основные принципы измерения каталитической

НП «СИБИРСКАЯ АССОЦИАЦИЯ КОНСУЛЬТАНТОВ»
http://sibac.info
ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ИЗМЕРЕНИЯ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ
АКТИВНОСТИ L-ФЕНИЛАЛАНИН-АММОНИЙ-ЛИАЗЫ,
ВЫДЕЛЕННОЙ МЕТОДОМ КЛОНИРОВАНИЯ
Бабич Ольга Олеговна
к. т. н., доцент
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования «Кемеровский технологический
институт пищевой промышленности», г. Кемерово
E-mail: Olich.43@rambler.ru
Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические
кадры
инновационной
России»
на
2009-2013
годы,
го.
Контракт
№02.740.11.5133.
L-фенилаланин-аммоний-лиаза
(КФ
4.3.1.5)
катализирует
реакцию
обратимого дезаминирования аминокислоты L-фенилаланин до транс-коричной
и аммиака [3]. Фермент представляет интерес в качестве терапевтического
средства для лечения фенилкетонурии, может быть использован как для прямой
терапии фенилкетонурии, так и для производства полноценных продуктов
питания не содержащих фенилаланин [3; 1]. Кроме медицинского применения
фермент может быть использован в биотехнологии для производства Lфенилаланина из транс-коричной кислоты [2].
Целью настоящей работы явилось измерение каталитической активности
L-фенилаланин-аммоний-лиазы,
выделенной
методом
клонирования
и
экспрессии гена из Rhodosporidium toruloides с дальнейшим применением его в
пищевой
промышленности
для
создания
функциональных
и
специализированных продуктов питания для больных фенилкетонурией.
Определение количественного содержания ферментов в биологических
объектах
представляет
исключением,
ферменты
известные
в
тканях
трудности,
поскольку,
присутствуют
в
за
ничтожно
редким
малых
концентрациях. Поэтому о количестве ферментов судят по скорости
Материалы международной заочной научно-практической конференции
«АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК»
26 ОКТЯБРЯ 2011 Г.
НП «СИБИРСКАЯ АССОЦИАЦИЯ КОНСУЛЬТАНТОВ»
http://sibac.info
катализируемой реакции в определенных, согласованных условиях измерения.
При оптимальных условиях температуры, рН среды и полном насыщении
фермента субстратом скорость катализируемой реакции пропорциональна
концентрации фермента. О скорости ферментативной реакции судят или по
скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта реакции.
Для выражения активности в практической работе с ферментами часто
пользуются произвольными понятиями удельной и молярной активности.
Удельную
активность
фермента
принято
выражать
числом
единиц
ферментативной активности на 1 мг белка (или числом каталов на 1 кг
активного
белка).
Количество
молекул
субстрата,
подвергающихся
превращению одной молекулой фермента в продукт в процессе реакции в
единицу времени при полном насыщении фермента субстратом, принято
называть числом оборотов фермента, или молярной активностью
В работе определяли каталитическую активность фермента в стандартных
оптимальных условиях при рН 8,5 для этого его разводили в 50 раз в
следующих буферных растворах: цитрат-НCl, ацетат- NaOH, КН2РО4-NaOH,
Трис-HCl, Na2B4O7 - NaOH с рН от 2 до 12 с концентрацией буфера 0,1М. Затем
пробы инкубировали при +30 °С в течение 10 мин и отбирали и вносили
аликвоты в инкубационную среду для анализа. Для построения диаграммы
стабильности
L-фенилаланин-аммоний-лиазы
использовали
среднее
арифметическое
соответствующем активной
в
зависимости
значение
от
активности
кислотности, выраженной в процентах
рН
при
от
активности фермента после 10 мин инкубации при рН 8,5. Результаты
эксперимента представлены на рисунке 1.
Данные, представленные на рисунке 1, свидетельствуют о том, что Lфенилаланин-аммоний-лиаза при кислых значениях рН (ниже 7,0) практически
не активен, так например, при значении активной кислотности 5,0 его
каталитическая способность сохраняется на 83 %, а при рН 4 PAL уже
Материалы международной заочной научно-практической конференции
«АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК»
26 ОКТЯБРЯ 2011 Г.
НП «СИБИРСКАЯ АССОЦИАЦИЯ КОНСУЛЬТАНТОВ»
http://sibac.info
полностью инактивировался после 10 минутной инкубации при +30°С.
