На правах рукописи КОНОВАЛОВА ЕВГЕНИЯ ВИКТОРОВНА ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ КАРНОЗИНА, ВКЛЮЧЕННОГО В
реклама
На правах рукописи КОНОВАЛОВА ЕВГЕНИЯ ВИКТОРОВНА ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ КАРНОЗИНА, ВКЛЮЧЕННОГО В СОСТАВ НАНОЛИПОСОМ, В УСЛОВИЯХ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА IN VITRO И IN VIVO 03.01.04 - «биохимия» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва - 2013 1 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный Центр Неврологии» Российской академии медицинских наук Научный руководитель: доктор биологических наук, Федорова Татьяна Николаевна Официальные оппоненты: Муронец Владимир Израилевич доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом биохимии животной клетки, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Орлова Елена Владимировна доктор биологических наук, руководитель группы клеточных технологий и нанокомпозитных материалов, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук. Защита состоится 23 декабря 2013 г. в 14 ч 00 мин. на заседании диссертационного совета Д. 001.002.01 при ФГБУ «НИИ питания» РАМН по адресу: 109240, Москва, Устьинский проезд, д.2/14. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ питания» РАМН. Автореферат разослан 22 ноября 2013 г. Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор В.М.Коденцова 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. В настоящее время развитие окислительных реакций в различных биологических структурах рассматривается как один из основных повреждающих механизмов. Особенно значимыми эти процессы являются для нервной системы, что связано с избирательной чувствительностью клеток возбудимых тканей к окислительной деструкции (Halliwell and Gutteridge, 1999). Нерегулируемое образование активных форм кислорода (АФК) в условиях недостаточной эффективности эндогенной антиоксидантной системы приводит к индукции окислительного стресса (ОС), сопровождающего патологические процессы в ЦНС (Tsai, Lieber, 2010). Показано, что развитие ОС активирует каскадный механизм саморазрушения нейронов по пути апоптоза или некроза. Для изучения механизмов развития ОС, индуцированного нейротоксинами в условиях in vitro, используется клеточная культура линии РС-12. Особенностью этих клеток является способность к образованию нейритов в ответ на действие фактора роста нервов NGF (Greene, Tischier, 1976). Дифференцировка клеток сопровождается такими характерными признаками как формирование нейронального фенотипа, определённая последовательность событий в клетке во время пролиферации, экспрессия нейрональных маркеров и секреция нейротрансмиттеров (Vandry et.al., 2002; Wesering, Ewing, 2008). В условиях in vivo для оценки нейропротекторного действия изучаемых соединений разрабатываются различные экспериментальные модели заболеваний ЦНС на здоровых животных, что ограничивает объективность получаемых результатов. С этой точки зрения одним из наиболее подходящих объектов являются мыши линии SAM, характеризующиеся ускоренным темпом старения и сниженным уровнем антиоксидантной защиты (Болдырев А.А. 2004, Федорова Т.Н и соавт, 2005). Природными протекторами клеток и тканей от окислительного стресса являются антиоксиданты, одним из которых является природный дипептид карнозин (β-аланин-Lгистидин) - антиоксидант прямого и непрямого действия, также проявляющий свойства протонного буфера, хелатора ионов металлов, модулятора супероксиддисмутазы и NMDAрецепторов (Boldyrev, 2006; 2012; Bellia F., 2011). Однако, для достижения стабильного протекторного эффекта требуется введение избыточных доз карнозина, чтобы компенсировать его гидролиз под действием специфических дипептидаз – тканевой и сывороточной карнозиназ (Lenny, J. F., 1990). Повысить эффективность карнозина можно путем его модификации, обеспечивающей устойчивость дипептида к действию карнозиназ, или связав его в структуру, недоступную для ферментов. Ранее были описаны производные карнозина, полученные путем его конденсации с Тролоксом®, обладающие основными биологическими свойствами карнозина, но при этом характеризующиеся высокой устойчивостью к карнозиназе (Stvolinsky 3 et al., 2010). Другим подходом к этой проблеме может быть включение карнозина в наноструктурные конструкции, наиболее распространенными среди которых являются нанолипосомы. Нанолипосомы определяются как липосомы в пределах наномерных размеров, везикулы которых образованы одно- или мультибислойными оболочками из амфифильных липидных молекул и содержат одно или несколько водных отделений (2002 Guidance for industry: liposome drug products. Rockville, MD: U.S. Food and Drug Administration). В последние годы как в России, так и за рубежом проводятся исследования по возможности применения нанокомплексов на основе фуллеренов, ферригидрита, синтетических полимеров, липосом и других нанокострукций. Принципиально значимыми являются данные о способности наноструктур преодолевать гематоэнцефалический барьер и проявлять заданные свойства при их адресной доставке в мозг. Физико-химические особенности наноразмерных структур делают эти конструкции перспективными для создания новых лекарственных препаратов. Уже утвержден ряд липосомальных препаратов для лечения онкологических заболеваний и различных инфекций (Zolnik B.S., Sadrieh N., 2009). Выявлена перспектива использования липосом в лечении заболеваний ЦНС, включая опухоль мозга, ишемию, инфекции и энцефалиты (Zhong Y., Bellamkonda R. V., 