Диссертация Грищенко Н.В. - Российский онкологический
реклама
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИМЕНИ Н.Н. БЛОХИНА» На правах рукописи Грищенко Наталия Викторовна ПРЕОДОЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ЛИПОСОМАЛЬНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ ИЗ ГРУППЫ НИТРОЗОАЛКИЛМОЧЕВИН 14.01.12 – «онкология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: академик РАН, доктор медицинских наук, профессор М.И. Давыдов кандидат фармацевтических наук М.А. Барышникова МОСКВА – 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ Список сокращений…………………………………………………… 4 Введение…………………………………………………………………. 6 Глава 1. Обзор литературы…………………………………………… 10 1.1. Механизмы клеточной гибели…..………………………………… 10 1.1.1. Апоптоз…………………………………………..………………. 10 1.1.2. Аутофагическая клеточная смерть……………………………… 25 1.1.3. Некроз………………………………………………………….…. 33 1.1.4. Нетоз…..………………………………………………………….. 36 1.1.5. Корнификация……………………………………………………. 36 1.1.6. Митотическая катастрофа……………………………………….. 37 1.1.7. Энтоз…...…………………………………………………………. 41 1.1.8. Партанотоз…….………………………………………………….. 41 1.2. Механизмы действия противоопухолевых препаратов нитрозоалкилмочевин…………………………………………………… 42 Глава 2. Материалы и методы исследования…………………….... 54 2.1. Материалы и реактивы…………………………………………….. 54 2.2. Оборудование………………………………………………………. 55 2.3. Методы исследования……………………………………………… 56 2.3.1. Клеточные линии и их культивирование…………….……….... 56 2.3.2. Изучение цитотоксического действия препаратов методом МТТ - тест……………………………………………………………….. 56 2.3.3. Метод двойного окрашивания с использованием Аннексина V-FITC в комбинации с пропидием йодидом………….……………… 58 2.3.4. Прямая реакция иммунофлуоресценции (РИФ)………………... 58 2 2.3.5. Проточно-цитофлуориметрический анализ……………………. 59 2.3.6. Определение мРНК mFas и sFas………..……………………….. 60 2.3.7. Статистическая обработка результатов……………..…………. 61 Глава 3. Результаты исследований………..………………………… 62 3.1. Исследование фенотипа клеточных линий меланомы………….. 62 3.1.1. Статус CD95/Fas рецептора …………………………….………. 62 3.1.2. Статус MDR1 гена …………………………………………..…… 66 3.2. Цитотоксическое действие двух лекарственных форм производных нитрозометилмочевины на меланомные клеточные линии……..……………………………………………………………..... 72 3.2.1. Лиофилизированная араноза…………………………………….. 72 3.2.2. Липосомальная араноза …..……………………………………... 77 3.3. Определение статистической значимости различий в проценте живых клеток после инкубации клеток с двумя лекарственными формами аранозы …………………………………………………......... 88 3.4. Цитотоксическое действие двух лекарственных форм OR-2011 на меланомные клеточные линии ……………………………………… 101 3.5. Влияние двух лекарственных форм аранозы на индукцию апоптоза в клеточных линиях меланомы человека…………………… 109 3.6.Преодоление множественной лекарственной устойчивости липосомальной аранозой …………………………………………..….. 118 Глава 4. Обсуждение результатов исследований………………….. 121 ВЫВОДЫ……………………………………………………………….. 124 Список литературы……………………………………………………. 125 3 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ АТФ Аденозинтрифосфат дATФ Дезоксиаденозинтрифосфат МОМР Пермобилизация наружной митохондриальной мембраны МЛУ Множественная лекарственная устойчивость ПЦР Полимеразная цепная реакция РТРС Мультипротеиновый комплекс пермобилизующих пор ТЭС Сыворотка эмбрионов крупного рогатого скота AIF Фактор индуцирующий апоптоз APAF1 Цитоплазматический адаптерный белок dATP Цитоплазматический адаптерный белок CAD Каспазо-активируемая ДНКаза CARD Домен активации и рекрутирования каспазы DD Домен смерти DED Эффекторный домен смерти DMSO Диметилсульфоксид DISC Сигнальный комплекс индуцирующий смерть FADD Белок, взаимодействующий с доменом смерти Fas-рецептора FITC Флуоресцеинизотиоцианат HTRA2 Сериновая протеаза IAPs Ингибитор апоптоза р53 Белок – онкосупрессор PI Пропидиум йодит PS Фосфатидилсерин 4 TNF Фактор некроза опухолей альфа TNFR1 Рецептор фактора некроза опухоли 1 TRADD TNFR-ассоциированный белок с доменом смерти TRAIL Апоптоз-индуцирующий лиганд семейства TNF TRAILR Рецептор к апоптоз-индуцирующему лиганду семейства TNF 5 ВВЕДЕНИЕ Химиотерапия является признанным методом лечения злокачественных опухолей. Однако нередко у больных вырабатывается резистентность к противоопухолевым химиопрепаратам. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) является серьезным препятствием в терапии рака. Развитие МЛУ вызывает гиперэкспрессия гена MDR1 и его продукта гликопротеида рgp 170. Она проявляется уменьшением внутриклеточного накопления противоопухолевых препаратов и приводит к значительному снижению эффективности лечения. В последние годы появились работы, в которых для преодоления МЛУ используются липосомальные лекарственные формы препаратов [27; 64; 138]. На протяжении последних 20 лет в практике мировой фармакологии интенсивно используются препараты различной направленности на основе липосом и липидов. Эти препараты нашли широкое применение в диагностике и химиотерапии опухолевых заболеваний [5; 39]. Основной недостаток липосом как носителя лекарственных препаратов состоит в том, что они активно захватываются клетками ретикулоэндотелиальной системы и быстро выводятся из кровотока. Для предотвращения этого недостатка липосомы покрывают полиэтиленгликолем (пегилирование), который создает повышенное осмотическое давление вокруг липосомы, препятствующее приближению других клеток. Пегилированные липосомы долго циркулируют в крови, усиливают эффект пермеабилизации (проницаемости) и накопления [7]. Главная лекарственных цель использования препаратов липосом заключается в в качестве носителей селективном накоплении действующих веществ в патологических очагах (опухолях, воспаленных тканях). Включение лекарства в липосому может изменить фармакокинетику и биораспределение препарата, приводящее к повышению эффективности противоопухолевой терапии и снижению токсичности [47; 6 51]. Противоопухолевые препараты отличаются от других лекарств высокой агрессивностью, химической нестабильностью во внешней среде и сильным местнораздражающим действием. Для достижения необходимого терапевтического эффекта инкапсулированный в везикулы препарат должен быть доступным для клеток-мишеней [52]. Далее липосомы интернализуются клетками-мишенями или разрушаются различными способами (ферментативным гидролизом либо воздействием извне – например, ультразвуком, температурой) возле поверхности клеток с последующим высвобождением препарата и его захватом этими клетками. Кроме того, липосомы преодолевают МЛУ [6; 15]. Известно, что химиопрепараты, применяемые в терапевтических дозах, вызывают гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза, активируя при этом различные сигнальные пути клеточной смерти. Апоптоз, или программированная гибель клетки, может быть запущен факторами, действующими как внутри клетки, так и приходящими из внеклеточной среды. К первым относятся неисправимые повреждения биомакромолекул клетки, ко вторым – опосредованные трансмембранными рецепторами сигналы цитокинов семейства фактора некроза опухоли (TNF). Оба пути через цепь последовательных событий активируют эффекторные каспазы. Противоопухолевые препараты обычно активируют как внеклеточный сигнальный путь гибели опухолевой клетки, взаимодействуя с CD95рецептором на поверхности клеточной мембраны, так и внутриклеточный сигнальный путь, способствуя высвобождению цитохрома с. Механизмы индукции внеклеточного/внутриклеточного апоптоза, или регулируемого некроза липосомальными противоопухолевыми препаратами практически не исследованы. Липосомальные формы противоопухолевых препаратов, обладая рядом преимуществ по сравнению со свободным препаратом, исключают контакт препарата с цитоплазматической мембраной и не способны активировать внеклеточный путь индукции апоптоза. Липосомы переносят препарат в цитоплазматические компартменты клетки и 7 активируют внутриклеточный путь индукции апоптоза или регулируемый некроз. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Целью работы является изучение преодоления лекарственной устойчивости липосомальной лекарственной формой противоопухолевых препаратов из группы нитрозоалкилмочевин. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Охарактеризовать клеточные линии меланомы кожи по экспрессии рецептора CD95/Fas, опосредующего апоптоз. 2. Охарактеризовать клеточные линии меланомы кожи по экспрессии гликопротеидов генов множественной лекарственной устойчивости. 3. Сравнить цитотоксическое действие липосомальных и традиционных лекарственных форм препаратов из группы нитрозоалкилмочевины аранозы и OR-2011 на линиях меланомы кожи человека mel Z, mel Mtp, mel Mtp clone X, mel Ibr, mel Kor. 4. Определить индукцию апоптоза в клеточных линиях липосомальными и традиционными лекарственными формами препаратов из группы нитрозоалкилмочевины. НАУЧНАЯ НОВИЗНА В настоящей работе впервые обнаружено, что липосомальная лекарственная форма противоопухолевого препарата аранозы индуцирует апоптоз. Впервые продемонстрировано, что липосомальная лекарственная форма противоопухолевых препаратов не использует CD95-зависимый путь индукции апоптоза. 8 НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Данные, полученные в настоящем исследовании, могут быть использованы для обоснования применения липосомальных лекарственных форм противоопухолевых химиопрепаратов при лечении онкологических больных, а также повышения чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам и преодоления устойчивости (МЛУ). 9 множественной лекарственной Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. МЕХАНИЗМЫ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ 1.1.1. Апоптоз Первые попытки классификации типов клеточной смерти были предприняты в середине 60-х годов. Так, в 1973 г. Schweichel и Merker предложили первую классификацию клеточной смерти: первый тип клеточной смерти ассоциирован с гетерофагией, второй тип ассоциирован с аутофагией и третий тип не связан был ни с каким типом. Эти формы клеточной смерти соответствовали апоптозу, аутофагической клеточной смерти и некрозу соответственно [96; 97; 124]. Классификацией типов клеточной смерти занимался номенклатурный комитет по клеточной смерти (Nomenclature Committee on Cell Death, NCCD) в 2005, 2009 и 2012 гг. Он обозначил несколько вариантов клеточной смерти. Помимо этих трѐх, ставших классическими, типов клеточной смерти в настоящее время охарактеризовано также много других. Подробнее каждый из этих типов клеточной смерти рассмотрены ниже. Апоптоз - (от греч. «από» – отделение и «πτωσις» – падение) генетически запрограммированная гибель клеток, которая приводит к «аккуратной» разборке и удалению клеток [23]. Апоптоз – многофазный процесс. На первом этапе (инициаторная фаза) происходит инициация Индукторами и трансдукция запрограммированной проапоптотического гибели могут сигнала. выступать самые различные факторы, такие как белковые продукты протоонкогенов, молекулы – лиганды цитотоксические мембранных лекарственные рецепторов препараты, смерти, вирусы и др. радиация, Большое количество белков участвуют в апоптозе. В зависимости от их функций их делят на две группы: белки-триггеры и белки-модуляторы. Белкимодуляторы участвуют в трансдукции 10 «сигнала смерти». Триггеры участвуют в индукции проапоптотического сигнала (например, белки из семейства фактора некроза опухолей, Т- и В-клеточные рецепторы). За инициацией следует эффекторная фаза, в ходе которой происходит активация каспазной системы клетки. Вслед за эффекторной наступает фаза деградации клетки, характеризующаяся деструкцией клеточного материала [45]. Морфологическими признаками этого активного процесса являются переход фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный монослой [48], уменьшение клетки в объеме, мембрана теряет микроворсинки и нормальную складчатость, образует пузыревидные вздутия («отшнуровывание» пузырьков, так называемых апоптотических телец), распад клеточного ядра, уплотнение хроматина и фрагментация ДНК. Сначала образуются крупные фрагменты ДНК по 30 000 – 700 000 пар оснований. Затем происходит межнуклеосомная деградация ДНК, т.е. ее расщепление в результате формирования разрывов между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180-190 пар оснований. Эти фрагменты выявляются при горизонтальном электрофорезе в агарозном геле в виде «ДНК-овой лестницы» - отдельных полос, соответствующих дискретности по молекулярной массе образующихся фрагментов ДНК [3; 4; 18; 23]. Апоптотические тельца фагоцитируются очень быстро, так как на их поверхности экспрессируются молекулы, распознаваемые фагоцитирующими клетками: тромбоспондин, фосфолипиды, содержащие фосфатидилсерин, гликоконъюгаты, содержащие концевой β-D-N-ацетилглюкозамин, витронектин. Процессу фагоцитоза способствует также инактивация на поверхности умирающих клеток молекул типа CD31, необходимых для распознавания не подлежащих поглощению жизнеспособных клеток [4; 49; 156]. Клетки, подвергшиеся апоптозу, распознаются макрофагами и другими фагоцитирующими клетками и быстро элиминируются. Морфологически регистрируемый процесс апоптоза продолжается 1—3 часа. Очень важно то, что при апоптозе не развивается воспалительный процесс. Апоптоз является 11 способом самоуничтожения клетки, который генетически запрограммирован и включается в нужное время и с нужной интенсивностью. В отличие от некроза апоптоз для своего развития требует наличия АТФ, т. е. является энергозависимым процессом расщепления ДНК эндогенными эндонуклеазами, при этом лизосомы остаются интактными. Посредством апоптоза организм избавляется от ненужных, или «отработавших», клеток, например во время эмбрионального развития, при формировании нервной системы и при иммунном ответе. Путем апоптоза элиминируются трансформированные клетки, например при канцерогенной дегенерации, вирусной инфекции или необратимом повреждении ДНК в случае облучения [4; 20; 23; 26; 158]. Внешний апоптоз Термин «Внешний апоптоз» сейчас используется для обозначения клеточной смерти, которая индуцируется внеклеточными сигналами, специфическими к трансмембранным рецепторам [97; 149; 197]. «Рецепторы смерти» представляют собой трансмембранные белки, для которых характерно наличие в цитоплазматической части молекулы участка размером около 80 аминокислотных остатков. Данная последовательность называется «доменом смерти» (death domain- DD) и необходима для трансдукции сигнала апоптоза [31]. В качестве таких сигналов выступают специфические внеклеточные лиганды, которые связываются со своим рецептором клеточной гибели, экспрессированным на поверхности клеточной мембраны и активируют соответствующий сигнал смерти. Известно пять сигнальных путей внешнего апоптоза и их рецепторы. Это FAS/CD95 и его лиганд (FASL/CD95L), рецептор опухоленекротического фактора альфа TNFR1 и его лиганд, TRAILR и его лиганд (TNFS10, 10 член суперсемейства лигандов TNF) [31; 197]. Кроме того, внешний проапоптотический сигнал может быть послан через так называемые «зависимые рецепторы». Например, через нетриновые рецепторы UNC 5A и DCC, которые проявляют свою внешнюю летальную 12 функцию только тогда, когда концентрация их специфического лиганда падает ниже порогового уровня [149; 159]. Первым хорошо изученным сигнальным путем внешнего апоптоза был FAS/ CD95 комплекс. Белок CD95 принадлежит к семейству рецепторов фактора некроза опухолей. Мембранная форма CD95- гомотримерный гликопротеин из 320335 аминокислотных остатков и молекулярная масса 42-52 кДа. CD95 экспрессируется на поверхности клеток многих типов: на фибробластах, кератиноцитах, тимоцитах, гепатоцитах, лимфобластоидных клеточных линиях, активированных Т- и В-лимфоцитах, миелоидных клетках, а также на клетках нервной системы (нейроцитах, олигодендроцитах и астроцитах) [164; 198]. Ген Fas у человека (название гена АРТ) относится к мембранным белкам I типа, состоит из 9 экзонов и локализован в длинном плече десятой хромосомы (10g23) [164]. В его структуре можно выделить три отдела: 1) экстрацеллюлярный, состоящий примерно из 160 аминокислотных остатков, закодированных в первых пяти экзонах гена Fas; 2) трансмембранный, соответствующий шестому экзону; 3) интрацеллюлярный, закодированный в 7-9 экзонах [164]. высокое Особенностью экспрессии гена CD95/Fas является разнообразие форм мРНК, образующихся в результате альтернативного сплайсинга. Среди них выделяют мембранную (mFas), доминирующую растворимую (sFasExo6Del/sFasTMDel) и несколько минорных растворимых форм с делециями 3; 4; 6 экзонов (FasExo3,4,6Del) и с делецией 4 экзона (FasExo4Del). Мембранная форма CD95/Fas участвует в инициации апоптоза [4; 45; 53]. Функциональная направленность растворимых форм обусловлена их структурной организацией. Мономерная растворимая форма CD95/Fas (sCD95/sFas) блокирует передачу сигнала смерти. Изменение экспрессии гена CD95/Fas может сопровождаться возникновением разных по составу и уровню представленности мРНК спектров, а также флуктуацией сывороточного содержания отличающихся по структуре и функциям фракций sCD95/sFas. Такая ситуация в отношении 13 мембранных и растворимых форм CD95/Fas вносит вклад в изменение баланса сигналов выживания/гибели уже на начальных этапах апоптоза [53]. В основе апоптоза нормальных и злокачественных клеток лежит CD95 (FAS/APO-1) FASL- рецепторно/лигандная система [79; 80; 123; 189]. Процесс апоптоза внеклеточных начинается лигандов с с взаимодействия рецепторами специфических клеточной гибели, экспрессированными на поверхности клеточной мембраны. Рецепторный путь начинается с активации на мембране клеток рецептора Fas (CD95), относящегося к семейству TNF (англ. tumor necrosis factor receptor или кратко TNFR – «рецептор фактора некроза опухолей»). Тример Fas- лиганда в результате взаимодействия тримеризуют Fas (то есть «сшивают» 3 молекулы рецептора), последний изменяет свою конформацию так, что DD-домен оказывается способным связываться с соответствующим доменом белкаадаптера FADD/Mort-1 [70]. FADD в своем составе содержит два ключевых домена: эффекторный домен смерти DED на N-конце и, связывающийся с молекулой CD95, DD на С-конце [73]. Адаптер FADD (от англ. Fas-associated DD-protein – «белок, взаимодействующий с доменом смерти Fas-рецептора») способен взаимодействовать Связывание происходит с неактивной прокаспазой -8 (FLICE). через DED-домены обеих молекул. Комплекс, в состав которого входит FasL – Fas – FADD – прокаспаза-8, образуется в течение нескольких секунд и носит название апоптосомы, апоптозные шапероны, или сигнальный комплекс, индуцирующий смерть (DISC – deathinducing signaling complex) [73; 167]. Прокаспазы обладают незначительной протеолитической активностью, составляющей 1–2% активности зрелой каспазы [105;159; 187]. Будучи в мономерной форме, прокаспазы, концентрация которых в клетке ничтожна, находятся в латентном состоянии. Предполагается, что пространственное сближение молекул прокaспаз при их агрегации ведет к образованию активных каспаз через механизм протеолитического само- и перекрестного расщепления (ауто- или транспроцессинга) [105, 159; 187]. В результате от прокаспазы (молекулярная 14 масса 30–50 кДа) отделяется регуляторный N-концевой домен (продомен), а оставшаяся часть молекулы разделяется на большую (~20 кДа) и малую (~10 кДа) субъединицы. Затем происходит ассоциация большой и малой субъединиц. Два гетеродимера образуют тетрамер с двумя каталитическими участками, действующими независимо друг от друга. Таким образом, прокаспаза-8 активируется в цитоплазие в виде каспазы-8 [48]. Активные субъединицы каспазы-8 начинают расщеплять в клетке субстраты, включая эффекторные каспазы-3, -6 и -7. Каспаза 8 активирует каспазу 3 путем протеолиза прокаспазы 3, после чего процесс, запущенный программой смерти, оказывается необратимым. Каспаза 3 активирует ряд протеаз семейства каспаз, фактор фрагментации ДНК, что ведет к необратимому распаду ДНК на нуклеосомальные фрагменты [20; 31; 45; 105]. Fas-лиганд (FasL) является цитокином семейства фактора некроза опухоли (TNF), который экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах и натуральных киллерах, а также клетках Сертоли и паренхимных клетках передней камеры глаза, что позволяет убивать любую Fas-экспрессирующую клетку, в том числе и Т-лимфоцит. FasL относится к мембранным белкам второго типа, гомотример, располагается в первой хромосоме человека. Белок существует в двух формах: нерастворимой (мембраносвязанной) и растворимой, отщепляемой от клетки с помощью металлопротеиназы. Растворимая форма человеческого FasL сохраняет свою активность [121; 179; 198]. Для рецепторов TNFR1 и DR3 взаимодействующий с доменом адаптером является TRADD (белок, смерти TNFR1-рецептора). Адаптер, ассоциированный с рецептором смерти, вступает во взаимодействие с эффекторами — пока ещё неактивными предшественниками протеаз из семейства инициирующих каспаз — с прокаспазами. В результате цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-адаптер-эффектор» агрегаты, в которых происходит активация каспаз. 