СПТ - скорректированный прирост тромбоцитов

На правах рукописи
КАРПОВА
Оксана Викторовна
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ ЗАГОТОВКИ,
ОБРАБОТКИ И КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАТОВ
ТРОМБОЦИТОВ.
14.01.21-гематология и переливание крови
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва 2014
Работа
выполнена
в
Федеральном
Государственном
Бюджетном
Учреждении
«Федеральный научно-клинический центр гематологии, онкологии и иммунологии им.
Дмитрия Рогачева» Министерства Здравоохранения Российской Федерации
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор Румянцев Сергей Александрович
доктор медицинских наук Трахтман Павел Евгеньевич
Официальные оппоненты:
Голенков Анатолий Константинович- доктор медицинских наук, профессор,
руководитель отделения клинической гематологии и иммунотерапии ГБУЗ МО
Московского областного научно-исследовательского клинического института им.
Н.Ф.Владимирского.
Жибурт Евгений Борисович – доктор медицинских наук, профессор, заслуженный
рационализатор РФ, проректор по научно-организационной работе Института
усовершенствования врачей Национального медико-хирургического центра имени
Н.И.Пирогова.
Ведущая организация:
Федеральное Государственное бюджетное учреждение Гематологический Научный
Центр Министерства Здравоохранения Российской Федерации по адресу: РФ Москва,125167,
Новый Зыковский проезд, д.4
Защита состоится « » __________ 2014 г. в ______ часов на заседании диссертационного
совета Д 208.050.01 при ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии,
онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России по адресу: 117198, г.
Москва, ул. Саморы Машела, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им.
Дмитрия Рогачева Минздрава России и на сайте www.niidg.ru
Автореферат разослан« » __________ 2014 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Чернов Вениамин Михайлович
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Сегодня
трансфузии
аллогенных
КТ
имеют
важное
значение
для
детей
с
онкогематологическими заболеваниями для профилактики или купирования геморрагического
синдрома, развившегося вследствие тромбоцитопении или тромбоцитопатии при различных
заболеваниях кроветворной системы или миелотоксического воздействия цитостатиков и/или
лучевой терапии (А.Г.Румянцев, В.А. Аграненко 2002). Интенсивность и агрессивность
современных протоколов химиотерапии, широкое внедрение технологий трансплантации
гемопоэтических стволовых клеток делают донорский концентрат тромбоцитов самым
востребованным компонентом крови.
Необходимо оптимизировать и совершенствовать технологии заготовки, обработки
компонентов крови для
обеспечения максимально качественной
гемотрансфузионной
поддержки (Филатов Ф. П. и др. 2001; Донсков С. И. и др. 2001).
Актуальными проблемами безопасности трансфузий на сегодня являются:
1.
Количество тестируемых патогенов ограничено только вирусами гепатитов В и С,
2.
Риск бактериальной контаминации концентратов тромбоцитов.
3.
«Слабые места» скрининг-тестирования: период «серонегативного окна» и
ВИЧ.
ограниченность чувствительности тест-систем.
4.
Отсутствие скрининговых тест-систем для новых патогенов.
5.
Риск развития негемолитических (фебрильных) трансфузионных реакций,
связанных с аллогенными донорскими лейкоцитами и белками плазмы.
На сегодняшний день указанные проблемы не решены окончательно, поэтому
необходимо использовать максимально все возможности для сведения посттрансфузионных
рисков к минимуму.
Для
решения
этих
задач
существует
стандартный
комплекс
мероприятий:
совершенствование методов отбора доноров, технологий двухэтапного лабораторного
скрининга (серологический скрининг+ тестирование нуклеиновых кислот (NAT), способов
заготовки
компонентов
крови
(приоритет
аферезным
технологиям
с
применением
лейкоредукции), бактериальное тестирование, архивация донорских образцов, выполнение
программы по карантинизации плазмы. Но, серологические методы и тестирование
нуклеиновых кислот (NAT) снижают, но не исключают вероятность передачи стандартных
тестируемых патогенов (Hogman C. F.1976).
Также возрастает риск передачи патогенов, на наличие которых не проводится скрининг
донорской крови. В 2009 году Комитет по заболеваниям, передаваемым при переливании крови
3
Американской ассоциации банков крови определил 68 новых патогенов с подтвержденным или
потенциальным риском передачи при переливании компонентов крови (Stramer S. et. al. 2009).
В качестве приоритетных для тестирования были определены следующие патогены: вирус
лихорадки Денге и Babesia spp, вирус Чикунгуньи, Leishmania spp, Plasmodia spp,
Trypanosomacruzi, парвовирус В19, аденовирус человека 5 типа, вирус гриппа Н1N1.
Распространение новых патогенов связано с естественной миграцией вирусов из
тропических стран в страны с умеренным климатом. Это связано и с увеличением
путешественников по всему миру, и с климатическими переменами (Sharm S. P. 2010; Rezza G.
et al. 2007; Zheng К. et al. 2010; Rasongles P.et al. 2009).
Еще больший риск трансфузионной передачи патогенов возникает в результате
потенциальной бактериальной контаминации концентрата тромбоцитов (КТ), что связано с
погрешностями заготовки (погрешность обработки локтевого сгиба, ошибки при венепункции,
повторная венепункция, отсутствие отвода первой порции крови в контейнер-спутник) (Corash
L. et al. 2011) и с комнатной температурой хранения КТ (Corash L. 2000).
Скрининг КТ на наличие бактерий не дает 100% гарантию безопасности гемотрансфузий
(Kleinman S. еt al. 2012). Доказано, что частота передачи бактериальной инфекции даже после
проведения скрининга составляет 1 на 1500 КТ (Murphy W. G. et al. 2008). Учитывая, что
средний взрослый пациент с онокгематологическим заболеванием получает 6 КТ за один цикл
химиотерапии, то риск передачи бактериальной инфекции при гемотрансфузиях возрастает до
1:250.
Актуальной проблемой остается не только инфекционная, но и иммунологическая
безопасность гемотрансфузионной терапии (Абдулкадыров К. М. и др.; Глазанова Т.В. и др.
Неинфекционные
2011).
(иммунологические)
трансфузионные
осложнения
связаны
с
присутствием в компонентах крови жизнеспособных аллогенных лейкоцитов, не смотря на
внедрение фильтрации донорской крови. К ним относятся: лихорадочные негемолитические
реакции, острое поражение легких связанное с переливанием (ТРАЛИ), аллоиммунизация к
лейкоцитарным антигенам, формирование рефрактерности к трансфузиям КТ, болезнь
«трансплантат против хозяина» (Pelszynski M. M. et al. 1994; Seftel M. D. et al. 2004; Rebulla P.
2005; Geiger T. L. et al. 2007; Hendrickson J. E. et al. 2009).
Поэтому на сегодняшний день очень актуален поиск оптимальных способов заготовки и
методов
обработки
компонентов
крови,
чтобы
максимально
минимизировать
риск
посттрансфузионных реакций. Особенно важен этот вопрос в отношении больных с
иммунодепрессией (Morel P. C. 1999; Mc Cullough J. 2007).
Заготовку аферезных КТ с пониженным содержанием плазмы можно рассматривать как
один из способов заготовки компонентов крови с целью уменьшения частоты трансфузионных
4
реакций, связанных с биологически активными компонентами плазмы (deWildt-Eggen J. et al.
2000; Аzuma H. et al. 2009; Fontana S. et al. 2011; Marschner S. et al. 2011).
В последнее десятилетие на фоне роста числа заместительных трансфузий все больший
интерес представляет заготовка КТ с применением добавочных растворов (ДР) с целью
снижения вероятности развития негемолитических посттрансфузионных реакций. Кроме того,
использование
добавочных
растворов
при
заготовке
КТ
способствует
сохранению
функциональной активности тромбоцитов при длительных сроках хранения (Murphy M. F. et
al. 1991; Seghatchian J. et al. 2001; Procházková R. еt al. 2007; Tynngard N. et al. 2012).
Для максимального уменьшения инфекционных рисков целесообразно внедрение
различных технологий инактивации патогенов (ИП) и донорских лейкоцитов (с применением
ультрафиолета (УФ) в сочетании с фотосенсибилизатором) в клеточных компонентах крови
(синонимы: инактивация патогенов, вирусинактивация). Современные технологии ИП
позволяют в короткие сроки получать КТ, свободными от патогенов (вирусов, бактерий,
простейших), тем самым обезопасив реципиента от возможных трансфузионных осложнений. В
отличие от бактериальной детекции, эффективные технологии ИП могут значительно снизить
риск пролиферации минимального уровня бактерий при хранении (Ruane P. H., et al. 2004;
Goodrich R. P. et al. 2006; Cardo L. J. et al. 2007; Rentas F.et al. 2007; Goodrich R. P. et al. 2009).
Основной принцип различных технологий инактивациии патогенов и аллогенных
лейкоцитов заключается в воздействии на нуклеиновые кислоты. Идеальные технологии ИП
должны обеспечивать не только максимальное снижение патогенной нагрузки на компонент
крови и инактивацию аллогенных лейкоцитов, но и обеспечивать максимальную сохранность
клеток и белков крови.
