Исследование механизма каталитического гидролиза фермента Аспартоацилазы и его мутантных аналогов методами компьютерного моделирования Коц Екатерина Дмитриевна Аспирант Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, Химический факультет, Москва, Россия kots.katya@gmail.com Аспартоацилаза (ASPA) – цинк-зависимый фермент класса карбоксипептидаз [Bitto, 2006, pp. 456-451], расщепляющий пептидную связь N-ацетил-аспарагиновой кислоты (NAA) [Surendran, 2003, pp. 604-610]. Нарушение уровня концентрации NAA в мозге служит индикатором многих нейрональных дисфункций: отклонение его концентрации было обнаружено при болезни Альцгеймера, болезни Канавана, шизофрении и др. [Jessen, 2013, pp. 197-205]. Модельная система для изучения механизма и функций ASPA – болезнь Канавана, вызванная врождёнными мутациями в гене, кодирующем данный белок [Wijayasinghe, 2014, pp. 4970-4988]. На данный момент в литературе существует лишь предполагаемый механизм гидролиза NAA, не объясняющий роль самых распространённых мутаций в дезактивации ASPA [Bitto, 2006, pp. 456-451]. Цель данной работы - расчёт профиля минимальной энергии реакции гидролиза n-ASPA и ASPA(E285A) с последующим построением кинетической схемы (включая образование белок-субстратного комплекса и выход продуктов) и сравнением значений рассчитанных kcat и Km с экспериментальными данными. Литературные данные по зависимости активности фермента от концентрации субстрата свидетельствуют о наличии второго центра связывания и процесса самоингибирования [Le Coq, 2006, pp. 5878-5884]. Поэтому вторичная цель работы - =объяснение описанной экспериментальной кривой. Для построения среза профиля минимальной энергии реакции гидролиза NAA с n-ASPA и ASPA(E285A) был использован метод КМ/ММ (NwChem 6.5.), где квантовая частьбыла описана методом ТФП c функционалом pbe0 (базис 6-31G(**)), ММ часть – с помощью силового поля AMBER99. Свободная энергия образования белок субстратного комплекса, выхода продуктов и побочного центра связывания были рассчитаны методом Umbrella Sampling (NAMD2.9) Полученные данные были сопоставлены с экспериментальными значениями kcat и Km [Le Coq, 2006, pp. 5878-5884]. Результаты: 1. Установлен механизм гидролиза NAA ферментом ASPA и рассчитан профиль минимальной энергии гидролиза и все сопутствующие барьеры. 2. Методами молекулярной динамики рассчитаны константы связывания субстрата с активным сайтов и выхода продуктов в раствор, и установлено, что лимитирующая стадия реакции – выход продуктов раствор. 3. Рассчитаны константы связывания для второго центра связывания для свободного белка и для белок-субстратного комплекса. Полученные значения доказывают возможность самоингибирования. Список литературы. 1. Bitto E., Bingman C.A., Wesenber G.E., McCoy J.G., Phillips G.N. Structures of aspartoacylase , the brain enzyme impaired in Canavan disease. // PNAS.2007. V. 104. P. 456-461. 2. Surendran S., Matalon K., Tyring S.K., Matalon R. Molecular basis of Canavan disease: from human to mouse. // J. Child. Neurol. 2003. V. 18. P. 604-610. 3. Jessen F., Fingerhut N., Sprinkart A.M., Petrovsky N., Maier W. et al. Nacetylaspartylglutamate (NAAG) and N-acetylaspartate (NAA) in patients with schizophrenia. // Schizophrenia Bulletin. V. 39(1). P. 197-205. 4. Le Coq J., An H.-J., Lebrilla C., Viola R.E. Characterization of Human Aspartoacylase: the brain enzyme responsible for Canavan disease. // Biochem. V. 45(18). P. 5878-5884.