15 формируются Рецепторы смерти, адаптеры и эффекторы взаимодействуют между собой сходными по структуре доменами: DD, DED, CARD. DD (от англ. death domain — «домен смерти») участвует во взаимодействии рецептора Fas с адаптером FADD и во взаимодействии рецепторов TNFR1 или DR3 с адаптером TRADD. Посредством домена DED (от англ. death-effector domain — «домен эффектора смерти») осуществляется взаимодействие адаптера FADD с прокаспазами -8 и -10. Домен CARD (от англ. caspase activation and recruitment domain — «домен активации и рекрутирования каспазы») участвует во взаимодействии адаптера RAIDD с прокаспазой-2. Рецепторы клеточной гибели находятся на поверхности клеток в виде тримеров, и вероятно, соответствующие лиганды располагаются в виде кластеров, которые связаны с двумя и более этих тримеров. Такое расположение делает рецепторы доступными для взаимодействия с внутриклеточными белками. После связывания между собой доменов гибели Fas/CD95 и рецепторов TRAIL, они ассоциируют с адаптерным белком FADD (Fas-associated death domain). Эта ассоциация возникает при участии домена гибели FADD белка. При этом в клетке молекулы FADD сближаются, и становится доступным другой регион белка, содержащий DED. Домен DED белка FADD связывается с DED-участками продомена мономера каспазы-8, что приводит к образованию димеров и активации инициаторной каспазы по механизму индуцированного сближения. После связывания рецептора гибели быстро образуется комплекс, содержащий FADD (за счет взаимодействия с доменом гибели). FADD связан с каспазой-8 (за счет взаимодействия с DED). Это сигнальный комплекс, индуцирующий клеточную гибель DISC [20; 31; 105]. В отличие от других рецепторов клеточной гибели, домен гибели TNFR1 не связывается с FADD. Вместо этого при взаимодействии с TNFR1 происходит связывание другой адаптерной молекулы TRADD (англ. TNFreceptor-associated death domain). После этого TRADD высвобождается внутрь клетки в виде димера, и в цитозоле этот димер начинает 16 контактировать и взаимодействует связываться с с инициаторной FADD. Димеризованный каспазой-8 и FADD активирует её. Взаимодействие с TNFR1 также вызывает связывание других молекул с внутриклеточной частью рецептора. К их числу относятся TRAF (TNFreceptor-associated factors). После этого TRAF запускают процесс активации ядерного фактора-кВ (NF-кВ), который представляет собой фактор транскрипции. Фактор запускает экспрессию нескольких белков, которые предотвращают образование DISС и активацию каспазы-8. Таким образом, связывание TNF с TNFR1 вызывает появление сигналов, способных как вызывать апоптоз, так и блокировать его. Если активируется NF-кВ, то TNF не запускает апоптоз, а участвует в развитии воспаления. Наоборот, при блокировании NF-кВ или ингибировании синтеза РНК или белка, TNF индуцирует апоптоз. Он играет важную роль в патогенезе и прогрессии злокачественных опухолей человека, в регуляции экспрессии множества генов, вовлеченных в пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток, а также генов воспалительного и иммунного ответа [21; 31; 119]. Главным участником в механизме внешнего апоптоза являются каспазы. Каспазы – семейство субъединичных протеаз, которые характеризуются присутствием цистеинового остатка в активном центре, а также тем, что расщепляют полипептидную цепь после остатка аспарагиновой кислоты. Каспазы синтезируются в виде предшественников и именно апоптотический сигнал способствует его «созреванию» в зрелый энзим. В зависимости от длины и структуры NH2 – концевого продомена каспаз их условно делят на два типа. Прокаспазы 1, 2, 4, 5, 8, 9 и 10 имеют длинный продомен, тогда как прокаспазы 3, 6, 7, 11 и 13 характеризуются коротким продоменом. В длинном продомене функционирование идентифицированы которых осуществляется два путем разных модуля, белок-белкового взаимодействия. Первый модуль называется «эффекторным доменом смерти» (DED, death effector domain) и имеется у прокаспаз 8 и 10. Второй модуль называется «доменом мобилизации каспаз» (caspase recruitment 17 domain) и входит в состав прокаспаз 1, 2, 4, 9 [9; 54; 55]. Непосредственное участие в реализации апоптоза индуцированном лигандами FasL, TRAIL, TNF-α или цитотоксическим фактором гранзимом B принимают участие каспазы 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10 [86; 147]. В зависимости от функций каспазы разделяют на два типа: инициаторные (каспазы -2, -8, -9, -10) и эффекторные (каспазы -3, -6, -7). Активация инициаторных каспаз происходит путем аутопротеолиза прокаспазных последних сигнальных молекул после мультимерных олигомеризации белковых комплексов. в Для составе активации эффекторных каспаз необходимо действие инициаторных каспаз – такой процесс последовательной (и необратимой) активации этих эндопептидаз называют каспазным каскадом [54]. Насчитывается 14 видов каспаз, пронумерованных в порядке их открытия [88]. Из них в человеческом организме экспрессируются каспазы 1-10, 12 и 14, причѐм каспаза 12 в большинстве человеческих популяций экспрессируется в нефункциональной укороченной форме [82; 114; 177]. Остальные каспазы выполняют иные функции, не связанные с запуском клеточной смерти: каспазы 1, 4 и 5 принимают участие в активации противовоспалительных цитокинов [147], прокаспаза 14 активируется при созревании кератиноцитов эпидермиса [ 87; 135]. Каждая субгруппа рецепторов смерти внешнего апоптоза имеет свои собственные специфические сигнальные пути и образует свой супрамолекулярный комплекс [65; 85; 151; 178]. Например, TNFR1 рецептор требует TNFR1- ассоциированного DD (ЕКФВВ) для рекрутирования FADD и каспазы - 8, тогда как FAS и TRAILR1/2 его не используют. Клетки различаются по механизму исполнения внешнего апоптоза. Их разделяют на два типа. В первом типе клеток, представителем которого являются лимфоциты, протеолитическое исполнительной активная созревание фазы каспаза-8 каспазы – каспаза-зависимого 18 напрямую 3 катализирует посредством апоптоза, триггера независимым от митохондрий образом [65; 178; 181]. Во втором типе клеток (гепатоциты, панкретические бета клетки) каспаза – 8 требует агониста протеолитического кливанжа ВН3-взаимодействующего домена смерти (BID), приводящее к образованию пермобелизирующего митохондрии домена (МОМР), известного как усеченный BID (tBID) [65; 133; 140; 178; 200]. Первый тип клеток подвергается внешнему апоптозу независимо от содействия с митохондриями. tBID и МОМР могут появиться в этих клетках, но они не обязательны для выполнения внешнего апоптоза. Второй тип клеток погибает от активации рецепторов смерти вызывая сигналы МОМР, индуцируя рассевание митохондриального трансмембранного потенциала и освобождая токсические белки, которые в нормальном состоянии остаются в митохондриальном пространстве. Среди них дериваты цитохрома С, которые совместно с цитоплазматическими адаптерными белками APAF1 и dATP собирают апоптоcому, т.е. другой активирующий каспазу мультипротеиновый комплекс [107; 134]. Механизм передачи сигнала смерти «зависимыми рецепторами» еще до конца не изучен. Имеется еще несколько других трансмембранных белков, которые при определенных обстоятельствах могут передавать летальный сигнал в ответ на связывание со своим рецептором. К ним относят CD2, CD4, TNFRSF8/CD30, TNFRSF5/CD40, CD45, CXCR4, а также молекулы главного комплекса гистосовместимости I и II класса. Эти белки имеют двойную функцию и в зависимости от обстоятельств и триггерного сигнала могут или индуцировать апоптоз, или угнетать его. Принципиальное отличие Fas-опосредуемого пути апоптоза от митохондриального заключается в том, что он является Ca2+ - независимым [198] и обходит регулирование со стороны белков Bcl-2 [45; 159]. Номенклатурный комитет по клеточной гибели в 2012 году дал следующее определение внешнего апоптоза. Внешний апоптоз является каспаза-зависимой клеточной смертью. Он может угнетаться химическими 19 или вирусными ингибиторами каспаз. Внешний апоптоз проходит по трем большим сигнальным каскадам: 1) Сигнал через рецептор смерти и активация каспазы-8 или -10-> каспаза-3; 2) Сигнал через рецептор смерти и активация каспазы-8 -> tBID -> МОМР -> каспаза-9 -> каспаза-3; 3) Активация «зависимого» рецептора дефицитом лиганда или нетрином – 1 -> прямая или МОМР-зависимая активация каспазы-9 -> каспаза-3 [97]. Внутренний апоптоз Апоптотическая смерть клетки может быть вызвана внутриклеточным стрессорным состоянием. Апоптоз индуцируют повреждение ДНК, оксидативный стресс, повышение внутриклеточного Са2+, накопление несобранных белков в эндоплазматическом ретикулеме и т.д.. Внутренний апоптоз является результатом биоэнергической и метаболической катастрофы. Выявлено много сигнальных каскадов, вызывающих внутренний апоптоз, точно также существует большая гетерогенность стимулов апоптоза. Их всех объединяет центральный митохондриальный контроль [125]. Часто с прохождением про-апоптотического сигнала возбуждается анти-апоптотический сигнал, пытающийся спасти клетку от стресса. Оба сигнала, как про-, так и анти-апоптотические, сходятся на митохондриальной мембране. Когда летальный стимул побеждает, происходит пермобилизация наружной митохондриальной мембраны (МОМР). МОМР может стартовать вне митохондриальной мембраны благодаря порообразующей активности проапоптотических членов семейства белков BCL-2, таких как ВАК И ВАХ, или в результате феномена, который называется митохондриальный пермобилизующий переход (МРТ). Последний происходит из внутренней митохондриальной мембраны и должен открывать мультипротеиновый комплекс пермобилизующих пор (РТРС). Появление МОМР приводит к рассеиванию митохондриального трансмембранного потенциала, остановке синтеза митохондриальной АТР и транспортной активности, зависимой от биопотенциала. Выключение дыхательных цепей приводит к гипегенерации 20 реактивного кислорода (ROS) и выхода в цитозоль белков, которые в норме ограничены митохондриальным мембранным пространством. Внутренний апоптоз делится на каспаза-зависимый и каспаза- независимый. Известны три пути индукции каспаза-зависимого внутреннего апоптоза. Первый путь связан с цитохромом С (белок с молекулярной массой 15 кДа). В результате повышения МОМР (повышение проницаемости наружной мембраны митохондрий), растворимые белки, которые находятся в межмембранном пространстве митохондрий, поступают в цитозоль, где взаимодействуют с содержащимися в нем белками. Цитохром С выходит из митохондрий связывается с цитоплазматическим адаптерым белком APAF1 (молекулярная масса 130 кДа). APAF1 содержит CARD-домен (домен активации и рекруции каспаз), при этом молекула фактора меняет конформацию, в результате чего с ней связывается молекула дATФ (дезоксиаденозинтрифосфат). Дальнейшее конформационное изменение APAF-1 приводит к активации домена олигомеризации и открывает доступ CARD-домена APAF-1 для прокаспазы-9, которая также содержит CARDдомен. Образуется комплекс, содержащий семь молекул APAF-1 и называемый апоптосомой [31; 61; 202]. Посредством протеолиза прокаспазы 9 происходит образование активированной каспазы 9. Зрелая каспаза 9 расщепляет и активирует каспазу 3. Каспаза 3 является эффекторной цистеиновой протеиназой. Она активирует другие эффекторные каспазы (например, каспазу -6 и -7), вызывает протеолиз различных субстратов, инициирует фрагментацию ДНК путем активации ДНКаз, что ведет к необратимому распаду ДНК на нуклеосомные фрагменты, кратные 180 нуклеотидным парам, данный феномен получил название апоптотической лестницы [20; 31]. Цистеиновые протеиназы инактивируют белки, защищающие клетки от апоптоза (например Bcl-2), нарушают работу полимеразных, киназных и других ферментативных систем, расщепляют структурные белки такие как ламинин, плектин, актин, фодрин и виментин, уничтожают сигнальные системы клетки [160; 168; 186]. 21 Второй путь каспаза-зависимого внутреннего апоптоза. Второй путь вызывает митохондриальный активатор каспаз (описанный в литературе как SMAC или DIABLO). Он действует на белки семейства ингибиторов апоптоза, которые активируют каспазу 9 и каспазу 3. Каспаза-8 активировалась в результате апоптоза с участием рецепторов клеточной гибели, расщепляет белок Bid (содержащий только ВН3 домен). При этом белок активируется. Активированный белок, в свою очередь, активирует Bax и Baк, что приводит к увеличению МОМР и к выходу цитохрома с. В результате апоптоз еще больше усиливается за счет активации апоптосомы и каспазы-9. Белки Smac и OMI, которые также выходят из митохондрий, снимают блокировку активации эффекторной каспазы, вызванную IAP (апоптоз-ингибирующие белки). Все IAP-протеины на N-конце содержат от 1 до 3 специфических повторов (примерно по 70 аминокислотных остатков в каждом), которые ответственны за ингибирующую функцию [45; 66; 84]. У человека идентифицировано 6 видов белков IAP-семейства: NAIP, cIAP-1, cIAP-2, XIAP, Survivin и BRUCE. Белки XIAP, cIAP-1 и cIAP-2 ингибируют ключевые каспазы -3, -7, -9 путем связывания тех участков, с которыми взаимодействуют и активаторы фермента. Белок NAIP ингибирует каспазы 1, -3, -6, -7, -8 [45; 84; 110; 173]. Третий путь индуцируется сериновой протеазой HTRA 2, которая активизирует каспазу 3. Ключевой эффекторной каспазой является каспаза-3, активация которой запускает ядерную деградацию, после чего развитие апоптоза становится необратимым. Сериновые протеазы - это ферменты, способные разрезать белки рассечением пептидных связей, которые отличаются от других протеаз наличием в своём активном центре аминокислоты серина. Сериновая протеаза HtrA2/Omi участвует в регуляции апоптоза [190]. При создании проапоптических условий в клетке, например при цитотоксической терапии, сериновая протеаза HtrA2 связывается с белками WT1 и расщепляет его на несколько фрагментов. 22 Роль Omi/HtrA2 в гибели клеток была обнаружена недавно, когда выяснилось, что этот белок, в норме находящийся в межмебранном пространстве митохондрий, при апоптозе выходит в цитозоль (наряду с другими митохондриальными проапоптозными факторами). Здесь Omi/HtrA2 связывается с белками - ингибиторами апоптоза (inhibitor of apoptosis proteins - IAPs) и инактивирует их, высвобождая секвестрированные IAPs каспазы, которые активируются и поддерживают дальнейшее развитие апоптоза [190]. Регуляторы апоптоза. Процесс высвобождения апоптогенов из митохондрии регулируют представители Bcl-2 белков, для которых характерно присутствие одного специфического ВН (Bcl-2 homology)домена. Исходя из функциональных и структурных особенностей указанных белков, выделяют три подгруппы [115]: 1) входят белки Bcl-2 , Bcl-хL , Bclw, Al и Mcl-1, содержащие четыре ВН-домена (ВН1, ВН2, ВН3, ВН4) и обладают антиапоптотическими свойствами. Эти белки содержат трансмембранный участок, который позволяет им встраиваться во внешнюю мембрану митохондрии; 2) белки Bax, Bak, Bad, Bok отличает не только отсутствие ВН4-домена, но и их проапоптотическая активность; 3) проапоптотические белки Bik, Bid, Bim, Bmf, HRK, Noxa, PUMA. Они содержат лишь один ВН3-домен, с помощью которого взаимодействуют с другими белками семейства Bcl-2. Эти молекулы чаще всего локализованы в цитоплазме, откуда в ответ на действие индукторов апоптоза они могут перемещаться к митохондрии. Интересно, что различные индукторы апоптоза избирательно активируют те или иные белки семейства Bcl-2. Например, Bim необходим для апоптоза, вызываемого дефицитом факторов роста, тогда как при гибели клеток вследствие необратимых повреждений ДНК задействован белок PUMA [54]; Bax формирует димеры bax – bax, которые усиливают действие активаторов апоптоза. Отношение bcl-2 и bax определяет чувствительность клеток к апоптотическим факторам и является «молекулярным переключателем», который 23 определяет, будет ли происходить рост или атрофия ткани [20]; регуляторный белок Bid расщепляет катепсин В, в результате образуется активный белок tBid, который индуцирует перестройку крист [14]. Сущуствует еще несколько механизмов, приводящих к апоптозу через ингибирование Bcl-2. Например, возможна регуляция через онкосупрессорбелок р53, замедляющий пролиферативную активность в нормальных клетках [31; 71]. При повреждении ДНК под действием ультрафиолетового или ионизирующего излучения происходит активация экспрессии гена р53. Белок р53 задерживает клетку в фазе G1/S клеточного цикла (через репрессию генов, регулирующих транскрипцию), чтобы дать время для работы репаративных систем. На уровне транскрипции фактор р53 регулирует экспрессию генов, участвующих в блокаде клеточного цикла – р21 (ингибитор циклин-зависимых киназ) и взаимодействует либо с комплексами, определяющими синтез и репарацию ДНК, либо с белками, модулирующими апоптоз (например, Bax). Если повреждения ликвидировать не удается, то р53 запускает апоптоз через инактивирование Bcl-2 при связывании с белком Bax. Известно, что гипоксия или митогенные онкогены активируют р53, переводя клетку на апоптотический путь. Каспаза - независимый апоптоз регулируется тремя путями. Апоптоз индуцирующий фактор AIF (англ. Apoptosis Inducing Factor – «фактор индуцирующий апоптоз», флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа), эдонуклеаза G и CAD (англ. Caspase Activated DNAse). Эти белки высвобождаются из митохондрий в поздних стадиях, когда клетка уже на пути к гибели. Белок AIF и эндонуклеза G, проникая через ядерную мембрану, индуцируют разрезание ДНК на фрагменты размером 180-200 пар нуклеотидов и конденсацию периферических участков хроматина. Такая ранняя конденсация в ядре получила название конденсации первого уровня. Белок CAD расщепляется каспазой-3, проникает в ядро и вызывает выраженную конденсацию хроматина. Эти более поздние и более ярко выраженные изменения в ядре называют конденсацией второго уровня. 24 Распад клетки на везикулы, переход фосфатидилсерина (химическая формула: 1,2-diacyl-sn-glycerol-(3)-L-phosphoserine - компонент внутреннего слоя клеточных мембран) из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный монослой [31; 91; 93], уменьшение объема клетки, сморщивание цитоплазматической мембраны, конденсация ядра (апоптозные тельца), фагоцитирующиеся макрофагами и клетками-соседями. Третий путь - сериновая протеаза HTRA2 также содействует каспаза-независимому апоптозу путем кливинга белков цитоскелета, внутренней и наружной митохондриальной мембран, комплекса пермебилизированных пор (РТРС) [190]. 1.1.2. Аутофагическая клеточная смерть Термин аутофагия ввел в 1963 г. лауреат Нобелевской премии Христиан де Дюв [10]. Аутофагия (аutophagy - от греческих слов: "auto", означающими само- и "phagein" означающее «поглощать») консервативным биологическим является эволюционно механизмом самостоятельного пищеварения в лизосомах, с помощью которого клетки перерабатывают долгоживущие белки, собственные компоненты, поврежденные органеллы [49; 96; 141; 184] Термин «Аутофагическая клеточная смерть» был введен на основании морфологических признаков и широко используется для определения примеров клеточной смерти, которые сопровождались массивной цитоплазматической вакуолизацией [96]. Аутофагическая клеточная смерть происходит в ответ на стресс или в течение развития. Аутофагия может быть индуцирована, ионизирующей радиацией, активными формами кислорода, некоторыми противоопухолевыми препаратами, прекращением действия факторов роста и особенно снижением содержания аминокислот и АТФ в цитозоле [10; 108; 118; 132]. В 3-х последних случаях аутофагия запускается как компенсаторный механизм, поставляющий питание клетке из эндогенных источников, тогда как в других ситуациях ее биологическая роль связана с 25 удалением поврежденных структур клетки. Интересно отметить, что цитокины, активирующие фагоцитоз (TNFальфа и IF гамма), также способны вызывать аутофагию [131; 132]. Парадокс явления аутофагии заключается в том, что она может выступать как программа выживания клетки. Показано, что если вслед за активацией апоптоза будет запущен процесс аутофагии, то происходит отмена программируемой гибели [20]. Существуют три различных типа аутофагии, которые различаются в способе доставки органелл к лизосомам. Первый тип - это макроаутофагия (macroautophagy), в котором элементы цитоплазмы и целые органеллы поглощаются так называемыми аутофагосомами (autophagosomes), имеющими двойную мембранную структуру, или первичными аутофаговыми вакуолями (AV-I). После слияния с лизосомами, аутофагосомы формируют одномембранную структуру, называемую аутолизосомой (autolysosome) или поздними аутофаговыми вакуолями (AV-II), содержимое которых деградируется и получившиеся элементы возвращаются в цитоплазму для метаболических реакций. Основным из ключевых регуляторов аутофагии в клетках является киназа белка-мишени рапамицина млекопитающих mTOR (его дрожжевой аналог называется TOR), подавляющая аутофагию в условиях достаточного поступления питательных веществ и факторов роста. Преобразователи сигналов, в том числе фосфотидилинозитол-3-киназы (PI3K) и Akt, обеспечивают взаимосвязь между рецепторами к тирозинкиназам и активацией mTOR, подавляя тем самым аутофагию в ответ на поступление факторов роста [62; 129; 139]. Активация mTOR в составе комплекса 1 (mTORC1) – и последующее подавление аутофагии – также может быть опосредовано митоген-активируемыми протеинкиназами (MAPK); в том числе киназами, регулируемыми внеклеточными сигналами (ERK) [142]. К другим важным регуляторам аутофагии относятся: АМФ-активируемая протеинкиназа (АМФК), ингибирующая mTOR при снижении уровня АТФ [169]; фактор инициации трансляции эукариот 2-альфа (eIF2α), реагирующий 26 на недостаточное поступление питательных веществ [183], ERN1 (дрожжевой ортолог которого известен как IRE1) – ассоциированный с эндоплазматическим ретикулумом (ЭР) белок, одновременно обладающий активностью киназы и эндорибонуклеазы и играющий важную роль в изменении экспрессии генов при стрессовых воздействиях на ЭР [111; 112; 144]; а также c-Jun-N-терминальная киназа, вовлеченная во множество сигнальных каскадов, активирующихся в условиях стресса [199]. Важный модулятор аутофагии Beclin 1 из ингибирующих комплексов с Bcl-2 или Bcl-XL [145; 194]; сиртуин 1, реагирующий на высокие уровни НАД+, фактически выступая при этом в качестве сенсора доступности питательных веществ [154]; белок-супрессор опухолей р53, присутствие которого в цитоплазме ингибирует аутофагию [185]; комплекс I-каппа-бикиназы (IκB киназы или IKK), также необходимый для активации NF-κB в условиях стресса [77; 78]; а также рецептор к инозитол-1,4,5-трифосфату (IP3R) на уровне ЭР [76; 194]. И, наконец, положительную регуляцию аутофагии обеспечивает активность факторов транскрипции, проявляемая E2F1 [170], NF-κB [74; 75], p53 [105; 195]. В пиковые события молекулярного механизма аутофагии вовлечены ULK1 и ULK2 (ортологи Atg1 млекопитающих), а также Beclin 1 (человеческий ортолог Atg6). Beclin 1 функционирует как аллостерический фосфатидилинозитол-3-киназы формирование/удлинение активатор (PI3K) фагофора фосфатидилинозитол-3-фосфата), класса с а hVps34 III помощью также [117] – (стимулирующей своего является продукта компонентом высокодинамичного мультибелкового комплекса, в состав которого могут входить различные стимуляторы (например, UVRAG, Bif-1/эндофилин B1, Ambra 1) и/или ингибиторы (например, Bcl-2) аутофагии [146; 165; 166; 203]. Подавление mTOR активности способствует ферментативной активации мультипротеинового комплекса, который формируется из III phosphatidylinositol 3-киназы (PI3K), белка вакуолярной сортировки 34 (Vps34), Beclin 1, белка вакуолярной сортировки 15 (Vps15), белка 27 резистентности к УФ-излучению (UVRAG), endophilin B1 (Bif-1), молекулы активации Beclin-1-зависимой аутофагии (Ambra 1) и, возможно, другие белки. Этот комплекс негативно регулируется белками Bcl-2 / XL. Vps34 производит фосфатидилинозитол - 3-фосфат [PtdIns (3) P], молекулярный сигнал для сборки аутофаговых комплексов формирующим удлинение и закрытие везикул. Процесс макроаутофагии можно заингибировать по пути insulin/IGF-1, где PI3K продуцируют phosphatidylinositol - 3,4,5-trisphosphate [PtdIns (3,4,5) P 3], которые стимулируют функцию mTOR [49; 95;128]. Следующий, второй тип аутофагии - микроаутофагия, при котором поглощение органелл производится непосредственно в лизосомные мембраны. Этот механизм также является путём деградации органелл и долгоживущих белков, но, в отличие от макроаутофагии, он не отвечает за адаптацию к недостатку питательных веществ. Одной из конкретных форм микроаутофагии является весьма избирательная деградация пероксисом (micropexophagy), описанная в дрожжах, как механизм адаптации к оксидативному стрессу [49]. Третий тип шаперон-опосредованная аутофагия. Этот путь также чувствителен к недостатку питательных веществ, в нём не происходит тотального поглощения органелл или избирательного распознавания субстрата. В данном типе аутофагии белки цитоплазмы, которые содержат конкретные пентапептидные мотивы, распознаваемые лизосомами (консенсус последовательность KFERQ), распознаются комплексом белковшаперонов (в том числе теплового шока 73 кДа-белок, hsc73) и направляются к лизосомной мембране, где они взаимодействуют с белками, связанными с мембраной лизосом (LAMP)2a. Субстратные белки затем разворачиваются и транспортируются в люмен лизосом для деградации. Мотив KFERQ находится примерно в 30% белков цитоплазмы, включающих в том числе RNase А и амилоидные белки предшественники (APP). Интересно, что АРР могут быть связаны hsc73, когда основной путь их деградации заингибирован и данное взаимодействие происходит 28 не через APP KFFEQ последовательности. Пока еще не ясно как KFERQ мотив распознается шапероновым комплексом. Некоторые пост-трансляционные изменения субстратов (например, окисление или денатурация) могут сделать этот мотив более доступными для шаперонов, повышая уровень их лизосомного поглощения [49; 120]. Эукариотические клетки часто подвергаются аутофагии, механизмом, посредством которого органеллы и часть цитоплазмы образуют пузырьки с двойной мембраной (аутофагосомы). Формирование аутофагосомы начинается с образования и удлинения так называемого фагофора – фрагмента изолирующей мембраны, отделяющегося от эндоплазматического ретикулума. Края фагофора смыкаются с которая впоследствии сливается с образованием лизосомой с аутофагосомы, формированием ауто(фаго)лизосомы. В конечном итоге содержимое просвета, а также внутренняя мембрана ауто(фаго)лизосомы (в комплексе называемые «аутофагическое тельце») расщепляются лизосомальными гидролазами. Конечные продукты высвобождаются в цитоплазму, где они могут повторно вступить в реакции анаболического и/или биоэнергетического метаболизма [111; 127; 130; 152; 155]. Необходимым компонентом аутолизосом являются белки LC3А и LC3В (microtubule-associated protein 1 light chain 3A или В) – гомологи белка дрожжей, ассоциированного с аутофагией (Atg 8). Второй белок также необходим для формирования аутолизосом – это белок Beclin -1 аналог белка Atg 6 дрожжей [103; 108; 150]. Молекулярный механизм аутофагии сложен и включает в себя две автономно работающие системы коньюгации, осуществляющие формирование аутофагосомы. Первая система включает в себя белки Atg 5, 7, 10 и 12, которые выступают в качестве «метки» для материала, подвергающегося удалению. После стадии распознавания материала к белкам присоединяется комплекс Atg 5–12, а затем на нем происходит мультимеризация Atg16. Образовавшийся 29 комплекс необходим для мембранной секвестрации подлежащих удалению органеллы с образованием аутофагосомы [150]. Вторая коньюгирующая система аутофагии представлена белками Atg 3 и Atg 4, которые выполняют функцию протеинов убиквитинзависимого пути деградации белков. За этим следует активация фермента Autophagin-1, который активирует белок Atg 8 (аналогами у человека является MAP1-LC-3), закрепляя его на мембране аутофагосомы за счет образования фосфолипидного «якоря» [131; 150]. Белок