УДК 616.012.03:616.07:616.699 Р 68 РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В ДИАГНОСТИКЕ ИДИОПАТИЧЕСКОГО

УДК 616.012.03:616.07:616.699
Р 68
РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В ДИАГНОСТИКЕ ИДИОПАТИЧЕСКОГО
БЕСПЛОДИЯ У МУЖЧИН
Б.Камалиева, Г.Ж.Абильдинова, М.Ф.Баянова, А.В.Боровикова, А.П.Вибе
АО «Национальный научный центр материнства и детства», г. Астана
В настоящее время бесплодием страдают около 10-15% супружеских пар, при
этом примерно 50% случаев обусловлено нарушением репродуктивной функции со
стороны мужчины, в 20% - нарушением репродуктивной функции обоих супругов
[1,2]. Примерно у 32% мужчин идиопатическое бесплодие
обусловлено
генетическими факторами, частота их встречаемости коррелирует с тяжестью
репродуктивной патологии [3,4].
Одним из генетических факторов
являются хромосомные аномалии
(числовые и структурные), микроструктурные перестройки и генные мутации
приводящие к нарушению детерминации пола, гормональной дизрегуляции,
нарушению сперматогенеза.
Мутации генов, контролирующих этапы сперматогенеза, могут приводить к
нарушению подвижности, морфологических и фертильных свойств сперматозоидов,
блоку сперматогенеза, проявляясь в диапазоне от легкого снижения сперматогенной
активности до полного отсутствия половых клеток в семенных канальцах (синдром
"только клетки Сертоли») [5].
Одна из причин мужского бесплодия - обструктивная азооспермия, которая
является следствием одностороннего или двустороннего врожденного отсутствия
семявыносящих протоков. Нередко у пациентов с данным диагнозом
обнаруживается мутация в одной, либо в обеих копиях гена муковисцидоза (CFTR cystic fibrosis transmembrane conductase ), локализованного на хромосоме 7 (q31.2)
[6,7].
Микроделеции локуса AZF (Azoospermia Factor, фактор азооспермии)
расположенного на длинном плече хромосомы Y (q11) обнаруживаются в среднем в
10-15% случаев при азооспермии и в 5-10% случаев при олигозооспермии тяжелой
степени, что является одной из причин нарушения сперматогенеза [8,9].
В хромосоме Y выделены три неперекрывающихся субрегиона: AZFa, AZFb и
AZFc. Гены - кандидаты AZFa-субрегиона представлены единственной копией,
поэтому, даже точковые мутации могут вызывать нарушения сперматогенеза и
приводить к бесплодию мужчин. Тогда как гены, субрегионов AZFb и AZFc
содержат по три десятка генов, многие из которых представлены в двух и более
копиях [12,13]. Наиболее частым типом полных AZF делеций являются AZFc
делеций, доля которых составляет 65-70% от всех полных AZF делеций. Второе
место по частоте встречаемости 15-20% занимают делеции, захватывающие
регионы AZFс и\или AZFb (AZFb+с). Наиболее редко 5-10% выявляют делеции
AZFa региона. В редких случаях обнаруживают другие типы AZF делеций,
например, AZF a+b и AZF a+b+c. В большинстве случаев микроделеции являются
мутациями de novo, но имеются сведения об единичных случаях наследования
после экстракорпорального оплодотворения [14].
Цель исследования: изучить роль генетических факторов у мужчин с
идиопатическим бесплодием.
Материал и методы исследования: Материалом исследования явилась
периферическая кровь 197 мужчин с бесплодием, обратившихся за медикогенетическим консультированием.
Проведено комплексное генетическое
исследование (цитогенетическое и молекулярно-генетическое).
Для проведения цитогенетических
исследований
использовали
гепаринизированную, венозную кровь пациентов. Препараты хромосом получали из
лимфоцитов периферической крови по стандартной методике: 1,5 мл сыворотки
крупного рогатого скота, 6 мл –RPMI 1640 + стерильный L-глутамин, 0,15 мл
фитогемагглютинина, 0,5 мл периферической крови, раствор 10 γ колхицина,
гипотонический раствор, охлажденный раствор фиксатора -этаноловый спирт и
ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1. Препараты окрашивали GTGметодом. Результаты цитогенетического исследования приведены согласно
Международной системе номенклатуры цитогенетики человека [15].
