autoreferat_malcevx - Институт биохимической физики им. Н
реклама
На правах рукописи Мальцев Дмитрий Игоревич Тканеспецифические мембранотропные биорегуляторы, выделенные из печени и легкого млекопитающих 03.01.02 биофизика 03.01.06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2013 1 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН Научные руководители: доктор химических наук, профессор Игорь Александрович Ямсков доктор биологических наук, профессор Виктория Петровна Ямскова Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Надежда Павловна Пальмина, главный научный сотрудник лаборатории физико-химических основ регуляции биологических систем ФГБУ Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН; доктор биологических наук Владимир Леонидович Воейков, профессор кафедры биоорганической химии Биологического факультета ФГБУ Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН Защита диссертации состоится 17 апреля 2013 г. в 13 час. 30 мин. на заседании Диссертационного совета Д 002.039.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН по адресу: 119334, Москва, ул. Косыгина, д. 4. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химической физики им. Н.Н. Семенова РАН Автореферат разослан "__"_________2013 г. Ученый секретарь Диссертационного совета Д 002.039.01 кандидат химических наук Мазалецкая Л.И. 2 Введение Актуальность работы Изучение различных биорегуляторов является чрезвычайно важной задачей современной биологии, в том числе биофизики. Большой интерес для исследователей представляют так называемые мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы (МГТБ), обнаруженные в животных, растительных тканях, в микроскопических грибах. МГТБ в сверхмалых дозах (СМД) влияют на важнейшие биологические процессы (адгезия, миграция, пролиферация, дифференцировка клеток, биосинтез и тд.) и по сути должны обеспечивать состояние органо-тканевого гомеостаза. На их основе разработаны фармакологические препараты нового поколения. Ранее было показано, что МГТБ присутствуют в различных тканях млекопитающих, в том числе, в тканях печени и легкого. Показано, что биорегуляторы данной группы локализованы в межклеточном пространстве и проявляют мембранотропное действие – изменяют вязкоупругие свойства и проницаемость плазматической мембраны клеток. Биорегуляторы были объединены в отдельную группу на основании сходства их физико-химических свойств и характера биологического действия. МГТБ присутствуют в растворах в виде наноразмерных частиц, содержащих белки, углеводы, липиды. Показано, что белковая компонента ответственна за проявление МГТБ биологической активности, причем основную роль в этом играют небольшие пептиды молекулярной массой не более 6 кДа. Было показано, что действие данных биорегуляторов носит тканеспецифический характер: биорегуляторы влияют на биологические процессы только в ткани - источнике их выделения. Однако молекулярные основы тканевой специфичности до сих пор остаются мало изученными. Цель работы Целью данного исследования являлось изучение тканевой специфичности действия биорегуляторов, выделенных из тканей печени и легкого млекопитающих. В отдельные задачи исследования входило: • получить фракции, содержащие МГТБ тканей печени и легкого млекопитающих; • изучить тканевую специфичность биологического действия отдельных фракций МГТБ, выделенных из печени и легкого на двух экспериментальных моделях in vitro: определения мембранотропной активности и роллерного органотипического культивирования печени тритона Pleurodeles waltl; • изучить методами электрофореза, обращенно-фазовой ВЭЖХ и масс-спектрометрии состав отдельных фракций МГТБ • исследовать белки-модуляторы, входящие в состав МГТБ, выделенных из тканей печени и легкого крыс; 3 • изучить методами иммуногистохимии состояние печени тритона до и после воздействия МГТБ; • сравнить лекарственные вещества, проявляющие гепатопротекторные свойства, на модели роллерного органотипического культивирования печени тритона Pleurodeles waltl in vitro. Научная новизна Показано, что в тканях печени, легкого млекопитающих присутствуют биорегуляторы, белковой природы, имеющие сложное строение, биологическое действие которых проявляется в СМД и характеризуется наличием тканевой, но не видовой специфичности. Биорегуляторы могут быть выделены как из свежеприготовленной ткани, так и из ткани, предварительно подвергшейся замораживанию. Показана тканевая специфичность мембранотропной активности фракций биорегуляторов, выделенных из печени, легкого и тонкого кишечника. Впервые показано, что в осадках тканевых экстрактов, полученных после высаливания белков сернокислым аммонием, присутствуют белки, влияющие на характер биологической активности низкомолекулярных пептидов - модуляторы. Методами масс-спектрометрии установлено, что данные биорегуляторы относятся к семейству сывороточных альбуминов. Впервые продемонстрировано отсутствие корреляции в биологическом действии МГТБ на модели мембранотропной активности и на модели роллерного специфичность органотипического действия культивирования. биорегуляторов на модели Продемонстрирована роллерного тканевая органотипического культивирования. Впервые методами иммуногистохимии проведена оценка состояния ткани тритона после роллерного органотипического культивирования. Впервые продемонстрирована локализация на поверхности клеток печени тритона макрофагального антигена человека. Практическая значимость работы Изученные МГТБ могут быть использованы в качестве основы для создания фармакологических и профилактических препаратов нового поколения для нормализации функций печени и легкого. Полученные данные органотипического указывают культивирования на возможность печени тритона применения in vitro модели для роллерного поиска новых гепатопротекторных веществ. Результаты данного исследования могут быть использованы в курсах лекций по клеточной биологии и клеточных технологиях. Структура и объем диссертации Работа имеет традиционную структуру, она состоит из: Введения, в котором представлены научная