Autophagin-1 ассоциирован с системой микротрубочек цитоскелета, благодаря чему происходят движение и расширение аутофагосомы для последующего слияния с лизосомой [103; 132]. Белки влияют на разные фазы процесса аутофагии. Например, mTOR (target of rapamycin) является основным элементом регуляции (ингибитором) стадии инициации аутофагии [132; 150], LAMP-2 отвечает за процесс слияния аутофагосомы с лизосомой [150], Beclin-1 регулирует процесс мембранной секвестрации подлежащих удалению органелл [103; 108; 150], ингибитор митохондриального этапа апоптоза Bcl-2 также способен ингибировать и аутофагию – это указывает на важную роль митохондрий в обоих процессах [130; 165; 166]. Аутофагическая гибель отличается следующими признаками: 1) частичная конденсация хроматина; 2) иногда пикноз ядра; 3) отсутствие фрагментации ядра и клетки на поздних стадиях гибели; 4) отсутствие деградации ДНК до нуклеосомного уровня; 5) увеличение числа аутофагосом и аутофаголизосом; 6) увеличение лизосомной активности; 7) увеличение протяженности аппарата Гольджи и иногда расширение цистерн эндоплазматического ретикулума; 8) длительная сохранность микротрубочек и промежуточных филаментов; 9) иногда возрастание проницаемости митохондрий; 10) отсутствие активации каспаз. В конечном итоге остается клеточный дебрис – остаток клетки, окруженный плазматической мембраной, который фагоцитируется макрофагами [49]. Эти признаки отличают аутофагию от апоптоза. Завершаться аутофагия может различно. В одних случаях на финальных этапах проходит по механизму апоптоза [127; 136; 137], в других 30 случаях этот процесс заканчивается как некроз. Некоторые авторы выделяют самостоятельный финал аутофагии, не сводимый к некрозу и апоптозу, чаще в виде фагоцитоза [136; 137]. Парадокс явления аутофагии заключается также в том, что она может выступать не только как вариант реализации танатогенного сигнала, но и, наоборот, как программа выживания клетки. Индуцированная стрессом аутофагия имеет более часто цитопротективные функции и способствует установлению гомеостаза и выживания. Фармакологическая или генетическая ингибиция аутофагии усиливает смерть. Аутофагия характерна для некоторых раковых клеток, особенно если они утратили апоптотические модуляторы, такие как BAX и BAK или каспазы [20; 46; 92; 180]. Она появляется в ответ на воздействие некоторых химиотерапевтических агентов in vitro [104; 129]. Аутофагия используется опухолевой клеткой как механизм выживания в стрессовых ситуациях, которыми являются анемия и гипоксия при несостоятельности кровоснабжения опухолевого узла или его участков, а также лучевая терапия и действие противоопухолевых препаратов, индуцирующих апоптоз [108; 132]. Однако активация аутофагии может быть причиной лекарственной устойчивости и ускорения роста опухоли. При этом следует отметить, что блокада процесса аутофагии в апоптоз-дефицитных опухолях приводит к массовой гибели клеток путем некроза [81]. Поэтому такой на первый взгляд положительный эффект, как выяснилось, усиливает опухолевую прогрессию из-за развития воспалительной реакции, индуцированной некрозом. Таким образом, модуляция опухолевого роста с помощью влияния на аутофагию представляет собой весьма тонкий подход, реализации которого еще требует уточнения сложных взаимоотношений между факторами, регулирующими как саму аутофагию, так и ее исход в опухолях [32]. Аутофагия способствует поддержанию высоких уровней АТФ внутри клетки [172; 122; 185], повышает способность клеток противостоять метаболическому стрессу (гипоксия в комбинации с дефицитом питательных веществ) [118; 185]. Аутофагия играет существенную роль 31 в процессах эмбриогенеза и постэмбрионального метаморфоза [10; 131]. Показано, что нарушения регуляции этого процесса имеют место при большом числе патологических состояний – миодистрофиях и кардиомиопатиях [150; 161], нейродегенеративных заболеваниях (хорее Геттингтона, болезнях Альцгеймера и Паркинсона) [132], инфекциях (механизм аутофагии вовлекается во внутриклеточное разрушение сальмонелл, стрептококков, шигелл, микобактерий туберкулеза) [132; 150] и злокачественных опухолях [32]. Отвечающие за аутофагию, гены Atg были идентифицированы у дрожжей. Сигнальные пути, которые управляются их производными сходны у круглых червей, дрозофил, млекопитающих. Зная, какие гены отвечают за аутофагию ученые могут избирательно «выключать» их у модельных организмов чтобы, например, исследовать влияние отсутствия таких генов на длительность жизни у генетически модифицированных организмов. Было показано, что «выключение» отвечающих за аутофагию генов atg-7 и atg-12 c помощью интерферирующих РНК уменьшало продолжительность жизни C.elegans [109]. А ингибирование фактора TOR который в свою очередь ингибирует аутофагию приводит к активации макроаутофагии и к увеличению продолжительности жизни подопытных животных. Гены, кодирующие белки отвечающие за аутофагию высоко консервативны, так что изучение регуляции аутофагии на таких модельных системах как D. Melanogaster, S. cerevisiae, C. elegans может дать ключ к пониманию процессов регуляции аутофагии у высших млекопитающих. Сегодня аутофагия является предметом исследования генетиков, молекулярных биологов, нейробиологов [49; 122]. На номенклатурном комитете по клеточной смерти в 2012 г. решили, что к аутофагической клеточной смерти будут относиться все случаи смерти, которые показывают маркеры аутофагии, такие как липидация легкой цепи 3 микротубуляр-ассоциированного белка 1 (известного как LC3/Atg8) или повышение деградации субстратов подобных сквестосоме 1 (SQSTM1) [97]. 32 1.1.3. Некроз Длительное время некроз рассматривали лишь как вариант неспецифической гибели клетки. Фактической причиной гибели при некрозе считают резкое падение содержания АТФ в клетках до такого уровня, который не совместим с жизнью [90; 94]. Наиболее принципиальным достижением в изучении программируемой гибели клетки явилось установление программируемого характера биохимических изменений, приводящих к некрозу [43; 137; 162; 171]. В связи с этим, в современной классификации программированной смерти клетки (ПСК) апоптоз получил название «ПСК I типа», аутофагия «ПСК II типа», а некроз «ПСК III типа». Установлено, что некроз может происходить не только как итог апоптоза в ситуации энергодефицита клетки, что было известно довольно давно [94], но и как самостоятельная танатогенная программа, ключевую роль в которой играют белок PARP, индукторы митохондриального окислительного стресса, протеаза omi, а также некоторые каспазы и ряд других ферментов [43; 68; 137; 162; 171]. Долгое время некроз рассматривался только как механизм клеточной смерти в отсутствии морфологических признаков апоптоза [98; 99; 126]. Однако теперь стало ясно, что некроз появляется регулируемым образом и некротическая клеточная смерть играет заметную роль при многих физиологических и патологических состояниях. Некроз участвует в патогенезе заболеваний, в том числе ишемического повреждения, нейродегенерации и вирусной инфекции, таким образом представляя привлекательной мишенью для избежания необоснованной гибели клеток [192]. Ругулируемый некроз появляется в результате цепи событий. В результате связывания опухоле-некротического фактора альфа (TNF-альфа) и цитоплазматического хвоста опухоле-некротического рецептора первого типа (TNFR1) прототипа рецептора смерти, происходит тримеризация TNFRассоциированного домена смерти (TRADD), рецептор связывающего белка 33 киназа 1 (RIP1), клеточных ингибиторов апоптоза 1 (cIAP1) и cIAP2, TNFRассоциированных факторов 2 (TRAF2) и TRAF5. В результате образуется мультибелковый комплекс. Затем RIP1 совместно с cIAP1 и cIAP2 готовит места для рекрутирования киназы 1 трансформирующего рост фактора бета (ТАК1), ТАК1-связывающих белков 1 (ТАВ2) и ТАВ3. ТАВ2 и ТАВ3 вместе обеспечивают выживающий сигнал путем активациитранскрипционного фактора NF-kB. В некоторых патофизиологических и экспериментальных ситуациях, или в результате отсутствия каспазы 8, RIP1 переходит в физическое и функциональное взаимодействие с ее гомологом RIP3 окончательно активируя выполнение некротической смерти. Регулируемый некроз также может быть индуцирован алкилирующим повреждением ДНК [111, 204]. Возможно, это происходит в результате повышения активности poly(ADP-ribosa) полимеразы 1. Этот процесс также реализуется через RIP3 [99; 193]. Морфологическими признаками некроза является набухание клеток и их мембранных вакуолизация органелл, неспецифическая цитоплазмы, нарушение компактизация целостности хроматина, плазматической мембраны и выход содержимого клеток во внеклеточное пространство. В итоге в многоклеточном организме в области некроза развивается воспалительная реакция [49]. Индуцировать программу некроза можно, если активировать программу апоптоза связыванием таких лигандов как Fas, TRAIL или вызывая гиперэкспрессию проапоптотического белка Bax, и в тоже время либо ингибируя активность каспаз, либо вызывая гиперэкспрессию антиапоптотических белков. Программированный некроз в свою очередь может быть подавлен, если на клетки воздействовать антиоксидантами либо подавить активность протеинкиназы RIP [113]. Интересно, что протеинкиназа RIP является одной из мишеней действия каспаз. Это означает, что инициация и осуществление апоптоза активно подавляют развитие некроза в клетках. Физиологическое 34 значение такого противоборства между апоптозом и программированным некрозом проявляется на двух системах. На клетках, инфицированных вирусом vaccinia virus, программированный некроз может быть не только вариантом гибели в условиях подавления апоптоза, но и выполнять функцию усиления иммунных реакций в ответ на инфицирование микроорганизмами. Отрицательная связь между апоптозом и программированным некрозом прослеживается и при повреждении ДНК, вызванном химическими агентами или ионизирующим излучением. В неопухолевых клетках в этих случаях включаются пункты проверки, действующие во всех фазах интерфазы клеточного цикла и предотвращающие вступление в митоз клеток с нарушенным геномом [49; 163;174]. В случае нарушения механизмов репарации клетки погибают путем апоптоза. Однако, как оказалось, если в таких клетках с поврежденной ДНК нарушены механизмы осуществления апоптоза, что является достаточно распространенным в трансформированных клетках, клетки погибают путем программированного некроза. Физиологическое значение некроза в такой ситуации имеет двоякий смысл. С одной стороны программированная гибель клеток путем некроза в отсутствие апоптоза все же снижает риск передачи дочерним клеткам мутаций [49; 90]. С другой стороны, распад клеток при некрозе может способствовать активации иммунного ответа многоклеточного организма [49]. Если проанализировать, в каких фазах клеточного цикла возможен тот или иной вариант гибели клеток, то складывается следующая картина. В отличие от апоптоза, который может запускаться в разных фазах клеточного цикла, в том числе и собственно в митозе в форме митотической катастрофы, аутофагическая гибель развивается преимущественно в непролиферирующих клетках (G0-фаза и терминальная дифференцировка). Однако, если в пролиферирующих клетках подавлены механизмы апоптоза, например, инактивированы каспазы, то гибель пролиферирующих осуществляется по механизму программированного некроз [49]. 35 клеток 1.1.4. Нетоз В ответ на некоторые стимулы нейтрофилы и эозинофилы могут высвобождать, так называемые, нейтрофильные внеклеточные ловушки (neutrophil extracellular traps, NETs). Это микробисидальные структуры состоящие из ядерного хроматина, гистонов и гранулярных антимикробных белков [201]. При воздействии физиологическими факторами, такими как ГМ-КСФ или С5 фрагмент комплемента, NET освобождается живыми клетками. Однако при нефизиологическом агенте NET высвобождает нейтрофилы, погибающие нетозом. Нетозные клетки демонстрируют массивную вакуолизацию цитоплазмы, быструю деконденсацию хроматина и поломку ядерной и нейтрофильной мембран, которые требуются для формирования NET. Нетоз не чувствителен к ингибиторам каспаз и некростатину 1, т.е. он существует отдельно от апоптоза и некроза. Нетоз зависит от образования супероксида. Нетоз имеет общие биохимические признаки с аутофагией и регулируемым некрозом [98]. 1.1.5. Корнификация Эпидермальные кератиноциты терминальной дифференцировки претерпевают уникальную форму и запрограммированной гибели клеток [89]. Клетки базального слоя эпидермиса в результате повреждающего действия подвергаются апоптозу или некрозу. Клетки внешнего слоя эпидермиса постоянно подвергаются физиологической клеточной смерти, названной «корнификацией». Слой погибших кератиноцитов состоит из смеси специфических белков, таких как кератин, лорикрин, инволюкрин и липидов (жирных кислот и церамидов), которые обеспечивают структурную стабильность кожи, механическую резистентность, эластичность и гидрофобность [89; 98]. Ороговение часто рассматривается как программа терминальной дифференцировки, анологичной той, которая существует в некоторых других тканях (зрелые эритроциты, хрусталиковые волокна) [20]. 36 Кератинизация на молекулярном уровне происходит в результате действия механизма дифференцировки эпителиальных клеток, в ходе которой кератиноциты экспрессируют все ферменты и субстраты, такие как неапоптотическая каспаза 14 и трансглутаминазы -1, -3, -5 катализирующие реакции ковалентной сшивки (при этом не происходит активации каспазных каскадов), необходимые для построения эпидермального барьера, позволяющего изолировать организм от окружающей среды. Эффект достигается: 1) путем синтеза высвобождающихся во внеклеточное пространство специфических липидов, где они ковалентно связываются с белками ороговевшей оболочки и ограничивают проницаемость барьера; 2) путем синтеза протеаз необходимых для десквамации роговых пластов; 3) путем перекрестного связывания трансглутаминазами 1, 3 и 5 типов несколько субстратов, таких как кератин, инволюкрин, лорикрин, SPR и S100 [20; 82]. Морфологическими признаками кератинизации является высвобождение липидов из ламеллярных (пластинчатых) телец во внеклеточное пространство и десквамация корнеоцитов путем активации протеаз, накопление лорикрина и филогрина в L- и F-кератогиалиновых гранулах, элиминация органелл. Биологическими критериями принято считать перекрестное связывание вышеуказанных белков и их субстратов и усиление экспрессии трансглутаминаз и их субстратов. [20]. Корнификация определяется как вариант клеточной смерти, который : 1) ограничен кератиноцитами; 2) функционально связан с образованием рогового эпителия; 3) может быть изменен, но не блокирован, ингибицией каспазы-14 [97]. 1.1.6. Митотическая катастрофа Впервые этот тип смерти был описан у дрожжей с мутацией, обусловливающей повышенную чувствительность клеток к изменению температуры [176]. Основанием для выделения митотической катастрофы в 37 отдельный тип смерти клеток послужили данные экспериментов по определению клоногенности облученных опухолевых клеток с блокированным апоптозом. Оказалась, что блокада апоптоза не может повысить выживаемость клеток и способность к колониеобразованию после облучения, причем наблюдалась обратная корреляция между этими показателями и частотой образования клеток с микроядрами [175]. Из этих фактов были сделаны далеко идущие выводы о существовании особой формы гибели клеток, отличной от апоптоза, некроза и аутофагии Последнее десятилетие молекулярных путей, предпринимались приводящих к попытки митотической [32]. определения катастрофе. Исследователи ограничивались использованием термина «митотическая катастрофа» для обозначения клеточной смерти, происходящей только во время митоза [72; 96; 98; 126]. Под митотической катастрофой принято понимать гибель клетки в результате грубых нарушений митоза, таких как отставание хромосом в метаи анафазе, К-митозы, мультиполюсные и многогрупповые мета- и анафазы [43; 100; 175]. При этом сегрегация хромосом отсутствует, и клетка блокируется в одной из фаз митоза. Как правило, блок происходит в так называемом Кмитозе (колхицино-подобном митозе), когда в митотической клетке нарушены организация веретена и выстраивание хромосом в виде метафазной пластинки. Далее происходит активация каспаз и последующие деструктивные события по типу апоптотических. Митохондриальный путь активации программы апоптоза считают преобладающим при гибели клеток собственно в митозе. Завершается апоптоз образованием апоптотических телец и их фагоцитозом. Вторым подтипом митотической катастрофы является гибель клеток, перешедших после аномального митоза в следующую G1-фазу без нормальной сегрегации хромосом и образования дочерних клеток [175], т.е. постмитотическая гибель полиплоидных клеток. При общей эуплоидности полиплоидной клетки ее отдельные ядра являются 38 в основном анеуплоидными. Данный подтип митотической катастрофы может быть назван апоптозом клетки, прошедшей полиплоидизирующий митоз. Причиной митотической катастрофы считают нарушение процессов контроля в клетках, в которых могли произойти повреждения ДНК или нарушения сборки веретена. Ключевым моментом в блокировании клеточного цикла и в индукции в этих клетках апоптоза является экспрессия р53, который служит фактором транскрипции для р21 – ингибитора G1–фазы клеточного цикла и для ряда проапоптотических белков. Митотическая катастрофа принципиально отличается от апоптоза одноядерных клеток и аутофагической гибели тем, что нарушение ее программы может существенно повлиять на хромосомный состав клеток. Если в тетраплоидной клетке, возникшей в результате нарушения сегрегации хромосом, неактивны механизмы, ведущие к апоптозу или действующие в пункте проверки G1– фазы, то такая клетка может пройти очередной клеточный цикл и митоз. Деление полиплоидных клеток часто сопровождается многополюсностью веретена, в результате чего после сегрегации хромосом могут возникать анеуплоидные клетки. Анеуплоидия может вести к отсутствию пунктов контроля пролиферации и нарушению механизмов гибели клеток. Клоны потомков таких клеток могут служить основой для трансформации клеток и роста опухолей [100]. Появились данные, что изменение хромосомного состава диплоидных клеток может влиять на их способность вступать в апоптоз. Обнаружено, что если сестринские клетки, образовавшиеся в результате многополюсного митоза и являющиеся анеуплоидными, подвергнуть апоптотическому воздействию, то погибает лишь часть таких клеток. Часть остаются жизнеспособными. Такие жизнеспособные анеуплоидные клетки можно рассматривать в качестве одного из этапов озлокачествления опухолей. Таким образом, преодоление именно митотического пункта проверки без нормализации состояния клетки (например, формирование многополюсного, а не биполярного веретена, образование микроядер) может быть 39 источником клонов клеток, генетический состав которых, а значит, и их свойства, резко отличаются от исходных родительских клеток [49]. Ингибирующее прохождение клеткой "второй сверочной точки» клеточного цикла – checkpoint 2, что может быть достигнуто нокаутом генов chkl, chkl2, atm, atr , plk1, pik1, mlh1, p53, p21 [100; 162; 175]. Контрольная точка на переходе G2/М фазы определяет дальнейшую судьбу клетки в зависимости от коррекции репликации ДНК. Прохождение контрольной точки на переходе метафазы в анафазу происходит при прикреплении хромосом к веретену деления [20]. Более часто, митотическая катастрофа отражает случаи клеточной смерти, которые индуцируются абберантным митозом и происходящей в течение митоза или в последующей интерфазе абберантного митоза мультинуклеация), в в клетках которых [96; 98; 126]. После увеличивается отсутствуют ядро явления (микро- и маргинации и конденсации хроматина, что отличает его от апоптоза . Отсутствуют также разрывы ДНК, выявляемые TUNEL-методом [162; 175]. Образование одного или нескольких микроядер, используется как морфологические маркеры для обозначения митотической катастрофы. Однако при апоптозе и некрозе также обнаруживаются такие клетки. Недавно предположили, что митотическая катастрофа является онкосупрессивным путем клеточной смерти и старения, которые предшествуют и отличаются от апоптоза и некроза [191; 195]. Митотическую катастрофу вызывает повреждающая ДНК каспаза-2, опухолевый супрессор ТР 53 и другие члены этого семейства [72; 188]. Явления митотической катастрофы могут быть вызваны прямым ингибированием сборки микротрубочек веретена деления колхицином, винбластином и винкристином [175]. Номенклатурный комитет по клеточной смерти 2012 г. дал определение митотической катастрофы исключительно по функциональным признакам. Так, митотическая катастрофа не является «чистым» путем исполнения клеточной смерти, а отражает онкосупрессивный механизм, который: 1) 40 инициирован путем пертурбации митотического аппарата (т.е. хромосом и аппарата обеспечивающего фатальную сегрегацию); 2) инициируется в течение М фазы клеточного цикла; 3) в некоторой степени сравним с митотическим арестом; 4) в конце концов индуцирует клеточную смерть или старение [97]. 1.1.7. Энтоз В 2007 г. M. Overholzer и соавт. предложили термин «энтоз» для описания механизма клеточной смерти, связанной с фенотипом «клетка в клетке», который часто проявляют нефагоцитирующие клетки в клинических опухолевых образцах. Таким фенотипом обладают лимфобласты пациентов с болезнью Хантигтона, прозванные «клеточными каннибалами» [153]. Энтоз провоцируется утратой ЕСМ взаимодействия, но не ведет за собой активацию апоптотического каскада, поэтому обычная клеточная смерть отличается от энтоза. Энтоз происходит в отсутствие активации каспаз, не чувствителен к ингибиторам BCL – 2 и происходит параллельно путем активации малых GTPas RHO и RHS-ассициированных протеин киназы 1 в поглощенных клетках. Поглощенные клетки сначала выглядят нормальными и потом исчезают. Номенклатурная комиссия считает, что клеточная смерть путем энтоза обладает тремя признаками: 1) поглощенные клетки никогда не уходят фагосомами и могут деградироваться лизосомами (энтоз блокируют лизосомальные ингибиторы); 2) «клеточно-клеточный» фенотип происходит из гомотипических взаимодействий, т.е. в него вовлекаются клетки того же самого типа; 3) процесс нечувствителен к химическим и генетическим вмешательствам, которые в норме блокируют каспаза-зависимый и каспазанезависимый апоптоз [97]. 1.1.8. Партанотоз Термин «партанотоз» был предложен для определения отдельного вида клеточной смерти, вовлекающего повреждающие ДНК poly(ADP-ribose) 41 полимеразы (PARPs), в частности, PARP1, которая по количеству составляет более 90% клеточного PARP. При токсическом повреждении ДНК происходит сверхактивация PARP, деплеция NAD+ и АТР, аккумуляция митохондриотоксического приводящего PAR, к исчезновению митохондриального потенциала и освобождения AIF. Партанотоз играет роль при многих экспериментальных и физиопатологических состояниях, таких как паралич, диабет. Партанотоз определили как вариант клеточной смерти, зависящий от активации PARP и проявляющий NAD+ АТР деплецию, параллельно с обусловленным AIF хроматинолизисом. Партанотоз не зависит от каспаз и возможно представляет собой вместе с некроптозом частный случай регулируемого некроза [97]. 