Получение полистирольных суспензий с карбоксильными

реклама
УДК 54.057
ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИСТИРОЛЬНЫХ СУСПЕНЗИЙ С
КАРБОКСИЛЬНЫМИ ГРУППАМИ НА ПОВЕРХНОСТИ ЧАСТИЦ ДЛЯ
СОЗДАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ- СИСТЕМ НА
САЛЬМОНЕЛЛЕЗ
Н.А. Лобанова1*, И.А. Грицкова1, Н.И. Прокопов1, Н.С. Серхачева1, А.Н.
Лобанов2, Я.М. Станишевский2
1 – Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования «Московский государственный
университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова», 119571,
Россия, г. Москва, проспект Вернадского, д.86,
2 - Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования «Российский университет дружбы
народов», 117198, Россия, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.
*Тел. 8(916)6727685.
E-mail: lavanda20002000@yandex.ru
Резюме. В статье показана возможность синтеза полистирольных микросфер с
узким распределением частиц по размерам со средними диаметрами 0,5 и 0,7
мкм при полимеризации стирола в присутствии полибутадиена со степенью
карбоксилирования 13% и 17% в качестве стабилизатора. На основе
полученных
микросфер
разработаны
латексные
сальмонеллезные
диагностикумы, сочетающие высокую активность и специфичность.
Ключевые слова: гетерофазная полимеризация, полистирол, латексные
диагностикумы.
OBTAINING POLYSTYRENE SUSPENSIONS WITH CARBOXYL GROUPS
ON THE SURFACE OF THE PARTICLES TO CREATE A DIAGNOSTIC
TEST SYSTEMS FOR SALMONELLOSIS
N.A. Lobanova1*, N.S. Serhacheva1, A.N. Lobanov2, Y.M. Stanishevskiy2
1 - Federal State Educational Institution of Higher Professional Education «Moscow
State University of Fine Chemical Technology named after M.V. Lomonosov»,
119571, Russia, Moscow, Vernadsky Avenue, 86,
2 - Federal State Educational Institution of Higher Professional Education « Peoples'
Friendship University of Russia », 117198, Russia, Moscow, Miclucho-Maclay str.,
6.
Abstract. The article describes the possibility of synthesizing polystyrene
microspheres with a narrow particle size distribution with mean diameters of 0.5 and
0.7 microns in the polymerization of styrene in presence of polybutadiene with a
degree of carboxylation of 13% and 17% as stabilizer. The obtained latex
microspheres designed Salmonella diagnostic tools that combine the high activity and
specificity.
Keywords: heterophase polymerization, polystyrene, latex diagnosticum.
ВВЕДЕНИЕ
Проблема синтеза полимерных суспензий с узким распределением частиц
по размерам является актуальной, поскольку область их практического
применения
чрезвычайно
широка.
Они
используются
в
качестве
калибровочных эталонов в электронной и оптической микроскопии и
светорассеивании, для определения размера пор фильтров и биологических
мембран, в качестве модельных коллоидов, для исследования кинетики и
механизма пленкообразования из латексов, а также в качестве полимерных
носителей биологических лигандов в иммунохимических исследованиях [1].
Трудность синтеза полимерных суспензий с узким распределением частиц
по размерам состоит в выборе ПАВ (поверхностно-активное вещество) и
условий формирования эмульсий, обеспечивающих образование полимерномономерных частиц по одному механизму и устойчивость полимерной
суспензии в процессе полимеризации.
