Путешествие генов

ПУТЕШЕСТВИЕ ГЕНОВ
Тугбаева А.С., Ковалицкая Ю.А., Шестибратов К.А.
Филиал ФГБУН Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и
Ю.А.Овчинникова Российской Академии Наук, 142290 Пущино, Проспект Науки 6.
УрФУ имени первого Президента России Б.Н.Ельцина, ИЕН, Департамент
биологический, кафедра физиологии и биохимии растений, 620000 Екатеринбург,
Проспект Ленина 5.
Трансгенными называются те растения, генетическая информация которых была изменена
с помощью методов генетической инженерии. Благодаря высокой тотипотентности
растительных клеток, из недифференцированных клеток in vitro можно получить целое
растение. Это открывает большие перспективы перед молекулярными биологами. В
настоящее время разработано несколько способов трансформации растительных клеток.
Наиболее
распространенным
и
доступным
является
метод
агробактериальной
трансформации. Он применяется для трансформации растительных, грибных клеток, а так
же клеток млекопитающих. В данной статье рассмотрен механизм агробактериальной
трансформации растительных клеток, свойства растений, которые можно изменить при
помощи данного метода.
Ключевые слова: агробактериальная трансформация, растения.
Сокращения: chv- bar – ген фосфинотрицин-N-ацетилтрансферазы; gfp – ген зеленого
флуоресцентного
белка;
hpt
–
ген
гигромицинфосфотрансферазы;
nptII
–
ген
неомицинфосфотрансферазы.
ВВЕДЕНИЕ
Агробактерии (Agrobacteria) – грамотрицательные почвенные бактерии, некоторые из них
являются патогенами растений. A. tumefaciens вызывает образование корончатых галлов
(опухоли)
у
пораженных
растений,
A.
rhizogenes
индуцирует
избыточное
корнеобразование – синдром «бородатого корня». Как показано учеными, опухолевый
рост клеток растений обусловлен высоким содержанием ауксинов и цитокининов в
пораженных тканях растений. Так же в растениях происходит синтез опинов – источников
углерода и азота для агробактерий [1, 2].
А. tumefaciens и A. Rhizogenes несут в себе плазмиды (Ti- и Ri-плазмиды соответственно),
которые являются удобным инструментом генной инженерии, благодаря способности
встраивать гены в геном растений. Плазмида – кольцевая одноцепочечная ДНК, способная
к репликации. Размер Тi-плазмиды составляет порядка 200-250 тпн. Она содержит
следующие последовательности: Right border и Left border, Т-ДНК. Т-ДНК кодирует более
35 генов вирулентности vir, гены катаболизма опинов, гены, участвующие в механизме
переноса и интеграции Т-ДНК в растительное ядро [1,2].
Поражаемая растительная клетка содержит область поранения – только в этом случае
произойдет заражение. Такая клетка выделяет в окружающую среду большое количество
полисахаридов, кислот, в том числе ацетосирингон. Движение бактерий в данном случае
носит характер положительного хемотаксиса.
ПЕРЕНОС ГЕНОВ
В
геноме
Аgrobacterium
sp.
содержится
несколько
генетических
локусов.
В
агробактериальной хромосоме расположены Chv-гены, которые индуцируются первыми и
обеспечивают функционирование других систем, они отвечают за синтез полисахаридов,
необходимых для обеспечения контакта и присоединения агробактерии к клетке растений.
После экспрессии chv-генов активируется vir-область плазмиды.
Vir-область содержит 7 оперонов: virA, virB, virC, virD, virE, virF, and virG. Эти гены
кодируют белки, участвующие в образовании одноцепочечной тДНК, транспорте через
агробактериальную мембрану и клеточную стенку, интеграции тДНК в хромосому
растительной клетки. Белок virA является рецептором ацетосирингона. При их
взаимодействии за счет самофосфорилирования изменяется конформация белка, что в
свою очередь активирует другие vir-гены [1].