Для проведения молекулярно-генетического исследования мутаций в локусе
AZF хромосомы Y и определение носительства мутаций в гене
(CFTR)
муковисцидоза из периферической крови была выделена геномная ДНК (набором
«Promega», USA). Высокая специфичность метода мультиплексной ПЦР задается
нуклеотидной последовательностью праймеров и специально отрабатываемыми при
создании ПЦР-тест-системы условиями их присоединения к строго специфическому
для данного фрагмента ДНК (мишени). По отсутствию в реакционной смеси
специфического фрагмента ДНК делали заключение в исследуемом материале о
делеции определенного участка. В основе метода лежит амплификация
специфического участка за счет многократного повторения циклов денатурации
ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок
(праймеров), которые
рассчитаны таким образом, что фрагменты ДНК,
амплифицируемые в ходе ПЦР, имеют различную длину: 129 - 600 пар нуклеотидов
для микроделеции локуса AZF и 66-212 пар нуклеотидов для муковисцидоза , так же
зонда, меченного флуоресцентным красителем и синтеза цепей ДНК с помощью
фермента Таq- полимеразы.
Набор праймеров использованных при амплификации позволял исследовать
9 STS-маркеров, специфичных для AZF-локусов:
1) для субрегиона AZFa: sY86; sY84; sY615;
2) для субрегиона AZFb: sY127, sY134;
3) для субрегиона AZFc : sY254 , sY255;
4) SRY;
5) ZFY.
ПЦР проводили на программируемом термоциклере ТП4-ПЦР-01 (ДНКтехнология). Состав ПЦР смеси: ПЦР буфер-5,0 мкл, dNTPs-12,5мкл, праймеры-1,0
мкл, Taq-полимераза-0,2 мкл, H2O-14,3 мкл, ДНК-2,0 мкл, контрольная ДНК-2,0
мкл. Общее количество смеси -25 мкл. Программа ПЦР проводилась в следующем
режиме: 95- 5 мин; 94- 45 сек, 65- 45 сек,72- 45 сек - 30 циклов; 72-7 мин.
Набор праймеров использованных
при
амплификации, позволял
анализаровать 11 частых мутации в гене CFTR: del 21 kb, Δ F508, Δ I507,
1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT, L 138ins, 604insA, 3944delTG.
ПЦР проводили на программируемом термоциклере ТП4-ПЦР-01 (ДНКтехнология). Состав ПЦР смеси: ПЦР буфер-7,5 мкл, dNTPs-2,5мкл, праймеры-1,0
мкл, Taq-полимераза-0,3 мкл, H2O-11,7 мкл, ДНК-2,0 мкл, контрольная ДНК-2,0
мкл. Общее количество смеси -25 мкл. Программа ПЦР проводилась в следующем
режиме: 95- 5 мин; 94- 2 сек, 62- 2 сек, 72- 2 сек - 30 циклов; 72-7 мин.
Результаты амплификации оценивали методом электрофареза
в 7%
полиакриламидном геле.
Результаты
исследования
и
обсуждения:
При
проведении
цитогенетического исследования лимфоцитов периферической крови 197
пациентам, у 168 (85%) мужчин был выявлен нормальный кариотип - 46,ХY, тогда
как у 29 (15%) пациентов обнаружены хромосомные патологии. Анализ
кариологического исследования показал, что среди аберраций превалируют
числовые хромосомные нарушения, так
в 22(75%) случаях диагностирован
синдром Клайнфельтера - 47,ХХY (Рис. 1); дисомия Y хромосомы - 47,ХYY –в
трех случаях (10%); и в четырех случаях (15%) выявлены следующие структурные
хромосомные патологии робертсоновская транслокация 45,ХY, der
(14;15)(q10;q10); перицентрическая инверсия 9 хромосомы 46,ХY, inv(9)(p11q13)
(Рис. 2); транслокации: 46,XY,t(X;21)(q21;q12); 46,X,t(Y;1)(q12;q21.1).
