîåêòû 04-04-49811 è 03-04-48062). Ðèñ. 2. ÁÒØ â êëåòêàõ àìåá Amoeba proteus øòàììà Val è èíôóçîðèé Paramecium jenningsi øòàììà SR1, êóëüòèâèðóåìûõ â ïðåñíîé ñðåäå. Èììóíîáëîòèíã ïîñëå ýëåêòðîôîðåçà â 13%-íîì ÏÀÀÃ. à — ìàðêåðû ìîëåêóëÿðíîé ìàññû, á — àìåáû, â — èíôóçîðèè. à ñ äðóãîé — ñîãëàñóåòñÿ ñ ðàíåå ïîëó÷åííûìè äàííûìè ïî òåìïåðàòóðíîìó âîçäåéñòâèþ íà àìåá äðóãîãî øòàììà òîãî æå âèäà (Podlipaeva, 2001). Ëþáîïûòíî, ÷òî ïðè äîïîëíèòåëüíîì ñòðåññîâîì âîçäåéñòâèè (ïåðåíîñ êëåòîê, àêêëèìèðîâàííûõ ê ýòîé ñîëåíîñòè, â ïðåñíóþ ñðåäó (ðèñ. 1, ç), à òàêæå òåïëîâîé øîê (ðèñ. 1, å, æ)) óðîâåíü ÁÒØ70 ñíèæàåòñÿ. Ýòî ìîæåò îçíà÷àòü, ÷òî íàêîïëåííûé áåëîê ðàñõîäóåòñÿ ïðè ñòðåññîâîì âîçäåéñòâèè. Èíûìè ñëîâàìè, ïðåñíîâîäíûå àìåáû, àêêëèìèðîâàííûå ê ïîâûøåííîé ñîëåíîñòè, ïðåàäàïòèðîâàíû ê âîçìîæíîìó ñòðåññîâîìó âîçäåéñòâèþ, à ñâîéñòâà èõ øàïåðîííîé ñèñòåìû â ïðîöåññå àäàïòàöèè èçìåíÿþòñÿ. Àíàëîãè÷íàÿ êàðòèíà âûÿâëÿåòñÿ ìåòîäîì äîò-áëîòèíãà è ó ïðåñíîâîäíûõ èíôóçîðèé P. jenningsi: óðîâåíü ÁÒØ70 íåçíà÷èòåëåí â êëåòêàõ, âûðàùåííûõ â ïðåñíîé ñðåäå (ðèñ. 3, à), è ïîâûøàåòñÿ ïðè ñîëåíîñòíîì øîêå (ðèñ. 3, â). Íàïðîòèâ, èíôóçîðèè, àêêëèìèðîâàííûå ê ñîëåíîñòè 2 O, äåìîíñòðèðóþò âûñîêèé êîíñòèòóòèâíûé óðîâåíü ÁÒØ70 (ðèñ. 3, á), êîòîðûé ñíèæàåòñÿ (ðàñõîäóåòñÿ) ïðè ñòðåññîâîì âîçäåéñòâèè (ñîëåíîñòíîì øîêå) (ðèñ. 3, ã). Ðèñ. 3. ÁÒØ â êëåòêàõ èíôóçîðèé Paramecium jenningsi øòàììà SR1, êóëüòèâèðóåìûõ â ñðåäå ñ ðàçíîé ñîëåíîñòüþ è ïîäâåðãíóòûõ ñîëåíîñòíûì øîêàì. Èììóíîõèìè÷åñêàÿ îêðàñêà äîò-áëîòîâ òîòàëüíîãî áåëêîâîãî ýêñòðàêòà èíôóçîðèé. à — êîíòðîëüíàÿ êóëüòóðà èíôóçîðèé, 0 O; á — êóëüòóðà èíôóçîðèé, àêêëèìèðîâàííûõ ê 2 O; â — ñîëåíîñòíûé øîê 0 D 2 O; ã — ñîëåíîñòíûé øîê 2 D 0 O. Ñïèñîê ëèòåðàòóðû Ìàðãóëèñ Á. À., Ãóæîâà È. Â. 2000. Áåëêè ñòðåññà â ýóêàðèîòè÷åñêèõ êëåòêàõ. Öèòîëîãèÿ. 42 (4) : 323—342. Øóáðàâûé Î. È. 1983. Àêâàðèóì ñ èñêóññòâåííîé ìîðñêîé âîäîé äëÿ ñîäåðæàíèÿ ïðèìèòèâíîãî ìíîãîêëåòî÷íîãî îðãàíèçìà Trichoplax è äðóãèõ ìåëêèõ áåñïîçâîíî÷íûõ. Çîîë. æóðí. 62 (4) : 618—621. Bakatselou C., Beste D., Kadri A. O., Somanath S., Clarka C. G. 2003. Analysis of genes of mitochondrial origin in the genus Entamoeba. J. Eukar. Microbiol. 50 : 210—214. Barque J. P., Schedler P., Floch E., Bonaly J. 2000. In Euglena gracilis, a heat-shock protein related to hsc73 is constitutive and stress inducible. Arch. Biochem. Biophys. 378 : 1—5. Deane E. E., Wool N. Y. 2004. Differential gene expression associated with euryhalinity in sea bream (Sparus sarba). Amer. J. Physiol. 287 : R1054—R1063. Drzymalla C., Schroda M., Beck C. F. 1996. Light-inducible gene HSP70B encodes a chloroplast-localized heat shock protein in Ñhlamydomonas reinhardtii. Plant Mol. Biol. 31 : 1185— 1194. Feder M. E., Hofmann G. E. 1999. Heat-shock proteins molecular chaperones, and the stress response: evolutionary and ecological physiology. Ann. Rev. Physiol. 61 : 243—282. Field J., Van Dellen K., Ghosh S. K., Samuelson J. 2000. Responses of Entamoeba invadens to heat shock and encystations are related. J. Eukar. Microbiol. 47 : 511—514. Fink K., Zeuthen E. 1980. Heat shock proteins in Tetrahymena studied under growth conditions. Exp. Cell Res. 128 : 23—30. Frankel J., Williams N. F., Nelsen E. M., Keeling P. J. 2001. An evaluation of Hsp90 as a mediator of cortical patterning in Tetrahymena. J. Eukar. Microbiol. 48 : 147—160. Hori M., Fujishima M. 2003. The endosymbiotic bacterium Holospora obtusa enhances heat-shock gene expression in the host Paramecium caudatum. J. Eukar. Microbiol. 50 : 293—298. Joshi B., Biswas S., Sharma Y. D. 1992. Effect of heat-shock on Plasmodium falciparum viability, growth and expression of the heat-shock protein «PFHSP70-I» gene. FEBS Lett. 312 : 91— 94. Kalinina L. V., Khrebtukova I. A., Podgornaya O. L., Wasik A., Sikora J. 1988. Heat shock proteins in Amoeba. Eur. J. Protistol. 