Масс-спектрометрия

Масс-спектрометрия
Масс-спектрометрия (МС) – очень точный и полезный метод исследования биополимеров, в
результате которого мы имеем хороший характеризующий параметр – молекулярную массу.
Другие методы (э/ф, хроматография, ц/ф) могут лишь косвенно оценить молекулярную массу.
Знание точной молекулярной массы позволяет, во-первых, оценить состав вещества, во-вторых,
степень его чистоты. Поэтому МС является важным этапом исследования синтезированного
вещества. Точность метода – 1 атом. Единственная проблема – метод масс-спектроскопии сложно
использовать при работе с веществами с высокой молекулярной массой.
Суть метода – превращение молекул в газообразные ионы и разделение в масс-спектрометре на
основании отношения массы к заряду (m/z). Масс-спектр – это график, отражающий
относительное количество ионов при каждом значении m/z. Масс-спектрометр измеряет
отношение m/z, т.е. ион 1000++ будет зарегистрирован как 500+
Устройство самого простого прибора







Система создания глубокого вакуума
Система ввода образца
Источник ионизации (MALDI, ESI, FAB, ‘электронный удар, химическая ионизация).
В этой камере частицам передается электрическая либо химическая энергия заданной
величины, и частицы превращаются в ионы зарядом +1 либо -1. Образования кратных
зарядов стараются избегать, т.к. прибор измеряет отношение m/z.
Масс-анализатор, он же масс-фильтр (TOF, квадрупольная ионная ловушка, магнитный
сектор, циклотрон с преобразователем Фурье).
Детектор (конверсионный динод, электронный умножитель, детектор с микроканальной
пленкой, матричный детектор).
Система обработки данных
Система создания вакуума
Для работы масс-анализатора всегда используют систему насосов для создания вакуума. Вакуум
используется для минимизации вероятности столкновения ионов образца с молекулами воздуха.
Если вакуумное разрежение будет недостаточным, то ионы могут просто не достигнуть детектора.
В большинстве приборов 2 вакуумных насоса:
Поворотно-лопастной / масляный насос, для начального снижения давления – 1 торр
Турбомолекулярный / диффузионный насос, для создания глубокого вакуума -1 – 1000 нторр.
Ионизация
Существуют методы, использующие ионизацию с формированием как катионов, так и анионов
(соответственно, как удаление, так и присоединение электронов), однако чаще используется
анализ с помощью положительно заряженных ионов.
Принципы разделения и детекции обоих типов ионов во многом совпадают.
Методы ионизации грубо разделяются на мягкие и жесткие. Некоторые мы сейчас рассмотрим.
Ионизация электронным ударом (Electron impact ionization, EI)
В настоящее время используется только для промышленных и фармацевтических анализов,
например, при проверке структуры нового лекарственного препарата, анализа метаболитов и
загрязняющих веществ.
Поток электронов разгоняется до потенциала 70 эВ и проходит сквозь вакуумную камеру, вызывая
ионизацию анализируемого вещества, которое в газообразной форме поступает в ту же камеру.
Максимальный размер молекул – 400 Да. Для некоторых пептидов с большим молекулярным
весом летучесть удается повысить с помощью химических модификаций. Кроме того, в процессе
анализа происходит фрагментация анализируемого вещества.
При бомбардировке электронами молекула теряет электрон (реже приобретает) внутри одной из
химических связей. При этом частица становится одновременно и катионом, и радикалом (М+∙).
Такие ион-радикалы называют ионами-предшественниками или родительскими. Они крайне
неустойчивы и при дальнейшей бомбардировке электронами распадаются дочерние продукты –
ион и радикал. Радикалы не несут заряда и не регистрируются, и выкачиваются под действием
вакуума . Заряженные частицы ускоряются и попадают в анализатор.
В процессе фрагментации разрыв химической связи случаен и любой продукт может быть и
ионом, и радикалом. Однако набор продуктов зависит от их термодинамической устойчивости.
Кроме того, ион может распадаться дальше вплоть до отдельных атомов. Следовательно, до
анализатора дойдет не так много ионов конкретного типа, что приведет к небольшой
интенсивности сигнала.