Область ДНК, заключенную между двумя повторами длиной 25 пар оснований – Right
border и Left border, называется Т-ДНК (от англ. Transforming – трансформирующая). На
ней расположены два других генетических локуса. Т-ДНК агробактерии кодирует опины
(производные аминокислоты аргинина), которые синтезируются в клетках пораженных
растений. Например, A. tumefaciens C58
индуцирует синтез нопалина, A. tumefaciens
Bo542 - агропина. Так же Т-ДНК несет информацию о ферментах, вызывающих
образование опухоли (онкогены). В участке Т-ДНК, гомологичном у разных Ti плазмид,
ученые выявили три гена, участвующие в биосинтезе фитогормонов (tms1, tms, tmr) [3].
Выключение 1 любого гена из трех приводило к изменениям опухолевого фенотипа,
одновременная супрессия трех генов приводила к замедлению опухолеобразования. В ТДНК Ti-плазмид выделяют также локус tml. Мутация в данном локусе вызывает
образование многочисленных опухолей у трансформированных растений.
Белки virD1, virD2 участвуют в образовании одноцепочечной Т-ДНК, которая
транспортируется в цитоплазму клетки хозяина через канал, образованный белками virD4
и virВ. Одноцепочечная нить Т-ДНК с белком virD2 на 5’ конце, покрытая белком virЕ2,
образует Т-ДНК транспортирующий комплекс (Т-комплекс). С помощью белков virD2 и
virЕ2 Т-комплекс импортируется в ядро клетки хозяина. За счет гомологичной
рекомбинации Т-ДНК интегрируется случайным образом в ядерную ДНК растения. Число
копий Т-ДНК в геноме растительной клетки варьирует от 1 до 10. Интеграция нескольких
копий Т-ДНК в один локус происходит крайне редко[4, 5, 6].
Таким образом, весь процесс агробактериальной трансформации можно разделить на
следующие стадии (Рисунок 1):
1. Распознавание и прикрепление Agrobacteria sp. к растительной клетке с помощью chvбелков.
2. Распознавание специфического химического сигнала растительной клетки, активация
системы белков virA- virG.
3. Активация vir-генов. Построение канала, по которому происходит перенос плазмиды в
растительную клетку из бактериальной.
4. Образование Т-нити ДНК.
5. Генерация virВ – virD4 транспортеров, транспорт Т-нити и vir-белков в цитоплазму
клетки хозяина.
6. Образование Т-комплекса.
7. Импорт Т-комплекса в ядро.
8. Внутриядерный транспорт Т-комплекса, интеграция Т-ДНК в геном клетки хозяина за
счет белков virD2 и virE2.
Рис.1. Стадии трансформации растений с помощью агробактерий (А, В, С, D1, D2, E2 и G
– продукты экспрессии vir-генов; Р – неорганический фосфат). (По Andy Prescott и др.)
АГРОБАКТЕРИАЛЬНАЯ ИНФЕКЦИЯ
Агробактериальная инфекция – результат экспрессии Т-ДНК. Гены, которые содержит
данная последовательность ДНК агробактерий необычны тем, что несмотря на
бактериальное роисхождение, промоторы имеют сходство с эукариотическими. Благодаря
этому происходит экспрессия генов Т-ДНК в растительной клетке (онкогены и гены
синтеза опинов). Пораженные растения характеризуются изменениями в фенотипе, так как
их гормональный баланс нарушен; часто такие растения стерильны [7].
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ДЛЯ МОДИФИКАЦИИ
АГРОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ
Ti-плазмиды были модифицированы за счет удаления онкогенов из Т-ДНК и фрагментов
ДНК, не нужных для клонирования. Для трансформации преимущественно используют
бинарный вектор. Для создания бинарного вектора используют 2 плазмиды: первая несет
вирулентные гены, вторая – целевой и маркерный гены [8, 9].
Интеграция и экспрессия генов в геноме растений зависит от промотора, который
находится на 5' конце интегрированной ДНК. Чаще всего используют промотор 35S,
полученный из вируса мозаики цветной капусты.
В качестве терминатора –
последовательности ДНК, располагающейся на 3’ конце – ген, кодирующий фермент
неопалинсинтазу
nos,
выделенный
из
Agrobacterium.