24 : 64—68. La Terza A., Papa G., Miceli C., Luporini P. 2001. Divergence between two antarctic species of the ciliate Euplotes, E. focardii and E. nobilii, in the expression of heat-shock protein 70 genes. Mol. Ecol. 10 : 1061—1067. Laemmli U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 : 680—685. À. Þ. Ïëåõàíîâ, À. Î. Ñìóðîâ è äð. 534 Lloyd D., Ralphs James R., Harris Janine C. 2002. Giardia intestinalis, a eukaryote without hydrogenosomes, produces hydrogen. Microbiology. 148 : 727—733. McMullin Th. W., Hallberg R. L. 1987. A normal mitochondrial protein is selectively synthesized and accumulated during heat shock in Tetrahymena thermophila. Mol. Cell. Biol. 7 : 4414—4423. Perez-Serrano J., Martinez J., Perez B., Bernadina W. E., Rodriguez-Caabeiro F. 2000. In vitro shock response to different stressors in free living and pathogenic Acanthamoeba. Int. J. Parasitol. 30 : 829—835. Plekhanov A. Y. 1996. Immunoreplica from the gel surface: rapid and sensitive blot plus intact gel. Anal. Biochem. 239 : 110—111. Podlipaeva Y. I. 2001. Heat shock protein of 70 kDa in Amoeba proteus. Protistology. 2 : 123—129. Prescott D. M., Carrier R. F. 1964. Experimental procedures and cultural methods for Euplotes eurystomus and Amoeba proteus. In: Methods in cell physiology. New York; London: Acad. Press. 1 : 85—95. Requena J. M., Jimee-Ruiz H., Soto M., Assiego R., Santaren J. F., Lopez A., Pataroyo E., Alonso C. 1992. Regulation of HSP70 expression in Trypanosoma cruzi by temperature and growing phase. Mol. Biochem. Parasitol. 53 : 201—211. Smurov A. O., Fokin S. I. 1998. Resistance of Paramecium caudatum infected with endonuclear bacteria Holospora against salinity impact. Proc. Zool. Inst. 276 : 175—178. Sonneborn T. M. 1970. Methods in Paramecium research. Meth. Cell Physiol. 4 : 241—339. Towbin H., Staeheln T., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 76 : 4350—4354. Triana O., Galanti N., Olea H., Wernstedt L. H., Medina C., Toro G. C. 2000. Chromatin and histones from Giardia lamblia: a new puzzle in primitive eukaryotes. J. Cell. Biochem. 82 : 573— 582. Varadharajan S., Chandrashekar B. K. S., Rangarajan P. N., Govindarajan P. 2004. Localization of ferrochelatase in Plasmodium falciparum. Biochem. J. 384 : 429—436. Wallace G. R., Ball A. E., Mac Farlane J., el Safi S. H., Miles M. A., Kelly J. M. 1992. Mapping of visceral leishmaniasis-specific immunodominant B-cell epitope of Leishmania donovani Hsp70. Infection and Immunity. 60 : 2688—3693. Ïîñòóïèëà 29 XI 2005 HEAT SHOCK PROTEINS OF FRESHWATER PROTISTS AND THEIR INVOLVEMENT IN ADAPTATION TO CHANGES IN THE ENVIRONMENTAL SALINITY A. Yu. Plekhanov,1 A. O. Smurov,2, 3 Yu. I. Podlipaeva,4 L. O. Ivanova,3 A. V. Goodkov3, 4 1 St. Petersburg Nuclear Physics Institute RAS, 2 Zoological Institute RAS, 3 Biological Research Institute, St. Petersburg State University, and 4 Institute of Cytology RAS, St. Petersburg; e-mail: pelgood@rambler.ru Changes in the level of heat shock proteins (HSP) in cells of freshwater protists, amoebae Amoeba proteus and ciliates Paramecium jenningsi, in response to changes in the environmental salinity were investigated. Changes in salinity levels were considered as a stress factor. The immunoblotting method revealed a polypeptide antigen cross-reacting with antibodies against bovine HSP70 in total protein extracts of both intact cells and cells subjected to salinity stress. The same polypeptide antigen was revealed in A. proteus cells subjected to heat shock. Therefore, it may be supposed that the polypeptide revealed after salinity shock is a heat shock protein related to the vertebrate HSP70. Under the impact of stress factor, well acclimated protists mostly spend their own previously accumulated HSP70. A conclusion is made that freshwater protists, living under conditions of increased salinity, appear to be preadapted to changes in environmental factors. K e y w o r d s: salinity adaptation, freshwater protists, Amoeba proteus, Paramecium jenningsi, heat shock proteins.