Основные направления развития дезинтеграции клеток и

Основные направления развития дезинтеграции клеток и области её
применения
Под дезинтеграцией (деструкцией) клеток понимают процесс необратимого
нарушения анатомической целостности клеток. С практической точки зрения необходимым и достаточным является разрыв клеточной оболочки, который может быть вызван
различными повреждающими факторами - физическими, механическими, химическими,
энзиматическими, биологическими. В природных условиях дезинтеграция клеток и клеточных систем вызывается внутриклеточными (внутренними) и внешними причинами. К
внутренним причинам можно отнести факторы генетической природы. К различным
внешним воздействиям можно отнести физические, физико-химические, химические и
биологические факторы. Причем любой из этих факторов при достаточной интенсивности
и продолжительности может стать дезинтегрирующим. Вызванную действием
внутренних факторов дезинтеграцию обычно определяют как естественную.
Наряду с естественной дезинтеграцией бывает искусственная (насильственная)
дезинтеграция. Последняя целенаправленно применяется человеком и часто используется
в научной и производственной деятельности.
При этом основной задачей дезинтеграции является извлечение функционально
активных структур и биополимеров.
В настоящее время можно определить три направления практического применения
методов искусственной дезинтеграции клеточных систем:
1.
Дезинтеграция биомассы (животной, растительной, микробной) для
производства продуктов пищевого, кормового и технического назначения.
2.
Дезинтеграция
как
способ
стерилизации
и
инактивации живых систем.
3.
Дезинтеграция как инструмент для направленного разрушения клеток и
клеточных систем в научной деятельности.
Первое и второе направление традиционны. Биомасса подвергается комплексному
внеклеточному дезинтегрирующему разрушению (механическому, химическому и
энзиматическому), а затем продукты распада (дезинтеграты) используются для биосинтеза.
Второе направление применяет методы, в том числе биологические, направленные на
тотальное уничтожение или полное, желательно необратимое, прекращение жизнедеятельности вредных и болезнетворных микроорганизмов и других вредителей
различной природы. Они могут применяться для консервации и хранения продуктов, в
борьбе с инфекционными болезнями, для обеззараживания различных сред и материалов.
Третье направление получило название инструментальной дезинтеграции клеток и
осуществляется с помощью специальных технических средств - дезинтеграторов. Особенно интенсивное развитие инструментальная дезинтеграция получила в период бурного
развития современной экспериментальной биологии, которая подошла к изучению и
расшифровке молекулярно-метаболической организации живой клетки. Это потребовало
создания инструментальных средств и методов для искусственного разрушения клеток и
выделения содержащихся в ней биоструктур и макромолекулярных компонентов.
Инструментальная дезинтеграция клеток возникла сравнительно недавно и встретила
определенные трудности. В случае дезинтеграции некоторых клеток растений и микроорганизмов наблюдается исключительно высокая механическая прочность клеточных
стенок, для разрушения таких структур необходимы высокоинтенсивные воздействия.
Применение таких воздействий приводит к крайне нежелательным явлениям инактивации,
модификации и деградации извлекаемых из дезинтегрируемой клетки целевых
компонентов. В этом заключается одна из основных проблем инструментальной
дезинтеграции.
Механические свойства клеток
Плазматическая мембрана клеток обеспечивает целостность и автономность от
окружающей среды, устойчивость к осмоактивным факторам, упругость, газо- и водопроницаемость, проницаемость для большого числа веществ различной природы,
распределение на клеточной поверхности электрических зарядов, ферментов, специальных
структур и образований и является очень сложным по структуре межфазным граничным
образованием, которое постоянно адаптируется к изменениям внутри- и внеклеточной
сред. Клетки характеризуются такими параметрами, как геометрические размеры,
плотность, прочность и упруго-вязкие свойства оболочки. Величины этих параметров
влияют на вероятность их разрушения при дезинтеграции, а особенно на прочностные
характеристики клеток. В зависимости от прочности клеток для их разрушения могут быть
использованы различные методы дезинтеграции.
Методы разрушения клеток
На процесс разрушения оказывает влияние окружающая среда. Она может
выступать как пассивный передатчик энергии (механической, тепловой) от
дезинтегратора к клетке, и как активный элемент процесса, интенсивно воздействующий на клеточные оболочки (химическое, химико-экстрактивное,
энзиматическое и различные анизоосмотические воздействия). В эту среду выходят
после разрушения оболочки целевые клеточные компоненты и претерпевают в ней
изменения.
Сдвиг
Клетка во льду. Применение ступок с абразивом, шаровых мельниц, дробилок и
экструдеров высокого давления для разрушения замороженных клеток указывает, что
причины разрушения клеток и микрочастиц твердых тел во многом подобны. В теории
измельчения считается общепринятым, что разрушение частицы твердого тела
происходит под действием сил удара, раздавливания и среза. Истирание и экструзия
замороженных клеток качественно рассматривается с точки зрения «твердого сдвига».