35S
промотор
является
конститутивным – то есть обеспечивает постоянную транскрипцию контролируемого им
гена, используется при трансформации многих видов растений [9].
Для отбора трансформированных клеток вектор содержит селективные гены. В качестве
селективных маркеров используются гены устойчивости к антибиотикам, например, nptII
– ген устойчивости к канамицину, hpt – устойчивость к гигромицину; гены устойчивости к
гербициду – bar (ген устойчивости к гербициду фосфинотрицину), ALS (ген устойчивости
к гербициду хлорсульфорону) и др. Репортерные гены, такие как гены глюкуронидазы
gusA (uidA) или зеленого флуоресцентного белка gfp, позволяют вести визуальный
скрининг трансформированных растительных клеток [10].
Классический метод трансформации основан на совместной инкубации (от 2-3 часов до 23 суток) растительных тканей с суспензионной культурой агробактерий (co-cultivation),
что часто отрицательно влияет на жизнеспособность эксплантов, может привести к
массовому развитию бактериальной инфекции и гибели клеток растений [11]. Для
снижения гибели клеток используют антибиотики, подавляющие рост бактерий, либо
применяют другие методы трансформации растений. После экспланты переносятся на
среду
для
прямого
побегообразования
или
регенерации
каллуса,
содержащую
антибиотики для подавления роста бактерий.
В качестве эксплантов для агробактериальной трансформации могут быть использованы
культура эмбриональных тканей, меристемы верхушечных побегов, листовые пластинки
молодых листьев, корни, семядоли, сегменты стеблей и каллуса в виде суспензионной
культуры. Для успешной агробактериальной трансформации необходимо учитывать
комплекс факторов, например, генотип исходного растения, штамм Agrobacterium,
содержание солей и pH среды, продолжительность и температуру совместной
культивации агробактерий и растительных эксплантов.
Растения отличаются по восприимчивости к Agrobacterium sp. Даже в пределах одного
вида, разных сортов или экотипов могут показать различные степени восприимчивости к
определенным штаммам Agrobacterium sp. [12].
Агробактериальная трансформация высших растений в настоящее время хорошо
разработана для двудольных видов. В последние годы возрос интерес ученых к созданию
трансгенных
однодольных
растений. Агробактериальная трансформация
успешно
применяется для риса, кукурузы, ячменя, пшеницы и сорго. Растения по-разному
чувствительны к Agrobacterium sp., это является основным недостатком в генетической
трансформации однодольных [12].
Каждый тип ткани и клеток растений требует изучения для создания оптимальных
условий
трансформации.
В
подавляющем
большинстве
экспериментов
ученые
сталкиваются с двумя проблемами при трансформации растений: высокий уровень
экспрессии экзогенной ДНК, замалчивание генов в ряду поколений.
ПРИМЕНЕНИЕ
С помощью агробактериальной трансформации можно получить растения, устойчивые к
различным
абиотическим
факторам
(засуха,
засоление,
экстремально
низкие
температуры), к грибной, бактериальной или вирусной инфекции. Кроме того, были
созданы линии трансгенных растений, устойчивых к гербицидам, получены растения с
высокой резистентностью к атакам насекомым.
Одно из бурно развивающихся направлений – синтез фармакологически активных
соединений в трансгенных растениях. В 1986 в растительной клетке был синтезирован
соматотропный гормон. Это послужило
демонстрацией потенциала растений в
производстве фармацевтических белков – интерферонов, моноклональных антител,
сывороточного альбумина. С тех спектр синтезированных рекомбинантных белков
значительно увеличился [13]. Кроме того, растения используются для синтеза белков,
играющих роль пищевых добавок или усилителей вкуса. К таким белкам относятся
таумантины – суперсладкие белки. Их органолептические свойства можно объяснить
специфической структурой [14]. Ген таумантина успешно экспрессировался в ряде
сельскохозяйственных растений, таких как огурцы, помидоры, картофель, яблоки [15].
Уже на протяжении трех десятилетий метод агробактериальной трансформации является
центральным в экспериментальной биологии и базовым в сельскохозяйственной
биотехнологии. Трансгенные растения используются в качестве тест-систем для
модификации эндогенного метаболизма, инактивации генов. Это вносит вклад в изучении
функции генов, регуляции физиологических процессов и роста растений [16].