2008; Reddy M. K., Labhasetwar V., 2009). В то же время, оценка протекторного действия наноразмерных биологически активных композиций в условиях моделирования патологических процессов в мозге, развивающихся под действием многофакторного ОС, является актуальной задачей. С этой точки зрения создание наноструктурных комплексов на основе карнозина в составе фосфолипидных структур липосом является актуальной задачей. В настоящей работе впервые предпринята попытка использовать карнозин, включенный в состав фосфолипидных наноструктур, на биологических моделях in vitro и in vivo в условиях окислительного стресса. Работа выполнена в соответствии с планом НИР ФГБУ «НЦН» РАМН в рамках темы № 146 «Исследование в условиях in vitro и in vivo проблем эффективности безопасности наноструктурных комплексов, обладающих нейропротекторным действием». Цель работы: оценить защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, в условиях индуцированного окислительного стресса in vitro (нейроны и клетки РС-12) и in vivo (мыши с ускоренным темпом старения). Задачи работы: 1. Охарактеризовать морфологические и функциональные свойства клеток PC-12, полученных в результате дифференцировки под действием фактора роста нервов NGF. 4 2. Выявить экспрессию мембранных белков: NMDA-рецепторов в клетках PC-12, дифференцированных под действием фактора роста нервов NGF. 3. Оценить действие индукторов окислительного стресса (пероксид водорода, гомоцистеиновая кислота, NMDA-специфический агонист NMDA-рецепторов, полиамины и продукт их распада акролеин) на продукцию АФК и гибель клеток РС-12. 4. Оценить протекторное действие карнозина в условиях токсического влияния индукторов окислительного стресса на рост АФК и гибель клеток PC-12. 5. Оценить протекторное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом на рост АФК и гибель клеток PC-12 (дифференцированных по нейрональному типу) в условиях токсического влияния полиаминов (спермина, спермидина и путресцина). 6. Оценить защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, на нейроны, выделенные из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения, в условиях ОС, индуцированного пероксидом водорода. 7. На модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с ускоренным темпом старения выявить позитивные эффекты карнозина, включенного в состав нанолипосом на физиологические (время потери позы, время «жизни на высоте», время до остановки дыхания, время реституции, способность к обучению) и нейрохимические (общая антиоксидантная активность) параметры. Научная новизна: Впервые на суспензии нейронов (в условиях ОС, индуцированного перекисью водорода), выделенных из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1) показано протекторное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом в сопоставлении с карнозином. Впервые выявлено защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом в условиях токсического действия полиаминов (спермина, спермидина и путресцина), а также продукта их распада акролеина на рост АФК и гибель клеток PC-12 в сопоставлении с карнозином. Впервые в условиях ОС in vivo на модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1/SAMR1) показано защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, проявляющееся в улучшении физиологических параметров и повышении антиоксидантной активности мозга животных. Теоретическая и практическая значимость: полученные результаты послужат обоснованием для разработки и применения высокоэффективных и специфичных препаратов, обладающих способностью к контролируемому транспорту в зону повреждения мозга. 5 Основные положения, выносимые на защиту: 1. Полученные в результате дифференцировки под действием фактора роста нервов NGF клетки PC-12 по морфологии имеют сходство с нейронами, по функциональным свойствам характеризуются наличием NMDA рецепторов и могут быть использованы в качестве модели для изучения патологических процессов, происходящих в ЦНС. 2. Карнозин, включенный в состав нанолипосом, оказывает более выраженное протекторное действие на уровень АФК и гибель нейрон-подобных клеток PC-12 относительно карнозина в условиях токсического влияния полиаминов (спермина, спермидина и путресцина). 3. Защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом на нейроны, выделенные из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения, проявляется в условиях ОС, индуцированного перекисью водорода. 4. На модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1) показано защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом на физиологические (время потери позы, время «жизни на высоте», время до остановки дыхания, время реституции, способность к обучению) и нейрохимические (общая антиоксидантная активность) параметры. Протокол диссертационного исследования «Защитное действие карнозина, включенного в состав нанолипосом, в условиях окислительного стресса in vitro и in vivo» был одобрен локальным этическим комитетом ФГБУ «НЦН» РАМН (протокол №12/12 от 10.10.2012 г). Апробация работы: диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместном собрании научных сотрудников неврологических отделений и лабораторий ФГБУ «НЦН» РАМН (протокол №10 от 18 октября 2013 года). Материалы диссертации были представлены на 7 международных конференциях: «Expression of Na/K-pump and N-methil-D-aspartat receptors in pheochromocytoma cells, activated by dexamethasone and nerve growth factor» Konovalova E., Dizhevskaya A., Boldyrev A (Италия, Флоренция, 2009); «Dexamethasone and rhu-NGF as differentiation factors of PC-12 cells» Konovalova E., Dizhevskaya A., Boldyrev A (Словакия, Мартин, 2009); «Carnosine containing nanoliposomes protect PC-12 cells and neurons from oxidative stress in vitro» Konovalova E., Karpova L., Stvolinsky S., Boldyrev A. (Бельгия, Гент, 2011). «Нейропротекторные эффекты нанолипосом, содержащих карнозин» Е.