1.2. Механизмы действия противоопухолевых препаратов нитрозоалкилмочевин В настоящее время существуют 4 группы цитостатиков, эффективность которых в режиме монотерапии при метастатической превышает 10% нитрозомочевины, - это платины, производные винкаалкалоиды меланоме кожи имидазол-карбоксамида, [24]. В нашей стране проводилась и продолжается активная научно-исследовательская работа, направленная на создание оригинальных противоопухолевых препаратов [37; 38; 39]. Интенсивное развитие противоопухолевой химиотерапии как самостоятельного научного и медицинского направления исследований приходится в нашей стране на 60-е годы. В этот период, в частности в Институте химической физики РАН были обнаружены противоопухолевые свойства нитрозоалкилмочевин (НАМ) и начато систематическое изучение этих соединений, составляющих в настоящее время один из основных классов средств для лечения онкологических заболеваний [40]. Молекулярные механизмы биологического действия НАМ обусловлены выраженной реакционной способностью продуктов их биодеградации к алкилированию и карбомоилированию макромолекул. Эти реакции могут 42 приводить к модификации структуры ДНК, повреждению аппаратов транскрипции и трансляции, блокированию систем репарации (главным образом за счет ингибирования активности фермента О6 – алкилгуанинтрансферазы) и лежат в основе противоопухолевого эффекта НАМ [41; 59; 60; 101]. Лекарственные средства из группы производных нитрозомочевины также обладают широким спектром Противоопухолевый эффект цитотоксической активности. обусловлен переносом алкильных групп на нуклеофильные центры ДНК, РНК, белков и алкилированием их молекул, что приводит к гибели опухолевой клетки. Отличительной особенностью препаратов данной группы является их способность проходить через ГЭБ и отсутствие перекрестной резистентности с производными хлорэтиламинов и этилениминов [41; 60]. Механизм противоопухолевого действия различных нитрозо- алкилмочевин практически одинаков. В условиях in vivo они быстро метаболизируются с образованием активных алкильных групп, которые атакуют кислород О6 в молекуле гуанина одной из цепей ДНК. Через 6 -12 ч происходит связывание этого участка с цитидином другой цепи. Таким образом, возникает межнитевая сшивка. Количество сшивок зависит от способности клетки оторвать алкильную группу от гуанина до образования сшивки. Это происходит при действии специального фермента - О6 – алкилгуанин – ДНК – трансферазы, в результате которого алкильная группа переносится с ДНК на остаток цистеина в молекуле фермента и инактивируется. Эта реакция инактивирует фермент, поэтому для существенного дезалкилирования ДНК требуется постоянный синтез новых молекул фермента. Имеется обратная корреляция между уровнем О6 – алкилгуанин – ДНК – трансферазы в опухолевых клетках и цитотоксичностью нитрозоалкилмочевины: чем выше уровень фермента, тем меньше эффективность. Этот процесс впервые был установлен на примере нитрозоалкилмочевин [24]. 43 Нитрозометилмочевина метаболизма которой карбомоилирующей (1-нитро-1-метилмочевина), в результате образуются изоцианаты, обладающие выраженной активностью, способна в отличие от других нитрозоалкилмочевин самостоятельно подавлять активность этого фермента, что вероятно, может объяснить ее высокую противоопухолевую эффективность [24]. Нитрозоалкилмочевины одинаково эффективны по отношению как к пролиферирующим, так и непролиферирующим (находящимся в фазе покоя G0) клеткам опухоли. В наибольшей степени эти два свойства нитрозоалкилмочевин - цитотоксическое действие на непролиферирующие клетки и карбомоилирующая активность присущи нитрозометилмочевине. Одна из характерных особенностей фармакологического действия нитрозомочевин, отличающих их от большинства известных цитостатиков – циклонеспецифичность действия, т.е. способность вызывать летальное повреждение как пролиферирующих клеток (преимущественно при переходе из пресинтетической фазы – G1 в фазу синтеза ДНК – S и в ранней S- фазе), так и клеток, находящихся в пролиферативном покое (фаза G0 ). Это свойство препаратов имеет принципиальное значение для их использования в терапии солидных опухолей с низкой фракцией делящихся клеток и значительным пулом покоящихся, проявляющих устойчивость к воздействию других химиотерапевтических средств [28; 40]. Проведенные J. Montgomery исследования корреляций между физико – химическими свойствами и противоопухолевой активностью, позволили авторам сформулировать основные факторы, определяющие активность производных нитрозомочевины. К факторам, способствующим более высокой активности, были отнесены: 1) высокая алкилирующая активность; 2) высокая растворимость в липидах; 3) низкая химическая стабильность (высокая реакционная способность); 4) низкая карбомоилирующая активность. Однако эти положения не следуют рассматривать как абсолютные. 44 Подтверждением тому может служить нитрозометилмочевина, которая имеет практически одинаковую растворимость в воде и липидах, коэффициент Р (коэффициент Р представляет собой логарифм отношения растворимости вещества в н-октаноле к растворимости в воде) близок к нулю. При этом она обладает высокой противоопухолевой активностью. По противоопухолевой активности противоположный препарат нитрозометилмочевине - это хлорэтилпроизводное нитрозомочевины PCNU. Он обладает высокой растворимостью в липидах, но при этом противоопухолевая эффективность препарата не превышала таковую других производных нитрозомочевины, в дальнейшем препарат не нашел практического применения [24]. Также не нашел практического применения хлорозотоцин. Он обладал низкой карбомоилирующей активностью среди хлорэтильных производных нитрозомочевины и уступал по терапевтическому индексу, установленному при клинических испытаниях. Хлорэтильные производные нитрозомочевины имеют хлорэтильные группы: BCNU к молекуле нитрозомочевины с обеих сторон присоединено по 1 хлорэтильной группе; CCNU оставлена одна хлорэтильная группа, вместо другой присоединена циклогексильная группа [24]. Среди синтезированных и изученных в 60 годах хлорэтильных производных нитрозомочевины два препарата оказались клинически значимыми и сохранили свое значение до настоящего времени – это циклогексил – хлорэтилнитрозомочевина (CCNU, ломустин, белустин) и бисхлорэтилнитрозомочевина (BCNU, кармустин). BCNU, кармустин (1,3-бис-(2-хлорэтил)-1 - нитрозомочевина), обладает алкилирующими свойствами, которым принадлежит ведущая роль в появлении первоначальных повреждений ДНК; противоопухолевым, цитостатическим, иммунодепрессивным свойствами. Кармустин вызывает карбомоилирование лизиновых остатков белков через образование изоцианатов: возникают разрывы в молекуле ДНК, образуются внутри- и межмолекулярные сшивки цепей и нарушается синтез 45 ДНК. Кармустин алкилирующим не обладает агентам. перекрестной Препарат резистентностью способен проникать к через гематоэнцефалический барьер и поэтому применяется при лечении опухолей головного мозга (глиобластоме, глиоме, медуллобластоме, эпендимоме) и метастазах в головной мозг злокачественных опухолей. Препарат ACNU является аналогом BCNU, в котором вместо одной хлорэтильной группы имеется азотистое основание. ACNU обладает высокой противоопухолевой эффективностью при относительно низкой токсичности и хорошо растворяется в воде [63]. Препарат применяется в клинике под торговым названием нимустин, нидран. Препарат CCNU - ломустин (N-(2-Хлорэтил)-N'-циклогексил-N- нитрозомочевина) производное нитрозомочевины. Обладает алкилирующим, противоопухолевым, цитостатическим, иммунодепрессивным свойствами. В клетках расщепляется с образованием метилкарбониевых ионов, которые атакуют нуклеофильные центры ДНК, РНК, белков и алкилируют фосфатные, гидроксильные, сульфгидрильные, аминные и карбоксильные группы в составе их молекулы. Ломустин нарушает трансляцию и транскрипцию в опухолевых клетках. Ингибирование синтеза ДНК связано с карбамоилированием ДНК-полимеразы и других ферментов репарации ДНК и повреждением ДНК-матрицы. Ломустин влияет на фазы клеточного цикла прежде всего выражено в замедлении прохождения клетками фазы S, когда и происходит значительное угнетение синтеза ДНК. Удлиняется прохождение фазы G2. Особенно высокочувствительны к ломустину клетки в стационарной фазе роста, что является одним из факторов, определяющих активность при сóлидных опухолях с низким пролиферативным пулом. Ломустин проходит через ГЭБ. Фотомустин (мюстофоран) – это соединение было представителем группы нитрозоалкилмочевин, в котором к первым молекуле хлорэтилнитрозомочевины был присоединен остаток аминокислоты – аланина. Мюстофоран обладает высокой светочувствительностью, в водных 46 растворах быстро распадается под действием света, поэтому во время инфузий препарата необходимо защищать его от света. В отличие от нитрозометилмочевины мюстофоран обладает слабой карбомоилирующей активностью и поэтому не может инактивировать ферменты, вовлеченные в процесс репарации ДНК, в частности О6 - гуанин алкилтрансферазу. Результатом этого является быстрая репарация одноцепочечных разрывов ДНК. Препарат отличается от других нитрозоалкилмочевин способностью образовывать большее количество сшивок ДНК – ДНК и ДНК – белок [24; 67; 116]. Лизомустин производное (синоним аминокислоты нитруллин; лизин) – 2-хлорэтилнитрозоуреидо- оригинальный отечественный противоопухолевый препарат, хлорэтильное производное на основе Lгомоцитруллина. Лизомустин синтезирован в Институте органического синтеза им. И.Я.Постовского Уральского отделения РАН. Лиофилизированная и липосомальная лекарственные формы лизомустина созданы в лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН [7; 27]. Препарат представляет собой смесь двух изомеров, отличающихся положением нитрозогруппы: 9-(2-хлорэтил)-7-нитрозо-L-гомоцитруллин (1) и 9-(2-хлорэтил)-9-нитрозо-L-гомоцитруллин (2). Соотношение изомеров 1 и 2 составляет 75% : 25% [44]. Лизомустин обладает высокой противоопухолевой активностью в отношении широкого спектра как солидных опухолей животных (карцинома Са-755, рак легкого LLC, меланома В-16), так и лейкозов (L-1210, Р-388) однако основным недостатком является низкая избирательность его действия на опухолевые клетки, следствием которой является общая токсичность [24; 57]. В ходе эксперимента были исследованы липосомы лизомустина. Критерием выбора липидной композиции и соотношения лизомустина и липидов являлась агрегатная стабильность липосомальной дисперсии. На аденокарциноме легкого Льюиса 47 противоопухолевый эффект липосомального лизомустина наиболее выражен в дозах 175 и 200 мг/кг с 100% излечением животных. В отношении лейкоза L-1210 лизомустин в липосомальной лекарственной форме проявлял максимальный противоопухолевый эффект в дозах 125 и 150 мг/кг и 100% излечение животных. Применение липосомальной лекарственной формы лизомустина позволяет расширить диапозон терапевтических доз (100 – 200 мг/кг) и достигнуть максимального противоопухолевого эффекта без усиления токсического действия как на лейкозах, так и на солидных опухолях [57]. OR-2011 – нитрозопроизводное аминокислоты орнитина из группы нитрозоалкилмочевин, представляет собой смесь двух изомеров. Синтезирован в Институте органической химии им. И.Я.Постовского [25]. Цистемустин - хлорэтильное производное нитрозомочевины, в молекулу которого была введена сульфонильная группа, содержащая атом серы. Это первый представитель нитрозоалкилмочевин такого строения. Препарат обладает высокой алкилирующей активностью и также практически одинаковой растворимостью в липидах и воде (коэффициент Р равен нулю), что обычно коррелирует с высокой биологической активностью [69; 143; 148]. Стрептозотоцин (2(3-метил-3-нитроуреидо)-2-деокси-D-глюкопираноз)) – представляет собой нитрозомочевину, соединенную с сахаром (2 – дезокси 2 - глюкозой). Стрептозотоцин обладает выраженным диабетогенным действием - это связано со способностью разрушать β – клетки островков Лангерганса поджелудочной железы. В молекуле стрептозотоцина глюкоза выступает в роли активного носителя цитотоксической группы – нитрозометилмочевины, что позволяет ей попадать в больших количествах в островки Лангерганса и вызывать там избирательное повреждение β – клеток [24]. Механизм противоопухолевого действия стрептозотоцина обусловлен образованием при его метаболизме in vivo метилкарбониевых ионов, алкилирующих ДНК с образованием межнитевых сшивок. Таким образом, механизм противоопухолевого действия стрептозотоцина такой же, как и у 48 других нитрозоалкилмочевин. Алкилирующая и карбомоилирующая активность стрептозотоцина в 3 – 4 раза меньше (из-за наличия в молекуле глюкозы), чем у нитрозометилмочевины. Механизм диабетогенного действия стрептозотоцина объясняют подавлением синтеза никотинамидаденин динуклеотида в β – клетках. Это соображение подтверждается возможностью предупредить развитие диабета при введении стрептозотоцина применением никотинамида. Противоопухолевая активность стрептозотоцина при этом не меняется [24]. АДЕКО – производное нитрозометилмочевины, аналог стрептозотоцина. Название препарата представляет собой аббревиатуру фамилий авторов Афанасьев, Джаманбаев, Эмануэль, Корман, Островская. В молекулу АДЕКО входит нитрозометилмочевина, соединенная с сахаром ксилодой (N – метил – N(бета-D)- ксилозил нитрозомочевина). По влиянию на перевиваемые опухоли препарат оказался близким к нитрозометилмочевине, но был менее токсичным. АДЕКО был подготовлен к клиническим испытаниям, однако возникшие трудности с наработкой субстанции и изготовлением лекарственной формы не позволили это осуществить [24; 59]. Араноза – является (3 -α – L - арабинопиранозил-1-метилнитрозомочевина) аналогом стрептозотоцина. нитрозометилмочевина, которая В соединена молекулу не с аранозы глюкозой входит как у стрептозотоцина, а с другим моносахаридом L – арабинозой. Наличие в молекуле аранозы остатка L – арабинозы снижает токсичность и улучшает захват соединения злокачественными опухолевыми клетками [42]. Модификация структуры изменила биологические свойства аранозы. В отличие от стрептозотоцина она не обладает диабетогенной активностью и имеет другой спектр противоопухолевой Эффективность активности [13; 24, 102]. аранозы и лизомустина в режиме монотерапии при диссеминированной меланоме кожи не уступает эффективности стандартной химиотерапии дакарбазином. 49 Араноза и лизомустин характеризуются умеренной токсичностью, связанной с миелосупрессией. Их эффективность повышается при использовании в сочетании с цисплатином, винкристином, дактиномицином. Оба препарата и их комбинация рекомендованы для применения при меланоме кожи [9; 39; 56]. Обобщая экспериментальные исследования противоопухолевых свойств и клеточных механизмов действия НАМ, отметим ряд фундаментальных особенностей, присущих данному классу соединений и отличающих его от большинства известных препаратов: 1) широта спектра терапевтического действия в отношении экспериментальных опухолевых моделей; 2) циклонеспецифичность действия, выражающаяся необратимых летальных повреждений в индуцировании как в пролиферирующих, так и в покоящихся клетках; 3) способность проникать через гемато-энцефалический барьер и связанная с этим активность при опухолях центральной нервной системы; 4) совместного отсутствие применения перекрестной устойчивости (одновременного или и возможность последовательного) с препаратами других групп, в том числе с алкилирующими агентами [12; 24; 40; 50]. Хлонизол относится к классу нитрозоалкилмочевин и был предложен НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова МЗ РФ. Хлонизол вызывает угнетение синтеза поли-АДФ-рибозополимеразы-фермента, ответственного за выживаемость клеток с поврежденной ДНК. Перечень чувствительных к препарату штаммов включает 12 экспериментальных опухолей различного гистогенеза, развивающихся в виде асцидных, солидных и внутричерепных новообразований таких как опухоли Эрлиха, саркомы 180 и 37, лейкоз L 1210, саркома 45, лейкоз Р 388, карцинома Льюиса, меланома В16, лимфосаркома ЛИО-1, карциносаркома Уокера. При сравнении действия хлонизола с одним из его ближайших аналогов – CCNU (ломустин) и с аранозой преимущественно более высокий уровень активности хлонизола в отношении опухолей указанных выше. Столь 50 высокую эффективность хлонизол проявляет при однократном применении [40; 60]. Важной особенностью хлонизола является способность ингибировать развитие уже сформировавшейся опухоли. Он вызывает более глубокое и длительное ингибирование роста опухоли, чем ломустин. Так, торможение роста опухоли меланомы В16 сохраняется на уровне 92%, при применении ломустина составляет 76% [41]. По данным фармакокинетического исследования, проявляет повышенную тропность к тканям мозга и печени, а также высокую цитогенетическую активность, индуцируя тотальное повреждение хромосом опухолевых клеток. Обладая набором ценных фармакологических свойств, присущих препаратам класса НАМ, хлонизол превосходит по уровню цитогенетической и противоопухолевой активности известные препараты данной группы – это открывает новые возможности применения нитрозопроизводных в химиотерапии опухолей [40, 41]. Стрептозоцин глюкопираноза) (2-Дезокси-2-//(метилнитрозоамин)карбонил/амино/-Dпроизводное - нитрозомочевины. Противоопухолевое алкилирующее средство. В экспериментальных исследованиях выявлено канцерогенное, тератогенное и мутагенное действие. Ингибирует митоз, преимущественно G2 фазу. Механизм противоопухолевого действия полностью не изучен, его активность является результатом образования метилкарбоновых ионов, которые вызывают алкилирование или связываются со многими внутриклеточными молекулярными структурами, включая также нуклеиновые кислоты. Обладает низкой алкилирующей активностью и слабо влияет на синтез РНК. Стрептозоцин подавляет пролиферацию клеток. Цитотоксическое действие обусловлено образованием поперечных сшивок между нитями ДНК, что и приводит к ингибированию ее синтеза. Стрептозоцин оказывает гипергликемический эффект, вызывая необратимое повреждение β-клеток поджелудочной железы. В настоящее время все еще ведется поиск новых соединений из класса нитрозомочевин, связанный с попытками 51 расширить спектр их противоопухолевого действия, снизить побочные и токсические эффекты, увеличить избирательность противоопухолевого действия, а также обусловленный тем, что опухоли не обладают перекрестной резистентностью к различным представителям этой группы препаратов. Одним из таких соединений является OR – 2011, синтезированный в Институте органической химии им. И.Я. Постовского УО РАН [1; 2; 16]. Появление новой концепции программированной клеточной смерти привело к изменению мнения о механизмах действия противоопухолевых препаратов. Два изученных механизма действия НАМ - алкилирование и карбомоилирование макромолекул - лишь первая фаза клеточной гибели. Исполнительный механизм клеточной гибели, описанный в главе 1 обзора литературы, для препаратов группы НАМ не изучен. Это может быть один из вариантов апаптоза, аутофагия, регулируемый некроз и т.д. Выяснение роли апоптоза и аутофагии под действием препаратов НАМ посвящена настоящая работа. На протяжении последних 20 лет в практике мировой фармакологии интенсивно используются препараты различной направленности на основе липосом и липидов. Эти препараты нашли широкое применение в диагностике и химиотерапии онкологических заболеваний [6; 7; 33; 34; 47]. За сравнительно короткий срок липосомы превратились из простой модели, имитирующей клеточные мембраны, в объект активных научных исследований и практического применения [5; 7; 8; 35; 36]. Главная лекарственных цель использования препаратов липосом заключается в в качестве селективном носителей накоплении действующих веществ в патологических очагах (опухолях, воспаленных тканях). Включение лекарства в липосомы может изменить фармакокинетику и биораспределение препарата, приводящее к повышению эффективности противоопухолевой терапии и снижению токсичности [15; 17; 29; 30]. Важную роль в этом процессе играет измененная неоваскуляризация опухоли, способствующая проникновению и накоплению липосом в опухоли 52 [6]. Для достижения необходимого терапевтического эффекта инкапсулированный в везикулы препарат должен быть доступным для клеток-мишеней [6; 17; 30]. Далее липосомы интернализуются клеткамимишенями или разрушаются различными способами (ферментативным гидролизом либо воздействием извне, например ультразвуком, температурой) возле поверхности клеток с последующим высвобождением препарата и его захватом этими клетками. Кроме того, липосомы преодолевают множественную лекарственную устойчивость [58]. Механизм действия липосомальных препаратов не изучен. Известно, что липосомальные препараты преодолевают множественную лекарственную устойчивость [58]. Это было продемонстрировано на клетках линии К-562 с гиперэкспрессией гликопротеида pgp170, продукта гена MDR1. Возможность индукции липосомами различных типов программированной клеточной смерти, описанных в главе 1, не исследована. Это определяет актуальность цели и задач данной диссертационной работы. 53 Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и реактивы Питательная среда RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) Гентамицин (ICN, США) Аминокислоты для среды RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) Витамины для среды RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) L-глутамин (Sigma, США) HEPES (Sigma, США) Телячья эмбриональная сыворотка (Gibco, США) Раствор Версена (ПанЭко, Россия) Натрий-фосфатный буфер (PBS) (pH 7,2-7,4) (ПанЭко, Россия) Антитела IgG, конъюгированные с FITS (Goat F (ab)2 ANTI HUMAN IgG:FITC) («Serotec») CD95 PE (Dako) Annexin-V FITC Apoptosis Kit (Invitrogen, США) Beclin1 (Литех, Россия) TRIzol (Sigma, США). Агарозный гель L (Хеликон, Россия) 96-луночные плоскодонные планшеты (Costar, США) Араноза-лио (Филиал «Наукопрофи» ФГБНУ РОНЦ, Россия) Липосомальная араноза (НИИ ЭДиТО ФГБНУ РОНЦ, Россия) OR-2011-лио (НИИ ЭДиТО ФГБНУ РОНЦ, Россия) Липосомальный OR-2011 (НИИ ЭДиТО ФГБНУ РОНЦ, Россия) 54 Таблица 1 Состав липосомальной лекарственной формы аранозы на 1 флакон Компонент Количество, г Фосфатидилхолин 0,38 Холестерин 0,038 ФЭ-ПЭГ-2000 0,025 Араноза 0,1 Лактоза 0,5 Сорбиновая кислота 0,004 Примечание: Включение аранозы 81± 2 %, размер везикул 167 ± 2 нм; включение OR-2011 в липосомы составило 43 ± 2 %, размер частиц 150 нм [1, 22]. 2.2 Оборудование Ламинарный шкаф NU – 437- 400E (NuAire, США) СО2 -инкубатор NU – 4750 E (NuAire, США) Лабораторная центрифуга (Sorvall LEGEND XTR, Германия) Микроцентрифуга (Eppendorf, Германия) Проточный цитофлуориметр FACSCanto II (Becton Dickinson, США). Инвертированный микроскоп (Leica, Германия) Холодильник с морозильной камерой на – 20° С (Стинол, Россия) Морозильник на – 80° С (NuAire, США) Шейкер S 3.02 (ELMI, Латвия) Фотометрическом анализатор иммуноферментных реакций «АИФР – 01» Униплан (ЗАО, «Пикон») Амплификатор «Терцик» (ДНК-Технология, Россия) 55 2.3. Методы исследования 2.3.1. Клеточные линии и их культивирование Исследования проводили на 5 клеточных линиях диссеминированной меланомы человека: mel Z, mel Mtp, mel Mtp clone X, mel Ibr, mel Kor, полученных из банка клеточных культур ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина». Клеточные линии культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10 % ТЭС, 10 мМ HEPES (Sigma, США), 2мМ L-глутамина (Sigma, США), 40нг/мл гентамицина (ICN, США), пируват натрия (ПанЭко), 0,1 % раствор аминокислот и 0,1 % раствор витаминов (ПанЭко, Россия) при 37° C в атмосфере 5 % СО2 (полная среда). Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста постоянным пересевом культуры через 3-4 дня. Для снятия клеток с пластика использовали раствор Версена. Клетки отмывали чистой бессывороточной средой RPMI-1640 и пересаживали в 96-луночные плоскодонные планшеты (Costar, США) по 4х103 клеток в 180 мкл полной среды RPMI-1640 на лунку. Далее клетки помещали в термостат при 37° C в атмосфере 5 % СО2 . 2.3.2. Изучение цитотоксического действия препаратов методом МТТ-тест Для оценки цитотоксической активности использовали МТТ-тест, впервые предложенный Т. Мосманном [157]. МТТ-тест основан на восстановлении желтой соли тетразолия 3-(4,5-диметилтиазолин-2)-2,5 митохондриальными и дифенилтетразолия цитоплазматическими бромид дегидрогеназами (МТТ) живых метаболически активных клеток с образованием фиолетовых кристаллов формазана, нерастворимых в воде. В результате этой реакции, количество полученного формазана зависит от числа клеток и их жизнеспособности и определяется спектрометрически. Цитотоксический эффект характеризует ИК50 – концентрация вещества, вызывающая гибель 50 % клеток. 56 Исследование проводили на 5 клеточных линиях диссеминированной меланомы человека: mel Mtp, mel Mtp clone X, mel Z, mel Kor, mel Ibr, полученных из банка клеточных культур ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» . Клетки этих линий раскапывали в концентрациях 4 x 103 клеток в 180 мкл полной среды RPMI-1640, засевали в 96-луночные плоскодонные планшеты. Для оценки цитотоксичности препарата в каждую лунку добавляли по 20 мкл исследуемых препаратов в разных концентрациях и инкубировали с клетками в течение 24, 48 и 72 ч при 5% СО2 и температуре 37° C. В контрольные лунки с клетками добавляли по 20 мкл среды RPMI-1640 или растворителя, в котором разводили препараты. Через 24, 48 или 72 ч в каждую лунку вносили по 20 мкл раствора МТТ в исходной концентрации 5 мг/мл (Sigma, Сhemical Co, США) и инкубировали 4 ч в термостате при t 37° C в атмосфере 5% СО2. По окончании инкубации планшеты центрифугировали при 1500 об/мин в течение 6 мин. Супернатант осторожно отбирали, вносили в каждую лунку по 150 мкл диметилсульфоксида (DМSО, Sigma, Сhemical Co, США). Планшеты помещали на 7 минут в термостат при температуре 37° C. Далее планшеты встряхивали на шейкере, после чего определяли оптическую плотность раствора формазана на фотометрическом анализаторе иммуноферментных реакций «АИФР – 01 Униплан» (ЗАО, «Пикон») при длине волны 530 нм. Величина поглощения прямо пропорциональна числу живых клеток. Процент живых клеток вычисляли по формуле: N1 N0 = ––––– ×100 % N2 N0 ─ процент живых клеток; N1 ─ средняя оптическая плотность в лунках, содержащих клетки и препарат; N2 ─ средняя оптическая плотность в контрольных лунках, содержащих только клетки. 