Фермент выражает свою стабильность при щелочных значениях среды, так уже
при значении активной кислотности 7,0 увеличилась по сравнению с рН 5,0 в
1,2 раза. Максимальная активность выделенного фермента наблюдается в
интервале активной кислотности 8,5 до 11,5, при этих значениях рН
каталитическая
активность
составила
105 %,
т.е.
по
сравнению
с
каталитической активностью при рН 5,0 она выросла в 1,26 раз. По-видимому,
это объясняется тем, что ингибирование L-фенилаланин-аммоний-лиазы
является обратимым и происходит быстрее при рН 11,0.
Рисунок 1. Каталитическая активность L-фенилаланин-аммоний-лиазы
при различных значениях активной кислотности
100
Активность, %
80
60
40
20
0
2
4
6
8
10
Активная кислотность
Зависимость активности PAL от температуры определяли в стандартной
реакционной смеси, которую предварительно выдерживали 10 мин при
Материалы международной заочной научно-практической конференции
«АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК»
26 ОКТЯБРЯ 2011 Г.
НП «СИБИРСКАЯ АССОЦИАЦИЯ КОНСУЛЬТАНТОВ»
http://sibac.info
температуре
реакции.
Измерения
проводили
на
спектрофотометре
с
термостатом, поддерживающим нужную температуру с точностью ±0,1оС.
Реакцию начинали ферментом (10,1 мг/мл), предварительно разведенным в 50
раз 0,1 М Трис-HCl буфером рН 8,5. Для расчета активности фермента
использовали линейный участок кинетической кривой. При построении
диаграмм применяли средние арифметические значения полученных удельных
активностей. Результаты опыта представлены на рисунке 2.
Рисунок 2. Каталитическая активность L-фенилаланин-аммоний-лиазы
при различных значениях температуры
2,5
акт. Е/мг белка
2
1,5
1
0,5
0
Температура, С
Результаты анализа, представленного на рисунке 2, свидетельствуют о том,
что
оптимальной
является
температурой
температура
+50°С,
работы
именно
при
L-фенилаланин-аммоний-лиазы
этой
температуре
реакции
наблюдается максимальная каталитическая активность (2,0 Е/мг белка). Также
из диаграммы следует, что каталитическая активность снизилась почти в 2,0
раза при повышении температуры реакционной среды до +60 °С. Причем это
снижение активности не может быть вызвано необратимой денатурацией
фермента. Так, было показано, что при данной температуре фермент теряет
50 % активности за 15 мин, тогда как время реакции в данной серии
экспериментов составляло 4 минуты. Это также подтверждается тем, что во
Материалы международной заочной научно-практической конференции
«АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК»
26 ОКТЯБРЯ 2011 Г.
НП «СИБИРСКАЯ АССОЦИАЦИЯ КОНСУЛЬТАНТОВ»
http://sibac.info
время реакции не наблюдалось значительных отклонений от линейности, как,
очевидно, должно было бы быть при денатурации белка в кювете.
Таким образом, в результате исследований определена каталитическая
активность фермента в зависимости от различной активной кислотности и
различной температуры реакционной среды. Эти показатели являются очень
важными, так как от них зависит разработка технологических режимов при
производстве продуктов питания специального назначения, предназначенных
для больных фенилкетонурией. Такие продукты максимально сбалансированы
по основным пищевым компонентам и соответствуют физиологическим
потребностям живого организма, но содержат минимальную массовую долю
аминокислоты - фенилаланина.
Список литературы:
1.
A different approach to treatment of phenylketonuria: Phenylalanine degradation
with recombinant phenylalanine ammonia lyase / C. N. Sarkissian, Z. Shao,
F. Blain,
R. Peevers,
H. Su,
R. Heft,
T. M. S. Chang,
C. R. Scriver
//
Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1999.- №96.- Р. 2339-2344.
2.
Biotransformation of trans-cinnamic acid to L-phenylalanine: Optimization of
reaction conditions using whole yeast cells / C. T. Evans, K. Hanna, C. Payne,
D. Conrad, M. Misawa // Enzyme Microb. Technol.- 1987.- №9.- Р. 417-421.
3.
Sarkissian, C.N. Phenylalanine ammonia lyase, enzyme substitution therapy for
phenylketonuria, where are we now? / C. N. Sarkissian, A. Gamez //
Mol. Genet. Metab.- 2005.- №86.- Р. 22-26.
Материалы международной заочной научно-практической конференции
«АКТУАЛЬНЫЕ ПРОБЛЕМЫ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК»
26 ОКТЯБРЯ 2011 Г.