Химическая ионизация при атмосферном давлении (CT)
Химическая ионизация используется для тех же молекул, что и ионизация электронным ударом.
Уровень фрагментации при этом методе невысок, что особенно удобно для определения
молекулярной массы. Источник ионизации аналогичен тому, что и у EI, но в системе должен
присутствовать газ (метан или аммиак), предварительно ионизированный с помощью EI.
Молекулы исследуемого вещества инкапсулируются в капельки растворителя, после чего
капельки попадают в зону глубокого вакуума. Там растворитель удаляется, и молекула готова к
взаимодействию. В условиях высокого давления происходит взаимодействие между молекулами
газа и анализируемым веществом, в результате чего наше вещество ионизируется. Следует учесть,
что образовавшиеся ионы будут отличаться по массе от нейтральных молекул.
Пики молекулярных ионов довольно тонкие и имеют высокую интенсивность. Точность метода
велика – до одного атома водорода. Однако в области низких значений масс-спектра неизбежно
наличие пиков, которые соответствуют продуктам распада.
Абсолютно неприменима для анализа смеси образцов. И для детекции веществ по молекулярным
массам такой метод тоже не подойдет.
Электроспрей (ESI)
Метод ионизации в мягких условиях, не приводящий к фрагментации молекул. Позволяет
анализировать крупные биополимеры – ДНК, белки.
Вещество в растворителе (50%-ный органический растворитель в воде) впрыскивают в сильное
электрическое поле (до 4 кэВ): создаются мельчайшие капельки заряженного вещества, а
растворитель удаляется. Ионизация проводится при атмосферном давлении.
В качестве растворителя обычно используется смесь (50:50) метанола или ацетонитрила и воды с
1%-ной уксусной или 0.1%-ной муравьиной кислотой. Наличие растворителя способствует
образованию капель и облегчает испарение. Органические кислоты способствуют ионизации
вещества. Концентрация образца от 1до 10 пмоль/мм3.
Небольшие молекулы обычно образуют однозарядные ионы, большие биополимеры –
многозарядные, что, соответственно, уменьшает соотношение z/m и позволяет определить их
молекулярную массу, хотя оптимум измерений метода – 200-3000 Да.
Белки обычно анализирую в виде положительных ионов при низких значениях pH: в таком случае
ионизуются боковые группы лизина, гистидина и аргинина, а также концевая NH2-группа.
Нуклеиновые кислоты чаще рассматриваются в виде аниона при высоких значениях pH.
Иногда для облегчения испарения растворителя вокруг иглы распылителя со слабой скоростью
пропускают газ (например, N2): это может быть полезно при анализе веществ, разрушающихся при
слабом нагревании.
MALDI (matrix-assisted laser desorption ionisation), лазерная десорбция-ионизация,
ассистируемая матрицей
етод был придуман независимо Ф.Хилленкампом с М. Карасом и К.Танаке в 1988 году, и
позволяет исследовать труднолетучие высокомолекулярные молекулы при минимальной
фрагментации.
Анализируемое вещество сокристаллизуется с матрицей, которая представляет собой
органическое соединение с сопряженными связями. Матрица хорошо поглощает свет на длине
лазерного источника (330-360 нм), а исследуемый образец на этой длине обычно поглощает плохо.
Обычно используют азотный лазер (337 нм) или неодим-иттрий-алюминий-гранатовый лазер (355
нм). Лазер можно перемещать, чтобы найти так называемые «сладкие точки», в которых
соотношение матрицы и образца оптимально для получения наибольшей чувствительности.