Сама процедура заготовки, процессинга и хранения тромбоцитов, а также способы
обработки КТ приводят к выраженным изменениям их морфологических и функциональных
характеристик, что в свою очередь ведет к снижению терапевтической эффективности
трансфузионной терапии (Holme S. 1998; Seghatchian J. 2006). Необходимо всесторонне оценить
не только морфо-функциональные характеристики клеток, но и клиническую эффективность
концентратов тромбоцитов, заготовленных и обработанных разными методами.
Цель исследования - оценить на разных сроках хранения качество КТ (in vitro и in vivo),
заготовленных и обработанных разными способами и их клиническую эффективность для
оптимизации гемотрансфузионной терапии в педиатрии.
Задачи исследования:
5
Оценить морфологические и метаболические характеристики концентратов
1.
тромбоцитов на разных сроках хранения, заготовленных разными способами.
Оценить уровни спонтанной активации тромбоцитов на разных сроках хранения,
2.
заготовленных разными способами.
3.
Оценить морфологические характеристики концентратов тромбоцитов на разных
сроках хранения, обработанных разными методами для инактивации патогенов и аллогенных
лейкоцитов.
4.
Оценить уровни спонтанной активации тромбоцитов на разных сроках хранения,
обработанных разными методами для инактивации патогенов и аллогенных лейкоцитов.
5.
Изучить
эффективность
рентгеновского
(Rg)-облучения
для
инактивации
остаточных лимфоцитов в КТ и необходимость Rg - облучения в технологической цепи
обработки КТ.
6.
Оценить и сравнить клиническую эффективность переливаний КТ, заготовленных
разными способами.
7.
Оценить и сравнить клиническую эффективность переливаний КТ, обработанных
разными методами для инактивации патогенов и аллогенных лейкоцитов.
Научная новизна:
В отличие от существующих стандартных методов заготовки АКТ был впервые
применен автоматический метод получения АКТ на аппарате Trima Accel с пониженным
содержанием плазмы с применением добавочного раствора SSP+. Новая методика афереза КТ
позволяет эффективно использовать компоненты крови в педиатрической практике с целью
снижения вероятности развития негемолитических посттрансфузионных осложнений у
пациентов (за счет уменьшения биоактивных компонентов плазмы) на фоне роста числа
заместительных трансфузий.
Впервые
в
России
проведен
сравнительный
анализ
морфофункциональных
и
биохимических параметров клеток в КТ, заготовленных на платформе Trima Accel по методике
с применением добавочного раствора. Показатели качества клеток in vitro указывают на
оптимальное качество тромбоцитов в течение всего периода хранения, независимо от способа
заготовки АКТ. По морфофункциональным и биохимическим параметрам КТ, заготовленные в
ДР, характеризуются менее интенсивными процессами гликолиза; по антигенной структуре
отличаются более низким уровнем спонтанной и индуцированной экспрессии маркеров
активации и апоптоза. Доказана необходимость внедрения новой методики процессинга АКТ в
ДР в педиатрической практике с целью решения задачи максимального сохранения
жизнеспособности тромбоцитов в процессе заготовки и хранения.
6
Впервые была проведена сравнительная оценка изменений морфологических и
активационных параметров тромбоцитов (заготовленных разными способами) при обработке
АКТ по технологии инактивации патогенов ИП с применением УФ+РФ и Rg-облучением в дозе
25
Гр.
Следствием
воздействия
на
тромбоциты
УФ+РФ
является
изменение
морфофункциональных показателей тромбоцитов к концу срока хранения и увеличение
активации тромбоцитов с запуском процессов апоптоза в течение хранения. При этом Rgоблучение не оказывает отрицательного влияния на тромбоциты, что подтверждается данными
исследования in vitro.
Впервые в педиатрической практике было изучено клиническое применение АКТ,
заготовленных разными способами и обработанных УФ+РФ, и проведен сравнительный анализ
данных. Доказано, что клиническая эффективность КТ, заготовленных в плазме и КТ в ДР
равнозначна по таким показателям, как АПТ и СПТ, но при оценке количества неэффективных
трансфузий и посттрансфузионных осложнений, более эффективными оказались КТ,
заготовленные в ДР. Выявлена корреляция между результатами in vitro и in vivo и доказано
уменьшение клинической эффективности КТ, обработанных ИП с применением УФ+РФ.
Научно-практическая значимость работы:
Полученные результаты позволяют считать заготовку КТ с добавочным раствором
приоритетным способом заготовки КТ в педиатрической практике. Данные по сравнению
клинической эффективности разных КТ, позволяют выработать правильную стратегию по
заготовке и обработке компонентов крови, для оптимизации гемостатической терапии для
пациентов с онокгематологическими заболеваниями.
Результаты работы были доложены и опубликованы:
1. Игнатова А.А, Карпова О.В., Трахтман П.Е., Пантелеев М.А. Оценка качества
аферезного концентрата тромбоцитов, заготовленного с использованием добавочного раствора
SSP+. материалы II конгресса гематологов Pоссии, 17-19 апреля 2014г. Москва // гематология и
трансфузиология. 2014. т.59, №1, с.96
2. Карпова О.В., Ройтман Е.В., Колесникова И.М., Трахтман П.Е., Румянцев С.А.
«Изменения функциоанальных показателей тромбоцитов при хранении тромбоцитных
концентратов, заготовленных разными методами». Всероссийская научно-практическая
конференция
с
международным
участием
«Актуальные
вопросы
гематологии
и
трансфузиологии», 24-25 июня 2014г, г. Санкт-Петербург.
3. Карпова О.В. Изменение функциональных показателей тромбоцитов при хранении
концентратов тромбоцитов, заготовленных разными методами. Международная научно7
практическая конференция «Актуальные вопросы и перспективы развития службы крови
Республики Казахстан», 10-11 сентября 2014 г., г. Алмата, Казахстан.
4. Eugene V. Roitman, Irina M. Kolesnikova, Oksana V Karpova, Pavel E. Trakhtman,
Sergey A. Roumiantsev. Changes in clot properties due to platelet concentrate storage (in vitro study)
// abstr. of 2ndeuplan conference, 24-26 september, Le bischenberg, France. European platelet
Network, 2014.vol. 126.p 110
5. Колесникова И.М., Ройтман Е.В., Карпова О.В., Трахтман П.Е., Румянцев С.А.
«Факторы, влияющие на изменения гемостатических свойств тромбоконцентратов при
хранении», ХIV съезд федерации анестезиологов и реаниматологов, Казань, 20-22 сентябрь
2014 C.156-157
6. И. М. Колесникова, Е.В.Ройтман, О.В. Карпова. Гемостатические свойства
тромбоцитных концентратов при хранении// Гемостаз, проблемы и достижения, 10-13 октября,
Ереван, Армения. Научно-практический журнал «Кровь», 2014. №2, с 80.
7.
Карпова
О.В.
«Сравнительная
характеристика
концентратов
тромбоцитов,
заготовленных и обработанных разными методами». Научно-практическая конференция
«Производственная и клиническая эффективность концентратов тромбоцитов плазмы,
инактивированных амотосаленом и ультрафиолетовым облучением», Санкт-Петербург 1112.11.2014г.
8. Eugene Roitman, Irina Kolesnikova, Oksana Karpova, Sergey Roumiantsev Subsequent
clot properties depend on the storage time of platelet concentrates // Cith abstract submission. Bleeding
disorders.cith 2014-abs-1056 Berlin Germany October 30-November 1 2014
9. О.В. Карпова, Е.В.Ройтман, А.А. Игнатова, С.Р. Мадзаев, С.А. Румянцев,
С.А. Плясунова, П.Е. Трахтман. Оценка качества тромбоцитного концентрата,
заготовленного методом афереза с использованием добавочного раствора SSP+ Журнал
«Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии 2014.»-№2(13)-С.20-24.
10. О.В. Карпова, Е.В. Ройтман, И.М. Колесникова, П.Е. Трахтман, М.Ю. Андрианова,
А.М. Исаева, С.А. Румянцев. Метаболические изменения при хранении тромбоцитных
концентратов, заготовленных разными методами. – Журнал «Трансфузиология» 2014 -№3(15)С. 30-32.
11. Е. В. Ройтман, И. М. Колесникова, О. В. Карпова. Изменения гемостатических
свойств сгустка при хранении тромбоцитных концентратов, заготовленных различными
методами.- Журнал «Гематология и трансфузиология» №3 2014-С. 30-34.
12.?????
13.??????
8
Апробация работы состоялась 10.10.2014г на заседании научного совета в Федеральном
Государственном
Бюджетном
Учреждении
«Федеральный
научно-клинический
центр
гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» МЗ РФ.
По теме диссертационной работы опубликовано 5 статей (4- в журналах ВАК) и 8
тезисов, 2 из которых в иностранных изданиях
Структура и объем диссертации:
Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, иллюстрирована 24
таблицами и 25 рисунками. Представлены ссылки на 176 литературных источника (16
отечественных, 160 зарубежных).
Содержание работы
Работа выполнена в _________
Материалы и методы исследования
Получение АКТ:
КТ были получены стандартизировано от здоровых доноров методом афереза на
сепараторе для автоматизированного сбора крови и ее компонентов Trima Accel (Caridian BCT,
США).