Рисунок 1.Кариотип мужчины 1983 г.р. с числовым хромосомным нарушением - синдром Клайнфельтера 47,ХХY
Рисунок 2. Кариотип мужчины 1975 г.р. со структурным хромосомным нарушением - перицентрическая
инверсия 9 хромосомы - 46,ХY,inv(9)(p11q13)
Молекулярно-генетические исследования микроделеции Y хромосомы были
проведены 91 (45%) мужчинам с патозооспермией с нормальным кариотипом –
46,ХУ. Микроделеции Y хромосомы обнаружены у 11 пациентов, что составило
14%. Были выявлены делеции AZF локусов: AZF a- 10%, AZF b- 10 %, AZF а+b10%, AZF b+с- 10% (Рис.3), AZF с - 60% .
Рисунок 3. Электрофореграмма результатов амлификации:
микроделеция Y хромосомы локуса AZF b+с
дорожки 1,2,4 - образец ДНК пациента
дорожка 3 - образец ДНК пациента с делецией локусов sY254, sY134, sY127 и
sY255 (AZFb и AZFc)
дорожка 5 - контрольные образцы без делеций
дорожка 6 - маркер молекулярного веса /Pst I.
При исследовании 17 образцов ДНК молекулярно-генетическим методом
11
мутации в гене CFTR патологии не выявлено.
Таким образом,
полученные результаты показали, что генетические
исследования числовых и структурных хромосомных аномалии и микроделеции Y
хромосомы позволяют установить генетическую причину бесплодия в браке,
оценить ее частоту, степень тяжести и значение для конкретной супружеской пары и
ее потомства, избежать необоснованного гормонального или хирургического
лечения и прогнозировать вероятность получения сперматозоидов для проведения
ЭКО или ИКСИ.
Список литературы:
1. Vogt P.H., et al. Human chromosome Y azoospermia factors (AZF) mapped to
different subregions in Yql1.//Hum. Mol. Genet.-1996.-№ 5.-Р.933-943.
2. Hargreave T.B., et al., Chromosome Y microdeletions and male subfertility. Androl
1996.-V.28, Suppl.-Р19-21.
3. Pryor I.L., et al., Microdeletions in the Y chromosome of infertile men.//New Eng J
Med 1997.-V.-336.-P.534-53.
4. Черных В.Б. AZF делеции - частая генетическая причина бесплодия у мужчин:
современное состояние исследований //Проблемы репродукции.-2009.-№1.- С.1014.
5. Вартанян Э.В., Петрин А.Н., Курносов Т.Р. Генетические факторы мужского
бесплодия //Проблемы репродукции.-2010.-№2.- С.74-78.
6. Федорова И.Д., Кузнецова Т.В. Генетические факторы мужского бесплодия. //
Журнал акушерства и женских болезней. -2007.-№ 1.- С.64-72
7. Foresta C., et al., Y chromosome microdeletions and alterations of spermatogenesis
// Endocr. Rev. 2001.-V. 22.-P.226-239.
8. Черных В.Б., Куриоло В.Б., Шилейко Л., и др. Анализ микроделеций в локусе
AZF у мужчин с бесплодием: совместный опыт исследований.//Медицинская
генетика.-2003.-№8.- С.367-379.
9. Глинкина Ж.И., Кузьмичев Л.Н., Бахарев Л.Н. Профилактика наследования
мутаций в AZF-локусе хромосомы Y у потомства мужчин с нарушением
репродуктивной функции. // Акушерство и гинекология.-2009.-№1.-С.52-55
10.Черных В.Б. Макро- и микроструктурные перестройки Y хромосомы. //
Медицинская генетика.-№10.-2007.-С.45-52.
11.Гоголевский П.А., Гоголевская И.К., Крамеров Д.А. и др. AZF-микроделеции и
мужское бесплодие. //Андрология и генитальная хирургия.- 2001.- № 4.-С.73–78.
