Нейроспецифические функции гена sbr (nxf1) у Drosophila
реклама
Отчет ассистента кафедры генетики и селекции Пугачевой Ольги Марковны за 2007-2008 учебный год. Нейроспецифические функции гена sbr (nxf1) у Drosophila melanogaster. Введение. Цель настоящего исследования состоит в изучении роли продуктов гена sbr (Dm nxf1) в развитии и функционировании нервной ткани и сенсорных органов у дрозофилы. Актуальность данного исследования определяется тем, что ген Dm nxf1 является крайне эволюционно консервативным и жизненно важным и имеет ортологов у разных групп организмов, включая человека. Мутации именно таких генов определяет тяжелые наследственные заболевания у человека. Известны нейропатологии, обусловленные мутациями в генах, принадлежащих семейству NXF (Nuclear eXport Factor), отвечающих за экспорт матричных РНК (мРНК) из ядра в цитоплазму. Мы предполагаем, что ядерный экспорт мРНК - не единственная функция данных белков. Наличие нескольких транскриптов, соответствующих генам nxf1 и выявленных не только у дрозофилы, но и у человека (Herold et al., 2001; Sasaki et al., 2005; Ivankova et al., in press), подтверждает возможное существование дополнительных функций названного гена. Определение нейроспецифичных функций гена sbr (Dm nxf1) будет проводиться с использованием специфичных современных антител, методов РНК-РНК иммунной гибридизаций, окраски целого тканей спектра с помощью молекулярно- генетических методов (RT-PCR, клонирование, in vitro транскрипция, экспрессия белка в бактериальных клетках и др.). Цели и актуальность исследования. На сегодняшний день известно, что ряд нейропатологических определенных заболеваний эволюционно человека консервативных опосредован генов. нарушением Исследования функций молекулярной этиологии и способов лечения таких заболеваний обычно проводится с использованием различных модельных животных. Перспективным направлением является использование хорошо изученного модельного объекта генетики – плодовой мушки Drosophila melanogaster. С использованием дрозофилы уже созданы генетические модели таких заболеваний, как болезни Паркинсона и Альцгеймера (Bilen and Bonini, 2005). Актуален также поиск различных мутаций, ответственных за наследственные нейропатологические синдромы. Так, сцепленная с полом умственная отсталость у человека обусловлена мутацией в гене NXF5, продукт которого принадлежит к семейству белков NXF (Nuclear eXport Factor), отвечающих за экспорт матричных РНК (мРНК) из ядра в цитоплазму. Ген NXF5 (паралог гена NXF1 (Tap) человека) является членом кластера генов NXF, расположенных в Х хромосоме. Оказалось, что у пациентов мужского пола, страдающих синдромной формой умственной отсталости, отсутствует продукт гена NXF5. Предполагают, что этот ген может быть вовлечен в процесс развития нервной ткани, обеспечивая метаболизм мРНК в нейронах (Jun et al., 2001). Интересно, что, несмотря на высокую гомологию с геном Tap/NXF1 (продукт его обнаружен в основном в ядре), продукту гена NXF5 не свойственна преимущественно ядерная локализация, он был обнаружен в цитоплазме тел нейронов и нейритов гипокампа. При этом белок NXF5 способен связываться как с мРНК, так и с белком р15/NXT, необходимым для транспорта мРНК (Jun et al., 2001). Таким образом, белки семейства NXF способны не только к ядерному экспорту, но и к цитоплазматическому транспорту мРНК, что имеет особое значение для нервных клеток, содержащих длинные отростки. Также известно, что другой высоко консервативный гомолог NXF1 у млекопитающих – белок NXF2 способен связываться с белком FMRP, отсутствие которого у человека приводит к синдрому ломкой Х-хромосомы, сопровождающемуся умственной отсталостью и макроорхидизмом в числе прочих симптомов. Белок FMRP способен специфически связываться с определенными мРНК, обеспечивая их транспорт не только из ядра в цитоплазму, но и по постсинаптическим дендритам нейронов, где выступает в качестве регулятора трансляции (Lai et al, 2006). Ортологом гена Tap (NXF1) человека является и ген small bristles - sbr (Dm nxf1) у Drosophila melanogaster. Показано, что основная функция этого гена также заключается в транспорте мРНК из ядра в цитоплазму (Wilkie et al., 2001). Исследователями нашей группы было впервые показано, что ген sbr у D. melanogaster проявляет специфичность в экспрессии на уровне транскрипции в зависимости от типа ткани и стадии эмбриогенеза; в числе прочих был выявлен транскрипт, специфичный для нервной ткани (Ivankova et al., in press). Длинный транскрипт – 5,1 т.н., выявленный методом нозерн-блот гибридизаций, впервые в развитии появляется у эмбрионов на 10-18 часу развития и в нервных ганглиях личинок в небольшом количестве по сравнению с конститутивным – 3,5 т.