новизна, практическая значимость работы; главы «Литературный обзор», в которой содержатся данные по строению печени, легкого и тонкого кишечника млекопитающих, представлен обзор данных литературы, включающих описание физико-химических свойств биорегуляторов данной группы, а так же характера их 4 биологической активности; главы «Экспериментальная часть», в которой содержится описание примененных методов исследования; главы «Результаты и их обсуждение», в которой представлены результаты исследования и их обсуждение, а также заключения и выводов. Диссертационная работа содержит 154 страницы, 43 рисунка, 21 таблиц, 196 литературных ссылок. Апробация работы Материалы диссертации были представлены на V Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине», Санкт-Петербург, 29 июня – 3 июля, 2009; Х Ежегодной Международной молодежной конференции «Биохимическая физика» ИБХФ РАН-ВУЗы, Москва, 8-10 ноября 2010; VI Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов», Алушта, 20-24 сентября, 2010; ХI Ежегодной Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». Москва, 9-11 ноября, 2011; ХII Ежегодной Международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». Москва, 29-31 октября, 2012. Публикации По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 2 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень Высшей аттестационной комиссии, 8 статей в сборниках научных трудов, 3 тезиса докладов на российских и международных конференциях. Результаты и их обсуждение Получение мембранотропной активности тканевых экстрактов и отдельных фракций, содержащих биорегуляторы Биорегуляторы выделяли экстракцией тканей печени или легкого крыс в водно-солевом растворе при пониженной температуре, предварительно удалив основное количество крови перфузией или промыванием в растворе. Аналогичным образом получали экстракт тонкого кишечника крыс, который далее использовали в качестве препарата сравнения при исследовании тканеспецифического характера биологического действия фракций, содержащих биорегуляторы. Также получали экстракты печени и легкого быка, которые предварительно подвергались глубокой заморозке адгезиометрическими (до -25оС). методами на Полученные проявление тканевые экстракты мембранотропной изучали активности двумя (Ма,%); эксперименты проводили на множественных органных культурах печени или легкого мыши (гибриды F1 С57ВI/CBA,18-22г.). Результаты, представленные в табл. 1 показывают, что тканевые экстракты проявляют мембранотропную активность, которая характеризуется наличием тканевой, но не видовой специфичности. Обращает на себя внимание тот факт, что экстракты, полученные из ткани, которую предварительно подвергли замораживанию (печень и легкое быка), проявляли также мембранотропную активность. 5 Таблица 1. Характеристики экстрактов тканей и их отдельных фракций* Мембранотропная активность, Ма Степень (%) Объем Концентрация разбавления Название фракции (мл) белка (мг/мл) фракций На культуре печени На культуре (10х)** мыши легкого мыши Экстракт печени крысы 166 5,7 1015 138,0±7,6 124,2±5,1 Супернатант экстракта печени крысы 15 0,12 1014 143,1±4,3 155,3±4,7 Осадок экстракта печени крысы 50 15,2 - 118,4±6,3 117,7±5,5 ВЭЖХ-фракция супернатанта экстракта печени крысы 0,26 0,05 1012 151,1±4,4 146,5±5,4 ИЭФ-фракция супернатанта экстракта печени крысы 14 0,07 1012 138,6±9,8 150,6±6,3 Экстракт легкого крысы 150 0,73 1013 108,3±5,2 135,4±8,1 Супернатант экстракта легкого крысы 75 0,08 1015 141,3±6,8 159,6±7,4 Осадок экстракта легкого крысы 50 2,1 - 116,4±4,4 105,4±7,9 Экстракт тонкого кишечника крысы 125 8,2 - 105,5±4,3 110,3±4,1 Супернатант экстракта тонкого кишечника крысы 10 0,25 1014 141,9±4,5 139,7±6,8 Осадок экстракта тонкого кишечника крысы 50 24,3 - 120,6±5,5 110,8±7,7 Экстракт печени быка 100 4,5 1015 141,4±6,5 112,4±5,3 Супернатант экстракта печени быка 5,8 0,23 1014 164,5±4,3 150,5±7,1 Осадок экстракта печени быка 50 4,6 - 107,5±6,6 117,7±9,9 Экстракт легкого быка 100 0,81 1013 110,2±4,1 135,4±6,3 Супернатант экстракта легкого быка 3 0,11 1013 146,3±8,3 135,7±7,5 Осадок экстракта легкого быка 10 2,3 - 114,5±5,8 112,3±1,9 *-в таблице представлены данные одного из экспериментов, которые рассчитаны на 100 гр. влажного веса ткани. ** - представлена максимальная степень десятикратного последовательного разбавления фракции, в которой определялась мембранотропная активность. После высаливания экстрактов в условиях насыщенного раствора сернокислого аммония мембранотропная активность была обнаружена во фракциях надосадочной жидкости – супернатантах; осадки не проявляли мембранотропной активности. Здесь следует отметить, что впервые удалось показать возможность использования замороженной ткани в качестве источника выделения биорегуляторов данной группы. Эти данные также указывают на то, что МГТБ не секретируются клетками при получении тканевых экстрактов. 6 Утрата тканеспецифического характера мембранотропной активности тканевых экстрактов после процедуры высаливания можно объяснить нарушением целостности биорегуляторов данной группы. Возможно, что при воздействии сульфата аммония происходит нарушение связей между отдельными компонентами МГТБ, и некоторая часть биорегулятора, осаждается вместе с примесными белками. Можно также предположить, что в осадок переходят вещества, модулирующие биологическое действие активной компоненты МГТБ. Для проверки этого предположения в отношении МГТБ, выделенных из печени и легкого млекопитающих, была проведена серия экспериментов по определению мембранотропной активности образцов, полученных взаимодействием супернатантов и осадков, выделенных из различных тканевых экстрактов. Исследование биологической активности комплексов "фракция осадка+супернатант экстракта ткани" Были поставлены следующие серии экспериментов: 1. Супернатант экстракта печени крыс + фракция осадка экстракта печени крыс на модели органотипической культуры печени мыши; 2. Супернатант экстракта печени крыс + фракция осадка экстракта печени крыс на модели органотипической культуры легкого мыши; 3. Супернатант экстракта