Название
Растворители для матрицы
Типы исследуемых
веществ
2,5-Дигидроксибензой-ная кислота
Вода, этанол, метанол, ацетон,
ацетонитрил, хлороформ,
тетрагидрофуран
Пептиды,
олигонулеотидыполисахари
ды, синтетические
полимеры
2-(4-Гидроксифенилазо)-бензойная
Диоксан, ацетон,
тетрагидрофуран,
Пептиды, белки,
Формула
кислота
диметилформамид
синтетические полимеры
α-циано-4-гидроксикоричная
кислота
Ацетон, водн. Ацетонитрил,
ТГФ, ДМФА, этанол
Пептиды, синтетические
полимеры
Синапиновая кислота
ТГФ, ДМФА
Пептиды, белки, липиды
Феруловая кислота
ТГФ, ДМФА
Пептиды, белки
1,8,9-Антрацентриол
ТГФ, ДМФА, толуол,
хлороформ, хлорбензол
Синтетические полимеры,
липиды
Таблица 1. Типы матриц для MALDI.
Образец смешивают с избытком матрицы (от 1 : 1 000 до 1 : 10 000 )и высушивают, после чего
производится выстрел лазером из прицела, похожего на игровой. Луч лазера за несколько
наносекунд поглощается молекулами матрицы, что приводит к возбуждению электронов матрицы.
В результате возбужденная матрица и сокристаллизованные с ней ионы вещества испаряются.
После этого проводится анализ с помощью TOF.
Ионизация в этом метод очень мягкая, и степень фрагментации низкая, поэтому с помощью
MALDI можно анализировать смеси веществ. Кроме того, в результате ионизации образуется
большое количество ионов, что обеспечивает высокий уровень чувствительности.
Максимальная чувствительность достигается в том случае, если концентрация образца
соответствует оптимуму. Если концентрация образца неизвестна, готовят серию образов.
Тип биополимеров
Оптимум концентрации
Полипептиды и белки
0,1 – 10 пмоль/мм3
Гликопротеины
10 пмоль/мм3
Олигонуклеотиды
10 – 100 пмоль/мм3
Нуклеионовые кислоты
100 пмоль/мм3
Таблица 2. Оптимальные концентрации биополимеров для исследования методом MALDI/TOF.
Существует модификация метода, носящая название Отсроченная экстракция (delayed extraction,
DE). В приборах первого поколения MALDI ионы, возникающие в разных точках камеры
обладали разной энергией. Такое различие в энергии приводит к снижению точности из-за
уширения пиков на спектрограмме. В DE-MALDI ионы образуются либо в слабом поле, либо в
отсутствии электрического поля, а затем в определенный момент подается высокое напряжение. В
градиенте напряжения медленные электроны разгоняются сильнее быстрых, и у детектора
нагоняют их.
Во многих приборах для увеличения разрешения используются отражатели-рефлектроны, которые
представляют собой ионное зеркало, которое увеличивает длину пути иона и корректирует
различия в энергии ионов одинаковой массы.
Масс-анализаторы
Ионы из ионизационной камеры попадают в масс-анализатор, где учитываются детектором,
причем в каждый момент времени регистрируются ионы с конкретными массами. В большинстве
приборов каждому типу ионизации соответствует свой масс-анализатор: для CT и EI обычно
используется магнитный сектор, ESI сочетается с квадруполем или ионной ловушкой, MALDI – с
времяпролетным детектором.
Квадрупольный анализатор
Квадруполь представляет собой четыре параллельно расположенных тонких цилиндра в
переменном электрическом поле, которое создается подачей постоянного напряжения и
переменного радиочастотного напряжения. В электрическом поле ионы ускоряются и если
резонансная частота поля совпадает с частотой колебания частиц с определtнным m/z, то частица
выходит из квадруполя и попадает на детектор. Если частоты колебаний не совпадают, частица
сталкивается с цилиндрами квадруполя и не выходит. Таким образом, единомоментно на
анализатор попадают ионы с определенным соотношением m/z. Придел анализа с помощью
квадруполя – 3000 m/z, поэтому его часто используют для исследования белков и неполимерных
молекул.
Ионная ловушка
Ионная ловушка представляет собой усовершенствованный квадрупольный анализатор.
Источником ионов для этого масс-анализатора служит электроспрей. Регистрация происходит
практически мгновенно, в течение нескольких миллисекунд, и затем ловушка заполняется новыми
ионами. Чувствительность такого анализатора значительно выше, чем у квадрупольного.
Применимость метода также шире: от анализа небольших биологических молекул до
комбинаторных библиотек.