В. Коновалова, О.А.Шадрина, О.А.Трунова, С.Л.Стволинский (Украина, Судак, 2012), «Моделирование биохимических процессов нейродегенерации и способы её коррекции» М.Г.Маклецова, Е.В. Коновалова, С.Л. Стволинский, Т.Н.Федорова (Россия, Ростов-на-Дону, 2012), «New mechanisms of 6 neuroprotective carnosine action: role of polyamine system.» Konovalova E., Kulikova O., Stvolisky S., Makletsova M., Rikhereva G., Fedorova T. (Bath, UK. 2013), «Polyamines neurotoxicity at the brain and ways of its correction». Konovalova E., Kulikova O., Stvolisky S., Makletsova M., Rikhereva G., Fedorova T. (Saint Petersbourg, Russia, 2013). Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 2 статьи в научных рецензируемых журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки РФ. Конкретное личное участие автора в получении результатов: автору принадлежит определяющая роль в постановке задач диссертационной работы и их выполнении, а также в анализе и обосновании полученных результатов (эксперименты на клеточной культуре РС-12 и на нейронах мозжечка in vitro и на модели острой гипобарической гипоксии у быстро стареющих мышей in vivo). Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 43 отечественных и 175 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 42 рисунками. Материалы и методы исследования В условиях in vitro экспериментальные исследования проведены на клетках линии РС-12 и суспензии нейронов, выделенных из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения. Окислительный стресс in vitro в суспензии выделенных гранулярных клеток мозжечка создавали инкубацией в среде 3,5 мМ пероксида водорода в течение 30 мин при 37 ОС; в клетках линии РС-12 – инкубацией в среде 5 мМ пероксида водорода в течение 60 мин при 37ОС, 1 мМ N-метил-D-аспартата (NMDA) в течение 30 мин при 37ОС, 500 мкМ гомоцистеиновой кислоты в течение 30 мин при 37ОС, 10 мкМ и 100 мкМ акролеина в течение 1, 3 и 24 ч при 37 ОС, а также с полиаминами (спермин, спермидин и путресцин - в дозе 500 мкМ, в течение 60 мин) Уровень активных форм кислорода (АФК) и количество мертвых клеток определяли методом проточной цитометрии (Sureda F.X.et al., 1998; A.Boldyrev et al., 1999). Работа была проведена на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences, USA). В каждом измерении регистрировали 10000 событий. Данные обрабатывали с помощью программы ModFit LTTM(BD Biosciences, USA) и Cell Quest Pro (BD Biosciences, USA), средние значения интенсивности флуоресценции рассчитывали в Microsoft Exel (Microsoft, США). 7 Для измерения внутриклеточного уровня АФК использовали флуоресцентный краситель DCFН2-DA (2,7-дихлордигидрофлуоресцеин-диацетат, λex = 485 нм, λem = 535 нм), высвобождающийся внутри клеток, в конечной концентрации 100 мкМ. Определение доли мертвых клеток проводили с помощью флуоресцентного красителя иодида пропидия (PI, λex =485 нм, и λem =610 нм) в конечной концентрации 10 мкМ. Анализ клеток РС12 на наличие субъединиц NR1 и NR2b NMDA рецепторов исследовали методом непрямого флуоресцентного окрашивания антителами. Субъединицы NR1 и NR2b NMDA рецепторов обладают разной активностью. NR1 субъединица встроена в мембрану, и выполняет каналообразующую функцию. NR2b субъединица выполняет регуляторную функцию белка. Контрольные клетки окрашиваются только вторичными антителами, для того чтобы исключить фоновое окрашивание. Опытные образцы окрашиваются первичными и вторичными антителами. Титр антител использовали 1:000, рекомендованный протоколом Cell signaling Technology, Германия. Наноструктурные препараты на основе карнозина. В работе использовали два вида липосомальных наноконструкций: 1. Липосомы, состоящие из 95,3% фосфолипидов, 2,5% неполярных липидов и содержащие 1,2% L-карнозина (карнозин содержащие липосомы, КСЛ), стерилизованные автоклавированием при избыточном давлении 1 атм в течение 45 мин. Средний диаметр липосомальных частиц составлял 150-160 нм. Оценку эффективности КСЛ проводили на суспензии нейронов мозжечка и на модели острой гипобарической гипоксии у мышей с ускоренным темпом старения. 2. Липосомы, состоящие из следующей липидной композиции: 1,2-дипальмитол-снглицеро-3-фосфохолин, 1,2-дистеароил-сн-глицеро-3-фосфохолин (Lipoid GmbH, Germany), 1,2дистеароил-сн-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [малеимид (полиэтилен гликоль) -2000] (соль аммония) и холестерол (Avanti Polar Lipids, Inc., USA). Было выбрано определенное молярное соотношение липидов (23:16:1.6), чтобы загруженность липидов карнозином составила 84%. Гидродинамический размер везикулы составляет 150 нм (рис. 1). Работа выполнена в лаборатории института Philipps-Universität Marburg Department of Pharmaceutics & Biopharmacy (г.Марбург, Германия) Левачёвой Ириной Сергеевной. 8 Рис. 1. Нанолипосомы. Проба, полученная на трансмиссионном электронном микроскопе методом замораживания-скалывания. Размер каждой липосомы составляет около 150 нм. Концентрацию карнозина в нанолипосомах измеряли методом определения карнозина в безбелковом экстракте по диазореакции (Практикум по биохимии изд. МГУ под ред. С.Е.Северина, Г.