При экструзии происходят фазовые переходы льда, а также во внимание
принимается абразивная роль неоднородностей в структуре льда, мелких частиц
абразива и клеток. При этом считается, что основной причиной разрушения клеток в
экструзионных и истирающих дезинтеграторах является сдвиговое течение твердой
среды при температурах не ниже -35°С, в дробилках и мельницах, работающих при
более низкой температуре, преобладает разрушение пластично-хрупкого и чисто
хрупкого характера.
Жидкий сдвиг. Этот вид сдвига часто рассматривают для объяснения причин
дезинтеграции микробных клеток, фрагментации их органелл и макромолекул, внешних
образований типа фибрилл, мембран, капсул и т.п.. Примером является работа
гидроэкструзионного дезинтегратора, принцип действия которого основан на жидком
сдвиге. Напротив, в жидкостном экструдере высокого давления считается, что истинной
причиной дезинтеграции клеток является декомпрессионный шок
Шоковые воздействия
Осмотический шок. Применяется для дезинтеграции клеток, имеющих малопрочную
и высокопроницаемую клеточную оболочку. При этом происходит солевой шок, оболочка
клеток, органелл, вирусов разрывается давлением воды, проникающей внутрь клетки.
Температурные шоки. Применяется при резко контрастных температурных
воздействиях на клетки в диапазонах от 0 до 37°С и от -100°С до 0°С (метод
попеременного замораживания и оттаивания ткани).
Газодекомпрессионный шок. Установлено, если насыщать клетки азотом под
высоким давлением, то при резком снижении давления газа происходит либо резкое
набухание клеток, либо разрыв оболочки (выделяющийся газообразный азот как бы
«взрывает» клетки.).
Механические и термомеханические шоки. Механическое деформирование
клеточной оболочки приводит к значительному уменьшению её объема (например, в 2
раза) за счет отжима воды из клетки, при этом концентрация солей и других
низкомолекулярных метаболитов в протоплазме повышается и клеточная оболочка может
разрушаться под действием тургорного давления. При этом энергия, идущая на
уменьшение объема клетки, расходуется на преодоление сил осмотического давления.
Дегидратационный и регидратационный шоки. Объяснение причин дезинтеграции
клеток при значительном изменении содержания свободной воды связывается с процессами замораживания, лиофилизации, испарения (замерзания) околоклеточной среды и
основывается на физически содержательных аналогиях между замораживанием и высушиванием микроорганизмов. При этом явления, протекающие в клетке при
дегидратации и регидратации, приводят к шоковым воздействиям и лизису. К
дополнительным причинам возникновения шоковых процессов, приводящих к лизису
клеток, можно отнести и различные виды экзогенного химического воздействия
(химические шоки), а также резкие нарушения в метаболлизме клеток (метаболитные
шоки) субстратного происхождения или обусловленные изменениями метаболлитного
пула клеток.
Физические методы
Наиболее популярными физическими и механическими методами являются:
баллистические, гидро- и криоэкструзионные, ультразвуковые, декомпрессионные.
Химические и энзиматические методы.
Нейтральные соли, органические соединения, хелатные агенты, детергенты и др.
способны повреждать и при некоторых условиях разрушать оболочку микробной клетки.
В основе данного метода лежат различные механизмы нарушения межмолекулярной и
химической связи между структурными элементами клеточной стенки. Обработку клеток
химическими реагентами используют как подготовительный этап, предшествующий
энзиматической дезинтеграции. Для энзиматической дезинтеграции используют широкий
набор ферментов и ферментных комплексов бактериологического, миколитического и
дрожжелитического действий. Причем энзиматическая дезинтеграции нашла особое
широкое применение в научных исследованиях, где её используют для холодного
выделения малоустойчивых субклеточных структур, изучения особенностей строения и
состава клеточных стенок, исследования путей и механизмов их биосинтеза и регенерации. Особенно перспективным является применение иммобилизованных литических
ферментов.
Биологическая дезинтеграция
Процессы биологической дезинтеграции клеток довольно часто встречаются в
природе. Они могут быть вызваны различными агентами: колицинами и
бактериоцинами, плазмидоподобными факторами, фагами, внутриклеточными
паразитами. Биологическая дезинтеграции может быть результатом генетических и
метаболических нарушений, а также следствием структурных перестроек, связанных с
циклами развития и процессами дифференцировки.
Баллистические дезинтеграторы
Количество описанных в научной и патентной литературе баллистических
дезинтеграторов достигает уже 150, куда входят простейшие, такие как ступки и
гомогенизаторы, так и сложные высокопроизводительные автоматизированные
установки для выполнения опытно-экспериментальных и промышленных работ.
Для всех баллистических дезинтеграторов содержательным представляется критерий
способа передачи энергии от рабочих органов дезинтегратора к клетке: непосредственно,
при механическом контакте, через рабочую среду или мелющие тела. Исходя из этого и
учитывая вид взаимодействия рабочих органов друг с другом, всю совокупность
баллистических дезинтеграторов можно разделить на несколько групп:
I - Дезинтеграторы истирающего и раздавливающего действий с непосредственной
передачей энергии от рабочих органов к клетке.