Перспективным оказался предложенный недавно синтез полимерных
микросфер с диаметрами полимерных микросфер в требуемом диапазоне
значений и узким распределением частиц по размерам в присутствии
нерастворимых в воде ПАВ. Отличительной особенностью синтеза полимерных
микросфер в присутствии нерастворимых в воде ПАВ является их высокая
устойчивость с момента образования до полной конверсии мономера,
обусловленная формированием прочного межфазного адсорбционного слоя на
их поверхности. Механизм образования этого слоя основан на фазовой
несовместимости
ПАВ
и
образующегося
полимера,
и
формировании
структурно-механического фактора по Ребиндеру [2]. Этот новый научный
подход к получению полимерных микросфер с узким распределением частиц
по размерам является актуальным и требует дальнейшего развития как с точки
зрения поиска новых типов доступных ПАВ, так и новых путей формирования
межфазных слоев на поверхности частиц с подобными свойствами. Одним из
путей решения этой проблемы может быть полимеризация мономеров в
присутствии полимеров, несовместимых с образующимися в процессе
полимеризации, в качестве стабилизаторов.
Таким
образом,
целью
работы
являлся
синтез
полистирольных
полимерных микросфер с узким распределением частиц по размерам в
присутствии полибутадиена, несовместимого с образующимся в процессе
полимеризации полимером, и обеспечивающим устойчивость полимерных
суспензий на всех стадиях их синтеза и применения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Полимеризацию стирола проводили в дилатометрах при 70 оС и объемном
соотношении фаз мономер/вода 1:9 соответственно. В качестве инициатора
использовали персульфат калия (концентрация 1% в расчете на мономер), а
стабилизатора частиц - полибутадиен со среднемассовой молекулярной массой
1000 и степенью карбоксилирования 13% и 17%.
Исходные реагенты:

Стирол, Aldrich, 99%, очищали от стабилизатора 5%-ным водным
раствором гидроксида натрия, промывали водой до нейтральной реакции,
сушили над прокаленным хлористым кальцием и дважды перегоняли в
вакууме. Использовали фракцию, кипящую при 41°С (2.1 кПа), d420=0,906 г/см,
nD20=1,5450.

Персульфат калия, Sigma Aldrich, 99,9%.

Гидроксид калия, ГОСТ 24363-80 (1 изм.)

Полибутадиен - (среднемассовая ММ = 1000 Да) с разной степенью
карбоксилирования, полученный в лаборатории ИОХ им. Н.Д.Зелинского.

Вода, бидистиллят
Жидкий азот – технический продукт, использовали для дегазирования.2.2.
Синтез
карбоксилированного
полибутадиена
проводили
путем
каталитического карбонилирования окисью углерода. В опытах использовался
полибутадиен со среднемассовой молекулярной массой 1000 и степенью
карбоксилирования 13% и 17%.
Эксперименты проводились в автоклаве из нержавеющей стали с
фторопластовыми вкладышами и магнитной мешалкой. Схема автоклава
представлена на рисунке 1. Давление окиси углерода 50–60 атм., температура
90–150оС. Во вкладыш помещали: 1,410-2 моль полибутадиена, 7,810-5 моль
PdCL2(PPh3)2, 8,610-4 моль PPh3, 6,0–12,0 мл CH2Cl2, 0,3–0,45 мл H2O.
Соотношение полимер/катализатор можно варьировать.
Структуру
исходного
полибутадиена
определяется
методом
ИК–
спектроскопии. Для определения наличия карбоксильных групп на поверхности
частиц снимали спектры полимерных пленок на спектрофотометре IR–435
“Shimadzu” (Япония) и регистрировали поглощение в области 1500–2000 см-1.
Характеристический пик поглощения карбонильной группы соответствует
1720–1760 см-1. Пик может быть расщеплен в случае, когда карбонилирование
протекает и по третьему и по четвертому атому углерода. Продукт высушивали
лиофильной сушкой и хранили в виде раствора в хлористом метилене.