57 2.3.3. Метод двойного окрашивания с использованием Аннексина V-FITC в комбинации с пропидием йодидом Клетки выращивали в 6-луночных планшетах (Costar) в среде RPMI1640 c 10% ТЭС. В лунки засевали по 2 мл клеточной суспензии, содержащей 1 × 105 клеток/мл. Через сутки в лунки с клетками добавляли традиционную лекарственную форму аранозы и липосомальную аранозу в концентрации 450 мг/мл и 900 мг/мл. В контрольных лунках клетки оставались без препаратов. Через 24 ч инкубации клетки из лунок снимали раствором Версена в пробирки со средой, в которой они росли, и осаждали центрифугированием 5 минут при 1000 оборотов/минуту. Затем клетки отмывали, после чего помещали в пробирки по 250-500 тыс. клеток на пробирку в 100 мкл аннексин-связывающего буфера. В пробирки добавляли по 5 мкл Аннексин V-FITC и 5мкл пропидий йодид. Образцы инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее к пробам добавляли 400 мкл аннексин-связывающего буфера и проводили анализ на проточном цитофлуориметре. 2.3.4. Прямая реакция иммунофлуоресценции (РИФ) Экспрессию CD95 иммунофлуоресценции. антигена Для исследовали осуществления в прямой прямой реакции реакции иммунофлуоресценции в пробирки с 50 мкл клеток в количестве 500 тыс. на пробирку добавляли моноклональные антитела CD95, меченные фикоэритрином (PE) по 10 мкл, затем инкбуировали в течение 30 мин при t 4° C, затем клетки дважды отмывали РВS и анализировали методом проточной цитофлуориметрии. 58 2.3.5. Проточно-цитофлуориметрический анализ Метод позволяет анализировать параметры клеточного цикла, ранний апоптоз, наличие клеточных рецепторов. Проточно-цитофлуориметрический анализ проводили на проточном цитофлуориметре FACSCantoII (Becton Dickinson, США). Клетки анализировали на основе параметров, измеряемых проточной цитометрией. Клетки в момент прохождения через луч лазера рассеивают свет во всех направлениях и испускают небольшое количество света за счет флуоресценции. Размер и форму клеток определяет прямое рассеивание света (FCS) – количество света в направлении лазерного пучка под углом 0°, тогда как боковое рассеивание (SSC) – под углом 90° по отношению к лазерному пучку определяет структурные особенности различных популяций клеток. На цитограмме устанавливали соответствующее окно дискриминации (гейт), в котором на основании SSC и FCS вырезали основной пул клеток с целью удаления крупных (агрегаты) частиц и мелких (дебрис) частиц. Интенсивность флуоресценции проводилась с учетом анализа гистограмм. На гистограммах по оси Y отображено число событий (число клеток), а по оси X – интенсивность флуоресценции. В зависимости от цели исследования в каждом образце накапливали не менее 5–10 тысяч событий. Длина волны для красной флуоресценции (РI) устанавливалась в канале РЕ- флуоресценции (585/42 нм), а длина волны для зеленой флуоресценции устанавливалась в канале FITC (530/30 нм). Данные получали в логарифмическом измерении для обоих каналов. Анализ апоптотических клеток, окрашенных Annexin V – FITC/PI, основывался на регистрации клеток ранний апоптоз Annexin V – FITC + PI ─ и поздний апоптоз Annexin V – FITC + PI+ . При анализе двойного окрашивания клеток в режиме «dot plot» Аннексином V-FITC в сочетании с PI были получены данные в логарифмическом измерении для обоих каналов FITC и РЕ. 59 2.3.6. Определение мРНК mFas и sFas При исследованиях 200 мкл суспензии клеток смешивали с равным объемом лизирующего раствора (4 М гуанидин тиоционата, 250 мМ ацетата натрия, 0,5 % Triton X-100), добавляли 400 мкл смеси фенола с хлороформом (1:1), преципитировали изопропанолом и промывали 75 % этиловым спиртом. Осадок разводили в 20 мкл воды, свободной от нуклеаз. Полученный препарат использовали в реакции обратной транскрипции с использованием MMLV ревертазы (AmpliSens, Россия), согласно рекомендациям производителя. В качестве затравки использовали поли-Т праймер. Детекцию мРНК мембранной формы Fas антигена (мРНК Fas) и мРНК растворимой формы Fas антигена (мРНК sFas) и оценку относительных уровней проводили методом ПЦР в реальном времени. Для нормализации использовали уровень мРНК UBC. Реакционная смесь содержала ПЦР буфер, 5 единиц активности TaqF-полимеразы (ООО «ИнтерЛабСервис», Москва), 0.4 мМ каждого из дНТФ, по 10 пМ праймеров, по 5 пМ зондов специфичных к исследуемым мРНК. Первичная структура праймеров и зондов представлена в таблице 2. ПЦР проводили в анализаторе нуклеиновых кислот DTlite (ДНК технология, Москва) при следующих температурных условиях: 94ºС – 15 мин и 50 циклов при 94ºС – 30 с, 55ºС – 40 с, 72ºС – 45 с. Полученные значения Cp, использовали для расчета уровней исследуемых мРНК. Уровни мРНК компенсировались с учетом эффективности реакции и нормализовались относительно уровня мРНК UBC. 60 Таблица 2 Первичная структура праймеров и зондов используемых в ПЦР в реальном времени Праймер Первичная структура (5' – 3') Fas-F ACCAAATGTGAACATGGAAT Fas-R TTCCTTTCTCTTCACCCAA sFas-R TTCCTTTCTCTTCACTTCC Fas-Z ROX-AGATCTAACTTGGGGTGGCTTTGTCTTCTT-BHQ2 sFas-Z FAM-AGAGGAAGTGAAGAGAAAGGAAGTACAGA-BHQ1 UBC-F CACAGCTAGTTCCGTCGCA UBC-R GAAGATCTGCATTGTCAAGT UBC-Z R6G-ATTTGGGTCGCAGTTCTTGTTTGTGGAT-BHQ1 2.3.7. Статистическая обработка результатов Нами было проанализирована достоверность полученных различий в цитотоксическом действии двух лекарственных форм аранозы. С этой целью сравнивали достоверность в проценте живых клеток после инкубации лиофилизированной аронозы и липосомальной аранозы при соответствующих концентрациях препаратов (определение преимущества липосомальной лекарственной формы), а также процент выживших клеток у разных линий при одной и той же концентрации препарата (определение различий в чувствительности клеточных линий к аранозе). Статистический анализ проводили с использованием программы BIOSTAT (Version 3.2), Microsoft Excel 2003, STATISTICA V. 8.0. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента. Различия считали статистически достоверными при р ≤ 0,05 [11]. 61 Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕНОТИПА КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ МЕЛАНОМЫ Для изучения механизма действия липосомальных противоопухолевых препаратов использовали клеточные линии диссеминированной меланомы кожи человека, полученные в ФГБНУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина [36]. Были исследованы клеточные линии mel Mtp, mel Mtp clone X, mel Kor, mel Z и mel Ibr. Ранее было показано, что клетки линии mel Mtp не экспрессируют рецептор CD95/Fas и резистентны к действию аранозы [50]. Для более детальной характеристики этих клеточных линий было проведено изучение экспрессии антигенов CD95/Fas и гликопротеида pgp170 (продукта гена множественной лекарственной устойчивости MDR1) методом проточной цитофлуориметрии, а также наличие в меланомных клетках мРНК генов CD95/Fas и MDR1 методом ПЦР. Кроме того, была исследована функция гликопротеида pgp170 по выбросу родамина. 3.1.1. Статус CD95/Fas рецептора В результате проведенной работы было обнаружено, что клетки линий клеток mel Mtp, mel Mtp clone X и mel Z не экспрессируют антиген CD95/Fas, а клетки линии mel Kor и mel Ibr – экспрессируют. Результаты представлены на рисунке 1. 62 Контроль СD95 A Контроль СD95 Б CD95 Контроль В 63 CD95 Контроль Г CD95 Контроль Д А – Клетки линии mel Mtp; Б – Клетки линии mel Mtp clone X; В – Клетки линии mel Z; Г – Клетки линии mel Kor; Д – Клетки линии mel Ibr. Рис. 1. Гистограммы распределения клеток меланомы кожи, окрашенных моноклональными антителами против антигена CD95/Fas, меченными фикоэритрином. 64 На рисунке 1 представлены гистограммы флуоресценции клеток линий mel Mtp, mel Mtp clone X, mel Z, mel Kor, mel Ibr, окрашенных контрольными изоспецифическими антителами или же моноклональными антителами против антигена CD95/Fas. Как видно из рисунка 1, контрольные изоспецифические моноклональные антитела не окрашивали клетки ни одной клеточной линии. Моноклональные антитела анти-CD95PE реагировали с клетками только двух клеточных линий – mel Kor и mel Ibr. Клеточная линия mel Kor содержала 39 % антигенположительных клеток, mel Ibr – 64,7 %, а mel Mtp содержала 0,5 %, mel Mtp clone X 1 %, mel Z 0,8 % антиген-положительных клеток. Таким образом, из 5 исследованных линий клеток меланомы кожи человека только две линии экспрессировали рецептор CD95/Fas, опосредующий апоптоз. Известно, что отсутствие экспрессии белка не всегда отражает активность гена. В связи с этим нами было проведено изучение наличия мРНК гена CD95/Fas в выше указанных клеточных линиях. Оценку уровней мРНК проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Определяли два вида mРНК - мембраносвязанную (mFas) и растворимую (sFas) формы. Результаты представлены в таблице 3. Таблица 3 Значения относительных уровней мРНК mFas и sFas Уровень мРНК Линии клеток меланомы Mtp Mtp clone X Ibr Kor Z mFas/UBC 0 0 0,25 0,13 0,19 sFas/UBC 0 0 0,14 0,15 0,28 mFas/sFas 0 0 1,76 0,89 0,67 65 Оба вида мРНК отсутствовали в клетках mel Mtp и mel Mtp clone X. В клетках mel Z уровень mFas был ниже sFas (0,19 и 0,28 ед. соотвественно). Соотношение mFas/sFas – 0,67. Таким образом, клетки линии mel Z имеют мРНК антигена CD95/Fas, но не экспрессируют белок. Клетки линии mel Kor имеют мРНК mFas и sFas (0,13 и 0,15 соответственно). Соотношение этих мРНК было 0,89. Клетки линии mel Ibr содержат больше mFas мРНК, чем sFas мРНК (0,25 и 0,14 соответственно). Их соотношение составило 1,76. Фенотип статуса CD95/Fas рецептора представлен в таблице 4. Таблица 4 Фенотип CD95/Fas рецептора в клеточных линиях меланомы Клеточные линии mel mel Mtp Mtp clone X Антиген CD95/Fas ─ ─ ─ + + mFas mРНК CD95/Fas ─ ─ + + + sFas мРНК CD95/Fas ─ ─ + + + Таким образом, mel Z mel Kor mel Ibr клеточные линии меланомы кожи различались по экспрессии CD95/Fas рецептора опосредующего апоптоза. Клетки линий mel Kor и mel Ibr экспрессировали белок и имели мРНК этого рецептора, клетки линий mel Mtp, mel Mtp clone X и поверхности антиген. mel Z не экспрессировали на своей Клетки линий mel Mtp и mel Mtp clone X не имели мРНК антигена CD95/Fas, а клетки mel Z были положительны. 3.1.2. Статус MDR1 гена Одним из механизмов защиты опухоли от противоопухолевых препаратов является гиперэкспрессия АВС транспортеров. Среди них 66 наиболее изученным является ген множественной лекарственной устойчивости MDR1 и его продукт гликопротеид pgp170. Токсические вещества выбрасываются из клетки и такую клетку трудно убить. Липосомальная лекарственная форма препарата способствует накоплению лекарственного вещества в опухолевом узле и изменяет путь проникновения препарата в опухолевую клетку. Накопление липосом в опухоли обусловлено особенностями неоангиогенеза опухоли, при котором в эндотелии сосудов образуются поры, через избирательно попадают которые липосомы определенного размера в опухолевую ткань. Проникновение липосом в опухоль происходит по пути пиноцитоза везикул, что обеспечивает отсутствие контакта лекарственного препарата с клеточной поверхностью. Это препятствует индукции внешнего апоптоза, обусловленного CD95/Fas рецептором. Каким образом индуцирует гибель клеток липосомальный препарат остается неизвестным. Целью настоящей работы было изучение механизма гибели клеток индуцированного липосомальными противоопухолевыми препаратами. В качестве препарата была выбрана липосомальная лекарственная форма аранозы. Исследование было проведена на культурах диссименированной меланомы кожи, полученных в ФГБНУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» в рамках создания противоопухолевых вакцин. Исследование было проведено на трех клеточных линиях меланомы mel Kor, mel Mtp сlone X и mel Ibr. Эти культуры клеток были охарактеризованы по экспрессии белков множественной лекарственной устойчивости, по экспрессии мРНК этих генов и выбросу родамина 123. Исследование экспрессии продукта гена MDR1 гликопротеида pgp170 показало, что только клетки mel Ibr экспрессировали pgp170 на 35 – 50 % клеток (Рис. 2). На других клетках реакция моноклональных антител к pgp170 отсутствовала. Моноклональные антитела против другого транспортера MRP1 не реагировали с этими клетками. 67 2,96 % mel Kor контроль 2,92 % mel Kor (РЕ) 3.46 % mel Ibr контроль 34.2 % mel Ibr (РЕ) Рис.2. Гистограммы клеток окрашенных моноклональными антителами к pgp170, меченными фикоэритрином. При исследовании уровня мРНК генов MDR1 и MRP1 за контроль фонового уровня были выбраны клетки mel Kor (Табл.5). Значение в таблице показывает во сколько раз относительно контроля изменяется экспрессия мРНК исследуемого гена. Знак "-" - снижение экспрессии, " +" - усиление экспрессии. Приведены средние значения трех экспериментов статистически значимые при р ≤ 0,05, пустая ячейка - нет статистической значимости при р ≤ 0,05. В клетках mel Mtp clone X уровень мРНК MDR1 был повышен в 38 68 раз, а в клетках mel Ibr в 12,5 раз по сравнению с клетками mel Kor. Уровень мРНК гена MRP1 в клетках mel Mtp clone X и mel Ibr не отличался от mel Kor. Таблица 5 Сравнение уровней мРНК генов MDR1 и MRP1 в меланомных клеточных линиях Линии клеток меланомы Гены транспортеры MDR 1 MRP 1 mel Kor контроль контроль mel Ibr 12,46663 1,505247 mel Mtp clone X 38,05463 -2,39496 Ниже приведен расчет в процентах, где экспрессия мРНК mel Kor принята за 100%. Таблица 6 Сравнение уровней мРНК генов MDR1 и MRP1 в меланомных клеточных линиях Экспрессия мРНК генов MDR1 и MRP1 в процентах от контроля Pgp 170 MRP 1 mel Kor 100,00 100,00 mel Ibr 1246,66 150,52 mel Mtp clone X 3805,463 41,75 Функциональную активность гликопротеидов pgp170 и MRP1 определяли по выбросу родамина 123. Исследование выброса родамина 123 показало, что клетки линии mel Kor накапливают родамин 123 и не выбрасывают его (Рис.3, Табл.7). Средний канал флуоресценции был равен 69 1157 без верапамила и 1146 с верапамилом. Таким образом, клетки mel Kor не экспрессируют pgp170, не имеют мРНК генов MDR1 и MRP1, и не выбрасывают родамин 123. Таблица 7 Выброс Родамина 123 (Rh123) клетками меланомных клеточных линий Клеточная линия Средний канал флуоресценции Накопление Rh123 Выброс Rh123 mel Kor 1157 1146 mel Ibr 1175 533 mel Mtp clone X 177 23 Клетки линии mel Ibr выбрасывали половину родамина 123 (Рис.3, Табл.7). Средний канал флуоресценции был 1175 с верапамилом и 533 без верапамила. Таким образом, эти клетки экспрессируют гликопротеид pgp170 на 35 – 50 % клеток, имеют повышенный уровень мРНК гена MDR1 и выбрасывали родамин 123. Клетки линии mel Mtp clone X накапливали лишь 177 ед. родамина 123 в течение 15 мин и почти весь родамин 123 выбрасывали (Рис.3,Табл.7). Можно предположить, что весь попадающий в клетку родамин 123 тот час выбрасывался. Таким образом, клетки меланомы линии mel Mtp clone X имеют мРНК гена MDR1 в 38 раз выше контрольных клеток, не экспрессируют pgp170, но интенсивно выбрасывают родамин 123. Возможно, высокая экспрессия pgp170 не позволяет моноклональным антителам связываться с гликопротеидом. Можно сделать заключение, что клетки mel Kor не экспрессируют pgp170. В клетках mel Mtp clone X и mel Ibr обнаружена гиперэкспрессия гена MDR1, проявляющаяся в увеличении мРНК этого гена, экспрессии pgp170 и выбросе родамина 123. 70 Mean-1157 mel Kor накопление Rh 123 Mean-1146 mel Kor выброс Rh 123 Mean-533 Mean-1175 mel Ibr накопление Rh123 mel Ibr Mean-177 mel Mtp clone X накопление Rh 123 выброс Rh 123 Mean-23 mel Mtp clone X выброс Rh 123 Рис.3. Накопление и выброс родамина 123 (Rh123). * Mean ─ средний канал флуоресценции. 71 3.2. ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ДВУХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ПРОИЗВОДНЫХ НИТРОЗОМЕТИЛМОЧЕВИНЫ НА МЕЛАНОМНЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ 3.2.1. Лиофилизированная араноза Описанные выше меланомные клеточные линии использовали для сравнения цитотоксического действия липосомальной аранозы и лиофилизированной аранозы. Различия в экспрессии рецептора CD95/Fas, опосредующего внешний апаптоз, и гликопротеида pgp170 позволяют определить различия цитотоксического действия лекарственных форм препарата и выявить возможный механизм действия липосомальных препаратов. Ранее Е.Г.Славиной и соавт. было показано, что клетки меланомы линии mel Mtp clone X устойчивы к аранозе, но чувствительны к альнорину. Этот препарат индуцирует рецептором. Араноза апоптоз вызывала посредством гибель взаимодействия других клеток с TNF меланомы, экспрессирующих CD95/Fas рецептор. Как видно из предыдущей главы, клетки линии mel Mtp clone X помимо утраты CD95/Fas рецептора имеют гиперэкспрессию гликопротеида pgp170, опосредующего множественную лекарственную устойчивость. Поэтому для изучения механизма действия лекарственных форм аранозы мы включили в исследование другие клеточные линии с разным статусом рецептора CD95/Fas и pgp170. На первом этапе работы мы изучили чувствительность клеточных культур меланомы к цитотоксическому действию лиофилизированной аранозы. Результаты представлены на рисунке 4. 72 А Б В Рис.4. Цитотоксическое действие лекарственной формы аранозы-лио на клетки линии меланомы: А: 24 ч инкубации; Б: 48 ч инкубации; В: 72 ч инкубации. 73 Клеточная линия mel Mtp Исследование статуса рецептора CD95/Fas и pgp170 в другом клоне клеток линии mel Mtp показало, что эти клетки не экспрессируют рецептор CD95/Fas, не имеют мРНК гена CD95/Fas, но, что очень важно, не гиперэкспрессируют pgp170. Поэтому мы имели возможность оценить механизм устойчивости клеток к аранозе – связан ли он с множественной лекарственной устойчивостью или, как заключили Е.Г.Славина и сооавт. вызван отсутствием рецептора CD95/Fas. Для решения этого вопроса исследовали чувствительность к аранозе клеток mel Z, не экспрессирующей рецептор CD95/Fas, но имеющей мРНК этого гена, а также две положительные по экспрессии CD95/Fas клеточные линии. Цитотоксическое действие аранозы определяли в МТТ-тесте после инкубации клеток с аранозой в течение 24, 48 и 72 ч. На рисунке 5 представлена средняя по 6 опытам кривая выживаемости клеток линии mel Mtp в зависимости от концентрации препарата. Аранозу использовали в концентрациях от 0,056 до 0,9 мг/мл. После инкубации аранозы в течение 24 ч ИК50 не была достигнута. При самой большой концентрации препарата выживало в среднем 74,9 % клеток (Р >0,01). Несмотря на статистически значимое угнетение процента живых клеток, такой высокий процент живых клеток указывает на не эффективность противоопухолевого препарата. Поэтому можно сделать заключение, что клетки линии mel Mtp устойчивы к лиофилизированной аранозе в первые 24 ч инкубации. После инкубации аранозы в течение 48 ч ИК50 составила 0,9 мг/мл (Рис.5Б). При всех концентрациях наблюдали статистически значимое угнетение процента живых клеток (Табл. 14). Через 72 ч ИК50 для аранозы было 0,518 мг/мл (Табл. 8,9). При всех концентрациях было показано статистически значимое угнетение процента живых клеток (Табл. 14). 74 Таким образом, культура клеток линии mel Mtp устойчива к аранозе при инкубации в течение 24 ч, а слабая чувствительность наблюдалась через 48 ч при большой дозе препарата и выраженная через 72 ч. Клеточная линия mel Mtp clone X Следующим этапом работы было исследование чувствительности к аранозе клеток mel Mtp clone X. Данные клетки не экспрессировали рецептор CD95/Fas, не имели мРНК этого рецептора, но гиперэкспрессировали ген множественной лекарственной устойчивости. Как видно из рисунка 6, клетки линии mel Mtp clone X были устойчивы к аранозе после инкубации в течение 24 и 48 ч. ИК50 не была достигнута (Табл. 8,10). Клеточная линия mel Z Клетки mel Z характеризуются отсутствием на своей поверхности рецептора CD95/Fas, но имеют мРНК этого рецептора. Цитотоксическое действие лиофилизированной аранозы отсутствовало при инкубации клеток в течение 24 и 48 ч (Рис. 7, Табл.11). Через 72 ч ИК50 составила 0,646 мг/мл (Табл. 11). Клеточная линия mel Kor Клетки mel Kor были чувствительны к действию аранозы. После инкубации клеток в присутствии аранозы в течение 24 ч ИК50 была 0,806 мг/мл (Рис.8,9; Табл. 8,12). Через 48 ч ИК50 было 0,662 мг/мл, а через 72 ч 0,188 мг/мл. Цитотоксический эффект был дозо-зависимым (Табл. 16). 75 Клеточная линия mel Ibr Клетки mel Ibr также были чувствительны к действию аранозы при инкубации в течение 48 и 72 ч. ИК50 была 0,9 и 0,45 мг/мл соответственно. После 24 ч ИК50 не была достигнута (Табл. 8,13). Таким образом, исследованные клеточные линии меланомы кожи человека проявили разную чувствительность к аранозе, которая по всей вероятности, связана с различными молекулярно-биологическими свойствами этих клеточных линий: разным статусом CD95/Fas рецептора, опосредующего апоптоз, и экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости. Суммарные данные представлены в Таблице 8. Таблица 8 Различия в чувствительности меланомных клеточных линий к аранозе Клеточные линии Время инкубации, ч ИК50 (мг/мл) 24 48 72 mel Mtp (CD95-) Не достигнута 0,9 0,518 mel Mtp clone X Не достигнута Не достигнута Не достигнута Не достигнута Не достигнута 0,646 mel Kor 0,806 0,662 0,188 mel Ibr Не достигнута 0,9 0,45 (CD95-, pgp170+) mel Z (CD95-) Наиболее чувствительной к аранозе линией клеток была mel Kor. ИК50 была достигнута уже через 24 ч. Другие клеточные линии в этот срок были 76 устойчивы. Клетки линии mel Mtp и mel Ibr стали чувствительными к препарату через 48 ч. Цитотоксическое действие аранозы проявилось после инкубации в течение 72 ч (Табл. 8). Исходя из этого, можно сделать вывод: Клетки линий меланомы кожи различаются по чувствительности к цитотоксическому действии аранозы. Наиболее чувствительные клетки линии mel Kor, которые экспрессируют рецептор CD95 и у которых не гиперэкспрессирован ген MDR1, наиболее устойчивые клетки линии mel Мtp clone X, у которых нет рецептора CD95/Fas и имеется гиперэкспрессия гена MDR1. 3.2.2. Липосомальная араноза Основной задачей данной диссертационной работы было изучение механизма действия липосомальных лекарственных форм противоопухолевых препаратов. Представленные выше характеристики меланомных клеточных линий и определение их чувствительности к аранозе позволили изучить влияние липосомальной лекарственной формы аранозы и отличие от лиофилизированной аранозы. Клеточная линия mel Mtp Цитотоксическое действие липосомальной аранозы определяли в МТТтесте после инкубации клеток с аранозой в течение 24, 48 и 72 ч. На рисунке 5 представлена средняя по 6 опытам кривая выживаемости клеток линии mel Mtp в зависимости от концентрации препарата. Обе лекарственной формы аранозы использовали в концентрациях от 0,056 до 0,9 мг/мл. 77 А Б В Рис. 5. Цитотоксическое действие лекарственных форм аранозы на клетки линии mel Mtp: А: 24 ч инкубации; Б: 48 ч инкубации; В: 72 ч инкубации. 78 Таблица 9 Ингибирующая концентрация лекарственных форм аранозы на клетки линии mel Mtp Лекарственные Время инкубации формы ИК50 аранозы- 24 ч 48 ч 72 ч Не достигнута 0,9 мг/мл 0,518 мг/мл 0,824 мг/мл 0,481 мг/мл 0,068 мг/мл лио ИК50 липосомальной аранозы После инкубации лиофилизированной аранозы в течение 24 ч ИК50 не была достигнута. ИК50 липосомальной аранозы была 0,824 мг/мл (Табл.9). После 48 инкубации ИК50 липосомальной аранозы была в два раза ниже, чем у лиофилизированной аранозы, а после 72 ч инкубации – почти в 10 раз ниже (Табл.9). Различия статистически значимы. Таким образом, липосомальная араноза оказывала более выраженный цитотоксический эффект по сравнению с лиофилизированной аранозой, несмотря на отсутствие CD95/Fas рецептора. Клеточная линия mel Mtp clone X Следующим этапом работы было исследование чувствительности к аранозе клеток mel Mtp clone X. Эти клетки не экспрессировали рецептор CD95/Fas, не имели мРНК этого рецептора, но гиперэкспрессировали ген множественной лекарственной устойчивости. 