А. Соловьёвой). Карнозин и карнозин в составе нанолипосом (в концентрации 1 мМ) добавляли за 1 ч до инкубации с индукторами ОС. Выделение гранулярных клеток мозжечка проводили из 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения (Sureda F.X. et al., 1998). Дифференцировка клеток PC-12 под действием фактора роста нервов NGF и дексаметазона. Клетки инкубировали в СО2 инкубаторе в присутствии 5% СО2 при 98% влажности и 37˚С. Фактор роста нервов (NGFβ) вносили в клетки в концентрации 0,1 нг/мл и оставляли на 48 ч. Для сравнения степени и качества дифференцировки часть клеток была продифференцирована по почечному типу с помощью дексаметазона. Сравнительный анализ проводили по морфологическим различиям, а также по количеству функциональных NMDA рецепторов. Окислительный стресс in vivo индуцировали с помощью острой гипобарической гипоксии. Экспериментальные исследования выполнены на быстростареющих мышах линии SAM (Senescence Accelerated Mice, клоны SAMR1 - resistance и SAMP1 - Prone) SPF-категории, выращенных в Питомнике экспериментальных животных в Пущино-на-Оке. Все эксперименты проводили с соблюдением регламента работы с экспериментальными животными, утвержденного Международным этическим комитетом (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals -- Russian Version The National Academies, Washington, D.C. (1996). Острую гипобарическую гипоксию (ОГГ) создавали в барокамере проточного типа для предотвращения развития эффекта гиперкапнии (Агаджанян А.Н., 1986; Boldyrev A.А. et al., 1997). Опыты выполнены на 8-месячных мышах линий SAMR1 (n=25) и SAMP1 (n=25), 9 самцы:самки - 50:50%, весом 25-30 г. Мышей из каждой линии делили на 2 группы по 12-13 особей в каждой. Животным одной из групп за 1 ч до гипоксического воздействия вводили внутрибрюшинно раствор карнозин содержащих липосом в дозе 48 мг/кг массы тела), животным другой группы (контрольной) – физиологический раствор. Определение общей антиоксидантной активности в образцах ткани мозга проводили по реакции восстановления стабильного радикала 2,2’-дифенил-1-пикрилгидразила, ДФПГ (Schlesier, K. et al., 2002). Статистическую обработку результатов проводили при помощи программ Microsoft Exel, а также компьютерной прикладной программы “Statistica 6.0”. Полученные данные представлены в виде M±m. Достоверность различий между группами оценивали по t-критерию Стьюдента и Манна-Уитни. Достоверность различий принималась при p<0,05. Результаты исследования Морфологическая и функциональная характеристика культуры клеток РС-12 В работе использована как интактная культура клеток РС-12, так и дифференцированная по нейрональному типу. а б в Рис. 2. Клеточная культура PC-12 в интактном состоянии (а), стимулированная дексаметазоном (б), стимулированная фактором роста нервов (в). В культуре интактных клеток, представленной на рис 2.а преобладают шарообразные клетки, некоторые из которых имеют отростки, сопоставимые по длине с размером клеток. Отростки не сужаются на дистальном конце, а имеют такой же диаметр, что и на проксимальном. Клетки, стимулированные дексаметазоном (дифференцировка по почечному типу), представленные для сравнения признаков дифференцировки (рис. 2.б) более распластанные (имеют форму многогранников) и крупнее, чем интактные клетки. Отростки 10 этих клеток отличаются по форме от отростков интактных клеток. Клетки, стимулированные NGF (рис. 2.в), напоминают по форме нейроны. У них есть «аксоны» и «дендриты», а также тело самой клетки вытянутое и многогранное. Клетки этой культуры могут сплетаться в сети, однако могут существовать и отдельно друг от друга. Этот тип клеток приобретает видимые различия от интактных клеток уже через сутки. Таким образом, клетки, стимулированные NGF, имеют морфологические признаки нейронов и могут быть протестированы на адекватность их использования в экспериментах по оценке нейротоксичности. Мы исследовали наличие NMDAрецепторов в данных клетках - мембранных белков, типичных преимущественно для нейрональных клеток. Анализ экспрессии NMDA рецепторов в клетках культуры PC-12, активированных дексаметазоном и NGF. Рис. 3. Анализ экспрессии субъединиц NMDA рецепторов с помощью специфических антител. По оси ординат - процент клеток метящихся антителами «goat-antimouse» относительно всех клеток, присутствующих в анализируемой прибором суспензии клеток. «*» соответствует статистически достоверному различи от интактных клеток. На рис. 3 представлены данные, свидетельствующие о достоверных отличиях экспрессии NR1 субъединицы (канальной) в интактных клетках от стимулированных различными химическими агентами. Данные для NR2 субъединицы (регуляторной) также достоверно отличаются. Анализ полученных данных показывает, что NMDA рецепторы экспрессируются в незначительном количестве в клетках феохромоцитомы в интактном состоянии, в клетках, стимулированных NGF, NMDA рецепторов достоверно больше, чем в клетках, стимулированных дексаметазоном. Так, при активации клеток дексаметазоном количество NR1 и NR2b субъединиц возрастает пропорционально исходному количеству данных субъединиц, присутствующих в интактной культуре. Это отношение приблизительно равно 8. При активации клеток NGF канальная субъединица экспрессируется в 12 раз больше, чем в интактной культуре, а 11 регуляторная - в 28 раз. Это свидетельствует о том, что, безусловно, NR1-субъединица NMDAрецептора является обязательной для формирования канал-рецепторного комплекса, она выполняет каналообразующую функцию. Но