рис. 1. Автоклав для гидрокарбоксилирования полибутадиена
1  корпус автоклава
6  фторопластовый стакан
2  крышка автоклава
7  канал для подвода газа
3  канал для термопары
8  канал для отбора пробы
4  канал для показывающей
9  канал для манометра
термопары
5  фторопластовое уплотнительное
10  магнитная мешалка
11  печка
кольцо
Для оценки распределения частиц полимерной суспензии по размерам
использовали фотонный анализатор частиц Zetasizer NanoZS фирмы «Malvern»
(Великобритания), с диапазоном измерений частиц от 0,6 до 6000 нм. Рабочий
интервал температур составляет 2 оС – 120 оС, концентрации 0,1 мг/мл до 40%,
угол детектирования рассеянного света 173º, в качестве источника света
используется гелий-неоновый лазер с длинной волны 633 нм, мощность
источника света 5 мВт. Прибор определяет размеры частиц при помощи
измерения скорости флуктуации рассеянного света частицами. Измерение
проводили в автоматическом режиме по стандартной методике [3].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ИК-спектр и микроструктура исходного полибутадиена приведены на
рисунке 2 и в таблице 1.
Рис. 2. ИК–спектр исходного полибутадиена ( Mw = 1 000).
Таблица 1. Микроструктура исходного полибутадиена
Микроструктура
Mw  1000
1,4–цис звенья
44%
1,4–транс звенья
29%
1,2 звенья
27%
Карбоксилирование полибутадиена проводили в автоклаве по методике,
описанной ранее. Наличие в полимерах карбоксильных групп подтверждается
ИК–спектрами (рисунок 3) в области 1500–2000 см-1. В отличие от ИК–спектра
исходного полибутадиена (рисунок 2) на спектре КПБ (карбоксилированного
полибутадиена) появляется пик в области 1720–1760 см-1, характерный для
карбонильной группы (>С=О).
В данном случае пик расщеплен, так как карбонилирование идет
равновероятно по 3 или 4 атому углерода:
В таблице 2 представлены условия получения и свойства, используемых в
работе
карбоксилированных
полибутадиенов.
Видно,
что
степень
карбоксилирования, определяемая как количество прореагировавших двойных
связей исходного полибутадиена, можно варьировать в широком диапазоне 
от 10% до 60%. Можно отметить, что возрастание температуры, времени
карбоксилирования и количества катализатора, приводит к возрастанию
степени карбоксилирования.
А
Б
Рис. 3. ИК–спектр карбоксилированного полибутадиена (А)- степень
карбоксилирования – 17%, (Б) - степень карбоксилирования – 13%.
Таблица 2. Условия получения и свойства КПБ.
Маркировка
Исходный
Количество
полибутадиен, катализатора,
Mw , Кп
Температура,
о
С
Время,
Степень
час
карбоксили-
моль/моль
рования, %
мономерных
звеньев
КПБ–10–1
КПБ–13–1
КПБ–17–1
Mw  10
3
Кп=2
КПБ–60–1
310-4
120
2,5
10
310-4
122
3
13
1,210-
136
4
17
140
3
60
4
110-3
Степень карбоксилирования, варьировали в широком диапазоне значений
 от 10% до 60%, изменяя температуру, время и количество катализатора.
Было исследовано влияние на протекание полимеризации добавки
карбоксилированного полибутадиена, обладающего хорошей растворимостью в
водных растворах щелочи (степень карбоксилирования около 60%). Скорость
полимеризации при использовании водорастворимых КПБ намного превышает
скорость полимеризации при использовании маслорастворимых КПБ. Так, для
КПБ со степенью карбоксилирования 60% и концентрацией в водной фазе 1%,
скорость полимеризации составляет 3,1%/мин, в то же время, для КПБ со
степенью карбоксилирования 17% и концентрацией 10% в мономерной фазе,
скорость полимеризации равна 0,45%/мин. Но при полимеризации в присутствии
КПБ с высокой степенью карбоксилирования не удавалось получить
полимерные суспензии с узким распределением частиц по размерам. Они
оказались перспективными в качестве ПАВ для суспензионной полимеризации
стирола и метилметакрилата.