н., тогда как в тканях головы взрослых насекомых является мажорным. Нейроспецифичность длинного транскрипта предполагается на основании тканеспецифичности его экспрессии (Ivankova et al., in press), и том факте, что именно у эмбрионов дрозофилы 10-18-ти часового возраста происходит основной этап дифференциации нейробластов (Kearney et al., 2004). Мы предполагаем, что длинный транскрипт гена sbr играет важную роль в формировании и работе нейросенсорной системы дрозофилы. Эти предположения также основаны и на результатах исследования проявлений различных мутаций в гене sbr. Нами были выявлены доминантные эффекты различных мутантных аллелей гена sbr. Характерной особенностью этих мутаций является широкий спектр плейотропных эффектов с такими аллель-специфичными проявлениями, как нарушения морфологии и числа макрохет (сенсорных органов дрозофилы) и морфологии глазных фасеток. Например, мутация sbr1 в гомозиготе и в компаунде с летальными аллелями гена sbr вызывает нарушения морфологии и числа макрохет, морфологии глазных фасеток, нарушение общей структуры сложного глаза дрозофилы, вплоть до его отсутствия. При этом частоты аномалий глазных фасеток достигали 80-92% (Маркова, 2002). Более того, одним из проявлений мутантного термочувствительного аллеля sbr10 является вызванное действием теплового шока (ТШ) нарушение долговременной памяти (Никитина и др., 2003). Авторы исследования полагают, что нарушение памяти у данного мутанта возможно не только за счет функциональных дефектов, но и за счет структурных изменений. Было показано, что ТШ на стадии личинки первого возраста (формирование грибовидных телец мозга) индуцировал дефекты памяти, аналогичные таковым при тепловой обработке взрослых самцов (Никитина и др., 2003). Известно, что в процессы формирования долговременной памяти включены так называемые долгоживущие мРНК (Si et al., 2003), возможно, что продукт гена sbr может участвовать не только в локализации таких мРНК, но и в регуляции их экспрессии, осуществляющейся на уровне трансляции. Таким образом, цель настоящего исследования состоит в изучении роли продуктов гена sbr в развитии и функционировании нервной ткани и сенсорных органов у дрозофилы. Актуальность данного исследования определяется тем, что ген Dm nxf1 является крайне эволюционно консервативным и жизненно важным и имеет ортологов у разных организмов, включая человека. Мутации именно таких генов определяет тяжелые наследственные заболевания у человека. Наиболее изученной функцией белков NXF1, в том числе Dm NXF1, является ядерноцитоплазматический транспорт большинства, а возможно и всех мРНК (Wilkie, 2001). Однако мы предполагаем, что ядерный экспорт мРНК - не единственная функция данных белков. Наличие нескольких транскриптов, соответствующих генам nxf1 и выявленных не только у дрозофилы, но и у человека (Herold et al., 2001; Sasaki et al., 2005; Ivankova et al., in press), подтверждает возможное существование дополнительных функций названного гена. Показано для человека и мыши и предполагается для дрозофилы (Sasaki et al., 2005; Li et al., 2006; Ivankova et al., in press), что тяжелый транскрипт, соответствующий генам nxf1 появляется за счет того, что один из интронов - 10-11 у человека и мыши и 5-6 – у дрозофилы не вырезается в процессе сплайсинга. Присутствие в соответствующих интронах стоп-кодона приводит к тому, что длинному транскрипту соответствует укороченная форма белка NXF1, содержащая только N-концевую половину белка (Li et al., 2006), включающую в себя домен, отвечающий за связывание с мРНК, и не содержит С- концевой части, функция которой заключается в обеспечении взаимодействия с нуклеопоринами – белками ядерно-порового комплекса (Grant et al, 2002). Таким образом, короткая изоформа белка NXF1 лишается возможности связывания с нуклеопоринами и транспортировать мРНК из ядра в цитоплазму, но сохраняет свойства рецептора и может взаимодействовать с различными мРНК и другими белками рибонуклеопротеинового (РНП) комплекса. Для гена Dm nxf1 экспериментально не доказано, что длинный транскрипт содержит интрон 5-6, и неизвестно, существует ли короткая изоформа белка Dm NXF1, соответствующая данному транскрипту. Предположение о том, что длинный транскрипт является нейроспецифичным (Ivankova et al., in press), а также фенотипические проявления мутантов гена sbr (Dm nxf1), свидетельствующие о возможном участии гена sbr в формировании и функционировании нервных клеток, и определили задачи настоящего исследования. Важную информацию в определении функции гена дает определение локализации его продукта(ов) в клетке и тканях. Мы располагаем полученными в нашей группе антителами к С-терминальному фрагменту белка Dm NXF1. Использование данных антител позволит ответить на вопрос о локализации конститутивного продукта гена Dm nxf1 в клетке, включая нейросенсорные клетки. Для выявления нейроспецифичных функций продуктов гена sbr (nxf1) нами были поставлены следующие задачи, соответствующие настоящему этапу работы: 1. Локализовать белок SBR в нервных тканях в разные периоды развития. Для этого предполагается использовать метод иммунного окрашивания целых органов – нервных ганглиев и тонких срезов мозга имаго с помощью имеющихся в нашей группе антител к С-концевой части белка SBR. На этом этапе работы необходимо