За счет изменения биосинтеза флавоноидов, каротиноидов и беталаинов японским ученым
удалось получить трансформированные лилии с синими цветками [17].
ВЫВОДЫ
Таким образом, метод агробактериальной трансформации – один из наиболее изученных и
применяемых в биотехнологии. В геном растений встраивается Т-ДНК агробактерий,
которая была модифицирована с помощью методов молекулярной биологии. За счет
встраивания целевого гена можно получить растений с заданными свойствами.
Агробактериальная трансформация успешно применятся для модификации двудольных
растений, разрабатываются протоколы для модификации однодольных растений.
Список литературы.
1. Jill S. Gartland Agrobacterium Virulence// Methods in Molecular Biology – 1995. – V. 44. –
P.15-28.
2. Alicja Ziemienowicz Plant Transgenesis// Methods in Molecular Biology. – 2010. – V.631. –
P. 253-268.
3. Shyamkumar Barampuram, Zhanyuan J. Zhang Recent Advances in Plant Transformation//
Methods in Molecular Biology. – 2011. - V. 701. – P. 1-35.
4. Paulina Balbás, Argelia Lorence Recombinant Gene Expression// Methods in Molecular
Biology – 2004. – V. 267. – P. 329-350.
5. Abhaya M. Dandekar, Henry J. Fisk Plant Transformation: Agrobacterium-Mediated Gene
Transfer// Methods in Molecular Biology. – 2004. – V.286. – P. 35-46.
6. Andy Prescott, Rob Briddon, Wendy Harwood Plant Transformation// Molecular Biomethods
Handbook. – 1998. – P. 251-269.
7. Nigel Grimsley Agroinfection// Methods in Molecular Biology. – 1995. – V. 44. – P. 325-342.
8. Corrin V. Wallis, Margaret I. Boulton Preparation of Coat Protein-Containing Binary Vectors
for Use in Agrobacterium-Mediated Transformation// Methods in Molecular Biology. – 1998. –
V. 81. – P. 341-352.
9. Gynheung An. Binary Ti Plasmid Vectors// Methods in Molecular Biology. – 1995. - V.44. –
P. 47-58
10.Рукавцова Е. Б., Лебедева А. А., Захарченко Н. С.,Бурьянов Я. И. Пути создания
биобезопасных трансгенных безмаркерных растений//Физиология растений. ̶ 2013. ̶ Т.
60, № 1. ̶ С. 17-30
11.Кузнецова Вл. В., Кузнецова В. В., Романова Г.А. Молекулярно-генетические и
биохимические методы в современной биологии растений. ̶ М.: «БИНОМ. Лаборатория
знаний», 2011. ̶ 487 с.
12. Karami O., Esna-Ashari M., Karimi Kurdistani G., Aghavaisi B. Agrobacterium-mediated
genetic transformation of plants: the role of host// Biologia Plantarum. ̶ 2009. ̶ V. 53, № 2. ̶
P. 201-212.
13. Goldstein D.A.,Thomas J.A. Biopharmaceuticals derived from genetically modified plants //
Q J Med. - 2004. ̶ № 97. ̶ P.705–716.
14 Stoger E. Plant bioreactors – the taste of sweet success//Biotechnology Journal. ̶ 2012. ̶ V.
7. ̶ P. 475–476.
15 Firsov A. P, Pushin A. S., Korneeva I. V.,Dolgov S. V. Transgenic Tomato Plants as
Supersweet Protein Thaumatin II Producers//Biochemistry and Microbiology. ̶ 2012. ̶ V. 48,
№ 9. ̶ P. 746–751.
16. Lorence A., Verpoorte R. Gene Transfer and Expression in Plants// Methods in Molecular
Biology. – 2004. - V. 267. – P. 329-350.
17. Nishihara M, Nakatsuka T. Genetic engineering of novel flower colors in floricultural plants:
recent advances via transgenic approaches// Methods in Molecular Biology. - 2010. – V.589. –
P.325-47.