Заготовка концентратов тромбоцитов была проведена двумя способами: классический –
в 100% плазме и с плазмозамещающим раствором SSP+ (Макофарма, Франция). ДР добавляли
сразу (с помощью коннектора) по окончанию процедуры афереза в расчете на такой конечный
объем КТ, чтобы выполнялось условие не менее 40 мл общего объема на 0,6х1011 клеток. При
этом соотношение донорской плазмы и ДР составляло 1:3 (30% донорской плазмы и 70% ДР).
Общая характеристика КТ:
КТ, заготовленные в плазме (n=28): ср. объем КТ 444±102 мл; средняя концентрация
тромбоцитов составила (6,6±1,5)x1011.
КТ, заготовленные с ДР (n=29): ср. объем КТ до добавления ДР составил 131±25,8; после
добавления- 437±86мл; средняя концентрация тромбоцитов составила (6,5±1,3)×1011.
Средняя концентрация тромбоцитов при заготовке в обеих группах КТ составила
6,85×1011, средний объем КТ – 458,46 мл.
Все заготовленные КТ были автоматически лейкоредуцированы (с помощью камеры
лейкоредукции LRS),c обязательным последующим лабораторным контролем на проточном
цитометре). Все КТ, участвовавшие в исследовании, содержали лейкоциты менее 1×106.
При исследовании образцов КТ, обработанных разными методами, разделение
исходного КТ проводилось по следующей схеме (табл.1).
Таблица 1
9
Схема разделения АКТ, заготовленных разными способами, для последующей
обработки разными методами
KT-Плазма
KT-ДР
Объем-570 мл
Объем 610 мл
Количество тромбоцитов 8,5×10
11
Количество тромбоцитов 8,5×10
КТ-К
КТ-Rg
КТ-М
КТ-К
КТ-Rg
КТ-М
105 мл
80 мл
360 мл
105 мл
80 мл
450 мл
11
1,55×10
1,1×10
11
11
11
5,4×10
11
1,55×10
1,1×10
6,3×10
11
11
КТ-К- не подвергалась никакой обработке, контрольная группа.
КТ-Rg- подвергалась рентгеновскому облучению в дозе 25 Гр.
КТ-М- подвергалась обработке по инактивации патогенов.
Вирусинактивация КТ проводилась с помощью технологии PRT–система Mirasol
(Caridian), основанная на сочетанном использовании рибофлавина и УФ-B–250-350 нм.
Вирусинактивация КТ проводилась строго согласно инструкции производителя, соблюдая
требования по технологии сбора КТ, по срокам обработки, объему КТ и концентрации
тромбоцитов (перед добавлением рибофлавина).
Rg-облучение КТ проводили в день заготовки не позднее двух часов после заготовки на
рентгеновском аппарате «АРДОК -1» (Россия).
КТ хранились в интегрированных полимерных контейнерах производства компании
Terumo BCT, соответствующих требованиям спецификации, в течении 5-и дней со дня
заготовки при температуре +20-24 °С в термостате при постоянном помешивании.
КТ обеих групп были разделены на две равные части (общее количество тромбоцитов на
один гемоконтейнер не должно превышать 5,1×1011 – по условиям от производителя).
Отбор проб (по 3 мл) КТ проводили в стерильных условиях через 2 часа после афереза
(1час- фаза покоя, КТ находился вне шейкера, комнатная температура хранения (для
спонтанной дезагрегации) и 1 час в термостате при температуре +20-24°С при постоянном
перемешивании)– на 0-й день, 1-й, 3-й и 5-й дни хранения.
Для оценки функциональной активности CD3+ (обработанных и необработанных)
клеток определяли митогенный ответ методом серийных разведений (МСР) путем выделения
МКПК (в градиенте Ficoll-Hypague), получения CD3-обедненной фракции методом негативной
иммунномагнитной селекции (Miltenyi Biotec, Калифорния) с последующим гамма-облучением
в
дозе
30
Гр;
выделения
CD3+
положительной
фракции
методом
позитивной
иммунномагнитной селекции с последующим приготовлением серийных разведений для
необработанных клеток: разведения 40, 20, 10, 5, 2,5 и 1,25 и 0,625 клеток/на объем лунки), и
10
для клеток, подвергнутых гамма-облучению или ИП разведения: - 1х105, 3,3х104, 1,1х104, 3700,
1200, 410, 140 и 46 клеток/на объем лунки).
Используемая среда содержала: 16% эмбриональная телячья сыворотка (FCS Atlanta
Biologicals, Атланта, штат Джорджия), 8 мг/мл ФГА-М (Sigma, Сент-Луис, штат Миссури), 50
ед/мл рекомбинантный IL-2 человека (Zeptometrix, Буффало, штат Нью-Йорк), 10% стимулятор
роста Т-клеток (TCGF, Zeptometrix).
В лунки 96-луночного планшета вносили фидерные клетки (1х105 клеток на объем
лунки), а затем добавляли обработанные и необработанные (контрольные) Т-клетки. Опыты с
каждым разведением были воспроизведены в 12 лунках; поставлен контрольный эксперимент
при отсутствии Т-клеток в системе.
На 3-й, 7-й, 14-й дни в каждую лунку вводили 25 мл питательной среды, содержащей
45% FCS, 45% TCGF, 500 U/мл рекомбинантного человеческого IL-2, 80мг/мл PHA-M. Для
предотвращения испарения все планшеты накрывались специальной водонепроницаемой и CO2
проницаемой пленкой и инкубировались при температуре 37 °С. На 21-й день проводилась
микроскопическая
оценка
розеткообразования.
Положительным
результатом
оценки
пролиферации клеток в каждой лунке считалось наличие хотя бы одной розетки под
микроскопом.
Для оценки клинической эффективности трансфузий в исследование были включены
трансфузии
КТ,
заготовленных
и
обработанных
разными
способами,
пациентам
с
тромбоцитопенией менее 20х109л. Оценивали трансфузии КТ пациентам с геморрагическим
синдромом по шкале ВОЗ менее 2 баллов (петехии, синяки на коже, подслизистые гематомы,
гематурия, мелена, кровохарканье, маточное кровотечение (более двух прокладок в сутки),
носовое кровотечение (продолжительностью более часа), но не требующее трансфузий
эритроцитов, и у которых отсутствовали состояния, связанные с повышенным потреблением
тромбоцитов (инфекция, лихорадка, спленомегалия, ДВС и др). Проанализировали клиниколабораторные показатели эффективности трансфузий: абсолютный прирост тромбоцитов (АПТ)
и скорректированный прирост тромбоцитов (СПТ) через 24 часа после трансфузии,
продолжительность межтрансфузионных интервалов, а также эффективность трансфузий и
количество посттрансфузионных осложнений КТ, заготовленных в 100% плазме, с добавочным
раствором
не-/обработанных
по
технологии
патогенной
редукции.
Неэффективными
трансфузиями считались те переливания КТ, когда АПТ был равен или ниже ноля, отсутствовал
гемостатический эффект и пациенту требовалась повторная трансфузия КТ для купирования
геморрагического синдрома.
Всего было проанализировано 814 трансфузий КТ, из них: КТ-Плазма - 387 ед.; КТ-ДР257 ед.; КТ-Плазма, обработанные ИП - 70 ед.; КТ-ДР, обработанные ИП -100 ед.
11
Подсчет количества тромбоцитов в исследуемых образцах проводили на автоматическом
гематологическом анализаторе Sysmex KX-21 путем разведения образца буферным раствором в
соотношении 1: 10 после предварительного перемешивания образца на программируемом
ротаторе-миксере BioSan MultiBioRS-24 (BioSan, Латвия).
Подсчет количества остаточных лейкоцитов в концентрате тромбоцитов проводили на
проточном цитометре FACS Canto IIс применением наборов Kit TruCount Fluorospheres фирмы
«Becton Dickinson» (определение антител против панлейкоцитарного маркера CD45).
Для оценки электролитного состава и кислотно-щелочного состояния КТ использовался
прибор POC-анализатор iSTAT (Abbot Laboratories Inc., США; Сервис Инструмент Плюс,
Россия - картриджи CHEM8+ и CG4+.)
Методика исследования КТ методом проточной цитометрии:
Образцы КТ разбавляли в 40 раз буфером А (150 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 0,4
мМ NaH2PO4, 20 мМ HEPES, 5 мМ глюкозы, 0,5 % бычий сывороточный альбумин, pH 7,4) с
добавлением 5 мМ CaCl2. В качестве маркеров активации тромбоцитов измеряли экспрессию Рселектина, фосфатидилсерина на поверхности тромбоцитов методом проточной цитометрии на
AccuriC6 (BD Biosciences, USA) с помощью флуоресцентно меченых антител PE-CD62P
(Bioscience, USA), FITC-PAC-1 (BDBiosciences, USA) и Alexa 647-annexinV (Biolegend, USA).
Для активации тромбоцитов (при исследовании маркеров активации в каждой из групп
при разделении КТ на три равные части: контрольная группа - КТ, группа, облученная Rg-КТRg; группа, обработанная по системе ИП-КТ-М) в пробы вносили аналог коллагена CRP
(collagen related peptide) до конечной концентрации 20 мкг/мл и перемешивали. Активацию
проводили в течение 15 минут, после чего в пробы добавляли флуоресцентно меченные
антитела и инкубировали еще 5 мин. Затем пробы разбавляли в 20 раз буфером А с 2,5 мМ
CaCl2 и анализировали на проточном цитометре по характерному светорассеянию и
флуоресценции связавшихся на поверхности тромбоцитов антител.