взаимодействие с лигандами осуществляется с помощью NR2b субъединицы. Таблица 1. Характеристика экспрессии субъединиц NMDA рецепторов в клетках РС-12 Экспрессируемая Интактные PC-12+ NMDA клетки PC-12(I), дексаметазон рецептора % субъединица II/I 50 μМ (II), % PC-12+NGF (III), % III/I NR1 1,43± 0,4 7,1 10,02± 1,1 ** 11,9 16,60± 1,1 ** NR2b 0,51± 0,09 9,6 4,80± 0,43 * 27,6 13,82± 1,2 * * - достоверность различий относительно контроля (интактных клеток) Таким образом, клетки, стимулированные фактором роста нервов, обладают не только морфологически схожими признаками нейронов, но также образуют на клеточной мембране NMDA рецепторы. В следующем разделе мы провели серию экспериментов, необходимых для подтверждения их функциональной активности. Окислительный стресс в недифференцированных клетках PC-12. В данной главе мы анализировали способность специфических и неспецифических активаторов развития окислительного стресса стимулировать выброс АФК, а затем полученные данные сравнили с ответом нейрон-подобных клеток в условиях окислительного стресса, вызванного теми же факторами. N-метил-D-аспартат (NMDA) и Н2О2. Инкубация клеток РС-12 с 1 мM NMDA (30 мин) приводит к повышению уровня АФК (23,9%) на 8% относительно интактных клеток (15,7%); в то время как инкубация клеток с 5 мМ H2O2 (60 мин) приводит к большему росту АФК (68,1%). Значительный сдвиг клеток из нижнего левого квадранта в область правого нижнего квадрантов (рис. 4.В) свидетельствует о выраженном повышении уровня АФК в клетках под действием H2O2 (в 4,5 раза) относительно интактных клеток. присутствии NMDA (23%) или H2O2 Число погибших клеток в (21%) было сопоставимо с интактными (24%). Таким образом, интактная культура PC-12 отвечает на действие как неспецифического индуктора окислительного стресса- пероксида водорода, так и на действие NMDA. 12 А Б В Рис. 4. Вид субпопуляции интактных клеток РС-12, представленных в координатах «PI vs DCF». Ось абсцисс – флуоресценция DCF, ось ординат – флуоресценция PI. А - в интактном состоянии, Б - при действии 1 мM NMDA, В - при действии 5 мМ.H2O2 . При действии специфических антагонистов NMDA рецепторов MK-801 и DAP-5 не происходит достоверной блокады сигнала от рецепторов, проявляющейся в снижении уровня АФК в клетках PC-12. Это указывает на то, что рецепторы в недифференцированных клетках PC-12 недостаточно функционально активны. Окислительный стресс в дифференцированных клетках PC-12. Влияние NMDA и перекиси водорода на клетки PC-12. В клетках, стимулированных фактором роста нервов, определяли уровень активных форм кислорода при действии NMDA и перекиси водорода. На рис. 5 представлены нейрон-подобные клетки, разделённые гейтами. Клетки PC-12 представляют собой разнородную популяцию. При инкубации их с фактором роста нервов не все клетки дифференцируются (от 10% до 30% от всей популяции, исходя из литературных данных). Таким образом, популяция становится еще более разнородной, по сравнению с интактной и делится на 3 субпопуляции, 2 из которых мы объединяем различными гейтами (R3, R5) и анализируем отдельно друг от друга; третья субпопуляция (вне гейтов) не анализировалась, т.к. она содержит мёртвые клетки, параметры которых не меняются в зависимости от изменения условий инкубации. 13 Рис. 5. Вид популяции клеток РС-12, стимулированных NGF. По оси абсцисс интенсивность флуоресценции DCF, по оси ординат PI. Гейтом R5 обозначена субпопуляция клеток, обладающая низкой флуоресценцией DCF. Гейтом R3 обозначена субпопуляция клеток с высокой флуоресценцией DCF. Инкубация дифференцированных клеток PC-12 с 5мМ H2O2 в течение 60 мин (табл. 2) приводит к значительному росту АФК в клетках обеих субпопуляций. Инкубация клеток с NMDA приводит к росту АФК в регионе R3. Клетки PC-12, активированные фактором роста нервов, отвечают как на действие специфического лиганда, так и на действие специфических антагонистов NMDA рецепторов, что свидетельствует о большей вовлечённости NMDA рецепторов в механизм клеточного сигналинга, чем в клетках недифференцированной культуры. Таблица 2. Уровень средней флуоресценции DCF анализируемых субпопуляций клеток РС-12 (отн. ед.). * - достоверность отличий от контроля R5 R3 Контроль 8,8±1,3 862,7±34,4 H2O2 18,2±5,2 * 1106,9±134,3 * NMDA 9,6±5,6 1501,7±111,3 * MK801 9,2±4,5 1378,8±98,9 * DAP5 9,1±4,2 1210,2±102,1 * Защитное действие карнозина на интактные клетки РС-12 в условиях окислительного стресса, индуцированного акролеином В наших исследованиях по оценке влияния карнозина на уровень АФК и гибель недифференцированных клеток РС-12, подвергшихся окислительному стрессу под действием акролеина, были предприняты два экспериментальных подхода. В одном случае карнозин вводился в культуру клеток до воздействия акролеина, в другом – карнозин добавляли после инкубации клеток с акролеином в течение 1, 3 и 24 ч. 14 Защитное влияние карнозина на рост АФК. Предварительное введение карнозина в инкубационную среду до акролеина, независимо от его концентрации, способствовало снижению роста АФК, наиболее значимому после 24 ч инкубации (рис.6). Эффект от внесения карнозина в инкубационную среду после действия акролеина зависел от дозы акролеина: так при концентрации акролеина 10 мкМ в среде карнозин способствовал значительному предотвращению роста АФК, регистрируемых в течение 24 часов. Уровень АФК при действии акролеина 10 мкМ в течение 1 и 3 ч инкубации возрастал незначительно. В то время как при концентрации акролеина 100 мкМ защитное действие