79 А Б Рис. 6. Цитотоксическое действие лекарственных форм аранозы на клетки линии mel Mtp clone Х: А: 24 ч инкубации; Б: 48 ч инкубации. Как видно из рисунка 6, клетки линии mel Mtp clone X были устойчивы к лиофилизированной аранозе после инкубации в течение 24 и 48 ч. ИК50 не была достигнута (Табл.10). ИК50 для липосомальной аранозы была достигнута в гораздо больших концентрациях, чем для родительской линии mel Mtp, что возможно связано с гиперэкспрессией MDR1 гена. 80 Таблица 10 Ингибирующая концентрация лекарственных форм аранозы на клетки линии mel Mtp clone X Лекарственные формы Время инкубации ИК50 аранозы-лио ИК50 липосомальной 24 ч 48 ч Не достигнута Не достигнута 1,606 мг/мл 1,643 мг/мл аранозы Клеточная линия mel Z Клетки mel Z характеризуются отсутствием на своей поверхности рецептора CD95/Fas, но имеют мРНК этого рецептора. Таблица 11 Ингибирующая концентрация лекарственных форм аранозы на клетки линии mel Z Время инкубации Лекарственные формы ИК50 аранозы- 24 ч 48 ч 72 ч Не достигнута Не достигнута 0,646 мг/мл Не достигнута 0,716 мг/мл 0,531 мг/мл лио ИК50 липосомальной аранозы 81 А Б В Рис. 7. Цитотоксическое действие лекарственных форм аранозы на клетки линии mel Z: А: 24 ч инкубации; Б: 48 ч инкубации; В: 72 ч инкубации. 82 Цитотоксическое действие лиофилизированной аранозы отсутствовало при инкубации клеток в течение 24 и 48 ч (Рис. 7, Табл.11). Через 72 ч ИК50 составило 0,646 мг/мл. Липосомальная араноза действовала более эффективно. Хотя через 24 ч ИК50 не была достигнута, через 48 ч она составила 0,716 мг/мл. Через 72 ч действие обеих форм аранозы было одинаковым. Следовательно, для цитотоксического действия липосомальной аранозы не требуется экспрессия CD95/Fas рецептора. Клеточная линия mel Kor Клетки mel Kor были чувствительны к действию лиофилизированной аранозы. После инкубации клеток в присутствии аранозы в течение 24 ч ИК50 была 0,806 мг/мл (Рис. 8,9; Табл.12). Через 48 ч ИК50 была 0,662 мг/мл, а через 72 ч - 0,188 мг/мл. Цитотоксический эффект был дозо- зависимым. Цитотоксическое действие липосомальной аранозы на эти клетки было аналогичным (Рис. 8,9; Табл.12). Из этого можно заключить, что на CD95/Fas положительных клетках цитотоксический эффект не зависит от лекарственной формы аранозы. Таблица 12 Ингибирующая концентрация лекарственных форм аранозы на клеточной линии mel Kor. Лекарственные формы Время инкубации 24 ч 48 ч 72 ч ИК50 аранозы-лио 0,806 мг/мл 0,662 мг/мл 0,188 мг/мл ИК50 0,666 мг/мл 0,338 мг/мл 0,161 мг/мл липосомальной аранозы 83 А Б В Рис. 8. Цитотоксическое действие лекарственных форм аранозы на клетки линии mel Kor: А: 24 ч инкубации; Б: 48 ч инкубации; В: 72 ч инкубации. 84 Рис. 9. Пятидесяти процентная ингибирующая концентрация лекарственных форм аранозы на клеточной линии mel Kor. 85 двух Клеточная линия mel Ibr А Б В Рис. 10. Цитотоксическое действие лекарственных форм аранозы на клетки линии mel Ibr: А: 24 ч инкубации; Б: 48 ч инкубации; В: 72 ч инкубации. 86 Таблица 13 Ингибирующая концентрация лекарственных форм аранозы на клетки линии mel Ibr Лекарственные Время инкубации формы ИК50 аранозы- 24 ч 48 ч 72 ч Не достигнута 0,9 мг/мл 0,45 мг/мл 0,9 мг/мл 0,368 мг/мл 0,112 мг/мл лио ИК50 липосомальной аранозы Клетки mel также Ibr были чувствительны к действию лиофилизированной аранозы при инкубации в течение 48 и 72 ч. ИК50 была 0,9 и 0,45 мг/мл соответственно. После 24 ч ИК50 не была достигнута (Табл.13). Липосомальная араноза также не оказывала действие при инкубации в течение 24 ч. Однако, в дальнейшем она оказывала более значимые эффекты по сравнению с лиофилизированной аранозой. Таким образом, сравнение цитотоксического действия двух лекарственных форм аранозы показало, что липосомальная араноза более эффективна и на ее цитотоксическое действие не влияет ни отсутствие CD95/Fas рецептора, ни гиперэкспрессия гена множественной лекарственной устойчивости (Табл. 17). Вывод: Липосомальная араноза более эффективна по сравнению с лиофилизированной лекарственной формой и на ее цитотоксическое действие не влияет ни отсутствие CD95/Fas рецептора, ни гиперэкспрессия гена множественной лекарственной устойчивости. 87 3.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАТИСТИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ РАЗЛИЧИЙ В ПРОЦЕНТЕ ЖИВЫХ КЛЕТОК ПОСЛЕ ИНКУБАЦИИ КЛЕТОК С ДВУМЯ ЛЕКАРСТВЕННЫМИ ФОРМАМИ АРАНОЗЫ Результаты сравнения процента выживших клеток меланомы линии mel Mtp представлены в (Рис. 11, Табл.14). Как видно из таблицы, через 24 ч липосомальная араноза в концентрациях 0,9 и 0,45 мг/мл статистически значимо сильнее оказывала цитотоксическое действие на эти клетки. При других концентрациях статистически значимых различий не обнаружили. Через 48 ч липосомальная араноза оказывала статистически значимое большее цитотоксическое действие по сравнению с лиофилизированной аранозой почти во всех концентрациях (Рис. 11, Табл.14). Однако через 72 ч эти различия стали статистически не значимы. Таким образом можно сделать вывод, что липосомальная араноза оказывает более сильное цитотоксическое действие на CD95/Fas- отрицательные клетки по сравнению с лиофилизированной аранозой при инкубации в течение 48 ч. Результаты сравнения процента выживших клеток меланомы линии mel Z представлены в (Рис. 12, Табл. 15). Как видно из таблицы, через 24 ч обе лекарственные формы аранозы были неактивны и ИК50 не была достигнута. Через 48 ч ИК50 для лиофилизированной аранозы не было достигнута, а для липосомальной аранозы она составила 0,716 мг/мл. Статистически значимые различия были при концентрациях 0,112 и 0,056 мг/мл. Через 72 ч было выявлено статистически значимое различие в тех же концентрациях. Из этого можно заключить, что различия в эффективности липосомальной аранозы проявляются при низких концентрациях препарата. Результаты сравнения процента выживших клеток меланомы линии mel Kor представлены в (Рис. 13, Табл.16). Как видно из таблицы, эффект обеих лекарственных форм аранозы статистически значимо не различался. 88 Аналогичные результаты получили при использовании клеток меланомы линии mel Ibr. Эффект обеих лекарственных форм аранозы статистически значимо не различался (Рис. 14, Табл. 17). 89 Таблица 14 Процент живых клеток на клеточной линии mel Mtp при культивировании с аранозой Концентрация препарата, (мг/мл) Время инкубации, Лекарственные формы аранозы (ч) Р Араноза-лио 0,9 0,45 0,225 0,112 0,056 0,9 0,45 0,225 0,112 0,056 0,9 0,45 0,225 0,112 0,056 24 48 72 74,9 ± 20,3 90,2 ±14,9 94,4 ± 8,6 96,1 ± 6,2 95,9 ± 6,1 51,6 ± 11,5 66,8 ± 8,4 79,3 ± 6,6 85,1 ± 8,1 88,8 ± 6,9 31,6 ± 4,0 53,6 ± 5,1 63,0 ± 8,6 68,3 ± 10,1 74,0 ± 12,4 90 Липосомальная араноза 47,3 ± 14,2 72,3 ± 13,1 84,8 ± 15,0 89,1 ± 12,9 92,1 ± 8,5 33,6 ± 12,9 51,0 ± 15,6 62,8 ± 14,3 76,0 ± 12,3 76,0 ± 12,3 25,0 ± 14,7 37,0 ± 18,7 42,0 ± 13,4 45,6 ± 14,0 53,0 ± 18,3 0,02 0,05 0,20 0,26 0,39 0,02 0,05 0,02 0,16 0,05 0,49 0,21 0,08 0,08 0,17 Таблица 15 Процент живых клеток на клеточной линии mel Z при культивировании с аранозой Концентрация препарата, (мг/мл) Время инкубации, (ч) Лекарственные формы аранозы Р Араноза-лио 0,9 0,45 0,225 0,112 0,056 0,9 0,45 0,225 0,112 0,056 0,9 0,45 0,225 0,112 0,056 24 48 72 63,7 ± 19,6 80,7 ± 17,7 85,2 ± 16,6 89,9 ± 12,4 91,9 ± 10,8 53,2 ± 19,1 73,2 ± 9,1 85,7 ± 14,0 96,9 ± 3,5 99,9 ± 0,0 40,5 ± 23,0 57,5 ± 14,1 71,2 ± 15,6 90,4 ± 15,2 97,4 ± 2,9 91 Липосомальная араноза 57,7 ± 12,6 69,2 ± 24,4 83,0 ± 11,9 88,2 ± 7,9 90,0 ± 4,2 44,2 ± 16,4 68,0 ± 9,4 77,5 ± 14,9 85,5 ± 9,1 88,7 ± 11,3 35,7 ± 19,5 52,5 ± 14,2 60,5 ± 15,8 70,0 ± 14,3 82,4 ± 11,9 0,62 0,47 0,83 0,82 0,74 0,50 0,45 0,45 0,05 0,09 0,76 0,63 0,37 0,09 0,05 Таблица 16 Процент живых клеток на клеточной линии mel Kor при культивировании с аранозой Концентрация препарата, (мг/мл) Время инкубации, (ч) Лекарственные формы аранозы Р Араноза-лио 0,9 0,45 0,225 0,112 0,056 0,9 0,45 0,225 0,112 0,056 0,9 0,45 0,225 0,112 0,056 24 48 72 47,0 ± 26,0 69,3 ± 25,7 75,6 ± 29,6 84,3 ± 21,3 91,2 ± 14,9 32,6 ± 14,9 51,6 ± 9,2 67,6 ± 15,1 84,6 ± 8,5 92,6 ± 2,8 24,5 ± 19,0 37,0 ± 11,3 45,0 ± 5,6 60,0 ± 8,4 71,5 ± 6,3 92 Липосомальная араноза 44,6 ± 13,6 58,3 ± 15,8 68,3 ± 16,5 81,0 ± 18,2 91,2 ± 14,9 36,0 ± 8,7 45,0 ± 3,4 55,3 ± 4,5 75,6 ± 6,6 87,0 ± 4,35 28,5 ± 19,0 35,5 ± 7,7 42,0 ± 4,2 56,5 ± 9,1 66,5 ± 9,1 0,89 0,56 0,73 0,84 1,00 0,75 0,30 0,24 0,22 0,13 0,85 0,89 0,60 0,73 0,59 Таблица 17 Процент живых клеток на клеточной линии mel Ibr при культивировании с аранозой Концентрация препарата, (мг/мл) Время инкубации, (ч) Лекарственные формы аранозы Р Араноза-лио 0,9 0,45 0,225 0,112 0,056 0,9 0,45 0,225 0,112 0,056 0,9 0,45 0,225 0,112 0,056 24 48 72 74,9 ± 16,8 81,7 ± 12,5 90,2 ± 13,1 92,9 ± 9,0 93,7 ± 9,9 51,2 ± 19,3 68,0 ± 24,0 82,9 ± 20,6 90,2 ± 11,2 94,9 ± 5,7 41,5 ± 14,8 50,0 ± 15,5 79,5 ± 19,0 97,9 ± 2,7 99,9 ± 0,0 93 Липосомальная араноза 54,9 ± 29,9 72,9 ± 18,9 90,2 ± 11,7 93,4 ± 11,6 99,9 ± 0,0 37,5 ± 4,4 45,0 ± 13,0 60,2 ± 19,9 71,2 ± 16,3 80,5 ± 14,2 21,0 ± 1,4 32,5 ± 12,0 41,5 ± 30,4 50,5 ± 37,4 60,0 ± 38,1 0,28 0,47 1,00 0,94 0,26 0,21 0,14 0,16 0,10 0,10 0,19 0,33 0,27 0,21 0,27 * р ≤ 0,05 А * * * * р ≤ 0,05 Б Рис. 11. Процент живых клеток на клеточной линии mel Mtp при культивировании с аранозой (начало) 94 В Рис. 11. Процент живых клеток на клеточной линии mel Mtp при культивировании с аранозой (окончание) А: 24 ч инкубации; Б: 48 ч инкубации; В: 72 ч инкубации. А Рис. 12. Процент живых клеток на клеточной линии mel Z при культивировании с аранозой (начало) 95 * р ≤ 0,05 Б * р ≤ 0,05 В Рис. 12. Процент живых клеток на клеточной линии mel Z при культивировании с аранозой (окончание) А: 24 ч инкубации; Б: 48 ч инкубации; В: 72 ч инкубации. 96 А Б В Рис. 13. Процент живых клеток на клеточной линии mel Kor культивировании с аранозой А: 24 ч инкубации; Б: 48 ч инкубации; В: 72 ч инкубации. 97 при А Б В Рис. 14. Процент живых клеток на клеточной линии mel Ibr при культивировании с аранозой А: 24 ч инкубации; Б: 48 ч инкубации; В: 72 ч инкубации. 98 Сравнение чувствительности клеточных линий к цитотоксическому действию аранозы показало, что наибольшую цитотоксичность вызывала араноза в клетках mel Kor. Эти клетки сохраняли рецептор CD95/Fas и не экспрессировали pgp170. Эти клетки могут служить как положительный контроль. В связи с этим мы сравнили статистическую значимость различий в чувствительности клеточных линий к апоптозу по сравнению с этой линией. Кроме того, было проверено различие между линиями. Было обнаружено, что клетки mel Kor отличались по чувствительности к аранозе от других клеток (Рис.4). Наиболее существенные различия были с клетками линии mel Z. Статистически значимые различия были при инкубации в течение 48 ч с концентрацией аранозы 0,45 мг/мл ( P<0,02), 0,112 мг/мл (P<0,044), 0,056 мг/мл (P<0,006) и при 72 ч инкубации с концентрацией 0,056 мг/мл (Р<0,001). Как видно, эффект был значимым при низких концентрациях препарата. Тем не менее, он подтверждает утверждение, что отсутствие рецептора CD95/Fas на поверхностной мембране делает клетки более резистентными к противоопухолевым препаратам. Сравнение чувствительности к аранозе клеток mel Kor и mel Mtp clone X выявило статистически значимые различия при 48 ч инкубации с концентрацией 0,45 мг/мл (P<0,049). Похожие результаты получили при сравнении чувствительности к аранозе клеток mel Kor и mel Mtp и выявили статистически значимые различия при 48 ч инкубации с концентрацией 0,45 мг/мл (P<0,042). При сравнении чувствительности к аранозе клеток линии mel Ibr, в 50 % клеток которой гиперэкспрессирован ген MDR1, с MDR1- отрицательными клетками mel Kor обнаружили, что они статистически значимо устойчивы при инкубации в течение 72 ч с концентрациями препарата 0,112 и 0,056 мг/мл (P<0,026 и 0,024 соотвественно). Таким образом, можно сделать заключение, что клетки линий mel Z, mel Mtp и mel Mtp clone X (у всех клеток отсутствует рецептор CD95/Fas) более 99 чувствительны к цитотоксическому действию аранозы по сравнению CD95/Fas-положительной линией mel Kor. Заключение Проведенное исследование показало, что клетки линий меланомы кожи различаются по чувствительности к цитотоксическому действию аранозы. Наиболее чувствительные клетки линии mel Kor, которые экспрессируют рецептор CD95 и у которых не гиперэкспрессирован ген MDR1. Наиболее устойчивые клетки линии mel Mtp clone X, mel Mtp и mel Z, у которых нет рецептора CD95/Fas. Клетки mel Ibr и mel Mtp clone X с гиперэкспрессией гена MDR1 также более устойчивы к лиофилизированной аранозе по сравнению с клетками mel Kor. Липосомальная араноза более эффективна лиофилизированной лекарственной формой по сравнению с и на ее цитотоксическое действие не влияет ни отсутствие CD95/Fas рецептора, ни гиперэкспрессия гена множественной лекарственной устойчивости. 100 3.4. ЦИТОТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ДВУХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ OR-2011 НА МЕЛАНОМНЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ Нами было проведено сравнение цитотоксического действия двух лекарственных форм нового противоопухолевого вещества из класса производных нитрозометилмочевины ормустина. Исследование проводили на 3 клеточных линиях: mel Kor, которые экспрессировали рецептор CD95/Fas и не имели гиперэкспрессию гена MDR1; mel Z, которые не экспрессировали рецептор CD95/Fas и не имели гиперэкспрессию гена MDR1; mel Ibr, которые экспрессировали рецептор CD95/Fas и имели гиперэкспрессию гена MDR1. Результаты представлены в рисунках 15-20 и таблицах 18-20. OR-2011 был более активный по сравнению с аранозой и вызывал ИК50 в меньших дозах. На клетках mel Kor при инкубации с OR-2011 в течение 24 ч ИК50 была достигнута при концентрации субстанции 0,197 мг/мл, а через 48 и 72 ч 0,161 и 0,053 мг/мл соответственно. Липосомальная форма OR-2011 действовала при меньшей концентрации (Табл. 19). На клетках mel Z при инкубации с OR-2011 в течение 24 ч ИК50 была достигнута при концентрации субстанции 0,102 мг/мл, а через 48 и 72 ч 0,064 и 0,053 мг/мл соответственно. Липосомальная форма OR-2011 действовала при концентрации в два раза меньшей (Табл.18). На клетках mel Ibr при инкубации с OR-2011 в течение 24 ч ИК50 была достигнута при концентрации субстанции 0,287 мг/мл, а через 48 и 72 ч 0,275 и 0,180 мг/мл соответственно. Липосомальная форма OR-2011 действовала при концентрации 0,110 мг/мл, 0,175мг/мл и 0,078 мг/мл через 24, 48 и 72 ч соответственно (Табл. 20). Таким образом, OR-2011 оказывает цитотоксическое действие при меньших концентрациях по сравнению с аранозой. Также как липосомальная араноза, липосомальный OR-2011 оказывает большее цитотоксическое 101 действие по сравнению с субстанцией. Цитотоксическое действие OR-2011 проявляется на CD95/Fas – отрицательной линии и pgp170 положительной линии клеток. Таблица 18 Ингибирующая концентрация лекарственных форм OR-2011 на клетки линии mel Z Лекарственные формы Время инкубации 24 ч 48 ч 72 ч ИК50 OR-2011 лио 0,102мг/мл 0,064 мг/мл 0,053 мг/мл ИК50 липосомального 0,060 мг/мл 0,032 мг/мл 0,027 мг/мл OR-2011 Таблица 19 Ингибирующая концентрация лекарственных форм OR-2011 на клетки линии mel Kor Лекарственные формы Время инкубации 24 ч 48 ч 72 ч ИК50 OR-2011 лио 0,197 мг/мл 0,161 мг/мл 0,053 мг/мл ИК50 0,130 мг/мл 0,083 мг/мл 0,029 мг/мл липосомального OR-2011 102 Таблица 20 Ингибирующая концентрация лекарственных форм OR-2011 на клетки линии mel Ibr Лекарственные формы ИК50 OR-2011 Время инкубации 24 ч 48 ч 72 ч 0,287 мг/мл 0,275 мг/мл 0,180 мг/мл 0,110 мг/мл 0,175 мг/мл 0,078 мг/мл лио ИК50 липосомального OR-2011 103 А Б В Рис. 15. Цитотоксическое действие лекарственных форм OR - 2011 на клетки линии mel Z : А: 24 ч инкубации; Б: 48 ч инкубации; В: 72 ч инкубации. 104 А Б В Рис.16. Цитотоксическое действие лекарственных форм OR - 2011 на клетки линии mel Kor: А: 24 ч инкубации; Б: 48 ч инкубации; В: 72 ч инкубации. 105 А Б В Рис. 17. Цитотоксическое действие лекарственных форм OR - 2011 на клетки линии mel Ibr: А: 24 ч инкубации; Б: 48 ч инкубации; В: 72 ч инкубации. 106 Рис. 18. Пятидесяти процентная ингибирующая концентрация двух лекарственных форм OR - 2011 на клеточной линии mel Kor. Рис. 19. Пятидесяти процентная ингибирующая концентрация двух лекарственных форм OR - 2011 на клеточной линии mel Z. 107 Рис. 20. Пятидесяти процентная ингибирующая концентрация двух лекарственных форм OR - 2011 на клеточной линии mel Ibr. 108 3.5. ВЛИЯНИЕ ДВУХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ АРАНОЗЫ НА ИНДУКЦИЮ АПОПТОЗА В КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА Для определения влияния аранозы на индукцию апоптоза использовали метод двойного прижизненного окрашивания клеток Аннексином V-FITC и Пропидием йодидом (PI), позволяющий выявлять клетки на ранних или поздних стадиях апоптоза. Клетки инкубировали в 6-луночных планшетах в течение 24 ч с аранозойлио или с липосомальной аранозой в концентрациях 450 мг/мл и 900 мг/мл, после чего с помощью проточной цитометрии определяли процент клеток на различных стадиях клеточной гибели: в раннем апоптозе (AnV+/PI–), позднем апоптозе (AnV+/PI+) или некрозе (AnV–/PI+). Исследование проводили на CD 95-положительной линии mel Kor и на CD95-отрицательных клеточных линиях меланомы человека mel Mtp, mel Mtp clone X и mel Z. Из рисунка 21 и таблицы 21 видно дозозависимое действие обеих лекарственных форм аранозы на индукцию апоптоза и некроза в клеточной линии mel Kor. Количество клеток в раннем апоптозе снижается при увеличении концентрации обеих лекарственных форм препарата, а количество клеток в позднем апоптозе или некрозе соответственно увеличивается. Липосомальная форма аранозы действует немного эффективнее, чем араноза-лио. Количество клеток в раннем апоптозе после инкубации с липосомальной формой немного ниже, чем после инкубации с аранозой-лио, а количество клеток в позднем апоптозе и некрозе – выше. Араноза-лио в исследованных дозах не индуцирует гибель клеточной линии mel Z. Липосомальная араноза вызывает дозозависимый эффект: после инкубации с препаратом в концентрации 450 мг/мл количество клеток в раннем апоптозе составляет 11,1%, в позднем апоптозе – 20,6%, а после инкубации с препаратом в концентрации 900 мг/мл количество клеток в 109 раннем апоптозе возрастает до 26,0%, в позднем апоптозе – до 52,6%. Некротической гибели на этой клеточной линии не наблюдали (Рис. 22, Табл. 21). Клеточная линия mel Mtp оказалась наиболее устойчива к обеим лекарственным формам аранозы после 24 ч инкубации (Рис. 23,Табл. 21). Араноза-лио оказала слабый эффект в концентрации 900 мг/мл – количество клеток в раннем апоптозе – 9,5%, в позднем – 6,7%. Липосомальная араноза оказала схожий эффект в меньшей концентарции 450 мг/мл: количество клеток в раннем апоптозе – 10,2%, в позднем – 6,3%. Чуть более выраженный эффект липосомальной аранозы в концентрации 900 мг/мл: ранний апоптоз – 11,8%, поздний – 11,2%. На клеточной линии mel Mtp clone X араноза-лио вызывала невыраженную индукцию апоптоза только в концентрации 900 мг/мл. После 24 ч инкубации с липосомальной аранозой в концентрации 450 мг/мл количество клеток в раннем апоптозе составило 28,7%, а в позднем апоптозе – 28,6%, после инкубации липосомального препарата в концентарции 900 мг/мл количество клеток в раннем апоптозе составило 82,8% и 5,7% – в позднем (Рис. 24,Табл. 21). 110 Таблица 21 Определение соотношения Аннексина V-FITC и PI на клеточных линиях меланомы после 24 ч инкубации с лекарственными формами аранозы Клеточные Живые Ранние Поздние Некротичес- линии клетки апоптотическ апоптотичес- кие клетки меланом (AnV–/PI–), ие % (AnV+/PI–), % mel Kor Препараты Интактный клетки кие клетки (AnV–/PI+), % (AnV+/PI+), % 90,1 2,8 6,8 0,3 63,5 14,8 20,4 1,3 25,4 4,2 49,3 21,2 58,2 9,8 27,5 4,4 15,4 2,3 48,9 33,5 92,8 1,2 5,8 0,1 92,0 1,4 5,6 0,1 92,9 2,6 4,4 0,2 66,8 11,1 20,6 1,5 18,7 26,0 52,6 2,6 контроль Араноза-лио, 450 мг/мл Араноза-лио, 900 мг/мл Липосомальная араноза, 450 мг/мл Липосомальная араноза, 900 мг/мл mel Z Интактный контроль Араноза-лио, 450 мг/мл Араноза-лио, 900 мг/мл Липосомальная араноза, 450 мг/мл Липосомальная араноза, 900 мг/мл 111 mel Mtp Интактный Таблица 21 (продолжение) 90,5 4,1 5,3 0,1 89,7 5,8 4,4 0,0 83,7 9,5 6,7 0,1 83,5 10,2 6,3 0,1 76,8 11,8 11,2 0,1 88,0 4,6 4,5 2,8 84,8 8,2 4,4 2,5 80,8 10,3 7,5 1,4 40,9 28,7 28,6 1,8 11,3 82,8 5,7 0,1 контроль Араноза-лио, 450 мг/мл Араноза-лио, 900 мг/мл Липосомальная араноза, 450 мг/мл Липосомальная араноза, 900 мг/мл mel clone X Mtp Интактный контроль Араноза-лио, 450 мг/мл Араноза-лио, 900 мг/мл Липосомальная араноза, 450 мг/мл Липосомальная араноза, 900 мг/мл 112 0,3% 6,8% 1,3% 20,4% 90,1% 2,8% 63,5% 14,8% А Б 4,4% 27,5% 21,2% 49,3% 58,2% 9,8% 25,4% 4,2% В Г 33,5% 48,9% 15,4% 2,3% Д Рис. 21. Распределение клеток линии mel Kor после 24 ч инкубации с лекарственными формами аранозы: А – интактный контроль; Б – клетки после инкубации с 450 мг/мл аранозы-лио; В – клетки после инкубации с 450 мг/мл липосомальной аранозы; Г – клетки после инкубации с 900 мг/мл аранозы-лио; Д – клетки после инкубации с 900 мг/мл липосомальной аранозы. 113 0,1% 5,8% 0,1% 5,6% 92,8% 1,2% 92,0% 1,4% Б А 1,5% 20,6% 0,2% 4,4% 66,8% 11,1% 92,9% 2,6% Г В 2,6% 52,6% 18,7% 26,0% Д Рис. 22. Распределение клеток линии mel Z после 24 ч инкубации с лекарственными формами аранозы: А – интактный контроль; Б – клетки после инкубации с 450 мг/мл аранозы-лио; В – клетки после инкубации с 450 мг/мл липосомальной аранозы; Г – клетки после инкубации с 900 мг/мл аранозы-лио; Д – клетки после инкубации с 900 мг/мл липосомальной аранозы. 114 0,1% 5,3% 0,0% 4,4% 90,5% 4,1% 89,7% 5,8% А Б 0,1% 6,3% 0,1% 6,7% 83,5% 10,2% 83,7% 9,5% В Г 0,1% 11,2% 76,8% 11,8% Д Рис. 23. Распределение клеток линии mel Mtp после 24 ч инкубации с лекарственными формами аранозы: А – интактный контроль; Б – клетки после инкубации с 450 мг/мл аранозы-лио; В – клетки после инкубации с 450 мг/мл липосомальной аранозы; Г – клетки после инкубации с 900 мг/мл аранозы-лио; Д – клетки после инкубации с 900 мг/мл липосомальной аранозы. 115 2,8% 4,5% 2,5% 4,4% 88,0% 4,6% 84,8% 8,2% А Б 1,8% 28,6% 1,4% 7,5% 40,9% 28,7% 80,8% 10,3% В Г 0,1% 11,3% 5,7% 82,8% Д Рис. 24. Распределение клеток линии mel Mtp clone X после 24 ч инкубации с лекарственными формами аранозы: А – интактный контроль; Б – клетки после инкубации с 450 мг/мл аранозы-лио; В – клетки после инкубации с 450 мг/мл липосомальной аранозы; Г – клетки после инкубации с 900 мг/мл аранозы-лио; Д – клетки после инкубации с 900 мг/мл липосомальной аранозы. 116 Заключение Показано, что араноза-лио оказывала выраженное действие в исследованных концентрациях только на CD-95-положительную клеточную линию mel Kor. На CD95-отрицательных линиях она либо вообще не вызывала клеточной гибели, либо оказывала слабо выраженное действие после инкубации с более высокой концентрацией препарата 900 мг/мл. Липосомальная форма аранозы на всех клеточных линиях действовала более эффективно и ее действие было дозозависимым. По-видимому, липосомальная форма препарата быстрее проникает в клетку, чем традиционный лиофилизат для инъекций. Возможно, это связано с механизмом проникновения липосомальной аранозы в клетки. 117 3.6. ПРЕОДОЛЕНИЕ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ АРАНОЗОЙ Гиперэкспрессия гена MDR1 была выявлена в двух клеточных линиях. В клетках mel Ibr мРНК гена MDR1 была повышена в 12 раз, а в клетках mel Mtp clone X – в 23 раза. Была изучена чувствительность выше охарактеризованных Исследование клеток проводили к в цитотоксическому МТТ тесте. Было действию аранозы. обнаружено, что лиофилизированная араноза, используемая в клинике для лечения больных, оказывала цитотоксическое действие на клетки меланомы линии mel Kor и не оказывала существенного влияния на клетки линий mel Ibr и mel Mtp clone X (Рис. 25). ИК50 для клеток mel Kor было в концентрации 0,9 мг/мл, а для других клеток не было достигнуто. Рис. 25. Определение цитотоксического действия лиофилизированной аранозы на клетки линии меланомы. Далее было проведено сравнение цитотоксического действия двух лекарственных форм аранозы – традиционной лиофилизированной и липосомальной. Как видно из рисунка 26, липосомальная араноза оказывала 118 цитотоксическое действие на все линии клеток. липосомальная устойчивость араноза преодолевает обусловленную Таким образом, множественную гиперэкспрессией гена лекарственную множественной лекарственной устойчивости. С целью изучения различий в механизме цитотоксического действия двух лекарственных форм аранозы определили индукцию раннего, позднего апоптоза и некроза с помощью окрашивания клеток Аннексином V-FITC и PI (Рис.21-24; Табл.21). Было обнаружено, что обе лекарственные формы аранозы в дозе 450 мг/мл индуцирует ранний и поздний апоптоз в клетках mel Kor, а в дозе 900 мг/мл индуцировали в этих клетках поздний апоптоз и некроз. Лиофилизированная араноза не индуцировала апоптоз в клетках mel Mtp clone X. Однако липосомальная араноза вызывала апоптоз в этих клетках. 