легкого крыс + фракция осадка экстракта легкого крыс на модели органотипической культуры легкого мыши; 4. Супернатант экстракта легкого крыс + фракция осадка экстракта легкого крыс на модели органотипической культуры печени мыши; 5. Супернатант экстракта легкого крыс + фракция осадка экстракта печени крыс на модели органотипической культуры печени мыши; 6. Супернатант экстракта легкого крыс + фракция осадка экстракта печени крыс на модели органотипической культуры легкого мыши; 7. Супернатант экстракта крыс печени + фракция осадка экстракта легкого крыс на модели органотипической культуры печени мыши; 8. Супернатант экстракта печени крыс + фракция осадка экстракта легкого крыс на модели органотипической культуры легкого мыши; 9. Супернатант экстракта легкого крыс + фракция модулятора сыворотки КРС на модели органотипической культуры печени мыши; 10. Супернатант экстракта легкого крыс + фракция модулятора сыворотки КРС на модели органотипической культуры легкого мыши; 11. Супернатант экстракта печени быка + фракция осадка экстракта печени крысы на органотипической культуры печени мыши; 7 12. Супернатант экстракта печени быка + фракция осадка экстракта печени крысы на органотипической культуры легкого мыши; 13. Супернатант экстракта легкого быка + фракция осадка экстракта легкого крысы на органотипической культуры печени мыши; 14. Супернатант экстракта легкого быка + фракция осадка экстракта легкого крысы на органотипической культуры легкого мыши. В этой экспериментальной серии по исследованию тканевой специфичности образцов, полученных в результате взаимодействия фракций супернатантов и осадков, выделенных из тканевых экстрактов, в качестве дополнительного контроля был изучен модулятор МГТБ, полученный из сыворотки крови (любезно предоставлен к.б.н. Рыбаковой Е.Ю.). Результаты этого исследования приведены в таблице 2. Таблица 2. Результаты определения мембранотропной активности образцов, полученных взаимодействием фракций осадков и супернатантов экстрактов тканей Экспериментальная модель определения Номер экспериментальной серии мембранотропной активности изучаемого образца Органотипическая культура печени мыши 1-2 3-4 5-6 7-8 9-10 11-12 13-14 145±3,1% 103±6,2% 135±6,5% 136±4,5% 135±5,7% 141±4,1% 104±5,6% Органотипическая культура легкого мыши 109±3,7% 146±3,2% 139±5,2% 137±4,4% 141±5,3% 106±4,9% 157±6,1% Было показано, что при взаимодействии фракций супернатантов и фракций осадков экстрактов, выделенных из ткани одного органа, происходит восстановление тканеспецифического характера мембранотропной активности полученного таким образом образца. Обращает на себя внимание отсутствие видовой специфичности активности образцов (серии 11-14). Таким образом, проведенное исследование фракций супернатантов, осадков и препаратов, полученных после их взаимодействия, показало, что в осадках экстрактов содержатся вещества, проявляющие определенный вид активности, а именно, их взаимодействие с компонентами биорегуляторов, содержащихся в супернатантах тканевых экстрактов, определяет тканеспецифический характер биологического действия последних. Изучение состава супернатантов экстрактов, выделенных из тканей млекопитающих Фракции супернатантов тканевых экстрактов были исследованы методами биохимии, биоорганической химии и физической химии. Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии было показано, что в супернатантах тканей млекопитающих присутствуют низкомолекулярные пептиды со значениями молекулярных ионов от 1000 до 9000 Да. Эти данные полностью согласуются с результатами исследования 8 биологически активных фракций МГТБ, выделенных из других источников. Кроме того, данные, приведенные в табл. 3 указывают на присутствие большого количества пептидов, значения молекулярных ионов которых отличаются друг от друга незначительно. Эти отличия можно объяснить либо присутствием большого количества разных пептидов, либо взаимодействием одного пептида с различными неорганическими молекулами и ионами – H2O, NH4, Na+,K+ и др. Таблица 3. Результаты MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа отдельных фракций тканевых экстрактов печени, легкого крысы и тонкого кишечника млекопитающих Фракция Молекулярные ионы (m/z) Супернатант экстракта печени крысы 1510, 1677, 1734, 1871, 1996, 2215, 2299, 2908, 3007, 3640 Супернатант экстракта печени быка 1178, 1419, 1567, 1609, 1741, 1831, 1873, 1963, 2005, 2095, 2153, 2269, 2285, 2417, 2475, 2549 1011, 1048, 1211, 1456, 1599, 1661, 1792, 1917, 2215, 2346, 2364, 2789, 3235, 3747, 3999, 4118 2017, 2056, 2777, 2929, 4298, 4583, 5045, 5864, 5996, 6054, 6080, 6145, 6286, 6299, 7646, 8180 1259, 1361, 1419, 1573, 1683, 1815, 1947, 2095, 2227, 2269, 2419, 2549, 2681, 2813, 2945, 3077 Супернатант экстракта легкого крысы Супернатант экстракта легкого быка Супернатант экстракта тонкого кишечника крысы ВЭЖХ-фракции (суммарная), полученные из супернатанта экстракта печени крысы ИЭФ-фракция, выделенная из супернатанта экстракта печени крысы (рН<3,0) 1974, 3450, 4134, 4379, 5388, 6959 1146, 1274, 1437, 1550, 1665, 1941, 2164, 3213, 3370 Рис.1 Обращенно-фазовая ВЭЖХ супернатанта тканевого экстракта печени крыс. Цветом отмечены фракции, проявлявшие мембранотропную активность. Ось ординаты 1 – интенсивность поглощения (mAU при 280нм); Ось ординаты 2 – содержание ацетонитрила (%); По оси абсцисс – время (мин.) На рис.1. приведена картина разделения супернатанта экстракта печени крыс обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте вода-ацетонитрил; в табл. 4 результаты определения мембранотропной активности полученных фракций. 