Анализ полученных результатов проводили при помощи
специализированного
программного обеспечения CFlowPlus. Границы популяции тромбоцитов определяли по
характерному светорассеянию. Далее только для выделенной зоны тромбоцитов анализировали
флуоресценцию связавшихся на их поверхности антител. За 100 % принимали число всех
событий в популяции тромбоцитов. Процент фосфатидилсерин-положительных определяли как
отношение выявленного количества тромбоцитов, окрашенных аннексином V, к количеству
всех событий в популяции тромбоцитов. Процент Р-селектин - положительных определяли как
отношение выявленного количества тромбоцитов, окрашенных CD62P, к количеству всех
событий в популяции тромбоцитов.
12
Статистический анализ проводили с помощью программного пакета Origin 8.0
(OriginLabCorp., USA). Значения показателей в группах представлены средними значениями (М
± SD). Для оценки различий между значениями показателей в группах применяли тест МаннаУитни. Различия считали достоверными при р< 0,05.
Вычисление
частоты
событий
(ответ
на
стимуляцию-розеткообразование)
в
исследовании методом серийных разведений рассчитывали по анализу си-квадратов на
основании распределения Пуассона. Для распределения Пуассона можно утверждать, что 37%
ячеек в среднем отрицательны, если один конкретный лейкоцит попадал в каждую лунку в
самом начале. Уменьшение логарифма Т-клеток может быть рассчитано следующим образом
(fконтроль/fобработка), гдеfконтроль – это частотность Т-клеток в контрольных клетках, а fобработка – это
частотность Т-клеток в ИП – обработанных или гамма-облученных клетках.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ:
По
морфологическим
параметрам
тромбоцитов
можно
проанализировать
их
биологическую полноценность - структурную целостность и функциональную активность.
Адекватный
гемостатический
эффект
при
клиническом
использовании
концентратов
тромбоцитов зависит от оценки параметров биологической полноценности клеток. (Ю.Л.
Шевченко, Е.Б. Жибурт, 2008).
Мы исследовали такие морфологические параметры в КТ-Плазма и КТ-ДР (без
обработки, подвергнутые Rg-облучению и обработанные ИП), как среднее количество, индекс
содержания больших тромбоцитов 12 фл (platelet large cell ratio - P-LCR), средний объем (mean
platelet volume– MPV) и ширина распределения по объему (platelets distribution width–PDW).
Измерение указанных параметров проводили сразу после заготовки (ТК0), на 1-й день (ТК1), на
3-й (ТК3) и пятый дни (ТК5)хранения.
Важным фактором поддержания качества хранящихся тромбоцитов является постоянная
концентрация тромбоцитов. Среднее содержание тромбоцитов во всех группах КТ на
протяжении всего периода хранения не менялась и достоверных отличий между группами не
выявлено. В образцах КТ, обработанных ИП, количество клеток было примерно в 1,2 раза
меньше по сравнению с КТ-К, что соответствует разведению при добавлении раствора
рибофлавина в количестве 35 мл. Это соотношение сохраняется в течение всего срока хранения
как для образцов заготовленных в плазме, так и в ДР (рис.1).
13
165
КТ-К ДР
PLT
145
КТ-Rg ДР
КТ-М ДР
125
КТ-К Плазма
105
КТ-Rg Плазма
85
КТ-М Плазма
0
1
3
День хранения
5
Рисунок 1. Среднее количество тромбоцитов в группах КТ, заготовленных и
обработанных разными способами.
Показатель
P-LCR
отражает
содержание
больших
тромбоцитов,
которые
характеризуются высокой активностью в процессах тромбообразования. По этому показателю в
обеих группах (по заготовке) также не выявлено значимых изменений в течение 5-и дней
хранения (рис 2).
35.0
P-LCR, %
30.0
КТ-К Плазма
25.0
КТ-Rg Плазма
20.0
КТ-М Плазма
15.0
КТ-К ДР
10.0
КТ-Rg ДР
5.0
0
1
3
День хранения
5
КТ-М ДР
Рисунок 2. Изменения индекса P-LCR в группах КТ, заготовленных и обработанных
разными способами, в течение срока хранения.
Величина PDW определяет степень анизоцитоза, указывает на наличие агрегатов
тромбоцитов или их фрагментов. К пятому дню хранения этот показатель достоверно снижался
в группе КТ с ДР (p=0,02) (рис.3).
14
16.0
PDW, %
14.0
КТ-К Плазма
12.0
КТ-Rg Плазма
10.0
КТ-М Плазма
КТ-К ДР
8.0
КТ-Rg ДР
КТ-М ДР
6.0
0
1
3
День хранения
5
Рисунок 3. Величина PDW в группах КТ, заготовленных и обработанных разными
способами, в течение срока хранения.
По среднему объему тромбоцитов (MPV) внутри обеих групп, заготовленных разными
способами, достоверных отличий не выявлено (рис.4).
11.0
MPV, fL
10.0
КТ-К Плазма
9.0
КТ-Rg Плазма
8.0
КТ-М Плазма
7.0
КТ-К ДР
6.0
КТ-Rg ДР
5.0
КТ-М ДР
0
1
3
День хранения
5
Рисунок 4. Величина MPV в группах КТ, заготовленных и обработанных разными
способами, в течение срока хранения.
Статистически значимых различий по MPV, P-LCR и PDWмежду группами КТ-Плазма и
КТ в ДР не выявлено в течение всего периода хранения. Группы образцов КТ-К и КТ-Rg между
собой также не отличаются по параметрам PLT, PDW, MPV и P-LCR в течение всего срока
хранения. Это справедливо, как для образцов, заготовленных в плазме, так и в ДР.
По морфологическим параметрам MPV, P-LCR и PDWотмечается достоверное
увеличение всех величин к пятому дню хранения в группах КТ-Плазма и КТ в ДР,
обработанных по технологии ИП, но они не выходят за рамки референсных значений.
(рис.1,2,3,4).
15
Можно сделать вывод, что в процессе заготовки КТ обоими способами и после обработки КТ методом Rg-облучения, а также в процессе их хранения морфологических изменений
не выявлено, а это важно для сохранения посттрансфузионной выживаемости тромбоцитов.
После обработки КТ по технологии ИП отмечается повышение параметров клеток MPV,
P-LCR и PDW. К концу хранения происходит увеличение- разбухание клеток (Ezuki S. et al.
2008), что объясняется и воздействием УФ-лучей спектра В и С (Li J. et al. 2005).
При исследовании биохимических показателей (pH, концентрация лактата и глюкозы)
можно сделать заключение, что условия хранения в КТ, заготовленных в плазме и в КТ с ДР
обеспечивают стабильность метаболических процессов в течение первых 5 суток.
При заготовке КТ с добавочным раствором уровень глюкозы и содержание лактата
несопоставимы с такими же параметрами в КТ-Плазма (согласно разведению). При сравнении
скорости метаболических процессов в обоих КТ отмечается снижение метаболизма в КТ с ДР,
что проявляется уменьшением скорости потребления глюкозы и образования лактата в
Потребление глюкозы,
ммоль/л
динамике по сравнению с КТ-Плазма (рис.5, 6).
20
y = -1,71x + 18,10
R² = 0,97
15
10
y = -0,69x + 5,17
R² = 0,98
5
0
0
1
2
3
Дни хранения
KT-Плазма
4
5
6
KT-ДР
Образование лактата,
ммоль/л
Рисунок 5. Сравнение потребления глюкозы в КТ-Плазма и КТ-ДР.
20
y = 2,65x + 1,90
R² = 0,97
15
10
5
y = 1,46x + 1,72
R² = 0,99
0
0
1
2
3
Дни хранения
KT-Плазма
4
5
6
KT-ДР
Рисунок 6. Сравнение образования лактата в КТ-Плазма и КТ-ДР.
Данные, полученные нами по изучению биохимических параметров, согласовываются с
данными Picker et al. и Macher et al: значения pH для всех КТ находились значительно выше
16
минимальных значений, установленных нормативными стандартами (6,4)- по стандартам
Европы (Руководство по приготовлению, использованию и обеспечению качества компонентов
крови. 16-е издание 2010г), в России- 6,4-7,4 (Постановление Правительства РФ № 29 от
26.01.2010).
Также на качество «жизни» тромбоцитов влияет не только способ их заготовки и
условия хранения, (длительность хранения), но и тип контейнера и среда хранения (плазма или
взвешивающий раствор) (Tynngrd N. 2009). Ключевым фактором поддержания окислительного
фосфорилирования для надлежащего синтеза АТФ, является достаточное количество
кислорода. Данный процесс варьирует в зависимости от того, из какого материала изготовлен
контейнер для хранения крови (Dumont L. J. еt al. 2003; DeWildt-Eggen J. еt al. 1998).
Наши результаты определения концентрации образовавшегося лактата и поглощенной
глюкозы в конце периода хранения, сходные с данными Picker et al. и Macher et al., которые
подтверждают качество заготовки КТ на платформе Trima Acell и говорят о достаточной
газопроницаемости контейнеров для тромбоцитов, используемых в технологии Trima Acell.