119 Риc. 26. Сравнение цитотоксического действия лиофилизированной и липосомальной аранозы на клетки линии меланомы. Заключение 1. Лиофилизированная араноза не оказывает цитотоксическое действие на клетки гиперэкспрессирующие ген MDR1. 2.Липосомальная лекарственная форма аранозы преодолевает множественную лекарственную устойчивость и индуцирует апоптоз в клетках гиперэкспрессирующих ген MDR1. 120 Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ В наших исследованиях был изучен механизм действия липосомальных противоопухолевых препаратов из класса производных нитрозомочевины – аранозы, OR-2011. Использовали клеточные линии меланомы кожи человека, полученные в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН [36]. Были исследованы клеточные линии mel Mtp, mel Mtp clone X, mel Kor, mel Z и mel Ibr. Для более детальной характеристики этих клеточных линий было проведено изучение экспрессии антигенов CD95/Fas и гликопротеида pgp170 (продукта гена множественной лекарственной устойчивости MDR1). Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) является серьезным препятствием в терапии рака. Она проявляется уменьшением внутриклеточного накопления противоопухолевых препаратов и приводит к значительному снижению эффективности лечения. В последние годы появились работы, в которых для преодоления МЛУ используются липосомальные лекарственные формы препаратов [27; 64; 138]. Исследовали pgp170 методом проточной цитофлуориметрии, а также наличие в меланомных клетках мРНК генов CD95/Fas и MDR1 методом ПЦР. Клеточные линии меланомы различались по экспрессии CD95/Fas рецептора опосредующего апоптоза. Клетки линий mel Kor и mel Ibr экспрессировали белок и имели мРНК этого рецептора, клетки линий mel Mtp, mel Mtp clone X и антиген. Кетки mel Z mel Z не экспрессировали на своей поверхности были положительны, а клетки линий mel Mtp и mel Mtp clone X не имели мРНК антигена CD95/Fas. Кроме того, была исследована функция гликопротеида pgp170 по выбросу родамина. В клетках mel Ibr ген MDR1 гиперэкспрессирован, а 121 клетки mel Kor, mel Z и mel Mtp не экспрессируют pgp170. Клетки mel Mtp clone X имеют гиперэкспрессию неизвестного АВС транспортера. Различия в экспрессии рецептора CD95/Fas, опосредующего внешний апаптоз, и гликопротеида цитотоксического действия позволяли pgp170 определить различия лекарственных форм препарата и выявить возможные механизм действия липосомальных препаратов. Исследованные клеточные линии меланомы кожи человека проявили разную чувствительность к аранозе, которая по всей вероятности, связана с различными молекулярно-биологическими свойствами этих клеточных линий: разным статусом CD95/Fas рецептора, опосредующего апоптоз, и экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости. Наиболее чувствительные клетки линии mel Kor, которые экспрессируют рецептор CD95 и у которых не гиперэкспрессирован ген MDR1, а наиболее устойчивые клетки линии mel mtp clone X, у которых нет рецептора CD95/Fas и имеется гиперэкспрессия гена MDR1. Нами было установлено, что липосомальная араноза оказывала более выраженный цитотоксический эффект по сравнению с лиофилизированной аранозой. Для цитотоксического действия липосомальной аранозы не требуется экспрессия CD95/Fas рецептора и гиперэкспрессия гена множественной лекарственной устойчивости. Наиболее устойчивые клетки линии mel Mtp clone X, mel Mtp и mel Z, у которых нет рецептора CD95/Fas. Клетки mel Ibr и mel Mtp clone X с гиперэкспрессией гена MDR1 также более устойчивы к лиофилизированной аранозе по сравнению с клетками mel Kor. Наиболее чувствительные клетки линии mel Kor, которые экспрессируют рецептор CD95 и у которых не гиперэкспрессирован ген MDR1. Нами было проведено сравнение цитотоксического действия двух лекарственных форм нового противоопухолевого вещества из класса производных нитрозометилмочевины OR-2011. 122 OR-2011 оказывает цитотоксическое действие при меньших концентрациях по сравнению с аранозой. Также как липосомальная араноза, липосомальный OR-2011 оказывает большее цитотоксическое действие по сравнению с субстанцией. Цитотоксическое действие OR-2011проявляется на CD95/Fas – отрицательной линии и pgp170 положительной линии клеток. Для определения влияния аранозы на индукцию апоптоза использовали метод двойного прижизненного окрашивания клеток Аннексином V-FITC и Пропидием йодидом (PI), позволяющий выявлять клетки на ранней или поздней стадиях апоптоза. Араноза-лио оказывала выраженное действие в исследованных концентрациях только на CD95 положительную клеточную линию mel Kor. На CD95 отрицательных линиях она либо вообще не вызывала клеточной гибели, либо оказывала слабо выраженное действие после инкубации с более высокой концентрацией препарата 900 мг/мл. Липосомальная форма аранозы на всех клеточных линиях действовала более эффективно, и ее действие было дозозависимым. 123 ВЫВОДЫ 1. Клеточные линии меланомы кожи различаются по экспрессии CD95/Fas рецептора, опосредующего апоптоз. Клетки линий mel Mtp и mel Mtp clone X не экспрессируют CD95/Fas рецептор и не содержат мРНК гена этого рецептора. Клетки линии mel Z не экспрессируют рецептор, но содержат мРНК гена этого рецептора. Клетки линий mel Kor и mel Ibr экспрессируют CD95/Fas рецептор и имеют мРНК гена этого рецептора. 2. В клеточных линиях mel Mtp clone X и mel Ibr гиперэкспрессирован ген MDR1 множественной лекарственной устойчивости. 3. Клетки линий меланомы различаются по чувствительности к циототоксическому действию аранозы: клетки линии mel Kor чувствительны, а клетки линий mel Mtp clone X, mel Mtp, mel Z и mel Ibr ─ резистентны. 4. Липосомальная араноза индуцирует апоптоз в клетках меланомы независимо от экспрессии CD95/Fas рецептора внешнего апоптоза. 5. Липосомальная араноза индуцирует апоптоз в клетках меланомы независимо от экспрессии pgp170 – продукта гена MDR1 множественной лекарственной устойчивости. 6. Липосомальная араноза более эффективна по сравнению с лиофилизированной лекарственной формой и на ее цитотоксическое действие не влияет ни отсутствие CD95/Fas рецептора, ни гиперэкспрессия гена множественной лекарственной устойчивости. 7. В механизм цитотоксического действия липосомальной аранозы не вовлекается CD95/Fas сигнальный путь апоптоза. 124 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Альбассит, Б. Липосомальный противоопухолевый препарат ОR-2011 из класса нитрозомочевины для лечения меланомы / Б. Альбассит, М.Т. Зангиева, Н.В. Грищенко, М.А Барышникова, Е.В. Игнатьева, В.С. Косоруков, В.П. Краснов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2014. ─ Т.13. ─ № 1. ─ С. 59. 2. Альбассит, Б. Разработка липосомальной лекарственной формы нового соединения из класса нитрозоалкилмочевины / Б. Альбассит, М.А. Барышникова, Е.В. Игнатьева и др. // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2013. ─ № 2. ─ С.5. 3. Барышников, А.Ю. Программированная клеточная смерть (апоптоз) / А.Ю. Барышников, Ю.В. Шишкин // Российский онкологический журнал. ─ 1996. ─ № 1. ─ С. 58. 4. Барышников, А.Ю. Иммунологические проблемы апоптоза / А.Ю. Барышников, Ю.В. Шишкин. ─ М.: Эдиториал УРСС, 2002. ─ 320 с. 5. Барышников, А.Ю. Противоопухолевые препараты, разработанные в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н. Блохина РАМН / А.Ю. Барышников, Н.А. Оборотова, Г.К. Герасимова, И.Ю. Кубасова // Вестник Московского общества онкологов. ─ 2004. ─ № 11. ─ С. 3- 4. 6. Барышников, А.Ю. Наноструктурированные липосомальные системы как средство доставки противоопухолевых препаратов // Вестник РАМН. ─ 2012. ─ № 3. ─ С. 23-30. 125 7. Барышникова, М.А. Иммунолипосомы и мишени их действия / М.А. Барышникова, А.Ю. Барышников // Российский химический журнал. Журнал Российского химического общества им. Д.И.Менделеева 2012. ─Т. LVI, № 3 ─ 4. ─ С. 60-67. 8. Барышникова, М.А. Взаимодействие липидных нанокапсул с клеткой / М.А. Барышникова, М.Т. Зангиева, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2013. ─ Т.12, № 1. ─ С. 11-15. 9. Барышникова, М.А. Влияние лекарственных форм аранозы на индукцию апоптоза / М.А. Барышникова, Н.В. Грищенко, А.П. Полозкова // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2014. ─ Т. 13. ─ № 1. ─ С. 64. 10. Вишнякова, Х.С. Возможная роль активации аутофагии в стимуляции регенерации / Х. С. Вишнякова, К. В. Попов, Е. А. Воротеляк, Р.Р. Файзуллин, А. С. Артюхов, Е. Е. Егоров // Молекулярная биология. ─ 2013. ─ Т. 47, № 5. ─ С. 796-805. 11. Гланц, С.А. Медико-биологическая статистика.─ М.: Практика, 1998. ─ 459 c. 12. Горбачева, Л.Б. Актуальные проблемы фармакологии и поиск новых лекарственных препаратов / Л.Б. Горбачева, Г.В. Кукушкина, Н.М. Перетолчина // Труды конференции. ─ Томск, 1990. ─ Т.4. ─ С. 98-101. 13. Горбунова, В.А. Новые противоопухолевые препараты, созданные в России / В.А. Горбунова, Г.Н. Егоров, Н.С. Бесова и др. ─ М., 1999. ─ С. 1-23. 126 14. Гордеева, А.В. Апоптоз одноклеточных организмов: механизмы и эволюция / А.В. Гордеева, Ю.А. Лабас, Р.А. Звягильская // Биохимия. ─ 2004. ─ В. 10. ─ Т. 69. ─ С. 1301-1313. 15. Грищенко, Н.В. Липосомальные противоопухолевые препараты не используют CD95-зависимый сигнальный путь апоптоза / Н.В. Грищенко, М.А Барышникова, А.П. Полозкова, Н.А.Оборотова, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2014. ─ Т. 13, № 1. ─ С. 37 41. 16. Грищенко, Н.В. Сравнение цитотоксического действия лекарственных форм противоопухолевых препаратов из класса нитрозомочевины / Н.В. Грищенко, Б. Альбассит., М.А. Барышникова, Л.В. Ланцова, А.П. Полозкова, Н.А. Оборотова, В.П. Краснов, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2014. ─ Т. 13, № 1. ─ С. 49 ─ 53. 17. Гуревич, Д.Г. Влияние размеров липосом на уровень и селективность накопления тиосенса в опухоли / Д.Г. Гуревич, И.Г. Меерович, Г.А. Меерович // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2007. ─ Т. 6, № 2. ─ С. 45-49. 18. Давыдов, М.И. Экспериментальная онкология на рубеже веков / М.И. Давыдов, А.Ю. Барышников ─ М.: 2003. ─ С. 147-159. 19. Заридзе, Д.Г. Канцерогенез / Под ред. Заридзе Д.Г. ─ М.: Медицина, 2004. ─ 576 с. 20. Зиновкин, Д.А. Смерть человека. Некроз, апоптоз и атипические типы гибели клетки / Д.А Зиновкин, Д.А Надыров, Л.А. 127 Мартемьянова. ─ Гомель: учреждение образования «Гомельский государственный медицинский университет», 2012. ─ 40 с. 21. Клаан, Н.К. Ядерный фактор каппа в (NF-KB) в качестве мишеней для действия природных противоопухолевых соединений / Н.К. Клаан, Т.А., Пронина, Л.П Акиньшина, В.В. Решетникова // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2014. ─ Т. 13, № 1. ─ С. 3-8. 22. Козеев, С.Г. Разработка липосомальной лекарственной формы противоопухолевого препарата араноза: автореф. дис. канд. фарм. наук: 14.04.01 / Козеев Сергей Геннадьевич. ─ М., 2013. ─ 24 с. 23. Кольман, Я., К.- Г. Рем. Наглядная биохимия: перевод с немецкого. ─ М.: «Мир». ─ 2004. ─ С. 382-383. 24. Корман, Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии. ─ М.: Практическая медицина, 2006. ─ 512 с. 25. Краснов, В.П. Нитрозомочевины на основе аминокислот. Оригинальный противоопухолевый препарат лизомустин / В.П. Краснов, Г.Л. Левит, М.А. Барышникова, Н.С. Сапрыкина, Н.М. Перетолчина, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2013. ─ Т. 12, № 2. ─ С. 46. 26. Кузнецов, С.Л., Мушкамбаров Н.Н. Гистология, цитология и эмбриология: Учебник для медицинских вузов. ─ М: ООО «Медицинское информационное агентство», 2007. ─ 600 с. 27. Ланцова, А.В. Сравнительное изучение противоопухолевой активности липосомальных лекарственных форм 128 препаратов производных нитрозоалкилмочевины / А.В. Ланцова, Н.А Оборотова, Н.М. Перетолчина, А.П. Полозкова, 3.С. Шпрах, И.Б. Шоуа, А.Ю. Барышников // Сибирский онкологический журнал. ─ 2005. ─ Т. 14, № 2. ─ С. 25-29. 28. Ланцова, А.В. Изучение противоопухолевой активности нано- структурированной липосомальной формы лизомустина in vivo /А.В. Ланцова, Н.С. Сапрыкина, Е.В. Санарова, Н.А. Оборотова // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2012. ─ Т. 11, №2.─ С. 32. 29. Ланцова, А.В. Изучение в системе in vitro наноструктурированной лекарственной формы лизомустина /А.В. Ланцова, М.А. Барышникова, Е.В. Санарова и др. // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2012.─ Т.11, № 2. ─ С.31. 30. Левачева, И.С. Направленная доставка противоопухолевых препаратов липосомами / И.С. Левачева, М.А. Барышникова // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2012. ─ Т.11, № 2. ─ С.32. 31. Льюин, Б. Клетки / Б. Льюин. ─ М.: БИНОМ, 2011. ─ 951 с. 32. Манских, В.Н. Пути гибели клетки и их биологическое значение / В.Н. Манских // Цитология. ─ 2007. ─ Т. 49, № 11. ─ С. 909-915. 33. Меерович, И.Г. Применение липосом в фотохимиотерапии: Липосомы в ФДТ / И.Г. Меерович, Н.А. Оборотова // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2003. ─ Т.2, № 4. ─ С. 3- 8. 34. Меерович, И.Г. Применение липосом в фотохимиотерапии: Липосомальные формы для создания фотоактивируемых липосомальных препаратов в фотобиологических исследованиях / И.Г. Меерович, Н.А. 129 Оборотова //Российский биотерапевтический журнал. ─ 2004. ─ Т.3, № 1. ─ С. 6-12. 35. Михайлова, И.Н. Клеточные линии меланомы – основа для создания противоопухолевых вакцин / И.Н. Михайлова, М.И. Лукашина, А.Ю. Барышников и др. // Вестник РАМН. ─ 2005. ─ № 7. ─ С. 37- 40. 36. Михайлова, Т.В. Разработка липосомальной формы противоопухолевой вакцины / Т.В. Михайлова, М.А. Барышникова, О.В. Клименко и др. //Российский биотерапевтический журнал. ─ 2011. ─ Т.10, № 4. ─ С. 62-8. 37. Оборотова, Н.А. Основные проблемы создания лекарственных форм противоопухолевых препаратов для внутривенного введения // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2003. ─ Т. 2, №2. ─ С. 27-31. 38. Оборотова, Н.А. 30 лет лаборатории разработки лекарственных форм ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН / Н.А. Оборотова, П.В. Лопатин // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2004. ─ Т. 3, №4. ─ С. 3-7. 39. Оборотова, Н.А. Роль новых фармацевтических технологий в повышении избирательности действий противоопухолевых препаратов / Н.А. Оборотова, Е.В. Санарова // Российский химический журнал. ─ 2012. ─ Т. LVI, № 3─ 4. ─ С. 33-40. 40. Островская, Л.А. Препараты класса нитрозоалкилмочевин в отечественной противоопухолевой химиотерапии / Л.А. Островская, Д.Б. Корман, Н.П. Дементьева, М.М. Фомина, Н.В. Блюхтерова // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2004. ─ Т. 3, № 1. ─ С. 24- 36. 130 41. Островская, Л.А. Хлонизол – новый эффективный противоопухолевый препарат класса нитрозоалкилмочевин / Л.А. Островская, В.А. Филов, Б.А. Ивин, А.Н. Стуков, М.М. Фомина, Н.В. Блюхтерова, В.А Рыкова, А.А. Кондратов // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2004. ─ Т. 3, № 1. ─ С. 37-48. 42. Преображенская, М.Н. Новое противоопухолевое средство араноза / М.Н. Преображенская, П.В. лекарственное Лопатин, Н.И. Переводчикова и др. // II Российский конгресс Человек и лекарство. ─ М.: 1995. ─ С. 203. 43. Проскуряков, С.Я. Некроз – активная, управляемая форма программируемой клеточной гибели / С.Я. Проскуряков, В.Л Габай, А.Г. Коноплянников // Биохимия. – 2002. – Т. 67 (4), С. 467-491. 44. Радина, Л.Б., Беляев А.А., Краснов В.П. и соавт. Патент РФ 1744946. ─ Приоритет 1989 г. ─ 26.05.1998. // Бюлл. Изобрет. ─ 1998. ─ № 31. 45. Рыжов, С.В. Молекулярные механизмы апоптотических процессов / С.В. Рыжов, В.В. Новиков // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2002. ─ Т. 1, № 3. ─ С. 27- 33. 46. Рябая, О.О. Влияние активирующих мутаций V600 гена B – RAF на способность клеток меланомы к аутофагии / О.О. Рябая, И.В. Цыганова, Т.А. Сидорова, О.С. Бурова, Е.В. Степанова // Экспериментальная онкология. ─ 2013. ─ № 3. ─ С. 68-72. 47. Саквина, О.И. Липосомы препаратов / О.И. в направленной доставке противоопухолевых Саквина, А.Ю. Барышников // биотерапевтический журнал. ─ 2008. ─ Т. 7, № 4. ─ С. 80 - 85. 131 Российский 48. Самуилов, В.Д. Программируемая клеточная смерть / В.Д. Самуилов, А.В. Олескин, Е.М. Лагунова // Биохимия. ─ 2006. ─ 65. 1029-1046 с. 49. Скибо, Ю.В. Методы исследования программируемой клеточной гибели: Учебно-методическое пособие для магистров по курсу «Теория апоптоза» / Ю.В. Скибо, З.И. Абрамова. - Казань: ФГАОУ ВПО КФУ, 2011. ─ 61 с. 50. Славина, Е.Г. Модификация фактором некроза опухоли (ФНО – альфа) цитотоксического и апоптотического действия противоопухолевых лекарств в клетках меланом человека / Е.Г. Славина, Х.А. Бигвава, Т.Н. Заботина и др. // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2009. ─ Т. 8, № 4. ─ С. 37-49. 51. Смирнова, З.С. Эффективность и фармакокинетика липосомальной лекарственной формы фотосенсибилизатора «Фотосенс» на основе сульфафталоцианина / З.С. Смирнова, Н.А. Оборотова, О.А. Макарова и др // Химико – фармацевтический журнал. ─ 2005. ─ Т. 39, № 7. ─ С. 3-7. 52. Тазина, Е.В. Особенности инкапсулирования лекарственных препаратов в липосомы / Е.В. Тазина, К.В. Костин, Н.А. Оборотова // Химико – фармацевтический журнал. ─ 2011. ─ Т. 45, № 8. ─ С. 30-40. 53. Уткин, О.В. Экспрессия CD95/FAS в клетках крови при раке толстой кишки / О.В. Уткин, Н.А., Сахарнов, Н.Б. Преснякова, Д.В. Новиков, А.В. Алясова, В.В. Новиков, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2013. ─ Т. 12, № 1. ─ С. 23- 29. 54. Фильченков, А.А. Визуализация и оценка апоптоза, вызванного противоопухолевой терапией: клинические перспективы / Фильченков // Онкология журнал. ─ 2011. ─ Т. 13, № 4. ─ С. 266-277. 132 А.А. 55. Фильченков, А.А. Апоптоз и рак / А.А. Фильченков, Р.С. Стойка - К.: Морион, 1999. – 184 с. 56. Харкевич, Г.Ю. Отечественные препараты нитрозомочевины в лечении меланомы кожи класса производных / Г.Ю. Харкевич, Г.Н. Егоров, Л.В. Манзюк, Л.В. Демидов // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2004. ─ Т. 3, № 1. ─ С. 72-76. 57. Шадрина, А.В. Биофармацевтические исследования липосомального лизомустина / А.В. Шадрина, Н.М. Перетолчина, А.П. Полозкова, З.С., Шпрах, Н.А. Оборотова, А.Ю. Барышников // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2004. ─ Т. 3, № 1. ─ С. 49-53. 58. Шоуа, И.Б. Действие липосомального доксорубицина на клетки линии, экспрессирующие активный pgp 170 / И.Б. Шоуа, А.П. Полозкова, Н.А. Оборотова // Российский биотерапевтический журнал. ─ 2004. ─ Т. 3, № 1. ─ С. 20-23. 59. Эмануэль, Н.М. Экспериментальное изучение противоопухолевой активности нового нитрозометилмочевины углеводсодержащего / Н.М. Эмануэль, Островская, Д.Б. Корман, Ж.А. Джаманбаев производного В.А. // Афанасьев, Л.А. Сб. Химиотерапия опухолей в СССР. – М., 1980. – Вып. 32. – С. – 35- 42. 60. Эмануэль, Н.М. Нитрозо-алкилмочевины – новый класс противоопухолевых препаратов / Н.М. Эмануэль, Д.Б. Корман, Л.А. Островская и др. – М.: Наука. - 1978. – 285 с. 133 61. Anichini, A. APAF-1 signaling in human melanoma / A. Anichini, R. Mortarini, M. Sensi, M. Zanon // Cancer Lett. ─ 2006. ─ Vol. 238(2). ─ Р. 168 -179. 62. Arico, S. The tumor suppressor PTEN positively regulates macroautophagy by inhibiting the phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B pathway / S. Arico, A. Petiot , C. Bauvy , P.F. Dubbelhuis , A.J. Meijer , P. Codogno , E. Ogier-Denis // J. Biol Chem. ─ 2001. ─ Vol. 276(38). ─ Р. 35243 - 35246. 63. Azakawa, M. Effect of ACNU on leukemia L-1210 / M. Azakawa, F. Simizu, N. Okava // Gann. ─ 1974. ─ Vol. 65. – P. 191-196. 64. Bajelan, E. Co-delivery of doxorubicin and PSC 833 (Valspodar) by stealth nanoliposomes for efficient overcoming of multidrug resistance / E. Bajelan, A. Haeri, A.M. Vali, S.N. Ostad, S. Dadashzadeh // J. Pharm Sci. ─ 2012. ─ Vol. 15(4). ─ P. 568-582. 65. Barnhart, B.C. The CD95 type I/type II model / B.C. Barnhart, E.C. Alappat, M.E. Peter // Semin. Immunol. ─ 2003. ─ Vol. 15. ─ P. 185-193. 66. Bertrand, M.J. clAP1 and clAP2 facilitate cancer cell survival by functioning as E3 ligases that promote RIP1 ubiguitination / M.J. Bertrand, S. Milutinovic, K.M. Dickson, W.C. Ho, A. Boudreauit, J. Durkin et al. // Mol Cell. ─ 2008. ─ Vol.30. ─ P. 689-700. 67. Boiardi, A. Fotemustine combined with procarbazine in recurrent malignant gliomas: a phase I study with evaluation of lymphocyte 06-alkylguanine-DNA alkyltransferase activity / A. Boiardi, A. Sievani, E. Ciusani Neurooncol. ─ 2001. ─ Vol. 52(2). ─ Р. 149-156. 134 et al. // J. 68. Bouchard, V.J. PARP-1, a determinant of cell survival in response to DNA damage / V.J. Bouchard, M. Rouleau, G.G. Poirier // Exp Hematol. ─ 2003. ─ Vol. 31(6). ─ Р. 446-454. 69. Bourut, C. Cytostatic action of two nitrosoureas derived from cycteamine / C. Bourut, E. Chenu, D. Goldeneche et al. // Brit. J. Pharmacol. ─ 1986. ─ Vol. 89. ─ P. 539-546. 70. Budd, R.C. Death receptors couple to both cell proliferation and apoptosis / R.C. Budd // J. Clin. Invest. ─ 2002. ─ Vol. 109(4).─ P. 437-442. 71. Carson, D.A. Cancer progression and p53 / D.A. Carson // Lancet. ─ 1995. ─ Vol. 346. ─ P. 1009-1011. 72. Castedo, M. Cell death by mitotic catastrophe: a molecular definition / M. Castedo, J.-L. Perfettini, T. Roumier, K. Andreau, R. Medema, G. Kroemere // Oncogene. ─ 2004. ─ Vol. 23. ─ P. 2825-2837. 73. Chang, H.Y. Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases / H.Y. Chang, X. Yang // Microbiol. and Mol. Biol. Rev. ─2000. ─ Vol. 64(4). ─ P. 821-846. 74. Chen, X.M. Multiple TLRs are expressed in human cholangiocytes and mediate host epithelial defense responses to Cryptosporidium parvum via activation of NF-kappaB / X.M. Chen, S.P. O'Hara, J.B. Nelson, P.L. Splinter, A.J. Small, P.S. Tietz, А.Н. Limper, N.F. LaRusso // J. Immunol. ─ 2005. ─Vol. 175(11). ─ Р. 7447-7456. 135 75. Copetti, T. p65/RelA modulates BECN1 transcription and autophagy / Т. Copetti, С. Bertoli, Е. Dalla, F. Demarchi, С. Schneider // Mol Cell Biol. ─ 2009. ─ Vol. 29. ─ Р. 2594-2608. 76. Criollo, A. Regulation of autophagy by the inositol trisphosphate receptor. Cell Death Differ / А. Criollo, M.C. Maiuri, E. Tasdemir, I.Vitale, A.A. Fiebig, D. Andrews, J. Molgo, J. Diaz, S. Lavandero, F. Harper, G. Pierron, D. di Stefano, R. Rizzuto, et al. // Cell Death Differ. ─ 2007. ─ Vol. 14(5). ─ Р. 1029-1039. 77. Criollo, A. IKK connects autophagy to major stress pathways / А.Criollo, L Senovilla, Н. Authier, М.С. Maiuri, Е. Morselli, I. Vitale, О. Kepp, Е. Tasdemir, L. Galluzzi, S. Shen, М. Tailler, N. Delahaye, А. Tesniere, et al. // Autophagy. ─ 2010. ─ Vol. 6(1). ─ Р. 189-191. 78. Criollo, A. The IKK complex contributes to the induction of autophagy / А. Criollo, L. Senovilla, H. Authier, M.C. Maiuri, E. Morselli, I.Vitale, O. Kepp, E. Tasdemir, L. Galluzzi, S. Shen, M. Tailler, N. Delahaye, A.Tesniere et al. // EMBO J. ─ 2010. ─ Vol. 29(3). ─ Р. 619-631. 79. Debatin, K.M. APO-1-induced apoptosis of leukemia cells from patients with adult T-cell leukemia / K.M Debatin, C.K Goldman, T.A. Waldman, P.H. Krammer // Blood. ─ 1993. ─ Vol. 81. ─ P. 2972-2977. 80. Debatin, K.M. CD95, apoptosis pathways and cancer therapy // Eur. J. Cancer. ─ 1999. ─ Vol. 35(4). ─ P. 336. 81. Degenhardt, T. The insulin-like growth factor-binding protein 1 gene is a primary target of peroxisome 136 proliferator-activated receptors / Т.Degenhardt , М. Matilainen , К.Н. Herzig , T.W. Dunlop ,С. Carlberg // J. Biol Chem. ─ 2006. ─ Vol. 281(51). ─ Р. 39607- 39619. 82. Denecker, G. Caspase-14 reveals its secrets / G. Denecker, P. Ovaere, P. Vandenabeele, W. Declercq // Cell Biol. ─ 2008. ─Vol. 180(3). ─ Р. 451- 458. 83. Deng, R. Acetylcholinesterase expression mediated by c-Jun-NH2-terminal kinase pathway during anticancer drug-induced apoptosis / R. Deng, W. Li, Z. Guan et al. // Oncogene. ─ 2006. ─ Vol. 25. ─ Р. 7070-7077. 84. Deveraux, Q.L. IAP family proteinssuppressors of apoptosis / Q.L. Deveraux, J.C. Reed // Genes and Development. ─ 1999. ─ Vol. 13. ─ P. 239-252. 85. Ea, C.K. Activation of IKK by TNFalfa reguires sitespecific ubiguitination of RIP1 and polyubiguitin binding by NEMO / C.K. Ea, L. Deng, Z.P. Xia, G. Pineda, Z.J. Chen et al. // Mol Cell. ─ 2006. ─ Vol. 22. ─ Р. 245-257. 