12.Тарасова М.Н., и др.,К диагностике нарушений репродуктивной функции
мужчин.//Проблемы репродукции. 2008.-№ 5.- С.52-55.
13.Ahmadi A., Ng S.C. Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa.//
J Exp Zool 1999.-V.284.- P.696—704.
14.Долгов В.В., Луговская С.А., Фанченко Н.Д. и др. Лабораторная диагностика
мужского бесплодия. М 2006;145c.
15.ISCN 2009. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature /
Ed.Mitelman F. Basel: S. Karger.-2009.-138 p.
Резюме
Роль генетических факторов в диагностике
идиопатического бесплодия у мужчин
Б.Камалиева, Г.Ж.Абильдинова, М.Ф.Баянова, А.В.Боровикова, А.П.Вибе
Ключевые слова: мужское бесплодие, Y хромосома, AZF локус, числовые и
структурные аномалии, микроделеции
При проведении комплексного генетического исследования 197 мужчин с
нарушением репродуктивной функции были выявлены следующие хромосомные
патологии: при кариологическом анализе числовых хромосомных нарушений в 25
(85%) случаях, структурных хромосомных аномалии в четырех (15%) случаях;
при молекулярно-генетическом исследовании 11 мутации в гене CFTR патологии
не выявлено, микроделеции Y хромосомы локусов AZF были выявлены у 11 (14%)
пациентов.
Результаты комплексного генетического исследования позволяют установить
генетическую причину бесплодия в браке, оценить ее частоту, степень тяжести и
значение для конкретной супружеской пары и ее потомства, избежать
необоснованного лечения и прогнозировать вероятность получения сперматозоидов
для проведения ЭКО или ИКСИ.
Тұжырым
Ер адамдардағы идиопатиялық бедеуліктің диагностикасындағы
генетикалық факторлардың ролі
Б. Камалиева, Г.Ж. Әбілдинова, М.Ф. Баянова, А.В. Боровикова, А.П. Вибе
Кілтті сөздер: аталық тұқымсыздық, Y хромосома, AZF локус, сандық және
құрылымды ауытқушылықтар, микроделеции
Репродуктивті қызметтерінін бұзушылықтары бар 197 ер адамдарға кешенді
генетикалық зерттеу өткізунде келесі хромосомалық патология анықталды:
кариологиялық талдауында 25 (85%) сандық хромосомалық бұзушылықтар, 4 (15%)
құрылымдық хромосомалық аномалиялар, Y хромосоманың AZF локусында 11
(14%) микроделециялар. CFTR генде 11 мутациялардың молекулярлы –генетикалық
зерттеуінде патология анықталмады.
Кешенді генетикалық зерттеу некедегі бедеуліктің генетикалық себебін, онын
жиілігін бағалау және нақты жұбайларға және оның ұрпақ үшін мәнін, және ЭКО
немесе ИКСИ өткізу үшін сперматозоидтарды алуына ықтималдықты болжауды
және айғақсыз емдерден құтылуына мүмкіндік береді.
SUMMARY
The role of genetic factors in the diagnostics idiopathic male infertility
B. Kamalieva, G. Abildinova, M. Bayanova, A. Borovikova, A. Wiebe
Keywords: male infertility, Y chromosome, AZF locus, numerical and structural
abnormalities, microdeletions
At carrying out complex genetic research of 197 men with violation of reproductive
function the following chromosomal pathologies were revealed: in the kariological
analysis of numerical chromosomal violations in 25 (85 %) cases, structural chromosomal
anomalies in four (15 %) cases; at molecular and genetic research of 11 mutations in a
gene of CFTR of pathology it is not revealed, micro deletions of Y of a chromosome of
loci of AZF were revealed at 11 (14 %) patients.
Results of complex genetic research allow establishing the genetic reason of infertility in
marriage, to estimate its frequency, severity and value for a concrete married couple and
its posterity to avoid unreasonable treatment and to predict probability of receiving
spermatozoa for carrying out EKO or IKS.