определить, каким образом распределен конститутивный белок в нервных ганглиях личинок – связан ли с морфогенетическими образованиями, расположен ли в районе дифференцированных клеток, имеет ли преимущественно ядерную локализацию или цитоплазматическую тоже, локализуется ли только в нейробластах или и в материнских ганглиальных (стволовых клетках), зависит ли локализация от стадии клеточного цикла (деление или интерфаза). Мы предполагаем, что конститутивная форма белка SBR может выполнять не только свою основную функцию – транспорт мРНК из ядра в цитоплазму, но и участвовать в таких процессах, как локализация мРНК в цитоплазме в составе нейрональных гранул, транспорт мРНК по нервным отросткам, регуляция трансляции и/или дифференциация нейросенсорных клеток. С помощью имеющихся в нашей группе антител к С-концевой части белка SBR мы показали, что в дифференцированных нейронах нервных ганглиев личинок первого возраста имеет преимущественно цитоплазматическую локализацию, причем интенсивно окрашиваются отростки нервных клеток. Помимо скопления белка в отростках, нами были обнаружены цитоплазматические крупные гранулы, содержащие белок SBR (рис.1). Рисунок 1. Иммунная окраска антителами к белку SBR. Район дифференциации нейронов в области среднего мозга нервных ганглиев личинок третьего возраста. отросток тело нейрона гранулы 2. Получение специфичных антител к N-концевой части белка SBR для выявления предполагаемого короткой изоформы белка. Для этого нами будет выделен фрагмент ДНК, соответствующий 1-3 экзонам гена sbr методом RT-PCR с помощью праймеров, содержащих необходимые в дальнейшем сайты рестрикции, последовательности ATG и стоп-кодоны для правильной экспрессии. Полученная таким образом последовательность будет клонирована в вектор экспрессии pET24b (Novagen) для экспрессии белка в бактериальных клетках. Полученным белком будут иммунизированы лабораторные мыши, а полученная антисыворотка будет специфически очищена на колонках, содержащих белок SBR. Для выполнения этой задачи нами были подобраны праймеры и проведены, выделение геномной РНК из голов взрослых насекомых дикой линии Oregon R, реакции обратной транскрипции со специфичными праймерами для получения кДНК фрагмента соответствующего 1-3 экзонам гена sbr и полимеразной цепной реакции (ПЦР) с этими же праймерами (рис. 2) Рисунок 2. Результаты ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к 1-3 экзонам. 1 2 3 1,2 дорожки – продукт ОТ-ПЦР, ожидаемая длина фрагмента 264 п.н. 3 дорожка – маркер молекулярного веса Полученный в результате фрагмент был выделен из геля, очищен и в данный момент секвенируется (определение нуклеотидной последовательности фрагмента), в качестве контрольной процедуры, после чего фрагмент будет клонирован в вектор экспрессии для получения pET24b (Novagen) для получения полипептида, соответствующего 1-3 экзонам гена sbr , и в дальнейшем используемого для получения антител к N-концевой части белка. Используя полученные результаты, нами поставлены следующие задачи: 1. Получение ответа на вопрос о преимущественной экспресси длинного транскрипта 5.1 т.н. в тканях головы взрослых особей D. melanogaster с помошью содержащего интрон 5-6 зонда. Данная задача будет решаться с использованием двух методов: Нозерн-блот гибридизации выделенной РНК из разных тканей и органов D. melanogaster и детекции тяжелого транскрипта в эмбриогенезе и мозге имаго методом РНК-РНК гибридизации in situ на целых эмбрионах и тонких срезах мозга имаго дрозофилы. В качестве зонда в обоих случаях предполагается использовать последовательность интрона 5-6, полученную методом RT-PCR, а затем меченую дигоксигенином с помощью тарнскрипции in vitro для получения рибонуклеиновой последовательности. Мы ожидаем, что в результате нозерн-блот гибридизаций с помощью интронспецифичного зонда, мы обнаружим длинный, содержащий 5-6 интрон, транскрипт в мозге имаго, на стадии 10-18-тичасовых эмбрионов и в нервных ганглиях личинок. В качестве контроля будут использоваться другие ткани, например семенники и/или яичники и эмбрионы более ранних стадий развития. 2. Определение специфичности в появлении короткой изоформы белка SBR в зависимости от типа ткани, органа и стадии развития D. melanogaster. Эту задачу планируется решать с использованием метода Вестерн-блот гибридизации полученных антител с разделенными путем гель-электрофореза белками, полученными из тканей голов имаго, нервных ганглиев личинок и семенников (отрицательный контроль) D. melanogaster. Педагогическая нагрузка за 2007/2008 учебный год: 1. Курс для лекций для студентов 5 курса (магистратура) «Генетические механизмы адаптаций» 2. Курс лекций для студентов 6 курса (магистратура) «Генетика клеточного ядра» 3. Семинарские занятия по курсу «Психогенетика» для студентов 3 курса факультета психологии 4. Научное руководство у 2-х студентов 3 курса (бакалаврс 5. Кураторство научной работой 1 студента 3 курса 6. Рецензирование выпусных квалификационных работ и отчетов о летней практике.