Высокая газопроницаемость контейнеров для хранения КТ позволяет поддерживать аэробный
метаболический гликолиз, что обеспечивает сохранность морфо-функциональных свойств
тромбоцитов.
Маркеры активации тромбоцитов являются важными показателями in vitro качества
тромбоцитов (их жизнеспособности и функциональной активности). Функциональное
состояние переливаемых тромбоцитов имеет первоочередное значение для купирования
геморрагического синдрома (остановки кровотечения) (Жибурт Е.Б. и др. 2009). На
посттрансфузионную активность тромбоцитов оказывает влияние любое воздействие на клетку
и в процессе заготовки, и в процессе хранения КТ, и в процессе обработки клеток, что приводит
не только к изменению биохимических параметров среды, окружающую тромбоциты, но и
приводит к выраженным изменениям самих тромбоцитов. Это приводит к активации
тромбоцитов, стимуляции реакции высвобождения содержимого гранул тромбоцитов. Поэтому
исследование in vitro маркера активации в КТ может прогнозировать его посттрасфузионные
свойства in vivo. Доказана обратная корреляция экспрессии Р-селектина с величиной
посттрансфузионного восстановления тромбоцитов через 15-60 минут после трансфузии и
величиной СПТ через 1 час после переливания (Rinder H. M. et al. 1991).
Важным прогностическим признаком функциональной активности и жизнеспособности
тромбоцитов после трансфузии является определение связывания аннексинV с фосфатидилсерином (Cookson P. et al. 2010).
Другие исследователи (Murphy S. 2004) считают, что ни один из маркеров активации
тромбоцитов не оказался эффективным предиктором восстановления или выживаемости
17
тромбоцитов после переливания. Таким образом, этот вопрос остается открытым на
сегодняшний день.
Следующим этапом нашего исследования было изучение и сравнение спонтанной
экспрессии Р-селектина и фосфатидилсерина в зависимости от способа заготовки АКТ.
Сразу после заготовки в обеих группах КТ наблюдался одинаково низкий уровень
экспрессии P-селектина в КТ-Плазма 0,2-5,7 % и в КТ-ДР - 0,3-5,1%., статистически
достоверное повышение активации тромбоцитов в КТ, заготовленных в плазме в 1-3-дни
хранения; значимое повышение активации клеток на 5-й день хранения по сравнению с днем
после заготовки в КТ, заготовленных в плазме- 1,5±1,4 против 6,7±3,7; в КТ-ДР -2,1±1,6 против
6,8±4,2. Достоверных отличий между показателями экспрессии Р-селектина на 5-й день между
обеими группами КТ не выявлено (р=0,62).
Также сразу после заготовки (табл.2) в обеих группах КТ отмечается низкий уровень
фосфатидилсерина (0,3-3,4 %). На 1-й и 3-й дни хранения экспрессия фосфатидилсерина в КТ,
заготовленных с использованием ДР, оказалась достоверно ниже, чем в КТ, заготовленных в
плазме: 0,7±0,2 и 1,1±0,3 против 1,0±0,3 и 1,8±0,9 (р<0,05). На 5-й день экспрессия
фосфатидилсерина достоверно ниже в в группе КТ-ДР (2,6±1,0), чем в группе КТ-Плазма
(3,1±1,3) (р<0,05).
В нашем лабораторном исследовании показано, что использование ДР при заготовке
АКТ значительно сокращает гликолиз (меньшее потребление глюкозы и снижение образования
лактата), что обеспечивает более низкую степень экспрессии маркеров активации и апоптоза.
Эти же данные подтверждает (Diedrich B. еt al. 2008). Но, Andreu G. в своем исследовании
показал, что на основании определения скорректированного прироста тромбоцитов и
посттрансфузионного выхода тромбоцитов преимуществ какой-либо технологии не было
выявлено - исследовали в течение 2-х лет трансфузии 4287 доз КТ. Также было доказано, что
использование ДР снижает частоту посттрансфузионных аллергических реакций, особенно при
переливании АКТ (Andreu G. еt al. 2007).
Таким образом, можно сделать выводы, что низкая экспрессия обоих исследуемых
маркеров независимо от способа заготовки говорит о качестве процессинга заготовки АКТ.
В процессе хранения клетки меньше активируются при заготовке КТ в добавочном
растворе, чем в плазме, и уровень экспрессии маркера апоптоза также ниже, чем в КТ-Плазма.
(табл.2).
Следующим этапом исследования был анализ экспрессии маркеров активации и
апоптоза на поверхности тромбоцитов в зависимости от способа обработки: Rg-облучения в
дозе 25 Гр или по технологии редукции патогенов c применением УФ+РФ.
18
Сразу после заготовки в группах КТ-Плазма и KT-ДР в образцах КТ-К и КТ-Rg
наблюдался одинаково низкий уровень экспрессии P-селектина (0,4-9,8%); в образцах КТ,
обработанных ИП, уровень экспрессии Р-селектина был несколько выше (2,4-10,6%). Для КТПлазма, обработанных ИП- 3,1±3,1 против - 5,9±3,3 (не обработанных ИП). Для КТ-ДР,
обработанных ИП- 1,5±1,4 против 6,7±1,9 (не обработанных ИП) (рис.6).
Таблица 2
Экспрессия маркеров тромбоцитов в зависимости от метода заготовки и сроков хранения КТ
Количество
Длительность хранения КТ, дни
тромбоцитов
(в %),
0
1
3
5
6
7
КТ-Плазма
1,5±1,4
2,8±1,9
5,3±3,0
6,7±3,7
6,8±3,7
11,6±7,2
КТ-ДР
2,1±1,6
1,9±1,9
2,7±1,6
6,8±4,2
8,2±3,8
12,5±4,9
p
0,24
0,01
0,0004
0,62
0,23
0,43
КТ-Плазма
1,1±0,8
1,0±0,3
1,8±0,9
3,1±1,3
4,8±2,9
8,2±6,1
КТ-ДР
0,8±0,2
0,7±0,2
1,1±0,3
2,6±1,0
5,0±3,1
10,6±6,3
p
0,23
0,003
0,0001
0,06
0,85
0,17
экспрессирую
щих маркер
CD62P
Annexin V
ТК0-ТК5: КТ-Плазма (n=28), КТ-ДР (n=29), ТК6-ТК7: КТ-Плазма (n=15), КТ-ДР (n=20).
На 1-й и 3-й дни хранения экспрессия Р-селектина в группах КТ-К и КТ-Rg,
заготовленных в ДР, достоверно ниже, чем в КТ-К и КТ-Rg, заготовленных в плазме.
Экспрессия Р-селектина в КТ-М, заготовленные в плазме, выше, чем КТ-К: 17,6±8,5 против
5,5±2,8 (1-е сутки) и 20,6±7,0 против 6,1±3,3 (3-и сутки). Экспрессия Р-селектина в КТ-М,
заготовленные в ДР выше, чем в КТ-К: 11.5±3.1 против 2,0±1,0 (1-е сутки) и 15,4±3,1 против
3,2±1,8 (3-сутки). При этом, экспрессия Р-селектина достоверно выше в группе КТ-М,
заготовленных в плазме по сравнению с КТ-М, заготовленных в ДР.
На 5-й день хранения экспрессия Р-селектина в КТ-М, заготовленных в плазме и с ДР,
выше, чем в КТ-: 36,2±15,4 против 6,5±2,8 (для КТ-Плазма) и 24,5±6,3 против 4,8±1,7 (для КТДР).
Спонтанная экспрессия Р-селектина практически не меняется во всех группах КТ в
течение хранения, за исключением групп КТ, обработанных ИП (достоверные отличия по
сравнению с КТ-К). Обработка ИП приводит к увеличению активации тромбоцитов, что
приводит к снижению их функциональной активности и проявляется в снижении клинической
эффективности (о чем будет сказано дальше).
19
% CD62P- положительных
тромбоцитов
60.00
50.00
КТ-К Плазма
40.00
КТ-Rg Плазма
30.00
КТ-М Плазма
20.00
КТ-К ДР
10.00
КТ-Rg ДР
0.00
0
1
3
День хранения
КТ-М ДР
5
Рисунок 6. Спонтанная экспрессия Р-селектина (CD62P) в зависимости от способа
обработки и сроков хранения КТ.
Экспрессия фосфатидилсерина во всех группах в течение срока хранения сохранялась на
низком уровне, за исключением групп КТ, обработанных ИП. При этом отмечаются
достоверные различия между контрольными группами и группами КТ, обработанных ИП в
течение всего срока хранения. Уровень экспрессии фосфатидилсерина в КТ-ДР, подвергнутых
ИП, значительно выше по сравнению с КТ-Плазма, подвергнутых ИП. Это может быть связано
с истощением запасов глюкозы или недостаточной буферной емкостью среды в КТ,
% аннексин V положительных тромбоцитов
заготовленных с ДР (Julmy F. et al.2008).
40.00
35.00
30.00
КТ-К Плазма
25.00
КТ-Rg Плазма
20.00
КТ-М Плазма
15.00
КТ-К ДР
10.00
КТ-Rg ДР
5.00
КТ-М ДР
0.00
0
1
3
День хранения
5
Рисунок 7. Оценка апоптоза (экспрессия фосфатидилсерина ) в зависимости от
способа заготовки и сроков хранения КТ.