9 Таблица 4. Мембранотропная активность ВЭЖХ-фракций супернатанта экстракта печени крыс на культуре печени мыши in vitro Фракции Фракции Ма (%) (время удерживания, Ма (%) (время удерживания, мин.) мин.) 22,3 36,7 134,1±4,3 145,4±4,1 24,5 40,0 105,2±4,2 145,5±4,1 25,7 46,7 108,2±6,4 132,4±5,1 27,4 50,5 107,3±2,8 151,1±4,4 30,8 53,7 120,4±2,4 135,1±6,5 32,8 58,1 114,3±2,5 142,2±8,4 35,1 58,9 121,2±6,4 141,6±5,1 Рис.2 SDS-Электрофорез в ПААГ супернатантов тканевых экстрактов, выделенных из печени (1) и легкого (2) Дорожка М – Маркеры (апротинин из легкого быка - 6,5 кДа, α-лактальбумин – 14,2 кДа, соевый ингибитор трипсина – 20,0 кДа, трипсиноген из поджелудочной железы быка – 24,0 кДа, карбоангидраза – 29,0 кДа, глицеральдегид – 3 – фосфатгидрогеназа – 36,0 кДа, овальбумин – 45,0 кДа, альбумин – 66, 0 кДа.) М 1 2 М Несоответствие полученных результатов, на наш взгляд, можно объяснить оригинальностью физико-химических свойств, проявляемых биорегуляторами данной группы: в растворах супернатантов тканевых экстрактов были обнаружены крупные наноразмерные частицы (табл. 5), вторичная структура пептидов, входящих в состав супернатантов, в растворе характеризуется наличием преимущественно β-структур и статистического клубка (табл. 6). Кумасси-окрашенные полосы элюировали из геля и проводили триптический гидролиз белка с последующим анализом методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Было показано, что наиболее вероятными компонентами обеих фракций супернатантов являются белки семейства сывороточных альбуминов с различными молекулярными массами (база данных UNIPROT). 10 Таблица 5. Исследование фракций супернатантов тканевых экстрактов методом лазерного динамического светорассеяния Объект исследования Значение гидродинамического радиуса частиц (нм) Супернатант экстракта печени крысы 100±4,6 Супернатант экстракта легкого крысы 90±5,4 Супернатант экстракта тонкого кишечника 235±3,9 Супернатант экстракта печени быка 784,4 Таблица 6. Исследование фракций супернатантов тканевых экстрактов методом кругового дихроизма. Элементы вторичной структуры Название фракции Супернатант экстракта печени крыс Супернатант экстракта легкого крыс Супернатант экстракта тонкого кишечника крыс Супернатант экстракта печени быка Суммарная ВЭЖХ-фракция, выделенная из супернатанта экстракта печени крыс Супернатант экстракта легкого быка αспираль β-структуры Параллельные 2,4 3,3 βскладки 17,3 15,6 Статистиче ский клубок 5,0 7,2 Антипараллельные 55,3 52,4 7,2 40,8 2,5 26,1 23,8 3,4 47,1 2,7 24,7 25,4 5,8 59,7 2,2 18,8 13,5 1,86 49,0 2,9 26,7 24,7 19,8 21,4 В настоящей работе было проведено исследование состава фракций осадков, полученных после высаливания тканевых экстрактов сульфатом аммония, методом MALDI-TOF массспектрометрии. Для этого после проведения SDS-электрофореза фракций осадков из геля вырезали наиболее интенсивно Кумасси-окрашиваемые полосы и проводили триптический гидролиз белка с последующим анализом методом MALDI-TOF масс-спектрометрии (рис.3). Полученные данные показывают, что в этих фракциях присутствует смесь белков, причем по составу эти фракции различаются между собой. В осадке, выделенном из экстракта печени, можно отметить ряд ферментов, которые локализованы в ткани этой железы. В осадке, полученном из экстракта легкого, отмечается присутствие белков крови. Следует отметить, что в состав обеих фракций осадков входят белки семейства альбуминов сыворотки крови, что согласуется с ранее высказанными предположениями о принадлежности белков этого семейства к модуляторам МГТБ. 11 Рис. 3 SDS-Электрофорез в ПААГ фракций осадков, собранных при 50-100% насыщении сульфатом аммония, тканевых экстрактов, выделенных из печени (1) и легкого (2) Дорожка М – Маркеры (апротинин из легкого быка - 6,5 кДа, α-лактальбумин – 14,2 кДа, соевый ингибитор трипсина – 20,0 кДа, трипсиноген из поджелудочной железы быка – 24,0 кДа, карбоангидраза – 29,0 кДа, глицеральдегид – 3 – фосфатгидрогеназа – 36,0 кДа, овальбумин – 45,0 кДа, альбумин – 66, 0 кДа.) Исследование фракций, полученных в условиях нативного электрофореза в ПААГ Так как ранее было показано, что белки семейства сывороточного альбумина являются модуляторами биологически активных пептидов в МГТБ, было проведено выделение альбуминовых фракций (зоны П-2 и Л-2). Для этого проводили электрофорез в ПААГ в неденатурирующих условиях - отсутствие додецилсульфата натрия (рис. 4). Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии были определены молекулярные ионы белков, содержащихся в зонах П-2 и Л-2; их значения соответствуют m/z 66246 и 66123 Да. Методом триптического гидролиза было показано, что данные белки относятся к семейству сывороточных альбуминов. Результаты исследования мембранотропной активности препаратов, полученных при взаимодействии альбуминовых фракций и супернатантов, выделенных из одного органа, приводит к восстановлению тканевой специфичности, характерной для исходного экстракта (табл. 7). 12 Рис. 4 Электрофорез в ПААГ (нативные условия) фракций осадков тканевых экстрактов печени (П) и легкого (Л) крыс, полученных при 50-100% насыщении сульфатом аммония. Гель разделяли на 4 зоны и элюировали белки 0,01 М фосфатным буфером. Рис. 5 SDS - электрофорез в ПААГ альбуминовых фракций (П2, Л-2), полученных из осадков тканевых экстрактов печени и легкого крысы. Дорожка 1 – Альбумин печени крысы Дорожка 2 – Альбумин легкого крысы Дорожка М – Маркеры (апротинин из легкого быка - 6,5 кДа, αлактальбумин – 14,2 кДа, соевый ингибитор трипсина – 20,0 кДа, трипсиноген из поджелудочной железы быка – 24,0 кДа, карбоангидраза – 29,0 кДа, глицеральдегид – 3 – фосфатгидрогеназа – 36,0 кДа, овальбумин – 45,0 кДа, альбумин – 66, 0 кДа.) Методом SDS-электрофореза в ПААГ было показано, что альбуминовые фракции представляют собой электрофоретически чистые белки (рис.5) с мол. массой около 66 кДа. Таблица 7. Мембранотропная активность образца, полученного взаимодействием супернатанта тканевого экстракта с альбуминами, выделенными из экстрактов тканей Экспериментальная модель определения мембранотропной активности изучаемой фракции Образец Альбуминовая фракция + супернатант, выделенные из тканевого экстракта печени крысы Альбуминовая фракция + супернатант, выделенные из тканевого экстракта легкого крысы Альбуминовая фракция + ВЭЖХ-фракция супернатанта, выделенные из тканевого экстракта печени крыс Органотипическая культура печени мыши Органотипическая культура легкого мыши 164,5±3,2 106,4±4,1 108,1±5,7 158,4±5,4 158,6±6,5 108,4±6,3 Полученные