карнозина проявлялось в условиях 3 ч инкубации с акролеином. Введение карнозина после инкубации клеток в течение 24 ч с акролеином не оказывало защитного действия. Рис. 6. Влияние введения карнозина и акролеина на флуоресценцию активных форм кислорода (A – акролеин 10 мкМ, B- акролеин в концентрации 100мкМ) на флуоресценцию DCF клеток PC-12. -контроль, -акролеин, - последующее действие карнозина на фоне акролеина, - предварительное действие карнозинана фоне акролеина. Защитное влияние карнозина на гибель клеток. Карнозин в условиях его предварительного введения предотвращал гибель клеток, индуцированную акролеином независимо от его концентрации и сроков инкубации. В то время как защитное действие карнозина, вводимого после 10 мкМ акролеина оказалось наиболее выраженным при 24 часовом воздействии. Токсическое действие 100 мкМ акролеина достоверно предотвращалось карнозином только при 1-часовой инкубации. Таким образом, наиболее выраженный защитный эффект карнозина в отношении предотвращения роста АФК и гибели клеток выявлялся в условиях его предварительного введения до акролеина. Эффективность карнозина в условиях его введения после акролеина зависела от дозы акролеина и сроков инкубации . 15 Рис. 7. Влияние введения карнозина и акролеина на смертность клеток PC-12 (A – акролеин 10 мкМ, B- акролеин в концентрации 100мкМ) на флуоресценцию DCF клеток PC-12. -контроль, -акролеин, - последующее действие карнозина на фоне акролеина, - предварительное действие карнозинана фоне акролеина. Протекторное влияние карнозина и нанолипосом, содержащих карнозин на рост АФК и гибель дифференцированных клеток PC-12, обусловленное действием полиаминов. Индукция окислительного стресса вызывалась биогенными аминами (полиаминами), которые играют значимую роль в патогенезе нейродегенеративных и сосудистых заболеваний ЦНС. На рис 8. представлены результаты протекторного действия карнозина и карнозина в составе нанолипосом на дифференцированные клетки РС-12, в условиях ОС, индуцированного полиаминами. При действии полиаминов (500мкМ, 60 мин) на клетки РС-12, уровень флуоресценции DCF повышается на 20% относительно флуоресценции интактной культуры. Внесение в инкубационную среду карнозина в этих условиях приводит к снижению уровня АФК на 30% относительно проб, содержащих только полиамины. Нанокарнозин действует более эффективно - снижает уровень АФК на 55%. 16 Рис. 8. Флуоресценция активных форм кислорода при воздействии карнозина и карнозин содержащих нанолипосом на клетки PC-12, дифференцированные фактором роста нервов при инкубации с биогенными аминами (спермин, спермидин, путресцин). По оси ординат отложены значения флуоресценции DCF в процентах. Med- (medium) среда, nl-(nanoliposomes) пустые не содержащие карнозин нанолипосомы, carn-(carnosine), nlcc-(nanoliposomes containing carnosine) нанолипосомы содержащие карнозин, sp-(spermine) спермин, sd-(spermidine) спермидин, pc-(putrescine) путресцин. - полиамины, - карнозин, -нанолипосомы, В качестве контроля использовали пробы с липосомами, не содержащими карнозин. Рис. 9. Уровень смертности дифференцированных фактором роста нервов NGF клеток PC-12 при окислительном стрессе, инициированном полиаминами и действии карнозина и нанокарнозина. Med- (medium) среда, nl-(nanoliposomes) пустые не содержащие карнозин нанолипосомы, carn-(carnosine), nlcc-(nanoliposomes containing carnosine) нанолипосомы содержащие карнозин, sp-(spermine) спермин, sd-(spermidine) спермидин, pc-(putrescine) путресцин. - полиамины, -карнозин, -нанолипосомы. Значения смертности клеток в разных условиях, выражены в процентах.(500мкМ, 60мин) 17 Инкубация клеток с полиаминами приводит к 50% гибели клеток (рис. 9), внесение карнозина снижает смертность на 15-25%, в то время как карнозин в составе нанолипосом предотвращает гибель клеток до уровня контроля (нанолипосомы с карнозином). Нанолипосомы, не содержащие карнозин (пустые липосомы), не оказывают влияния на клеточную гибель и уровень активных форм кислорода. Таким образом, полиамины в концентрации 500 мкМ активируют ОС в нейрон-подобных клетках PC-12, что выражается ростом уровня АФК и увеличением их гибели. Действие карнозина в составе нанолипосом, направленное на предотвращения роста АФК (на 25%) и на гибель клеток (на 60%), оказалось более эффективным относительно карнозина. Защитное действие карнозина в составе нанолипосом на нейроны головного мозга мышей линии SAMP1/SAMR1 в условиях окислительного стресса Окислительный стресс in vitro создавали инкубацией суспензии гранулярных клеток мозжечка мышей линии SAMR1 с перекисью водорода в присутствии и в отсутствие карнозин содержащих нанолипосом (КСЛ). Конечная концентрация карнозина, внесенного в составе КСЛ в суспензию нейрональных клеток, составляла 2,65 мМ. Рис. 10. Индукция окислительного стресса в выделенных клетках мозжечка мышей SAMR1 пероксидом водорода (3.5 мМ, 30 мин) в отсутствие (А) и в присутствии карнозинсодержащих нанолипосом (Б). Серый фон – интактные клетки, черная линия – после инкубации с Н202: по оси ординат – количество клеток, по оси абсцисс – относительные единицы флуоресценции АФК Используемые в экспериментах in vitro гранулярные клетки мозжечка характеризовались уровнем флуоресценции DCF (15,6 ±0,7 отн. ед.), соответствующим стационарному уровню АФК. Инкубация клеток с «пустыми» (не нагруженными карнозином) нанолипосомами не оказывала существенного влияния на уровень флуоресценции АФК (14.0±0,5 отн. ед.). 