В состав ионной ловушки входят три гиперболических электрода, образующих небольшую
полость диаметром в 4-5 см. Ионы из источника попадают в полость ловушки через квадруполь и
отверстие, которое расположено в замыкающем электроде. Электроды создают трехмерное
электрическое поле, благодаря которому ионы удерживаются внутри ловушки, причем захват
зависит от значения m/z. Для детекции потенциал изменяют, и ионы выбрасываются из ловушки
на детектор в порядке возрастания m/z. Кроме того, можно задержать в ловушке ионы с
определённым значением m/z для последующей многократной фрагментации (MCn).
Полость ловушки заполняют гелием при очень низком давлении. Происходит диссоциация ионов
в результате соударений с атомами гелия (collision-induced dissociation, CID). При этом ионы
распадаются на фрагменты, и они также выталкиваются из ловушки, и на детекторе появляется
спектр фрагментов. Процесс можно повторять заново, но с каждым актом фрагментации падает
чувствительность. Максимальное число фрагментаций, которое когда-либо проводили – 14.
Времяпролетный масс-спектрометр (Time-Of-Flight, TOF)
Времяпролетный спектрометр практически не имеет ограничения по массам исследуемых
веществ. Как правило, TOF требует MALDI в качестве источника ионов.
После ускорения в электрическом поле, ионы влетают в пролетную трубку, где поле отсутствет
(область дрейфа). Более легкие ионы движутся быстрее, более тяжелые – медленнее. Если иону
ускоряют путем наложения одного и того же потенциала в фиксированной точке и в
фиксированный начальный момент времени, они разделятся в соответствии со значениями m/z.
По времени, проведенному в трубке, мы можем реконструировать массу.
Ekin | U  z  e 
1 2
mv , где
2
Еkin – полная кинетическая энергия, U – ускоряющий электростатический потенциал, v – скорость,
которую приобретают ионы с отношением масса/заряд - m/z.
m
 t, t 
z
m
Обычно для построения хорошего спектра требуется несколько сотен лазерных
z
импульсов.
Тандемная масс-спектрометрия
Масс-спектрометр может иметь два масс-анализатора. Такой масс-спектрометр называют
тандемным. Тандемные масс спектрометры применяются, как правило, вместе с «мягкими»
методами ионизации, при которых не происходит фрагментации ионов анализируемых молекул
(молекулярных ионов).
Таким образом, первый масс-анализатор анализирует молекулярные ионы. Покидая первый массанализатор, молекулярные ионы фрагментируются под действием соударений с молекулами
инертного газа или излучения лазера, после чего их фрагменты анализируются во втором массанализаторе. Наиболее распространёнными конфигурациями тандемных масс спектрометров
являются квадруполь-квадрупольная и квадруполь-времяпролётная.
Для примера могу представить вам прибор, который предлагала APPl BiOS
В качестве ионизатора они использовали вот такой вот Турбо-В
После ионизации вещества поступают в тройной квадруполь
В первом квадруполе (Q1) выбирается ион с определенным значением m/z. Но потом ион не
детектируется, а идет во второй квадруполь (Q2), где подвергается соударениям с ионами газа.
Квадруполь Q3 играет роль второго масс-спектрометра, который сканирует величины m/z для
построения спектров ионов фрагментов.
Квадруполь Q2 называют еще камерой соударений. Часто на него дополнительно воздействуют
радиочастотными волнами, чтобы повысить частоту соударений.
После этого происходит детекция ионов и их сканирование, после чего происходит первичная
компьютерная обработка. Анализ таких масс спектров, конечно ,по сложности несравним с там де
анализом данных НГС, но тоже весьма непрост и трудоемок.
Обычно такую тандемную масс-спектрометрию используют для анализа смесей пептидов,
поэтому в камере соударений происходит фрагментация по петидным связям
Какие проблемы мы можем решать?





исследование пептида по (состав реконструируется)
исследование класса веществ, содержащих один и тот же фрагмент
исследование степени фосфорилирования
поиск общего фрагмента в разных соединениях
фрагментирование до аминокислот и определение состава (аналог метода Эдмана)