данные указывают на то, что эти белки являются различными изоформами семейства сывороточных альбуминов. Таким образом, полученные нами результаты показывают, что обнаруженные в осадках альбумины сыворотки крови, проявляют свойства модулировать мембранотропную активность пептидов, присутствующих 13 во фракции супернатантов. Полученные результаты показывают, что электрофоретически индивидуальные белки, определяемые как сывороточные альбумины, очевидно, представляют собой изоформы этого белка, поскольку их взаимодействие с супернатантами тканевых экстрактов приводит к образованию тканеспецифического комплекса (табл. 7). Исследование биологической активности экстрактов и отдельных их фракций на модели роллерной органотипической культуры печени тритона in vitro Для исследования специфической активности МГТБ ранее были разработаны модели роллерного органотипического культивирования тканей позвоночных животных (млекопитающих и хвостатых амфибий) in vitro. Поэтому в данной работе для изучения экстрактов и их фракций была применена модель роллерного органотипического культивирования печени тритона in vitro. В качестве изучаемого параметра была выбрана площадь, занимаемая пигментированными клетками печени тритона, которую оценивали морфометрически. Кроме оценки этого параметра, в настоящей работе была предпринята попытка с помощью ряда маркеров оценить состояние печени взрослого тритона при роллерном органотипическом культивировании, в том числе, и после действия биологически активных фракций изучаемых биорегуляторов. На рис. 6 представлены гистологические срезы интактной печени тритона Pl. waltl. Печень покрыта состоящей из фиброзных волокон капсулой, под которой располагается кортикальный слой, представленный многослойными структурами соединительнотканных клеток. Данные клетки бедны цитоплазмой, характеризуются крупными ядрами разной формы, среди них отмечаются митозы. Основное отличие функции печени взрослых хвостатых амфибий от млекопитающих заключается в сохранении кроветворения. Паренхима ткани печени тритона компактна и по типу строения приближается к таковой у млекопитающих. Паренхиматозные клетки имеют неправильно многоугольную форму, иногда несколько округленные края и большие размеры. Вокруг сосудов отмечается развитая область соединительнотканных клеток, в которой видны желчные протоки. В просветах кровеносных сосудов обнаружены эритроциты. В печени тритона много пигментных клеток, которые часто располагаются в виде групп, как в кортикальном слое, так и в паренхиме. Пигментированные клетки печени амфибий являются аналогами купферовских клеток печени млекопитающих и функционируют как макрофаги, поглощая разные частицы, например, микроорганизмы, вирусы, а также осуществляют детоксикацию ксенобиотиков. Эти клетки происходят из гемопоэтических стволовых клеток. Распределение пигмента в этих клетках печени зависит от ряда причин, например, оно сезонно изменяется: значительно уменьшается ко второй половине зимы и увеличивается весной и летом. Полученные нами данные показывают, что распределение пигмента в клетках печени также зависит от состояния организма животных, например, увеличение их количества в железе тритона наблюдается после операции (ампутации конечности), травмы животного, например 14 травма глаза. Следует отметить, что в литературе имеются данные, показывающие увеличение количества пигментированных клеток в печени амфибий после частичной гепатэктомии. На рис. 7 представлены гистологические срезы печени тритона, у которого было исследовано количество пигментных клеток через семь дней после того, как был удален частично хвост. Площадь, занимаемая пигментированными клетками существенно увеличилась (табл.8). Рис. 6 Гистологический срез интактной печени тритона Pleurodeles waltl: а - кортикальный слой кроветворных клеток, б - паренхиматозные клетки, в – пигментированные клетки, г – кровеносный сосуд. увеличение ок.х10, об.х20. Таким образом, в проведенном исследовании было установлено, что параметр (площадь, занимаемая пигментированными клетками), который выбран нами для оценки состояния ткани печени, зависит, в свою очередь, от состояния организма животного. Рис. 7 Гистологические срезы печени тритона Pleurodeles waltl до (А-1) и после (А-2) операции удаления фрагмента хвоста. а - кортикальный слой, б паренхиматозные клетки, в – пигментированные клетки, г – кровеносный сосуд. увеличение ок.х10, об.х20. Таблица 8. Влияние травмы и некоторых фракций тканевого экстракта печени крыс на состояние ткани печени тритона при роллерном органотипическом культивировании* Состояние тритона перед постановкой органотипической культуры печени (площадь, занимаемая пигментированными клетками в % от общей площади среза) Экспериментальная серия Ампутация конечности за 7 Не оперированный тритон дней до начала эксперимента по культивированию Интактная печень 0,61±0,12 2,13±0,44 Контроль (без добавления препаратов) 0,59±0,12 1,21±0,33 Супернатант тканевого экстракта печени крыс 0,74±0,19(p<0,5) 1,63±0,25(p<0,05) Суммарная ВЭЖХ-фракция супернатанта 0,86±0,20(p<0,05) 2,06±0,37(p<0,05) тканевого экстракта печени крыс * представлены данные одного из экспериментов, в котором наблюдали двух животных, содержащихся в одинаковых условиях (проведено не менее трех экспериментов). 