II - Дезинтеграторы со свободными мелющими телами, опосредующими передачу
энергии от рабочих органов к клетке. Эта группа наиболее многочисленна.
III. Дезинтеграторы с агрегированными мелющими телами, в которых передача
энергии клетке от рабочих органов может быть и непосредственной, и опосредованной
рабочей средой, в зависимости от того, куда преимущественно вводится энергия - в
рабочие органы или в рабочую среду.
IV - Дезинтеграторы ударного действия, характеризующиеся отсутствием
свободных мелющих тел при высокой плотности потока энергии, отдаваемой рабочими
органами клетке при непосредственном контакте и заметно меньшей - в присутствии
рабочей среды, играющей роль передатчика энергии клетке.
V. Коллоидные мельницы, в которых в зависимости от характера взаимодействия
рабочих органов друг с другом передача энергии клетке может быть и непосредственной,
и опосредованной средой.
Ультразвуковая дезинтеграция микроорганизмов
Введение в ультразвуковую дезинтеграцию
Современная инструментальная техника дезинтеграции микробных клеток
насчитывает сотни способов, среди которых особое место занимает ультразвуковая
дезинтеграция. Разрыв между минимальными интенсивностями воздействий,
необходимых для дезинтеграции клеток, и воздействий достаточных для необратимого
разрушения их внутриклеточных структур, исключительно велик и составляет примерно
3-5 десятичных порядков. Именно такой большой разрыв между устойчивостью самих
клеток и их внутренних структур к действию разнообразных дезинтегрирующих
факторов и определяет глубокое противоречие между основной целью дезинтеграции и
возможностью её инженерной реализации. Сказанное в полной мере можно отнести и к
ультразвуковой дезинтеграции.
К основным положительным особенностям ультразвукового дезинтегрирующего
воздействия на микробные клетки следует отнести удобство и относительную легкость его
организации. Энергонапряженность и производительность процесса могут быть выбраны
в весьма широких пределах. Причем приборы и установки могут быть рассчитаны на
создание ультразвуковых полей практически любых необходимых конфигураций,
размеров, в широком диапазоне объемов, с приемлемыми частотами и амплитудами
колебаний, с самыми различными составами жидкой и газо-жидкостной рабочей среды и
т.п.
Характеристика процессов в локальном околоклеточном объеме ультразвукового
дезинтегратора
Ультразвуковое воздействие, приводящее к разрушению микробной оболочки,
обусловлено разнообразными физическими и физико-химическими явлениями, имеющими кавитационную природу. Под кавитацией понимается образование и рост газовых
пузырьков в жидкости, насыщенной звуковым полем. Затем происходит движение пузырьков с различной скоростью, которое сопровождается физическими эффектами.
Кавитация - это комплексное явление, включающее в себя ряд взаимосвязанных процессов: высокоградиентные потоки, ударные волны, локальные скачки давления и
температуры, возбуждения люминесценции и рождения свободных радикалов. Важнейшим
свойством кавитации является то, что перечисленные выше процессы локализуются в
очень малых областях порядка нескольких микрометров. Причем вблизи пузырьков
происходит локальное концентрирование (на 3-4 порядка) акустической энергии,
охватывающее области пропорциональные размеру микробной клетки.
Поведение пузырька определяется интенсивностью и частотой ультразвука,
составом и свойствами жидкости, в основном, радиусом пузырька. Газовый пузырек в
жидкости представляет собой резонансную систему. В диапазоне частот 105-106 Гц
резонансные размеры лежат в области единиц и десятков мкм. Важным является также
концентрация пузырьков резонансного размера, которая зависит от наличия в среде
кавитационных зародышей, от насыщения жидкости растворенным газом. Поэтому для
повышения эффективности процесса дезинтеграции в обрабатываемую среду вносятся
различные твердые включения, содержащие в своих порах газовые микропузырьки,
имеющие гидрофобные поверхности, способствующие возникновению и затем росту
кавитационных зародышей.
Резонансный пузырек резко увеличивает амплитуду своих колебаний, вызывая
вокруг себя интенсивные микромасштабные движения жидкости, так называемые
микропотоки, которые охватывают область протяженностью всего лишь в несколько мкм
вблизи колеблющегося пузырька. Градиент скорости микропотока определяет основные
наблюдаемые механические эффекты при кавитации. Сдвиговые напряжения,
возникающие в микропотоках жидкости и ответственные за разрушение клеточной стенки
пропорциональны произведению градиента скорости на вязкость среды.
Таким образом, за счет явления кавитации происходит разрушение клетки.
Лабораторное оборудование.
а – пестиковый ручной гомогенизатор: 1 – пестик, 2 – корпус, 3 – мотор, 4 – штатив; механический
гомогенизатор (б) и шаровая мельница (в): 1 – корпус с электродвигателем и