18 Для оценки антиоксидантной активности нанолипосом в суспензии клеток мозжечка мышей SAMR1 индуцировали ОС под действием перекиси водорода (рис. 10). Уровень АФК при инкубации нейронов в течение 30 мин с 3,5 мМ Н2О2 увеличивался примерно в 3 раза (до 297,65%) относительно контроля, принятого за 100%. Внесение в инкубационную среду за 30 мин до индукции ОС карнозина в составе нанолипосом (до конечной концентрации 2,65 мМ карнозина) подавляло рост АФК, уровень которых (95,2%) был при этом сопоставим с контролем. При этом также снижалась и смертность нейронов: в популяции клеток, содержащихся в среде с перекисью водорода, эта величина составляла 21,2±3,0%, а в присутствии КСЛ она не превышала 15,4±2,9%. Таким образом, карнозин в составе нанолипосом эффективно снижает продукцию активных форм кислорода и гибель клеток. Окислительный стресс in vivo индуцировали с помощью острой гипобарической гипоксии у мышей линии SAMP1. Карнозин в составе нанолипосом вводили внутрибрюшинно за 1 ч до гипоксии в дозе 48 мг/кг массы тела. Рис. 11. Влияние КСЛ на устойчивость мышей линии SAMR1 (А) и SAMP1 (Б) к воздействию острой гипобарической гипоксии. * -достоверность отличий от группы без введения КСЛ. На рис. 11 представлены результаты экспериментов по оценке влияния КСЛ на устойчивость мышей к гипоксии. Видно, что время до потери позы (ВПП) у контрольных животных линии SAMR1(34,92±9,6 сек.) почти вдвое превышает этот показатель у животных линии SAMP1 с ускоренным темпом старения (18.83±7.59сек.); время жизни на высоте в условиях гипоксии до остановки дыхания (ВЖ) у мышей контрольной линии также больше (70,77±24,01 сек.), чем у мышей SAMP1 (52.0±14.7 сек). Напротив, время реституции – восстановление активной позы от момента перемещения животного в условия нормального атмосферного давления (ВР) у быстростареющих мышей SAMP1 (92.92±35.77 сек.) выше, чем у 19 контрольной линии – SAMR1 (68,36±21,65 сек). Введение мышам линии SAMR1 препарата нанолипосом, нагруженных карнозином, перед гипоксическим воздействием достоверно повышало ВПП (47,77±18,75 сек) и ВЖ (93,62±25.81 сек) и уменьшало ВР (49,0± 16,03 сек) – (см. рис. 2.15А). В отличие от мышей линии SAMR1 введение КСЛ мышам линии SAMP1 улучшало только один показатель – ВР (67.17±23.29 сек) (см. рис. 2.15.Б). Еще одним информативным показателем оценки эффективности антигипоксического действия КСЛ может быть отношение времени реституции (ВР) к времени жизни на высоте (ВЖ). В условиях ОГГ без введения КСЛ у мышей контрольной линии SAMR1 составил 0,96; у быстростареющих (SAMP1) - 1,79. В то же время на фоне применения КСЛ значения этого параметра составили 0,52 и 1,23 - соответственно. Исходя из полученных данных, можно полагать, что этот параметр характеризует повышение адаптационных возможностей организма под действием КСЛ в условиях ОГГ. Для оценки влияния карнозина в составе нанолипосом на общую антиоксидантную активность, в ткани мозга животных измеряли суммарное восстановление радикала ДФПГ. Введение КСЛ приводило к повышению суммарной антиоксидантной активности в мозге мышей обеих линий. При этом у мышей с нормальным темпом старения (SAMR1) отмечалось более выраженное антиоксидантное действие нанолипосомального карнозина (см. табл. 3), что соответствует лучшим показателям устойчивости к гипоксическому воздействию, характерным для этой линии животных (см. рис. 11). Таблица 3. Влияние карнозина в составе нанолипосом (введение за 1 ч до ОГГ в дозе 48 мг/кг массы тела) на суммарную антиоксидантную активность экстрактов из ткани мозга, определяемую по восстановлению ДФПГ-радикала. Линейные мыши Восстановление ДФПГ, мкмоль/г ткани SAMR1 5,1 ± 1,3 ОГГ на фоне введения карнозина в составе нанолипосом 6,3 ± 1,1* SAMP1 4,6 ± 0,74 5,3 ± 0,48 ОГГ Примечание: (*) р<0,05 по отношению к животным, подвергнутым действию ОГГ без введения карнозина в составе нанолипосом (U-критерий Манна-Уитни). Таким образом, в опытах in vitro и in vivo в условиях окислительного стресса у мышей, характеризующихся ускоренным темпом старения (SAMP1) и их контрольной линии (SAMR1) впервые была выявлена антиоксидантная активность карнозина в составе нанолипосом. В 20 опытах in vitro в суспензии нейрональных клеток, выделенных из мозжечка мышей линии SAMP1/SAMR1, КСЛ подавляли образование активных форм кислорода и препятствовали их гибели в условиях индукции окислительного стресса перекисью водорода. При этом механизмы защиты нейронов от ОС, обусловленные действием КСЛ, сопоставимы со свободным Lкарнозином. Однако рост АФК и смертность клеток в культуре клеток PC-12 в условиях ОС, индуцированного пероксидом водорода или полиаминами, подавлялась под действием карнозина в составе нанолипосом гораздо более эффективно (на 25% и 60% - соответственно), чем при действии карнозина. С другой стороны, в опытах in vivo в условиях воздействия на мозг окислительного стресса, вызванного острой гипобарической гипоксией, были получены данные, указывающие на способность КСЛ защищать мозг от гипоксии. Профилактическое введение этого препарата мышам приводило к улучшению физиологических показателей устойчивости мозга к гипоксическому воздействию и повышению его суммарной антиоксидантной активности, более выраженным у мышей с нормальным темпом старения (SAMR1). Следует отметить, что эффективность L-карнозина, вводимого мышам в составе нанолипосом в дозе 48 мг/кг, сопоставима с действием L-карнозина, вводимого крысам линии Wistar в дозе 100 мг/кг до воздействия ОГГ (Стволинский С.