15 Результаты исследования, полученные в условиях 3-х дневного роллерного органотипического культивирования печени тритона in vitro при воздействии тканевых экстрактов, выделенных из печени, легкого и тонкого кишечника крыс, показали, что все три экстракта в СМД не оказывали влияния на площадь пигментированных клеток печени тритона по сравнению с контрольными сериями (табл. 9). Экстракт, выделенный из тонкого кишечника крыс, исследовали как препарат сравнения, на основании ранее полученных результатов, показывающих проявление им тканеспецифического характера мембранотропной активности. Таблица 9. Влияние экстрактов, выделенных из ткани печени, легкого и тонкого кишечника крыс, на состояние ткани печени тритона в условиях 3-х дневного роллерного органотипического культивирования in vitro* Исследованная фракция Площадь, занимаемая пигментированными клетками в % от общей площади среза Контроль 0,13±0,04 Экстракт печени крысы 0,15±0,06 (p>0,5) Экстракт легкого крысы 0,13±0,04 (p>0,5) Экстракт тонкого кишечника крысы 0,12±0,03 (p>0,5) *- представлены данные одного эксперимента; всего проведено 4 опыта При исследовании супернатантов, выделенных из экстрактов тканей млекопитающих, было показано тканеспецифическое биологическое действие супернатантов, выделенных их экстрактов печени (табл. 10). Таблица 10. Влияние супернатантов тканевых экстрактов, выделенных из печени, легкого и тонкого кишечника млекопитающих, на состояние ткани печени тритона при роллерном органотипическом культивировании in vitro* Исследованная фракция Площадь, занимаемая пигментированными клетками в % от общей площади среза Контроль 0,12±0,01 Супернатант экстракта печени крысы 0,15±0,02 (p<0,05) Супернатант экстракта печени быка 0,14±0,01 (p<0,05) Супернатант экстракта легкого крысы 0,12±0,01 Супернатант экстракта легкого быка 0,11±0,04 Супернатант экстракта тонкого кишечника крысы 0,11±0,05 *- представлены данные одного эксперимента; проведено 3 эксперимента. Обращает внимание тот факт, что действие супернатантов, выделенных из печени, как крысы, так и быка, оказывают практически одинаковое действие на параметр, отражающий занимаемую пигментированными клетками площадь в печени тритона в условиях роллерного органотипического культивирования. Следует отметить сохранение структуры ткани печени и кроветворных клеток при действии в СМД обоих супернатантов по сравнению с культурами контрольной серии: сохраняется балочное строение ткани печени и кроветворение в субкапсулярной области и вокруг сосудов, поддерживаются адгезионные, контактные взаимодействия между клетками, а также их жизнеспособность, то есть состояние ткани наиболее приближается к состоянию интактной печени тритона. Суммарная ВЭЖХ-фракция была исследована на культуре печени тритонов – оперированного и не оперированного (табл.8). Различие между данными контрольной и опытной серий, проведенных на ткани не оперированного тритона при исследовании фракции супернатанта тканевого экстракта было малодостоверным (p<0,5), в то время как в эксперименте по 16 культивированию печени травмированного тритона, достоверность биологического эффекта исследуемых фракций была значительно выше (p<0,05) (табл. 8). На наш взгляд, это могло быть связано с относительно небольшим количеством пигментированных клеток, в основном одиночных, неравномерно распределенных по ткани печени неоперированного тритона. Следует отметить, что аналогичные данные были получены при исследовании влияния супернатанта, выделенного из экстракта печени крыс (табл.8). TUNEL – окрашивание применяли для оценки состояния ткани - выявления апоптических клеток. Окрашивание интактной ткани печени тритона выявило неспецифическое окрашивание клеток крови, которое наблюдается как в красном, так и в зелёном канале (рис.9 А). Аналогично в обоих каналах были видны ядерные эритроциты. Специфическое окрашивание во всех образцах не выявлялось. Это означает, что в интактной ткани печени практически не встречаются апоптические клетки. В культивированной ткани печени наряду с неспецифическим окрашиванием клеток крови, наблюдается также специфическое окрашивание (отличающееся по интенсивности и характеру свечения) групп клеток, свидетельствующее об увеличении числа клеток, входящих в апоптоз. Эти клетки имели другое по интенсивности свечение, и не имели сигнала в красном канале. Большинство меченых клеток наблюдалось на периферии среза, в зоне максимально подверженной механическим воздействиям. Клетки образовали группы и скопления (рис 9 Б). Таким образом, с помощью данного маркера удалось выявить апоптотические клетки в печени тритона после роллерного органотипического культивирования в течение трех дней. В ткани печени, культивированной с супернатантом тканевого экстракта печени крыс, при иммунохимическом TUNEL - окрашивании наблюдалось изменение локализации меченых клеток: в контроле обнаруживались группы меченых апоптотических клеток, тогда как в опытной серии наблюдались единичные меченые клетки, не образующие группы, что предполагает меньший процент гибнущих клеток в культуре и протекторное действие фракции супернатанта в СМД на состояние ткани печени тритона (рис. 9 В). Рис. 8 Иммунохимическое окрашивание клеток, синтезирующих ДНК, в печени тритона до (А) культивирования и после культивирования (Б) (Стрелками показаны ДНКсинтезирующие клетки) увеличение ок.х10, об.х20. 17 Рис. 9 TUNEL - окрашивание в печени тритона: А - до культивирования (стрелками показаны неспецифически окрашенные клетки крови); Б - в контрольных образцах (желтой рамкой показана зона специфически окрашенных апоптотических клеток); В - в образцах с добавлением супернатанта экстракта печени крыс (стрелками показаны специфически окрашенные апоптотические клетки). увеличение ок.х10, об.х20. Рис. 10 Иммунохимическое окрашивание с пероксидазной меткой клеток, синтезирующих ДНК, в печени тритона до (А) и после (Б) культивирования. увеличение ок.х10, об.х20 Состояние печени тритона оценивалось также по наличию пролиферативных процессов, которое осуществляли с помощью иммуногистохимического окрашивания на присутствие ДНКсинтезирующих клеток в ткани печени тритона. Выявление предшественника синтеза ДНК BrdU, проводили окрашиванием с помощью флуоресцентной и пероксидазной меток (рис. 8, 10). Было показано наличие единичных пролиферирующих клеток в интактной печени тритона; после культивирования печени тритона наблюдалось 18 значительное увеличение числа ДНК- синтезирующих клеток (рис.8 Б). Эти результаты были подтверждены так же окрашиванием пероксидазой хрена (рис.10). Полученные данные показывают, что роллерное органное культивирование стимулирует пролиферативные процессы в ткани, что согласуется с литературными данными о дополнительной активации клеточных источников регенерации в этих условиях культивирования. В этой экспериментальной серии не удалось обнаружить влияния супернатанта, выделенного из печени тритона на пролиферативные процессы. Рис. 11. Иммунохимическое окрашивание против макрофагального фенотипа: А - в интактной печени тритона; Б - после культивирования в контрольных образцах; В - после культивирования в присутствии супернатанта экстракта печени крысы (стрелками указан специфический антиген на поверхности клеток). увеличение ок.