Полимеры с высокой степенью карбоксилирования (60%), обладающие
хорошей растворимостью в водных растворах щелочей и практически
нерастворимые в мономере (стирол), в дальнейших исследованиях не
использовались. Исследования были начаты с синтеза полимерных суспензий в
присутствии КПБ со среднемассовой молекулярной массой 1000 и степенью
карбоксилирования 13%.
На рисунках 4 и 5,
синтезированных
приведены микрофотографии и гистограммы
полимерных
суспензий.
Полученные
полимерные
микросферы имели размер в пределах 0,5–0,7 мкм и коэффициент вариации 3–
6%. Определенной зависимости между концентрацией КПБ и размером
микросфер не наблюдается (рисунок 6). Можно отметить, что с увеличением
диаметра микросфер возрастает коэффициент вариации: от 11% (при среднем
диаметре частиц 515 нм) до 42% (при среднем диаметре частиц 722 нм).
(1)
(2)
Рис. 4. Микрофотографии полистирольных суспензий, синтезированных в
присутствии КПБ со степенью карбоксилирования 13% (1) и КПБ со степенью
карбоксилирования 17% (2)
(1)
Рис.5. Гистограмма распределения частиц по размерам полистирольной
суспензии, полученной в присутствии КПБ со степенью карбоксилирования
13% (1) и 17% (2).
(2
Рис. 6. Зависимость среднего диаметра частиц и коэффициента вариации
от концентрации КПБ.
Полистирольные микросферы с карбоксильными группами на поверхности
(диаметром ~ 0,7 мкм), полученные методом гетерофазной полимеризации в
присутствии КПБ со среднемассовой молекулярной массой 1000 и степенью
карбоксилирования 13% были использованы в качестве носителей биолигандов
для создания диагностических тест-систем на сальмонеллез.
Перед использованием латексную суспензию в концентрации 2-4%
подвергали обработке в ультразвуковом диспергаторе в течение 3-5 минут с
целью устранения агломератов.
Из всех испытанных буферных систем наилучшие результаты были
получены при использовании глицинового буфера с рН 8,2-8,4.
Оптимальным способом очистки иммуноглобулинов является метод с
использованием ДЭАЭ-сефадекса А-50.
При использовании метода физической адсорбции ПМ (полимерные
микросферы) взаимодействуют с антителами за счет сил электростатического и
гидрофобного взаимодействия. В результате проведенных исследований
установлено, что методом физической адсорбции не удалось получить
стабильные латексные диагностикумы. Известно, что при физической
адсорбции
в
Основными
системе
протекают
процессами,
различные
оказывающими
динамические
влияние
на
процессы.
стабильность
диагностикумов, полученных методом физической адсорбции, являются
процессы десорбции белковых молекул, а также замена одних белковых
молекул на другие, или обмен на такие же молекулы. Следствием этого
является зависимость адсорбированного слоя от времени и присутствие в
системе белковых молекул с измененной конформацией, что обусловливает
быстрое снижение чувствительности полученных препаратов.
Метод химической активации функциональных групп ПМ позволял
получить более прочную и долговременную ковалентную связь носителя с
антителами, а также обеспечивал оптимальную адсорбцию антител на
поверхности ПМ, по сравнению с физической адсорбцией.
Одностадийный
метод
активации
с
использованием
ВРК
(водорастворимые карбодиимиды) и двухстадийный метод «активированных»
эфиров при подборе оптимальных физико-химических параметров давали
хорошие результаты. При использовании для активации функциональных
групп водорастворимых карбодиимидов, время активации 10–15 минут при
постоянном перемешивании и температуре 4–6С. Время сенсибилизации ПМ
антителами составляло 1,5–2 часа при температуре 4–6С при постоянном
перемешивании.
Затем
диагностикум
выдерживали
10–14
часов
при
температуре 4С. Конечная концентрация диагностикума составляла 2%.