86. Earnshaw, W.C. Mammalian caspases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis / W.C. Earnshaw, L.M. Martins, S.H. Kaufmann // Annu. Rev. Biochem. ─ 1999. ─ Vol. 68. ─ P. 383- 424. 87. Eckhart, L. Caspase-14: analysis of gene structure and mRNA expression during keratinocyte differentiation / L. Eckhart, J. Ban, H. Fischer, E. Tschachler // Biochem. Biophys. Res. Commun. ─ 2000. ─ Vol. 277(3). ─ Р. 655- 659. 88. Eckhart, L. Identification and characterization of a novel mammalian caspase with proapoptotic activity / L. Eckhart, С. Ballaun, А. Uthman, С. Kittel, М. Stichenwirth, М. Buchberger , Н. Fischer, W. Sipos, Е. Tschachler // J. Biol. Chem. ─ 2005. ─ Vol. 280. ─ Р. 35077-35080. 137 89. Eckhart, L. Cell death by cornification / L. Eckhart , S. Lippens , E . Tschachler , W. Declercq // Biochim Biophys Acta. ─ 2013. ─Vol . 1833(12). ─ Р. 3471-3480. 90. Edinger, A.L. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy / A.L. Edinger , C.B. Thompson // Curr Opin Cell Biol. ─ 2004. ─ Vol .6. ─ Р. 663669. 91. Fadok, Vol.A. Exposure of phosphatidylethanol-amine on the surface of apoptotic cells / Vol.A. Fadok , P.A . Voelker, J.J. Сampbell et. аl. // Exp. Cell. Res. ─ 1992. ─ Vol. 232. ─ P. 430-434. 92. Fazi, B. Fenretinide induces autophagis cell death in caspase-defective breast cancer cells / B. Fazi, W. Bursch, G.M. Fimia, R. Nardacci, M. Piacentini, F. Di Sano et al. // Autophagy. ─ 2008. ─ Vol. 4. ─ P. 435-441. 93. Ferri, K.F. Control of apoptotic DNA degradation / K.F. Ferri, G. Kroemer // Nat. Cell Biol. ─ 2000. ─ Vol. 2. ─ P. 63-64. 94. Fiers, W. More than one way to die: apoptosis, necrosis and reactive oxygen damage / W. Fiers , R. Beyaert , W. Declercq , Р. Vandenabeele // Oncogene. ─ 1999. ─ Vol. 18(54). ─ Р. 7719 -7730. 95. Furuya, N.. The evolutionarily conserved domain of Beclin 1 is required for Vps34 binding, autophagy and tumor suppressor function / N. Furuya, J. Yu, М. Byfield, S. Pattingre , В. Levine // Autophagy. ─ 2005. ─ Vol. 1(1). ─ Р. 46-52. 138 96. Galluzzi, L. Cell death modalities: classification and pathophysiological implications / L. Galluzzi, M.C. Maiuri, I. Vitale , H. Zischka, M. Castedo, L. Zilvogel et al. // Cell Death Differ. ─ 2007. ─ Vol. 14. ─ P. 1237-1243. 97. Galluzzi, L. Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012 / L. Galluzzi, I. Vitale, J.M. Abrams, E.S. Alnemri, E.H. Baehrecke et al. // Cell Death Differ. ─ 2012. ─ Vol. 19. ─ Р. 107-120. 98. Galluzzi, L. Mitochondria: master regulators of danger signaling / L. Galluzzi, O. Kepp, G. Kroemer // Nat Rev Мол Cell Biol. ─ 2012. ─ Vol. 13(12). ─ Р. 780-788. 99. Galluzzi, L. Molecular mechanisms of regulated necrosis / L. Galluzzi, O. Kepp, S. Krautwald, G. Kroemer, A. Linkermann // Semin Cell Dev Biol. ─ 2014. - PII: S1084-9521 (14) 00018-4. 100. Gastedo, M. Apoptosis regulation in tetraploid cancer cells / M. Gastedo, A. Coguelle, S. Vivet, I. Vitale, A. Kauffmann, P. Dessen et al. // EMBO J. ─ 2006. ─ Vol. 25. ─ Р. 2584-2595. 101. Gnewuch, C.T. A Critical Appraisal of the Evolution of N-Nitrosoureas as Anticancer Drugs / C.T. Gnewuch, G. Sosnovsky // Chem. Rev. ─ 1997. ─ Vol. 97(3). ─ Р. 829-1013. 102. Gorbacheva, L.B. Clinical and biochemical properties os a new nitrosourea 3 – aL- arabinopyranosyl 10 methyl -1- nitrosourea (CRC 0510375) / L.B. Gorbacheva, G.V. Kukushkina, T.A. Elknes et al. // Int. J. Exp. Clin. Chemotherapy. ─ 1993. ─ Vol. 6. ─ N. 1. 139 103. Gozuacik, D. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism / D. Gozuacik, А. Kimchi // Oncogene. ─ 2004. ─ Vol. 23(16). ─ Р. 2891-2906. 104. Grander, D. Autophagy as the main means of cytotoxicity by glucocorticoids in hematological malignancies / D. Grander, P. Kharazina, E. Laane, K. Pokrovskaja, T. Panaretakis // Autophagy. ─ 2009. ─ Vol. 5. ─ Р. 1198-1200. 105. Green, D.S. Human sodium channel gating defects caused by missense mutations in S6 segments associated with myotonia: S804F and V1293I / D.S. Green, A.L. Jr George, S.C. Cannon // J. Physiol. ─ 1998. ─ Vol. 510( 3). ─ Р. 685-694. 106. Green, D.R. Cytoplasmic functions of the tumour suppressor p53 / D.R. Green, G. Kroemer // Nature. ─ 2009. ─ Vol. 458. ─ Р.1127-1130. 107. Gu, S. High expression of APAF-1 elevates erythroid apoptosis in iron overload myelodysplastic syndrome / Gu S, Zhao Y, Guo J, Xu F, Fei C, Zhang X, Xiao C, Chang C, Li X // Tumour Biol. ─ 2014. ─ Vol. 35(3). ─ Р. 2211-2218. 108. Hait, W.N. The individualization of cancer therapy: the unexpected role of p53 / W.N. Hait , J.M. Yang // Trans Am Clin Climatol Assoc. ─ 2006. ─ Vol. 117. ─ Р. 85-101. 109. Hars, E.S. Autophagy regulates ageing in C. elegans / E.S. Hars, Н. Qi, A.G. Ryazanov, S. Jin, L. Cai, С. Hu, L.F. Liu // Autophagy. ─ 2007. ─ Vol. 3(2). ─ Р. 93-95. 140 110. Hauser, H.P. A giant ubiguitin – conjugatin enzyme related to IAP apoptosis inhibitors / H.P. Hauser, M. Bardroff, G. Pyrowolakis et al. // J. Cell Biol. ─ 1998. ─ Vol. 141. ─ P. 1415-1422. 111. He, C. Regulation mechanisms and signaling pathways of autophagy / C. He, D.J. Klionsky // Annu Rev Genet. ─ 2009. ─ Vol. 43. ─ Р. 67- 93. 112. Hetz, C. XBP-1 deficiency in the nervous system protects against amyotrophic lateral sclerosis by increasing autophagy / C. Hetz, P. Thielen, S. Matus, M. Nassif, F. Court, R. Kiffin, G. Martinez, A.M. Cuervo, R.H. Brown, L.H. Glimcher // Genes Dev. ─ 2009. ─ Vol. 23. ─ Р. 2294-2306. 113. Holler, N. Fas triggers an alternative, caspase-8-independent cell death pathway using the kinase RIP as effector molecule / N. Holler, R. Zaru , О. Micheau, М. Thome, А. Attinger, S. Valitutti, J.L. Bodmer, Р. Schneider, В. Seed, J. Tschopp // Nat Immunol. ─ 2000. ─ Vol. 1(6). ─ Р. 489-495. 114. Hoste, E. Caspase-14 is required for filaggrin degradation to natural moisturizing factors in the skin / E. Hoste, P. Kemperman, M. Devos, G. Denecker, S. Kezic, N. Yau, B. Gilbert, S. Lippens, P. De Groote, R. Roelandt, P. Van Damme, K. Gevaert, R.B. Presland, H. Takahara, G. Puppels, P. Caspers, P. Vandenabeele, W. Declercq // J. Invest Dermatol. ─ 2011. ─ Vol. 131(11). ─ Р. 2233-2241. 115. Hotchkiss, R.S. Cell death / R.S. Hotchkiss, А. Strasser, J.E. McDunn, P.E. Swanson // N Engl J. Med. ─ 2009. ─ Vol. 361 (16). ─ Р. 1570-1583. 116. Jacguillat, C. Final report on the French multicenter phase II study of the nitrosourea fotemustine in 153 evaluable patients with disseminated melanoma, 141 including patients with cerebral metastases / C. Jacguillat, D. Khayat, P. Banzer et al. // Cancer. ─ 1990. ─ Vol. 66. ─ Р. 1873-1878. 117. Juhász, G. The class III PI(3)K Vps34 promotes autophagy and endocytosis but not TOR signaling in Drosophila / G. Juhász, J.H. Hill, Y. Yan, М. Sass, Е.Н. Baehrecke , J.M. Backer, Т.Р. Neufeld // J. Cell Biol. ─ 2008. ─ Vol. 181(4). ─ Р. 655- 666. 118. Karantza-Wadsworth, V. Autophagy mitigates metabolic stress and genome damage in mammary tumorigenesis / V. Karantza-Wadsworth, S. Patel, O. Kravchuk , G. Chen, R . Mathew, S . Jin, E. White // Genes Dev. ─ 2007. ─ Vol. 21. ─ Р. 1621-1635. 119. Karin, M. Nuclear factor ─ kB in cancer development and progression / M. Karin // Nature. ─ 2006. ─ Vol. 441. ─ P. 431-436. 120. Kaushik, S. Chaperone-Mediated Autophagy / S. Kaushik, A. M. Cuervo, A.M. March. // Methods Mol Biol. ─ 2008. ─ Vol. 445. ─ P. 227-244. 121. Kayagaki, N. Metalloproteinase – mediated release of human Fas ligand / N. Kayagaki, А. Kawasaki, Т. Ebata, et al. // J. Exp. Med. ─ 1995. ─ Vol. 182. ─ P. 1777-1783. 122. Klionsky, D.J. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes / D.J. Klionsky, Н. Abeliovich, P. Agosting, D.K. Agrawal, G. Aliev, D.S. Askew et al. // Autophagy. ─ 2008. ─ Vol. 4. ─ Р. 151-175. 123. Krammer, P.H. The role of APO-1-mediated apoptosis in the immune system / P.H. Krammer, J. Dhein, Н. Walczak, I. Behrmann, S. Mariani, B. Matiba, М. 142 Fath, P.T. Daniel, E. Knipping, M.O. Westendorp et al. // Immunol Rev. ─ 1994 . ─ Vol.142. ─ Р. 175-191. 124. Kroemer, G. Caspase-independent cell death / G. Kroemer , S.J. Martin // Nat Med. ─ 2005. ─ Vol. 11. ─ Р. 725 -730. 125. Kroemer G. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death / G. Kroemer, L. Calluzzi, C. Brenner // Physiol Rev. ─ 2007. ─Vol. 87. ─ Р. 99163. 126. Kroemer, G. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2009 / G. Kroemer, L. Galluzzi, P. Vandenabeele, J. Abrams, E.H. Baehrecke et. аl. // Cell Death Differ. ─ 2009. ─ Vol. 16. ─ Р. 3-11. 127. Kundu, M. Autophagy: basic principles and relevance to disease / М. Kundu, С.В. Thompson // Annu Rev Pathol. ─ 2008. ─ Vol. 3. ─ Р. 427-455. 128. Kuwamoto, K. Identification of various types of α2-HS glycoprotein in sera of patients with pancreatic cancer: Possible implication in resistance to protease treatment / К. Kuwamoto, Y. Takeda, А. Shirai , Т. Nakagawa, S . Takeishi, S. Ihara, Y. Miyamoto, S. Shinzaki, J.H. Ko , Е. Miyoshi // Mol Med Rep. ─ 2010. ─ Vol. 3(4). ─ Р. 651- 656. 129. Laane, E. Cell death induced by dexamethasone jn lymphoid leukemia is mediated through initiation of autophagy / Е. Laane, К.Р. Tamm, Е. Buentke, К. Ito, Р. Kharaziha, J. Oscarsson et al. // Cell Death Differ. ─ 2009. ─ Vol. 16. ─ Р.1018-1029. 143 130. Levine, B. Autophagy in the pathogenesis of disease / В. Levine, G. Kroemer // Cell. ─ 2008. ─ Vol. 132. ─ Р. 27-42. 131. Levine, B. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy / В. Levine, D.J. Klionsky // Dev Cell. ─ 2004. ─ Vol. 6(4). ─ Р. 463-477. 132. Levine, B. Autophagy in cell death: an innocent convict? / В. Levine, J. Yuan // J. Clin Invest. ─ 2005. ─ Vol. 115(10). ─ Р. 2679-2688. 133. Li, H. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis / Н. Li, Н. Zhu, C.J. Xu // Cell. ─ 1998. ─ Vol. 94. ─ Р. 491-501. 134. Li, P. Cytochrome c and dATP- dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade / Р. Li, D.Nijhawan, I. Budihardjo, S.M. Srinivasula, М. Ahmad, E.S. Alnemri et al. // Cell. ─ 1997. ─ Vol. 91. ─ Р. 479-489. 135. Lippens, S. Epidermal differentiation does not involve the pro-apoptotic executioner caspases, but is associated with caspase-14 induction and processing / S. Lippens, М. Kockx, М. Knaapen, L. Mortier, R. Polakowska, А. Verheyen, М. Garmyn, А. Zwijsen, Р. Formstecher, D. Huylebroeck, Р. Vandenabeele, W. Declercq // Cell Death Differ. ─ 2000. ─ Vol. 7(12). ─ Р. 1218-1224. 136. Lockshin, R.A. Apoptosis, autophagy, and more / R.A. Lockshin, Z. Zakeri // Int J. Biochem Cell Biol. ─ 2004. ─ Vol. 36(12). ─ Р. 2405-2419. 144 137. Lockshin, R.A. Caspase-independent cell death? / R.A. Lockshin, Z. Zakeri // Oncogene. ─ 2004. ─ Vol. 23(16). ─ Р. 2766 -2773. 138. Lo, Y.L. Overcoming multidrug resistance using liposomal epirubicin and antisense oligonucleotides targeting pump and nonpump resistances in vitro and in vivo / Y.L. Lo, Y. Liu, J.C. Tsai // Biomed Pharmacother. ─ 2013. ─ Vol.67(4).─Р.261-267. 139. Lum, J.J. Growth factor regulation of autophagy and cell survival in the absence of apoptosis / J.J. Lum, D.E. Bauer, М. Kong, М.Н. Harris, С. Li, Т. Lindsten, С.В. Thompson // Cell. ─ 2005. ─ Vol. 120. ─ Р. 237-248. 140. Luo, X. Bid, a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors / Х. Luo, I. Budihardjo, Н. Zou, С. Slaughter, Х. Wang // Cell . ─ 1998. ─ Vol. 94. ─ Р. 481-490. 141. Lu, S.Z. Autophagy and cancer / S.Z. Lu, D.D. Harrison-Findik // World J Biol Chem. ─ 2013. ─ Vol. 4(3).─ Р. 64-70 142. Ma, L. Phosphorylation and functional inactivation of TSC2 by Erk implications for tuberous sclerosis and cancer pathogenesis. / L. Ma, Z. Chen, Н. Erdjument-Bromage, Р. Tempst , Р.Р. Pandolfi // Cell. ─ 2005. ─ Vol. 121. ─ Р. 179-193. 143. Madelmon, J.C. New cysteamine (2-chloroethyl) nitrosourea. Synthesis and preliminary antitumor results / J. C. Madelmon, D. Godeneche, D. Parry et al. // J. Med. Chem. ─ 1985. ─ Vol. 28. ─ P. 1346-1350. 145 144. Madeo, F. Autophagy for the avoidan-ce of neurodegeneration / F. Madeo, Т. Eisenberg, G. Kroemer // Genes Dev. ─ 2009. ─ Vol. 23. ─ Р. 2253- 2259. 145. Maiuri, M.C. Functional and physical interaction between Bcl-X(L) and a BH3-like domain in Beclin-1 / М.С. Maiuri, G. Le Toumelin, А. Criollo, J.C. Rain, F. Gautier, Р. Juin, Е. Tasdemir, G. Pierron, К. Troulinaki, N. Tavernarakis, J.A. Hickman, О. Geneste, G. Kroemer // EMBO J. ─ 2007. ─ Vol. 26. ─ Р. 2527-2539. 146. Maiuri, M.C. Crosstalk between apoptosis and autophagy within the Beclin 1 interactome / М.С.Maiuri, А. Criollo, G. Kroemer // Embo J. ─ 2010. ─ Vol. 29(3). ─ Р. 515-516. 147. Martinon, F. Inflammatory caspases: linking an intracellular innate immune system to autoinflammatory diseases / F. Martinon, J. Tschopp // Cell. ─ 2004. ─ Vol. 117(5). ─ Р. 561- 574. 148. Mathe, G. Phase I trial of cystemustine, a new cysteamine (2-chloroethyl) nitrosourea: an intrapatient escalation scheme / G. Mathe, J. L. Misset, В.К. Triano et al. // Drugs Exp. Clin. Res. ─ 1992. ─ Vol. 18. ─ P. 155-158. 149. Mehlen, P. Dependence receptors: froms basic research to drug development / P. Mehlen, D.E. Bredesen // Sci Signal. ─ 2011. ─Vol. 4(157). ─ mr 2. 150. Meijer, A.J. Regulation and role of autophagy in mammalian cells / A.J. Meijer, Р. Codogno / / Int J. Biochem Cell Biol. ─ 2004. ─ Vol. 36(12). ─ Р. 2445 - 2462. 146 151. Micheau, O. Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two seguential signaling complexes / О. Micheau, J. Tschop // Cell. ─ 2003. ─ Vol. 114. ─ Р. 181-190. 152. Mizushima, N. Protein turnover via autophagy: implications for metabolism / N. Mizushima, D.J. Klionsky // Annu Rev Nutr. ─ 2007. ─ Vol. 27. ─ Р. 19 40. 153. Mormone, E. Genotype-dependent priming to self- and xeno-cannibalism in heterozygous and homozygous lymphoblasts from patients with Huntington's disease / Е. Mormone , Р. Matarrese , А. Tinari, V. Maglione, M.G. Farrace, М. Piacentini, L. Frati, М. Cannella, W. Malorni, F. Squitieri // J. Neurochem. ─ 2006. ─ Vol. 98(4). ─ Р. 1090-1099. 154. Morselli, E. Autophagy mediates pharmacological lifespan extension by spermidine and resveratrol / Е. Morselli, L. Galluzzi, О. Kepp, А. Criollo, М.С. Maiuri, N. Tavernarakis, F. Madeo, G. Kroemer // Aging (Albany NY). ─ 2009. ─ Vol.1(12). ─ Р. 961-970. 155. Morselli, E. Anti- and pro-tumor functions of autophagy / Е. Morselli, L. Galluzzi, О. Kepp, J.M. Vicencio, А. Criollo, М.С. Maiuri, G. Kroemer // Biochim Biophys Acta. ─ 2009. ─ Vol. 1793. ─ Р.1524-1532. 156. Moreira, M.E. Apoptotic cell and phagocyte interplay: recognition and consequences in different cell systems / M.E. Moreira , M.A. Barcinski // An Acad Bras Cienc. ─ 2004. ─ Vol. 76(1). ─ P. 93-115. 157. Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Meth. ─ 1983. ─ Vol. 65. ─ P. 55-63. 147 158. Muñoz-Pinedo, C. Signaling pathways that regulate life and cell death: evolution of apoptosis in the context of self-defense // Adv Exp Med Biol. ─ 2012. ─ Vol. 738. ─ P. 124-143. 159. Nagata, S. Apoptosis by death factor // Cell. ─ 1997. ─ Vol. 88. ─ P. 355 365. 160. Nagata, S. Apoptotic DNA fragmentation // Exp. Cell Res. ─ 2000. ─ Vol. 256. ─ P. 12-18. 161. Nishino,_I. Autophagic vacuolar myopathies / I. Nishino // Curr Neurol Neurosci Rep. ─ 2003. ─ Vol. 3(1). ─ P. 64-69. 162. Okada, H. Pathways of apoptotic and non-apoptotic death in tumor cells / H. Okada, T. W. Mak // Nat. Rev. Cancer. ─ 2004. ─ Vol. 4. ─ P. 592-603. 163. Orcholski, M.E. Signaling via amyloid precursor-like proteins APLP1 and APLP2 / М.Е. Orcholski, Q. Zhang, D.E. Bredesen // J. Alzheimers Dis. ─ 2011. ─ Vol. 23(4). ─ Р. 689-699. 164. Papoff, G. Identification and characterization of a ligand-independent oligomerization domain in the extracellular region of the CD95 death receptor / G. Papoff, Р. Hausler, А. Eramo et al. // J. Biol. Chem. ─ 1999. ─ Vol. 274(53). ─ Р. 38241-38250. 165. Pattingre, S. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy / S. Pattingre, А. Tassa, Х. Qu, R. Garuti, X.H. Liang, N. Mizushima, М. Packer, M.D. Schneider, В. Levine // Cell. ─ 2005. ─ Vol. 122(6). ─ Р. 927-939. 148 166. Pattingre, S. Bcl-2 inhibition of autophagy: a new route to cancer?/ S. Pattingre, B. Levine //Cancer Res. - 2006. - Vol. 66(6). - Р. 2885 - 2888. 167. Peter, M.E. Does the Caenorhabditis elegans protein CED-4 contain a region of homology to the mammalian death effector domain?/ М.Е. Peter , J.P. Medema, P.H. Krammer // Cell Death Differ. ─ 1997. ─ Vol. 4(7). ─ Р. 523-525. 168. Pinkoski, M.J. Fas and Fas ligand in gut and liver / M.J. Pinkoski, Т. Brunner, D.R. Green et al. // Am. J. Physiol. Gastrointest. ─2000. ─ Vol. 278. ─ P. 354-366. 169. Poels, J. Expanding roles for AMP-activated protein kinase in neuronal survival and autophagy / J. Poels, M.R. Spasic, Р. Callaerts, К.К. Norga // Bioessays. ─ 2009. ─ Vol. 31. ─ Р. 944-952. 170. Polager, S. E2F1 regulates autophagy and the transcription of autophagy genes / S. Polager, М. Ofir, D. Ginsberg // Oncogene. ─ 2008. ─ Vol. 27. ─ Р. 4860-4864. 171. Proskuryakov, S.Y. Necrosis: a specific form of programmed cell death? / S.Y. Proskuryakov, A.G. Konoplyannikov, V.L. Gabai // Exp Cell Res. ─ 2003. ─ Vol. 283(1). ─ Р. 1-16. 172. Qu, X. Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development / Х. Qu, Z. Zou, Q. Sun, К. Luby-Phelps, Р. Cheng, R.N. Hogan, С. Gilpin , В. Levine // Cell. ─ 2007. ─ Vol. 128. ─ Р. 931946. 149 173. Rathmell, J.C. The central effectors of cell death in the immune system / J.C. Rathmell, С.В. Thompson // Annu. Rev. Immunol. ─ 1999. ─ Vol. 17. ─ P. 781-828. 174. Rieder, C.L. Mitosis and checkpoints that control progression through mitosis in vertebrate somatic cells / C.L. Rieder , А. Khodjakov A // Prog Cell Cycle Res. ─ 1997. ─ Vol. 3. ─ Р. 301-312. 175. Roninson, I. B., Broude E. V., Chang B.-D. If not apoptosis, then what? Treatment-induced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells / I.В. Roninson, E.V. Broude, B.D. Chang // Drug Resist. Updates. ─ 2001. ─ Vol. 4. ─ Р. 303-313. 176. Russell, P. Cds25 functions as an inducer in the mitotic control of fission yeast / Р. Russell, Р. Nurse // Cell. ─ 1986. ─ Vol. 45. ─ Р. 145-153. 177. Saleh, M. Differential modulation of endotoxin responsiveness by human caspase-12 polymorphisms / М. Saleh, J.P. Vaillancourt, R.K. Graham, М. Huyck, S.M. Srinivasula, E.S. Alnemri, М.Н. Steinberg, V. Nolan, С.Т. Baldwin, R.S. CHotchkiss, T.G. Buchman, В.А. Zehnbauer, M.R. Hayden, L.A. Farrer, S. Roy, D.W. Nicholson // Nature. ─ 2004. ─ Vol. 429 (6987). ─ Р. 75-79. 178. Scaffidi, C. Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways / С. Scaffidi, S. Fulda, А. Srinivasan et al. // EMBO J. ─ 1998. ─ Vol. 17(6). ─ Р. 1675- 1687. 179. Schneider, P. TRAIL receptors 1 (DR4) and 2 (DR5) signal FADD-dependent apoptosis and activate NF-kappaB / Р. Schneider, М. Thome, К. Burns, J.L. Bodmer, К. Hofmann, Т. Kataoka, N. Holler, J. Tschopp // Immunity. ─ 1997. ─Vol. 7(6). ─ Р. 831-836. 150 180. Shimizu, S. Role of Bcl-2 family proteins in a non –apoptotic programmed cell death dependent on autophagy genes / S. Shimizu, Т. Kanaseki, N. Mizushima, Т. Mizuta, S. Arakava-Kobayashi, С.В. Thompson et al. // Nat Cell Biol. ─ 2004. ─ Vol. 6. ─ Р. 1221-1228. 181. Srinvasula, S.M. Molecular ordering of the Fas-apoptotic pathway: the Fas/APO-1 protease Mch5 is a CrmA-inhibitable protease that activates multiple Ced-3/ICE-like cysteine proteases / S.M. Srinvasula, М. Ahmad, Т. Fernandes-Alnemri, G. Litwack, E.S. Alnemri // Proc Natl Acad Sci U S A. ─ 1996. ─Vol. 93(25). ─ Р. 14486-14491. 182. Staibano, S. Overexpression of cyclin-D1, bcl-2, and bax proteins, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), and DNA-ploidy in squamous cell carcinoma of the oral cavity / S. Staibano, M.D. Mignogna, L. Lo Muzio , L. Di Alberti, E. Di Natale, A. Lucariello, E. Mezza, E. Bucci, G. DeRosa // Hum Pathol. ─ 1998. ─ Vol. 11. ─ Р. 1189-1194. 183. Talloczy, Z. Regulation of starvation- and virus-induced autophagy by the eIF2alpha kinase signaling pathway / Z. Talloczy, W . Jiang, Virgin HWt, D.A. Leib, D. Scheuner, R.J. Kaufman, E.L. Eskelinen, B. Levine // Proc Natl Acad Sci U S A. ─ 2002. ─ Vol. 99. ─ Р. 190-195. 184. Tam, B.T. Autophagic cellular responses to physical exercise in skeletal muscleт / B.T. Tam , P.M. Siu // Sports Med. ─ 2014. ─ Vol. 44(5). ─ P. 625-640. 185. Tasdemir, E. Regulation of autophagy by cytoplasmic p53 / E. Tasdemir, M.C. Maiuri, L. Galluzzi, I. Vitale, M. Djavaheri-Mergny, M. D'Amelio, A. 151 Criollo, E. Morselli, C. Zhu, F. Harper, U. Nannmark, C. Samara, Р. Pinton, et al. // Nat Cell Biol. ─ 2008. ─ Vol. 10. ─ Р. 676-687. 186. Thornbery, N.A. Caspases: enemies within / N.A. Thornbery, Y. Lazebnik // Science. ─ 1998. ─ Vol. 281. ─ P. 1312-1316. 187. Thornberry, N.A. Caspases: key mediators of apoptosis // Chem Biol. ─ 1998. ─ Vol. 5(5). ─ Р. 97-103. 188. Tomasini, R. Tap73 knockout shows genomic instability with infertility and tumor suppressor functions et al. / R. Tomasini, K. Tsuchihara, M. Wilheim, M. Fujitani, A. Rufini, C.C. Cheung // Genes Dev. ─ 2008. ─ Vol. 22. ─ P. 2677-2691. 189. Trauth, B.C. Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis / B.C. Trauth, C.А. Klass, A. M.J. Peters et. аl. // Science. ─ 1989. ─ Vol. 245. ─ P. 301-305. 190. Tripathi, L.P. Genome-wide survey of prokaryotic serine proteases: analysis of distribution and domain architectures of five serine protease families in prokaryotes / L.P. Tripathi, R. Sowdhamini // BMC Genomics. ─ 2008. ─ Vol. 9. ─ Р. 549. 191. Vakilametoglu, H. DNA damage induces two distinct modes of cell death in ovarian carcinomas / H. Vakilametoglu, M. Olsson, C. Tamm, N. Heidari, S. Orrenius, B. Zhivotovsky // Cell Death Differ. ─ 2008. ─ Vol. 15. ─ P. 555566. 152 192. Vandenabeele, P. Molecular mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion / P.Vandenabeele , L. Galluzzi , T. Vanden Berghe , G. Kroemer // Nat Rev Mol Cell Biol. ─ 2010. ─ Vol. 11(10). ─ Р. 700-714. 193. Vanden Berghe, T. Regulated necrosis: the expanding network of nonapoptotic cell death pathways / T. Vanden Berghe, А. Linkermann, S. JouanLanhouet, Н. Walczak, Р. Vandenabeele // Nat Rev Mol Cell Biol. ─ 2014. ─ Vol.15(2). ─ Р.135-147. 194. Vicencio, J.M. The inositol 1,4,5-trisphosphate receptor regulates autophagy through its interaction with Beclin 1 / J.M. Vicencio, С. Ortiz, А. Criollo, A.W. Jones, О. Kepp, L. Galluzzi, N. Joza, I. Vitale, Е. Morselli, М. Tailler, М. Castedo, M.C. Maiuri, J. Molgo, et al. // Cell Death Differ. ─ 2009. ─ Vol.16. ─ Р. 1006-1017. 195. Vitale, I. Mitotic catastrophe: a mechanism for avoiding genomic instability / I. Vitale, L. Galluzzi, М. Castedo, G. Kroemer // Nat Rev Mol Cell Biol. ─ 2011. ─ Vol. 12(6). ─ Р. 385-392. 196. Vousden, K.H. p53 and metabolism / K.H. Vousden, K.M. Ryan // Nat Rev Cancer. ─ 2009. ─ Vol. 9. ─ Р. 691-700. 197. Wajant, H. The Fas signaling pathway more than a paradigm / H. Wajant // Science. ─ 2002. ─ Vol. 296. ─ P. 1635-1636. 198. Walczak, H. The CD95 (APO-1/Fas) and the TRAIL (APO-2L) apoptosis systems / H. Walczak, P.H. Krammer // Exp Cell Res. ─ 2000. ─ Vol. 256(1). ─ P. 58-66. 153 199. Wei, Y. JNK1-mediated phosphorylation of Bcl-2 regulates starvationinduced autophagy / Y. Wei, S. Pattingre, S. Sinha, M. Bassik, B. Levine // Mol Cell. ─ 2008. ─ Vol. 30. ─ Р. 678-688. 200. Yin, X.M. Bid-deficient mice are resistant to Fas – induced hepatocellular apoptosis / X.M. Yin, K. Wang, A. Gross, Y. Zhao, S. Zinkel, B. Klocke et al. // Nature. ─ 1999. ─ Vol. 400. ─ P. 886-891. 201. Yousem, S.A. The histopathology of BRAF-V600E-mutated lung adenocarcinoma / S.A. Yousem, M. Nikiforova, Y. Nikiforov // Am J Surg Pathol. ─ 2008. ─ Vol. 32(9). ─ Р. 1317-1321. 202. Zhao, Y. Downregulation of p21 in myelodysplastic syndrome is associated with p73 promoter hypermethylation and indicates poor prognosis / Y. Zhao, J. Guo, X Zhang, Z. Zhang, S. Gu, C. Fei, X. Li, С. Chang // Am J Clin Pathol. ─ 2013. ─ Vol. 140(6). ─ Р. 819- 827. 203. Zhong, Y. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex / Y. Zhong, Q.J. Wang, X. Li, Y. Yan, J.M. Backer, B.T. Chait, N. Heintz, Z. Yue // Nat Cell Biol. ─ 2009. ─ Vol. 11. ─ Р. 468- 476. 204. Zong, W.X. Alkylating DNA damage stimulates a regulated form of necrotic cell death / W.X. Zong, D. Ditsworth, D.E. Bauer, Z.Q. Wang, С.B. Thompson et. аl. // Genes Dev. ─ 2004. ─ Vol.18. ─ P. 1272-1282. 154