Таким образом, обработка КТ (заготовленных обоими способами) ИП приводит к
активации тромбоцитов и к запуску в них апоптоза. Эти процессы нарастают к пятым суткам
хранения. Метод обработки клеток Rg-облучением не приводит к увеличению экспрессии Рселектина и фосфатидилсерина в течение всего периода наблюдения.
20
Раньше технология гамма – или Rg- облучения в дозе 25 Гр компонентов крови с
применением лейкоредукции были единственной альтернативой для инактивации аллогенных
лейкоцитов с целью профилактики посттрансфузионной РТПХ у пациента. На сегодняшний
день с этой целью компоненты крови подвергают обработке ИП. Поэтому интересно сравнить
два способа инактивации лейкоцитов.
Для этого провели сравнение способности к пролиферации трех категорий лейкоцитов:
не прошедших обработку (рис.8), обработанных в системе ИП (рис.9),обработанных гаммаоблучением (рис.10).
Анализ предельного разведения проводили для количественной оценки эффективности
воздействия любого способа обработки на способность Т-клеток к пролиферации. Для этого
различное количество необработанных и обработанных СD3+клеток добавляли в лунки, где
содержались аллогенные СD-3 обедненные облученные питающие клетки и факторы
стимуляции (IL-2, митоген, ФГА) и проводилась количественная оценка наличия клонов на 21й день.
Провели два эксперимента, графические результаты которых обозначены двумя линиями
(см. рис. 8,9,10). Воздействие ИП и воздействие облучения в дозе 25 Гр имели одинаковую
эффективность
при
предотвращению
пролиферации
лимфоцитов,
что
подтверждает
логарифмическоe уменьшение числа жизнеспособных Т-клеток на 4,9 и 4,3 порядка
Доля негативных результатов
соответственно.
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0%
1
10
100
Содержание CD3+ клеток/лунку
Рисунок
8.
Оценка митогенной
активности
необработанныхCD3+клеток
(в %
cодержание «негативных» лунок).
21
Доля негативных результатов
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0%
10
100
1,000
10,000
100,000
Содержание CD3+ клеток/лунку
Рисунок 9.Оценка митогенной активности обработанных ИПCD3+клеток (в %
cодержание «негативных» лунок).
Доля негативных
результатов
120%
100%
80%
60%
40%
20%
0%
10
100
1,000
10,000
100,000
СодержаниеCD3+ клеток/лунку
Рисунок 9. Оценка митогенной активности обработанных гамма-облучением в дозе 25 Гр
CD3+клеток (в % cодержание «негативных» лунок).
Для оценки клинической эффективности трансфузий КТ, заготовленных и обработанных
разными способами, проводился мониторинг пациентов, оценивались клинико-лабораторные
показатели эффективности трансфузий в каждой группе исследуемых КТ: абсолютный прирост
тромбоцитов (АПТ) через 24 часа после переливания, скорректированный прирост тромбоцитов
(СПТ) через 24 часа после переливания, продолжительность межтрансфузионных интервалов,
количество неэффективных трансфузий, количество посттрансфузионных реакций.
Проанализировано 4 группы трансфузий: КТ-Плазма (N=387), КТ-ДР(N=257), КТПлазма, обработанные ИП (N=70), КТ-ДР, обработанные ИП (N=100).
1 группа (КТ-плазма):387 трансфузий,132ж., 255м., медиана возраста11лет (4мес. -21 г)
со следующими заболеваниями: острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) - 223, острый
миелобластный лейкоз (ОМЛ) - 164.
2 группа (КТ-ДР): 257 трансфузий, 77 ж., 180 м., медиана возраста 10 лет (4 мес. -21 г) со
следующими заболеваниями: ОЛЛ - 152, ОМЛ – 105.
3 группа (КТ-Плазма, обработанные ИП): 70 трансфузий, 32 ж., 38 м., медиана возраста
15 лет (2,4-18 лет) со следующими заболеваниями: ОЛЛ - 30, ОМЛ- 40.
22
4 группа (КТ-ДР, обработанные ИП): 100 трансфузий, 38ж., 62м., медиана возраста 12
лет (4мес -21 г) со следующими заболеваниями: ОЛЛ - 56, ОМЛ – 44.
Среднее
содержание
тромбоцитов
у
реципиентов
до
трансфузии
составило
(14,2±6,9)×109/л, (13,5±6,5)×109/л,(14,6±7,0)×109/л и(13,8±6,3)×109/л в 1, 2, 3 и 4 группах
соответственно. Терапевтическая доза КТ определялась перед каждой трансфузией из расчета
0,55-0,6×1011 тромбоцитов на каждые 10 кг веса реципиента и в среднем составила
(2,3±1,1)×1011, (2,3±1,3)×1011, (2,7±1,1)×1011, (2,3±1,0)×1011в 1, 2, 3 и 4 группах соответственно.
Исследование числа тромбоцитов через 24 часа после трансфузии показало, что средний
уровень тромбоцитов через сутки после переливания составил (40,3±17,8)×109/л в 1
группе,(33,1±13,5)×109/л во2 группе, (27,4±12,0)×109/л в 3 группе и (27,2±12,6)×109/л в 4
группе. Во всех группах число тромбоцитов через сутки после трансфузии превышало исходное
значение, что свидетельствовало об удовлетворительной эффективности заместительной
терапии.
Трансфузию КТ можно считать успешной, если минимальные значения СПТ через 24
часа были больше 4,5 (Schiffer C. A. еt al. 2001). И если так оценивать все трансфузии КТ в
нашем исследовании, то можно сказать, что переливания всех исследуемых групп КТ можно
считать успешными. Но, учитывая достоверность выявленных отличий между группами КТ по
АПТ, СПТ и длительностью межтрансфузионного интервала, то необходимо более детально
сравнить полученные данные.
Таблица 3
Данные по приростам КТ, заготовленных разными методами и обработанных ИП
n
Абсолютный
Скорректированный
Межтрансфузионный
прирост, 10
прирост, 10
интервал, дни
9
9
КТ-Плазма
387
26,1±17,3(22)*
12,7± 7,5(11,4)*
2,1±1,5(2,0)*
КТ-Плазма-M
70
12,8±9,4(12)*
6,8±5,0 (6,9)*
1,7±0,9 (1,0)*
КТ-ДР
257
19,6±12,0(18,0)*
9,4± 5,7 (8,3)*
2,1±1,3(2,0)*
KT-ДР- M
100
13,3±10,7(13,0)*
6,4± 5,1 (6,1)*
1,4±0,8(1,0)*
Примечание: *р<0,05 (отличия между группами)
Выявлены
9
различия(p<0,05)
между
уровнями
9
абсолютного
9
(АПТ=26,1х10
и
9
АПТ=19,6х10 ) и скорректированного (СПТ=12,7х10 и СПТ=9,4х10 ) прироста между группами
КТ-Плазма и КТ-ДР, но, величина межтрансфузионного интервала для трансфузий этих групп
23
КТ была одинаковой -2,1дней(p<0,05). Это свидетельствует о сохранении функциональной
активности тромбоцитов в ДР, что также подтверждается более низким уровнем экспрессии Рселектина и фосфатидилсерина по сравнению с тромбоцитами, заготовленными классическим
способом (табл.3).
КТ, обработанные ИП (как в плазме, так и в ДР) характеризуются более низкими
9
(p<0,05) уровнями абсолютного (АПТ=12,8х10
9
9
и АПТ=13,3х10 ) и скорректированного
9
(СПТ=6,8х10 и СПТ=6,4х10 ) прироста. СПТ при переливании КТ-Плазма, обработанные ИП,
в 2 раза ниже, чем при переливании КТ-Плазма, не обработанные ИП. СПТ при переливании
КТ-ДР, обработанные ИП, в 2 раза ниже, чем при переливании КТ-ДР, не подвергнутые ИП.
Более низкая эффективность КТ при обработке ИП подтверждается и в снижении уровня
межтрансфузионных интервалов для КТ-Плазма и КТ с ДР, обработанных ИП (1,7 день и
1,4день соответственно),(p<0,05) и приводит к более частым трансфузиям(табл. 3). Более
частые трансфузии у детей с онкогематологическими заболеваниями приводят к повышенному
риску формирования аллоиуммунизации и инфекционных осложнений.
Эти различия связаны с тем, что после заготовки и до проведения переливания пациенту
у тромбоцитов, обработанных по технологии ИП, выявлены более высокие уровни спонтанной
и индуцированной активации тромбоцитов, что снижает их функциональную активность.
Таблица 4
Данные по приростам КТ, заготовленных с ДР и обработанных ИП, (парные трансфузии)
и перелитые одному пациенту
КТ-ДР
КТ-ДР-М
p
9
18,1±12,0 (15,0)
12,9±10,0 (12,5)
0,09
9
9,1±5,5 (8,1)
6,4±4,2 (6,3)
0,09
АПТ через 24 ч, ×10 /л
СПТ через 24 ч, ×10 /л
Мы провели исследование, когда одному и тому же пациенту проводили две трансфузии
(одна за другой) - парные трансфузии: одна трансфузия- КТ-ДР (без обработки ИП), другаяКТ-ДР, обработанная ИП. Были оценены 68 трансфузий (34 пары) по вышеуказанным
критериям (табл.4). Выявлена тенденция к снижению АПТ и СПТ после переливаний в группе
КТ, подвергнутых обработке ИП (табл. 3 и 4).