К преимуществам данного способа следует отнести его простоту. Однако,
из-за того, что белковые молекулы содержат как карбоксильные, так и
аминогруппы, возможно протекание меж– и внутримолекулярного сшивания,
что
снижает
использовании
биохимическую
данного
активность
способа
лиганда.
возможны
Кроме
значительные
того,
при
изменения
ориентации и конформации белковых молекул, т.к., они являются высоко
динамичными
структурами,
что
может
привести
к
неспецифической
агглютинации.
В значительной степени этот недостаток устраняется путем использования
двухстадийного метода активации. На первой стадии карбоксильные группы
переводили в активную (но стабильную) форму и ПМ отделяли методом
фильтрования через мембранные
дисперсионной
среды
с
фильтры с диаметром пор 0,45 мкм от
оставшимися
в
ней
непрореагировавшими
компонентами, а на второй стадии проводили ковалентное связывание с
иммуноглобулинами.
При этом использовали гидроксисукцинимид и ВРК в соотношении – 2:1
(по массе). Реактивы к суспензии ПМ добавляли порционно, на встряхивателе.
Активация протекала в течение 30 минут при постоянном перемешивании и
температуре
4-6С.
Активированные
таким
образом
ПМ
отмывали
фильтрованием от избытка реагентов. Сенсибилизацию ПМ осуществляли в
течение 2,5-3 часов на встряхивателе при температуре 4-6С. Диагностикум
дополнительно выдерживали 18-20 часов при 4-6С. Итоговая концентрация
диагностикума составляла 2%.
Концентрацию
адсорбированного
иммуноглобулина
определяли
измерением оптической плотности исходного раствора иммуноглобулина и
оптической
плотности
фильтрата,
содержащего
несвязавшиеся
иммуноглобулины на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Количество
адсобированных на поверхности ПМ иммуноглобулинов составляла 90
мкг/см3 2%-ной суспензии ПМ.
Для блокады несвязавшихся активных групп весьма удачным оказалось
использование 0,5М раствора глицина в течение 20-30 минут при постоянном
перемешивании.
Однако,
при
подборе
оптимальной
концентрации
иммуноглобулинов или антител, необходимость в блокаде свободных активных
групп может отпадать.
При получении латексных диагностикумов двухстадийным методом
«активированных» эфиров, чувствительность препаратов была выше, чем при
использовании одностадийного метода с применением водорастворимых
карбодиимидов и составляла 106 м.к./см3.
Проверку специфичности полученных поливалентных и монорецепторных
сальмонеллезных
агглютинации)
диагностикумов
на
стекле
с
проводили
чистыми
в
РЛА
культурами
(реакции
латекс-
микроорганизмов
гомологичных и гетерологичных родов и видов. Параллельно ставили
необходимые контроли. Результаты приведены в таблицах 3, 4 и 5.
Таблица 3. Результаты проверки специфичности поливалентного
сальмонеллезного диагностикума
Наименования культур
Контроль
Контроль-
микроорганизмов (109 м. к./см3)
(физ.р-р)
ный пре-
1*
2**
парат
1
2
3
4
5
1. Salmonella london
-
-
+
-
2. Salmonella infantis
-
-
+
-
3. Salmonella dublin
-
-
+
+
4. Salmonella anatum
-
-
+
-
5. Salmonella gallinarum (pullorum)
-
-
+
+
6. Salmonella enteritidis
-
-
+
+
7. Salmonella virchow
-
-
+
-
8. Salmonella choleraesuis
-
-
+
-
9. Salmonella typhimurium
-
-
+
-
«+»
– положительный результат реакции
«-»
– отрицательный результат реакции
1*
– поливалентный сальмонеллезный диагностикум
2**
– монорецепторный сальмонеллезный диагностикум к группе D
При
проверке
использованием
специфичности
гетерологичных
диагностических
культур
семейства
тест-систем
с
Enterobacteriaceae
перекрестных реакций отмечено не было. При РЛА с гомологичными
культурами микроорганизмов наблюдали образование хорошо видимых
агглютинатов с просветлением фона.