х10, об.х20. Впервые в этом исследовании было проведено иммунохимическое окрашивание на наличие макрофагального антигена человека в клетках интактной печени тритона. На рис. 12 представлены гистологические срезы ткани печени тритона после иммуногистохимического окрашивания на присутствие макрофагального антигена человека и микрофотография, полученная фазово-контрастной микроскопией. Полученные данные показывают, что в зеленом канале обнаруживается специфическое свечение, которое указывает на присутствие соответствующего антигена на поверхности клеток печени тритона (тонкие стрелки), окрашенные клетки могут быть пигментированными, в то же время, в некоторых положительно окрашиваемых клетках визуально не обнаруживается присутствие пигмента. Следует так же отметить, что не все клетки, обладающие типичной морфологией макрофагов окрашиваются специфически на данный антиген (белая стрелка на рис. 12). Таким образом, в настоящем исследовании впервые было продемонстрировано присутствие макрофагального антигена на поверхности клеток печени тритона. В этом аспекте можно добавить, что присутствие данного антигена возможно не только у макрофагов, но и у 19 гистиоцитов, представляющих собою, так называемые «блуждающие» клетки, способные к амёбоидному движению, выполняющие также защитную функцию, выражающуюся в поглощении различных крупных частиц. При повреждении ткани и развитии воспалительных процессов, гистиоциты активируются и превращаются в типичные макрофаги. Методами иммуногистохимии было показано, что экспрессия макрофагального антигена человека на поверхности клеток печени тритона сохраняется после культивирования, а также после действия отдельных фракций тканевых экстрактов печени (рис. 11). Рис. 12. Иммунохимическое окрашивание на макрофагальный фенотип. (желтыми стрелками указан специфический антиген на поверхности клеток, белой стрелкой указана клетка с морфологией макрофага). увеличение ок.х10, об.х20. Следует отметить, что визуальные наблюдения показывают, что в условиях культивирования экспрессия макрофагального антигена уменьшается, а при действии супернатанта печени крыс – увеличивается. Количественное определение специфической флуоресцентной метки представляет собой отдельную методическую задачу, достаточно сложную. Поэтому в данном исследовании такой сравнительный аспект осуществляли только визуально. Исследование ряда лекарственных препаратов на модели роллерного органотипического культивирования печени тритона in vitro Исследование гепатопротекторного действия различных веществ представляет собой достаточно сложную экспериментальную задачу. Обычно такие эксперименты проводятся на большом количестве животных in vivo, с использованием в качестве гепатотоксинов четыреххлористого углерода, хлороформа в течение длительного времени. Оценка гепатопротекторного действия обычно производится по определению уровня работы ряда ферментов, гистологическому анализу состояния отдельных популяций клеток печени. Кроме того, подобные медикобиологические исследования не всегда способны привести к пониманию механизма действия биологически активных веществ, проявляющих гепатопротекторную активность. Поэтому актуальна разработка новых методов оценки гепатопротекторного действия, которые не только являлись бы менее трудоемкими и дорогостоящими, но и давали бы более конкретные 20 представления о механизме действия этих веществ. На наш взгляд, модель роллерного органотипического культивирования печени тритона могла бы быть использована в качестве экспериментальной модели для скрининга веществ на проявление гепатопротекторного действия. С целью проверки этого предположения была проведена опытная серия по оценке влияния ряда известных и применяемых для лечения патологий печени лекарственных средств на состояние печени тритона при роллерном органотипическом культивировании (табл. 11). Таким образом нами было установлено, что на данной модели только препараты Гепарис и Эссенциале Форте оказывали влияние на площадь пигментированных клеток при роллерном органотипическом культивировании. Таблица 11. Исследование влияния на состояние печени тритона при роллерном органотипическом культивировании in vitro некоторых лекарственных препаратов* Исследованная фракция Нативная ткань Супернтантант экстракта печени крыс Экстракт печени крыс Контроль Карсил Гепарис Галстена Площадь, занимаемая пигментированными клетками в % от общей площади среза 1,49±0,45 2,45±0,61(p<0,05) 1,51±0,37 1,81±0,64 1,43±0,64 2,37±0,63(p<0,05) 1,74±0,61 Эссенциале Форте 2,01±0,35(p<0,05) * - приведены данные одного из экспериментов, проведенного на культуре печени одного тритона. Выводы 1. Показано, что в тканях печени, легкого млекопитающих присутствуют биорегуляторы, белковой природы, имеющие сложное строение, биологическое действие которых проявляется в СМД и характеризуется наличием тканевой, но не видовой специфичности. Биорегуляторы могут быть выделены как из свежеприготовленной ткани, так и из ткани, предварительно подвергшейся замораживанию. 2. Показано, что при высаливании тканевых экстрактов, в условиях насыщенного раствора сульфата аммония образуется биологически активная фракция надосадочной жидкости, содержащая пептиды с молекулярной массой от 1000 до 9000 Да и осадок белков с мол. массой от 10000 до 160000 Да, в состав которого входят модуляторы биологической активности пептидов. 3. Показано, что одними из компонентов фракции белков - модуляторов, входящих в состав биорегуляторов печени и легкого крыс, являются изоформы сывороточного альбумина. 