Таблица 5
Сравнение клинической эффективности трансфузий КТ, заготовленных в КТ-Плазма и КТ-ДР
24
КТ-ДР
КТ-Плазма
Доля, %
N
Доля, %
N
Всего трансфузий
257
Неэффективных
11
4,28%*
36
9,3%*
Осложнений
7
2,72%*
24
6,2%*
387
*р<0,05 (отличия между группами)
Но,
качество
трансфузии
эффективности/неэффективности
КТ
необходимо
переливания
на
оценивать
основании
и
по
критерию
мониторинга
динамики
геморрагического синдрома у пациента (до и после переливания) и по наличию или отсутствию
посттрансфузионных осложнений.
В нашем исследовании все осложнения при переливании КТ относились к группе
фибрильных негемолитических осложнений.
Переливания КТ в ДР сопровождаются значительно меньшим количеством как
постранфузионных осложнений (p<0,05), так и меньшим количеством неэффективных
трансфузий (p<0,05) (табл.5). Известно, что частота аллергических реакций при применении КТ
во взвешивающих растворах уменьшается за счет удаления плазмы. (Herve F. Франция)показал в масштабном французском исследовании, что использование PAS снижает частоту
побочных аллергических посттрансузионных реакций.
Таблица 6
Сравнение клинической эффективности трансфузий КТ, заготовленных в КТ-Плазма и КТ-ДР,
обработанных ИП
КТ-ДР-M
КТ-Плазма -М
Доля,
N
%
Доля,
N
%
Всего трансфузий
100
Неэффективных
13
13,0%
10
14,29%
Осложнений
1
1,0%
3
4,29%
70
25
Количество неэффективных трансфузий и посттрансфузионных осложнений не
отличаются в обеих исследуемых группах КТ, обработанных ИП (табл. 6).
Таблица 7
Сравнение клинической эффективности трансфузий КТ, заготовленных в КТ-ДР и КТДР, обработанных ИП
КТ-ДР-М
КТ-ДР
Доля,
N
Доля,
N
%
%
100
Всего трансфузий
257
Неэффективных
11
4,28%*
Осложнений
7
2,72%
13
13,0% *
1
1,0%*
*р<0,05 (отличия между группами)
Количество неэффективных трансфузий увеличивается в группе с КТ, заготовленных в
ДР и обработанных ИП (p<0,05). Достоверных различий по осложнениям нет (табл.7).
Таблица 8
Сравнение клинической эффективности трансфузий КТ, заготовленных в плазме и
обработанных УФ+РФ
КТ-Плазма-М
КТ-Плазма
Доля, %
N
Доля, %
N
70
Всего трансфузий
387
Неэффективных
36
9,3%*
Осложнений
24
6,2%
10
14,29%*
3
4,29%
*р<0,05 (отличия между группами)
Количество неэффективных осложнений в КТ-Плазма, обработанных по технологии ИП,
достоверно выше, чем в группе КТ, заготовленных в плазме и не обработанных ИП. По
количеству осложнений эти две группы КТ не отличаются.
Результаты
клинической
эффективности,
полученные
в
нашем
исследовании,
согласованы с зарубежными данными.
26
В рамках исследования (Slichter S. J. et al. 2009) по оценке безопасности и
эффективности обработанных с помощью системы Mirasol PRT тромбоцитов, не было выявлено
преимуществ одного методапо сравнению с другим. Автор утверждает, что для соответствия
критериям отсутствия преимуществ одного метода по сравнению с другим абсолютное
различие между двумя группами по величине CCI должно быть менее 2940. С учетом этого
между переливаниями КТ в группе обработанных УФ+РФ, и контрольной группой не было
различий в среднем числе дней между трансфузиями, в среднем числе трансфузий концентрата
тромбоцитов на одного пациента, а также в дозе перелитых тромбоцитов и по количеству
посттрансфузионных осложнений.
Slichter S. J., и Jackman R. P.провели клиническое испытаниe (MIRACLE) по
клинической оценке переливаний КТ, обработанных УФ+РФ. Пациенты, получавшие
тромбоциты, обработанные ИП, вначале показывали более низкий средний показатель прироста
тромбоцитов (CI) за периоды 1 ч и 24 ч по сравнению с контрольной (необработанные) группой
КТ. В ходе последующих трансфузий показатель прироста КТ-M не снижался. В
противоположность этому величины показателей прироста тромбоцитов в контрольной группе
неуклонно понижались по мере увеличения количества трансфузий. Одна из возможных
причин такого результата при переливании тромбоцитов в динамике заключается в развитии
аллоиммунизации пациента, в клиническом исследовании TRAP этот эффект сопровождался
высокими уровнями антител HLA (Slichter S. J. et al. 2005; Jackman R. P. et al. 2009). Для
пациентов, получающих аллогенный концентрат тромбоцитов, повышается вероятность
выработки более высокого уровня антител в организме реципиента, что приведет к выведению
тромбоцитов из кровотока. В настоящее время проводятся клинические исследования,
направленные на изучение наличия корреляции между показателями прироста тромбоцитов и
выработкой аллоантител при переливании КТ, обработанных ИП.
Заключение:
Мы проанализировали морфологические и функциональные характеристики КТ,
заготовленные методом афереза с использованием добавочного раствора. Полученные
результаты показали, что использование добавочного раствора по сравнению с плазмой
снижает спонтанную активацию тромбоцитов и способствует сохранению функциональной
активности и жизнеспособности клеток при хранении КТ. Морфологические признаки
тромбоцитов при обоих способах заготовки КТ были неизменными, а интенсивность процессов
метаболизма в КТ с ДР была ниже, чем в КТ, заготовленных в плазме. В целом, можно сделать
заключение, что условия хранения КТ с ДР обеспечивают стабильность метаболических
процессов в течение всего периода хранения КТ.
27
Морфологических изменений не выявлено при обработке КТ, заготовленных обоими
способами и подвергнутых рентгеновскому облучению в дозе 25 Гр.
Метод обработки клеток Rg-облучением не приводит к увеличению экспрессии Рселектина и фосфатидилсерина в течение всего периода хранения
При исследовании антигенной структуры тромбоцитов были выявлены более низкие
уровни экспрессиии маркеров P-селектина (связывание с CD62P) и фосфатидилсерина
(связывание аннексинV) в КТ, заготовленных с ДР и не наблюдалось значимых изменений по
экспрессии указанных маркеров в течение всего периода хранения обоих групп КТ при их
обработке рентгеновским облучением.
Данные выводы были подтверждены результатами клинического исследования по
переливаниям КТ, заготовленных разными способами. Не смотря на то, что по таким
параметрам оценки клинической эффективности, как АПТ и СПТ, группа КТ с ДР показала
более низкие значения, чем КТ в плазме, но величина межтрансфузионного интервала была
одинаковой
в
обеих
группах
КТ.
По
количеству
неээфективных
трансфузий
и
посттрнасфузионных осложнений (фибрильные негемолитические реакции) КТ с ДР показали
явное превосходство по отношению к КТ в плазме.
Нами было доказано, что обработка КТ по технологии ИП с применением УФ+РФ,
влияет на морфофункциональные характеристики тромбоцитов, что проявляется в увеличении
морфологических параметров клеток к пятому дню хранения. Обработка КТ по технологии ИП
приводит к активации тромбоцитов и запуску в них апоптоза в течение хранения. И эти
процессы нарастают к пятым суткам.
Выявленные изменения тромбоцитов при обработке ИП находят свое отражение при
последующем анализе клинического применения КТ, заготовленных двумя способами и
обработанных УФ+РФ. Переливания КТ, подвергнутые ИП, характеризуются более низкими
значениями АПТ и СПТ по сравнению с необработанными КТ, более коротким
межтрансфузионным интервалом и большим количеством неэффективных трансфузий.
Нами была доказана равнозначность обоих методов обработки КТ с целью
профилактики РТПХ у пациентов: Rg-облучение, как и ИП, эффективно снижает способность
аллогенных лимфоцитов к пролиферации. Поэтому необходимо наряду с новым способом
инактивации лимфоцитов (ИП) активно применять и стандартный метод облучения клеток в
дозе 25 Гр, учитывая его меньшую степень воздействия на клетки.
Доказав и подтвердив лучшую сохранность тромбоцитов при заготовке КТ с помощью
автоматизированного афереза с использованием добавочного раствора, данный метод заготовки
АКТ в педиатрической практике можно считать приоритетным. Данный способ заготовки КТ
28
решает проблему уменьшения трансфузионной нагрузки на пациента и проблему снижения
вероятности развития посттрансфузионных реакций.
Данная работа имеет большое практическое значение для клинических трансфузиологов
и гематологов. Наши выводы и рекомендации помогут врачам выбрать правильную тактику
трансфузионной терапии пациентам.