Чувствительность полученных диагностикумов оценивали в РЛА с
разведениями чистых культур микроорганизмов гомологичных видов в
концентрации от 109 до 104 м.к./см3.
Таблица 4. Проверка чувствительности поливалентных сальмонеллезных
диагностикумов
Наименование
Контроль
культур
(физ р-р)
Концентрация микроорганизмов,
м.к./см3
109
108
107
5х106
106
105
1.Salmonella dublin
-
+
+
+
+
-
-
2.Salmonella anatum
-
+
+
+
+
-
-
3.Salmonella gallinarum
-
+
+
+
+
-
-
4.Salmonella enteritidis
-
+
+
+
+
-
-
5.Salmonella virchow
-
+
+
+
+
-
-
6.Salmonella choleraesuis
-
+
+
+
+
-
-
7. Salmonella typhimurium
-
+
+
+
+
-
-
(pullorum)
«+»
– положительный результат реакции
«–»
– отрицательный результат реакции
Таблица 5. Проверка чувствительности монорецепторных диагностикумов
к группе D
Наименования
Контроль
культур
(физ р-р)
Концентрация микроорганизмов,
м.к./см3
109
108
107
5х106
106
105
1.Salmonella dublin
-
+
+
+
+
-
-
2..Salmonella gallinarum
-
+
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
(pullorum)
3..Salmonella
enteritidis
«+»
– положительный результат реакции
«–»
– отрицательный результат реакции
Чувствительность препаратов составляла 5х106 м.к./см3. Наблюдали
образование хорошо заметных агглютинатов с просветлением фона в течение
1–2 минут после смешивания компонентов при отрицательных контролях.
Из полученных данных видно, что максимальная чувствительность
диагностических препаратов составляла 5х106 м.к./см3. При этом концентрация
иммуноглобулинов составляла 92 – 94 мкг/см3 при значении рН среды 8,0 – 8,2.
Полученные
поливалентные
и
монорецепторные
сальмонеллезные
диагностикумы хранили при температуре +4С, периодически определяя
активность препаратов (с интервалом 1 раз в неделю). При создании
диагностикумов с помощью вышеописанного метода их чувствительность
сохранялась на первоначальном уровне в течение 5 – 6 месяцев.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, при полимеризации стирола в присутствии полибутадиена
со степенью карбоксилирования 13% и 17% при их концентрации 3 % масс. в
расчете на мономер, были синтезированы полимерные суспензии с узким
распределением частиц по размерам, устойчивые в процессе синтеза и в
физиологическом растворе со средними диаметрами 0,5 и 0,7 мкм.
Разработанные нами латексные сальмонеллезные диагностикумы сочетают
высокую активность и специфичность, а их использование характеризуется
методической простотой и быстротой, характерной для агглютинационных
тестов.
Приведенные
выше
результаты
показывают,
что,
несмотря
на
значительное количество предлагаемых в научной литературе способов
получения латексных диагностикумов, в каждом конкретном случае необходим
подбор индивидуальных условий и режимов с учетом характеристик
поверхности полимерных микросфер, функциональных групп, расположенных
на поверхности полимерных микросфер, условий их активации, адсорбции
антител и оптимального соотношения сорбента и белка.
ЛИТЕРАТУРА
1.
Дж. Уайтсайдс. Нанотехнологии в ближайшем десятилетии. Прогноз
направлений, исследований / Под. Ред. М. К. Роко. Пер. с англ. — М.: Мир.
2002. 292 с.
2.
П.А. Ребиндер. Механические свойства и стабилизирующие действия
адсорбционных слоев в зависимости от степени их насыщения // Коллоидный
журнал. 1958. №2. Т. 20. С. 527-535.
3.
Determination of Particle Size. Photon Correlation Spectroscopy. ISO TS
24/SC4/WG7 Fourth Draft, 1993.
Скачать