4. Сравнительный анализ результатов оценки биологического действия МГТБ, выделенных из печени и легкого крыс, полученных на двух экспериментальных моделях, а именно определения мембранотропной активности на модели органотипического культивирования 21 ткани печени или легкого мыши, с одной стороны, и роллерного органотипического культивирования печени тритона Pleurodeles waltl, с другой, показал, что за тканевую специфичность биологического действия биорегуляторов ответственны как пептидная часть, так и белки – модуляторы. 5. Показано, что фракции биорегуляторов, выделенные из печени, легкого и тонкого кишечника крыс различались по характеру биологического действия: тканеспецифическое мембранотропное действие проявляли только тканевые экстракты; мембранотропная активность супернатантов, ВЭЖХ- и ИЭФ-фракций характеризовалась отсутствием тканевой специфичности. Было установлено, что тканевые экстракты не проявляли биологического действия на модели органотипического роллерного культивирования печени тритона, в то время как фракции супернатантов оказывали тканеспецифическое действие, а ВЭЖХ - и ИЭФ - фракции биорегулятора печени крыс по своему действию от фракции супернатанта тканевого экстракта не отличались. 6. Впервые показана локализация цитоплазматического макрофагального антигена человека LN5 на поверхности паренхиматозных клеток печени тритона, что свидетельствует о сходстве антигенных детерминант молекул поверхности клеток печени тритона, а также белков цитоскелета макрофагов человека. 7. Впервые иммуногистохимическими методами было показано, что при роллерном органотипическом культивировании in vitro воздействие фракции супернатанта тканевого экстракта печени крысы способствует увеличению жизнеспособности клеток печени тритона. 8. Показано, что нанесение травмы вызывает у тритона увеличение площади пигментированных клеток в печени. 9. Показано, что лекарственные вещества, проявляющие гепатопротекторное свойство, оказывают влияние на состояние печени тритона при культивировании, что выражается в изменении площади, занимаемой пигментированными клетками печени. 22 Список публикаций 1. Ямскова В.П., Борисенко А.В., Краснов М.С., Ильина А.П., Рыбакова Е.Ю., Мальцев Д.И., Ямсков И.А. Влияние биорегуляторов, выделенных из печени, сыворотки крови и желчи млекопитающих, на состояние ткани печени тритона при органотипическом культивировании // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2010. №3. С. 156-159. 2. Ильина А.П., Куликова О.Г., Мальцев Д.И., Краснов М.С., Рыбакова Е.Ю., Скрипникова В.С. , Кузнецова Е.С., Буряк А.К., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Идентификация новых пептидов из межклеточного пространства методом MALDI-TOF масс-спектрометрии // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. №2. C. 135-140. 3. Мальцев Д.И., Ямскова В.П., Ильина А.П., Маргасюк Д.В., Ямсков И.А. Исследование биорегуляторов, выделенных из ткани печени млекопитающих // Сборник научных трудов «Факторы экспериментальной эволюции организмов». К.: Логос. 2010. Т. 9. С. 303-307. 4. Malcev D.I., Yamskova V.P., and Yamskov I.A.. Tissue Specificity Study of Bioregulators Isolated from Liver and Lung of Mammals // Journal of Information, Intelligence and Knowledge. 2012. V. 4. Iss.2. P.3-9. 5. Golubtsova T.A., Uspenskaya E.V., Maltsev D.I., Yamskova V.P.,Yamskov I.A and Syroeshkin A.V. Study of supramolecular structure of aqueous solutions of bioregulators of animal origin in ultralow doses // In the book «Modern Problems in Biochemical Physics», Ed. By G.E. Zaikov, S.D. Varfolomeev et al., Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc. 2012. P. 143-147. 6. Богданов В.В., Мальцев Д.И., Ямскова В.П., Ямсков И.А. «Разработка новых лекарственных средств на основе мембранотропных эндогенных биорегуляторов» // Сборник научных трудов «Новые химико-фармацевтические технологии». Москва. 2012. С. 233-239. 7. Ямскова В.П., Мальцев Д.И., Богданов В.В, Ямсков И.А. «Роллерное органное культивирование «in vitro» ткани печени тритона Pleurodeles waltl как модель для исследования гепатопротекторной активности» // Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине. Тезисы 3 Международной научно-практической конференции. Казань. 2012. С. 235-236. 8. Мальцев Д.И., Ильина А.П., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Сравнительное изучение биорегуляторов органно-тканевого гомеостаза, выделенных из тканей животных различных видов // Тезисы V Международного конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». Санкт-Петербург 29 июня – 3 июля 2009. C. 133-135. 9. Мальцев Д.И., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Исследование активности биорегуляторов печени и легкого млекопитающих в сверхмалых концентрациях и в состоянии «мнимых» растворов // Труды X Ежегодной Международной молодежной конференции "Биохимическая физика" ИБХФ РАН-ВУЗы 8-10 ноября 2010. C. 148-152. 23 Голубцова Т.А., Успенская Е.В., Мальцев Д.И., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Сыроешкин 10. А.В. Изучение супрамолекулярной структуры водных растворов биорегуляторов животного происхождения в сверхмалых дозах // Труды X Ежегодной Международной молодежной конференции "Биохимическая физика" ИБХФ РАН-ВУЗы 8-10 ноября 2010. С. 50-53. Мальцев Д.И., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Изучение тканевой специфичности 11. биорегуляторов, выделенных из печени и легкого млекопитающих // Труды XI Ежегодной Международной молодежной конференции "Биохимическая физика" ИБХФ РАН-ВУЗы. 2011. C. 142-145. Мальцев Д.И., Рощин А.О., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Изучение состава новой группы 12. биорегуляторов, выделенных из печени и легкого млекопитающих // Труды XII Ежегодной Международной молодежной конференции "Биохимическая физика" ИБХФ РАН-ВУЗы. 2012. C. 58-59. 13. Мальцев Д.И., Ямскова В.П., Ямсков И.А. Имунногистохимическое исследование состояния печени тритона до и после роллерного органотипического культивирования. // «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Тезисы 3 Международной научно-практической конференции. Казань. 2012г. C. 143-144. 24