Выводы:
1. Концентраты тромбоцитов, заготовленные с добавочным раствором, характеризуясь
менее интенсивными процессами гликолиза, не имеют достоверных отличий по
морфологическим и биохимическим параметрам (MPV, PDf, P_LCR, pH, pO2, PCO2).
2. Концентраты тромбоцитов, заготовленные в добавочном растворе, характеризуется
более низким уровнем спонтанной экспрессии Р-селектина и фосфатидилсерина
(p<0,05), чем в концентратах тромбоцитов в 100% плазме, что приводит к сохранению
функциональной активности клеток и клинической эффективности концентратов
тромбоцитов.
3. Инактивация патогенов в концентратах тромбоцитов
приводит к увеличению
морфологических параметров клеток (MPV, PDF, P_LCR), p<0,05, что сопровождается
изменениями их функциональной активности (увеличению агрегационно-адгезионной
способности клеток при хранении). Rg-облучение не приводит к изменениям
морфологических параметров клеток.
4. Уровни экспрессии Р-селектина и фосфатидилсерина при спонтанной активации
достоверно
выше
ультрафиолетовым
в
группах
облучением
с
концентратов
тромбоцитов,
добавлением
рибофлавина
подтверждается снижением клинической эффективности
обработанных
(р<0,05),
что
переливаний концентратов
тромбоцитов, подвергнутых обработке по технологии инактивации патогенов. Rgоблучение не влияет на уровень экспрессии маркеров активации и апоптоза..
5. Rg-облучение и технология патогенной редукции являются эффективным способом для
предотвращения пролиферации аллогенных лимфоцитов (профилактика РТПХ), о чем
свидетельствует доказанное логарифмическое уменьшение их количества на 4,3 и 4,9
соответственно.
6. Переливания концентратов тромбоцитов с добавочным раствором сопровождаются
меньшим количеством постранфузионных осложнений, и меньшим количеством
неэффективных трансфузий, что доказывает их большую клиническую эффективность
по сравнению с концентратами тромбоцитов, заготовленных в плазме.
29
7. Количество неэффективных трансфузий достоверно выше в группе концентратов
тромбоцитов, заготовленных в плазме и с добавочным раствором и обработанных по
технологии с применением ультрафиолетового облучения с рибофлавином, что
приводит не только к снижению абсолютного и скорректированного прироста, но и
уменьшению межтрансфузионного интервала и, как следствие, увеличению количества
трансфузий на одного пациента. Необходимо рассмотреть возможность использования
альтернативной технологии
Практические рекомендации:
1. При стандартной заготовке аферезных концентратов тромбоцитов могут быть
использованы оба способа заготовки – классический - в 100% плазме и с добавочным
раствором - в минимальном соотношении 1:3 (30% плазмы и 70% добавочного
раствора).
2. Метод заготовки аферезных концентратов тромбоцитов с добавочным раствором
можно широко использовать в педиатрической практике и считать приоритетным
способом заготовки концентратов тромбоцитов, так как такой метод заготовки
демонстрирует лучшую сохранность тромбоцитов и решает проблему снижения
вероятности развития посттрансфузионных реакций у пациентов.
3. Способ заготовки концентратов тромбоцитов с добавочным раствором можно
считать приоритетным по отношению к донорам с точки зрения плазмосберегающей
технологии заготовки концентратов тромбоцитов.
4. При
использовании
технологии
инактивации
патогенов
с
применением
ультрафиолетового облучения и рибофлавина можно рекомендовать использовать
метод заготовки концентратов тромбоцитов в 100% плазме.
5. С учетом более низкой клинической эффективности концентратов тромбоцитов
после
обработки
ультрафиолетового
по технологии
облучения
с
инактивации
рибофлавином
патогенов
с
рекомендуется
применением
рассмотреть
возможность использования альтернативной технологии инактивации патогенных
биологических агентов в концентратах тромбоцитов.
6. При выборе тактики гемотрансфузионной терапии при переливании концентратов
тромбоцитов после инактивации патогенов с применением ультрафилетового
излучения с рибофлавином, необходимо учитывать, что срок хранения влияет на
развитие активационно-апоптических процессов в тромбоцитах и приводит к
ухудшению их функциональной активности, а, следовательно, и к снижению
30
клинической
эффективности.
Рекомендуется
использование
концентратов
тромбоцитов, обработанных по технологии с применением ультрафиолета и
рибофлавина, в кратчайшие сроки после заготовки и обработки.
Результаты работы были доложены и опубликованы:
1. Игнатова А.А, Карпова О.В., Трахтман П.Е., Пантелеев М.А. Оценка качества
аферезного концентрата тромбоцитов, заготовленного с использованием добавочного раствора
SSP+. материалы II конгресса гематологов Pоссии, 17-19 апреля 2014г. Москва // гематология и
трансфузиология. 2014. т.59, №1, с.96
2. Карпова О.В., Ройтман Е.В., Колесникова И.М., Трахтман П.Е., Румянцев С.А.
«Изменения функциоанальных показателей тромбоцитов при хранении тромбоцитных
концентратов, заготовленных разными методами». Всероссийская научно-практическая
конференция
с
международным
участием
«Актуальные
вопросы
гематологии
и
трансфузиологии», 24-25 июня 2014г, г. Санкт-Петербург.
3. Карпова О.В. Изменение функциональных показателей тромбоцитов при хранении
концентратов тромбоцитов, заготовленных разными методами. Международная научнопрактическая конференция «Актуальные вопросы и перспективы развития службы крови
Республики Казахстан», 10-11 сентября 2014 г., г. Алмата, Казахстан.
4. Eugene V. Roitman, Irina M. Kolesnikova, Oksana V Karpova, Pavel E. Trakhtman,
Sergey A. Roumiantsev. Changes in clot properties due to platelet concentrate storage (in vitro study)
// abstr. of 2ndeuplan conference, 24-26 september, Le bischenberg, France. European platelet
Network, 2014.vol. 126.p 110
5. Колесникова И.М., Ройтман Е.В., Карпова О.В., Трахтман П.Е., Румянцев С.А.
«Факторы, влияющие на изменения гемостатических свойств тромбоконцентратов при
хранении», ХIV съезд федерации анестезиологов и реаниматологов, Казань, 20-22 сентябрь
2014 C.156-157
6. И. М. Колесникова, Е.В.Ройтман, О.В. Карпова. Гемостатические свойства
тромбоцитных концентратов при хранении// Гемостаз, проблемы и достижения, 10-13 октября,
Ереван, Армения. Научно-практический журнал «Кровь», 2014. №2, с 80.
7.
Карпова
О.В.
«Сравнительная
характеристика
концентратов
тромбоцитов,
заготовленных и обработанных разными методами». Научно-практическая конференция
«Производственная и клиническая эффективность концентратов тромбоцитов плазмы,
инактивированных амотосаленом и ультрафиолетовым облучением», Санкт-Петербург 1112.11.2014г.
31
8. Eugene Roitman, Irina Kolesnikova, Oksana Karpova, Sergey Roumiantsev Subsequent
clot properties depend on the storage time of platelet concentrates // Cith abstract submission. Bleeding
disorders.cith 2014-abs-1056 Berlin Germany October 30-November 1 2014
9. О.В. Карпова, Е.В.Ройтман, А.А. Игнатова, С.Р. Мадзаев, С.А. Румянцев,
С.А. Плясунова, П.Е. Трахтман. Оценка качества тромбоцитного концентрата,
заготовленного методом афереза с использованием добавочного раствора SSP+ Журнал
«Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии 2014.»-№2(13)-С.20-24.
10. О.В. Карпова, Е.В. Ройтман, И.М. Колесникова, П.Е. Трахтман, М.Ю. Андрианова,
А.М. Исаева, С.А. Румянцев. Метаболические изменения при хранении тромбоцитных
концентратов, заготовленных разными методами. – Журнал «Трансфузиология» 2014 -№3(15)С. 30-32.
11. Е. В. Ройтман, И. М. Колесникова, О. В. Карпова. Изменения гемостатических
свойств сгустка при хранении тромбоцитных концентратов, заготовленных различными
методами.- Журнал «Гематология и трансфузиология» №3 2014-С. 30-34.
12.?????
13.??????
Список сокращений
КТ- концентрат тромбоцитов
ТРАЛИ - острое поражение легих, связанное с переливанием компонентов крови
ДР - добавочный раствор
ТИП - технология инактивации патогенов
ДТВ – доза тромбоцитов для взрослого
ТЛП - тромбоциты из лейкоцитарной пленки
ТОТП - тромбоциты из обогащенной тромбоцитами плазмы
ТОД - тромбоциты от одного донора
ЛРС - лейкоредукционная система
АПТ - абсолютный прирост тромбоцитов
СПТ - скорректированный прирост тромбоцитов
PAS - раствор для хранения тромбоцитов
ТА - TrimaAccel
AM - Amicus
MC - MCS
ПТ – РТПХ - посттрансфузионная реакция «трансплантат против хозяина»
ФНГТР - фебрльные негемолитические трансфузионные реакции
PRT – Pathogen ReductionTechnology
МСР - метод серийных разведений
РФ - рибофлавин
УФ - ультрафиолет
КТПСП - КТ с пониженным содержанием плазмы.
МКПК – мононуклеары периферической крови
SSP+ - platelet storage solution – раствор для хранения тромбоцитов
32
33