Л., 2006). Таким образом, результаты полученные как в экспериментах in vitro, так и in vivo указывают на высокую антиоксидантную и нейропротекторную активность карнозина в составе нанолипосом, превышающую аналогичные эффекты карнозина. Поскольку карнозин как природное активно метаболизирующееся соединение имеет ограниченное время жизни в организме, подвергаясь расщеплению специфическим ферментом карнозиназой, можно полагать, что нанолипосомальный препарат, созданный на его основе будет иметь большую длительность антиоксидантной активности за счет увеличения времени жизни в организме, что может обеспечить повышение эффективности его действия. В целом, карнозин в составе нанолипосом может рассматриваться как перспективная наноконструкция, обладающая антигипоксическими и антиоксидантными свойствами. Выводы: 1. Полученные после дифференцировки под действием фактора роста нервов NGF клетки PC-12 по морфологии имеют сходство с нейронами, по функциональным свойствам характеризуются наличием NMDA рецепторов. 2. Дана сопоставительная оценка токсического действия как специфических (NMDAспецифический агонист NMDA-рецепторов, гомоцистеиновая кислота), так и неспецифических (перекись водорода, акролеин) индукторов окислительного стресса, проявляющегося ростом АФК и гибелью клеток РС-12. 21 3. Преинкубация с карнозином оказывала выраженное защитное действие на клетки, подвергшиеся окислительному стрессу при действии акролеина. Наблюдалось предотвращение роста АФК и снижение гибели клеток. При постинкубации с карнозином достоверно нейтрализовалось действие акролеина в концентрации 10 мкМ после 24 ч инкубации и при 100 мкМ - после 3 ч инкубации. 4. Показано протекторное действие карнозина и его липосомального наноструктурного аналога на рост АФК и гибель клеток PC-12 в условиях токсического влияния полиаминов (спермина, спермидина и путресцина). 5. Выявлено защитное действие карнозина в составе нанолипосом на нейроны, выделенные из мозжечка 10-12 дневных мышей с ускоренным темпом старения, в условиях ОС, индуцированного перекисью водорода. 6. На модели острой гипобарической гипоксии у взрослых мышей с ускоренным темпом старения (SAMP1) показано протекторное действие карнозина в составе нанолипосом на физиологические (время потери позы, время «жизни на высоте», время до остановки дыхания, время реституции, способность к обучению) и нейрохимические (общая антиоксидантная активность) параметры. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых журналах, определенных ВАК 1. Коновалова Е.В., Федорова Т.Н., Маклецова М.Г., Березов Т.Т. Влияние карнозина на гибель клеток РС-12, индуцированную токсическим действием акролеина. // Вопросы биологической, медицинской и фармакологической химии.- 2013.- №6.-С.43-48. (0,75 печ.л.) 2. Березов Т.Т., Маклецова М.Г., Сяткин С.П., Рихирева Г.Т., Куликова О.И., Коновалова Е.В., Федорова Т.Н. Роль обмена полиаминов в функциональной активности мозга в норме и при патологии. // Журнал неврология и психиатрия им. С.С.Корсакова.- 2013.-№7.-С. 65-70. (0,75 печ.л.) Материалы научных конференций 3. Konovalova E., Dizhevskaya A., Boldyrev A. Expression of Na/K-pump and N-methil-D-aspartat receptors in pheochromocytoma cells, activated by dexamethasone and nerve growth factor // Membrane Proteins: Abstracts.-Italy.-Florence.- 2009.- P.69 (0,06 печ.л.). 4. Konovalova E., Dizhevskaya A., Boldyrev A. Dexamethasone and rhu-NGF as differentiation factors of PC-12 cells. // Neurological congress: Abstracts.-Slovakia.- Martin.- 2009.- P.63 (0,06 печ.л.). 22 5. Konovalova E., Karpova L., Stvolinsky S., Boldyrev A.Carnosine containing nanoliposomes protect PC-12 cells and neurons from oxidative stress in vitro // Carnosine in exercise and disease. Abstracts.Belgium.- Ghent.- 2011. –P45. (0,06 печ.л.) 6. Е.В. Коновалова, О.А.Шадрина, О.А.Трунова, С.Л.Стволинский. Нейропротекторные эффекты нанолипосом, содержащих карнозин // International Congress «neuroscience for Medicine and Psychology» Тезисы– Украина.- Крым.- Судак.- 2012.- С.210-211 (0,1 печ.л.). 7. М.Г.Маклецова, Е.В. Коновалова, С.Л. Стволинский, Т.Н.Федорова. Моделирование биохимических процессов нейродегенерации и способы её коррекции // Материлы XVI Международной конференции по нейрокибернетике – Россия.- Ростов-на Дону.- 2012. - С.28-31 (0,2 печ.л.). 8. Konovalova E., Kulikova O., Stvolinsky S., Makletsova M., Rikhereva G., Fedorova T. New mechanisms of neuroprotective carnosine action: role of polyamine system // 5 th Conference on Advances in Molecular Mechanisms Underlying Neurological Disorders .Abstract book- Bath.- UK.2013.-P31 (0,06 печ.л.). 9. Konovalova E., Kulikova O., Stvolinsky S., Makletsova M., Rikhereva G., Fedorova T. Polyamines neurotoxicity at the brain and ways of its correction. // The 38th FEBS Congress.FEBS Journal.Abstracts-Saint Petersbourg.- Russia.- 2013.-P576 (0,06 печ.л.). СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АФК - активные формы кислорода ВЖ - время жизни ВПП - время до потери позы ВР - время реституции SAMP - senescence accelerated mice (prone) SAMR - senescence accelerated mice (resistant) ГЦ - гомоцистеин ГЦК - гомоцистеиновая кислота ДФПГ - 2,2’-дифенил-1-пикрилгидразил КСЛ - карнозинсодержащие липосомы ОГГ – острая гипобарическая гипоксия ОС - окислительный стресс ЦНС - ценральная нервная система DCF - dichlorfluoresceine NGF – nerve growth factor NMDA – N-methyl-D-aspartate PC-12 - клетки феохромоцитомы PI - propidium iodide 23
